UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA Jênifer Silva Nogueira ESTRATÉGIAS PARA A CONSERVAÇÃO EX SITU DE Dendrocalamus asper E MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES DO GÊNERO Guadua (BAMBUSOIDEAE, POACEAE) Orientador: Jonny Everson Scherwinski-Pereira Brasília, 2018 Jênifer Silva Nogueira ESTRATÉGIAS PARA A CONSERVAÇÃO EX SITU DE Dendrocalamus asper E MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES DO GÊNERO Guadua (BAMBUSOIDEAE, POACEAE) Orientador: Jonny Everson Scherwinski-Pereira Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Botânica do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília, com pesquisa desenvolvida na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, para obtenção do título de Doutora em Botânica. Brasília, 2018 Folha de Aprovação Tese de Doutorado apresentada por Jênifer Silva Nogueira, com o título: ESTRATÉGIAS PARA GERMINAÇÃO E CONSERVAÇÃO EX SITU DE Dendrocalamus asper E MICROPROPAGAÇÃO DE ESPÉCIES DO GÊNERO Guadua (BAMBUSOIDEAE, POACEAE) ao Programa de Pós-Graduação em Botânica da UnB como requisito à obtenção do título de Doutora. A Tese foi aprovada em sua forma final pela comissão julgadora instituída pelo Programa de Pós-Graduação em Botânica da UnB. Brasília, ______de_______________de 2018. ____________________________________________________ Dr. Jonny Everson Scherwinski-Pereira (Presidente) Embrpa Recuros Genéticos e Biotecnologia Departamento de Botânica, IB/UnB ____________________________________________________ Dr. Thomas C. Rhys Williams (Membro interno) Departamento de Botânica, IB/UnB _____________________________________________________ Dr. João Batista Teixeira Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Membro externo) _____________________________________________________ Dra. Jaqueline Martins Vasconcelos (Membro externo) Universidade Federal de Rondônia, UNIR _____________________________________________________ Dra. Maria Elvira de Rezende (Membro externo, Suplente) Embrapa Quarentena Vegetal Ofereço À minha, mãe Luceneida Silva Ao meu, pai João Faria Nogueira Dedico À minha avó, Nelcionita Clara de Castro Agradecimentos À minha mãe Luceneida pelo amor e apoio incondicionais. Ao meu pai João Faria e minha madrasta Weiva por todo incentivo. À minha vozinha Sonita, que mesmo com toda sua simplicidade sempre me incentivou a seguir em frente. Aos meus irmãos Danillo, Vinicius, Weider e Myllane pela compreensão da minha ausência e principalmente, por terem me presenteado com meus amados sobrinhos Emanuelle, Joaquim, Ana Lívia e João Pedro, meus recarregadores de energia. Ao namorado, amigo e companheiro de todas as horas André Carvalho. Ao meu orientador Jonny Everson Scherwinski Pereira por me receber em seu grupo de pesquisa e possibilitar excelentes condições de trabalho. A todos os professores do departamento de Botânica da UnB que contribuíram de alguma forma nesse processo, seja durante as disciplinas ou durante as etapas de defesa do projeto e de qualificação. Especialmente a professora Sueli pelas contribuições durante o estágio docência, ao professor Thomas, pela orientação durante o estágio docência e pelo auxílio fundamental nas análises bioquímicas e também a professora Cássia pelo excelente trabalho a frente da coordenação do programa. Aos funcionários do departamento e as secretárias do IB, particularmente Sarah Lee. Aos colegas que passaram pelo LCT II da Embrapa Recursos Genéticos Amanda Kenya, Cheila Ferreira, Fernanda Furlan, Filipe Sathler, Giuliano Frugeri, Glória, Hugo Gomes, Inaê Mariê, Jéssica Barbosa, Luciana Lacerda, Patrícia Bartos, Paulo César, Paloma Lima, Rafaela Liz, Raphael Ferreira, Rennan Meira, Samanta Siqueira e Talita Balzon, que contribuíram de forma direta e indireta com o desenvolvimento dos experimentos e agradeço principalmente, pela convivência diária e os momentos de descontração. À Zanderluce Gomes Luis amiga desde a graduação, por me mostrar este árduo e gratificante caminho; à Gabriela Nogueira por pegar sempre no meu pé e não me deixar esquecer de como é a convivência entre irmãos; à Emília Saleh por ser tão mãezona; e Jaqueline Martins por ter um coração enorme. Obrigada pela amizade, pelos jantares, conversas jogadas fora e mesmo com cada uma seguindo seu caminho e seus compromissos não terem deixado de dar tanto apoio. Aos colegas de pós-graduação do PPG-Botânica e demais programas da UnB, com quem convivi, mesmo que brevemente, Ana Fabricia, Cíntia Bonatto, Daiane Gonzaga, Edriana Araújo, Fernanda Catenacci, Natasha Silva e Thiago Moreira. Às amigas irmãs Aurélie Piocnhon, Katiane Godoi e Kélvia Simene que mesmo com a distância não deixaram de estar sempre presentes. À Mariana Carvalho pela amizade, conversas filosóficas e principalmente por me abrigar nos momentos iniciais e finais desta jornada. Às “colegas de quarto” hoje amigas para a vida Camila Ananias, Maria Cunha e Auricélia Miranda e as demais companheiras de moradia, porém não menos importantes, Ada Vidal, Ariane Pandolfo, Isis Caniello e Lívia Nascimento. Ao André Xavier de Souza, analista do LCT II, pelo pronto auxílio e paciência. Ao Dr. João Batista Teixeira e Dra. Maria Elvira por suas inúmeras contribuições a esta pesquisa, durante a avaliação do projeto e/ou dos resultados parciais. Ao Dr. Luciano Paulino pelo auxílio na tentativa de eliminar os contaminantes dos explantes durante o desenvolvimento dos estudos e possibilitar a identificação de bactérias de ocorrência em bambus. E à Dra. Arailde Fontes Urben pela identificação de fungos de ocorrência em bambus. Ao Instituto Jatobás e ao Vitor Marçal pela disponibilização de sementes e mudas de bambu para o desenvolvimento desta pesquisa. Ao Cnpq e a Capes pela concessão de bolsa DTI e de doutorado. A todos não nomeados aqui, mas que de alguma forma agregaram conhecimento, boas energias e auxiliaram no meu desenvolvimento profissional, pessoal e espiritual. RESUMO Neste trabalho foram estudadas três espécies de bambus lenhosos sendo uma espécie nativa da Ásia (Dendrocalamus asper), uma nativa das Américas (Guadua angustifolia) e a última endêmica da região Centro-oeste (Guadua magna), com o objetivo de elucidar questões sobre a germinação, conservação ex situ e micropropagação. Dessa forma, referente as sementes e a germinação de D. asper, foram realizados estudos de germinação em papel germitest, substrato Bioplant e meio de cultivo de MS em duas condições de luminosidade: claro e escuro. Também foram realizados testes para desinfestação de sementes com NaOCl2 e HgCl2. Além da avaliação da germinação em tubos de ensaio com de MS semissólido e em biorreatores RITA com meio de MS liquido com adição (Sac+) ou não (Sac-) ao meio. Como resultado o meio de cultivo in vitro aliado a desinfestação com cloreto de mercúrio foi o mais promissor para germinação de D. asper independente das condições de luminosidade. Após a germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas com três fenótipos distintos (verde, variegado e albino), quantificou-se o DNA nuclear através de citometria de fluxo e os fenótipos não apresentaram diferenças na quantidade de DNA. Durante a germinação e desenvolvimento pós-seminal, também realizou-se a caracterização anatômica, histoquímica e análise bioquímicas, constatando-se que as sementes desta espécie possuem endosperma amiláceo, camada de aleurona e embrião maduro bem desenvolvido. Sendo o amido o metabólito mais abundante, seguido por proteínas e lipídeos. Para o protocolo de criopreservação, sementes de D. asper foram dessecadas por 0, 24, 48, 96 e 144 horas em dessecador. Ao término de cada período de dessecação as sementes foram divididas em três partes: uma parte foi seca em estufa por 24 horas para medir o teor de umidade; a segunda parte foi colocada para germinar em meio de MS e a terceira parte foi imersa em nitrogênio líquido (-196 ºC) por 48 horas, depois desse período foram descongeladas e inoculadas em meio de MS. A dessecação de sementes por até 144 horas garantiu um teor de umidade de cerca de 5% e não influenciou na germinabilidade tanto em nenhum dos tratamentos (-NL e +NL), o que indica o possível comportamento ortodoxo destas sementes. A conservação ex vitro foi realizada a partir do armazenamento de sementes sob as temperaturas de 25 (controle), 6, -20 e -196 ºC por 0, 30, 90, 180, 360 e 600 dias. Após cada período de armazenamento as sementes foram inoculadas em tubos com meio de MS. As plantas obtidas da germinação foram aclimatizadas. Nos períodos de armazenamento de 0, 360 e 600 dias foram coletadas sementes para realização de análises bioquímicas, onde quantificou-se amido, proteínas e lipídeos. Sementes de D. asper mantem sua viabilidade por até 600 dias quando conservadas nas temperaturas de -20 ºC e -196 ºC, enquanto na temperatura de 25 ºC ocorre decréscimo acentuado da viabilidade aos 600 dias, além de ocorrer o desenvolvimento anormal de plantas. A análise da composição bioquímica das sementes conservadas corroborou com os resultados obtidos no experimento de germinação, apresentando poucas diferenças para os metabólitos entre os períodos de armazenamento. Para as espécies G. magna e G. angustifolia objetivou-se desenvolver um protocolo de micropropagação completo, a partir de mudas mantidas em casa de vegetação onde foram tratadas ou não com fungicida Mythos. Em laboratório, para etapa de estabelecimento segmentos nodais foram inoculados em meio de MS com diferentes formulações: MS normal; MS com 3,0 m.L-1 de PPM e MS com 1 m.L.L-1 de fungicida Carbendazin. A adição de Carbendazin e PPM ao meio, reduziram a contaminação em G. magna e não influenciaram a taxa de contaminação