Agronomía Costarricense 35(2): 9-19. ISSN:0377-9424 / 2011 www.mag.go.cr/rev agr/index.html www.cia.ucr.ac.cr MICROPROPAGACIÓN DE PILÓN (Hieronyma alchorneoides) Ana Abdelnour1/*, Mª Elena Aguilar**, Lissette Valverde†*** Palabras clave: Micropropagación, cultivo in vitro, pilón, Hieronyma alchorneoides, citocininas. Keywords: Micropropagation, in vitro culture, pilon, Hieronyma alchorneoides, cytokinins. Recibido: 05/07/11 Aceptado: 23/09/11 RESUMEN ABSTRACT El pilón (Hieronyma alchorneoides, Micropropagation of pilon (Hieronyma Euphorbiaceae) es una de las especies nativas alchorneoides). Pilon (Hieronyma alchorneoides) maderables de Costa Rica mejor adaptadas a (Euphorbiaceae) is one of the native timber condiciones abiertas de plantación; por sus carac- species of Costa Rica best adapted to conditions of terísticas de crecimiento y variedad de usos, la open plantation. Due to its growth characteristics demanda por material de siembra se ha incre- and variety of uses, the demand for planting mentado. Esta especie presenta serios problemas material has increased. This species presents en su reproducción sexual: es dioica, la produc- serious problems with seed reproduction; it is ción de frutos muy variable en el tiempo y entre a dioecious, the fruit production varies over árboles, que producen gran cantidad de frutos, time and between trees, trees produce large pero son fuertemente depredados por diferentes quantities of fruit but are heavily predated by aves. En los últimos años el porcentaje de frutos different birds. In recent years, the percentage dañados se ha incrementado a niveles conside- of damaged fruit has increased due to wasps and rables debido a avispas y las semillas pierden su the seeds lose their ability to germinate within capacidad de germinación pocos días después de days of harvest (recalcitrant). These factors la cosecha (recalcitrante). make micropropagation an attractive option for Estos factores hacen que la micropropa- mass propagation of the species. In the present gación sea una opción atractiva para su multi- study various stages of in vitro cultivation were plicación. En el presente estudio se evaluaron evaluated. The aseptic establishment of the las diferentes etapas del cultivo in vitro. El embryos was achieved by scarifying the seeds with establecimiento aséptico de los embriones se concentrated sulfuric acid for 10 min, followed by logró mediante incubación de las semillas con incubation in 5.5% sodium hypochloride (NaClO) ácido sulfúrico concentrado por 10 min, seguido for 30 min, then embryos were inoculated on the de la inmersión en hipoclorito de sodio (NaOCl) culture medium described by Murashige and al 5,5% durante 30 min; los embriones fueron Skoog (MS) without growth regulators. When 1 Autor para correspondencia. Correo electrónico: ** Laboratorio de Biotecnología, Centro Agronómico [email protected] Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), * Centro de Investigación en Biotecnología, Instituto Turrialba, Costa Rica. Tecnológico de Costa Rica (ITCR), Cartago, Costa *** Laboratorio de Cultivo de Tejidos, Instituto de Rica. Investigación y Servicios Forestales (INISEFOR), Universidad Nacional (UNA), Heredia, Costa Rica. 10 AGRONOMÍA COSTARRICENSE inoculados en el medio de cultivo de Murashige vegetative material was used as initial explant, y Skoog (MS) sin reguladores del crecimiento. the use of 0.095% mercuric chloride (HgCl2) La asepsia de material vegetativo se logró con during 5 min, allowed 50% of cuttings to develop cloruro de mercurio (HgCl2) al 0,095% por 5 shoots under aseptic conditions on a simple MS min, el 50% de las microestacas que brotaron medium. It was observed that pilon does not en el medio MS simple. Además, se observó que require the addition of growth regulators during el pilón no requiere de la adición de regulado- bud induction nor in the multiplication stages. res del crecimiento en las etapas de brotación y During rooting, the addition of indole butyric acid multiplicación. (IBA) at concentrations of 0.1 mg.l-1 promoted the El uso de 0,1 mg.l-1 de ácido indolbutírico highest percentage of rooted shoots (80%), the (AIB) promovió el enraizamiento del 80% de los largest number of roots per stem (5.0) and the tallos y el número mayor de raíces por tallo (5,0) best quality of the roots formed. Survival of in de buena calidad. Se logró un 70% de sobreviven- vitro plants after acclimation under greenhouse cia en la aclimatación de las plantas en condicio- condition reached 70%. nes de invernadero. INTRODUCCIÓN dificulta la identificación de árboles semilleros (COSEFORMA 1998). La producción de frutos Hieronyma alchorneoides El pilón ( ), tam- es muy variable en el tiempo y entre árboles. bién conocido como zapatero, palo curtidor, palo Aunque los árboles producen gran cantidad de rosa, tinto entre otros, pertenece a la familia frutos, estos son fuertemente depredados por Euphorbiaceae. Su zona de distribución natu- diferentes aves y en los últimos años el porcentaje ral alcanza desde México hasta la cuenca del de frutos dañados se ha incrementado a niveles Amazonas brasileño y las islas de las Indias considerables debido a avispas de la familia Occidentales (González 1995). En Costa Rica se Eurytomidae (Moya et al. 2009). Un problema encuentra en los bosques lluviosos de las zonas adicional que presentan las semillas es que bajas del Norte y del Atlántico, en alturas desde pierden su capacidad de germinación pocos días el nivel del mar hasta los 800 m. Se presenta tanto después de la cosecha (semillas recalcitrantes) en bosques primarios como secundarios y a lo (COSEFORMA 1998). largo de ríos y quebradas (Torres et al. (2002), El pilón es una de las especies nativas que González 1995). mejor se ha adaptado a condiciones abiertas de En condiciones naturales presenta pobla- plantación, muestra poca exigencia con respecto a ciones pequeñas, por lo que al aprovecharla se la calidad del sitio, buena forma de fuste y rápido corre el riesgo de amenazar su permanencia en crecimiento durante los primeros años, además el ecosistema. El pilón es una especie dioica, es su madera es muy apreciada en el mercado por decir, presenta árboles macho y árboles hembra, su amplio rango de usos (Solis y Moya 2004). los cuales no pueden ser identificados antes de la Se utiliza en construcciones, tanto en interiores floración. No se conoce la relación entre la fre- como exteriores para puentes, pisos, carrocería de cuencia de los árboles macho y hembra y no todos camiones, soportes, postes, barriles para sólidos, los árboles florecen cada año. Existen árboles durmientes de ferrocarril, barcos y construccio- que nunca han presentado una floración, lo que nes marinas (Carpio 1992). El conocimiento de Agronomía Costarricense 35(2): 9-19. ISSN:0377-9424 / 2011 ABDELNOUR et al.: Micropropagación de pilón 11 estas características ha incrementado la demanda sodio (NaOCl) en varias concentraciones y tiem- de pilón por parte de los reforestadores (Moya pos de inmersión (2,75% durante 20 min, 4,12% et al. 2009), por lo tanto, se espera contar en un durante 20 min, 5,5% durante 20 y 30 min). Un futuro cercano, con materiales de siembra de último tratamiento consistió de la escarificación calidad para cubrir esta demanda. Sobre la micro- de las semillas con ácido sulfúrico concentrado propagación de pilón, solamente se encontraron 2 por 10 min seguida de la desinfección en 5,5% referencias de trabajos realizados en Costa Rica de NaOCl por 30 min. Todos los tratamientos se (Valverde 1998, Gamboa 1998); sin embargo, colocaron en agitación. Después de la desinfec- la metodología propuesta debió ser revisada y ción, las semillas fueron lavadas 3 veces con agua completada. Por lo tanto el objetivo del presente destilada estéril en la cámara de flujo laminar y trabajo fue establecer una metodología eficiente los embriones disectados y distribuidos en viales para la micropropagación de pilón. (11 cm de largo x 8 cm de diámetro) con 10 ml del medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) (1962), -1 MATERIALES Y MÉTODOS suplementado con 3% de sacarosa y 1,8 g.l de gelrite® como gelificante. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de la esterilización por auto- Material vegetal clave (1,2 atm de presión y 121º de temperatura durante 20 min). Los cultivos se mantuvieron en Para los ensayos de introducción y esta- un cuarto de crecimiento con una temperatura de blecimiento in vitro se utilizaron semillas y 27±2ºC, un fotoperiodo de 16 h luz y una intensi- estacas procedentes de árboles seleccionados. dad lumínica de 2000 lux. Las semillas de pilón fueron suministradas por Para las pruebas de desinfección y esta- la Organización de Estudios Tropicales (OET) y blecimiento in vitro de material vegetativo se el Banco de Semillas Forestales del Centro Agro- tomaron los rebrotes de las estacas mantenidas en nómico Tropical de Investigación y Enseñanza invernadero y se eliminaron las hojas, y se dejó (CATIE). El material vegetativo para la intro- solo una pequeña parte del pecíolo. Se utilizaron ducción in vitro de brotes consistió de esquejes o explantes de aproximadamente 3 a 4 cm con 1 estacas tomados de plantas ubicadas en el jardín a 3 nudos. Se procedió a hacer un lavado con clonal del Instituto Tecnológico de Costa Rica agua y detergente y luego se incubó el material en la Zona Norte y en el vivero de la Escuela de en los diferentes tratamientos de desinfección. Agricultura de la Región del Trópico Húmedo Como desinfectante se utilizó cloruro de mercu- (EARTH). Estas estacas fueron mantenidas en rio (HgCl ) en concentraciones de 0,095, 0,1 y el invernadero para estimular la brotación de 2 0,2% durante 5 a 7 min. las yemas y se asperjaron semanalmente con Una vez desinfectados los rebrotes, para una mezcla de Agrimicin® y Benlate® (estrep- inducir la brotación de las yemas axilares y la tomicina y benomil, respectivamente), en una producción de nuevas plántulas in vitro, microes- concentración de 1 g.l-1 de cada uno para reducir tacas de aproximadamente 0,5 a 1,0 cm, con un la contaminación una vez introducidas in vitro.