C. elegans and CRISPR/Cas gene editing to study BAP1 cancer-related mutations and cisplatin chemoresistance Carmen Martínez Fernández TESI DOCTORAL UPF / 2020 Thesis supervisor Dr. Julián Cerón Madrigal Modeling Human Diseases in C. elegans Group. Gene, Disease, and Therapy Program. IDIBELL. Department of Experimental and Health Sciences Para aquellos que aún perviven en el amor, la alegría y la perseverancia. Acknowledgments En primer lugar, quiero agradecer a mis padres, María del Mar y Fran, por darme vuestro amor y apoyo incondicional en todas las decisiones que he tomado en estos 27 años. Y a mi hermana, Helena, por tener el corazón más grande del planeta, a juego con sus labios y su frente, y tenerme siempre en él. No os lo digo, pero os quiero mucho. A mi familia, porque sois la mejor que me ha podido tocar: a mi abuelo Paco, a mi abuela Carmen y mi a abuela Maru. A vosotros, Caki y Padrino, titos y titas. A mis primos, primitas y primito =) Os quiero mucho a todos! Mención especial a Julián, ¡lo hemos conseguido!. Gracias por el apoyo. Gracias por la motivación que desprendes, aunque a veces sea difícil de encontrar. Gracias también por echarme del país y por dejarme empezar a aprender contigo. No ha sido fácil, pero sin duda, volvería a repetir. A Curro, Karinna, Xènia y Montse, porque fuisteis mis primeros labmates. Esos nunca se olvidan. A la segunda ronda, David, Dimitri, LLuís y Jeremy. ¡Lo que une Cerón lab, no lo separará nae! En especial, quería agradecer a XS, Mex y Dim. Habéis sido más que amigos, habéis sido la familia que no he tenido en el día a día en estos años. Creo que no podría haber tenido más suerte. Espero, nos reunamos de nuevo, porque seguro hay muchos Yunpengs deseando conocernos. A vosotros, que nos hemos encontrado en el camino y también habéis llegado para quedaros: Leire, David, Nat, las del Rin Romántico… A mis Malagueños en la distancia, o no tanto: a Ana (Montreal) y a Carlos (en la calle de al lado), a los Colegas Atómicos (Málaga-Berlín), Marina, Julia. Siempre es un placer volver y encontrarnos y saber que en el fondo nada ha cambiado. ¡Nos vemos en las bolas! A Ale Moles, porque sin tu alegría no lo habría conseguido. Y a ti…te quiero al que más. V ABSTRACT ABSTRACT Model organisms and gene-editing strategies are fundamental to address a variety of scientific questions from basic science to biomedical research. Here, we reinforced the use of two powerful tools, the experimental system Caenorhabditis elegans and the CRISPR/Cas gene-editing technology, to model cancer-related mutations and investigate cisplatin-based chemoresistance. We have established a model to study BAP1 cancer predisposition syndrome-related mutations in the BAP1 ortholog ubh-4. By exploring distinct ubh-4 alleles, we have discovered a synthetic interaction between ubh-4 and rpn-9, an essential regulatory subunit involved in proteasome assembly. Moreover, we suggest a cooperating role between these genes in the ubiquitin-mediated proteostasis at meiotic prophase. In addition, we have exploited C. elegans to study the toxicity of cisplatin-based therapies in different ways. First, by studying the impact of glucose and lipid metabolism on cisplatin toxicity. Then, we have described the harmful effect of cisplatin in mitochondrial functions. Finally, we have established a method to investigate the cisplatin-induced neurotoxicity by using an automated worm tracking system and discovered a protective role of dopamine. IX RESUMEN Los organismos modelo y las estrategias de edición genética son fundamentales para desentrañar incógnitas en ciencias de la vida, desde la investigación básica hasta investigación aplicada a la biomedicina. En este estudio, reafirmamos la importancia del uso de dos potentes herramientas, el sistema experimental Caenorhabditis elegans y la tecnología de edición genética CRISPR/Cas, para modelar mutaciones relacionadas con cáncer e investigar la quimiorresistencia al cisplatino. Hemos modelado mutaciones asociadas al síndrome de predisposición tumoral BAP1, en ubh-4/BAP1. Explorando el efecto de distintos alelos mutantes de ubh-4, hemos descubierto una interacción sintética entre ubh-4 y rpn-9, el cual codifica para una subunidad reguladora esencial para el ensamblaje del proteasoma. Además, proponemos que la cooperación funcional de dichos genes está implicada en la degradación de proteínas mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma durante la profase meiótica. También hemos investigado la respuesta generada por la terapia con cisplatino en C. elegans. Por una parte, hemos demostrado que la toxicidad inducida por el cisplatino puede modularse alterando el metabolismo glucídico y lipídico. Por otro lado, hemos observado que esta droga genera disfunción mitocondrial. Finalmente, mediante un sistema automatizado, hemos puesto a punto un método para evaluar el efecto neurotóxico del cisplatino en el nemátodo y hemos encontrado que la dopamina posee un efecto protector. XI PREFACE PREFACE Precision medicine is particularly relevant in cancer. Thus, the description of individuals’ genetic landscape is essential to unravel cancer susceptibility and propose personalized anticancer therapies. Particularly, we have focused on BAP1 cancer predisposition syndrome, and chemoresistance to cisplatin-based therapies. Caenorhabditis elegans has been successfully used as an experimental system since the 1970s, providing several advantages over other models. Here, we have taken advantage of its power as a genetic tool, together with CRISPR/Cas technology, to generate several transgenic lines, including cancer-related mutants and endogenous reporters. Additionally, C. elegans is a well-established system to investigate neuromodulatory pathways in vivo, and the effect of genotoxic drugs in a pluricellular context. Based on our expertise in C. elegans gene editing by CRISPR/Cas, we mimicked missense mutations related with BAP1 cancer predisposition syndrome and, particularly, with malignant pleural mesothelioma. Thanks to C. elegans hermaphroditism and the viability of BAP1-related alleles, we were able to analyze the sub-cellular implications of these mutations in an isogenic population. Moreover, using RNAi, partial inactivation of functionally related genes revealed a possible therapeutic target for BAP1 affected tumors. Our lab has previously employed C. elegans to understand the cytotoxicity induced by cisplatin. Here, we have further XV PREFACE exploited this model using semi-automated platforms such as Seahorse, providing information about C. elegans respirometry, and the Tierpsy Tracker automated tracking system for evaluating behavioral features. The latter was kindly provided by André Brown (Institute of Clinical Sciences, Imperial College London). Conveniently for neurotoxic studies, we generated a set of dopamine signaling-related mutants, which resulted in a system for studying cisplatin-induced neuronal damage. All the above will help us to answer fundamental questions regarding cisplatin therapeutic use. During my PhD, I have been funded by the European Cooperation in Sciences and Technology (COST) Mission with a GENIE Short Term Mission (STSM) grant to perform an internship at Carina Holmberg’s laboratory at Medicum, University of Helsinki (Helsinki, Finland) and by the Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) for a 6-months internship Short-Term Grant at Sebastian Honnen’s laboratory at Toxicology Institute, Heinrich Heine Universität (HHU) (Düsseldorf, Germany). XVI KEY WORDS KEY WORDS C. elegans CRISPR/Cas ubh-4 rpn-9 Ubiquitin Proteasome system RNA interference Meiosis Cisplatin Glucose sbp-1 Mitochondrial dysfunction Catechol-O-methyltransferase Dopamine Neurotoxicity Behavior XIX TABLE OF CONTENTS TABLE OF CONTENTS ACKNOWLEDGMENTS ............................................................................ V ABSTRACT .............................................................................................. VII RESUMEN ................................................................................................. XI PREFACE ............................................................................................... XIII KEY WORDS ........................................................................................ XVII TABLE OF CONTENTS ......................................................................... XXI LIST OF FIGURES AND TABLES ...................................................... XXIX INTRODUCTION ................................................................................. XXXV 1. Animal models in biomedical research ............................................... 3 2. Platinum-based compounds as first-line cancer treatment ................ 4 3. Caenorhabditis elegans to study cisplatin response and mimic human cancer mutations ........................................................................ 6 3.1. C. elegans biology ....................................................................... 6 3.2. C. elegans relevance as a model organism ................................ 7 3.2.1. Genetic conservation between human and C.elegans ..................... 7 3.2.2. The complete C. elegans neuronal connectome has been explored8 3.2.3. Powerful genetic tool ........................................................................ 9 (i) Forward genetics .......................................................................................... 9 (ii) Reverse genetics .......................................................................................... 9