CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA GLUCOSA OXIDASA (GOX) (EC 1.1.3.4.) LIBRE E INMOVILIZADA EN DOS SOPORTES (ALGINATO DE SODIO Y AGAROSA) PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUCÓNICO. MILENA SOSA ROMERO PATRICIA GALVIS FRANCO UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA “UNAD” ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS BOGOTA 2010 1 CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA GLUCOSA OXIDASA (GOX) (EC 1.1.3.4.) LIBRE E INMOVILIZADA EN DOS SOPORTES (ALGINATO DE SODIO Y AGAROSA) PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUCÓNICO MILENA SOSA ROMERO PATRICIA GALVIS FRANCO Trabajo de grado presentado como requisito parcial Para optar el título de Ingeniero de alimentos Ing. GLAEHTER YOHN FLOREZ GUZMAN Director UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA “UNAD” ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS TECNOLOGIA E INGENIERIA INGENIERIA DE ALIMENTOS BOGOTA 2010 2 Nota de Aceptación ______________________ ______________________ ______________________ ______________________ __________________________ Firma del presidente del jurado _______________________ Firma del jurado _______________________ Firma del jurado 3 DEDICATORIA A mi mamá que con gran sacrificio y mucho trabajo, ha logrado sacar adelante a sus hijas con todo el amor y buen ejemplo que solo una madre puede dar. A mi hermana que me tuvo una paciencia enorme y que también en muchas ocasiones aportó su grano de arena para hacer este trabajo una realidad. Patricia Galvis F. Primero que todo a Dios por permitirme hacer este sueño realidad. A mi esposo Andrés, padres y hermanos por su apoyo incondicional, a mi hijo Tomás quien es el motor de mi vida y a cada una de las personas que de una u otra forma me colaboraron para poder llevar a cabo este trabajo. | Milena Sosa R. 4 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN DELIMITACIÓN DEL TEMA PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA JUSTIFICACIÓN INTRODUCCIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. MARCO TEORICO ENZIMOLOGÍA Nomenclatura y Clasificación de las Enzimas 1.2 CINETICA ENZIMATICA 1.2.1 Enzima Micheliana 1.2.2 Enzima Alostérica 1.3 GLUCOSA OXIDASA 1.3.1 Reacción de la Glucosa Oxidasa 1.3.2 Activadores de la Glucosa Oxidasa 1.4 SUSTRATO 1.4.1 Glucosa 1.5 INMOVILIZACION EMZIMATICA 1.5.1 ALGINATO DE SODIO 1.5.1.1 Origen 1.5.1.2 Características 1.5.2 Estructura Química de los Alginatos 1.5.3. Propiedades de la Solución de Alginato de Sodio 1.5.4 Efecto del Peso Molecular en el Alginato de Sodio 1.5.6 Efecto de la Concentración en el Alginato de Sodio 5 1.5.7 Efecto de la Temperatura en el Alginato de Sodio 1.5.8 Efecto del pH en el Alginato de Sodio 1.6. AGAROSA 1.7. ACIDO GLUCÓNICO 1.7.1 Industria Alimentaría 1.7.2 Industria Farmacéutica 1.7.3. Producción de Envases y Equipamientos 1.7.4 Usos Agropecuarios 2. METODOLOGÍA 2.1. Glucosa Oxidasa (GOX) (EC 1.1.3.4.) 2.2. Unidades de Actividad Enzimática 2.3. Sustrato 2.4. Reacción Enzimática 2.5. Caracterización de la enzima libre 2.5.1. Efecto de la temperatura sobre la Actividad Enzimática 2.5.2. Efecto del pH sobre la Actividad Enzimática 2.5.3. Efecto de la concentración de sustrato sobre la Actividad Enzimática 2.6. Inmovilización de la Enzima 2.6.1. Alginato de Sodio 2.6.2. Determinación de la Concentración optima del Alginato de Sodio 2.6.3. Preparación de las esferas de Alginato de Sodio con Enzima atrapada 2.7. Determinación de la concentración optima del Gel de Agarosa 2.7.1. Preparación del Gel de Agarosa con enzima 2.7.2. Cuantificación de la enzima inmovilizada 2.8. Caracterización de la Glucosa Oxidasa inmovilizada en Alginato de Sodio 2.8.1. Efecto de la temperatura sobre la Actividad Enzimática 2.8.2. Efecto del pH sobre la Actividad Enzimática 2.8.3. Efecto de la concentración de sustrato sobre la Actividad Enzimática 2.9. Caracterización de la Glucosa Oxidasa inmovilizada en Gel de Agarosa 2.9.1. Efecto de la temperatura sobre la Actividad Enzimática 2.9.2. Efecto del pH sobre la Actividad Enzimática 6 2.9.3. Efecto de la concentración de sustrato sobre la Actividad Enzimática 3. ANALISIS DE RESULTADOS 3.1. Caracterización de la Enzima Libre 3.1.1. Influencia de la temperatura sobre la Actividad Enzimática 3.2 Inmovilización de la enzima 3.2.1 Determinación de la concentración optima de alginato de sodio 3.3 Influencia del pH sobre la Actividad Enzimática 3.4 Influencia de la concentración de sustrato sobre la Actividad Enzimática 3.5 Cinética enzimática de la Glucosa Oxidasa (GOX) libre 3.5.1 Linealización Km y Vm 3.6 Cinética enzimática de la Glucosa Oxidasa (GOX) inmovilizada en alginato de sodio 3.6.1. Linealización Km y Vm 3.7. Cinética enzimática de la Glucosa Oxidasa (GOX) inmovilizada en agarosa 3.7.1 Linealización Km y Vm 4. Diseño Experimental CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA GLOSARIO ANEXOS 7 AGRADECIMIENTOS Los autores expresan sus agradecimientos a: A Dios por permitirnos alcanzar nuestra meta, concediéndonos la fuerza y el empeño necesarios para alcanzar nuestros propósitos. A nuestro Director Yhon Flórez Guzmán, Ingeniero de Alimentos, MSc, muy especialmente por su constante orientación y guía en la culminación de este proyecto. Claudia Cisneros, Harrison Corza Polanía, Gabriela Romero, Angélica María Yara y a Luis Domingo Galvis, por su desinteresada, eficiente y eficaz colaboración en la utilización de los laboratorios permitiendo la realización de los ensayos y obtener así los datos para el trabajo de grado. A la Universidad Nacional Abierta y a Distancia (UNAD) y a todos los docentes que brindaron sus conocimientos durante la carrera. 8 LISTA DE TABLAS Tabla 1 Funciones y clasificación de las enzimas Tabla 2 Nombres alternativos de la Glucosa oxidasa Tabla 3 Cofactores de la Glucosa oxidasa Tabla 4 Enzimas que requieren cofactores Tabla 5 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L libre e inmovilizada Tabla 6 Efecto del ph sobre la actividad de la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L libre e inmovilizada Tabla 7 Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la enzima comercial Glucosa oxidasa Maxazyme 4000 L libre e inmovilizada Tabla 8 Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la enzima comercial Glucosa oxidasa Maxazyme 4000 L en agarosa inmovilizada Tabla 9 Relación entre la concentración de sustrato y la actividad enzimática. Tabla 10 Valores de actividad y sustrato de la enzima (GOX) inmovilizada en alginato de sodio. 9 LISTA DE FIGURAS Figura No. 1 Reacción de la Glucosa oxidasa Figura No. 2 Estructura química de la glucosa Figura No. 3 Fórmulas clásicas de las dos unidades monoméricas del ácido algínico Figura No. 4 Fórmulas en forma de silla Figura No. 5 Estructura química de la agarosa Figura No. 6 Estructura disacárido agarobiosa Figura No. 7 Estructura química del acido glucónico Figura No. 8 Obtención de ácido glucónico 10 LISTA DE GRAFICOS Gráfico No.1: Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L libre Gráfico No.2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L inmovilizada en alginato de sodio. Gráfico No.3: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L inmovilizada en agarosa. Gráfico No.4: Efecto del pH sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L libre Gráfico No.5: Efecto del pH sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX 4000 L inmovilizada en alginato de sodio Gráfico No.6: Efecto del pH sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L inmovilizada en agarosa Gráfico No.7: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L libre Gráfico No.8: Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L inmovilizada en agarosa. Gráfico No.9: Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad enzimática en la enzima comercial Glucosa oxidasa GOX Maxazyme 4000 L inmovilizada en alginato de Sodio Gráfico No.10: Linealización de la relación entre sustrato ya actividad enzimática utilizando la Ecuación de Linewcaver Burk. Gráfico No.11: Valores de actividad y sustrato de la enzima (GOX). 11 ANEXOS Anexo A. Ensayos de laboratório Anexo B. Ficha técnica de la enzima Glucosa Oxidasa Anexo C. Diagrama preparación de la solución buffer 50 Mm. Anexo D. Diagrama de la inmovilización de la enzima Glucosa Oxidasa en alginato de sodio. Anexo E. Diagrama de la inmovilización de la enzima Glucosa Oxidasa en agarosa. 12 RESUMEN CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA GLUCOSA OXIDASA (GOX) (EC 1.1.2.4.) LIBRE E INMOVILIZADA EN DOS SOPORTES (ALGINATO DE SODIO Y AGAROSA) PARA LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO GLUCÓNICO. El objetivo de este trabajo consiste en la caracterización de la enzima comercial glucosa oxidasa GOX EC(1.1.2.4) marca Maxazyme 4000 L de Novonordys libre e inmovilizada en dos tipos de soportes alginato de sodio y agarosa. Inicialmente se caracterizó fisicoquímica y cinéticamente la enzima libre en cuanto a sus parámetros óptimos de pH, temperatura y concentración de sustrato, obteniendo unos valores de 5, 55°C y 0,22 M de glucosa como sustrato respectivamente. La enzima muestra un comportamiento Micheliano con un Vmax: 714.2 y un Km de 22.8 mM, por el método de Lineweaver Burk. Las condiciones óptimas de inmovilización en alginato fueron: 2% de alginato de sodio y 1.5% de cloruro de calcio (CaCl2), con un tamaño de partícula y la concentración de agarosa fue del 3% p/v.