1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ LARISSA JUNQUEIRA GATTO ESTUDO FITOQUÍMICO, MORFOANATÔMICO, ATIVIDADES BIOLÓGICAS E PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES DA ESPÉCIE Myrcia hatschbachii D. Legrand, MYRTACEAE CURITIBA 2018 2 LARISSA JUNQUEIRA GATTO ESTUDO FITOQUÍMICO, MORFOANATÔMICO, ATIVIDADES BIOLÓGICAS E PROPRIEDADES ANTIOXIDANTES DA ESPÉCIE Myrcia hatschbachii D. Legrand, MYRTACEAE Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profa Dra Marilis Dallarmi Miguel Coorientador: Prof° Dr° Obdulio Gomes Miguel CURITIBA 2018 3 4 5 Dedico este trabalho às minhas seis pessoas preferidas no mundo: Carmem, Mauro, Melissa, Vinicius, Vó Cida e Vô Tião (in memoriam). 6 AGRADECIMENTOS A Deus e Nossa Senhora, agradeço a todo momento. A Universidade Federal do Paraná e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. À Profa. Dra. Marilis Dallarmi Miguel, pela oportunidade de orientação, pelas conversas e trocas de experiências, pelo tempo dedicado às correções, por acreditar e confiar em mim, deixando-me confortável na condução do trabalho. Ao Prof. Dr. Obdulio Gomes Miguel, por se fazer presente durante toda a pesquisa, sempre preocupado com as novas moléculas e disposto a ajudar no que fosse preciso. Ao Grupo de Pesquisa de Produtos Naturais, professores, técnicos e alunos de mestrado e doutorado, pela amizade, compartilhamento de conhecimentos, contribuições científicas e pelos momentos que estivemos juntos. À Natasha Fabri, pela parceria nos experimentos durante todo o trabalho. Dividimos nossas alegrias, dificuldades, preocupações, além dos dias em que madrugamos ou ficamos até tarde no laboratório, para que os resultados fossem os mais confiáveis e coerentes possíveis. Também compartilhamos muitas conversas, maçãs verdes e, acima de tudo, uma grande amizade. Às amigas e mestrandas Natasha Stopinski e Camila de Jesus, pelo companheirismo, auxílio nos experimentos, por tornarem o dia a dia mais leve e divertido. À doutoranda Katlin Rech, pela ajuda desde o início, da rotina do laboratório às contribuições de RMN e CLAE. À doutoranda Vanessa Bobek, pelo auxílio no estudo morfoanatômico, sendo sempre gentil e paciente em me ensinar e tirar todas as dúvidas. 7 Ao doutorando Francis Merino, por seu tempo e empenho na aquisição dos espectros de RMN. Ao Prof. Dr. Andersson Barison, pela ajuda na interpretação e discussão dos resultados. À Profa. Dra. Josiane de Fátima Gaspari Dias e aos doutorandos Carolina Sette, Gustavo Bellei e Leticia Freire, pelo auxílio com os métodos biológicos, estatísticos e discussão dos resultados. À Profa. Josiane, também agradeço a oportunidade e experiência do estágio em docência. À Profa. Dra. Deise Montrucchio e ao Prof. Dr. Vinicius Bednarczuk, pelas valiosas contribuições e correções do trabalho. Ao Prof. Vinicius, também agradeço pelo auxílio com a análise de CLAE e discussão da substância isolada. À técnica Maria da Graça, pela ajuda com os equipamentos da Central Analítica e ao secretário da pós-graduação, Jean Godoi. Ao curador do MBM, José Tadeu Weidlich Motta, pela identificação da espécie. Ao departamento de química da UFPR, pela realização das análises de RMN, CG-EM (Meira Ballesteros) e Difratometria de raio X de monocristal (Francielli Santana). À CAPES, pelo auxílio financeiro. Aos meus pais, Mauro e Carmem, por serem exemplos de vida, por todos os esforços, valores e conhecimentos transmitidos, por priorizarem a minha educação, por estarem ao meu lado, apoiando minhas escolhas. À minha irmã, Melissa, pela torcida, conselhos e, principalmente, companheirismo. À Vó Cida, pelas muitas orações nos momentos em que mais precisei. Ao meu marido, Vinicius, pelo incentivo e entusiasmo à pesquisa, por ter efetivamente participado deste trabalho, seja contando sementes para o teste de alelopatia, digitando dados no Excel, levando-me a Universidade aos domingos, lendo textos intermináveis. Pela preocupação com o meu conforto físico e emocional, e por abdicar de alguns planos para que eu pudesse realizar o mestrado. 8 RESUMO A espécie Myrcia hatschbachii D. Legrand (Myrtaceae) é nativa e endêmica do Brasil, tendo ocorrência confirmada nos estados do Sul. O objetivo deste trabalho foi realizar o estudo fitoquímico, morfoanatômico e avaliar as propriedades antioxidantes e atividades biológicas, visto ser apenas uma das muitas espécies da biodiversidade brasileira sem respaldo científico documentado na literatura. O material vegetal foi coletado em Curitiba, Paraná, Brasil e identificado por comparação no Museu Botânico Municipal. O estudo morfoanatômico foi realizado por microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura, além da realização de testes histoquímicos. A folha apresentou estômatos paracíticos e nervura central com formato côncavo-convexo. Houve a presença de tricomas tectores, drusas de oxalato de cálcio e compostos fenólicos nas folhas, pecíolos e galhos. No screening fitoquímico foi observada a presença de compostos fenólicos e esteroides e/ou triterpenos. O óleo essencial foi extraído por Clevenger, resultou em um rendimento de 0,17% e seus compostos majoritários foram trans-Calameneno, E-Cariofileno e Espatulenol. A extração das folhas e galhos foi realizada por Soxhlet e após o fracionamento, resultaram-se as frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e remanescente. A partir da fração folha acetato de etila foi isolado e identificado o ácido gálico. Os testes antioxidantes por formação do complexo fosfomolibdênio e redução do radical DPPH• apresentaram significativa atividade, com destaque para as frações folha e galho acetato de etila. No ensaio de toxicidade in vitro frente à Artemia salina, o óleo essencial foi considerado moderadamente tóxico. Na alelopatia, houve inibição do crescimento do hipocótilo e radícula nos extratos brutos e frações de folhas e galhos, além do óleo essencial. Obteve-se atividade hemolítica na faixa de 50% na concentração de 1000 µg/mL da fração folha hexano e óleo essencial. Considerando a presença do constituinte ácido gálico, as propriedades antioxidante e alelopática demonstradas pelos extratos brutos e frações, bem como a toxicidade do óleo essencial, estudos de aplicações diversas podem ser aprofundados posteriormente para o enriquecimento da pesquisa desta espécie. Palavras-chaves: Óleo essencial. Ácido gálico. Toxicidade. Alelopatia. Hemólise. 9 ABSTRACT The species Myrcia hatschbachii D. Legrand (Myrtaceae) is native and endemic to Brazil, having confirmed occurrence in the Southern States. The aim of this research Was to realize phytochemical, morphological and anatomical studies, and evaluate antioxidant properties and biological activities, as this is only one of many species that compose brazilian biodiversity Without any scientific study documented in literature. The plant material Was collected in Curitiba, Parana, Brazil and identified by comparison in Museu Botânico Municipal (Municipal Botanical Museum). The morphological and anatomical studies Were performed by using optical and electronic microscopy, on top of histochemical tests. The leaf presented paracitic stomata and central nervure With concave-convex format. Tector trichomes, calcium oxalate druses and phenolic compounds Were present on leaves, stems and branches. By using phytochemical screening, it Was observed that phenolic compounds and steroids and/or triterpenes Were present. The essential oil Was extracted by using Clevenger apparatus, resulting in yield of 0.17% and its main compounds Were trans- Calamenene, E-Caryophylene and Spathulenol. Extractions from leaves and branches Were obtained via Soxhlet and after fractioning, resulted in hexane, chloroform, ethyl acetate and remaining hydroalcoholic fractions. From the leaf ethyl acetate fraction Was isolated and identified gallic acid. The antioxidant capacity by formation of phosphomolybdenum complex and DPPH• radical scavenging method presented significant activity, With special emphasis in leaf and branch ethyl acetate fraction. In the test for in vitro toxicity toWards Artemia salina, the essential oil Was considered moderately toxic. In the allelopathic study, there Was groWth inhibition in hypocotyl and radicle in crude extracts and fractions from leaves and branches, and also essential oil. Hemolytic activity Was found in the 50% range at 1000 µg/mL of leaf hexane fraction and essential oil. Considering the presence of the gallic acid, the antioxidant and allelopathic properties demonstrated by the crude extracts and fractions, as Well as the essential oil toxicity, several applications studies can be further developed to enrich the research of this species. Keywords: Essential Oil. Gallic acid. Toxicity. Allelopathy. Hemolisis. 10 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - DISTRIBUIÇÃO DA ESPÉCIE Myrcia hatschbachii D. Legrand NO BRASIL.................................................................................30 FIGURA 2 - ILUSTRAÇÃO DA ESPÉCIE Myrcia hatschbachii D. Legrand.......................................................................................30 FIGURA 3 - FLUXOGRAMA DAS ETAPAS DA PESQUISA .........................31 FIGURA 4 - FOTOGRAFIA DAS FOLHAS COLETADAS DE Myrcia hatschbachii D. Legrand..............................................................32 FIGURA 5 - FOTOGRAFIAS DA ESPÉCIE Myrcia hatschbachii D. Legrand NO LOCAL DA COLETA.............................................................32 FIGURA 6 -