Funktionelle Untersuchungen von FLORICAULA und KNOX-Genen in Eschscholzia californica Cham. Dissertation Zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften Am Fachbereich Biologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Andrea Scholz geb. in Bochum Mainz, Juli 2008 Dekan: 1. Berichterstatter: 2. Berichterstatter: Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2008 Die Ergebnisse des Kapitels 3.3.1 sind Inhalt der folgenden Publikation: WEGE S., SCHOLZ A., GLEISSBERG S., BECKER A. (2007): Highly Efficient Virus- induced Gene Silencing (VIGS) in California Poppy (Eschscholzia californica): An Evaluation of VIGS as a Strategy to Obtain Functional Data from Non-model Plants. Annals of Botany 100: 641-649 Inhalt _____________________________________________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung................................................................................................................ 4 2. Material und Methoden......................................................................................... 14 2.1 Material ........................................................................................................... 14 2.1.1 Pflanzenmaterial ................................................................................... 14 2.1.2 Verwendete Medien .............................................................................. 14 2.1.3 Verwendete Oligonukleotide (Primer) ................................................... 16 2.1.4 Verwendete Plasmide ........................................................................... 17 2.2 Molekularbiologische Methoden...................................................................... 18 2.2.1 Isolierung genomischer DNA ................................................................ 18 2.2.2 Isolierung von Gesamt-RNA ................................................................. 18 2.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA ................................................................. 18 2.2.4 Reinigung von PCR-Produkten und enzymatischen Reaktionen .......... 18 2.2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................ 18 2.2.6 Sequenzierung von PCR-Produkten..................................................... 19 2.2.7 cDNA Synthese..................................................................................... 19 2.2.8 Semiquantitative RT-PCR (sqRT-PCR) ................................................ 20 2.3 Gewebekultur und Agrobacterium-vermittelte Transformation von Eschscholzia californica..................................................................... 21 2.3.1 Sterile Aussaat...................................................................................... 21 2.3.2 Kallusinduktion und somatische Embryogenese aus Keimlingen von E. californica ...................................................................................... 21 2.3.3 Screening der Hormonkonzentration .................................................... 22 2.3.4 Einfluss der Temperatur auf die Embryogenese................................... 22 2.3.5 Kombiniertes Hormon-Temperatur-Screening ...................................... 22 2.3.6 Kallusinduktion und somatische Embryogenese aus Samen von E. californica ...................................................................................... 22 2.3.7 Regeneration somatischer Embryonen................................................. 23 2.3.8 Ti-Plasmide für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von E. californica ..................................................................................... 23 2.3.9 Vektorkonstruktion ................................................................................ 24 2.3.10 Herstellung und Transformation kompetenter Agrobacterien.............. 25 2.3.11 Einsatz von Antibiotika bei der Gewebekultur von E. californica......... 25 1 Inhalt _____________________________________________________________________________________________________ 2.3.12 Agrobacterium-vermittelte Transformation von Keimlingsexplantaten von E. californica ................................................... 26 2.3.13 Agrobacterium-vermittelte Transformation von Samen von E. californica ...................................................................................... 26 2.3.14 Histochemischer Nachweis von -Glucuronidase-Aktivität in transgenem Gewebe von E. californica.................................................... 27 2.3.15 PCR-Nachweis von transgenen Pflanzen ........................................... 27 2.4 Untersuchung des Einflusses von Auxin auf die Blattentwicklung .................. 28 2.4.1 Aussaat und Aufzucht von E. californica............................................... 28 2.4.2 Analyse der Transkriptmengen von EcFLO und EcSTM durch sqRT-PCR ...................................................................................... 28 2.5 Virus induziertes Gen Silencing (VIGS) .......................................................... 29 2.5.1 Vektoren ............................................................................................... 29 2.5.2 Vektorkonstruktion ................................................................................ 30 2.5.3 Klonierung des Gens Phytoen-Desaturase aus E. californica............... 30 2.5.4. Aussaat und Anzucht von E. californica............................................... 31 2.5.5 Infektion von E. californica mit pTRV-Vektoren..................................... 31 2.5.6 Vergleichende Untersuchung des Einflusses einer Infektion mit pTRV- EcFLO und pTRV-EcKNOX auf die Blattentwicklung von E. californica... 32 2.5.7 Rasterelektronenmikroskopie (REM) .................................................... 33 2.5.8 Statistische Auswertung der Blatt- und Fiederzahlen............................ 33 2.5.9 Untersuchung der Transkriptmengen von EcPDS, EcFLO und EcSTM mittels sqRT-PCR ................................................................. 34 3. Ergebnisse............................................................................................................ 35 3.1 Gewebekultur und Agrobacterium-vermittelte Transformation von Keimlings- explantaten und unreifen Samen von Eschscholzia californica ................ 35 3.1.1 Keimlingsexplantate ................................................................................. 35 3.1.1.1 Kalluskultur und somatische Embryogenese ..................................... 35 3.1.1.2 Screening der Hormonkonzentrationen ............................................. 35 3.1.1.3 Einfluss der Temperatur auf die Embryogenesefähigkeit von Kallusgewebe .................................................................................... 37 3.1.1.4 Kombiniertes Hormon-Temperatur-Screening ................................... 37 3.1.1.5 Agrobacterium-vermittelte Transformation von Keimlingsexplantaten........................................................................ 37 2 Inhalt _____________________________________________________________________________________________________ 3.1.2 Unreife Samen.......................................................................................... 38 3.1.2.1 Kalluskultur und somatische Embryogenese ..................................... 38 3.1.2.2 Agrobacterium-vermittelte Transformation unreifer Samen ............... 38 3.2 Der Einfluss von Auxin auf die Blattentwicklung von Eschscholzia californica 41 3.2.1 Phänotypische Veränderungen bei Hemmung des Auxintransports ........ 41 3.2.2 Untersuchung der Expression von EcFLO und EcSTM bei Hemmung des Auxintransports........................................................... 43 3.3 Virus Induziertes Gen Silencing (VIGS) in Eschscholzia californica ............... 44 3.3.1 VIGS von EcPDS...................................................................................... 44 3.3.1.1 Phänotypen........................................................................................ 44 3.3.1.2 Analyse der Transkriptmenge von EcPDS......................................... 49 3.3.2 VIGS von EcFLO und EcKNOX................................................................ 50 3.3.2.1 Phänotypen........................................................................................ 50 3.3.2.2 Analyse der Transkriptmengen von EcFLO und EcSTM.................... 53 4. Diskussion ............................................................................................................ 55 4.1 Gewebekultur und Agrobacterium-vermittelte Transformation von Eschscholzia californica.................................................................... 55 4.1.1 Somatische Embryogenese aus Keimlingsexplantaten............................ 55 4.1.2 Somatische Embryogenese aus unreifen Samen..................................... 58 4.2 Der Einfluss von Auxin auf die Blattentwicklung von Eschscholzia californica..................................................................... 61 4.2.1 Der Einfluss von Auxin auf Blattpositionierung und -morphologie ............ 61 4.2.2 Regulation von EcFLO durch Auxin.......................................................... 63 4.2.3 Regulation von EcSTM durch Auxin......................................................... 64 4.3 Virus induziertes Gen Silencing (VIGS) in Eschscholzia californica................ 65 4.3.1 Silencing von Phytoen-Desaturase (PDS)................................................ 65 4.3.2 Die Rolle von EcFLO und EcSTM in der Blattentwicklung von E. californica .....................................................................................