NATIONAL AND KAPODISTRIAN UNIVERSITY OF ATHENS SCHOOL OF SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY DOCTORAL DISSERTATION Development of High Resolution Mass Spectrometric Methods for the investigation of food authenticity KALOGIOURI NATASA MSc CHEMIST ATHENS JULY 2017 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ανάπτυξη Μεθόδων Φασματομετρίας Μάζας Υψηλής Διακριτικής Ικανότητας για τη μελέτη της αυθεντικότητας τροφίμων KΑΛΟΓΙΟΥΡΗ ΝΑΤΑΣΑ Α.Μ.: 001305 ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Νικόλαος Θωμαϊδης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ: Κωνσταντίνος Ευσταθίου, Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής Νικόλαος Θωμαΐδης, Αναπληρωτής Καθηγητής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κωνσταντίνος Ευσταθίου, Καθηγητής Αντώνιος Καλοκαιρινός, Καθηγητής Μιχαήλ Κουππάρης, Καθηγητής Βικτώρια Σαμανίδου, Καθηγήτρια του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, Τμήμα Χημείας Νικόλαος Θωμαΐδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Ευάγγελος Μπακέας, Αναπληρωτής Καθηγητής Αναστάσιος Οικονόμου, Αναπληρωτής Καθηγητής ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ: 18/7/2017 DOCTORAL DISSERTATION Development of High Resolution Mass Spectrometric Methods for the investigation of food authenticity KALOGIOURI NATASA Registration Number: 001305 SUPERVISING PROFESSOR: Dr. Nikolaos Thomaidis, Associate Professor THREE-MEMBER CONSULTATIVE COMITTEE: Dr. Konstantinos Efstathiou, Professor Dr. Michail Koupparis, Professor Dr. Nikolaos Thomaidis, Associate Professor SEVEN-MEMBER EXAMINATION COMITTEE: Dr. Konstantinos Efstathiou, Professor Dr. Antony Calokerinos, Professor Dr. Michail Koupparis, Professor Dr. Victoria Samanidou, Professor in the Aristotle University of Thessaloniki, Department of Chemistry Dr. Nikolaos Thomaidis, Associate Professor Dr. Evangelos Bakeas, Associate Professor Dr. Anastasios Economou, Associate Professor DEFENDING DATE: 18/7/2017 ABSTRACT Food authenticity has become increasingly important in recent years due to food fraud incidents and the handling of low quality products with misleading labels. The guarantee of the authenticity of olive oil arises great public concern because of its sensory, nutritional and economic importance. The main objective of this thesis is to develop integrated LC-HRMS workflows, including target, suspect and non-target screening strategies, coupled with advanced chemometric tools, for olive oil fingerprinting. First, the biological activities of some minor constituents in olive oil, phenolic compounds, are reported and their occurrence and wide-scope properties in olive matrices, as well as effects of various factors on olive oil phenolic profile, are discussed. The present state of the art for their determination in foodomics science is presented, focusing on target and non-target screening HR-MS workflows coupled to chemometrics. The experimental section of the thesis consists of three sections: (1) Olive oil authenticity studies by target and non-target LC-QTOF-MS combined with advanced chemometrics, for identifying markers that classify olive oil to defective and EVOOs (Chapter 3), (2) Investigating the organic and conventional production type of EVOOs with target and suspect screening by LC-QTOF-MS, a novel semi-quantification method using chemical similarity and advanced chemometris; in order to identify a marker with a concentration threshold, by ACO/RF, that can be used to discriminate organic and conventional EVOOs (Chapter 4), and (3) Classification of Greek olive oil varieties with non-target UHPLC-QTOF-MS and advanced chemometrics; for the investigation of the fingerprints of six greek olive oil varieties and the identification of markers, with post-defined concentration thresholds, that guarantee the varietal and geographical origin (Chapter 5). We believe that these studies have made great progress in the food authenticity field via the introduction of novel integrated HRMS screening workflows which are followed by advanced data processing, comprehensive data mining and predictive modelling tools. SUBJECT AREA: Analytical Chemistry KEYWORDS: Authenticity, olive oil, HR-MS, non-target screening, chemometrics ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η αυθεντικότητα των τροφίμων αποτελεί ένα ιδαίτερα σημαντικό γεγονός τα τελευταία χρόνια, λόγω των πολλών περιστατικών νοθείας τροφίμων και διακίνησης προϊόντων κατώτερης ποιότητας με παραπλανητικές ετικέτες. Η εξασφάλιση της αυθεντικότητας του ελαιολάδου δημιουργεί μεγάλη ανησυχία λόγω της οργανοληπτικής, θρεπτικής και οικονομικής του σημασίας. Ο κύριος στόχος αυτής της διατριβής είναι η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων υγροχρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (LC-HRMS) που θα συμπεριλαμβάνουν στρατηγικές στοχευμένης, «ύποπτης» και «μη στοχευμένης σάρωσης», σε συνδυασμό με προηγμένα χημειομετρικά εργαλεία, για την εύρεση του αποτυπώματος του ελαιολάδου. Aρχικά, αναφέρονται οι βιολογικές δράσεις των ελάσσονων συστατικών του ελαιολάδου, των φαινολικών ενώσεων, και οι επιδράσεις διαφόρων παραγόντων στο φαινολικό προφίλ. Παρουσιάζονται όλες οι σύγχρονες και αναλυτικές μέθοδοι που συνδυάζουν την επιστήμη των τροφίμων με τεχνικές μεταβολομικής, με έμφαση στις μεθόδους HR-MS. Το πειραματικό μέρος της διατριβής αποτελείται από τρία τμήματα: (1) Μελέτες αυθεντικότητας ελαιολάδου με LC-QTOF-MS σε συνδυασμό με στοχευμένη και μη στοχευμένη σάρωση και χημειομετρία για την αναγνώριση δεικτών που κατατάσσουν το ελαιόλαδο ως ελαττωματικό ή έξτρα παρθένο. (Κεφάλαιο 3), (2) Διερεύνηση του βιολογικού και συμβατικού τύπου παραγωγής των έξτρα παρθένων ελαιολάδων με LC- QTOF-MS σε συνδυασμό με στοχευμένη και «ύποπτη» σάρωση, προτείνοντας μια νέα μέθοδο ημι-ποσοτικοποίησης (Κεφάλαιο 4), και (3) Ταξινόμηση έξι ελληνικών ποικιλιών ελαιoλάδου με LC-QTOF-MS μη στοχευμένη στοχευμένη σάρωση και χημειομετρία, για την αναγνώριση δεικτών με προκαθορισμένα όρια συγκέντρωσης, που εγγυώνται την ποικιλιακή και γεωγραφική προέλευση (Κεφάλαιο 5). Πιστεύουμε ότι οι παραπάνω μελέτες έχουν σημειώσει μεγάλη πρόοδο στον τομέα της γνησιότητας των τροφίμων με την ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων HR-MS και μέσω της εισαγωγής μιας νέας ολοκληρωμένης ροής εργασιών που περιλαμβάνει στρατηγικές στοχευμένης, «ύποπτης» και μη στοχευμένης σάρωσης HRMS, σε συνδυασμό με, ολοκληρωμένα εργαλεία εξόρυξης, επεξεργασίας δεδομένων και προγνωστικά μοντέλα. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Αναλυτική Χημεία ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Αυθεντικότητα, ελαιόλαδο, HR-MS, μη στοχευμένη σάρωση, χημειομετρία To my grandfather and grandmother Στον παππού και στη γιαγιά “Sometimes you have to play a long time to be able to play like yourself” - Miles Davis (1926-1991) ACKNOWLEDGEMENTS I would like to express my sincere gratitude to my thesis director Dr. Nikolaos Thomaidis, for having accepted me to realize this doctoral thesis in his research group. His good advice, continuous guidance and encouragements were key motivations throughout my PhD. I am grateful to him for his trust, understanding and support both in academic and personal life. Special thanks are attributed to the three-member committee and seven-member examination committee for their cooperation throughout this thesis and their valuable comments. I am sincerely thankful to professor Ioannis Stratis for his continuous assistance and encouragements to keep following my goal, since I was an undergraduate student. I would like to thank all my colleagues for their friendhip and enjoyable and memorable time we had together in the Laboratory of Analytical Chemistry, and especially my colleague and close friend, Reza Aalizadeh. None of what I have achieved would have become true without the encouragement of my family and friends. I am deeply grateful to you for your support and encouragements. To my parents, grandfather and grandmother and my aunt who raised me up and taught me to be hardworking, honest and patient. CONTENTS PREFACE ..................................................................................................................... 21 1. CHAPTER 1 OLIVE OIL AUTHENTICITY STUDIES……………………………….....22 1.1 Introduction .......................................................................................................... 22 1.2 Olive oil authenticity ............................................................................................. 24 1.3 Olive oil bioactive constituents ............................................................................. 29 1.3.1 Classification of phenolic and other bioactive compounds in virgin olive oil..29 1.3.1.1 Phenolic acids ........................................................................................ 30 1.3.1.2 Phenyl alcohols ...................................................................................... 30 1.3.1.3 Secoiridoids ............................................................................................ 31 1.3.1.4 Flavonoids .............................................................................................. 32 1.3.1.5 Lignans ................................................................................................... 33 1.3.1.6 Non phenols ........................................................................................... 34 1.3.2 Nutritional and health benefits ....................................................................... 34 1.3.3 Factors affecting phenolic composition ......................................................... 35 1.4 Analytical methodologies for the identification of olive oil phenolic compounds .. 36 1.4.1 Identification of phenolic compounds with TOF-MS ...................................... 43 1.5 HRMS screening workflows ................................................................................. 44 1.5.1