FUNKTIONELLE UND STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DES OVASTACINS IN VIVO UND IN VITRO Dissertation zur Erlangung des Grades ‚Doktor der Naturwissenschaften‘ Am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Vorgelegt von André Hildebrand geboren am 16.01.1979 in München Mainz, März 2013 Gutachter: Dekan: 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatter: Tag der mündlichen Prüfung: 24.07.2013 Für meine Familie. INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung ............................................................................................ 1 2. Einleitung ........................................................................................................... 2 2.1 Proteasen ............................................................................................................ 2 2.2 Serinproteasen .................................................................................................... 4 2.2.1 Elastase .............................................................................................................. 5 2.2.2 Trypsin ................................................................................................................ 6 2.3 Metalloproteasen ................................................................................................. 7 2.3.1 MMPs .................................................................................................................. 7 2.3.2 Astacine .............................................................................................................. 9 2.3.3 Ovastacin ...........................................................................................................10 2.4 Inhibitoren ..........................................................................................................13 2.4.1 Fetuine ...............................................................................................................13 2.5 Oogenese und Reifung der Eizellen ...................................................................14 2.5.1 Aufbau der Oocyten und Spermien ....................................................................15 2.5.2 Fertilisation von Oocyten ....................................................................................16 2.5.3 Embryonalentwicklung von Mus musculus .........................................................17 2.6 Ziele der Arbeit ...................................................................................................18 3. Material und Methoden ....................................................................................19 3.1 Verwendete Geräte und Chemikalien .................................................................19 3.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .....................................................................20 3.3 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................22 3.4 Restriktion ..........................................................................................................23 3.5 Ligation ..............................................................................................................24 3.6 Transformation - Einschleusung fremder DNA in Bakterien ................................25 3.7 Eukaryotische Zellkultur .....................................................................................27 3.7.1 Baculovirus-Expressionssystem .........................................................................27 3.7.2 Sf9-Zellen ...........................................................................................................30 3.7.3 HighFive-Zelllen .................................................................................................30 3.7.4 CHO-Zellen zur Expression von Pro-Ovastacin-Strep ........................................31 3.7.5 HEK-293-Zellen zur Expression von Pro-Ovastacin-Strep ..................................32 3.7.6 Transfektion .......................................................................................................32 3.8 Antikörperherstellung .........................................................................................33 3.9 Ermittlung der Proteinkonzentration ...................................................................34 3.10 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ..............................................................35 3.11 Western-Blot (Semi-dry Verfahren) ....................................................................36 I INHALTSVERZEICHNIS 3.12 Immunologischer Nachweis von Proteinen mittels Chemilumineszenz ...............37 3.13 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................................41 3.14 Zymographie-Gelelektrophorese ........................................................................42 3.15 Native Zymographie-Gelelektrophorese .............................................................42 3.16 Coomassie Brillant Blue-Färbung .......................................................................42 3.17 Reinigung ...........................................................................................................44 3.17.1 Ammoniumsulfat-Fällung ....................................................................................44 3.17.2 Dialyse ...............................................................................................................44 3.17.3 Affinitätschromatographie über Strep-Tactin ......................................................44 3.17.4 Gelchromatographie über Hema Bio 1000 .........................................................45 3.18 Herstellen von Zelllysaten ..................................................................................46 3.19 Herstellung von Organlysaten ............................................................................47 3.20 Limitierte Proteolyse ...........................................................................................48 3.21 FRET-Assay .......................................................................................................49 3.22 pH Abhängigkeit der Aktivierung von Pro-Ovastacin-Strep .................................51 3.23 Sequenz-Alignments und Modellierung von Pro-Ovastacin ................................52 3.24 Superovulation von Mäuseeizellen .....................................................................52 3.25 Präparation der Eileiter aus FVB Mäusen ...........................................................52 3.26 Entnahme der Zygoten .......................................................................................53 3.27 Vorbereitung der Zygoten für die Kultivierung ....................................................54 3.28 In vitro-Kultivierung der Zygoten .........................................................................55 3.29 Immunhistochemischer Antikörpertest mit Sf9-Zellen .........................................55 3.30 Antikörperbehandlung und Fixierung von Embryonen ........................................56 3.31 Transmissions‐Elektronenmikroskopie (TEM) ....................................................58 4. Ergebnisse ........................................................................................................59 4.1 Herstellung der DNA-Konstrukte für die Expression ...........................................59 4.1.1 Ovastacin-Strep .................................................................................................59 4.1.2 Ovastacin-Kat-Strep ...........................................................................................62 4.1.3 Zusammenfassung der Klonierung der 3 Ovastacin-Varianten ...........................65 4.2 Nachweis der Ovastacin mRNA in HUVEC Zellen ..............................................65 4.3 Herstellung eines polyklonalen Anti-Pro-Ovastacin Antiserums ..........................67 4.4 Expression und Reinigung von Ovastacin-Strep .................................................67 4.5 Expression und Reinigung von Ovastacin-Kat-Strep ..........................................69 4.6 Expression und Reinigung von Pro-Ovastacin-Strep ..........................................71 4.7 Massenspektrometrische Analyse und N-terminale Sequenzierung ...................73 4.8 Untersuchung der Oligomerisierung von Pro-Ovastacin .....................................74 4.9 Stabilität des Pro-Ovastacins in Abhängigkeit von pH-Wert und Temperatur .....77 II INHALTSVERZEICHNIS 4.10 Aktivierung von Pro-Ovastacin-Strep ..................................................................81 4.10.1 Sequenzalignment und Homologiemodellierung zur Identifizierung der potenziellen Aktivierungsschnittstelle des Pro-Ovastacins..................................81 4.10.2 Aktivierung von Pro-Ovastacin mit MMP-2 .........................................................86 4.10.3 Aktivierung von Pro-Ovastacin-Strep mit Trypsin ...............................................87 4.10.4 Aktivierung von Pro-Ovastacin mit neutrophiler Elastase ...................................89 4.10.5 Interaktion von Pro-Ovastacin mit Proteaseninhibitoren .....................................94 4.10.6 Massenspektrometrische Analyse und N-terminale Sequenzierung des aktivierten Ovastacins..................................................................................95 4.11 Nachweis von Ovastacin in Geweben ................................................................96 4.12 Expression von Pro-Ovastacin in Cho-K1-Zellen ................................................97