INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Detalhamento morfológico e análise da expressão proteica do nematoide Angiostrongylus costaricensis em suas diferentes fases evolutivas Karina Mastropasqua Rebello Orientador(es): Dra. Ana Gisele da Costa Neves Ferreira Dr. Henrique Leonel Lenzi (in memoriam) RIO DE JANEIRO ANO 2012 INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Karina Mastropasqua Rebello Detalhamento morfológico e análise da expressão proteica do nematoide Angiostrongylus costaricensis em suas diferentes fases evolutivas Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Celular e Molecular Orientador(es): Dra. Ana Gisele da Costa Neves Ferreira Dr. Henrique Leonel Lenzi (in memoriam) RIO DE JANEIRO ANO 2012 ii Rebello, Karina Mastropasqua Detalhamento morfológico e análise da expressão proteica do nematoide Angiostrongylus costaricensis em suas diferentes fases evolutivas./Karina Mastropasqua Rebello.- Rio de Janeiro: 2012. xviii, 131f. Tese (Doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e Molecular, 2012. 1.Angiostrongylus costaricensis.2.Morfologia.3.Proteômica.4.Proteases. I.Título iii INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular AUTOR: Karina Mastropasqua Rebello TÍTULO DA TESE Detalhamento morfológico e análise da expressão proteica do nematoide Angiostrongylus costaricensis em suas diferentes fases evolutivas ORIENTADOR (ES): Dra. Ana Gisele da Costa Neves Ferreira Dr. Henrique Leonel Lenzi (in memoriam) Aprovada em: 31/07/2012 EXAMINADORES: Dr. Delir Corrêa Gomes Maués da Serra Freire - Presidente Dr. Carlos Graeff Teixeira Dra. Leila Maria Lopez Bezerra Dra Patrícia Cuervo Escobar - suplente Dr. Marcelo Machado Pelajo - suplente Rio de Janeiro, 31 de Julho de 2012 iv Dedico aos meus pais Adelino e Sandra e aos meus irmãos Rodrigo e Fernanda e Ao meu querido e eterno orientador Dr. Henrique Lenzi (in memoriam) v Tantas vezes pensamos ter chegado, tantas vezes é preciso ir além. Fernando Pessoa vi Agradecimentos Ao Mestre e querido orientador Dr. Henrique Lenzi (in memoriam), pela amizade, maravilhosa convivência, inúmeros ensinamentos, histórias regadas a chás e biscoitos... enfim, por tudo. Obrigada por ter tido o privilégio de ser sua aluna. À minha orientadora Dra. Ana Gisele Costa Neves Ferreira, pela orientação, confiança, paciência, imenso auxílio principalmente no final da tese, estímulo e por todo o aprendizado durante esta caminhada científica. Aos meus pais Adelino e Sandra, meus eternos incentivadores, pelo amor e apoio incondicionais e aos meus irmãos Rodrigo e Fernanda, que estão sempre vibrando com cada conquista minha. Ao Dr. Richard Hemmi Valente, pelo incentivo à pesquisa, pelas incontáveis contribuições durante a realização desta tese e nos artigos dela resultantes. Ao Dr. Jonas Perales, por todo apoio científico, amizade e incentivo durante a elaboração deste projeto. À Dra. Ester Maria Mota, pelos ensinamentos e esclarecimentos sobre o Angiostrongylus costaricensis e por todo auxílio para a realização desta tese. À Dra. Aleksandra Oliveira Menezes, pela amizade, colaboração científica e imensa ajuda com a análise dos resultados desta tese. Ao Dr. James McKerrow, por me aceitar em seu laboratório na UCSF para realização do meu doutorado sanduíche em São Francisco, Califórnia. À minha amiga Daniela Beghini, pelos inúmeros ensinamentos das técnicas proteômicas, pela amizade eterna, pela ótima convivência no laboratório e pela ajuda no desenvolvimento desta tese. Aos Drs. Alex Donat Chapeaurouge (Henk) e André Texeira (Pink), pelo auxílio na utilização do espectrômetro de massas. Às minhas ex-alunas de iniciação científica Caroline Siqueira e Erika Ribeiro que me auxiliaram na elaboração de alguns experimentos desta tese. Aos amigos e ex-companheiros de laboratório André Gubler e Thayssa Gusmão, pela amizade, divertida convivência e inestimável ajuda nos zip-tips no início deste trabalho. Às amigas e companheiras de laboratório Joelma Saldanha, Viviane Tostes e Monique Nunes, pelo apoio técnico para realização deste trabalho, amizade e convivência maravilhosa. Ao amigo Rubem Mena Barreto, pela amizade, divertida convivência e colaboração científica. vii À amiga Claudia d´Avila Levy, pela amizade, ensinamentos, colaboração científica e revisão da tese. Ao Dr. Marcelo Pelajo, pela revisão da tese e pelo apoio para a realização do projeto. Ao Dr Paulo Carvalho pelo imenso auxílio nas análises dos resultados de espectrometria de massas. Aos colegas de laboratório Aline Garcia, Viviane Bastos, Giselle Brunoro, Surza Lucia, Monique Trugilho, Carolina Nicolau, Karen Trinta, Tamires Souza, Priscila Brandão e Matheus Tempone, pela convivência. Às técnicas do Laboratório de Patologia do IOC responsáveis pela manutenção do ciclo do A. costaricensis e pela manutenção do biotério: Andréa da Silva, Iolanda Pedro, Juciara de Souza e Thatiane Cristina Barros. Ao Laboratório de Biologia de Helmintos Otto Wucherer da UFRJ e seus integrantes, pela colaboração científica imprescindível na parte de microscopia. À amiga Claudia Calvet, pela maravilhosa convivência durante o meu doutorado sanduíche na UCSF e por toda ajuda na ambientação ao laboratório. Ao amigo Dan Sjoka, pela imensa ajuda durante a minha estada na UCSF com os experimentos e ambientação no laboratório. Aos meus avós Othello e Francisca (in memoriam) que sempre rezaram por mim e sempre se orgulharam da neta cientista. À Plataforma de Microscopia Eletrônica do Instituto Oswaldo Cruz (IOC-FIOCRUZ), pela aquisição das belíssimas imagens de microscopia eletrônica de varredura. À Plataforma de Microscopia Confocal Eletrônica do Instituto Oswaldo Cruz (IOC- FIOCRUZ), pela aquisição das imagens de microscopia de luz e confocal. Em especial, agradeço ao Igor José da Silva, técnico responsável por operar o microscópio. À Coordenação do Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular do Instituto Oswaldo Cruz, pelo apoio e suporte financeiro em eventos científicos. À agência de fomento CAPES, pela minha bolsa de estudos durante o doutorado dentro e fora do país (PDSE). viii Lista de Figuras Figura 1: Ciclo biológico do Angiostrongylus costaricensis......................................... 8 Figura 2: Corte histológico longitudinal da região anterior de verme adulto de A. costaricensis mostrando o esôfago e o intestino, este último contendo sangue 45 (Giemsa, barra 500 µm)........................................................................................................ Figura 3: Corte histológico de fêmea adulta. (A) Corte transversal de A. costaricensis mostrando dois ovários contendo ovos maduros e o intestino (HE, barra 500 µm); (B) Corte longitudinal mostrando dois ovários e o intestino (Giemsa, 46 barra 500 µm)......................................................................................................................... Figura 4: Fêmea adulta de A. costaricensis. (A) Útero repleto de ovos maduros e o intestino com epitélio ciliado (Reticulina, barra 500 µm); (B) corte lateral evidenciando o intestino e o útero contendo ovos (Giemsa, barra 500µm); (C) Corte 47 lateral mostrando ovos fertilizados contendo casca no interior do útero (Giemsa, barra 500 µm)............................................................................................................. Figura 5: Vermes adultos de A. costaricensis. Fêmea (A) e Macho (B) (barra 500 µm). (A) Foto de uma fêmea mostrando vulva e ânus; (B) Foto de um macho evidenciando a bolsa copuladora formada por raios bursais (v.v.- ventro ventral, v.l.- 48 ventro lateral, l.a.- lateral anterior, l.p.- lateral posterior, d.e.- dorsal externo, d – dorsal) e dois espículos em seu interior ............................................................................. Figura 6: Fotos de campo claro de ovos (barra 500 µm). (A) e (B) ovos fertilizados contendo casca; (C) ovo não fertilizado....................................................................... 49 Figura 7: Foto de campo claro de espermatozoides (barra 500 µm).......................... 49 Figura 8: Cortes histológicos de macho adulto (A) Corte transversal mostrando o testículo e o intestino (HE, barra 500 µm); (B) Corte longitudinal mostrando a porção anterior do testículo (t) contendo espermatídes e o intestino (i) (HE, barra 50 500 µm)....................................................................................................................... Figura 9: Cortes histológicos da porção posterior de machos adultos. (A) bolsa copuladora repleta de espermatozoides (Giemsa, barra 500 µm); (B) evidenciação dos espículos (s), gubernáculo (g) e da cloaca (c) (SR, barra 500 51 µm)............................................................................................................................. Figura 10: (A) / (C) Larvas de primeiro estágio (L1); (B) / (D) Larvas de terceiro estágio (L3). (A) projeção tridimensional de L1 evidenciando o interior da larva repleto de grânulos onde só é possível indicar a localização do ânus, (B) Corte tomográfico de L3 evidenciando um interior mais diferenciado, onde podemos 52 observar claramente o intestino e os ovários tubulares, além da abertura anal, (C) corte histológico de L1, (D) corte histológico de L3...................................................... Figura 11: Porção posterior da fêmea adulta recém fecundada. (A) corte tomográfico mostrando a vulva e o canal uterino repleto de espermatoizes (e) e o útero com ovos fecundados