Analyse von Herkunft und funktioneller Aktivität humaner membranständiger Glucocorticoidrezeptoren vorgelegt von Diplom-Biochemikerin Cindy Strehl aus Berlin von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktorin der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Neubauer Berichter: Prof. Dr. Roland Lauster Berichter: Prof. Dr. Frank Buttgereit Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 24. Oktober 2011 Berlin 2011 D83 2 Meiner Familie... 3 4 „Wer A sagt, der muss nicht B sagen. Er kann auch erkennen, dass A falsch war.“ (Berthold Brecht 1898 – 1956) Der Jasager. Der Neinsager 1929 - 1930 5 Inhaltsverzeichnis 6 Inhaltsverzeichnis IInnhhaallttssvveerrzzeeiicchhnniiss 7 Inhaltsverzeichnis 8 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung........................................................................ 17 Abstract ....................................................................................... 19 1. Einleitung ................................................................................ 23 1.1 Hormone – die Botenstoffe des Körpers .................................................................................. 23 1.1.1 Allgemeines ....................................................................................................................... 23 1.1.2 Die Steroidhormone: Ein Grundgerüst - Unterschiedliche Wirkungen ............................ 24 1.1.2.1 Biosynthese und Regulation der Steroidhormone .................................................... 25 1.1.2.2 Einteilung der Steroidhormone und deren allgemeine Wirkung .............................. 26 1.2 Glucocorticoide......................................................................................................................... 28 1.2.1 Klinisch relevante Effekte von Glucocorticoiden .............................................................. 28 1.2.2 Das Wundermittel und seine Schattenseiten ................................................................... 31 1.2.3 Wirkmechanismen der Glucocorticoide ........................................................................... 32 1.2.3.1 Genomische GC Effekte werden durch einen cytosolischen Rezeptor vermittelt .... 32 1.2.3.2 Transaktivierung und Transrepression von Genen ................................................... 34 1.2.3.3 Schnelle Effekte von GC werden durch nicht-genomische Effekte vermittelt .......... 36 1.2.3.4 cGCR vermittelte nicht-genomische Wirkmechanismen von GC .............................. 37 1.2.3.5 Unspezifische Effekte entstehen durch Wechselwirkungen mit zellulären Membranen ............................................................................................................................... 37 1.2.3.6 Spezifische nicht-genomische GC Effekte werden durch den membranständigen GCR ausgelöst ................................................................................................................................... 38 1.2.4 Der membranständige Glucocorticoidrezeptor ................................................................ 38 1.2.4.1 Nachweismethode mittels hochsensitiver Immunfluoreszenzfärbung .................... 38 1.2.4.2 Vorkommen und klinische Relevanz des mGCRs ...................................................... 39 1.3 Vertreter der nukleären Hormonrezeptoren mit membranständigen Isoformen ................... 41 1.3.1 Der humane Östrogen- und Progesteronrezeptor ........................................................... 41 1.3.1.1 Proteinstruktur, Isoformen und Signalübertragung .................................................. 41 1.3.1.2 Durch Östradiol vermittelte nicht-genomische Effekte ............................................ 43 1.3.1.3 Nicht-genomische Progesteron Wirkung .................................................................. 44 1.4 Ableitung der Fragestellung ..................................................................................................... 49 9 Inhaltsverzeichnis 2. Material und Methoden .......................................................... 53 2.1 Material .................................................................................................................................... 53 2.1.1 Zelllinien und Bakterienstämme ...................................................................................... 53 2.1.2 Medien .............................................................................................................................. 54 2.1.3 Antikörper, Antikörperkonjugate und Beads .................................................................... 54 2.1.4 Plasmide, siRNA und Vektoren ......................................................................................... 55 2.1.5 Synthetische Oligonukleotide ........................................................................................... 56 2.1.6 Chemikalien, Antibiotika, Molekulargewichtstandards und Enzyme ............................... 57 2.1.7 Lösungen, Puffer und Kits ................................................................................................. 59 2.1.8 Geräte und sonstige Materialien ...................................................................................... 60 2.1.9 Software ............................................................................................................................ 62 2.2 Methoden ................................................................................................................................. 63 2.2.1 Mikrobiologische Methoden ............................................................................................ 63 2.2.1.1 Transformation .......................................................................................................... 63 2.2.1.2 Bakterienkultur .......................................................................................................... 63 2.2.2 Zellbiologische Methoden ................................................................................................ 63 2.2.2.1 Einfrieren und Auftauen von Zellen .......................................................................... 63 2.2.2.2 Kultivierung von adhärenten Zellen .......................................................................... 64 2.2.2.3 Kultivierung von Suspensionszellen .......................................................................... 64 2.2.2.4 Isolation mononukleärer Zellen aus humanem peripherem Blut (PBMCs) .............. 64 2.2.2.5 Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) primärer CD14+ oder CD4+ Zellen .... 65 2.2.2.6 Zellzahlbestimmung .................................................................................................. 66 2.2.2.6.1 Neubauer-Zählkammer ....................................................................................... 66 2.2.2.6.2 Casy Zellzählsystem ............................................................................................. 66 2.2.2.7 Transfektions- und Transduktionsmethoden ............................................................ 66 2.2.2.7.1 Transiente Transfektion zur Suppression der Genexpression mittels RNA- Interferenz (RNAi) .................................................................................................................. 66 2.2.2.7.2 Calcium-Phosphat-Transfektion von HEK 293T Zellen für Reportergenassay zum Nachweis der Reinheit und Stabilität von Dex-BSA via Luciferase- Reportergenassay ........ 66 2.2.2.7.3 Calcium-Phosphat-Transfektion von HEK 293T Zellen zur Herstellung von Virenpartikeln ........................................................................................................................ 67 2.2.2.7.4 Transduktion von HEK 293T Zellen ...................................................................... 67 2.2.2.8 Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung ........................................................................ 68 2.2.2.9 Hochsensitive Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis mGCR positiver Zellen .... 68 2.2.3 Molekularbiologische und biochemische Methoden ....................................................... 69 10 Inhaltsverzeichnis 2.2.3.1 RNA- und DNA-Analysen ........................................................................................... 69 2.2.3.1.1 Isolation von Plasmid-DNA .................................................................................. 69 2.2.3.1.2 Isolation von Total-RNA ....................................................................................... 69 2.2.3.1.3 Bestimmung der DNA-/RNA-Konzentration ........................................................ 70 2.2.3.1.4 Klonierung der verschiedenen pLL3.7 GCR sh Vektoren ..................................... 70 2.2.3.1.5 cDNA-Synthese .................................................................................................... 73 2.2.3.1.6 Genexpressionsanalyse mittels Real-Time-PCR .................................................. 73 2.2.3.1.7 Genexpressionsanalyse mittels Microarray ........................................................ 75 2.2.3.2 Proteinanalysen ......................................................................................................... 76 2.2.3.2.1 Proteinisolation nach Zelllyse – Gesamtzellextrakt ............................................ 76 2.2.3.2.2 Proteinisolation für eine Immunpräzipitation ..................................................... 76 2.2.3.2.3 Bestimmung