UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE DETECÇÃO DE VÍRUS EM MORCEGOS NO BRASIL ATRAVÉS DO SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO FERNANDO FINOKETTI Orientadora: Profª. Drª. Ana Cláudia Franco Porto Alegre Setembro/2018 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE DETECÇÃO DE VÍRUS EM MORCEGOS NO BRASIL ATRAVÉS DO SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO Fernando Finoketti Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Microbiologia Agrícola e do Ambiente. Área de concentração: Virologia Orientadora: Profª. Drª. Ana Cláudia Franco Porto Alegre, Rio Grande do Sul - Brasil Setembro/2018 ii iii AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Jadir e Ilineta, e meu irmão Felipe, por todo amor, apoio e confiiança, e que não mediram esforços para tornar esse sonho realidade, meu eterno amor e agradecimento. A professora Ana Cláudia Franco, pela dedicação e paciência em me orientar, pelos ensinamentos compartilhados, e pela sua postura e entrega com a pesquisa e docência, sem deixar de ser uma ótima mãe, servindo de inspiração para seus alunos. Ao professor Paulo Roehe, pela gestão e manutenção do laboratório, sempre instigando os alunos a desenvolveram uma pesquisa de qualidade e se envolveram com todos os assuntos técnicos e administrativos do laboratótio. A Dra. Helena Beatriz de Carvalho Ruthner Batista, pela confiança em mim deposita para o desenvolvimento deste projeto, e pelos sábios conselhos compartilhados desde a época da iniciação científica. Ao Dr. Fabrício Souza Campos, pela amizade e ensinamentos desde o início da minha trajetória científica. Aos amigos Aline Campos, André Zani e Raíssa Nunes, que estiveram presentes em todas as etapas desse projeto, pelo companheirismo, amizade e, principalmente por me aturarem nas saídas a campo. Aos demais colegas do LabVir do ICBS/UFRGS, por todo respeito, apoio e parceiria, durante esses anos de convívio. Aos docentes do Programa de Pós Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, por toda dedicação e gentileza no convívio dentro e fora da sala de aula. A todos envolvidos nas coletas das amostras do Grupo de Estudos em Ecologia de Mamíferos e Educação Ambiental da Universidade Estadual de Maringá- PR e do Instituto Pasteur de São Paulo. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) que fininciou uma parte desse projeto, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq) pela concessão da bolsa. iv DETECÇÂO DE VÍRUS EM MORCEGOS NO BRASIL ATRAVÉS DO SEQUENCIAMENTO DE ALTO DESEMPENHO Autor: Fernando Finoketti Orientadora: Profª. Drª. Ana Cláudia Franco RESUMO Os morcegos são reconhecidamente reservatórios de diversos vírus com potencial zoonótico, como o vírus da raiva e ebola. A grande diversidade ecológica, acrescida de alguns fatores fisiológicos, característicos desses animais, faz deles excelentes mecanismos de manutenção e dispersão de vírus na natureza. O crescente contato entre humanos e morcegos é uma preocupação para a saúde pública, aumentando o foco para a vigilância viral nesses animais. No Brasil, poucos estudos buscaram acessar a diversidade viral em morcegos, dificultando o trabalho de vigilância, uma vez que não são conhecidos os vírus circulantes nesses animais. Assim, o presente estudo visa acessar a diversidade viral em amostras de morcegos através do sequenciamento de alto desempenho. Foram utilizadas amostras de swab anal, swab oral e pulmão, de diferentes espécies e localidades. Após as análises dos resultados, foram identificados fragmentos de Adenovirus, Papillomavirus e Parvovírus, bem como dois genomas completos de duas novas espécies de Anellovirus e uma nova espécie de Circovírus. As análises filgenéticas demonstraram que um dos fragmentos de Adenovirus possui similaridade com o adenovírus humano tipo C, associado a doenças respiratórias. Os resultados encontrados contribuem para aumentar o conhecimento da diversidade viral, bem como reforça a importância de uma vigilância não apenas para raiva, demonstrando a possibilidade da presença de outros vírus com potencial zoonótico. 1Tese de Doutorado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente – Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (124p.) Setembro, 2018. v DETECTION OF VIRUSES IN BRAZILLIAN BATS THROUGH HIGH THROUGHPUT SEQUENCING 1 Author: Fernando Finoketti Advisor: Prof. Dr. Ana Cláudia Franco ABSTRACT Bats are recognized as reservoirs of several viruses with zoonotic potential, such as rabies virus and ebola. The large ecological diversity, added to fisiological characteristics, typical from bats, makes them excellent mechanisms of maintenance and dispersion of viruses in nature. The increasing contact between humans and bats is a concern for public health, reinforcing the importance for viral surveillance in these animals. In Brazil, few studies have sought to access viral diversity in bats, making surveillance difficult, since the circulating viruses in these animals are still unknown. Thus, the present study aims to access viral diversity in bat samples through high throughput sequencing. Samples of different origins, species and regions were used. Following the analysis of the results, fragments of Adenovirus, Papillomavirus and Parvovirus were identified, as well as two complete genomes of two new species, one Anellovirus and one species of Circovirus. The phylogenetic analyzes demonstrated that one of the fragments of Adenovirus has similarity with the human adenovirus type C, associated to respiratory diseases. The results described here contribute to the knowledge of viral diversity, as well as reinforce the importance of surveillance not only for rabies, as long as they demonstrate the presence of other viruses with zoonotic potential in Brazilian bats. 1Doctoral Dissertation in Agricultural and Environmental Microbiology – Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. (124 p.) Sptember, 2018. vi SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 3 2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 3 2.2 Objetivos Específicos......................................................................................... 3 3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 4 3.1 Aspectos biológicos e ecológicos dos morcegos ............................................... 4 3.2 Conceitos básicos de metagenômica ................................................................ 7 3.3 A relação entre vírus e morcegos ...................................................................... 9 4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 14 4.1 Swab anal e orofaríngeo .................................................................................. 14 4.1.1 Coleta das amostras ................................................................................. 14 4.1.2 Purificação das partículas virais ................................................................ 15 4.1.3 Extração de ácidos nucléicos .................................................................... 16 4.1.4 Enriquecimento de genomas virais ........................................................... 17 4.2 Amostras de pulmão ........................................................................................ 18 4.2.1 Coleta de amostras ................................................................................... 18 4.2.2 Purificação das partículas virais ................................................................ 18 4.2.3 Extração de ácidos nucléicos .................................................................... 20 4.2.4 Enriquecimento de genomas virais ........................................................... 20 4.3 Sequenciamento de alto desempenho ............................................................ 20 4.4 Montagem e identificação de contigs ............................................................... 21 4.5 Análises filogenéticas ...................................................................................... 22 4.6 Biossegurança ................................................................................................. 23 5 RESULTADOS ....................................................................................................... 24 5.1 Swab anal de Artibeus lituratus ....................................................................... 27 5.2 Swab orofaríngeo de Artibeus lituratus ............................................................ 29 5.3 wab anal de Sturnira lilium ............................................................................... 34 5.4 Swab orofaríngeo de Sturnira lilium ................................................................. 35 5.5 Pulmão de Molossus molossus ......................................................................