Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Departamento de Microbiologia Tese de Doutorado Taxonomia, diversidade, ecologia, caracterização de resistência a antifúngicos e bioprospecção de fungos presentes na neve e gelo glacial da Antártica Graciéle Cunha Alves de Menezes Belo Horizonte, MG 2019 Graciéle Cunha Alves de Menezes Taxonomia, diversidade, ecologia, caracterização de resistência a antifúngicos e bioprospecção de fungos presentes na neve e gelo glacial da Antártica Tese apresentada ao Departamento de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito para obtenção do grau de Doutora em Ciências Biológicas (Microbiologia). Orientador: Dr. Luiz Henrique Rosa Laboratório de Microbiologia Polar e Conexões Tropicais-ICB/UFMG Coorientador: Dr. Carlos Augusto Rosa Laboratório de Taxonomia, Biodiversidade e Biotecnologia de Fungos- ICB/UFMG Belo Horizonte, MG 2019 Colaboradores Dr. Carlos Leomar Zani Dra. Tânia Maria de Almeida Alves Dra. Betânia Barros Cota Dra. Silvane Maria Fonseca Murta Dr. Policarpo Ademar Sales Junior Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-MG) Dr. Jefferson Cardia Simões Centro Polar e Climático, Instituto de Geociências – Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS Agradecimentos A Deus, por me mostrar os caminhos a seguir e me dar forças quando preciso. Ao meu orientador, Luiz H. Rosa, pela oportunidade de fazer parte do laboratório, pela orientação e confiança dadas a mim para desenvolver este trabalho tanto no laboratório da UFMG, quanto nas expedições antárticas. Agradeço as várias oportunidades proporcionadas durante a trajetória do doutorado, que serviram e servem de incentivo para continuar. Obrigada pela amizade, profissionalismo e boa convivência que tornaram esses quatro anos mais leves e agradáveis. Ao professor Carlos A. Rosa, pela co-orientação neste trabalho, pela ajuda, conselhos e disponibilidade. A professora Susana, pelo incentivo e apoio acadêmico. A Jordana, pela amizade, companheirismo, risadas, Natais e festas familiares compartilhadas. Agradeço principalmente por ter me recebido tão bem em Belo Horizonte, aberto as portas da sua casa e família, sempre tentando tornar a distância de casa menor. Posso dizer agora, que tenho uma família mineira que o doutorado me proporcionou. A Soraya, pela amizade, companheirismo, brincadeiras que renderam ótimas risadas, colaboração na bancada e por ter me recebido de forma tão carinhosa e receptiva quando cheguei ao laboratório. Obrigada pela oportunidade de crescermos profissionalmente juntas e principalmente pelo incentivo diário, fizeram total diferença! Aos colegas e exs colegas do Laboratório de Microbiologia Polar e Conexões Tropicais e do Laboratório de Taxonomia e Biodiversidade de Fungos, agradeço pelos bons anos de convivência, pelas experiências e aprendizado em conjunto. Gostaria de agradecer especialmente aos colegas Grazi, Eldon, Mariana (Zé), Bárbara, Raissa, Lana, Lívia, Vivi, Bebel, Thais, Ana Luiza, Luiza, Ana Raquel e Camila pela ajuda e carinho. A todos os professores, colegas e funcionários do Departamento de Microbiologia da UFMG, pela ajuda, convivência e aprendizado. Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia da UFMG, pela oportunidade e a FAPEMIG e CNPq pela bolsa de estudos. Aos membros da banca avaliadora que gentilmente aceitaram o convite para avaliar e colaborar com este trabalho. Aos meus pais Regina e Gilbrando, pelo amor e carinho, por me proporcionarem todas as condições para que eu trilhasse meu caminho até aqui. Obrigada por todo apoio incondicional, por serem meus maiores incentivadores e meu porto seguro mesmo de longe e, principalmente por compreenderem as ausências em datas importantes. Essa conquista é nossa! Ao meu esposo Thiago, pelo amor, companheirismo, amizade e por ter topado esse sonho do doutorado comigo. Obrigada amor, por ter aceito e encarado mudar radicalmente nossas vidas e sempre ser meu apoio nos momentos difícieis, pela compreensão das minhas ausências e por sempre me incentivar e acreditar em mim, mais do que eu mesma. A minha família, irmão, sobrinhos, tios e sogros por toda a torcida e incentivo. Aos meus amigos, que mesmo de longe sempre são fonte de incentivo, obrigada Rodrigo, William, Priscila e Ana Olívia pela amizade! Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma colaboraram e torceram por mim! “Aventure-se fora de sua zona de conforto. As recompensas valem a pena!” Rapunzel - Filme Disney Sumário Colaboradores ................................................................................................................. 3 Agradecimentos .............................................................................................................. 4 Lista de Abreviaturas .................................................................................................... 10 Lista de Figuras............................................................................................................. 11 Lista de Tabelas ............................................................................................................ 12 Resumo ......................................................................................................................... 13 Abstract ......................................................................................................................... 15 1 Introdução ................................................................................................................ 17 1.1 Antártica ................................................................................................................ 17 1.2 Fungos da Antártica ............................................................................................... 19 1.2.1 Diversidade e ecologia.................................................................................... 19 1.2.2 Potencial biotecnológico................................................................................. 20 1.2.3 Fungos presentes na neve e gelo glacial da Antártica .................................... 21 1.3 Poluentes orgânicos no ambiente antártico: potenciais agentes de seleção de micro- organismos resistentes a drogas ................................................................................... 23 1.4 Fungos resistentes aos antifúngicos ....................................................................... 26 1.4.1 Relação dos agrotóxicos com a resistência cruzada aos antifúngicos ............ 28 2 Justificativa e Relevância ........................................................................................ 31 3 Objetivos ................................................................................................................... 33 3.1 Objetivo Geral ....................................................................................................... 33 3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................ 33 4 Materiais e Métodos ................................................................................................ 34 4.1 Áreas de Coletas .................................................................................................... 34 4.2 Coleta, isolamento e processamento das amostras de neve e gelo .................... 35 4.2.1 Purificação e preservação dos fungos ................................................................. 37 4.3 Identificação dos fungos ........................................................................................ 37 4.3.1 Identificação dos fungos filamentosos ........................................................... 37 4.3.1.1 Extração do DNA total .................................................................................... 38 4.3.1.2 Amplificação utilizando o iniciador (GTG)5 ............................................... 38 4.3.1.3 Amplificação da região ITS ......................................................................... 39 4.3.1.4 Amplificação parcial do gene da β-tubulina ................................................ 40 4.3.1.5 Amplificação parcial da RNA polimerase II ............................................... 40 4.3.1.6 Caracterização morfofisiológica das espécies do gênero Penicillium ......... 41 4.3.2 Identificação das leveduras ................................................................................. 41 4.3.2.1 Extração do DNA total ................................................................................ 41 4.3.2.2 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e NL4 ................................... 42 4.3.3 Purificação dos amplicons .................................................................................. 42 4.3.4 Reações de sequenciamento ............................................................................... 43 4.3.5 Análise computacional das sequências ............................................................... 44 4.4 Diversidade da comunidade fúngica: índices de abundância, riqueza, dominância e similaridade ................................................................................................................. 44 4.5 Preparo dos extratos fúngicos ................................................................................ 46 4.6 Ensaios Biológicos ................................................................................................ 47 4.6.1 Ensaio in vitro com a forma amastigota-like de Leishmania (leishmania) amazonensis