INVESTIGAÇÃO DE FATORES GENÉTICOS NA ETIOLOGIA DA SÍNDROME DO MELANOMA FAMILIAL: COPY NUMBER VARIATIONS (CNV) E SEQUENCIAMENTO DE EXOMA FELIPE FIDALGO DE CARVALHO Tese apresentada à Fundação Antônio Prudente para a obtenção do título de Doutor em Ciências Área de Concentração: Oncologia Orientadora: Dra. Ana Cristina Victorino Krepischi Co-orientadora: Dra. Dirce Maria Carraro São Paulo 2016 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente Carvalho, Felipe Fidalgo de Investigação de fatores genéticos na etiologia da síndrome do melanoma familial: copy number variations (CNV) e sequenciamento de exoma / Felipe Fidalgo de Carvalho – São Paulo 2016. 112p. Tese (Doutorado)-Fundação Antônio Prudente. Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração: Oncologia. Orientadora: Ana Cristina Victorino Krepischi Descritores: 1. MELANOMA/genética. 2. SEQUENCIAMENTO DE NUCLEOTÍDEOS EM LARGA ESCALA. 3. VARIAÇÕES DO NÚMERO DE CÓPIAS DE DNA. 4. HEREDITARIEDADE/genética. 5. EXOMA. DEDICATÓRIA Esse trabalho é dedicado a minha mãe e a minha avó que sempre me deram suporte, força e amor em todos os momentos da minha vida, a minha família e aos meus amigos, especialmente meu irmãozão que não está mais entre nós, Erick Augusto da Silva (o irmão mais velho que eu nunca tive). Além disso, dedico esse trabalho a todos os pacientes e famílias que concordaram em participar de projetos de pesquisa e que tornam possíveis os avanços da ciência. E espero que meu trabalho abra portas em benefício dessas pessoas. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente a Deus e a vida, que me deram todas essas oportunidades até hoje e me permitem acordar todos os dias para dar mais um passo em busca dos meus objetivos. Agradeço minha mãe, sempre presente, nos dias bons e ruins. Você é a minha maior fonte de inspiração e de amor e sempre estarei ao seu lado. Obrigado por me educar, por me mostrar o caminho do bem e por sempre acreditar em mim. Te amo mainha! Agradeço minha avó que hoje é um anjo da guarda que me guia e olha por mim aonde quer que eu vá. Mulher que sempre me ensinou que devemos ter fé sempre, independente da situação, e que devemos nos levantar e ter força sempre para conquistar o que desejamos. Muito obrigado por cuidar de mim e ter depositado todo amor que a Senhora tinha em mim. Sempre vou te amar e te admirar veínha! Agradeço muitíssimo a Ana, minha orientadora, que ao longo desses últimos 6 anos acreditou em mim e me deu essas oportunidades. Obrigado pela paciência, pela força, pela fé em mim, pelas chances, pelas broncas. Obrigado por ter me dado a chance de eu me desenvolver e conquistar esses objetivos. Serei eternamente grato por tudo! Conseguimos!!! Aos amigos de grupo, Dimitrius, Érica e Talita pelo companheirismo durante essa caminhada, pela cia. muitíssimo agradável, pelas piadinhas e por não me deixarem só, pelo menos nas reuniões de quarta, quando eu ostentava que também tinha um grupo hahaha. Obrigado!!! Tati Rodrigues!!! Parceiraça sempre presente nessa jornada, em congressos, reuniões, experimentos, mais congressos, na pipetagem de placa 384 na mão. Enfim, valeu parça!! Tu é sensacional!!! Obrigado!!! Os: me arruma um emprego! hahaha Agradeço aos meus amigos/irmãos. Pela lealdade, amor, carinho, e claro, as zoeiras sem limites. O que seria da minha pessoa sem vocês, cara!!??? Vocês são incríveis!!! Dedico e agradeço também a um grande amigo que infelizmente não faz mais parte desse plano, o cara que eu chamava de irmão mais velho que nunca tive e que sempre admirei. Obrigado pelo tempo que estivemos juntos nessa vida brother!!! Você sempre foi um dos maiores incentivadores da minha caminhada e sempre acreditou muito em mim e no que eu fazia. Obrigado por ensinar pra mim e pra toda nossa galera que pra vencer tem que se jogar de cabeça naquilo que se quer, que tem que ter fé e persistência e nunca passar por cima de ninguém. Essa vitória também tem um Q de EriQUÊ!!! Agradeço a todos meus amigos do CIPE que ao longo desses anos fizeram cada dia de lab muito mais proveitosos e que me fazem agora ter que sair com o coração na mão, com aquele nózinho na garganta da saudade de ver vocês todos os dias e rir nas horas do café, na sinuquinha do Geva, no Marquês antes das 7 pra não pagar a entrada. Enfim, vocês são incríveis e com certeza tenho muito orgulho de dizer que trabalhei com vocês pelas pessoas que são. Agradeço a minha co-orientadora, Dra. Dirce Carraro e a Dra. Bruna Barros, por terem me ajudado muito com os sequenciamentos. Por me ensinarem a técnica e teoria da mesma. Desculpem por algumas reações que não deram certo, mas no fim deu tudo certo! rs Agradeço toda equipe do Departamento de Oncologia Cutânea, principalmente Dr. João Duprat-Neto, Luciana Facure e Dr. Elimar que foram colaboradores valiosos neste trabalho e nos artigos publicados a partir do mesmo. Agradeço muito também a Dra. Maria Isabel Achatz e a enfermeira de pesquisa Amanda França pela valiosíssima contribuição na seleção dos pacientes e das famílias para a execução desse projeto. Agradeço demaaaais a Suely, da biblioteca, pela enorme ajuda na hora de configurar a tese e consertar todos os erros de formatação e de referências!!! Sem você minha tese estaria muito torta! Hahaha... Você é demais!!! Muitíssimo obrigado mesmo!!! RESUMO Carvalho FF. Investigação de fatores genéticos na etiologia da síndrome do melanoma familial: copy number variations (CNV) e sequenciamento de exoma. São Paulo; 2016. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente]. O melanoma é um tipo raro e agressivo de câncer de pele e a maioria dos casos é esporádica. Entretanto, alguns indivíduos da população apresentam alta predisposição ao desenvolvimento de tipos específicos de câncer em decorrência da presença de mutações germinativas e/ou variantes genômicas de risco. Aproximadamente 10% dos casos de melanoma cutâneo são causados por mutações germinativas, em especial no locus CDKN2A, responsável por até 40% do melanoma familial. Outros genes com mutações germinativas altamente penetrantes já foram descritos no melanoma, como CDK4, POT1, TERT, entre outros, mas tais mutações são detectadas em pouquíssimas famílias. Portanto, a etiologia genética da maior parte da predisposição ao melanoma cutâneo permanece não determinada. O objetivo central deste trabalho foi a identificação de variantes genômicas raras associadas à suscetibilidade ao melanoma cutâneo em pacientes negativos para mutações nos principais genes conhecidos. Dois tipos de abordagens metodológicas foram empregadas: o estudo de variações do número de cópias de segmentos genômicos (Copy Number Variation - CNV) e sequenciamento de exoma. A análise de CNV foi realizada em uma casuística constituída por um grupo de 41 pacientes de melanoma cutâneo não relacionados (selecionados como melanoma familial e/ou melanomas múltiplos), sem mutações nos genes de predisposição a melanoma CDKN2A, CDK4, MITF e TERT. Identificamos 10 CNVs raras não recorrentes, distribuídas em 9 dos pacientes (22% da coorte). Todas as CNVs foram validadas pela técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e, adicionalmente, não foram detectadas em um grupo controle de 400 indivíduos. As CNVs detectadas afetam segmentos genômicos grandes (>200 Kb), compreendendo 3 deleções (2q33.3-q34, 6p24.3 e 10q22.3) e 7 duplicações (6p22.1, 10q22.3, 12p12.3, 20p12.1, 4q26-q27, 8q23.1 e 9p24.2). Dentre os genes afetados pela mudança no número de cópias, os principais genes candidatos à predisposição ao melanoma cutâneo são IDH1, ANXA11 e ANGPT1. Na segunda parte deste trabalho, um subgrupo de cinco famílias de melanoma familial, sendo 2 membros afetados de cada família e negativos para CNVs raras foram selecionados para o sequenciamento de exoma. Selecionamos apenas variantes genômicas não- sinônimas que fossem raras na população geral (frequência < 0,01%) segundo bancos de dados populacionais e que estivessem presentes nos dois afetados da família; dessa forma, foram identificadas um total de 214 variantes genômicas raras não- sinônimas em 210 genes. Dentre essas, 63 foram consideradas danosas à função proteica, segundo algoritmos de predição. Oito variantes ocasionam perda de função protéica (LoF – loss-of-function). Entre os 210 genes afetados, os genes MYO7A e WRN, já foram previamente associados à predisposição ao melanoma cutâneo. Adicionalmente, o grupo de genes identificados no exoma está associado a diferentes fenótipos como melanoma (ITGA3, RECK, ADAMTS4, TYMP e MCM3), pigmentação e pele (COL4A2, HPS5, MLPH, VNN2, NID2, SLIT2 e HMCN1), além de suscetibilidade a câncer em geral (ZFHX3 e CTBP2). Em conclusão, nossos dados revelaram alterações germinativas raras em pacientes de melanoma famílial e/ou melanomas múltiplos, como CNVs e mutações potencialmente patogênicas. Este estudo, portanto, identificou novos fatores genéticos de suscetibilidade ao melanoma cutâneo na população brasileira, contribuindo com vários genes candidatos a serem explorados em futuros trabalhos. SUMMARY Carvalho FF. [Investigation of genetic factors on the familial melanoma syndrome etiology: copy number variations (CNV) and exome sequencing]. São Paulo; 2016. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente]. Melanoma is a rare and aggressive kind of skin cancer and sporadic on the most cases. However, some people of the population shows high predisposition to development of specific types of cancer due germline mutations and/or genomic variants of risk. Approximately 10% of all cases of melanoma are caused by germline mutations, specially affecting the CDKN2A locus, which responds up to 40% of familial melanoma cases. Other genes harboring penetrant mutations were already described in hereditary melanoma such as CDK4, POT1, TERT, among others, but these mutations are identified in few families. Therefore, the most part of genetic etiology to cutaneous melanoma predisposition remains not elucidated. The main objective of this work was to identify rare genomic variants associated to the cutaneous melanoma susceptibility in melanoma-prone patients negative for mutations at the main genes associated to this syndrome.