Daiane Fiuza Montagner PERFIS DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ATIVIDADE BIOLÓGICA DE CALOS CULTIVADOS IN VITRO, FOLHAS, PERICARPOS E SEMENTES DE Passiflora tenuifila Killip. E Passiflora setacea BRS PÉROLA DO CERRADO (PASSIFLORACEAE). Tese submetido ao Programa de Pós- graduação em Biotecnologia e Biociências da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Doutora em Biotecnologia e Biociências. Orientadora: Profª. Drª. Ana Maria Viana Florianópolis 2018 Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC. Fiuza Montagner, Daiane Perfis de metabólitos secundários, atividade antioxidante e atividade biológica de calos cultivados in vitro, folhas, pericarpos e sementes de Passiflora tenuifila Killip. e Passiflora setacea BRS Pérola do Cerrado (Passifloraceae). / Daiane Fiuza Montagner ; orientador, Ana Maria Viana , 2018. 256 p. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2018. Inclui referências. 1. Biotecnologia e Biociências. 2. Cultura in vitro. metabólitos secundários. Atividade antioxidante. Atividade biológica. I. , Ana Maria Viana. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências. III. Título. Este trabalho é dedicado aos meus queridos pais e para toda a minha família. AGRADECIMENTOS “ DEUS, quero te agradecer por você ter gostado de mim do jeito que sou. Por ter me aceitado com meus defeitos e por saber também elogiar minhas virtudes. Por me ensinar que a cada dia podemos recomeçar. Por me fazer sentir um alguém diferente e por eu saber que sempre contigo poderei contar.” Autor desconhecido À minha família, por acreditar em mim, pelo incentivo e principalmente pelo amor e carinho, e por terem feito de mim o que sou hoje. Aos meus amados pais, Cledir e Darcy, irmão Darci Junior e irmã Marta, aos meus primos (as) Fernando, Álvaro, Carlos, Carolaine e Elenice, às minhas tias Neli e Cleci, ao Raimundo Neto e à princesa da dinda, Anna Carolina. Aos que não foram citados acima, mas que tenho profundo carinho e respeito. À Profa. Drª. Ana Maria Viana, pela orientação, por ter me acolhido no seu grupo de pesquisa e pelos ensinamentos ao longo destes anos de doutorado; À Profª. Drª. Ines Maria Costa Brighente, do Laboratório de Química de Produtos Naturais (LQPN, QMC, UFSC), pela orientação, pelos conselhos, pela confiança. À Drª. Ana Maria Costa, pesquisadora da Embrapa Cerrados e Coordenadora da Rede Passitec, pelo fornecimento de sementes, frutos e mudas das espécies estudadas e pelo apoio, em todas as fases desse estudo. Ao Prof. Dr. Marcelo Maraschin do Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento e Genética Vegetal (CCA, UFSC), por estar sempre aberto a colaborações com nosso grupo de pesquisa e ao grupo de pesquisa do mesmo pela atenção dada a mim, especialmente à Drª. Fernanda Ramlov e a Drª. Eva Regina Oliveira, pela iniciação nas análises bioquímicas, pelo aprendizado e incentivo. Também a todas as gurias do laboratório pelos momentos de descontração e aprendizagem. À Drª. Simone Mazzutti por ter realizado as extrações supercríticas do material deste trabalho, também pelos ensinamentos. À Profª. Drª. Sandra Regina Salvador Ferreira do Laboratório de Termodinâmica e Tecnologia Supercrítica – LATESC do Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos da UFSC, por permitir que fizéssemos as extrações supercríticas. Ao Prof. Dr. Eduardo Carasek e a Franciele do Laboratório de cromatografia e espectrometria atômica (QMC, UFSC), pelas análises de compostos voláteis deste trabalho. Ao Prof. Dr. Mario Steindel e a Drª. Milene do Laboratório de Protozoologia (MIP, UFSC), pela disponibilidade e parceria para realização dos testes de atividade biológica contra agentes etiológicos. À Profa. Drª. Susana Johann da Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG, pela realização do ensaio de atividade antifúngica. À Profa. Drª. Michelle Debiasi da FURB e às alunas Bruna Veiga e Camila Paganelli, pela realização do ensaio de atividade antibacteriana. Aos Prof. Dr. Luciano Vitali e Gustavo Amadeu Micke aos Doutorandos (as) Ana Paula Ruani e Diogo Siebert do Laboratório de Eletroforese Capilar (LabEC) pelas análises e ajuda na interpretação dos dados LC-MS/MS, deste trabalho. Ao Prof. Dr. Faruk Jose Nome Aguilera (in memoriam) Laboratório Catálise e Fenômenos Interfaciais (LACFI) do Departamento de Química da UFSC, pela disponibilização do equipamento para realização das análises. À Profa. Drª. Ana Claudia Rodrigues e à Profa. Drª Makeli Gariboti Lusa do Laboratório de Anatomia Vegetal (BOT, UFSC), pelo ensinamento da técnica de histoquímica dos calos. Ao pesquisador Antonio Gomes Soares da Embrapa Agroindústria de Alimentos do Rio de Janeiro, por ajudar nas diversas dúvidas referentes aos compostos voláteis. Agradeço aos meus companheiros do Laboratório de Fisiologia Vegetal, Fábio, Letícia e Gustavo. Ao pessoal da Química, Marcos (Birante), Chico, Luiz Felipe, Leandro (Leko), Laís, Baiano e Maranha, foi um prazer conviver com todos vocês. Agradeço à Ana Paula Ruani, Dalila Venzke (mamis), Larissa Sens (mana), Eva Regina, Tiago Tizziani, Valdelucia Grinevicus, Isadora, Carolina, Igor, Débora e Daniela por ser minha família, pelo incentivo, companheirismo, aprendizado e pelas boas risadas. À Joana e à Kamila, pela amizade que germinou na graduação e ainda permanece na lavoura da amizade, também à Daiana, Andressa e aos demais amigos pelo carinho e companheirismo. E por fim, agradeço à Embrapa Cerrados, ao Programa de Pós- graduação em Biotecnologia e Biociências da UFSC e ao CNPq e CAPES, por fomentarem essa pesquisa. Agradeço à banca examinadora, pelas contribuições ao trabalho aqui apresentado. “Para termos uma noção do pouco que valemos, basta subtrair ao que somos o que aprendemos, o que lemos, o que vivemos com os outros. É só ver o que fica. Coisa pouca. Sozinho quase ninguém é quase nada. É somente juntos que podemos ser alguma coisa.” Miguel Esteves Cardoso Muito obrigada! Daiane “Eu me lembrei de que o mundo real era amplo e que uma infinidade de esperanças e temores, sensações e empolgações aguardavam os que tinham coragem de adentrar sua vastidão, buscar o verdadeiro conhecimento da vida, em meio aos seus perigos.” Charlotte Brontë, Jane Eyre RESUMO Passiflora tenuifila Killip. e Passiflora setacea DC são espécies nativas predominantes nos biomas brasileiros Cerrado, Mata Atlântica e Caatinga, selecionadas para o programa de melhoramento genético da Embrapa Cerrados, por apresentarem características importantes como produção de frutos de qualidade, genes de resistência a doenças (Xanthomonas axonopodis e Cladosporium herbarum) e propriedades toxicológicas, medicinais e bioquímicas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a produção de fenólicos totais, flavonoides, carotenoides, terpenos e as atividades antioxidante e biológica de culturas in vitro de calos, em diferentes condições de cultivo e comparar com os extratos de folhas, pericarpos e sementes de P. tenuifila e P. setacea. Os calos de segmentos de raiz, hipocótilo, nó cotiledonar, cotilédone, nó foliar e epicótilo de P. setacea foram cultivados em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose ou frutose; 2,5 µM de 2,4-D e 2 g.L-1 de Phytagel. Os calos de sementes imaturas e de segmentos de caules de P. tenuifila foram cultivados, respectivamente, em 88,5 mM de sacarose; 2,5 µM de 2,4-D e 2 g.L-1 de Phytagel ou em 88,5 mM de sacarose ou frutose; 2,5 µM de ANA e 2 g.L-1 de Phytagel. A elicitação dos calos foi realizada com a adição de 500 µl de solução aquosa de 145 µM de ácido salicílico às culturas. Após os ciclos de cultivo os calos foram submetidos à extração e analisados pelos métodos colorimétricos de Folin Ciocalteu (fenólicos totais) e cloreto de alumínio (flavonoides). A identificação dos compostos fenólicos, carotenoides e terpenos presentes nos extratos foi realizada através de LC-ESI/MS/MS, CLAE e HS-SPME/GC/MS, respectivamente. A atividade antioxidante foi avaliada através da capacidade sequestradora de radicais livres (DPPH) e poder redutor (redução do íon férrico). A atividade antimicrobiana dos extratos de calos, pericarpos, sementes e folhas foi avaliada contra as cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, atividade antifúngica contra cepas de Cryptococcus gattii e C. neoformans; Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis e Paracoccidioides brasiliensis- Pb18 e atividade antiprotozoária, nas forma promastigota, da espécie de Leishmania amazonenses e na forma tripomastigota da espécie Trypanosoma cruzi. Os calos de sementes imaturas P. tenuifila, em sacarose apresentaram os maiores níveis de fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante, mas a produção de luteína foi maior nas culturas de calos de segmentos de caule. Os calos de segmentos caulinares, em frutose e elicitados exibiram os maiores teores de fenólicos totais e a maior atividade antioxidante. Em sacarose, os calos elicitados de cotilédone de P. setacea apresentaram os maiores conteúdos de fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante e os calos elicitados de nó cotiledonar, o maior conteúdo de luteína. Os extratos das sementes de P. tenuifila e P. setacea apresentaram maiores teores de fenólicos e maior potencial antioxidante e os extratos de folhas os maiores níveis de flavonoides. Os extratos