Effect-directed identification and fate analysis of potent antiandrogenic coumarin derivatives in a central European river Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Chemiker Matthias Muschket aus Bad Salzungen Berichter: Prof. Dr. rer. nat. Henner Hollert PD Dr. rer. nat. Werner Brack Tag der mündlichen Prüfung: 07.09.2018 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Universitätsbibliothek verfügbar. ii Erklärung Die vorliegende Dissertation wurde im Department wirkungsorientierte Analytik des UFZ - Helmholtz Zentrum für Umweltforschung in Zusammenarbeit mit dem Lehr- und Forschungsgebiet für Ökosystemanalyse des Institutes für Umweltforschung (Biologie V) der RWTH Aachen unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. Henner Hollert und Herrn PD Dr. Werner Brack angefertigt. Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Doktorarbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Alle Textauszüge und Grafiken, die sinngemäß oder wörtlich aus veröffentlichten Schriften entnommen wurden, sind durch Referenzen gekennzeichnet. Matthias Muschket Aachen, den 02. Juli 2018 iii iv Abstract Surface waters are adversely affected by the discharge of wastewater that is containing numerous anthropogenic micropollutants. In consequence, endocrine disrupting effects like androgenicity and antiandrogenicity are frequently observed in the aquatic environment. Even if a large list of androgen axis disruptors is available, linking of adverse effects to responsible chemicals is hampered by a great share of this compound group, which is remaining unknown. Structure elucidation of these “unknowns” in environmental mixtures of typically thousands of compounds is extremely challenging even despite powerful tools like effect-directed analysis (EDA) are available. In this thesis, a novel, multidimensional fractionation approach was developed to support EDA of surface waters with endocrine disrupting activity. In chapter 2, four reversed phases were selected with a focus on the separation of androgens and antiandrogens. To this end, a representative mixture of 39 endocrine disrupting compounds (EDCs) was separated on a set of 17 columns with widely differing bond chemistries. After exclusion of columns with poor peak shapes and chromatographic resolution those stationary phases displaying the highest degree of orthogonal separation selectivity for EDCs were depicted using principal component analysis and Spearman rank correlation: aminopropyl-, octadecyl-, and pyrenyl ethyl silica phase. Additionally, a pentafluorophenyl silica phase was chosen due to promising results reported in the literature. A surface water sample with antiandrogenic activity was fractionated in parallel on the four selected columns. The resulting coverage of the virtual two-dimensional separation space with non-target peaks confirmed the high degree of orthogonality of the selected stationary phases. Besides, the separation of co-eluting isobaric compounds led to a 4.8fold increase of the number of detected peaks. Consequently, the fractionation system is facilitating the chemical identification of organic micropollutants by chemical target, suspect and non-target screening using high resolution mass spectrometry. In chapter 3, the established fractionation approach was applied to minimize the complexity of a surface water sample collected close to the effluent of a waste water treatment plant in the river Holtemme in Germany. In concert with a miniaturized luciferase reporter gene cell- based anti-AR-CALUX assay and LC-HRMS/MS non-target screening the highly potent antiandrogen 4-methyl-7-diethylaminocoumarin (C47), as well as the two less active v derivatives 4-methyl-7-ethylaminocoumarin (C47T1) and 4-methyl-7-aminocoumarin (C47T2) were identified. The measured in vitro effect was quantitatively confirming C47 as the major cause of antiandrogenicity. Furthermore the antiandrogenic activity of C47 was also observed in vivo in spiggin-gfp Medaka already at the concentration equal to the concentration in the non-concentrated water extract. The longitudinal and temporal distribution of C47 and its derivatives along the whole river stretch was investigated in chapter 4. A constant exposure of the aquatic ecosystem by the three antiandrogens was observed at all sites downstream of the wastewater treatment plant of Silstedt, which was identified as the continuous source that is releasing C47, C47T1 and C47T2 in the gram per day range. Moreover, all compounds were detected in sediment and biota represented by the ubiquitous species Gammarus pulex. In this context, an experimental evaluation did not confirm typically proposed hydrophobic interaction to organic carbon as the driving force of partitioning into sediment but suggested cation binding of these aromatic amines to sediment. Finally, the coumarin derivatives were assessed as persistent as C47 is solely partially degraded to the less antiandrogenic potent C47T1 and C47T2 in the WWTP while a further attenuation of the compounds within the river was solely attributed to dilution by groundwater inflow. vi Zusammenfassung Oberflächengewässer werden durch die Einleitung von Abwasser, das zahlreiche anthropogene Mikroverunreinigungen enthält, negativ beeinträchtigt. Infolgedessen werden in der aquatischen Umwelt häufig endokrine Effekte wie die Androgenität und Antiandrogenität beobachtet. Obwohl eine große Liste von Androgenen und Antiandrogenen bekannt ist, kann auftretenden hormonellen Aktivitäten häufig keine ursächliche Chemikalie zugeordnet werden. Die Strukturaufklärung bisher unbekannter endokriner Disruptoren in Umweltmischungen von typischerweise tausenden von Verbindungen ist trotz leistungsfähiger Werkzeuge wie der wirkungsorientierten Analyse (EDA) äußerst schwierig. In dieser Arbeit wurde ein neuartiger, mehrdimensionaler Fraktionierungsansatz zur Unterstützung der EDA von Oberflächengewässern mit endokriner Aktivität entwickelt. In Kapitel 2 wurden vier Umkehrphasen mit Schwerpunkt auf der Trennung von Androgenen und Antiandrogenen ausgewählt. Zu diesem Zweck wurde eine repräsentative Mischung von 39 endokrin wirksamen Verbindungen (EDCs) auf 17 Säulen chromatographisch getrennt. Nach Ausschluss von Säulen mit schlechter Peakform und chromatographischer Auflösung wurden die stationären Phasen mit der höchsten orthogonalen Trennleistung für EDCs mittels Hauptkomponentenanalyse und Spearman-Rankkorrelation ausgewählt: Aminopropyl-, Octadecyl- und Pyrenylethyl-Silica-Phase. Zusätzlich wurde eine Pentafluorphenyl-Silica-Phase entsprechend vielversprechender Ergebnisse aus der Literatur gewählt. Eine Oberflächenwasserprobe mit antiandrogener Aktivität wurde parallel auf den vier ausgewählten Säulen fraktioniert. Die daraus resultierende Deckung des virtuellen zweidimensionalen Trennraumes mit Non-target Peaks bestätigte die hohe Orthogonalität der ausgewählten stationären Phasen. Außerdem führte die Trennung von co-eluierenden isobaren Verbindungen zu einem 4,8-fachen Anstieg der Anzahl der detektierten Peaks. Das Fraktionierungssystem erleichtert somit die chemische Identifizierung von organischen Mikroverunreinigungen durch chemisches Target-, Suspect- und Non-target Screening mittels hochauflösender Massenspektrometrie. In Kapitel 3 wurde der etablierte Fraktionierungsansatz angewendet, um die Komplexität einer Oberflächenwasserprobe, welche in der Nähe des Abflusses einer Kläranlage in der Holtemme in Deutschland gesammelt wurde, zu minimieren. In Verbindung mit einem miniaturisierten anti-AR-CALUX-Assay und der Flüssigchromatographie-hochauflösenden vii Massenspektrometrie-Kopplung (LC-HRMS) wurden das hochwirksame Antiandrogen 4-Methyl-7-diethylaminocoumarin (C47) sowie die beiden weniger aktiven Derivate 4-Methyl-7-ethylaminocoumarin (C47T1) und 4-Methyl-7-aminocoumarin (C47T2) identifiziert. Der gemessene in vitro-Effekt bestätigte C47 als Hauptursache der Antiandrogenität. Darüber hinaus wurde die antiandrogene Aktivität von C47 auch in vivo in spiggin-gfp Medaka bereits in der Konzentration beobachtet, die der Konzentration im nicht konzentrierten Wasserextrakt entspricht. Die Längs- und Zeitverteilung von C47 und seinen Derivaten entlang der gesamten Flussstrecke wurde in Kapitel 4 untersucht. Eine konstante Belastung des aquatischen Ökosystems durch die drei Antiandrogene wurde an allen Standorten flussabwärts der Kläranlage von Silstedt beobachtet, die als kontinuierliche Quelle identifiziert wurde und C47, C47T1 und C47T2 im Gramm pro Tag Bereich freisetzt. Darüber hinaus wurden alle Verbindungen in Sedimenten und Biota der ubiquitären Spezies Gammarus pulex nachgewiesen. In diesem Zusammenhang bestätigte ein Verteilungsexperiment nicht die typischerweise angenommene hydrophobe Wechselwirkung mit organischem Kohlenstoff als Hauptursache für die Sorption dieser aromatischen Amine an Sediment, sondern wies auf Kationenbindung als treibende Kraft der Sorption hin. Schließlich wurden die Cumarinderivate als persistent beurteilt, da C47 in der Kläranlage nur teilweise zu den weniger aber dennoch antiandrogen wirksamen C47T1 und C47T2 abgebaut wird, während eine Konzentrationsabnahme der Verbindungen innerhalb des Flusses ausschließlich auf eine Verdünnung durch Grundwasserzufluss zurückzuführen ist. viii ix Contents List of Figures viii List of Tables xi List of Abbreviations xiv 1 Chapter 1 - Introduction