Immunochemical and Chromatographic Methods for Two Anthropogenic Markers of Contamination in Surface Waters: Caffeine and Coprostanol Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Chemie eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin von Apotheker José João Dias Carvalho Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. Jan-Hendrik Olbertz Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. Andreas Herrmann Gutachter/innen: 1. Prof. Dr. Ulrich Panne 2. Priv.-Doz. Dr. Michael G. Weller 3. Priv.-Doz. Dr. Rudolf J. Schneider Tag der mündlichen Prüfung: 12.04.2011 This page intentionally left blank. 2 Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2006 bis März 2010 im Arbeitskreis von Prof. Dr. Ulrich Panne, Institut für Chemie, Humboldt-Universität zu Berlin durchgeführt. 3 This page intentionally left blank. 4 Dedicated to my great-uncle José Fernando Coelho de Sousa, whom I never met. 5 This page intentionally left blank. 6 Zusammenfassung Koffein (1,3,7-Trimethylxanthin) und Coprostanol (5β-cholestan-3β-ol) wurden im Berliner Oberflächenwasser nachgewiesen. Ihre Konzentrationen korrelierten mit dem Verunreinigungsgrad der Proben, was nahelegt, dass sie sich als Marker für menschliche Aktivität eignen. Bemerkenswerterweise wurde Koffein in jeder einzelnen Oberflächenwasserprobe oberhalb der Bestimmungsgrenze von 0,025 µg/L gefunden. Um Oberflächenwasserproben in größeren Serien zu untersuchen, war die Entwicklung zweier neuer Methoden erforderlich: ein Immunoassay, basierend auf einem monoklonalen Antikörper für Koffein und eine dispersive flüssig-flüssig Mikroextraktionsmethode (DLLME), gefolgt von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für Coprostanol. Der entwickelte Koffein-Immunoassay zeigt die beste je erhaltene Nachweisgrenze für Koffein (0,001 µg/L), erlaubt Hochdurchsatz-Analysen und erfordert keine Probenvorbereitung. Der Assay wurde auch erfolgreich für die Messung von Koffein in Getränken, Haarwaschmitteln, Koffeintabletten und menschlichem Speichel angewendet. Antikörper gegen Coprostanol sind nicht kommerziell erhältlich. Eine neue Strategie Anti-Coprostanol-Antikörper zu generieren wurde erarbeitet, die eine analoge Verbindung – Isolithocholsäure (ILA) – als Hapten verwendet, mit der eine Gruppe von Mäusen immunisiert wurde. Ein polyklonales Anti-ILA-Serum wurde produziert, welches Coprostanol bindet, aber die niedrige Affinität erlaubte nicht den Aufbau eines Immunoassays, der die Messung von Umweltkonzentrationen des Anayten (im Bereich ng/L) zulässt. Spezifische Anti-ILA-Immunglobuline G wurden auch in den Faeces der Mäuse gefunden. Coprostanol wurde in den Wasserproben durch die Verwendung einer neuentwickelten LC-MS/MS-Methode unter APCI-Ionisation (atmospheric pressure chemical ionisation) gemessen. Konzentrationen oberhalb von 0,1 µg/L wurden nach Voranreicherung der Probe mittels DLLME bestimmt. Diese Extraktionsmethode erwies sich auch als geeignet für die Anreicherung von Coprostanol-ähnlichen Verbindungen wie Cholesterol, Cholestanol, Cholestanon, Ergosterol und Stigmasterol. 7 This page intentionally left blank. 8 Abstract Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) and coprostanol (5β-cholestan-3β-ol) were detected in samples of Berlin’s surface water. Their concentrations correlated with the contamination status of the samples, suggesting their usefulness as markers of human activity. Remarkably, caffeine concentrations were always well above the limit of quantitation of 0.025 µg/L. In order to screen surface water samples in larger series, the development of two novel methods was required: a monoclonal antibody-based immunoassay for caffeine and a dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) method, followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for coprostanol. The caffeine immunoassay developed shows the best analytical limit of detection (LOD) obtained so far for caffeine (0.001 µg/L), allows high-throughput analysis, and does not require sample pre-treatment. The assay was also successfully employed to measure caffeine in beverages, shampoos, caffeine tab-lets, and human saliva. Antibodies to coprostanol are not commercially available. A new strategy to generate anti-coprostanol antibodies was elaborated using an analogous com- pound as hapten – isolithocholic acid (ILA) – and immunizing a group of mice. A polyclonal anti-ILA serum was produced, which binds coprostanol but the low affinity did not permit setting up an immunoassay to measure environmental concentrations of the analyte (in the range of ng/L). Specific anti-ILA immunoglobulin G were also found in the faeces of the immunized mice. Coprostanol was quantified in the water samples using a newly developed LC- MS/MS method using atmospheric pressure chemical ionisation (APCI). Concentrations above 0.1 µg/L were determined after sample preconcentration using DLLME. This extraction method also proved to be successful for enrichment of coprostanol-related compounds such as cholesterol, cholestanol, cholestanone, ergosterol, and stigmasterol. 9 This page intentionally left blank . 10 Contents Contents Zusammenfassung .................................................................................................. 7 Abstract ................................................................................................................... 9 Contents ................................................................................................................ 10 Abbreviations and acronyms ................................................................................. 16 1. Introduction .................................................................................................... 19 1.1. Pharmaceuticals in surface water ........................................................... 19 1.1.1. Brief historical review ...................................................................... 19 1.1.2. Analytical challenge and regulations ............................................... 27 1.2. Caffeine and coprostanol as anthropogenic markers for pharmaceuticals input in environmental water .............................................................................. 30 1.2.1. Caffeine and coprostanol as markers ............................................. 30 1.2.2. Analytical methods to quantify caffeine – state of the art ................ 32 1.2.3. The stanols analytical challenge ..................................................... 33 1.3. Immunochemical methods in Environmental Chemistry ......................... 36 1.3.1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) at a glance ............. 36 1.3.2. ELISA – state of the art .................................................................. 39 1.3.3. Antibody production ........................................................................ 41 1.3.4. Antibody structure and function ...................................................... 41 1.3.5. Triggering the immune system for a self molecule .......................... 44 1.3.6. In vivo Immunization ....................................................................... 45 1.3.7. Polyclonal and monoclonal antibodies ............................................ 45 1.3.8. Challenge in hapten(-self)-specific antibodies ................................. 46 1.3.9. Production of mAbs – The hybridoma technology ........................... 48 1.3.10. Hybridoma selection ....................................................................... 50 2. Objectives ...................................................................................................... 53 3. Thesis structure ............................................................................................. 54 4. Equipment and common materials ................................................................. 56 4.1. General instrumentation ......................................................................... 56 4.1.1. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) .............. 56 4.1.2. Immunoassay equipment................................................................ 56 11 Contents 4.1.3. Extraction equipment ...................................................................... 56 4.1.4. MALDI-TOF/MS .............................................................................. 56 4.1.5. Capillary electrophoresis ................................................................ 57 4.1.6. Chromatography columns ............................................................... 57 4.2. Software ................................................................................................. 57 4.3. Proteins .................................................................................................. 58 4.4. Buffers.................................................................................................... 59 4.5. Materials ................................................................................................ 60 4.6. Chemicals and buffer salts ..................................................................... 60 ______________________________________________Part I (Caffeine)________ 5. Additional materials (PART I) ......................................................................... 63 5.1. Chemicals .............................................................................................. 63 5.2. Antibodies .............................................................................................