T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSÜK OTU (DIGITALIS SP.) BİTKİSİ KALLUS KÜLTÜRLERİNDE TUZLULUĞUN BÜYÜME VE FENOLİK MADDE KOMPOZİSYONUNA ETKİSİ Melike KEYFLİ DANIŞMAN Doç.Dr. Rağbet Ezgi DURAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ISPARTA - 2020 © 2020 [Melike KEYFLİ] İÇİNDEKİLER Sayfa İÇİNDEKİLER ....................................................................................................................... i ÖZET ................................................................................................................................. ii ABSTRACT ........................................................................................................................ iv TEŞEKKÜR ........................................................................................................................ vi ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................... vii ÇİZELGELER DİZİNİ ......................................................................................................... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ................................................................................. ix 1. GİRİŞ ............................................................................................................................. 1 2. LİTERATÜR ÖZETİ .......................................................................................................... 4 2.1. Digitalis Bitkisinin Botanik Özeti ve Yayılışı ........................................................... 4 2.2. Digitalis Bitkisinde Bulunan Sekonder Metabolitler ve Kullanım Alanları Nelerdir? ................................................................................................................. 7 2.3. İn vitro Sekonder Metabolit Üretiminin Önemi .................................................. 17 2.4. İn vitro Kültürde Elisitör ve Prekürsörlerin Sekonder Metabolit Üretiminde Etkisi ..................................................................................................................... 20 3. MATERYAL VE METOT ................................................................................................ 26 3.1. Materyal .............................................................................................................. 26 3.1.1. Bitki materyali ............................................................................................... 26 3.1.2. Dönör bitkilerin yetiştirilmesi ....................................................................... 26 3.2. Metot ................................................................................................................... 27 3.2.1. Kültür ortamının hazırlanması ...................................................................... 27 3.2.2. Eksplant sterilizasyonu.................................................................................. 29 3.2.3. Yaprak ayası eksplantlarının kültüre alınması .............................................. 30 3.2.4. Kallusların alt kültüre alınması ...................................................................... 33 3.3. İstatistiksel Analiz ................................................................................................ 35 4. BULGULAR .................................................................................................................. 35 4.1. Çeşitli NaCl Uygulamalarının Yüksük Otu Kallus Oluşumuna Etkisi ..................... 36 4.2. Çeşitli NaCl Uygulamalarının Yüksük Otu Kallus Taze Ağırlıklarına Etkisi ............ 37 4.3. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Toplam Fenolik Madde Üzerine Etkisi .. 38 4.4. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Kateşin Miktarı Üzerine Etkisi .............. 39 4.5. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Klorojenik Asit Miktarı Üzerine Etkisi ... 40 4.6. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Kafeik Asit Miktarı Üzerine Etkisi ......... 41 4.7. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe P-kumarik Asit Miktarı Üzerine Etkisi ... 42 4.8. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Ferulik Asit Miktarı Üzerine Etkisi ........ 43 4.9. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Apigenin Miktarı Üzerine Etkisi ............ 44 4.10. NaCl’nın Yüksük Otu Kallus Kültüründe Toplam Aromatik Madde Üzerine Etkisi .................................................................................................................. 45 5. TARTIŞMA VE SONUÇ ................................................................................................. 50 KAYNAKLAR .................................................................................................................... 59 ÖZGEÇMİŞ ...................................................................................................................... 69 i ÖZET Yüksek Lisans Tezi YÜKSÜK OTU (DIGITALIS SP.) BİTKİSİ KALLUS KÜLTÜRLERİNDE TUZLULUĞUN BÜYÜME VE FENOLİK MADDE KOMPOZİSYONUNA ETKİSİ Melike KEYFLİ Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr.Rağbet Ezgi DURAN Yüksük otu (Digitalis purpurea L.) zengin sekonder metabolit ve özellikle kalp ilaçlarının hammaddesini oluşturan kardenolit glikozitleri içermesinden dolayı ülke ekonomisine ve tıp sektörüne önemli katkıları olan Scrophulariaceae familyasına ait otsu bir bitkidir. Bu çalışmada yüksük otu bitkisinin in vitro kültürdeki başarısı ile stres koşullarında sekonder metabolit içeriği arasındaki ilişkinin belirlenmesi ve yüksük otunun fenolik ve aromatik madde miktarının maksimum olduğu büyüme ortamının tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yüksükotu bitkileri, tohumların ekiminden itibaren 16 saat/gündüz 8 saat/gece fotoperiyodu düzeninde, 135 μmol m−2 s−1 PAR ışık yoğunluğu, 22-24 °C sıcaklık ve % 51-54 nem oranı koşulları altında ortalama 1-2 ay boyunca yetiştirilmiştir. Bitki büyüme odasında yetiştirilen bitkilerin yaprakları eksplant olarak kulanılmış ve eksplantlar yüzey sterilizasyonu yapıldıktan sonra farklı NaCl konsantrasyonlarını (0, 75, 100, 125, 150 ve 200 mM NaCl) içeren Murashige ve Skoog (MS) besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Her NaCl uygulaması için kallus oluşum oranları belirlenmiş ve oluşan kallusların taze ağırlıkları ölçüldükten sonra eppendorf tüperine alınarak fenolik bileşiklerin miktarının belirlenmesi amacı ile -18°C’de saklanmıştır. Daha sonra kallusların fenolik madde miktarları HPLC, aromatik miktarları ise GC-MS ile her uygulama için ayrı ayrı belirlenmiştir. Çalışmamızda toplamda 976 yüksük otu yaprak eksplantı kültüre alınmış bu eksplantlardan 618 kallus elde edilmiştir (%63,31). En yüksek kallus oluşum oranının kontrol grubunda (NaCl içermeyen) (%81,17), en düşük oranın ise 100 mM NaCl uygulamasında (%44,37) olduğu bulunmuştur (P<0.01). 150 mM NaCl ortamında kontrol grubundan sonra en yüksek değer gözlenmiştir. 200mM’lık NaCl ortamında ise kallus oluşumu meydana gelmemiştir. Kallus taze ağırlıklarında NaCl’nın artan konsatrasyonları ile birlikte genel anlamda bir düşüş gerçekleşmiştir. Kontrol grubunda bu oran 0,1487 g iken 150 mM NaCl ortamında 0,0091 g’a düşmüştür (P<0.01). Yüksük otu yaprak analizinde kateşin tespit edilemediği halde toplam fenolik madde miktarı diğer çeşitli NaCl uygulamalarında oluşan kalluslardan çok daha fazla ve 157,6 µg/g ii olarak bulunmuştur (P<0.01). Kontrol grubu kalluslarında ise genel olarak NaCl uygulamalarından elde edilen kalluslara nazaran fenolik madde miktarının daha düşük olduğu bulunmuştur (P<0.01). GC-MS cihazıyla ölçülen aromatiklerin en yüksek madde miktarı 150 mM NaCl uygulamasında bulunmuştur. Yüksek konsantrasyonda NaCl bu grup kalluslarda fenolik madde miktarını düşürürken aromatik madde miktarını artırmıştır. Ayrıca kontrol grubu kalluslarında bulunmayan ve tuz stresine karşı savunma olarak sentezlendiği düşünülen farklı aromatikler tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Digitalis, Yüksük otu, Tuz stresi, Kallus, Fenolik madde 2020, 69 sayfa iii ABSTRACT M. Sc. Thesis THE EFFECT OF SALINITY ON THE GROWTH AND COMPOSITION OF PHENOLIC COMPOUNDS IN CALLUS CULTURES OF FOXGLOVE (DIGITALIS SP.) Melike KEYFLİ Süleyman Demirel University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Rağbet Ezgi DURAN Foxglove (Digitalis purpurea L.) is a herbaceous plant belonging to the Scrophulariaceae family, which has significant contributions to the national economy and the medical sector since it contains rich secondary metabolites and cardenolite glycosides which are the raw materials of heart medicines. The aim of this study was to determine the relationship between the success of in vitro callus culture of foxglove plant and secondary metabolite content under stress conditions and to determine the growth medium with maximum phenolic and aromatic substances of foxglove. Foxglove plants were grown for 16 hours/ ay 8 hours/night under the conditions of 135 μmol m−2 s−1 PAR light intensity, 22-24 ° C temperature and 51-54% humidity for an average of 1-2 months. The leaves of the plants grown in the plant growth chamber were used as explants and after surface sterilization, the explants were cultured in Murashige and Skoog (MS) containing different NaCl concentrations (0, 75, 100, 125, 150 and 200 mM NaCl). Callus formation rates were determined for each NaCl application and then the fresh weights of the callus were measured and taken into the eppendorf tube and stored at -18 °C to determine the amount of phenolic compounds. Then the phenolic contents of callus were determined by HPLC and the aromatic contents by