I Abstract ABSTRACT This PhD thesis includes research work on two different projects, involving expression, purification and characterization of two enzymes. The first project was performed at University of Trieste under the supervision of Prof. Rita De Zorzi and was aimed at the structural characterization of Wzx, an O-antigen flippase, from Pseudomonas aeruginosa. Wzx is an integral membrane protein located in the inner membrane of gram-negative bacteria and involved in Lipopolysaccharide (LPS) biosynthesis. P. aeruginosa is an opportunistic pathogen and one of the main causes of nosocomial infections, particularly difficult to eradicate due to the bacterium resistance to antibiotics. Multi drug-resistant P. aeruginosa strains are becoming one of the most common causes of morbidity and mortality in immune-compromised patients, pressing for the development of new drugs. As Wzx is a fundamental enzyme for the assembly of the cell wall, this protein may be a promising target for a new class of antibiotics and antibiotic co-adjuvants, specifically aimed at a single bacterial strain due to the high sequence variability of this protein. Inhibiting the proper LPS biosynthesis could result in the disruption of the bacterial outer membrane, leading to higher antibiotic permeation. The flippase Wzx was cloned in an overexpression vector and subsequently expressed in E. coli. The overexpressed protein was extracted from the lipid bilayer by detergent solubilization and purified through different chromatographic techniques. Expression and purification procedures were optimized, leading to a considerable yield of the membrane protein Wzx, suitable for crystallographic studies. Unfortunately, experiments led to the crystallization of a contaminant, the Cytochrome o Ubiquinol Oxidase. However, smaller crystals grown in different conditions were obtained and, considering the differences in the unit cell parameters, the study continued with the optimization of these conditions. So far, the quality of the crystals did not allow structure determination. In parallel, protein folding and stability were investigated with circular dichroism and fluorescence spectroscopy. IR and Raman spectroscopies yielded information on the unfolding process of Wzx. The oligomeric state of the protein was investigated by negative staining EM. The second project was performed at the Structural Biology Laboratory of the Elettra Synchrotron (Trieste), under the supervision of Dr. Paola Storici. This project was aimed at the structural determination of the complex between the human Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3-) and its inhibitor SR90, synthesized by the laboratory of Dr. Stephanie Federico at University of Trieste. GSK3- catalyzes the addition of a phosphate group to specific protein targets and is part of the regulation mechanisms of multiple metabolic pathways, including signaling cascades involved in neurodegenerative disorders. In particular, GSK3- is implicated in the formation of -amyloid I Abstract aggregates, in the hyperphosphorylation of protein tau and in the accumulation of -Synuclein – molecular processes that are thought to lead to Alzheimer and Parkinson diseases. Since an inhibition of this kinase may be beneficial for the treatment of these pathologies, SR90 inhibitor was designed to covalently bind GSK3-. In addition, SR90 is able to inhibit another kinase, the Casein Kinase1 (CK1-), by competing for ATP binding. CK1- is also involved in neurodegenerative pathologies and phosphorylates GSK3- substrates, acting as a priming kinase. Three constructs of GSK3- were cloned and expressed in insect cells: the full length and two truncated constructs, corresponding to residues 25-393 and 35-386, respectively. In the latter, the N- and C-termini were removed due to their flexibility that may hamper the crystallization. The shorter construct (residues 35-386) was efficiently expressed and purified to a high purity grade. The inhibitor activity towards the kinase was investigated by Thermal Shift Assays to determine the binding effect on protein stability. Since the compound seemed to greatly stabilize protein folding, co-crystallization trials between GSK3-35-386 and SR90 were set up, in addition to crystallization tests for the apo protein. Conditions were initially screened using commercially available kits and subsequently optimized. The X-ray diffraction patterns of the crystals were collected at the Elettra Synchrotron obtaining data at 2.6 Å resolution for the apo kinase, at 2.4 Å resolution for the apo crystal soaked in the inhibitor solution, and at 2.3 Å for the co-crystal of GSK3- and the inhibitor. The analysis of the electron density maps of both the co-crystallized structure and that obtained from soaking experiments demonstrated the formation of a covalent protein-inhibitor bond involving the residue Cys199 of GSK3-, confirming previous computational modelling simulations. Activity assays were performed to assess SR90 potency, obtaining an IC50 value of 0.49 M. II Abstract RIASSUNTO Questa tesi di dottorato include il lavoro di ricerca su due progetti diversi riguardanti l’espressione, la purificazione e la caratterizzazione di due enzimi. Il primo progetto è stato svolto all’Università di Trieste sotto la supervisione della professoressa Rita De Zorzi ed era volto alla caratterizzazione strutturale della O-antigen flippasi Wzx da Pseudomonas aeruginosa. Wzx è una proteina integrale di membrana che si trova nella membrana interna dei batteri gram-negativi ed è coinvolta nella biosintesi del lipopolisaccaride (LPS). P. aeruginosa è un patogeno opportunista e una delle principali cause delle infezioni nosocomiali, è inoltre particolarmente difficile da eradicare a causa della sua resistenza agli antibiotici. Ceppi di Pseudomonas multi- resistenti stanno diventando una delle cause più comuni di morbilità e mortalità nei pazienti immunocompromessi, rendendo necessario lo sviluppo di nuovi farmaci. Essendo Wzx un enzima fondamentale per la formazione della parete cellulare, questa proteina potrebbe essere un promettente bersaglio per una nuova classe di antibiotici e di adiuvanti degli antibiotici. Vista l’alta variabilità di sequenza della flippasi, questi farmaci sarebbero specificamente diretti verso un singolo ceppo batterico. L’inibizione della biosintesi dell’LPS può causare il disassemblaggio della membrana esterna del batterio portando a una maggiore permeazione degli antibiotici all’interno della cellula. La flippasi Wzx è stata clonata in un vettore di overespressione e successivamente trasformata in E. coli. La proteina overespressa è stata estratta dal doppio strato fosfolipidico solubilizzandola in detergente e purificata attraverso diverse tecniche cromatografiche. Le procedure di espressione e purificazione sono state ottimizzate portando a una considerevole resa della proteina di membrana utilizzabile per gli studi cristallografici. Sfortunatamente, gli esperimenti hanno portato alla cristallizzazione di un contaminante, il Citocromo o Ubichinolo Ossidasi. Comunque, sono stati ottenuti dei piccoli cristalli in condizioni differenti che, considerando la differenza dei parametri di cella unitaria, sono stati ottimizzati. Finora la qualità dei cristalli non ha permesso la determinazione della struttura. Parallelamente, il folding e la stabilità della proteina sono stati investigati con il dicroismo circolare e la spettroscopia di fluorescenza. Inoltre, le spettroscopie IR e Raman hanno fornito informazioni sul processo di degradazione di Wzx. Lo stato oligomerico della proteina è stato investigato con il microscopio elettronico utilizzando la tecnica del negative-staining. Il secondo progetto è stato svolto nel Laboratorio di Biologia Strutturale di Elettra Sincrotrone (Trieste) sotto la supervisione della dottoressa Paola Storici. Questo progetto era volto alla determinazione strutturale del complesso tra la Glicogeno Sintasi Chinasi 3 (GSK3-) e il suo inibitore SR90, sintetizzato nel laboratorio della dottoressa Stephanie Federico all’Università di Trieste. GSK3- catalizza l’addizione di un gruppo fosfato a specifiche proteine bersaglio e fa parte dei meccanismi di regolazione di molteplici vie metaboliche tra cui le cascate di segnale associate ai III Abstract disordini neurodegenerativi. In particolare, GSK3- è implicata della formazione degli aggregati di -amiloide, nell’iperfosforilazione della proteina tau e nell’accumulo di -sinucleina che sono processi molecolari che sembrano portare alle malattie di Alzheimer e Parkinson. Visto che un’inibizione di questa chinasi può essere benefica per il trattamento di queste patologie, l’inibitore SR90 è stato progettato per legarsi covalentemente con GSK3-. Inoltre, SR90 è in grado di inibire un’altra chinasi, la casein chinasi1 (CK1-), competendo con il legame dell’ATP. Anche CK1- è coinvolta nelle patologie neurodegenerative e fosforila i substrati di GSK3- agendo come chinasi iniziatrice. Tre costrutti sono stati clonati ed espressi in cellule d’insetto: la proteina intera e due costrutti troncati, corrispondenti ai residui 25-393 e 35-386 rispettivamente, in cui i terminali sono stati rimossi a causa della loro flessibilità che può pregiudicare la cristallizzazione. Il costrutto più corto (35-386) è stato efficientemente espresso e purificato ottenendo un alto grado di purezza. L’attività dell’inibitore sulla chinasi è stata investigata con il Thermal Shift Assay per determinare l’effetto del legame sulla stabilità della proteina. Visto che il composto si è dimostrato in