Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Incorporation of pyrrolysine derivatives into proteins and development of bioorthogonal protein modification methods Michael Johannes Gattner aus München 2018 Erklärung Diese Dissertation wurde im Sinne von §7 der Promotionsordnung vom 28. November 2011 von Herrn Prof. Dr. Thomas Carell betreut. Eidesstattliche Versicherung Diese Dissertation wurde eigenständig und ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet. Mannheim, den 21. Juli 2018 Michael J. Gattner Dissertation eingereicht am 27. Dezember 2018 1. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Carell 2. Gutachterin: Prof. Dr. Anja Hoffmann-Röder Mündliche Prüfung am 21. Februar 2019 Parts of this thesis were published: Publications: Gattner, M. J., Vrabel, M. & Carell, T. Synthesis of ε-N-propionyl-, ε-N-butyryl-, and ε-N- crotonyl-lysine containing histone H3 using the pyrrolysine system. Chem. Commun. 49, 379–381 (2013). Schneider, S., Gattner, M. J., Vrabel, M., Flügel, V., López-Carrillo, V., Prill, S. & Carell, T. Structural insights into incorporation of norbornene amino acids for click modification of proteins. ChemBioChem 14, 2114–2118 (2013). Vrabel, M., Kölle, P., Brunner, K. M., Gattner, M. J., López-Carrillo, V., de Vivie-Riedle, R. & Carell, T. Norbornenes in inverse electron-demand Diels-Alder reactions. Chemistry 19, 13309–13312 (2013). Gattner, M. J., Ehrlich, M. & Vrabel, M. Sulfonyl azide-mediated norbornene aziridination for orthogonal peptide and protein labeling. Chem. Commun. 50, 12568–12571 (2014). Ehrlich, M., Gattner, M. J., Viverge, B., Bretzler, J., Eisen, D., Stadlmeier, M., Vrabel, M. & Carell, T. Orchestrating the biosynthesis of an unnatural pyrrolysine amino Acid for its direct incorporation into proteins inside living cells. Chemistry 21, 7701–7704 (2015). Datz, S., Argyo, C., Gattner, M., Weiss, V., Brunner, K., Bretzler, J., Schirnding, von, C., Torrano, A. A., Spada, F., Vrabel, M., Engelke, H., Bräuchle, C., Carell, T. & Bein, T. Genetically designed biomolecular capping system for mesoporous silica nanoparticles enables receptor-mediated cell uptake and controlled drug release. Nanoscale 8, 8101–8110 (2016). Further publication: Flühe, L., Knappe, T. A., Gattner, M. J., Schäfer, A., Burghaus, O., Linne, U. & Marahiel, M. A. The radical SAM enzyme AlbA catalyzes thioether bond formation in subtilosin A. Nat. Chem. Biol. 8, 350–357 (2012). Danksagung An dieser Stelle möchte ich einigen Menschen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Zuallererst danke ich meinem Doktorvater Prof. Thomas Carell, der mir die Möglichkeit gab, in seiner Arbeitsgruppe in einem spannenden Forschungsgebiet zu arbeiten. Ich bedanke mich für die vielseitige Themenstellung, interessante Diskussionen und Anregungen, das entgegengebrachte Vertrauen und die Bereitstellung exzellenter Arbeitsbedingungen. Die hier erlernten Fähigkeiten haben es mir erlaubt, meinen angestrebten Weg als Wissenschaftler in der Industrie zu gehen. Ich danke den Mitgliedern meiner Prüfungskommission für die Evaluierung meiner Arbeit. Bei Frau Prof. Dr. Hoffmann-Röder möchte ich mich herzlich für die Übernahme der Zweitkorrektur bedanken. Für die Unterstützung bei organisatorischen Belangen bedanke ich mich bei Slava Gärtner, Sabine Voß und Kerstin Kurz. Für das sorgfältige Korrekturlesen dieser Arbeit bedanke ich mich ganz herzlich bei Dr. Veronica Lopez Carrillo, Dr. Markus Müller, Dr. Michael Ehrlich und Dr. Milan Vrabel. Ein großer Dank geht an Dr. Markus Müller für seine Hilfe und Unterstützung in allen biochemischen Fragestellungen. Außerdem bedanke ich mich bei ihm, bei Dr. Emine Kaya und bei Dr. Christian Deiml für die Einführung in das spannende Thema. Besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Milan Vrabel, der mich stets mit frisch synthetisierten unnatürlichen Aminosäuren versorgt hat. Durch wissenschaftliche Diskussionen und sein unglaubliches Durchhaltevermögen inspirierte und motivierte er mich und trug maßgeblich zu dieser Arbeit bei. Milan, ich wünsche Dir weiterhin alles gute auf dem steinigen Weg zum Professor. Auch bei Dr. Michael Ehrlich möchte ich mich herzlich für die Zusammenarbeit bedanken. Die Synthese des D-Ornithin-Derivats hatte sich als herausfordernder herausgestellt, als wir ursprünglich annahmen. Es freut mich, dass wir das Projekt gemeinsam zum erfolgreichen Ende brachten. Ich danke Dr. Christian Argyo und Dr. Stefan Datz und deren Gruppenleiter Prof. Thomas Bein für die gute Zusammenarbeit. Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe danke ich für eine ausgesprochen angenehme Atmosphäre. Es hat Spaß gemacht, Teil dieser Gruppe zu sein. Nicht nur die gute Zusammenarbeit im Labor, sondern auch viele außeruniversitäre Unternehmungen bleiben mir im Gedächtnis. Da waren feuchtfröhliche Bootsausflüge, ausgiebige Wiesnbesuche, üppige Weißwurstfrühstücke, ausgelassene Caferaumparties und gemütliche Feierabendbiere, um nur einige zu nennen. Auch das wöchentliche Fußballspiel zusammen mit einigen Kollegen aus dem Genzentrum war eine willkommene Ablenkung vom meistens aufregenden, manchmal aber auch frustrierenden Laboralltag. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinen ehemaligen Arbeitskreis- Kollegen, jetzt Freunden Dr. Dorothea Matschkal, Dr. Ines Pfaffeneder, Dr. Sandra Koch, Dr. Felix Gnerlich, Dr. Martin Münzel, Dr. Michael Ehrlich, Dr. Toni Pfaffeneder, Dr. Caterina Brandmeyer, Dr. Stefan Prill, Dr. Mirko Wagner, Dr. Michael Ehrlich und Dr. Milan Vrabel. Ein besonderer Dank gebührt meinen Eltern und meiner Schwester, die mich im Studium und in meiner Promotionszeit aber auch danach moralisch und finanziell unterstützt haben und mich auch danach immer wieder motiviert haben, die Arbeit abzuschließen. Der letzte und größte Dank geht an Dr. Veronica Lopez Carrillo, meine ehemalige Kollegin, jetzt Verlobte und Mutter unserer wunderbaren Tochter Inara. Danke, dass Du Dich für einen PostDoc-Aufentahlt in der Carell-Gruppe entschlossen hast und Danke für Deine Unterstützung während des Anfertigens dieser Arbeit. Te quiero bonita! Table of Contents 1 Summary ......................................................................................................................................................... 13 2 Zusammenfassung ....................................................................................................................................... 16 3 Abbreviations ................................................................................................................................................ 19 4 Introduction ................................................................................................................................................... 22 4.1 Natural expansions of the genetic code ...................................................................................................... 22 4.1.1 The 20 canonical amino acids .................................................................................................................. 22 4.1.2 Selenocysteine, the 21st proteinogenic amino acid ............................................................................ 23 4.1.3 Pyrrolysine, the 22nd proteinogenic amino acid ................................................................................ 26 4.2 Incorporation of NCAAs into proteins ........................................................................................................ 31 4.2.1 Applications of unnatural amino acids in proteins ............................................................................ 31 4.2.2 Site-specific, genetically encoded incorporation of NCAAs ........................................................... 35 4.3 Bioorthogonal modifications of unnatural pyrrolysine homologs ..................................................... 46 4.3.1 Bioorthogonality and practical aspects of protein labeling strategies ......................................... 46 4.3.2 Ketone-hydrazide/hydroxylamine reactions ....................................................................................... 47 4.3.3 Staudinger ligations .................................................................................................................................... 48 4.3.4 Azide-alkyne reactions ............................................................................................................................... 50 4.3.5 Inverse electron-demand Diels-Alder cycloadditions ...................................................................... 52 4.3.6 Desmethylpyrrolysine-aminobenzaldehyde ligations ..................................................................... 54 4.3.7 Other ligation methods .............................................................................................................................. 55 5 Literature of the introduction ................................................................................................................... 56 6 Aims of the thesis ......................................................................................................................................... 74 7 Original publications .................................................................................................................................. 75 7.1 Synthesis of ε-N-propionyl-, ε-N-butyryl-, and ε-N-crotonyl-lysine containing histone H3 using the pyrrolysine system ........................................................................................................................