DOCTORAL THESIS 90) - 02 - 28 ( 2 47 . núm a Cataluny e d t Title neralita e G . d STRUCTURAL-FUNCTIONAL ANALYSIS OF LACTO-N-BIOSIDASE FROM Fun . Bifidobacterium bifidum: A POTENTIAL BIOCATALYST FOR THE Rgtre . ivada PRODUCTION OF HUMAN MILK OLIGOSACCHARIDES r P ó daci n Fu l Lul n Presented by Cristina Val Cid Ramo t ita s Univer 0 4 Centre IQS School of Engineering 90697 5 : G . C.I.F Department Bioengineering Directed by Dr. Magda Faijes and Dr. Antoni Planas C. Claravall, 1-3 08022 Barcelona Tel. 936 022 200 Fax 936 022 249 E-mail: [email protected] www.url.es A mis padres A Jaume “Quien no haya experimentado la irresistible atracción de la ciencia, no podrá comprender su tiranía” Frankenstein o el moderno Prometeo Mary Shelley ACKNOWLEDGEMENTS Quisiera expresar mi agradecimiento a todas las personas que han hecho posible que esté escribiendo estas líneas, tanto a las que me han acompañado en esta etapa, como a las que me inspiraron a empezarla; Al Dr. Toni Planas y a la Dra. Magda Faijes por llevar a cabo la dirección de este trabajo, y la confianza que depositaron en mí para realizarlo. Toni, gracias por permitirme formar parte de tu equipo de trabajo, por el conocimiento que has compartido y por todo lo que yo he aprendido. Magda, gracias por tu cercanía y tu motivación, tan necesaria en algunos momentos. Tu orientación y tu constancia han hecho de esta tesis un trabajo mejor. En definitiva, gracias por todo tu apoyo! A Teresa, Dra. Pellicer, mi madre científica, como tú sueles decir. Empecé contigo en esto de la “ciencia”, y mira hasta dónde hemos llegado! Porque contigo, y gracias a ti, he crecido tanto profesional como personalmente. Gracias por creer en mí, y, aunque no soy la primera que te lo dice, yo de mayor, quiero ser como tú! A mis compañeros de bioquímica, los que están y los que estuvieron, ha sido un inmenso placer compartir estos años con vosotros. A los Cristians, Calzada y Benedito, fue un primer año increíble allí abajo, gracias! A Ellen, por tu paciencia, por saber escuchar y por ser tan buena persona. A Montse, Nuria Abajo y Damián, por las tardes de risas. A Patri, por tu ayuda durante estos años. A Edu, a Xavi Turón y, a Xavi Pérez por la introducción al mundo de la analítica. A Marta Palomo y a Amanda por vuestro buen rollo. A Cris Alsina por tu disponibilidad para ayudar. A Laia y Nuria Orive que comienzan ahora esta aventura, mucha suerte! Y por último, pero no menos importante a mis compañeros de fatiga, a Javi, Oscar y Marta V. por compartir esta aventura juntos. Especialmente, a Victoria, un referente del lab, fuiste la primera persona que conocí en bioch y el buen rollo que me trasmitiste ese día, continúa hasta ahora. Admiro la pasión que tienes por la ciencia, y créeme, te llevará lejos! A Sergi, un grande, por tu empatía, tus consejos, tu amistad, has conseguido que en un grupo de enzimas, tus algas tengan un lugar privilegiado! A Carles, por tu ayuda, por nuestras charlas de compañeros de mesa, y porque… qué hubieran sido esos cafés sin tu “aportación”? A Hugo, por tu complicidad, por tu ayuda y por tu amistad, gracias por dejarme conocerte! A Estela, por tu paciencia, optimismo y entrega por los demás, y por esa sonrisa que nos alegra el día. A Xevi, Dr. Biarnés, por tu inestimable ayuda, tu aportación ha sido clave para esta tesis. Pero además, por tu optimismo, por tu buen humor, y por tu apoyo personal, que, aunque por modestia no reconozcas, yo lo he sentido, y te lo agradezco de corazón. A Régis, Dr. Fauré, despite only being together for six months, it was a pleasure to work next to you, I learnt a lot. Thanks for your empathy and your wise advice. A Marta Marszalek, my scientific sole mate (te lo cojo prestado), por tu apoyo, tu complicidad y tu amistad. Lo hemos compartido todo durante estos años, y aunque ahora sea de manera más esporádica, lo mejor es… que lo seguiremos haciendo! A estas cuatro fantásticas chicas por su colaboración en esta tesis, Annie, Sara, Mireia, ojalá pudieras continuar con este trabajo, y especialmente a Jenny, fuiste mi primer “estudiante” y fue un placer trabajar contigo. Aprendí mucho, y me alegra que, finalmente, nos haya quedado una bonita amistad. I A toda la gente que he conocido en IQS durante estos años, gracias por los buenos momentos. A Cris Castells y a Sejin, por vuestro apoyo y vuestra amistad, y porque, cuan necesario es tener otro punto de vista! A Lourdes, por las largas jornadas de escritura en la biblio, que sin ti, no hubieran sido divertidas! A la Dra. María José Hernáiz, por acogerme en su laboratorio para realizar la síntesis del sustrato clave de esta tesis, por su cercanía y por su orientación. También quisiera expresar mi agradecimiento a su equipo, en especial a Carlos y a Sara, por su ayuda y por hacerme sentir como en casa. Al Dr. Andrés Fernández, por confiar en mí, por acogerme en su equipo y por darme la oportunidad de desarrollar mi carrera profesional previa a mi etapa doctoral. Ésta, sin duda, me inspiró para aventurarme en este proyecto. A todos mis compañeros de Salvat, donde comenzó todo. A todos los que dedicaron parte de su tiempo a enseñar a la que empezó siendo la becaria. Qué buenos recuerdos guardo de aquella época! Y en especial, a las tres buenas amigas que me llevé, Teresa, Carmen López y Carme Alemany. Carmencita, gracias por todo! Por recogerme cada mañana para que no llegara tarde, por nuestras confidencias, por tu apoyo, y en definitiva, por tu amistad! A mis chicas de Ferrer, Nuria, Vanessa, Wilmar, Clara, Laia, Gemma y Marta N., mis happy deivis! por lo bien que lo pasamos juntas, por vuestro apoyo y vuestra amistad. A mis amigos, por su cariño, por su apoyo y su paciencia, menudos rollos me habéis aguantado cada sábado… María, Roger, por esos consejos locos!, Albert, Marta, la mejor psicóloga, Dani y en especial, Merca y Arantxa. Anxov eres como una hermana para mí. Mi BFF!, gracias por todos los momentos que hemos pasado juntas a lo largo de todos estos años, por comprenderme, por apoyarme y por estar siempre ahí! A mi familia política, especialmente, a Lola y a Jaime, por vuestra comprensión y cariño. A toda mi familia, por todo el cariño y apoyo que recibo de ellos, porque tengo mucha suerte de tener esta familia. A mi hermano Richi, por estar siempre a mi lado, aunque nos separen unos kilómetros, porque tienes el don de, siempre, hacerme reír, y… por esas peleas de bacterias! A mis tíos, Carlos y Ángela, porque sé que me mandáis toda la energía que podéis! A mi prima Tere, por tu apoyo incondicional. Y a mis abuelos, a mi yaya Regu, por preocuparte siempre por mí, por cuidarme y apoyarme, y a mi yayo Marce, que aunque ya no esté con nosotros, siempre me acompaña. A Jaume, por ser el pilar de mi vida. Por tu apoyo, tu cariño, tu paciencia y tu ayuda. Por animarme a emprender esta aventura, por acompañarme en el camino y por ayudarme a finalizarla. Mi querido Castle, esta tesis también es tuya! Y mi más profundo agradecimiento es para mis padres, Mª Antonia y Luis. Mamá, papá, no tengo palabras para agradeceros todo lo que habéis hecho por mí. Gracias por creer en mí, por vuestro cariño, vuestro apoyo, por ver siempre lo mejor de mí. Porque esta tesis ha sido posible gracias a vuestro esfuerzo y a la confianza que, día a día, depositáis en mí. Por esto y por mucho más, quiero dedicaros lo más valioso que he conseguido hasta el momento, esta Tesis. II SUMMARY The potential health benefits of human milk oligosaccharides (HMO) have been studied for many years. It is well known that these oligosaccharides provide a protective barrier and nutritive support that infants with poor access to breast milk do not acquire in the first years of life. Human milk is considered to be unique among mammals in terms of the quantity and complexity of its oligosaccharides. To date, 130 chemical structures within HMO have been identified. No other natural resources provide access to these complex oligosaccharides in such large amounts, and until now, large scale synthesis of HMO has not been possible by any traditional organic chemistry methodology. Enzymatic synthesis is an alternative synthetic tool since enzymes can form the new glycosidic linkage between carbohydrates with high regio- and stereoselectivity. The objective of this thesis is to evaluate the use of Lacto-N-biosidase from Bifidobacterium bifidum (LnbB) as an efficient biocatalyst in the following two ways: i) the structural-functional study of LnbB and ii) protein engineering of LnbB to generate biocatalysts able to synthesize the target lacto-N-tetraose. Here, we have analysed the domain organization of GH20 enzymes, and accordingly, have defined two models of domain architectures. Model A, contains at least two domains, a non- catalytic GH20b domain, and the catalytic GH20 which is always accompanied with an extra α- helix. In contrast, Model B consists only of the catalytic GH20 domain. By expressing different truncated forms of LnbB, we have described the structural requirements for functionality of GH20 enzymes, and in particular for LnbB, to obtain a minimal functional unit that retains the enzymatic activity. With regard to the synthesis of lacto-N-tetraose using new engineered LnbB proteins as biocatalysts, we envisage two different enzymatic strategies.