UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Produção de peptídeos bioativos a partir do colágeno isolado de dourado (Coryphaena hippurus) NATHALIA ALBUQUERQUE ROBERTO RECIFE 2017 NATHALIA ALBUQUERQUE ROBERTO Produção de peptídeos bioativos a partir do colágeno isolado de dourado (Coryphaena hippurus) Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, como requisito final para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Ranilson de Souza Bezerra Co-orientadora: Prof.ª Drª. Ana Lucia Figueiredo Porto RECIFE 2017 Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788 Roberto, Nathalia Albuquerque Produção de peptídeos bioativos a partir do colágeno isolado de dourado (Coryphaena hippurus) / Nathalia Albuquerque Roberto. – Recife: O Autor, 2017. 69 f.: il. Orientadores: Ranilson de Souza Bezerra, Ana Lucia Figueiredo Porto Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Biologia, 2017. Inclui referências e anexos 1. Peptídeos 2. Colágeno 3. Peixes - Criação I. Bezerra, Ranilson de Souza (orient.) II. Porto, Ana Lucia Figueiredo (coorient.) III. Título. 672.65 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2017-171 NATHALIA ALBUQUERQUE ROBERTO Produção de peptídeos bioativos a partir do colágeno isolado de dourado (Coryphaena hippurus) Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE, como requisito final para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Ranilson de Souza Bezerra Co-orientadora: Prof.ª Drª. Ana Lucia Figueiredo Porto Aprovada em: 22/02 /2017 BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Ranilson de Souza Bezerra (Orientador) Universidade Federal de Pernambuco -UFPE Dr. Vagne de Melo Oliveira (Examinador Externo) Dr. ª Marcia Nieves Carneiro da Cunha (Examinador Externo) À minha família AGRADECIMENTOS Agradeço ao meu bom Deus pelo dom da vida e por sua abundante graça em meio ao caos. Aos meus pais e irmão, por todo amor, suporte e incentivo durante as dificuldades que enfrentamos jutos nesses anos. Aos meus orientadores Prof. Ranilson Bezerra, Prof.ª Ana Porto e Prof. Vagne Oliveira, pela oportunidade, confiança e dedicação na orientação deste trabalho. À Banca Examinadora, titulares e suplentes, pelas críticas e sugestões na melhoria deste trabalho. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (PPGCB/UFPE) e do Departamento de Bioquímica, por todo auxílio durante esses dois anos de Mestrado. Agradeço aos colegas de trabalho do LABENZ e LABTECBIO, com os quais tive a oportunidade de conviver e compartilhar conhecimentos. Sou muito grata por todos momentos compartilhados, e certamente levarei vocês eternamente no meu coração. Em especial, quero deixar registrado meu agradecimento a Rafael Azevedo, Flávia Thuane, Robson Coelho, Márcia Carneiro e Lidiane Nascimento por toda ajuda durante a realização dos experimentos, que permitiram a conclusão dessa minha etapa acadêmica. À colônia de pescadores do Janga (Paulista-PE), na pessoa de “Seu Nado” pela receptividade e colaboração. Por fim, agradeço aos meus familiares e amigos externos a essa “vida acadêmica”, por todo apoio, momentos de descontração e incentivo. “Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos” (Isaac Newton). RESUMO Os resíduos de processamento de peixe são uma importante fonte de recursos subutilizados que apresentam potencial para diversas aplicações biotecnológicas. A espécie Coryphaena hippurus, conhecida no Brasil como dourado, representa um importante recurso pesqueiro com uma ampla distribuição global. O colágeno, é uma proteína fibrosa encontrada em todo o reino animal, que possui uma variedade de aplicações industriais, principalmente nos setores farmacêutico, de cosméticos e alimentos. Devido aos baixos riscos de transmissão de doenças, alto rendimento nos processos de extração e ausência de toxicidade, organismos aquáticos têm se destacado como uma alternativa frente ao colágeno comercial (obtido a partir de animais terrestres). Assim, o presente trabalho teve por objetivo produzir peptídeos bioativos através da hidrólise do colágeno isolado da pele de dourado (C. hippurus), empregando colagenase extraída de suas vísceras intestinais. O rendimento da extração do colágeno ácido solúvel (ASC) e pepsino solúvel (PSC) foi de 43% e 3%, respectivamente. A SDS-PAGE do ASC e PSC apresentaram padrão de bandas semelhante ao encontrado na literatura para amostras de colágeno, com cadeias α 1 e α 2, bem como cadeia β. O espectro de absorção ultravioleta (UV) de ambos colágenos apresentou absorção máxima a 230 nm. A solubilidade de ASC e PSC foi maior na faixa de pH ácida, alcançando seu máximo em pH 1 e 2, respectivamente. A solubilidade do ASC foi superior em baixas concentrações de NaCl, apresentando diminuição da solubilidade em concentrações acima de 1%. Os espectros FTIR do ASC e PSC exibiram picos característicos de Amida I, II, III bem como amida A e B, semelhantes a colágenos do tipo I de outros peixes. Os resultados obtidos neste estudo indicam a possibilidade de obtenção de proteases e colágeno do tipo I a partir da pele do dourado para a produção de peptídeos bioativos. Palavras-chave: Colágeno. Coryphaena hippurus. Dourado. Resíduos. Peptídeos de colágeno. ABSTRACT Fish processing wastes are an important source of underutilized resources that have potential for various biotech applications. The species Coryphaena hippurus, represents an important fishery resource with a wide global distribution. Collagen is a fibrous protein found throughout the animal kingdom, which has a variety of industrial applications, mainly in the pharmaceutical, cosmetics and food industries. Due to the low risks of disease transmission, high yields in the extraction processes and absence of toxicity, aquatic organisms have stood out as an alternative against commercial collagen (obtained from terrestrial animals). Therefore, the present work aimed to produce bioactive peptides through the hydrolysis of collagen isolated from the skin of gold (C. hippurus), using collagenase extracted from its intestinal viscera. The extraction yield of ASC and PSC was 43% and 3%, respectively. The SDS-PAGE of the ASC and PSC presented bands pattern similar to that found in the literature for samples of collagen, with α 1 and α 2 chains, as well as β chain. The ultraviolet (UV) absorption spectrum of both collagens showed maximum absorption at 230 nm. The solubility of ASC and PSC was higher in the acid pH range, reaching its maximum at pH 1 and 2, respectively. The solubility of the ASC was higher at low NaCl concentrations, with a decrease in solubility at concentrations above 1%. FTIR spectra of ASC and PSC exhibited characteristic peaks of Amide I, II, III as well as amide A and B, similar to type I collagens of other fish. The results obtained in this study indicate the possibility of obtaining proteases and type I collagen from the skin of gilt for the production of bioactive peptides. KEYWORDS: Collagen. Coryphaena hippurus. Dolphinfish. Wastes. Collagen Peptides. LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - Produção e utilização da pesca e aquicultura mundial ........................................ 16 FIGURA 2 - Produção de pescado nas Regiões brasileiras no período de 2007 a 2010 .......... 17 FIGURA 3 - Produção global do Coryphaena hippurus de 1950 a 2014 ................................ 19 FIGURA 4 - Coryphaena hippurus Linnaeus, 1758 ................................................................ 20 FIGURA 5 - Mapa de distribuição de Coryphaena hippurus .................................................. 21 FIGURA 6 - Estrutura do colágeno. ......................................................................................... 22 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS (t) – toneladas µg - Micrograma µL - Microlitro ASC - Colágeno ácido solúvel ATPS – aqueous two-phase system Azocoll – Azo dye-impregnated collagen. BSE - Encefalopatia espongiforme bovina Da - Dalton FAO - Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura IUCN - União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais kDa – Quilo Dalton MPA - Ministério da Pesca e Aquicultura PEG – polietilenoglicol pH - Potencial Hidrogeniônico PPG - polipropilenoglicol PSC - Colágeno pepsino solúvel SDFA – sistema de duas fases aquosas. SDS - Sódio dodecil sulfato SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida utilizando SDS TSE - Encefalopatia espongiforme transmissível U/mg - Unidades de atividade enzimática por miligrama U/mL - Unidades por mililitro UV-vis - Ultravioleta visível v/v - Volume/volume w/v - Peso/volume TCA - Ácido tricloroacético SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 14 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 16 2.1 Produção de pescado ................................................................................................. 16 2.2 Recuperação de resíduos do processamento do pescado ....................................... 18 2.3 Produção do Coryphaena hippurus .........................................................................