MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE PERFIL DE IMUNOGLOBULINAS E CORRELAÇÃO DE AUTOANTICORPOS COM A OCORRÊNCIA DE DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS EM PACIENTES CHAGÁSICOS CRÔNICOS DANIELA FERREIRA NUNES NATAL/RN 2013 DANIELA FERREIRA NUNES PERFIL DE IMUNOGLOBULINAS E CORRELAÇÃO DE AUTOANTICORPOS COM A OCORRÊNCIA DE DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS EM PACIENTES CHAGÁSICOS CRÔNICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão Coorientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes NATAL/RN 2013 CATALOGAÇÃO NA FONTE N972p Nunes, Daniela Ferreira. Perfil de imunoglobulinas e correlação de autoanticorpos com a ocorrência de diversas formas clínicas em pacientes chagásicos crônicos / Daniela Ferreira Nunes. – Natal , 2013. 62f. Orientador: Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão. Coorientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Trypanosoma cruzi – Dissertação. 2. Doença de Chagas humana – Dissertação. 3. Troponina T – Dissertação. 4. Autoanticorpos – Dissertação. I. Galvão, Lúcia Maria da Cunha. II. Título. RN-UF/BS-CCS CDU: 616.937(043.3) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Profa. Dra. Ivonete Batista de Araújo NATAL/RN 2013 III DANIELA FERREIRA NUNES PERFIL DE IMUNOGLOBULINAS E CORRELAÇÃO DE AUTOANTICORPOS COM A OCORRÊNCIA DE DIVERSAS FORMAS CLÍNICAS EM PACIENTES CHAGÁSICOS CRÔNICOS Aprovada em: __/__/____ BANCA EXAMINADORA: Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão - UFRN (Presidente) Prof. Dra. Rosiane Viana Zuza Diniz - UFRN (Membro interno) Profa. Dra. Walderez Ornelas Dutra - UFMG (Membro externo) Profa. Dra. Valéria Soraya Farias Sales - UFRN (Suplente interno 1) Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende – UFRN (Suplente interno 2) Profa. Dra. Eliane Lages Silva – UFTM (Suplente externo) IV Dedico este trabalho ao meu pai, Damião Nunes, pelo exemplo de luta que tenho, pela educação exemplar e por me mostrar que a honestidade, perseverança e fé removem as “montanhas” que existem em nossa vida! V AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por todas as bênçãos que Ele proporciona em minha vida, A Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão por ter confiado em mim e me aceito como sua aluna de mestrado e estar contribuindo para meu amadurecimento intelectual, pessoal e profissional. Agradeço pela disponibilidade de sempre e por todos os ensinamentos e conselhos que me ajudaram a crescer, Ao Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes, pelas ideias, entusiasmo e orientação que enriqueceram este trabalho, além da oportunidade de desenvolver a parte experimental desta dissertação em seu laboratório, Ao Prof. Egler Chiari, pela colaboração e fundamental apoio na realização de todo o projeto, A Profa. Dra. Antônia Cláudia Jácome da Câmara que me iniciou no mundo da ciência e sempre será meu exemplo de postura profissional, Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da UFRN e ao corpo docente deste Programa pelos ensinamentos transmitidos, À Kalieny, secretária do Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, pelo carinho e atenção constantes, Aos Professores, alunos, laboratórios e funcionários do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, CCS/UFRN que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, Aos membros de minha banca de qualificação, as professoras. Rosiane Diniz e Selma Jerônimo, pelas críticas e sugestões brilhantes, A Andressa Noronha, uma grande amizade construída desde a iniciação científica, pelo companheirismo e apoio em todos os momentos difíceis, sempre dando força para continuar, Aos demais colegas, antigos e atuais, do Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas, PPgCF/CCS/UFRN, Kiev Martins, Ramon Brito, Ana Vanessa Julião e Pedro Igor, pelas palavras de incentivo, paciência e ajuda em diversos momentos na realização deste trabalho, VI Aos colegas do Laboratório de Imunoparasitologia, CB/UFRN, Nathalie Sena, Danik Cabral, Redson Paulo e Tamyres Queiroga, por dividirem um pouco de seu espaço comigo e aguentarem minhas incontáveis reclamações, Ao Cléber de Mesquita Andrade, doutorando e Professor da Universidade Estadual do RN, pela imprescindível colaboração na avaliação clínica e atenção aos indivíduos que participaram deste trabalho, Aos meus pais, Damião e Marluce, por me ensinarem a importância de estudar para “crescer na vida”, Ao meu grande amor, Felipe Xavier, pelo apoio incondicional, incentivo e carinho; e sua amada mãe, Maria Amélia, que me recebeu de coração e portas abertas, A minha querida amiga Yasminie Midlej, um presentinho que Deus me ofereceu com esse mestrado, pelos bons momentos e pelas longas horas de conversa, pela convivência doce, pelos ensinamentos e pelo carinho, Aos meus queridos amigos: Emanoelly Roberta, Alanne Kyssia, Breno Borges, Renato Gondim, Isaac Guimarães, José Hilário, Madson Reis, Lenilda, Ricardo Victor e outros por se fazerem sempre presentes em meu coração e meus pensamentos, apesar da justificada ausência física em alguns momentos – sei que vocês torcem pelo meu sucesso, Às pessoas que aceitaram participar deste trabalho, minha grande gratidão. A todos aqueles que direta ou indiretamente participaram deste projeto. Ao suporte financeiro concedido pelas Agências de Fomento à Pesquisa, CAPES, CNPq e FAPERN. VII “A única forma de chegar ao impossível é acreditar que é possível” Lewis Carrol VIII RESUMO Introdução: O dano miocárdico na doença de Chagas resulta tanto da ação parasitária quanto da resposta imune do hospedeiro humano. O mimetismo molecular entre proteínas do Trypanosoma cruzi e vários antígenos do hospedeiro tem sido amplamente descrito gerando células T CD8+ e anticorpos autorreativos. Entretanto, a geração dos autoanticorpos e seu papel na imunopatogenia da doença de Chagas ainda não têm sido elucidados, o que nos levou, neste trabalho, a avaliar a produção de imunoglobulina G total (IgGt) e seus isotipos anti-T. cruzi, proteínas cardíacas e sua possível associação com as diferentes formas clínicas da doença de Chagas. Métodos: A produção de IgGt e isotipos foi mensurada pelo método de ELISA no soro de pacientes com as formas clínicas indeterminada (IND, n=72), cardíaca (CARD, n=47) e digestiva/cardio-digestiva (DIG/CARD-DIG, n=12) da doença de Chagas, usando como antígenos as formas epimastigota e tripomastigota do T. cruzi e proteínas cardíacas humana (miosina e troponina T). As amostras de indivíduos não infectados saudáveis (CONT, n= 30) e pacientes com cardiomiopatia isquêmica (ISCH, n=15) foram usadas como controle. Os títulos de autoanticorpos foram correlacionados com parâmetros da função cardíaca obtidos por exames eletrocardiográficos, radiográficos e ecocardiográficos. Resultados: Neste estudo foram incluídos 131 indivíduos sem diferença significativa relativa à idade ou sexo. Destes, 55% foram classificados como IND, 35,9% CARD e 9,1% DIG/CARD-DIG. Os títulos de IgGt foram mais elevados em pacientes com as formas clínicas IND, CARD e DIG/CARD-DIG do que em indivíduos CONT e ISCH usando os antígenos as formas tripomastigotas e epimastigotas do T. cruzi e, proteínas cardíacas humanas. Os pacientes com formas clínicas CARD e DIG/CARD-DIG mostraram a produção mais elevada de IgG total dirigida contra antígenos de tripomastigota e epimastigota do que os IND. Os grupos de pacientes IND e CARD apresentaram uma similar produção de IgG total específica direcionada à miosina e troponina T, e mais elevada do que em indivíduos CONT e ISCH. Há uma correlação negativa entre a produção de anticorpos anti-proteínas cardíacas com a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) em pacientes chagásicos crônicos. Os pacientes foram agrupados em “baixo” e “alto” produtores de autoanticorpos e comparados com a fração de ejeção demonstrando que em pacientes “alto” produtores de anti-troponina T (p=0.042) e miosina (p=0.013) a FEVE foi mais baixa do que os “baixo” produtores. A maioria dos pacientes IX chagásicos produz simultaneamente autoanticorpos direcionados à ambas proteínas cardíacas (r=0.9508, p=0.0001). Conclusões: Estes resultados indicam que os autoanticorpos anti- troponina T e miosina cardíaca parecem induzir redução FEVE e deve ser associado com o desenvolvimento de cardiomiopatia chagásica. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas humana, troponina T, miosina, autoanticorpos, imunopatogenia. X LISTA DE ABREVIATURAS CARD – cardíaca; CCC – Cardiopatia chagásica crônica; DIG/CARD-DIG – digestiva/cardio-digestiva; ECG – Eletrocardiograma; ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay; FEVE – Fração de ejeção do ventrículo esquerdo; HAI – Hemaglutinação indireta; IFN-γ – Interferon gama; IL-10 – Interleucina 10; IL-4 – Interleucina 4; IND – Indeterminada; LIT – Liver infusion tryptose; PBS – Salina tamponada com fosfato; PBS-T– Salina tamponada com fosfato acrescida de 0,05% Tween-20; TCD4+ – Linfócito T helper; TCD8+ – Linfócito T citolítico; TGF-β – Fator de transformação de crescimento beta; Th1 – T helper tipo 1; Th17 – T helper tipo 17; Th2 – T helper tipo 2; TMB – 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. XI LISTA DE FIGURAS