DISEÑO DE UNA TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE COLAGENASA A BAJO COSTO CLAUDIA LORENA MOSQUERA GIL UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTE FALCULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICA PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA SANTIAGO DE CALI 2013 DISEÑO DE UNA TÉCNICA DE PRODUCCIÓN DE COLAGENASA A BAJO COSTO CLAUDIA LORENA MOSQUERA GIL Proyecto de Grado para optar el título de Ingeniero Biomédico Director RAFAEL SANTIAGO CASTAÑO VALENCIA B.Sc. (Biología), M.Sc. & Ph.D. (Ciencias Biomédicas) UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE OCCIDENTE FALCULTAD DE INGENIERÍA DEPARTAMENTO DE AUTOMÁTICA Y ELECTRÓNICA PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA SANTIAGO DE CALI 2013 Nota de aceptación: Aprobado por el Comité de Grado en cumplimiento de los requisitos exigidos por la Universidad Autónoma de Occidente para optar al título de Ingeniero Biomédico JULIO CÉSAR MONTOYA VILLEGAS __________________________________ Jurado PAOLA ANDREA NEUTA ARCINIEGAS __________________________________ Jurado Santiago de Cali, 14 de Marzo de 2013. CONTENIDO pág. RESUMEN ............................................................................................................. 12 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 14 1. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ................................................................... 16 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................ 16 2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 18 3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 19 3.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 19 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 19 4. MARCOS DE REFERENCIA ............................................................................. 20 4.1 MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 20 4.1.1 Colágeno y Colagenasa.. ............................................................................ 20 4.1.2 Análisis in silico .. ........................................................................................ 33 4.1.3 Bacterias colagenolíticas.. ......................................................................... 37 4.1.4 Medio de cultivo.. ........................................................................................ 50 4.1.5 Aislamiento de ADN.. .................................................................................. 57 4.1.6 Reacción en cadena polimerasa (PCR). .................................................... 59 4.1.7 Electroforesis.. ............................................................................................ 66 5. METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ....................................................... 70 5.1 REVISIÓN MATERIAL BIBLIOGRÁFICO. ...................................................... 72 5.2 FASE DE LABORATORIO (ANÁLISIS IN SILICO). ....................................... 72 5.3 FASE DE LABORATORIO (EXPERIMENTAL) .............................................. 74 5.3.1 Cultivo para obtener cepas bacterianas con actividad colagenasa. ...... 74 5.3.2 Extracción de ADN.. .................................................................................... 80 5.3.3 PCR. .......................................................................................................... 84 5.3.4 Electroforesis. ............................................................................................. 93 6. RESULTADOS .................................................................................................. 97 7. CONCLUSIONES ............................................................................................ 122 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 124 ANEXOS .............................................................................................................. 133 LISTA DE CUADROS pág. Cuadro 1. Comparación de precios entre Xiapex y el tratamiento quirúrgico. ...............................................................................................................................31 Cuadro 2. Costo del tratamiento con colagenasa IRUXOL SIMPLEX. ............. 32 Cuadro 3. Enzimas colagenolíticas de bacterias patógenas. .......................... 38 Cuadro 4. Campylobacter y Helicobacter asociadas con manifestaciones clínicas de infecciones humanas. ...................................................................... 41 Cuadro 5. Especies del género Helicobacter actualmente reconocidas y sus hospedadores. ..................................................................................................... 45 Cuadro 6. Temperaturas de crecimiento de microorganismos. ...................... 55 Cuadro 7. Muestras rotuladas. ............................................................................ 75 Cuadro 8. Reactivos que se alicuotaron. ........................................................... 84 Cuadro 9. Características de los primers diseñados. ....................................... 85 Cuadro 10. MIX PCR. ........................................................................................... 86 Cuadro 11. Condiciones del Termociclador. ..................................................... 88 Cuadro 12. Mix PCR para 10 muestras. ............................................................ 88 Cuadro 13. Componentes del mix. ..................................................................... 89 Cuadro 14. Combinaciones de los primers de Helicobacter pylori. ................ 89 Cuadro 15. Condiciones del termociclador para los 52 tubos. ........................ 91 Cuadro 16. Temperatura de Melting promedio y Temperatura de alineamiento promedio de cada uno de los mix. ..................................................................... 91 Cuadro 17. Condiciones del Termociclador para las 2 muestras. ................... 92 Cuadro 18. Mix para 5 muestras. ........................................................................ 92 Cuadro 19. Combinaciones de los primers para Staphylococcus aureus. ..... 92 Cuadro 20. Secuencias de proteínas y de nucleótidos escogidas para Helicobacter pylori. .............................................................................................. 99 Cuadro 21. Secuencias de proteínas y de nucleótidos para Staphylococcus aureus. ................................................................................................................ 100 Cuadro 22. Primers diseñados para Helicobacter pylori. ............................... 102 Cuadro 23. Primers diseñados para Staphylococcus aureus. ....................... 102 Cuadro 24. Muestras que amplificaron a aproximadamente 1500 pb. .......... 110 Cuadro 25. Muestras que amplificaron a aproximadamente 1281 pb. .......... 115 Cuadro 26. Mix para 10 muestras con DMSO. ................................................. 115 Cuadro 27. Muestras que amplificaron a aproximadamente 1281 pb con DMSO. ................................................................................................................. 117 Cuadro 28. Inversión en pesos colombianos para producir colagenasa...... 120 Cuadro 29. Costo de colagenasa comercial vs. costo colagenasa producida en laboratorio. .................................................................................................... 121 LISTA DE FIGURAS pág. Figura 1. Gráfico de la unidad fundamental del colágeno. .............................. 21 Figura 2. Gráfico del proceso de expresión y obtención de colagenasa. ....... 25 Figura 3. Gráfico de la bacteria Campylobacter Jejuni. ................................... 42 Figura 4. Gráfico de la forma típica de C. Jejuni después de 48 horas de cultivo. .................................................................................................................. 43 Figura 5. Forma típica de H. pylori después de 72 horas de cultivo. .............. 46 Figura 6. Gráfico de la bacteria Staphylococcus aureus. ................................ 48 Figura 7. Placa de cultivo que presenta lisis de colágeno. .............................. 50 Figura 8. Gráfico de colonias de un microorganismo sobre agar nutritivo. ... 51 Figura 9. Gráfico de las colonias de Campylobacter Jejuni en agar sangre. 56 Figura 10. Gráfico de la metodología de PCR. .................................................. 61 Figura 11. Gráfico que muestra los pasos de la técnica PCR. ......................... 64 Figura 12. Gráfico del número de ciclos en PCR. ............................................. 65 Figura 13. Diagrama de flujo de la metodología utilizada. ............................... 71 Figura 14. Ventana de entrada de Tblastn. ........................................................ 73 Figura 15. Página de inicio de PRIMACLADE. ................................................... 74 Figura 16. Foto del color obtenido hasta ahora del cultivo celular. ................ 76 Figura 17. Fotos de las placas petri con medio de cultivo para Campylobacter. .................................................................................................... 78 Figura 18. Foto del Sistema de anaerobiosis*. .................................................