UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE Lychnophora pinaster MART. PAULO SÉRGIO SIBERTI DA SILVA Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura) BOTUCATU – SP Abril-2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA E COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE Lychnophora pinaster MART. PAULO SÉRGIO SIBERTI DA SILVA Orientadora: Profa. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques Coorientadora: Profa. Dra. Maria Imaculada Zucchi Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Horticultura) BOTUCATU – SP Abril-2016 III AGRADEÇO À CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão da bolsa de estudos, da qual esta tese é derivada. À Profa. Dra. Márcia Ortiz Mayo Marques (IAC) por ter aceito me orientar desde o mestrado, pela amizade, sinceridade (sempre!), apoio, dedicação, conselhos, críticas, paciência, pelo exemplo de profissionalismo, sendo a minha principal referência profissional durante estes cinco anos de caminhada. Obrigado Profa. Márcia! Vou carregar comigo tudo que aprendi com você. Foi um previlégio e, onde estiver, sempre vou praticar os seus ensinamentos de rigor, transparência, sinceridade, ética e de qualidade na pesquisa e no ensino. Isso foi o que mais me marcou durante a nossa caminhada juntos; À Profa. Dra. Maria Imaculada Zucchi (APTA) pela coorientação, conselhos, críticas, opoio e amizade. Ao Dr. José Baldin Pinheiro (ESALQ), pelo apoio e por ceder a estrutura necessária para realização do estudo de biologia molecular. Ao Dr Ronei Jesus Poppi (UNICAMP), pelos ensinamentos e ajuda nas análises quimiométricas. Ao Dr. Miklos Maximiliano Bajay (ESALQ) e à Jaqueline Campos (UNICAMP), pelo apoio nas estatísticas e experimentos de biologia molecular, respectivamente. À Profa. Dra. Alexandra C. H. Frankland Sawaya (UNICAMP), por ceder a estrutura necessária, ensino e apoio nos experimentos de cromatografia líquida. À Dra. Carolina Borsoi e ao doutorando Caio Haddad, do CNPEM, pelo estrutura necessária e apoio nos experimentos de atividade biológica e citotoxicidade. Ao Prof. Dr. Luiz Fernando Rolim de Almeida, pelo apoio desde o mestrado em tudo que foi preciso, pelos ensinamentos, as dicas, críticas, sugestões e gentileza. Aos proprietários das áreas de coleta, que cederam os locais para o estudo; A todos os colegas de laboratório e pós-graduação que, de certa forma, sempre me deram força nesta caminhada. Agradeço em particular à Deus, que indicou os caminhos certos quando solicitei. Aos meus pais, Paulo Cézar e Guiomar Siberti, e à minha esposa Claudia pelo apoio incondicional. E mais que especial, agradeço à minha filha, Anna Julia, pelos momentos de amor, distração e alegria, sendo o meu refúgio nos momentos mais difíceis. Devido à ela, os meus problemas da pós-graduação se transformaram em inspiração e superação. Obrigado a todos, sempre lembrarei de vocês! IV DEDICO E OFEREÇO À minha filha, Anna Julia Borba Siberti da Silva, à minha esposa, Claudia Soares de Borba e à minha mãe, Guiomar Siberti da Silva. V SUMÁRIO PÁGINA LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ................................................................ VIII RESUMO .............................................................................................................................. 1 SUMMARY .......................................................................................................................... 3 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 5 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 9 2.1. Geral ............................................................................................................................. 9 2.2. Específicos ................................................................................................................... 9 3. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ........................................................................ 11 3.1. O Domínio Fitogeográfico do Cerrado e os Campos Rupestres ................................ 11 3.2. A Família Asteraceae ................................................................................................. 12 3.3. O Gênero Lychnophora Mart. .................................................................................... 13 3.4. A Espécie Lychnophora pinaster Mart. ..................................................................... 15 3.4.1. Sinônimos Botânicos, Hábitos, Ocorrência e Uso Tradicional ........................ 15 3.4.2. Características Ecológicas ................................................................................ 16 3.4.3. Características Morfológicas e Fenológicas .................................................... 17 3.4.4. Estudos das Atividades Biológicas de Lychnophora pinaster ......................... 18 3.5. Metabolismo Especializado Vegetal .......................................................................... 21 3.5.1. Óleos Essenciais ............................................................................................... 22 3.5.1.1. Fatores Genéticos e Ambientais e a Produção dos Óleos Essenciais............ 23 3.5.2. Extratos Vegetais: Definição e Uso ................................................................. 24 3.5.2.1. Fatores que Influenciam na Composição Química de Extratos Vegetais ..... 25 3.6. Marcadores Moleculares ............................................................................................ 26 3.6.1. Marcadores Microssatélites .............................................................................. 28 3.7. Diversidade Genética ................................................................................................. 30 3.8. Estrutura Genética Populacional ................................................................................ 32 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 34 4.1. Estudo de Diversidade Genética e Estrutura Populacional de Lychnophora pinaster utilizando Marcadores SSR ................................................................................................. 36 4.1.1. Coleta do Material Vegetal .............................................................................. 36 4.1.2. Extração e quantificação de DNA .................................................................... 38 4.1.3. Amplificação e Determinação dos Microssatélites .......................................... 39 4.1.4. Análises Estatísticas ......................................................................................... 41 VI 4.1.4.1. Variabilidade genética ................................................................................... 41 4.1.4.2. Estrutura Populacional .................................................................................. 42 4.2. Estudo da Composição Química dos Óleos Essenciais e dos Extratos Etanólicos das Populações de Lychnophora pinaster .................................................................................. 43 4.2.1. Coleta e Beneficiamento do Material Vegetal ................................................. 44 4.2.2. Análise dos Solos dos Locais de Coleta das Populações ................................. 44 4.2.3. Extração dos Óleos Essenciais das Folhas ....................................................... 44 4.2.4. Análise da Composição Química dos Óleos Essenciais .................................. 45 4.2.4.1 Análises Estatísticas ....................................................................................... 46 4.2.5. Obtenção dos Extratos Etanólicos .................................................................... 47 4.2.6. Análise dos Extratos por UHPLC-MS ............................................................. 47 4.3. Estudo in vitro da Atividade Tripanocida dos Extratos Etanólicos e dos Óleos Essenciais de Populações de Lychnophora pinaster ........................................................... 49 4.3.1. Cultura de Células ............................................................................................ 50 4.3.2. Parasita Trypanosoma cruzi ............................................................................. 50 4.3.3. Composto de Referência e Amostras ............................................................... 50 4.3.4. Preparo das Amostras ....................................................................................... 50 4.3.5. Ensaio Anti-Tripanossoma cruzi ..................................................................... 51 4.3.6. Definições ........................................................................................................ 52 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 53 5.1. Estudo de Diversidade Genética e Estrutura Populacional de Lychnophora pinaster Utilizando Marcadores SSR ................................................................................................ 53 5.1.1. Variabilidade Genética ....................................................................................