TTHHÈÈSSEE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l’Université Toulouse III- Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Physiopathologie
Présentée et soutenue par Elodie Trouche Le 2 mars 2010
Utilisation des cellules souches adultes dans le cadre de la thérapie Cellulaire des organes solides : études des relations cellules greffées- environnement tissulaire.
JURY Pr. Angelo PARINI Professeur des universités/Praticien Hospitalier, Toulouse Président Dr. Jöel NARGEOT Directeur de recherche au CNRS, Montpellier Rapporteur Dr. Jean-Loup Bascands Directeur de recherche à l’INSERM, Toulouse Rapporteur Dr. Sylvie BEGU Maître de Conférence, Montpellier Rapporteur Dr. Luc Sensébé Directeur Médical et Scientifique de l’EFS Centre-Atlantique, Tours Examinateur Dr. Daniel CUSSAC Maître de Conférence, Toulouse Directeur de Thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies Unité de recherche : INSERM U858-Equipe 6 Directeur de Thèse :Dr. Daniel Cussac
Remerciements
à Ghislain,
Remerciements
Tout d’abord je tiens à remercier Monsieur Angelo Parini de m’avoir fait l’honneur d’accepter de présider cette thèse et de m’avoir acceuilli dans son équipe.
Je remercie sincèrement Monsieur Jöel Nargeot et Madame Sylvie Bégu d’avoir accepté d’être mes rapporteurs et d’avoir pris le temps de juger ce travail de thèse. Merci pour vos remarques constructives.
Je tiens également à remercier Messieurs Luc Sensébé et Jean-Loup Bascands d’avoir accepté de participer à ce jury.
Je remercie enfin Daniel de m’avoir fait confiance et de m’avoir permis de réaliser ma thèse dans son équipe. Merci pour ton encandrement et tes conseils qui m’ont permis de mener ce travail à bien.
Remerciements
Ce travail est également dédié
à Céline pour tout ton soutien, ton aide, ton écoute, ta patiente et ton amitié. Je te souhaite pleins de bonnes choses pour l’avenir.
à MH pour ton aide technique, ton soutien moral et surtout pour animer le labo. Ces quatre ans auraient été tristes sans tes râleries quotidiennes !!!!
à l’ensemble de l’équipe 6 Jeanne, Nanou, Cathy, Christelle, Oxana, Camille, Claire et Christophe pour m’avoir aidé, chacun à sa façon, à l’élaboration de ce travail.
à l’équipe « capsule » Brigitte, Sophie et Caroline pour m’avoir aidé à développer ce projet.
à Denis pour tout ton travail en microchirurgie.
à mes amies, les « Aveyronnaises » Laure et Mélanie pour toutes ces soirée en aveyron et tous ces moments passés aux jardins de varennes et ailleurs, Mais aussi à Laure la « béarnaise » pour tous les moments de détente que nous avons partagés. Merci de m’avoir écouté me plaindre pendant toutes ces années et pour votre présence dans les bons comme dans les mauvais moments. Maintenant je vous attends à la « playa » !!!!
à ma famille, mes parents sans qui je ne serais pas arrivée jusque là. Nathalie, Jöel, Sylvie, Joseph et Jérôme pour votre soutien inconditionnel même quand il fallait m’héberger, me faire à manger et faire mes lessives !!!A mon tour maintenant de vous inviter à manger (pas de sourire moqueur en lisant cettre phrase !!). Aux « petits » Laura (qui est plus grande que moi !!), Adrien, Louis, Gabriel et Justin pour tout votre amour.
à Jérôme pour ton soutien et ta patiente pendant cette stressante dernière ligne droite. Le meilleur reste à venir.
Résumé
Les travaux de mon Doctorat ont été réalisés dans le domaine de la thérapie cellulaire des organes solides. Dans cette nouvelle stratégie thérapeutique, je me suis intéressée aux problèmes de la mortalité des cellules greffées, les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) médullaires, au moment de leur administration. Le premier axe a consisté à étudier les relations qu’il existait entre les cellules greffées et l’environnement tissulaire. Pour cela, nous avons étudié l’impact de la sérotonine (5-HT), catécholamine augmentée dans certaines pathologies cardiaques, sur le comportement des CSMs. Nos résultats montrent que les CSMs sont capables d’internaliser et de dégrader la 5-HT. Elles expriment en effet le transporteur de la 5-HT (SERT) ainsi que les monoamines oxydases A et B (MAO-A et MAO- B), flavoenzymes de la membrane externe mitochondriale capables de dégrader les catécholamines. Ces MAO sont fonctionnelles dans les CSMs et la dégradation des catécholamines génère, entre autre, une production de peroxyde d’hydrogène. De plus, le traitement par la 5-HT induit une apoptose des CSMs et cet effet est reversé par la pargyline, un inhibiteur des MAO et par l’imipramine, un inhibiteur de SERT. Ainsi, la dégradation de la 5-HT par la voie SERT/MAO-A pourrait être impliquée dans l’apoptose des CSMs induite par la 5-HT lors d’une greffe dans un environnement tissulaire riche en 5-HT. La seconde stratégie d’optimisation de la thérapie cellulaire a consisté à définir un nouveau mode d’administration des cellules permettant d’éviter l’injection intraparenchymateuse et un contact direct avec un environnement potentiellement délétère. Dans ce but, nous avons encapsulé les CSMs dans des microparticules d’alginate. Nous avons créé deux types de microparticules: les microsphères et les microcapsules (sans ou avec membrane externe respectivement). Les résultats montrent que malgré des différences morphologiques et mécaniques, les microsphères et les microcapsules restent stables au cours du temps. En revanche, les CSMs présentent une meilleure survie dans les microsphères que dans les microcapsules. Nous avons donc poursuivi l’étude seulement avec les microsphères et nous avons montré que les CSMs sont fonctionnelles et ne se différencient pas au cours du temps dans les microsphères. Enfin, nous avons montré que la greffe de microsphères dans les organes solides est faisable et sure pour le receveur. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle de la MAO-A dans la régulation des effets de la 5-HT sur les CSMs et son implication dans les processus physiologiques et pathologiques. D’autre part, l’encapsulation des CSMs dans des microsphères d’alginate représente une approche prometteuse pour améliorer la survie des cellules après leur greffe dans des organes solides.
Abstract
The work of my PhD has been realized in the field of cell therapy of solid organs. In this new therapeutic strategy I was interested in the problem of the medullar mesenchymal stem cells (MSCs) early death after graft. The first approach consisted in studying relations between grafted cells and tissular environment. Thus we have studied the impact of serotonin (5-HT), a catecholamine which increases in several cardiac pathologies, on MSCs behavior. Our results showed that MSCs are able to internalize and to degrade 5-HT. Indeed, they express the membrane 5-HT transporter, (SERT) and the monoamine oxidases-A and B (MAO-A and MAO-B), flavoenzymes of the outer mitochondrial membrane, able to degrade catecholamine. These enzymes are functional in MSCs and during catecholamine degradation a production of hydrogen peroxide could be observed. Furthermore, exposure of MSCs to 5-HT promotes an increase in cell apoptosis and this effect is prevented by pargyline, a MAO inhibitor and by imipramine, a SERT inhibitor. Consequently, the 5-HT- degrading pathway SERT/MAO-A could be implicated in the apoptosis of MSCs when cells are grafted in an environment enriched in 5-HT. The second study consisted in defining a new way of cell administration which permitted to avoid intraparenchymal injection and a direct contact with the potentially deleterious environment. For this, we have encapsulated MSCs in alginate microparticles. We designed a strategy based on the encapsulation of MSCs in alginate microspheres or microcapsules (without or with an external membrane respectively). Results showed that each microparticle has distinct morphology and mechanical resistance but both remained stable over time. However, as MSCs exhibited a better viability in microspheres than in microcapsules, the study was pursued with microspheres. We demonstrated that viable MSCs in microspheres were still functional and did not present any differentiation processes with time. We then proved that implantation of microspheres on solid organ is feasible and safe for the recipient.
In conclusion, these results open new perspective in the comprehension of the role of MAO-A in the regulation of 5-HT effects in MSCs and its involvement in physiological and pathological processes. On the other hand, encapsulating MSCs in alginate microspheres would be a promising approach to improve cell survival after their graft in a solid organ.
Table des matières
Table des matières
Table des matières
Liste des abréviations……………………………………………………………………………….p1 Liste des figures……………………………………………………………………………………..p5 Liste des tableaux.....………………………………………………………………………………..p8 INTRODUCTION GENERALE……………………………………………………………..…….p10 I/ CHOIX DES CELLULES………………………………………………………………………..p12 A/ LES DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES …………………………..p12 B/ LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES……………………………p14 1/ Définition………………………………………………………………………...p14 2/ Pouvoir de différenciation……………………………………………………..p15 3/ Phénotype………………………………………………………………….…...p16 4/Effet immunomodulateur……………………………………………………….p17 C/ HOMOGENEITE ET QUANTITE DE CELLULES A INJECTER………………….p18 II/ VOIE D’ADMINISTRATION DES CELLULES……………………………………………....p21 A/ VOIE VASCULAIRE……………………………………………………………………p21 1/ Injection intraveineuse………………………………………………………...p21 2/ Injection intracoronarienne…………………………………………………....p22 3/ Mobilisation des cellules progénitrices……………………………………....p22 B/ VOIE PARENCHYMATEUSE…………………………………………………………p23 1/ Injection intramyocardique…………………………………………………….p23 2/ Injection transendocardique………………………………………………...... p24 III/ LIMITES DE LA THERAPIE CELLULAIRE………………………………………………...p26 A/ ROLE DE L’ENVIRONNEMENT ……………………………………………………..p26 B/ ROLE DU TYPE D’INJECTION ……………………………………………………...p27 IV/ OPTIMISATION DE LA THERAPIE CELLULAIRE………………………………………..p28 A/ MODIFICATIONS GENETIQUES…………………………………………………….p28 B/ MODIFICATIONS PHARMACOLOGIQUES ………………………………………..p28 C/ LES BIOMATERIAUX………………………………………………………………….p29 1/ Définitions……………………………………………………………………….p30 a. Matériau support……………………………………………………….p30 b. Matrice………………………………………………………………….p31 c. Encapsulation…………………………………………………………..p32 2/ Les polymères………………………………………………………………….p34 3/ Applications thérapeutiques…………………………………………………..p35
Table des matières
a.Thérapie cellulaire du diabète………………………………………...p36 b. Thérapie cellulaire de la maladie de Huntington…………………...p37 c. Thérapie cellulaire de la douleur……………………………………..p37 d. Thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque……………………..p38 e. Thérapie cellulaire des lésions cartilagineuses………..…………...p40 f. Thérapie cellulaire des lésions osseuses………………….……..….p42 g. Les essais cliniques………………………………………..………….p44
V/ OBJECTIFS DE LA THESE…………………………………………………………..……….p46 PREMIERE ETUDE : EFFETS DE L’ENVIRONEMENT TISSULAIRE SUR LES CELLULES GREFFEES………………….…………………………………………………..…..p48 I/ INTRODUCTION………………………………………………………………………………...p49 A/ LA SEROTONINE……………………………………………………………………...p49 1/ Biosynthèse et métabolisme………………………………………………….p49 2/ Rôle et distribution……………………………………………………………..p51 3/ Les récepteurs de la sérotonine……………………………………………...p52 a. Les récepteurs aux protéines G……………………………………...p52 * Structure et activation………………………………………….p52 * Voies de signalisations activées par les protéines G………p53 b. Classification des récepteurs à la sérotonine...... p54 4/ Localisation et stockage……………………………………………………….p57 5/ Applications thérapeutiques…………………………………………………..p57 a. Présentation générale………………………………………………...p58 b. Les maladies cardio-vasculaires…………………………………….p58 B/ LES MONOAMINES OXYDASES……………………………………………………p60 1/ Définition………………………………………………………………………...p60 2/ Isoformes ……………………………………………………………………….p61 3/ Structure………………………………………………………………………...p62 4/ Localisation……………………………………………………………………..p63 5/ Fonctions des monoamines oxidases………………………………………..p65 a. Rôle au niveau du système nerveux central………………………..p65 b. Rôle au niveau des organes périphériques…………………………p66 c. Réaction catalysée…………………………………………………….p67
Table des matières
6/ Monoamines oxidases et stress oxydant …………………………………...p68 a. Les espèces réactives de l’oxygène………………………………...p68 * Définition………………………………………………………...p68 * Classification……………………………………………………p69 b. Le stress oxydant……………………………………………………...p71 c. Rôle des MAO lié à la production d’EROs………………………….p71 7/ Applications thérapeutiques des monoamines oxydases………..………..p72 a. Les maladies neurodégénératives et psychiatriques……………..p72 b. Le diabète……………………………………………………………..p74 II/ MATERIELS ET METHODES………………………………………………………………....p76 A/ APPROCHES IN VITRO………………………………………………………………p76 1/ Culture primaire de cellules souches mésenchymateuses……………….p76 2/ PCR semi-quantitative………………………………………………………...p76 3/ Western blot…………………………………………………………………….p77 4/ Dosage de l’activité MAO…………………………………………………...... p77 5/ Evaluation de l’apoptose………………………………………………...... p78 6/ Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène……………………….p78 B/ ANALYSES STATISTIQUES...... p78 III/ RESULTATS……………………………………………………………………………………p79 IV/ CONCLUSION………………………………………………………………………………..p102 DEUXIEME ETUDE : STRATEGIE D’OPTIMISATION DE LA THERAPIE CELLULAIRE A L’AIDE DE BIOMATRICES…………………………………………………p103 I/ INTRODUCTION……………………………………………………………………………….p104 A/ LES HYDROGELS…………………………………………………………………...p105 B/ ARCHITECTURE MACROMOLECULAIRE………………………………………p108 C/ MICROENCAPSULATION………………………………………………………….p108 b Concept d’immunoisolement………………………………………..p109 c. Biocompatibilité des microparticules………………………………p110 D/ ALGINATE…………………………………………………………………………….p111 1/ Structure ………………………………………………………………………p111 2/ Biocompatibilité ………………………………………………………...... p113 3/ Les microparticules d’alginate………………………………………………p114 II/ MATERIEL ET METHODES…………………………………………………………………p116
Table des matières
A/ APPROCHES IN VITRO…………………………………………………………….p116 1/ Culture primaire de cellules souches mésenchymateuses……………..p116 2/ Microencapsulation des cellules souches mésenchymateuses………..p116 3/ Morphologie et stabilité des particules au cours du temps……………...p118 4/ Microscopie électronique à balayage (MEB)……………………………...p118 5/ Résistance macanique………………………………………………………p118 6/ Test de la viabilité cellulaire…………………………………………………p119 7/ Induction de la différentiation des CSMs encapsulées en chondrocytes……………………………………………………………………………………...p119 8/ Western blot…………………………………………………………………..p119 9/ Immunocytochimie…………………………………………………………...p120 B/ APPROCHES IN VIVO………………………………………………………………p120 1/ Modèle animal pour la transplantation des microcapsules……………...p120 2/ Evaluation de la fonction rénale : dosage de l’urée et de la crétinine plasmatiques……………………………………………………………………………………...p121 3/ Immunohistochimie…………………………………………………………..p121 C/ ANALYSES STATISTIQUES...... p122 III/ RESULTATS………………………………………………………………………………….p123 IV/ CONCLUSION………………………………………………………………………………..p149 CONCLUSION GENERALE...... p150 ANNEXE -Autres publications……………………………………………………..………….p155 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………………………………..p177
Liste des abréviations
Liste des abréviations
Liste des abbréviations
ACT Autologous Chondrocytes Transplantation ADN Acide Désoxyribonucléotide ADH Alcool Déhydrogenase AMPc Adénosine Monophosphate cyclique APA Alginate-poly(L-lysine)-alginate ATP Adénosine Triphosphate b-FGF basic-Fibroblast Growth Factor BMP-4, 2 Bone Morphogenetic Protein-2, 4 CD 105, 73, 90, etc Cluster de Différenciation CFU-F Colony Forming Unit-Fibroblasts CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité CNTF Ciliary Neurotrophic Factor CSF Fluide Cerebrospinal CSMs Cellules Souches Mésenchymateuses DA Dopamine DAO Di-amine Oxydase DC Cellules Dendritiques DOPAC Dihydroxy-phenylacetia acid EPC Endothélial Progenitor Cells ERK Extracellular signal-Regulated Kinase EROs Espèces Réactives de l’Oxygène FAD Flavine Adenine Dinucleotide Flt-3 Fms-related tyrosine kinase-3 GAG Glycosaminoglycane G-CSF Granulocytes-Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor GVHD Graft Versus Host Disease HEMA Poly(2-hydroxyethylmathacrylate) HEMA-MMA hydroxyéthyl méthacrylate-méthyl méthacrylate HGF Hepatocyte Growth Factor
2 Liste des abbréviations
H2O2 Peroxyde d’Hydrogène HSC Hematopoietics Stem Cells HSP-70 Heat Shock Protein 70 IC Insuffisance Cardiaque IGF Insuline Growth Factor IL-1, 6, etc Interleukine IRA Insuffisance Rénale Aigue KO Knock-Out LAT-1 L-type amino acide transporteur 1 LIF Leukemia Inhibitor Factor MAO Monoamine Oxydase MAPCs Multipotent Adult Progenitor Cells MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 M-CSF Monocyte-Colony Stimulating Factor MEC Matrice Extracellulaire MMP 1 / 2 / 9 Matrix Metalloproteinase 1 / 2 / 9 NA NorAdrénaline NE Norepinephrine NK Natural Killer OA Ostéoarthrite OSM Oncostatin M PAO Polyamine Oxydase PEA Phenylethylamine PEO Poly(ethylene oxide) PEG Polyethylène Glycol PGE 2 Prostaglandin E2 PLA Poly(D,L-lactic acid) PLL Poly (L- lysine) PPF Poly(propylene fumarate) p(PF-coEG) Poly(propylene fumarate co-ethylene) glycol PVA Poly-vinyl alcool RCPG Récepteurs Couplés aux Protéines G
3 Liste des abbréviations
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SCF Stem Cell Factor SDF-1 Stromal Cell Derived Factor-1 SERT Serotonin Transporter SNC Système Nerveux Central SOD Superoxyde Dismutase SSAO Semicarbazide Sensitives Amines Oxydases SSRI Selectives Serotonin Recapture Inhibitors TGF-β Transforming Growth Factor β Trp Tryptophane VEGF Vascular Endothelial Growth Factor 5-HIAA 5-hydroxyindole Acetic Acid 5-HT Sérotonine 5-HTP 5-Hydroxytryptophane
4 Liste des figures
Liste des figures
5 Liste des figures
Figure 1 : Les caractéristiques des cellules souches………………………………………….p13
Figure 2 : Anatomie de la moelle osseuse……………………………………………………...p15
Figure 3 : Caractère « souche » des CSMs……………………………………………….……p16
Figure 4 : Effet immunomodulateur des CSMs……………………………………………..…..p18
Figure 5 : Illustration des applications des feuillets cellulaires en médecine régénérative..p31
Figure 6 : Schéma de l’implantation d’un « patch » au niveau d’un infarctus du
myocarde ……………………………………………………………………………………….…p32
Figure 7 : Microcapsule d’alginate-poly(L-lysine)-alginate……………………………………p33
Figure 8 : Photo de la suture d’un patch sur un cœur ischémié……………………………...p39
Figure 9 : Mécano-transduction matrice/cellule : une voie possible de différenciation…....p41
Figure 10 : Hydrogel de collagène I sur lequel seront ensemencées les CSMs pour la transplantation……………………………………………………………………………………...p42
Figure 11 : Biocomplexe collagène/cellules utilisé pour reconstruire la mandibule………...p44
Figure 12 : Synthèse de la sérotonine…………………………………………………………...p51
Figure 13 : Structure générale des RCPG………………………………………………………p53
Figure 14 : Voies de signalisation des protéines Gαs, Gαi et Gαq…………………………..p54
Figure 15 : Structure cristallographique des MAO humaines…………………………………p63
Figure 16 : Synapse sérotoninergique (5-HT), noradrénergique (NE) et dopaminergique
(DA) ………………………………………………………………..………………………….……p65
Figure 17 : Déamination oxydative par les MAO mitochondriales……………………………p67
Figure18 : Concept d’immunoisolement………………………………………………………..p110
Figure 19 : Structure chimique (A) de l’acide mannuronique et de l’acide guluronique ;
(B) de l’alginate……………………………………………………………………………………p112
Figure 20 : Gélification de l’alginate par les ions calcium et le modèle de la boite à
œufs...... p113
Figure 21 : Les différentes modalités de préparation de microparticules avec de l’alginate……………………………………………………………………………………………p115
Figure 22 : Schéma de l’encapsulateur IE-50R……………………………………………….p117
6 Liste des figures
Figure 23 : Transplantation de microcapsules sous la capsule rénale……………………..p121
7 Liste des tableaux
Liste des tableaux
8 Liste des tableaux
Tableau I : Les différents types de cellules souches classées selon leur origine…………..p13
Tableau II : Injection myocardique par cathéter veineux trans-coronarien………………….p23
Tableau III : Injection transendocardique sous guidage EMM………………………………..p25
Tableau IV : Biomatériaux utilisés pour l’ingénierie tissulaire…………………………………p35
Tableau V: Les différents récepteurs sérotoninergiques chez les mammifères…………….p57
Tableau VI : Principaux substrats et inhibiteurs des MAO………………...…………………..p62
Tableau VII : Expression tissulaire des MAO-A et-B chez l’Homme………………………….p64
Tableau VIII: Caractéristiques comportementales et neurochimiques des souris inhibées pour le gène codant pour la MAO...... p66
Tableau IX : Les différentes espèces réactives de l’oxygène……………………………...... p71
Tableau X : Inhibiteurs réversibles et irréversibles des MAO utilisés ou ayant été utilisés en médecine………………………………………………..……………………………………....p74
Tableau XI : Polymères se transformant en hydrogels utilisés pour la microencapsulation de cellules ou de tissus……………………………………………...……p108
9 Introduction générale
Introduction générale
10 Introduction générale
A l’heure actuelle, de nombreuses pathologies ne peuvent être traitées par les outils thérapeutiques classiques (pharmacologie ou chirurgie). C’est pourquoi de nouvelles stratégies se sont développées dont la thérapie cellulaire et l’ingénierie tissulaire. La thérapie cellulaire consiste a injecter des cellules saines et fonctionnelles provenant du patient lui- même (greffe autologue) ou d’un donneur volontaire compatible (greffe allogénique). Ces nouvelles cellules greffées peuvent remplacer des cellules mortes ou détruites dans un tissu (suite à une ischémie, une irradiation, une chimiothérapie, etc.) mais permettent également de remédier à des défaillances fonctionnelles cellulaires (maladie de Parkinson, Diabète, etc.). L’ingénierie tissulaire, quant à elle, a pour but la régénération partielle ou complète de parties déficientes du corps. Cette tâche est accomplie par le développement de technologies qui créent ou manipulent des biomolécules, des matériaux biologiques, des cellules et des tissus, dans le but de synthétiser un nouveau tissu, un organe, ou un appareil qui seront implantés au niveau de la lésion. Dans notre exposé, nous allons nous intéresser plus particulièrement à la thérapie cellulaire, utilisée depuis plusieurs années dans des études pré-cliniques ou cliniques. Elle offre déjà de nombreux résultats convaincants dans différents domaines médicaux et notamment l’hématologie, la rhumatologie et la dermatologie. Elle représente une alternative à de nombreux traitements et en particulier aux greffes d’organes. En effet, dans de nombreuses pathologies, la greffe reste l’unique solution thérapeutique. Cependant, elle présente de nombreux inconvénients notamment la pénurie d’organes sains disponibles et les problèmes de compatibilité entre donneurs et receveurs. De ce fait, la thérapie cellulaire est très intéressante puisqu’elle permet d’implanter de nouvelles cellules fonctionnelles avant que les organes ne soient totalement défaillants tout en évitant les lourds traitements immunosuppresseurs dans le cas de greffe de cellules autologues. Cependant, malgré son potentiel thérapeutique, la thérapie cellulaire présente des limites qui font l’objet de nombreuses études menées actuellement. En effet, pour que l’efficacité de la thérapie cellulaire soit optimale, il faut tout d’abord correctement choisir l’organe et la pathologie cible car sa mise en œuvre clinique est basée sur le ratio bénéfices/risques. Il faut ensuite déterminer quel type cellulaire est le mieux adapté à l’organe cible et aux attentes thérapeutiques (différenciation en cellules fonctionnelles, effet paracrine,etc), le nombre de cellules à injecter qui permettra d’obtenir les meilleurs effets bénéfiques tout en étant sans risque pour le receveur (formation de thrombus, de tératome, etc), à quel moment les injecter
11 Introduction générale et leur voie d’administration. Enfin, un obstacle à surmonter pour optimiser la thérapie cellulaire demeure le risque de mort précoce des cellules après la greffe.
I/ CHOIX DES CELLULES
La thérapie cellulaire s’intéresse à différents types de cellules qui peuvent être :
- des cellules déjà différenciées et fonctionnelles (chondrocytes, cellules des îlots de Langerhans, etc.), - des précurseurs ou progéniteurs déjà engagés dans des voies de différenciation précises (progéniteurs endothéliaux, précurseurs érythroïdes, etc.),
- des cellules souches (cellules souches hématopoïétiques, cellules souches mésenchymateuses, etc.).
Nous développerons plus particulièrement ici le cas des cellules souches car elles font l’objet de nombreuses études et sont très prometteuses dans le cadre de la thérapie cellulaire. En effet, grâce à leur pouvoir de différenciation et/ou de sécrétion, elles sont capables de participer à la régénération d’un tissu endommagé.
A/ LES DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES
Une cellule souche est une cellule capable de s’autorenouveller, c’est à dire se diviser à l’identique pendant de très longues périodes (division symétrique) et qui présente une importante plasticité c’est à dire la capacité à se différencier en cellules matures (division asymétrique, cf. Figure 1) (Smith 2006).
12 Introduction générale
Cellule souche
Cellule souche (cellule souche hématopoiétique) Autorenouvellement
Cellule spécialisée (neurone) Différenciation
Figure 1 : Caractéristiques des cellules souches
On peut actuellement isoler des cellules souches à différents stades du développement (de l’embryon à l’adulte) et selon leur origine elles n’auront pas le même pouvoir de différenciation (totipotente, pluripotente, multipotente ou unipotente). Les différents types de cellules souches classées selon leur origine sont présentés dans le tableau suivant :
Type Origine Pouvoir de différenciation
Blastomères Premières divisions de Totipotentes l’œuf ou zygote
Embryonnaires Masse interne du Pluripotentes blastocyste Fœtales Foetus Multipotentes
Adultes Tissus adultes Multipotentes ou unipotentes
Tableau I : Les différents types de cellules souches classées selon leur origine
Cependant, malgré l’existence de ces différents types, les cellules souches adultes sont le plus classiquement utilisées. Tout d’abord pour des raisons éthiques, les cellules souches embryonnaires sont isolées à partir d’embryons surnuméraires ou issus d’avortement (McLaren 2001). En France, la loi dd décembre 2003 autorise par dérogation les recherches
13 Introduction générale sur les embryons dits "surnuméraires" ou issus d'IVG ou importés pour une période limitée à cinq ans, lorsqu’elles sont susceptibles de permettre des progrès thérapeutiques majeurs. De la même façon, ce problème éthique se pose pour les cellules souches fœtales. D’autre part, les cellules souches embryonnaires ont un fort pouvoir tumorigène (Seminatore et al.) et avec les cellules souches fœtales elles peuvent être rejetées par le système immunitaire. Les cellules souches adultes, elles, posent moins de problème éthique quant à leur obtention et elles permettent des greffes autologues, évitant ainsi le rejet immunitaire.
B/ LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES DE LA MOELLE
1/ Définition
Dans notre laboratoire, nous étudions et utilisons plus particulièrement les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) qui sont des cellules souches adultes issues du stroma de la moelle osseuse et qui ont été identifiées pour la première fois par Friedenstein et Petrakova en 1966 (Friedenstein et al. 1966). Des études ont ensuite révélé que ces cellules possédaient un pouvoir d’autorenouvellement et de différenciation important (Ashton et al. 1980; Friedenstein et al. 1987; Owen 1988). Le nom de CSMs a été introduit en 1991 par Caplan (Caplan 1991). Les CSMs représentent seulement une petite fraction (0.001-0.001%) de la population totale des cellules nuclées de la moelle et sont dix fois moins abondantes que les cellules souches hématopoïétiques (cf. Figure 2) (Pittenger et al. 1999).
14 Introduction générale
Figure 2 : Anatomie de la moelle osseuse (Coulombel ; 2003)
Cependant, différentes études montrent que les CSMs peuvent aussi être isolées à partir d’autres tissus comme le tissu adipeux (Vieira et al. 2009), le placenta (Huang et al. 2009), le cordon ombilical (Seo et al. 2009), les tendons (Salingcarnboriboon et al. 2003), les ligaments (Kawanabe et al. 2009), les muscles (Zhang et al. 2003), le cartilage (Alsalameh et al. 2004) ou le sang menstruel (Musina et al. 2008).
2/ Pouvoir de différenciation
Comme les autres cellules souches, les CSMs possèdent la capacité de s’autorenouveller. En effet les études in vitro montrent que les CSMs sont capables de se diviser pendant plusieurs générations sans changement de morphologie ni perte de leur pouvoir de différenciation (Bruder et al. 1997). D’autre part, les études de cycle cellulaire révèlent que la majorité des CSMs est en état de quiescence (phases G1/G0, seulement 10% sont en phase S/G2/M). Ces cellules ne prolifèrent et ne se différencient qu’en cas d’atteintes tissulaires. D’autre part, elles sont multipotentes (cf Figure 3), et peuvent se différentier en cellules issues du feuillet mésodermique (ostéoblastes, chondroblastes, adipocytes ou fibroblastes)
15 Introduction générale
(Xiao et al.; Liu et al. 2009) mais également in vitro en cellules provenant des trois feuillets embryonnaires (cardiomyocytes, cellules musculaires squelettiques, neurones, cellules épithéliales rénales, hépatocytes) (Talens-Visconti et al. 2006; Khoo et al. 2008; Qian et al. 2008; Kim et al. 2009; Liu et al. 2009; Miskon et al. 2009).
Cellules Souches Mésenchymateuses
AUTORENOUVELLEMENT
MULTIPOTENCE Différenciation “classique” Différenciation “induite in vitro”
chondrocytes ostéocytes adipocytes fibroblastes neurones cellules cellules cellules cardiaques squelettiques épithéliales Figure 3 : Caractère « souche » des CSMs
3/ Phénotype
Des efforts considérables ont été déployés dans l’identification de marqueurs de surfaces spécifiques pour la sélection et la détection des CSMs. Récemment, le comité de l’ISCT (International Society for Cellular Therapy) a proposé des standards de caractérisation des CSMS (Dominici et al. 2006). Cette définition des CSMs comprend : - l’adhérence cellulaire au plastique dans des conditions de culture standard, - un phénotype cellulaire défini en cytométrie de flux par un panel d’antigènes de surface dont l’expression est positive (CD105, CD73 et CD90) et un panel d’antigènes dont l’expression est négative (CD45, CD34, CD14, CD79 et HLA-DR), - un potentiel de différenciation multipotent in vitro dans des conditions standards et vers les trois voies mésenchymateuses : ostéoblastes (coloration par le rouge Alizarin ou coloration de Von Kossa), chondroblastes (coloration par le bleu Alcian ou par immunocytochimie pour le collagène de type II) et adipocytes (coloration par l’Oil Red O).
16 Introduction générale
Suite à la découverte de ce potentiel de différenciation in vitro, plusieurs mécanismes ont été mis en évidence pour expliquer les effets bénéfiques des CSMs dans le cadre de la thérapie cellulaire : - la transdifférenciation (Antonitsis et al. 2007; Gong et al. 2008; Ishii et al. 2008; Khoo et al. 2008; Pijnappels et al. 2008) qui reste un mécanisme parfois controversé et en tous les cas minoritaire (Duffield et al. 2005; Wang et al. 2005; Rose et al. 2008), - la fusion cellulaire (Alvarez-Dolado et al. 2003) elle aussi controversée (Vadala et al. 2008; Singaravelu and Padanilam 2009), - leur activité paracrine qui est à l’heure actuelle l’explication la plus probante. En effet, ces cellules sécrètent des cytokines (SCF, LIF, SDF-1, OSM, BMP-4, Flt-3, TGF-β) (Majumdar et al. 2000; Wagner et al. 2007; Oh et al. 2009),des interleukines (IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15), des facteurs de croissance (VEGF, HGF, b-FGF et IGF-1) et des molécules favorisant le « homing » de progéniteurs (SCF) (Kinnaird et al. 2004; Jeong et al. 2005; Nagaya et al. 2005; Ohnishi et al. 2007; Togel et al. 2007; Schinkothe et al. 2008)
4/ Effet immunomodulateur
Une des propriétés la plus surprenante des CSMs cultivées in vitro est leur capacité à affecter la réponse immune in vitro et in vivo (cf. Figure 4). Les résultats obtenus récemment indiquent que les CSMs dérivées de la moelle osseuse et des autres tissus modulent le système immunitaire via des interactions avec plusieurs cellules immunitaires telles que les lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules natural killer (NK) et les cellules dendritiques (DCs) (Nauta and Fibbe 2007; Noel et al. 2007; Ramasamy et al. 2007; Stagg and Galipeau 2007; Ye et al. 2008; Kode et al. 2009). Ces propriétés immunomodulatrices des CSMs ont été la base pour leur utilisation dans des conditions de traitement caractérisées par des dysrégulations immunologiques comme la maladie de Crohn et la maladie de l’hôte contre le greffon après transplantation d’HSC allogéniques (Le Blanc et al. 2008; Paczesny et al. 2009).
17 Introduction générale
Figure 4 : Effet immunomodulateur des CSMs (Aggarwal and Pittenger 2005)
C/ HOMOGENEITE ET QUANTITE DE CELLULES A INJECTER
Lors de la mise en place de protocoles de thérapie cellulaire, il est important de suivre les mêmes critères pour les cellules greffées que ceux attribués aux médicaments. Il faut, d’une part, s’assurer de la pureté de la population cellulaire utilisée et d’autre part, déterminer la quantité de cellules à injecter. Á ce jour, la caractérisation précise des différents types de cellules souches présents dans l’organisme n’est pas clairement établie. En effet, les travaux de thérapie cellulaire qui visent à isoler des cellules souches à partir de différents organes mettent en évidence diverses populations de cellules suivant leurs marqueurs de surface et leurs propriétés. C’est par exemple le cas des cellules souches de la moelle osseuse. En effet, alors qu’il y a quelques années, on pensait que seulement trois types de cellules souches résidaient dans la moelle osseuse (les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches mésenchymateuses et les progéniteurs endothéliaux), plusieurs études ont permis d’identifier de nombreuses sous-populations de cellules souches exprimant des antigènes
18 Introduction générale différents. De ce fait, des travaux complémentaires doivent être réalisés de manière à établir une définition complète des différents types de cellules souches, de leur capacité de prolifération et de différenciation, de leur phénotype précis et de leur(s) effet(s) thérapeutique(s) suivant l’organe et le modèle dans lesquels elles sont injectées. De plus, il faut être vigilant quant à l’extrapolation à l’Homme des résultats obtenus dans des études pré-cliniques du fait des différences de nature et d’expression des marqueurs cellulaires entre espèces. Concernant la quantité de cellules à injecter, il y a de grandes différences selon le type cellulaire et le potentiel thérapeutique de chacun dans les études expérimentales et cliniques. Des essais pré-cliniques « dose-réponse » doivent être réalisés suivant la pathologie à traiter afin d’évaluer la quantité de cellules suffisant à induire des effets fonctionnels bénéfiques. S’agissant des pathologies ischémiques, la masse tissulaire à reconstituer ou à implanter s’avère considérable à l’échelle cellulaire (20 à 30 cm3). Il faudra donc envisager l’injection de grandes quantités de cellules différenciées ou de quantité moindre de cellules à fort potentiel prolifératif mais sans excès (Bartunek et al. 2006; Henning et al. 2007; Wolf et al. 2009). Cependant, il n’est pas nécessaire de parvenir à un repeuplement complet des zones pathologiques. Dans le cas de l’insuffisance cardiaque, un gain de fonction même faible peut avoir un impact très appréciable sur la qualité de vie du patient. De plus, l’administration de certains types cellulaires se heurte à des problèmes de migration. Ainsi, les myoblastes ne migrent qu’à 1 ou 2 mm des sites d’injection dans le muscle cardiaque d’où l’intérêt d’injecter à de multiples sites lors des essais cliniques. Des progrès méthodologiques permettront de palier à ce problème mais on peut également envisager de stimuler les capacités migratroires des cellules, soit en les modifiant génétiquement, soit en utilisant des conditions de culture mimant l’environnement physiologique lié à leur activation. Enfin, le moment de l’administration des cellules souches joue un rôle important dans la prise de la greffe, la survie des cellules et leur différenciation. En considérant les processus inflammatoires et de réparation qui ont lieu après la lésion d’un organe, il est difficile de déterminer un moment idéal. En effet, il peut être trop tôt ou trop tard suivant que les premières cellules seront tuées par les cytokines inflammatoires et ou que le tissu cicatriciel sépare les cellules greffées des cellules hôtes. A l’heure actuelle, il n’existe pas de consensus entre les différentes études sur la fenêtre de temps idéale pour la greffe.
19 Introduction générale
Ainsi, l’utilisation des cellules souches adultes semble plus sure comparée aux cellules souches embryonnaires : elles posent des problèmes éthiques mineurs et le risque de formation de tératome est moindre. Cependant il faut rester prudent quant à leur pouvoir de différenciation, il peut en effet y avoir des différenciations incongrues après la greffe (cartilage dans le cœur par exemple). Une fois le type cellulaire choisi il faut encore déterminer le nombre de cellules à injecter et le moment de l’injection. Ces paramètres dépendent du potentiel thérapeutique des cellules, de l’organe choisi et de la pathologie.
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20 Introduction générale
II/ VOIES D’ADMINISTRATION DES CELLULES
Il est important de bien déterminer quelles méthodes vont permettre la meilleure administration des cellules souches tout en présentant le moins de risques. Le besoin de spécificité va dépendre de l’attraction (« homing »), de la diapédèse et de la migration des cellules transplantées. De plus, la voie d’administration doit permettre une rétention maximale des cellules. La rétention étant définie comme la fraction de cellules transplantées retenues sur le site de transplantation pour une courte période (heures). Le milieu environnant est un composant important de la rétention puisqu’il va influencer la survie à court terme ainsi que l’adhésion cellulaire, la migration et l’invasion tissulaire. Classiquement, les deux voies majeures d’administration des cellules souches envisagées dans les protocoles de thérapie cellulaire sont la voie vasculaire (Lundberg et al. 2009) ou la voie intratissulaire (parenchymateuse). Selon les organes cibles, ces voies d’injection peuvent varier. Etant donné qu’au laboratoire nous nous concentrons sur la thérapie cellulaire des organes solides, et afin de simplifier l’exposé, nous allons ici nous intéresser plus particulièrement au cas du cœur.
A/ LA VOIE VASCULAIRE
Cette voie d’administration présente l’avantage d’être moins invasive qu’une injection directe dans le parenchyme d’un organe solide.
1/ Injection intraveineuse
Dans des modèles expérimentaux, l’injection en intraveineuse de CSMs améliore la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde (Boomsma et al. 2007; Wang et al. 2007; Wolf et al. 2009). Cependant, le « homing » des cellules vers les autres organes constitue une limitate à l’application en clinique de cette technique (Aicher et al. 2003; Barbash et al. 2003; Hale et al. 2008). En effet, le « homing » de cellules de la moelle osseuse vers le cœur est observé lors d’injection intracoronarienne et non lors d’injection en intraveineuse (Hofmann et al. 2005).
21 Introduction générale
2/ Injection intra-coronarienne
L’injection intra-coronarienne permet de déposer une concentration maximale de cellules de façon homogène au niveau du site lésé. De plus, elle est relativement facile à réaliser. L’injection intra-coronarienne de cellules souches permet une meilleure communication avec le microenvironnement local dans lequel certaines cytokines bénéfiques sont hautement exprimées. Cependant, Vulliet et collaborateurs ont montrés que l’injection intra- coronarienne de CSMs cause des micro-infarctus chez des chiens en bonne santé ce qui pose un problème quand à sa sûreté (Vulliet et al. 2004). De plus, le pourcentage de cellules injectées par voie intra-coronarienne et migrant jusqu’à la zone cible n’est pas clair. En 2005, Hofmann et collaborateurs ont prouvé à l’aide de cellules non triées de la moelle osseuse et de cellules CD34+ marquées par radiactivité, qu’après passage dans le foie et la rate, 14 à 39 % de la radioactivité totale était retrouvée dans le myocarde infarcie (Hofmann et al. 2005).
3/ Mobilisation des cellules progénitrices
Il semblerait que la lésion cardiaque représente une sorte de signal qui mobiliserait les cellules souches de la moelle osseuse et du sang vers le site lésé et pourrait ainsi régénérer les cardiomyocytes. Mais ce mécanisme ne serait pas suffisant pour réparer tous les cardiomyocytes. Ainsi, la mobilisation de ces cellules par les cytokines serait une technique non invasive pour la régénération cardiaque. Ce concept a été testé dans des modèles animaux d’infarctus du myocarde (Orlic et al. 2001; Norol et al. 2003) et dans des études pilotes chez des patients ayant un infarctus du myocarde en phase aigue et des ischémies chronique du myocarde (Ince et al. 2005; Ince and Nienaber 2007). Les résultats montrent que cette technique est une stratégie prometteuse pour préserver le myocarde des lésions dues à l’ischémie.
22 Introduction générale
B/ LA VOIE PARENCHYMATEUSE
Le deuxième type de voie d’administration est l’injection directe des cellules souches dans le parenchyme de l’organe à réparer ou à régénérer. Cette voie permet aux cellules d’être directement intégrées au sein du tissu lésé sans avoir recours au processus de migration.
1/ Injection intramyocardique
Comme le nombre de cellules demeurant dans la zone cible après injection intra- coronarienne est limité, d’autres techniques d’injections ont été envisagées notamment celles basées sur l’utilisation d’un cathéter. Ainsi en 2003, Thompson et collaborateurs ont évalué pour la première fois la faisabilité d’une injection intramyocardique utilisant le système veineux coronarien pour accéder directement au myocarde et délivrer les cellules dans un modèle porcin. Aucune mort, tamponnade cardiaque, arythmie ventriculaire ou autres complications ne sont apparues (Thompson et al. 2003). Cette méthode d’injection des cellules est donc sure pour le patient et une grande quantité de cellules peut être injectée avec une faible perte cellulaire attendue (Siminiak et al. 2005).
Type de cellules Maladie n Suivi Complications Références CSMs Cochons sains 6 28 jours Aucune (Thompson et al. 2003) Myoblastes Insuffisance 2 4 semaines Aucune (Siminiak et squelettiques cardiaque post- al. 2003) IM Myoblastes IM chronique 10 6 mois Aucune (Siminiak et squelettiques al. 2005) Tableau II: Injection myocardique par cathéter (d’après Qian, 2006)
23 Introduction générale
2/ Injection transendocardique
En se basant sur des résultats préliminaires, Fuchs et collaborateurs ont testé la faisabilité d’injection transendocardique de moelle osseuse autologue avec un système NOGA (par guidage par cartographie électromécanique (MEM)) dans un modèle porcin d’ischémie myocardique chronique (Kinnaird et al. 2004). Les résultats montrent que cette approche est réalisable et sure. De plus, en 2003, Dick et collaborateurs ont montré que le dépôt précis de CSMs après un infarctus du myocarde était réalisable avec un cathéter sous guidage par imagerie à résonance magnétique (IRM) (Dick et al. 2003). L’avantage majeur de l’administration sous guidage par imagerie à résonance magnétique est que les cellules ainsi marquées sont visualisables et le site où elles se greffent est clairement connu. Cependant, à l’heure actuelle, l’impact des nanoparticules de fer sur les propriétés biologiques des cellules greffées in vivo n’est pas connu. De plus, aucun essai chez l’Homme n’a encore été réalisé.
Type de Maladie n Suivi Complications Références cellules CSMs Cochons 14 4 semaines Aucune (Kinnaird et sains al. 2004) Cellules Cœur 8 3 mois Aucune (Tse et al. mononuclées ischémié 2003) dérivées de la moelle osseuse Myoblastes Insuffisance 5 6 mois Aucune (Smits et al. squelettiques cardiaque 2003) Cellules Insuffisance 21 2 ou 4 mois Aucune (Perin et al. mononuclées cardiaque 2003) dérivées de ischémique la moelle sévère osseuse Cellules Insuffisance 20 6 ou 12 mois Aucune (Silva et al. mononuclées cardiaque 2004)
24 Introduction générale dérivées de ischémique la moelle sévère osseuse Tableau III : Injection transendocardique sous guidage EMM
Ainsi le choix du mode d’administration est déterminant pour le bon déroulement du protocole de thérapie cellulaire. Dans leur étude, Fukushima et collaborateurs, ont injecté dans un modèle d’infarctus du myocarde chez le rat, des cellules mononuclées dérivées de la moelle osseuse par voie intramyocardique ou intracoronarienne (Fukushima et al. 2007). Ils observent plus d’arythmie dans le groupe « injection intramyocardique » car dans ce cas là il y a formation d’îlots contenant les cellules greffées et des cellules inflammatoires dans la zone bordant la zone de l’infarctus. La voie d’administration doit donc être adaptée à l’organe cible et au type cellulaire injecté.
25 Introduction générale
III/ LIMITES DE LA THERAPIE CELLULAIRE
Il y a donc plusieurs points critiques à prendre compte au moment du développement d’un nouveau protocole de thérapie cellulaire mais un problème persistant de cette stratégie est la mort précoce des cellules, environ 90%, dans les heures suivant la greffe intraparenchymateuse (Reinecke et al. 1999; Muller-Ehmsen et al. 2002; Toma et al. 2002; Maurel et al. 2005). Or, il a été prouvé que l’efficacité de la thérapie cellulaire dépend de la quantité de cellules survivantes (Tambara et al. 2003; Mias et al. 2008). L’amélioration de la survie des cellules est donc un défi important pour optimiser la thérapie cellulaire.
A/ ROLE DE L’ENVIRONNEMENT
Plusieurs facteurs environnementaux, comme le stress oxydant ou l’inflammation peuvent être impliqués dans la mort précoce des cellules après la greffe. En effet, dans le cadre d’ischémie-reperfusion d’organes solides (cœur ou rein), il y a génération d’espèces réactives de l’oxygène et donc apparition d’un stress oxydant. C’est au moment de la reperfusion et de son afflux massif de sang, d’oxygène et de nutriments qu’est généré le stress oxydant. Les radicaux libres dérivés des cellules (résidentes ou greffées) endomagées par les lésions mécaniques ou de l’ischémie-reperfusion pourraient être des médiateurs de cette mort précoce. D’autre part, l’apoptose des cellules résidentes et l’infiltration de cellules inflammatoires pourraient expliquer la mort précoce des cellules après la greffe. En fait, l’apoptose a lieu de façon précoce et pourrait être responsable de l’inflammation induite par la reperfusion. Les facteurs inflammatoires (interleukines) sont produits pendant l’ischémie et simultanément les molécules d’adhésion cellulaire exprimées à la surface des cellules endothéliales facilitent la liaison et l’infiltration des leucocytes circulants. Ainsi, une fois greffées, les cellules se trouvent confrontées à cet environnement oxydatif et inflammatoire et ce pourrait être lui qui cause en partie leur apoptose. D’autre part, dans le laboratoire nous avons montré que les CSMs sont capables d’interagir avec les fibroblastes cardiaques dans le cas de l’infarctus du myocarde (Mias et al. 2009). Dans le cadre de cette étude, les CSMs avaient un effet positif sur ces fibroblastes puisqu’elles modulaient leur phénotype pour diminuer la fibrose. Mais on peut émettre
26 Introduction générale l’hypothèse que d’autres cellules de l’organe lésé peuvent sécréter des facteurs (cytokines, etc) qui induiraient la mort des cellules greffées. Enfin, il est maintenant admis que des modifications biochimiques au niveau de l’organe peuvent également influencer la survie des cellules greffées. La sérotonine (5-HT) en est un exemple probant. En effet, le taux de cette catécholamine libérée par les plaquettes activées augmente au cours de pathologies aiguës ou chroniques, situations susceptibles d’être traitées par la thérapie cellulaire. Au niveau cardiaque, plusieurs études montrent que la 5- HT s’accumule pendant l’ischémie-reperfusion où elle contribue à la progression des lésions et au dysfonctionnement du myocarde (Longhurst et al. 2001; Fu and Longhurst 2002; Shimizu et al. 2002) . De plus, elle est supposée participer à la pathogenèse de troubles cardiaques secondaires aux tumeurs carcinoïdes (Meijer et al. 2002). Mais les concentrations élevées en 5-HT sont également impliquées dans d’autres pathologies comme le diabète (Barradas et al. 1988; Malyszko et al. 1994) et l’athérosclérose (Hilton and Cumings 1971; Agnihotri et al. 2004). Il est donc intéressant d’évaluer si ces augmentations ont des effets sur la survie des cellules greffées. Ceci fait l’objet du premier travail.
B/ ROLE DU TYPE D’INJECTION
Comme nous l’avons vu plus haut, le mode d’injection des cellules a un impact important sur leur devenir. Lors d’injection intraparenchymateuse par exemple, une grande quantité de cellules est injectée en une seule fois ce qui crée un îlot de cellules au niveau du site d’injection. A l’intérieur de cet îlot, les cellules souffrent d’un apport réduit en oxygène et en nutriments et peuvent donc entrer dans un processus d’apoptose. D’autre part, au moment de l’injection, les cellules subissent un stress mécanique lors du passage au travers de la seringue (injection intraveineuse, intracoronarienne, intraparenchymateuse) puis au travers du parenchyme (injection intraparenchymateuse). Ce stress mécanique pourrait lui aussi induire, en partie, l’apoptose des cellules greffées. Lo’bjectif de mon second travail a donc été d’essayer de s’affranchir de cet effet délétère.
27 Introduction générale
IV/ OPTIMISATION DE LA THERAPIE CELLULAIRE
Cette optimisation passe notamment par l’amélioration de la survie des cellules après la greffe. Actuellement, trois axes sont développés dans ce but, les modifications génétiques et pharmacologiques des cellules et l’utilisation de biomatrices.
A/ MODIFICATIONS GENETIQUES
La modification génétique des cellules avant leur injection constitue une approche prometteuse. En effet, ces modifications peuvent porter sur la survie, le métabolisme, la prolifération ou la différenciation des cellules souches. De plus, la thérapie génique et la thérapie cellulaire peuvent être combinées pour potentialiser l’effet des cellules. En ce qui concerne l’amélioration de la survie, Mangi et collaborateurs (Mangi et al. 2003) ont utilisé un rétrovirus viral pour surexprimer le gène promoteur de survie, Akt , dans les CSMs avant implantation dans un myocarde infarcie de rat. Ils ont ainsi démontré que la surexpression de la protéine Akt permet d’améliorer la survie des CSMs et prévient le remodelage pathologique après l’infarctus. D’autres études ont également prouvées que la transfection de cellules souches avec l’Heme Oxygénase-1 (HO-1, enzyme ayant des propriétés antioxydantes) ou la kallikréine (anti-inflammatoire et antifibrotique) améliore la survie des cellules après la greffe et protègent l’organe lésé (Tang et al. 2005; Hagiwara et al. 2008).
B/ MODIFICATIONS BIOCHIMIQUES ET PHARMACOLOGIQUES
Dans le cadre de modifications biochimiques, le traitement de myoblastes par choc thermique (Heat Shock) permet d’augmenter l’expression de la protéine hsp70 (heat shock protein 70) et de protéger les cellules de l’apoptose in vitro. De plus, in vivo, ce traitement diminue la mort des myoblastes 24 heures après leur greffe et augmente considérablement le nombre de fibres musculaires issues de ces cellules en comparaison avec l’injection de cellules non traitées (Riederer et al. 2008).
28 Introduction générale
Les modifications pharmacologiques consistent, elles, à pré-traiter les cellules souches avec un agent pharmacologique avant la greffe ou d’injecter les deux simultanément. Cette approche est donc plus facile à mettre en place et plus rapide que les modifications génétiques. Par exemple, il a été montré qu’un préconditionnement des myoblastes au stress oxydant en les incubant avec du diazoxide (ouverture des canaux mitochondriaux ATP sensibles au potassium) améliore leur survie après la greffe ainsi que leur activité paracrine (Niagara et al. 2007). Dans le cas de CSMs, nous avons montré que la mélatonine se comporte comme un agent de préconditionnement qui augmente leur survie, leur activité paracrine et leur efficacité (Mias et al. 2008).
C/ LES BIOMATERIAUX
Depuis quelques années une nouvelle approche pour greffer les cellules repose sur l’utilisation de biomatériaux Ils sont définis comme des matériaux non viables, utilisé dans l’élaboration d’un dispositif médical destine à fonctionner au contact de l’environnement physiologique (Williams and Blayney 1987). Les biomatériaux, en servant de support mécanique aux cellules, permettent d’améliorer leur survie mais également de promouvoir leur différenciation (Suuronen et al. 2008). Les cellules sont ainsi immobilisées dans des microparticules ou ensemencées sur des supports puis transplantées. Cette technique présente l’avantage majeur de permettre la greffe du biomatériau sur l’organe évitant ainsi l’injection intraparenchymateuse et protégeant les cellules du stress mécanique. Cependant, la survie permanente du greffon n’a jamais été démontrée. La perte du greffon pourrait être du à la réponse immunitaire de l’hôte (Soon-Shiong et al. 1991; Zimmermann et al. 1992; Fritschy et al. 1994) ou au déséquilibre entre le renouvellement et la mort cellulaire à l’intérieur des capsules (Finegood et al. 1995).
29 Introduction générale
1/ Définitions
a. Matériau support
Ils correspondent à des structures en 2-dimensions (éventuellement associés pour dormer des struct en 3-dimensions) sur lesquelles les cellules seront ensemencées dans un second temps (post-chargement des cellules). On peut, par exemple, citer les feuillets cellulaires. Cette technologie est basée sur l’utilisation de polymères thermosensibles qui gélifient à partir de 32°C. Ces hydrogels sont placés dans des boites de culture afin d’obtenir une épaisseur de l’ordre du nanomètre et l’adhésion de divers types cellulaires est contrôlée par variation de la température. Ces surfaces ont permit de développer une nouvelle stratégie d’ingénierie tissulaire où les cellules en culture sont récupérées sous forme de feuillets intacts avec leur matrice extracellulaire (MEC). Ces feuillets peuvent être transplantés seuls (cas de la peau par exemple) (Maeda et al. 2009), en couches homotypiques pour former une structure tridimentionnelle (cas du muscle cardiaque) (Sekine et al. 2008; Guo et al. 2009) ou en stratifiant différents feuillets cellulaires pour recréer des structures plus complexes (cas des lobules hépatiques) (Ohno et al. 2009).
30 Introduction générale
Figure 5 : Illustration des applications des feuillets cellulaires en médecine régénérative. a : en utilisant les feuillets seuls, b : en utilisant des couches homotypiques, c : en utilisant une stratification hétérotypique (Yang et al. 2006).
b. Matrice
Ce sont des structures en 3-dimensions possédant une macro-porosité ouverte et une bonne résistance mécanique. On les appelle parfois éponges. Les cellules sont ensemencées sur les matrices après synthèse. Leurs applications peuvent être diverses. Des matrices d’alginate sont déjà commercialisées par la société GIBCO (AlgiMatrixTM 3D Culture System). Elles sont vendues sous forme de plaques 6 puits recouvertes d’alginate, stériles et prêtes à être ensemencées. Comme les autres matrices, elles permettent de créer un modèle de culture en 3-dimensions. Cependant, l’utilisateur ne peut pas maitriser la composition en alginate, la géométrie et la pureté de cette matrice. Or, comme nous le verrons plus loin, ces paramètres doivent être adaptés à chaque type cellulaire. Dans notre cas, par exemple, nous avons choisi de l’alginate ultrapur pour des raisons de stérilité de culture mais aussi car il a été démontré que la pureté joue un rôle dans la biocompatibilité de l’alginate (Ponce et al. 2006)
31 Introduction générale
Un autre exemple est le développement es « patchs » cardiaques. Dans le cadre de la thérapie cellulaire cardiaque, le support idéal améliore l’attachement, la croissance et la différenciation des cellules. L’intérêt de cette technique réside principalement dans le fait qu’elle permet d’éviter la greffe intramyocardique en construisant des « patchs » à l’aide de polymères synthétiques ou naturels. Le « patch » est ensuite suturé sur la paroi du ventricule, au niveau de la zone infarcie. Les premiers résultats montrent qu’ainsi la fonction cardiaque est améliorée (Simpson et al. 2007; Yang et al. 2009). Il faut cependant rester attentif à la stabilité du polymère utilisé et à sa biocompatibilité pour éviter tout rejet par le système immunitaire. .
Figure 6 : Schéma de l’implantation d’un « patch » au niveau d’un infarctus du myocarde (Simpson et al. 2007)
c. Encapsulation
De façon générale, l’encapsulation se définit comme un piégeage d’un composé ou d’un système au sein d’un matériau dispersé en vue de son immobilisation, sa protection et le contrôle de son transfert. Dans ce système on procède à un pré-chargement des cellules puisque les cellules sont mélangées avec le matériau qui sera ensuite polymérisé. Les capsules peuvent contenir un principe actif (cas de l’administration de médicaments) ou des cellules (cas de la thérapie cellulaire).
32 Introduction générale
Dans le cas de l’administration de médicaments, ce sont des microparticules (microcapsules, microsphères) ou des nanoparticules ayant pour but de contrôler la libération du principe actif et de transporter les molécules biologiquement actives jusqu’à la cible pharmacologique. Les buts de ces systèmes sont 1/ de vectoriser le transport du principe actif, 2/de le protéger de la dégradation (enzymatique, chimique ou immunologique), 3/ d’administrer de plus faibles doses et 4/ de réduire les concentrations de principe actif au niveau des organes non ciblés. Par exemple, une étude récente montre que la co- encapsulation de plusieurs médicaments antituberculeux dans de l’alginate devrait améliorer l’observance du traitement par le patient (Ahmad and Khuller 2008). De la même façon, la microencapsulation, en tant que système de délivrance per os apporte des progrès intéressants dans l’administration de l’insuline (Gholamipour-Shirazi 2008; Yadav et al. 2009).
De manière plus appliquée à la thérapie cellulaire, des cellules naturellement sécrétrices d’une substance bioactive ou sécrétant cette substance suite à des modifications génétiques sont enveloppées ou encapsulées dans une matrice. Elle permet de générer deux types de particules : les capsules ou les sphères selon qu’elles sont ou non entourées d’une membrane.
Figure7 : Microcapsule d’alginate-poly(L-lysine)-alginate (APA)
33 Introduction générale
2/ Les polymères
L’incorporation de cellules dans une biomatrice en vue d’une transplantation comporte des exigences spécifiques qui ne se posent pas dans la plupart des applications non- médicales. Celles-ci concernent surtout la nécessité de ne pas compromettre la viabilité ou le fonctionnement des cellules pendant la production du biomateriau (c'est-à-dire, pas d’exposition prolongée à des pH ou des températures non physiologiques ou l’utilisation de solvants toxiques). Cette exigence conduit obligatoirement à l’utilisation de matériaux non- cytotoxiques. Les biomatériaux utilisés peuvent être des polymères, des céramiques, des matériaux naturels. Les conditions qu’ils doivent remplir pour être utilisés en clinique sont la biocompatibilité (n’induit pas de réponse immunitaire chez l’hôte), la tolérance, la non toxicité et ils ne doivent pas être carcinogènes (Lacy et al. 1991; Li 1998). Ils doivent donc répondre à des normes précises rendant compte des réactions entre les biomatériaux et les tissus qui sont définies par l’Association Française de Normalisation (AFNOR). Leur vérification implique la réalisation d’études concernant la toxicité sur culture cellulaire, l’irritation de la peau, l’implantation à long terme (tolérance), la carcinogenèse, la compatibilité sanguine et la sécurité (test des pyrogènes).
Biomateriau Abbreviation Polymères Synthetiqueq Polymères biodegradables Poly(lactic acide) PLA Poly(glycolic acide) PGA Poly(lactic-co-glycolic acide) PLGA Poly(ε-caprolactone) PCL Poly(hydroxyalkyalkanoate) PHA Poly(p-dioxanone) PPD ou PDS Poly(propylene fumarate) PPF Poly(1,3-trimiethylene carbonate) PTMC Poly(glycerol-sebacate) PGS Poly(esther urethane) PEU Polymères bioérudibles
34 Introduction générale
Poly(ortho-ester) POE Poly(anhydride) PA Poly(phosphazene) PPHOS Polyurethane PU Polymères non-dégradables Poly(tetrafluoethylene) PTFE Poly5ethylene teraphtalate) PET Poly(propylene) PP Poly(methyl methacrylate) PMMA Poly(N-isopropylacrylamide) PNIPAAm Polymères dégradables Polysaccharides Protéines Tableau IV : Biomatériaux utilisés pour l’ingénierie tissulaire (d’après (Chen et al. 2008))
3/ Applications thérapeutiques
Les avantages de l’implantation de biomatrices sont 1/ la production in situ de molécules peptidiques, 2/ la production continue qui évite les problèmes de stabilité limitée de ces molécules, 3/ idéalement, un contrôle de la dose grâce au nombre de cellules transplantées, 4/ une meilleure efficacité grâce à une production et une libération des substances actives localisées et 5/ un arrêt possible du traitement par retrait des biomatrices. L’implant idéal pour ces applications est : - biocompatible, - biodégradable, - hautement poreux pour permettre la pénétration des cellules et l’imprégnation tissulaire, - assez perméable pour permettre la libération de nutriments et les échanges gazeux, - adaptable à l’environnement mécanique, - responsable de l’attachement des cellules à sa surface, et promoteur de la migration cellulaire, de la formation de MEC appropriée et de la transmission des molécules de signalisation.
35 Introduction générale
a. La thérapie cellulaire du diabète
Le diabète est un désordre métabolique hétérogène qui, selon l’International Diabetes Federation touche 4 millions de personnes en France en 2010. La prévalence mondiale était de 130 millions de personnes en 2000 et on l’estime à 300 millions en 2025. Le diabète peut être classé en deux maladies d’étiologies distinctes : - le diabète de type I causé par une destruction auto-immune des cellules bêta des îlots de Langerhans et qui touche 0,5 % des populations, - le diabète de type II causé par une résistance à l’insuline dans les muscles, le tissu adipeux et le foie. Son incidence est 10 fois supérieure à celle du type I et elle augmente constamment en raison des habitudes alimentaires modernes (3% en France). Les traitements (règles hygiéno-diététiques, insuline exogène) couramment utilisés pour les deux types retardent mais ne préviennent pas les dommages microvasculaires consécutifs à la maladie qui provoquent des complications telles que les maladies cardio- vasculaires, les rétinopathies et l’insuffisance rénale. A l’heure actuelle, pour traiter le diabète de type I, la transplantation d’îlots pancréatiques issu de patients en état de mort cérébrale est la thérapie de remplacement cellulaire la plus utilisée (Correa-Giannella and Raposo do Amaral 2009). Cependant, la rareté des îlots humains transplantables pose un obstacle majeur à l’utilisation généralisée de cette thérapie. C’est pourquoi l’encapsulation de cellules a été envisagée comme pour permettre l’immunoprotection des cellules lors de xéno- et d’allo-transplantation. Des résultats prometteurs ont été obtenus dans des approches d’allo- et de xeno-transplantation (Antosiak-Iwanska et al. 2009; Cui et al. 2009) et une étude pilote à récemment été mise en place par Calafiore et collaborateurs (Calafiore et al. 2006). Dans cette étude, des ilôts humains ont été microencapsulés dans de l’alginate de sodium et greffés chez dix patients présentant un diabète de type I traités par l’insuline. Les résultats pour les deux premiers patients montrent une amélioration de la glycémie et une diminution de la consommation exogène d’insuline. Soixante jours après la greffe ils observent une réponse bi-phasique du peptide C ce qui suppose une différenciation des cellules β des îlots, cette réponse est toujours détectable six mois (patient 1) et un an (patient 2) post greffe. En ce qui concerne les CSMs, Chandra et collaborateurs ont induit la différenciation in vitro de CSMs du tissu adipeux en agrégats cellulaires semblables aux îlots de Langerhans (ICAs). Ces cellules différenciées sont ensuite encapsulées dans de l’alginate de calcium
36 Introduction générale présentant une membrane de polyuréthane biocompatible. Enfin, elles sont transplantées dans la cavité péritonéale de souris diabétiques Swiss albino. Ces souris présentent une diminution des taux de glucose sanguin pendant deux semaines après la greffe {Chandra, 2009 #697.
b. La thérapie cellulaire de la maladie de Huntington
La chorée de Huntington, aussi connue sous le nom de maladie de Huntington, est une maladie héréditaire incurable qui évolue inexorablement vers la mort. Cette maladie ne se développe, le plus souvent, que chez les personnes âgées de 40 à 50 ans. Elle se traduit par une dégénérescence neuronale affectant les fonctions motrices et cognitives aboutissant à une démence. Ces manifestations psychiatriques de la maladie s'accompagnent de manifestations neurologiques avec, chez le sujet éveillé, des gestes incohérents et anormaux (mouvements choréiques), des troubles de l'équilibre et une léthargie. Actuellement, il n’existe pas de traitement pour cette maladie. C’est pourquoi la thérapie cellulaire combinée à l’encapsulation des cellules ont été envisagé. Emerich et collaborateurs {Emerich, 2006 #321} ont développé un système d’encapsulation de plexus choroide dans de l’alginate pour permettre une libération adéquate de facteur neurotrophique chez un modèle primate de la maladie de Huntington. Les transplants de plexus choroide protègent significativement les neurones striataux de la dégénerescence et cette technique semble être un bon moyen pour prévenir l’atteinte de ces neurones.
c. La thérapie cellulaire de la douleur
Les lésions ou les dysfonctionnements du système nerveux peuvent conduire à des douleurs neuropathiques, le plus souvent résistantes aux thérapies courantes (antalgiques, interventions chirurgicales) (Baron 2009). Ces douleurs représentent un problème majeur tant sur le plan médical que sur le plan social puisqu’elles ont un cout financier important. Ainsi, l’encapsulation de cellules produisant des substances analgésiques a été envisagée afin de permettre une libération prolongée et contrôlée de ces substances. Par exemple, des cellules chromaffines bovines connues pour sécréter de nombreuses substances
37 Introduction générale neuroactives, ont été encapsulées puis greffées dans un modèle de douleur neuropathique chez le rat. Cette greffe induit une augmentation des taux de catécholamines et de metenképhaline (Jeong et al. 2005; Moustafa et al. 2006).
d. La thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque
L’insuffisance cardiaque (IC) est un problème majeur de santé publique. En effet, elle a une prévalence de 1 à 2 % dans le monde occidental et son incidence est de 1 % par an. Les approches de revascularisation ont permis de diminuer la mortalité de l’IC aiguë alors que de plus en plus de patients meurent de l’IC chronique en raison d’une perte permanente du tissu contractile cardiaque et par conséquent d’un ventricule gauche moins performant. A l’heure actuelle, on peut diviser l’arsenal thérapeutique disponible en trois groupes : - la pharmacologie : inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine, les diurétiques, les β-bloquants et les antagonistes de l’aldostérone. Tous permettent d’améliorer les symptômes et le pronostic, - la chirurgie : la greffe cardiaque permet d’augmenter l’espérance de vie mais elle présente trois limites majeures que sont les complications péri-opératoires, le traitement immunosuppresseur qui doit être pris à vie et la disponibilité des greffons, - les méthodes encore expérimentales : le traitement avec de l’érythropoïétine ou le « granulocyte stimulating factor » (G-CSF) afin d’augmenter et de stimuler le nombre de cellules progénitrices circulantes (Theiss et al.; Huang et al. 2009) la thérapie génique (Vinge et al. 2008) ou la thérapie cellulaire. Le cœur peu présenter un certain degré d’autorenouvellement (Kubo et al. 2008), les stratégies visant à améliorer ce phénomène pourraient représenter une approche prometteuse. Les cellules actuellement les plus utilisées dans les études préliminaires sur la thérapie cellulaire cardiaque sont 1/ les myoblastes squelettiques (Menasche et al. 2008) mais leur utilisation peut être liée à des risques d’arythmies (Veltman et al. 2008) et 2/ les cellules de la moelle osseuse (Rota et al. 2008) et plus particulièrement les cellules CD34+ (Hendrikx et al. 2006). Les biomatériaux ont également été envisagés dans le cadre de cette pathologie. Même si certaines études démontrent la possibilité d’injecter directement les capsules dans le
38 Introduction générale myocarde (Wei et al. 2007; Zhang et al. 2008), les « implants » sont préférés pour des raisons de contraintes mécaniques. Divers types de biomatériaux ont été utilisés : - des patchs ont été développé pour réparer le myocarde et les résultats montrent qu’ils préviennent l’insuffisance cardiaque en inhibant le remodelage pathologique et la détérioration des fonctions cardiaques (Piao et al. 2007; Wei et al. 2008), - des couches de feuillets cellulaires c’est-à-dire des cellules cultivées sur des polymères thermosensibles ce qui permet la formation de strates de feuilles de cellules cardiaques. C’est une technique prometteuse car elle évite l’utilisation d’enzymes pendant la culture et elle permettrait de produire des feuillets de cellules individuels, formant un tissu myocardique en 3D battant simultanément (Haraguchi et al. 2009), - de la colle de fibrine, directement injectée dans la zone infarcie. Ce système permet de diminuer la taille de l’infarctus (Garcia-Villarreal and Casillas-Covarrubias 2008; Terashima et al. 2008). Concernant l’utilisation des CSMs, Wei et collaborateurs ont développé un patch cardiaque à partir de la technique des feuillets cellulaires. Les CSMs sont cultivées en plusieurs couches puis insérées dans un implant biologique et la construction est implantée dans un modèle d’infarctus du myocarde chez le rat. Les résultats montrent que les cellules cultivées ainsi ont une meilleure adhérence, viabilité et leur distribution spatiale est uniforme. Les résultats in vivo quant à eux indiquent que la transplantation de ce patch permet de préserver la fonction cardiaque (Wei et al. 2008). Enfin, Yang et collaborateurs ont montré que les CSMs ensemencées sur des patchs hybrides de soie-polysaccharide présentent une meilleure prolifération et une meilleure différenciation en cardiomyocytes quand elles sont cultivées en présence de 5-azacytidine (Yang et al. 2009).
Figure 8 : Photo de la suture d’un patch sur un cœur ischémié (Bowen et al. 2001)
39 Introduction générale
e. La thérapie cellulaire des lésions cartilagineuses
Les lésions du cartilage peuvent être locales (au cours de traumatisme articulaires) ou étendues (arthrose). Actuellement, il n’existe pas de traitement curatif pour soigner cette maladie. Les seuls outils pharmacologiques que l’on possède sont entre autres, les anti- inflammatoires stéroïdiens et non-stéroïdiens mais ils sont insatisfaisants car ils traitent seulement les symptômes (inflammation et douleur). Le cartilage adulte ne pouvant pas réparer ses propres lésions car il synthétise du cartilage fibreux (Caplan et al. 1997; Buckwalter and Mankin 1998), de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à stimuler les fonctions anaboliques du cartilage ont été développées. Elles ont pour but d’améliorer la cicatrisation des lésions et ainsi prévenir l’évolution vers l’arthrose. Ces stratégies se basent sur la thérapie cellulaire. L’une des premières thérapies cellulaires développée a été la transplantation de chondrocytes autologues (« Autologous Chondrocyte Transplantation », ACT). Cependant, 15 ans après son initiation, cette technique n’a pas convaincu quant à son intérêt par rapport aux autres techniques chirurgicales classiques. En effet, une étude randomisée compare l’ACT à la technique des microfractures et aucune différence entre les deux groupes n’est observée tant sur le plan clinique, visuel (arthroscopie) ou qualitatif (biopsie) (Knutsen et al. 2007). C’est d’ailleurs l’une des raisons qui ont amené la Haute Autorité de Santé à ne pas autoriser cette technique en France. De nombreuses études se dirigent donc maintenant vers les cellules souches ou progénitrices qui pourront se différencier secondairement en chondrocytes. Les cellules de prédilections pour cette approche sont les cellules souches de la moelle osseuse (Centeno et al. 2008), du tissu adipeux (Ishimura et al. 2008), de l’os trabéculaire (Noth et al. 2002), du tissu synovial (De Bari et al. 2001), du périoste (De Bari et al. 2006) et du cartilage articulaire (Dowthwaite et al. 2004). Il faut néanmoins rester prudent sur l’utilisation de ces cellules car des études montrent qu’une fois introduites dans la lésion elles poursuivent leur processus de différenciation vers une hypertrophie puis une mort par apoptose (Kafienah et al. 2007). Les contacts cellule-cellule ou cellule-matrice jouent un rôle majeur dans l’induction de la voie chondrogénique in vitro et in vivo. En premier lieu, les biomatériaux ont été utilisés comme support permettant aux protéines matricielles néosynthétisées par les chondrocytes de rester dans l’environnement cellulaire. Mais ils permettent également de mimer la présence d’une matrice protéique cartilagineuse et ils activent des mécanorécepteurs
40 Introduction générale spécifiques (les intégrines) susceptibles d’induire l’expression des gènes chondrogéniques par des voies de signalisation propre. Ainsi le matériau devient un leurre biologique (cf. Figure 7) (Montembault et al. 2006).
Figure 9 : Mécano transduction matrice/cellule : une voie possible de différenciation chondrocytaire (Corvol et al. 2008)
En comparaison avec l’injection intra-articulaire, l’application des CSMs sur le cartilage érodé via un implant permet plus de contrôle. L’ensemencement des CSMS sur un implant biodégradable pour la prolifération et la production de matrice offre l’avantage d’avoir une source de cellules progénitrices accessible, facile à manipuler et s’autorenouvellant. Mais les résultats sont ambigus selon les espèces, certains montrent la formation de cartilage alors que d’autres observent une fragmentation des CSMs. En effet, Im et collaborateurs ont montré une différenciation des CSMs en cartilage in vivo chez le lapin (Im et al. 2001) alors que l’équipe de Quintavalla démontre que chez la chèvre, deux semaines après la greffe, il y a une perte progressive des cellules ainsi qu’une fragmentation de l’implant (Quintavalla et al. 2002). Une autre technique pourrait être d’implanter des CSMs prédifférenciées in vitro en chondrocytes (Necas et al. 2009). Pour cela, en plus de ce système de culture les CSMs sont cultivées dans un milieu défini auquel sont ajoutés des facteurs bioactifs comme l’insuline, le pyruvate et le TGFβ (Lee et al. 2004). En effet, plusieurs études ont montré que,
41 Introduction générale cultivées dans les bonne conditons, les CSMs encapsulées dans de l’alginate peuvent se différentier en chondrocytes (Haider et al. 2008; Park and Na 2008; Chung and Burdick 2009). Des études récentes montrent que les CSMs ensemencées dans des implants de cartilage représentent un outil thérapeutique interessant. Elles peuvent en effet se différentier en chondrocytes et l’implant permet ainsi de reconstituer le cartilage lésé (Noth et al. 2008; Necas et al. 2009; Yang et al. 2009).
Figure 10 : Hydrogel de collagène I sur lequel seront ensemencées les CSMsS pour la transplantation (d’après (Noth et al. 2008)
f. La thérapie cellulaire des lésions osseuses
La régénération du tissu osseux représente un enjeu de santé publique considérable puisque l’os est l’organe le plus communément greffé (DeLacure 1994), des 1-2 millions de fractures traitées chaque année aux Etats Unis, environ 250 000 nécessitent une greffe osseuse (Langer and Vacanti 1993). La perte du tissu osseux peut être due à un traumatisme, une maladie ou à l’ablation d’une tumeur. Les personnes âgées représentent la population la plus touchée par la perte du tissu osseux notamment à cause de l’ostéoporose. Ainsi, pour compenser la perte osseuse, la greffe est actuellement le traitement le plus utilisé. En raison des limitations associées avec les allo- et les xénogreffes (rejet immunitaire, etc.), les autogreffes sont préférées en clinique. Cependant, elles présentent elles aussi des inconvénients tels que la résorption du matériel implanté, l’inflammation et la
42 Introduction générale douleur au site donneur, le risque d’infection et la faible quantité de matériel disponible. D’autres techniques ont également été envisagé comme la greffe synthétique (Masuda et al. 1998) mais leur efficacité étant limitée elles ne sont plus utilisées. Il est donc important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorant la réparation osseuse tout en évitant les procédures chirurgicales lourdes nécessaires pour l’autogreffe. La thérapie cellulaire est donc une approche prometteuse, mais dans le cas de la réparation osseuse elle est le plus souvent combinée à l’utilisation de biomatériaux et dans ce cas on parle plutôt d’ingénierie tissulaire. Différents types cellulaires ont été utilisés tels que des préparations cellulaires à partir de la moelle osseuse (Holy et al. 2003), des CSMs (Sauerbier et al.), des ostéoblastes (Hofmann et al. 2003), des cellules du périoste (Redlich et al. 1999) et des cellules génétiquement modifiées (Dong et al. 2009). Classiquement, ces cellules sont pré-différenciées in vitro en ostéoblastes puis fixées sur une matrice et transplantées. Ainsi, dans ce cas, au choix des cellules les mieux adaptées se rajoute le choix du biomatériaux le plus approprié à la régénération osseuse et à la greffe chez l’individu (biocompatibilité, biorésorption,etc). La formation de l’os à partir de CSMs requiert un implant en 3-dimensions pour diriger la croissance et la différenciation cellulaire (Otto and Rao 2004). Plusieurs biomatériaux ont été proposés avec pour but de reproduire le milieu dans lequel des interactions complexes entre cellules et matrices ont lieu. Les caractéristiques de l’implant idéal pour cette application sont : - la facilité d’implantation, - la capacité d’héberger, de faire proliférer et de maturer les cellules, - la formation d’une barrière pour les autres tissus - la compatibilité du temps de réabsorption qui doit permettre la formation osseuse mais ne doit pas interférer avec la substitution du tissu. Un autre argument pour utiliser les biomatrices est qu’elles ont déjà une porosité ouverte similaire à celle de l’os. De la même façon que pour la différenciation en lignée chondrocytaire, l’implant n’est pas suffisant pour la différenciation en ostéocytes, un milieu ostéoinducteur contenant de la dexamethasone, de l’ascorbate-2-phosphate et du β-glycerol phosphate est nécessaire. Des études ont montré que des CSMs humaines encapsulées dans des implants et cultivées pendant cinq semaines dans un milieu ostéogénique sont capables de se différentier en os (Wang et al. 2009). Dans une autre étude, des CSMs ont été cultivées dans des conditions
43 Introduction générale osteogéniques pendant quatorze jours puis ensemencées sur un implant d’alginate et implantées chez des souris pendant huit semaines. L’histologie, l’immunohistologie, la microscopie à transmission électronique et la RT-PCR montrent que les CSMs se sont bien différenciées en ostéocytes (Cai et al. 2007).
Figure 11 : Biocomplexe collagène/cellules utilisé pour reconstruire le mandibule (d'Aquino et al. 2009)
g. Les essais cliniques
A l’heure actuelle, peu de résultats concernant des essais cliniques utilisant des cellules microencapsulées sont disponibles dans les bases de données classiques. En ce qui concerne la thérapie cellulaire cardiaque, pour l’instant aucun résultat d’essai clinique n’a été publié. En revanche, une étude clinique pilote de phase I a été menée dans le cadre de la thérapie cellulaire du diabète. Dans cette étude, des patients atteints de diabète de type I et sous traitement par insuline exogène reçoivent une transplantation d’ilôts microencapsulés dans de l’alginate de sodium dans la cavité péritonéale. Les résultats montrent que cette greffe est sure et ne provoque pas d’effets secondaires chez le receveur (Calafiore et al. 2006; Calafiore et al. 2006). Cependant, des améliorations restent à apporter au protocole d’isolation des ilôts afin d’améliorer le rendement et la dose optimale d’ilôts à greffer doit être déterminée. Enfin, des essais cliniques de phase I ont été menés dans le cadre de la dégénérescence rétinienne (Sieving et al. 2006). Des cellules transfectées par le « ciliary
44 Introduction générale neurotrophic factor » (CNTF) humain et encapsulées dans du poly(ethylene terephthalate) sont implantées chirurgicalement dans l’œil de dix patients ayant une perte de la vision. Celle-ci est due à une dégénérescence des photorécepteurs rétiniens. Six mois après, les implants sont retirés, les cellules sont toujours vivantes et continuent de produire le CNTF à des taux thérapeutiques. Ils observent également une amélioration de l’acuité visuelle des patients jusqu’à six mois après le retrait des implants. Ainsi, les recherches portant sur l’utilisation de cellules encapsulées pour la thérapie cellulaire sont encore majoritairement au stade pré-clinique. Ces études ont permis de démontrer la biocompatibilité des polymères et l’efficacité de cette stratégie dans des modèles animaux. Mais les premières études cliniques, notamment dans le cas du diabète, ont montré que l’application de cette technique est plus complexe. La faisabilité et la sûreté ont pu être démontrées, reste maintenant à optimiser l’efficacité en adaptant la quantité de cellule à injecter.
Ainsi, plusieurs stratégies sont accessibles pour améliorer la survie des cellules après la greffe. Le choix peut se faire selon la facilité de mise en place du prétraitement souhaité (modifications génétiques ou pharmacologiques), selon la cible (stress oxydant, inflammation, etc) et selon le moment choisi. On peut en effet préconditionner les cellules ou injecter un agent pharmacologique au moment de la greffe ou encore ensemencer les cellules sur des biomatrices pour leur éviter le stress de l’injection. Il n’y a donc pas de stratégie idéale, il faut s’adapter au type cellulaire et à l’organe étudiés. Les biomatériaux appliqués aux CSMs permettent d’une part de soutenir leur adhésion, leur croissance et leur différenciation et d’autre part de les protéger de l’environnement tissulaire. Même si jusqu’à présent, les CSMS couplées à des biomatrices ont surtout été utilisées dans des microcapsules pour être différenciées en chondrocytes ou en ostéocytes, de nouvelles applications apparaissent maintenant pour d’autres voies de différenciations. Le développement des patchs et leur facilité de greffe permet d’envisager des perspectives prometteuses pour la thérapie cellulaire cardiaque mais également pour d’autres organes solides.
45 Introduction générale
V/ OBJECTIFS DE LA THESE
En raison de leur multipotence et de leur activité paracrine, les CSMs représentent une source cellulaire intéressante pour la thérapie cellulaire. Ce sont des cellules souches adultes provenant du stroma de la moelle osseuse, leur source ne pose donc pas de problèmes éthiques et elles permettent les greffes autologues. Même s’il a été démontré qu’elles pouvaient se différencier in vitro à la fois en cellules du lignage mésodermique et en cellules de lignage non mésodermique, il semble maintenant évident que leur effet bénéfique soit majoritairement du à leurs sécrétions paracrines (Togel et al. 2007). Cependant, la greffe intraparenchymateuse des CSMs dans les organes solides se traduit par une mort massive des cellules dans les 48 heures suivant la greffe (Muller-Ehmsen et al. 2002; Tambara et al. 2003). L’amélioration de la survie cellulaire est donc un enjeu important pour potentialiser les bénéfices de la thérapie cellulaire. Classiquement, des modifications génétiques des cellules ont permis d’améliorer leur survie. Dans notre laboratoire, nous nous sommes déjà intéressés à cette question et nous avons montré qu’un préconditionement pharmacologique des CSMs avec la mélatonine entraînait une amélioration de leur survie et par conséquent de leur activité paracrine et de leur efficacité (Mias et al. 2008). Suite à cette étude, nous avons voulu étudier plus particulièrement les relations qui existaient entre les cellules greffées et l’environnement tissulaire. Dans un premier travail, nous avons évalué quelle influence pouvait avoir l’environnement tissulaire sur les cellules greffées. En effet, après la greffe, les cellules se retrouvent dans un environnement pathologique soumis à du stress oxydant, de l’inflammation et des modifications biochimiques. Les CSMs sont bien évidemment soumises à ces modifications mais dans quelle mesure ? Il semble évident que le stress oxydant et l’inflammation soient en partie responsables de la mort précoce des cellules mais qu’en est-il des modifications biochimiques ? Le second axe de notre travail avait pour but d’améliorer l’influence des cellules greffées sur l’environnement. En effet, les CSMs par leurs effets paracrines vont stimuler la régénération de l’organe lésé. Or, la greffe intraparenchymateuse génère un « cluster » de cellule au niveau du site d’injection. Les cellules ainsi accumulées vont avoir des apports en oxygène et en nutriments diminués ce qui pourra compromettre leur. Nous avons donc conçu un système de dépôt des cellules sur l’organe pour améliorer leur survie tout en
46 Introduction générale potentialisant leur activité paracrine. Ce système est basé sur la microencapsulation des CSMs. Mais quel type de microparticules est le plus approprié pour les CSMs ? Est-ce que ces microparticules vont pouvoir être déposées sur les organes solides ? Vont-elles résister aux contraintes mécaniques de l’organe sans se dégrader ? Est-ce que leur implantation ne va pas endommager l’organe ?
Ainsi ces deux axes de recherche devraient ouvrir de nouvelles perspectives pour l’amélioration de la survie des CSMs après la greffe. L’intérêt de ces deux approches différentes est qu’elles vont cibler des organes et des pathologies différentes. Il semble en effet difficile de développer une stratégie universelle pour l’amélioration de la survie cellulaire après la greffe.
47 Premième étude
PREMIERE ETUDE : Effet de l’environnement tissulaire sur les cellules geffées
48 Premième étude
I/ INTRODUCTION
A l’origine de ce travail, plusieurs études montraient que l’un des problèmes majeurs de la thérapie cellulaire était la survie très limitée des cellules greffées. Des études ont mis en évidence l’importance des espèces réactives de l’oxygène (EROs) dans cette mort précoce. En effet, des modifications génétiques (Tang et al. 2005) ou des préconditionnements pharmacologiques (Mias et al. 2008) induisant une diminution du stress oxydant permettent d’améliorer la survie cellulaire post-greffe. Nous avons émis l’hypothèse que les monoamines oxidases (MAO) pourraient représenter une source d’EROs dans les CSMs. D’autre part, il a récemment été mis en évidence une augmentation des taux de sérotonine (5-HT) dans certains troubles candidats pour la thérapie cellulaire. D’autres études ont montré qu’in vitro la 5-HT pouvait agir sur le comportement des CSMs (prolifération, neuroplasticité). Ainsi, cette 5-HT, via sa dégradation par les MAO et la génération subséquente de peroxyde d’hydrogène (H2O2), pourrait être jouer un rôle dans la mort des CSMs après la greffe. Dans cette étude nous avons vérifié que les CSMs possédaient tous les outils pour métaboliser la 5-HT, c’est-à-dire son transporteur SERT pour l’internaliser et la MAO-A pour la dégrader. Puis nous avons étudié l’effet de différentes concentrations en 5-HT sur la viabilité des CSMs in vitro et établi l’implication des MAO dans cet effet.
A/ LA SEROTONINE
1/ Biosynthèse et métabolisme
La 5-hydroxytryptamine ou 5-HT est une amine biogène dérivée du tryptophane. Sa synthèse a été étudiée pour la première fois par Hamlin et Fischer en 1951. Comme elle ne peut pas traverser la barrière hémato-encéphalique, sa synthèse au niveau cérébral est exclusivement réalisée au sein des neurones sérotoninergiques (Udenfriend et al. 1957). Le tryptophane (Trp), précurseur dans la biosynthèse de la 5-HT, est un acide aminé dit essentiel, c’est-à-dire qu’il ne peut être synthétisé par l’organisme, mais doit être apporté via la dégradation des protéines provenant de l’alimentation (cf. Figure 10). La quantité quotidienne de Trp ingérée varie de 0.5 à 1 g, bien que l’apport minimum nécessaire soit
49 Premième étude
évalué à 200 mg/j. Plus de 95% du Trp est utilisé pour la synthèse des protéines, cependant il ne représente que 1% des 20 acides aminés constituant les protéines. Après la dégradation des protéines de l’alimentation, le Trp est présent dans la circulation sanguine sous deux formes : la majeure partie (50 à 80%) est liée à l’albumine sérique (Mc and Oncley 1958), tandis que le reste du Trp est sous forme libre, 1% étant utilisé pour la synthèse de 5-HT (Salter et al. 1989). En effet, seule la fraction libre du Trp peut traverser la barrière hémato-encéphalique grâce à un transporteur actif, le L-type amino acide transporteur 1 (LAT-1) présent sur la membrane de certaines populations de cellules, principalement les cellules endothéliales (Curzon 1996; Russo et al. 2003). La biosynthèse de la 5-HT à partir de son précurseur est réalisée en deux étapes distinctes (Boadle-Biber 1993) : 1/ hydroxylation du Trp en 5-hydroxytryptophane (5-HTP), réaction catalysée par l’enzyme limitante de cette voie de biosynthèse, la tryptophane-5-hydroxylase (Grahame- Smith 1964; Levenberg et al. 2007), 2/ décarboxylation du 5-HTP en 5-HT par la L-amino-décarboxylase (Henry and Bowsher 1986). Cependant, la voie de biosynthèse ne se termine pas avec la formation de 5-HT car une faible proportion de la 5-HT produite est elle-même transformée en mélatonine au sein de la glande pinéale (Moore and Rapport 1971; Bowsher and Henry 1983). Après dépolarisation du neurone, la 5-HT libérée dans la fente synaptique est rapidement inactivée en étant recapturée par le bouton présynaptique via un transporteur membranaire spécifique (SERT) (Rudnick 1977). Sa dégradation est assurée par la monoamine oxydase-A (MAO-A) (Cawthon and Breakefield 1979), présente au sein des neurones sur la membrane externe des mitochondries qui provoque une déamination oxydative de la 5-HT. Le produit de cette réaction est ensuite oxydé pour former l’acide 5-hydroxyindole acétique (5-HIAA), principalement retrouvé dans les urines mais également au niveau du liquide cépahlo- rachidien (5%).
50 Premième étude
L-tryptophane Tryptophane hydroxylase
L-5-Hydroxytryptophane L-aromatique amino-acide décarboxylase
5-Hydroxytryptamine ou 5-HT 5-HT N-acétylase HO N-acétyl-5-HT Hydroxyindole O-méthyltransférase
Mélatonine
Figure 12 : Synthèse de la sérotonine
2/ Rôle et distribution
La 5-HT initialement localisée dans les plaquettes et connue pour son activité vasoconstrictrice, a été isolée et purifiée pour la toute première fois en 1948 à partir du sérum (Rapport et al. 1948). Bien que 95% de la 5-HT de l’organisme soit produit par les cellules entérochromaffines de la muqueuse du tractus gastro-intestinal, elle a également été mise en évidence dans les plaquettes et au niveau cérébral (Erspamer and Asero 1952; Twarog and Page 1953). Les études menées par le groupe d’Amin et collaborateurs en 1954 ont montré une diffusion différentielle de la 5-HT au sein du système nerveux central et exclusivement au sein de la substance grise contenant les corps cellulaires des neurones. Il a ensuite été démontré par immunohistochimie que la 5-HT était synthétisée par des neurones dont les corps cellulaires sont particulièrement concentrés dans les noyaux du
51 Premième étude raphé du tronc cérébral (Dahlstroem and Fuxe 1964; Steinbusch 1981; Touret et al. 1987). Les neurones sérotoninergiques les plus rostraux se projettent majoritairement dans le cerveau antérieur, le thalamus et l’hypothalamus par des voies ascendantes, tandis que les cellules les plus caudales et ventrales se projettent par des voies descendantes dans la moelle épinière et le cervelet respectivement (Azmitia 2007). Ainsi, la 5-HT est largement distribuée au sein du système nerveux central où elle joue le rôle de neurotransmetteur. Les effets de la 5-HT sur les neurones sont excitateurs ou inhibiteurs en fonction des récepteurs impliqués. La 5-HT est le médiateur dont les récepteurs spécifiques sont les plus nombreux (Lucki 1998).
3/ Les récepteurs de la sérotonine
La 5-HT a un rôle important surtout dans le SNC. Ses nombreux récepteurs ont été définis à partir de 1979 avec, parallèlement, la mise sur le marché de ligands originaux dans des domaines thérapeutiques variés : anxiété, migraine, vomissements.
a.Les récepteurs couplés aux protéines G
* Structure et activation
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) ont une structure générale caractéristique avec 7 domaines transmembranaires formés par des hélices α, un domaine N-terminal extracellulaire et 3 boucles intracytoplasmiques (cf. Figure 11). D’une manière générale, après liaison du ligand, les RCPG subissent un changement de conformation qui passe par les hélices transmembranaires et se répercute sur le domaine C- terminal et les boucles intracellulaires, relais de la transduction du signal. Cependant, malgré des structures tridimensionnelles proches, les RCPG n’ont pas tous le même site de liaison du ligand ou la même succession de changements conformationnels au moment de leur activation (Gether and Kobilka 1998). Dans le cas des amines biogènes comme la 5-HT, la liaison se fait au niveau du noyau formé par les hélices transmembranaires et interagit directement avec les hélices par des liaisons hydrogènes. La structure tridimensionnelle du récepteur est alors modifiée et les
52 Premième étude domaines transmembrannaires vont bouger les uns par rapport aux autres et transmettre le signal aux domaines intracellulaires du récepteur (Ji et al. 1998; Bockaert and Pin 1999).
Figure13 : Structure générale des RCPG
* Voies de signalisations activées par les protéines G
Les RCPG activent des complexes trimériques composés de protéines Gα liées à une molécule de GDP, Gβ et Gγ. Lorsque le récepteur est inactif, le complexe des protéines G est lié à la troisième boucle intracellulaire, le changement de conformation du récepteur consécutif à son activation entraîne l’échange de GDP en GTP et la dissociation du complexe en sous-unités Gα et Gβγ. Chacune des sous unités ainsi activées transmet alors le signal aux autres protéines des voies de transduction et activent une voie de signalisation spécifique (cf. Figure 12). L’état actif de la protéine Gα-GTP est ensuite progressivement annulée par sa réassociation avec le complexe Gβγ et l‘hydrolyse subséquente du GTP en GDP, directement catalysé par l’activité GTPase de la protéine Gα.
53 Premième étude
Figure 14 : Voies de signalisation des protéines Gαs, Gαi et Gαq.
b. Classification des récepteurs de la sérotonine
Chez les mammifères on compte 16 gènes codant pour des récepteurs de la 5-HT. A l’exception des récepteurs 5-HT3 qui sont des canaux ioniques, tous les autres appartiennent à la famille des RCPG et sont classés en six familles selon la nature de la protéine Gα actée, les homologies de leurs séquences protéiques et leurs propriétés pharmacologiques. Ainsi, les récepteurs 5-HT1 sont couplés aux protéines Gαi/o et inhibent l’adényl cyclase, les récepteurs 5-HT2 sont eux couplés aux protéines Gαq/11 et augmentent la concentration de calcium intracellulaire. Enfin, les récepteurs 5-HT4, 5-HT6 et 5-HT7 sont couplés aux protéines Gαs et activent la production d’AMPc (Hoyer et al. 2002). La distribution des différents récepteurs de la 5-HT dans les organes des mammifères, leurs rôles et les maladies pour lesquelles ils représentent des cibles thérapeutiques sont présentés dans le tableau suivant.
54 Premième étude
Nom Localisation Rôle Traitement 5-HT1 5-HT1A SNC Autorécepteur modulant la Anxiété Système gastro-intestinal libération de 5-HT dans le SNC Dépression Stimulation neuroendocrine Hypothermie Régulation nerveuse de la pression sanguine et du rythme cardiaque Locomotion Régulation du tractus intestinal 5-HT1B SNC Autorecepteur modulant la Migraine Système vasculaire libération de 5-HT dans le SNC Douleur Inhibition de la libération de Alcoolisme (souris noradrénaline dans la veine knock-out) cave Extravasation dans les ganglions trigéméniaux 5-HT1D SNC Autorecepteur modulant la Migraine Cœur libération de 5-HT dans le SNC Douleur Régulation de la libération de 5-HT dans le cœur 5-HT1E SNC Inconnu Pas impliqué dans un traitement 5-HT1F SNC Possible rôle d’autorécepteur Migraine Utérus Extravasation dans les Douleurs Mésentère ganglions trigéméniaux 5-HT2 5-HT2A SNC Contractions des muscles Hypertension Système vasculaire lisses Schizophrénie Agrégation plaquettaire Anti-Psychotique Stimulation des sécrétions hormonales
55 Premième étude
5-HT2B SNC Vasorelaxation Prophylaxie de la Système gastro-intestinal Stimulation de la prise migraine Reins alimentaire Poumons Anxiété Système cardio- Développement cardiaque vasculaire Développement des neurones entériques 5-HT2C SNC Hypoactivité Anxiété Inhibition de la prise alimentaire Problèmes Comportements suicidaires d’alimentation Dyskinésie orale (anorexie, boulémie) 5-HT3 Système gastro-intestinal Mobilité du tractus intestinal Mémoire Système nerveux Stimulation des sécrétions périphérique (SNP) intestinales Système gastro-intestinal Vomissement 5-HT4 SNC Contraction de l’œsophage et Arythmie cardiaque Système gastro-intestinal du côlon Incontinence Cœur Stimulation des sécrétions urinaire intestinales Constipation Modulation de la libération des neurotransmetteurs dans le SNC Stimulation du rythme cardiaque 5-HT5 SNC (astrocytes) Adaptation au stress Pas impliqué dans un traitement 5-HT6 SNC (neurones) Comportements (bâillement, Dépression étirement, mastication) Anti-psychotique
56 Premième étude
Inhibition de la prise alimentaire Mémoire 5-HT7 SNC Vasodilatation Relaxation des Système vasculaire Hypothermie vaisseaux sanguins Muscles lisses non Sommeil Hypothermie vasculaires Tableau V : Les différents récepteurs sérotoninergiques chez les mammifères
4/ Localisation et stockage
Des études ont définit la distribution des neurones 5-HT dans le cerveau par des méthodes d’histochimie et d’immunohistochimie (Dahlstroem and Fuxe 1964). La plupart des neurones contenant la sérotonine sont localisés le long de la ligne médiane du cerveau et envoient de longs axones pour innerver de nombreuses zones. Au niveau périphérique, la 5-HT est principalement stockée dans les plaquettes et libérée par les plaquettes activées.
5/ Applications thérapeutiques
La sérotonine est connue pour influencer de nombreux systèmes physiologiques tels que la régulation cardiovasculaire, la respiration, la thermorégulation et de nombreuses fonctions comportementales incluant le rythme circadien, les cycles veille-sommeil, l’appétit, l’agressivité, les comportements sexuels, la sensibilité à la douleur et l’apprentissage. Il n’est donc pas surprenant que la régulation pharmacologique de la 5-HT influence une série de désordres psychiatriques comme la dépression, les désordres de l’anxiété, la schizophrénie et l ‘anorexie. Des désordres de la personnalité : agressivité, dépendance aux drogues ou au jeu et le déficit d’attention ont été associés à la 5-HT. Enfin, des travaux plus récents montrent que les récepteurs à la 5-HT peuvent être ciblés pour traiter les maladies
57 Premième étude neurodégénératives et la maladie d’Alzheimer (Elliott et al. 2009; Geldenhuys and Van der Schyf 2009).
a. Présentation générale
Les applications thérapeutiques de la 5-HT étant nombreuses nous n’en exposerons pas une liste exhaustive. On peut cependant, citer le cas de la migraine. Mëme si les Les phénomènes entrant en jeu sont encore hypothétiques, il à été montré que la 5-HT est impliquée (Milovanovic et al. 1999; Nagata et al. 2006). Les triptans, médicaments de la crise migraineuse et des crises d’algie vasculaire de la face sont des agonistes sélectifs des récepteurs 5-HT1B, 5-HT1D et potentiellement 5-HT1F (Amoozegar and Pringsheim 2009). De même, les dysfonctions de la neurotransmission serotoninergique ont été associé à l’apparition de désordres dépressifs majeurs (Maes et al. 1995) et les inhibiteurs sélectifs de la recapture de 5-HT (SSRIs) se sont révélés efficaces dans le tratement de la dépression. D’autre part, la sécrétion de 5-HT par les cellules formant les tumeurs carcinoïdes est à l’origine du syndrôme carcinoïde (Kulke and Mayer 1999). Enfin, la 5-HT est impliquée dans la régulation du comportement alimentaire (Leibowitz and Alexander 1998), des fonctions neuroendocrines (Murphy et al. 1996), de l’agressivité (Miczek et al. 1994) et dans l’aggravation de l’hypertension pulmonaire (Egermayer et al. 1999).
b. Les maladies cardio-vasculaires
Ces dernières années, des études ont suggérées quela dépression était associée à une augmentation de la mortalité chez des patients souffrant de troubles cardiaques (Kent and Shapiro 2009; Yohannes et al. 2009). La plupart des études suggèrent que l’agrégation plaquettaire, augmentée chez les patients dépressifs, serait impliquée. En effet, elle provoque la formation de thrombus impliqués dans la pathophysiologie des complications cardiaques post infarctus du myocarde et dans le risque de développement des troubles coronariens (Musselman et al. 2002). Certaines études montrent que la 5-HT serait impliquée dans ce phénomène. Dans ces études, la 5-HT amplifie l’agrégation plaquettaire, via ses récepteurs 5-HT2, chez les patients dépressifs en comparaison aux sujets sains (Shimbo et al. 2002).
58 Premième étude
D’autre part, lors de l’ischémie du myocarde on observe une activation des plaquettes permettant la libération de concentrations élevées en 5-HT pour stimuler des fibres sympathiques afférentes cardiaques. Cette augmentation des taux de 5-HT pourrait contribuer à la progression des lésions du myocarde (Longhurst et al. 2001; Fu and Longhurst 2002; Shimizu et al. 2002; Nigmatullina et al. 2009). La concentration circulante en 5-HT est également augmentée dans l’athérosclérose (Hilton and Cumings 1971). En effet, des doses élevées de 5-HT induisent une vasoconstriction via la stimulation des récepteurs 5-HT2. Ainsi, les taux sanguins et totaux de 5-HT peuvent être un marqueur des lésions vasculaires athérosclérotiques (Hara et al. 2004).
Ainsi, le rôle de la 5-HT a été majoritairement étudié au niveau central, mais la mise en évidence de sa présence en périphérie a conduit les chercheurs à envisager un rôle de la 5-HT dans de nombreuses pathologies. L’exemple le plus probant est le système cardio-vasculaire où l’augmentation des taux de 5-HT en conditions pathologiques pourrait servir de marqueur alors que les molécules modulant la synthèse ou la dégradation de la 5-HT pourraient servir d’outils thérapeutiques.
59 Premième étude
B/ LES MONOAMINES OXYDASES
Les amines oxydases sont des enzymes largement distribuées chez les organismes vivants (bactéries, plantes, animaux) (Mondovi et al. 1984). Elles catalysent la déamination oxydative des amines (mono-, di- et polyamines). Elles sont classées en deux groupes : - les amines à FAD ou FAD-amine oxydases (monoamines oxydases MAO et polyoamines oxydases PAO) - les amines possédant un atome de cuivre dans leur site actif et un co-facteur organique ou amine oxydases à cuivre ou Cu-amine oxydase (di-amine oxydases DAO, lysyl oxydase, amines oxydases sensibles au semicarbazide SSAO). Leur fonction dans le métabolisme des amines biogènes leur confère un rôle important dans les processus essentiels comme la prolifération (Vindis et al. 2000), la différenciation cellulaire et l’apoptose (Toninello et al. 2004).
1/ Définition
Les premiers travaux sur les monoamines oxydases (MAO) datent de 1928 avec Maty Hare-Bernheim qui a décrit une enzyme catalysant la déamination oxydative de la tyramine qu’elle nomma tyramine oxydase. Quelques années plus tard, Hugh Blaschko trouve que la tyramine oxydase, la noradrénaline oxydase, les amines aliphatiques oxydases correspondent à la même enzyme capable de métaboliser les amines primaires, secondaires et tertiaires. Cette enzyme ne métabolise pas les diamines (comme l’histamine) et c’est Zeller qui la nomma MAO (Youdim 1975). Ce sont presque essentiellement les observations cliniques qui ont permis l’avènement de ces drogues. L’iproniazide est arrivé sur le marché au début des années 1950 en tant que traitement de la tuberculose. Il est apparu comme un inhibiteur puissant des MAO. Il fut administré en 1956 chez des patients et il a permis une amélioration spectaculaire des états dépressifs. Ainsi, dans les années 1950 et 1960, l’iproniazide et les autres inhibiteurs des MAO ont montré une action antidépressive remarquable mais leur intérêt thérapeutique a été sérieusement compromis par leurs effets secondaires.
60 Premième étude
2/ Isoformes
Une découverte cruciale dans les années 1960 montre qu’il existe au moins deux formes qui ont un pH optimal et une sensibilité à l’inactivation par la chaleur différents. Ces isoformes ont deux autres différences qui ont une grande signification pharmacologique : leur spécificité pour les substrats et les inhibiteurs. Le type A est défini comme étant inhibé par la clorgyline et le Ro 41-1049 (Cesura et al. 1990) et métabolisant la NA et la 5-HT, alors que le type B est inhibé par le déprényl (Knoll and Magyar 1972) et le Ro 16-6491 (Cesura et al. 1989). Le benzylamine et la phényléthylamine sont ses substrats (Johnston 1968). La tyramine et la dopamine (DA) sont métabolisées par les deux isoformes (Youdim et al. 2006). Cette définition des MAO-A et MAO-B a été rapidement suivie par la découverte d’une distribution différente des isoformes dans le cerveau des mammifères (Collins et al. 1970). Ces découvertes suggèrent que la détermination de 1/ la distribution des isoformes des MAO dans le cerveau humain et 2/ la sélectivité pour les inhibiteurs permettraient de développer des traitements pour les dépressions et les maladies neuropsychiatriques. Ceci devrait permettre de diminuer les effets indésirables des anciens inhibiteurs non sélectifs des MAO (Youdim et al. 1972). Les deux gènes codant pour la MAO-A et la MAO-B sont situés sur le bras court du chromosome X. Ces deux gènes sont retrouvés côte à côte et sont homologues à 70%.
61 Premième étude
MAO-A MAO-B MAO-A et MAO-B Substrats Sérotonine b-phénylethylamine Dopamine Benzylamine Adrénaline Méthyl-histamine Noradrénaline MPTP Tyramine Inhibiteurs réversibles Moclobémide RO-196327 Milacémide Toloxatone Befloxatone RO-41-1049 brofaromine Inhibiteurs irreversibles Clorgyline L-déprényl Pargyline LY51641 LY54761 Iproniazide Phenelzine Tranylcypromine Tableau Vi : Principaux substrats et inhibiteurs des MAO (Vindis et al. 2001)
3/ Structure
Les recherches ont montré que les MAO sont formées de deux sous unités liées par un pont disulfure et associées à un groupement FAD. Les MAO sont donc des enzymes appartenant à la famille des flavo-protéines (cf. Figure 13). Plus tard, ce co-facteur a été identifié comme le site auquel les inhibiteurs irréversibles des MAO tels que la pargyline et la rasagiline sont liés par des liaisons covalentes (Youdim et al. 2006). Par mutagenèse dirigée, l’étude du site actif des MAO a montré que certains acides aminés jouent un rôle clé dans l’activité enzymatique (Wu et al. 1993) ou la spécificité de substrat (Tsugeno and Ito 1997). Des approches structurales de cristallographie ont permis d’améliorer la connaissance de leur site catalytique et de leurs sites de liaison aux inhibiteurs ou à leur substrat (Binda et al. 2003; De Colibus et al. 2005). Cette nouvelle approche a permis de modéliser de nouvelles molécules.
62 Premième étude
Figure 15: Structure cristallographique des MAO humaines
4/ Localisation
Les MAO sont localisées sur la membrane mitochondriale externe même si une petite proportion de chaque enzyme est associée avec la fraction microsomale (Youdim et al. 2006). En contraste avec le nombre de travaux concernant la localisation des MAO dans le SNC, il y a relativement peu d’étude sur les MAO dans les tissus périphériques. Cette localisation périphérique est résumée dans le tableau suivant.
Tissu et type cellulaire MAO-A MAO-B Références Cerveau ++ ++ (Saura et al. 1992) Duodénum ++ + (Saura et al. 1992) Pancréas exocrine ++ + (Saura et al. 1992) Glande surrénale ++ + (Billett 2004) Vaisseaux sanguins : (Billett 2004) Cellules endothéliales -/+ -/+ (Rodriguez et al. 2001) Média - - Fibroblastes + + Adventice + +
63 Premième étude
Vaisseaux lymphatiques : Cellules endothéliales - + Cellules sanguines : Lymphocytes périphériques - + Plaquettes - + Placenta (Billett 2004) Syncytiotrophoblastes +++ - Trophoblastes intermédiaires +++ - Cœur (Saura et al. 1992; Cardiomyocytes ++ + Figueiredo et al. 1998; Capillaires myocardiques + + Rodriguez et al. 2001; Billett 2004) Rein (Fernandes and Soares- Capsule de Bowman -/+ -/+ da-Silva 1992; Pizzinat et Glomérules -/+ -/+ al. 1999; Rodriguez et al. Hanse de Henle ++ +++ 2001; Billett 2004) Tubules proximaux ++ +++ Tubules distaux ++ +++ Tubules collecteurs ++ -/+ Pancréas endocrine + + (Rodriguez et al. 2000; Billett 2004) Glande thyroïde ++ -/+ (Rodriguez et al. 2000) Poumons ++ ++ (Rodriguez et al. 2000; Billett 2004) Tissu adipeux blanc +++ ++ (Pizzinat et al. 1999) Foie ++ ++ (Saura et al. 1992; Rodriguez et al. 2001; Billett 2004) Rate : cellules musculaires lisses + + (Saura et al. 1992; et cellules réticulaires Rodriguez et al. 2000) TableauVIi: Expression tissulaire des MAO-A et –B chez l’Homme (d’après (Billett 2004))
64 Premième étude
5/ Fonctions des monoamines oxidases
Les rôles primaires des MAO reposent sur le métabolisme des amines exogènes et le contrôle des taux de neurotransmetteurs et de stocks d’amines intracellulaires. Ainsi, il est supposé que leur distribution dans les tissus du SNC et les tissus périphériques reflète ces rôles physiologiques.
a. Rôle au niveau du système nerveux central
La dégradation rapide des monoamines cérébrales telles que la 5-HT, la NA et la dopamine (DA) est importante pour le fonctionnement correct de la transmission synaptique (cf. Figure 14).
Figure 16:Synapse sérotoninergique (5-HT), noradrénergique (NE pour » norepinephrine » en anglais) et dopaminergique (DA) (Bortolato et al. 2008)
L’étude du phénotype des souris invalidées (« knock-out KO KO) pour les gènes codant pour les deux isoformes des MAO a apporté une contribution importante pour la compréhension de leur rôle dans les comportements et les fonctions cérébrales. Les souris KO pour la MAO-A présentent des niveaux cérébraux en 5-HT et NA supérieurs à ceux des souris sauvages, l’augmentation est plus modeste pour la DA. De
65 Premième étude plus, leur agressivité est augmentée et leur résistance aux stress environnementaux est améliorée (Cases et al. 1995; Shih et al. 1999). En effet, ces souris présentent des perturbations de leur perception des stress extérieurs ce qui pourrait expliquer l’augmentation de leur comportement agressif. Les souris KO pour la MAO-B, elles, présentent seulement une augmentation des taux cérébraux de PEA qui n’est pas associée avec des changements significatifs de la locomotion. Par contre elles semblent moins dépressives (temps d’immobilité diminué lors du test de la nage forcée) (Grimsby et al. 1997; Lee et al. 2004). Les souris KO pour les deux isoformes ont un phénotype unique qui ne correspond pas à la somme des deux mutations. Elles présentent des taux de phenylethylamine, 5-HT, NE et DA supérieurs à ceux des souris KO MAO-A et MAO-B et le comportement est caractérisé par une mobilité réduite, une anxiété et une agressivité (Chen et al. 2004). Tous ces phénotypes sont récapitulés dans le tableau suivant :
Trait phénotypique MAO-A KO MAO-B KO MAO-A/B KO Taux de neurotransmetteurs 5-HT + 200% / + 700% NE +130% / + 200% DA +110% / + 200% PEA / + 700% + 1400% Activité locomotrice - - -- Réactivité à la peur - ? ? Agressivité ++ - + Anxiété et peur - - + Depression - - ? Tableau VIII : Caractéristiques comportementales et neurochimiques des souris KO MAO comparées aux souris sauvages (Bortolato ; 2008)
b. Rôle au niveau des organes périphériques
La co-localisation des MAO-A et MAO-B dans plusieurs tissus indique que ces enzymes ont des rôles et/ou des substrats identiques dans les tissus périphériques.
66 Premième étude
Dans le système gastro-intestinal, le foie et les vaisseaux, les MAO semblent réguler les taux d’amines exogènes alimentaires telles que la tyramine (Da Prada et al. 1988). Les MAO peuvent également être importantes pour le catabolisme des neurotransmetteurs dans les tissus périphériques puisque à la fois les neurotransmetteurs eux-mêmes et leurs produits d’oxydation peuvent moduler la fonction cellulaire (Pizzinat et al. 1999; Vindis et al. 2001). Les MAO rénales semblent impliquées dans la déamination des monoamines synthétisées dans le rein, telles que la dopamine (Lee 1982), la 5-HT (Stier and Itskovitz 1985) et aussi les amines de source extrarénale telles que la NA et l’adrénaline.
c. Réaction catalysée
Le mécanisme réactionnel des MAO implique la déamination oxydative des amines primaires, secondaires et tertiaires en un aldéhyde correspondant et une amine libre avec la génération de peroxyde d’hydrogène (cf. Figure 15). L’aldéhyde est rapidement métabolisé par l’aldéhyde déhydrogénase en métabolites acides. Ce sont ces métabolites acides 5- HIAA à partir du 5-hydroxytryptamine ou dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC) à partir de la dopamine, qui sont couramment utilisés pour mesurer l’activité MAO in vivo ou in vitro.
Figure 17: Déamination oxydative par les MAO mitochondriales
67 Premième étude
6/ Monoamines oxidases et stress oxydant
L’impact des MAO sur la signalisation cellulaire a longtemps été associé à leur rôle dans la régulation de la concentration en substrat, par exemple dans la maladie de Parkinson, où elles constituent une cible thérapeutique. D’autres travaux ont attribué un rôle aux métabolites (aldéhydes) produits lors de la dégradation de leur substrat, dans la maladie d’Alzheimer par exemple (Burke et al. 2001). Il a récemment été envisagé un autre mode d’action des MAO impliquant la production des EROs lors de la dégradation de leur substrat. Cette production d’EROs et le stress oxydant qui en découle permettent d’associer les MAO à une signalisation pro-apoptotique ou mitogène selon le type cellulaire et la concentration de substrat en présence.
a. Les espèces réactives de l’oxygène
* Définition
Les espèces réactives de l’oxygène sont une famille d’entités chimiques regroupant les dérivés non radicalaires (ne possédant pas d’électron célibataire) et les radicaux libres oxygénés (espèces chimiques possédant un électron célibataire non apparié). On peut distinguer les radicaux primaires, qui ont un rôle physiologique particulier et les radicaux secondaires, issus de la réaction des radicaux primaires avec des entités biochimiques cellulaires (lipides, protéines, glucides…).
68 Premième étude
* Classification
Nom Réaction Définition/ Toxicité Les dérivés primaires non radicalaires Peroxyde * Pas en lui-même un radical libre d’hydrogène (H2O2) mais une molécule ayant tous ses électrons périphériques appariés * Intermédiaire réduit de l’oxygène relativement toxique * La majeure partie de la toxicité du peroxyde d’hydrogène provient de sa capacité à générer le radical hydroxyle en présence de cations
.- .- + 2+ O2 + O2 +2H H2O2 + O2 métalliques tels que Fe (réaction SOD de Fenton) * Moins réactif que certains autres EROs, mais un agent de signalisation efficace de par son effet prolongé par rapport au radical hydroxyle à l’effet éphémère et à la demi-vie courte. * Réagit avec l’anion superoxyde pour fournir l’hydroyxle (réaction de Haber-Weiss).
L’oxygène singulet 1 O2 O2 1 ( O2) + - 1 H2O2 + HOCl H2O + H + Cl + O2
L’acide * Produit par les H O + H+ +Cl- H O + HOCl hypochlorique 2 2 2 myéloperoxydases leucocytaires (HOCl) * Activité bactéricide importante
Le peroxynitrite . .- - NO + O2 ONOO (ONOO-)
69 Premième étude
Les radicaux libres oxygénés
Le radical * Le plus délétère des EROs en hydroxyle (.OH) raison de son extrême réactivité * Formé par la réaction de Fenton, H O + O2- .OH + OH-+ O 2 2 2 la réaction de Haber-Weiss ou
sous l’effet de radiations ionisantes (rayons X ou gamma). * Radical libre qui diffuse peu et réagit quasiment sur le lieu de sa production * Attaque tous les matériaux biologiques (ADN, protéines, lipides…).
L’anion superoxyde * Modérément réactif, mais sa
.- (O2 ) durée de vie est longue et il peut O + e- O .- 2 2 diffuser loin de son lieu de production * Substrat d’enzymes essentielles, + - NADPH + 2O2 NADP + H+ + 202 les superoxydes dismutases (SOD)
NADPH oxydase qui le transforment en H2O2 mais également du cytochrome c et de l’ascorbate.
Le radical * Forme protonée de l’anion perhydroxyle superoxyde (Hool 2006)
(HO2- .)
Le monoxyde * Agent vasodilatateur (Moncada d’azote ou oxyde and Higgs 1993; Cosentino and
nitrique (NO.) L-Arginine + O2 L-Citrulline + NO Luscher 2002) NOS * Peu réactif mais constitue un précurseur pouvant être activé en d’autres espèces plus réactives. Les dérivés secondaires de l’oxygène
Le radical peroxyle * Très réactif avec la plupart des
70 Premième étude
. (RO2 ) molécules * Impliqué dans la propagation de l ‘oxydation des acides gras poly- insaturés des membranes cellulaires.
Le radical alkoxyle (RO.)
Tableau IX : Les différentes espèces réactives de l’oxygène
b. Le stress oxydant
Le stress oxydant correspond à une situation où la cellule ne contrôle plus la présence excessive de radicaux libres toxiques. Les conséquences biologiques du stress oxydant sont très variables selon la dose et le type cellulaire. De faibles stress augmentent l’activation de signaux mitogènes, la prolofération cellulaire (Natarajan et al. 1995; Madamanchi et al. 2001; Moon et al. 2001; Shen et al. 2001) et l’expression de protéines d’adhésion (Rojas et al. 2006). En revanche, des stress moyens faciliteront les dommages à l’ADN, aux mitochondries et l’apoptose (Chen et al. 2009; Circu and Aw 2009; Gong et al. 2009) et des stress importants provoqueront une nécrose (la balance entre nécrose et apoptose variant d’un type cellulaire à l’autre) (Burlacu et al. 2001). Enfin, des stress extrêmes désorganiseront la membrane cellulaire, entraînant des lyses immédiates.
c. Rôle des MAO lié à la production d’EROs
Des travaux récents ont montré un rôle des MAO périphériques dans certaines conditions pathologiques. Par exemple, dans le rein de rat, il a été établi que le peroxyde d’hydrogène libéré par l’oxydation de la dopamine se conduit comme un messager intracellulaire mitogénique via l’activation de ERK (Vindis et al. 2001). Ainsi, il semble que les MAO, en plus de contrôler les niveaux de substrats, régulent les fonctions des cellules du
71 Premième étude tubule proximal rénal via la génération de peroxyde d’hydrogène. Les MAO doivent jouer un rôle dans le contrôle de la croissance cellulaire, les processus de réparation. De plus, les MAO ont été impliquées dans des lésions rénales induites suite à une ischémie reperfusion (Kunduzova et al. 2002), de la même manière que leur rôle dans l’ischémie reperfusion cérébrale (Simonson et al. 1993). Enfin, l’activation des MAO induite par le stress pourrait causer des dommages oxydatifs à la mitochondrie. Il a été montré que les inhibiteurs non spécifiques des MAO utilisés en clinique abolissent les effets oxydatifs néfastes induits par le peroxyde d’hydrogène généré pendant l’oxydation de la tyramine (Hauptmann et al. 1996). Les dérégulations de la balance rédox et les dommages mitochondriaux induits par l’activation des MAO pourraient induire une apoptose neuronale et des lésions du cerveau (Maragos et al. 2004; Ou et al. 2006).
7/ Applications thérapeutiques des monoamines oxydases
a. Les maladies neurodégénératives et psychiatriques
Les inhibiteurs de MAO sont la première classe d’antidépresseurs qui a été développée. Le mécanisme de l’action antidépressive est généralement interprété comme basée sur l’inhibition des MAO et par conséquent l’habilité à s’opposer à la réduction en 5-HT et NE qui caractérise la dépression. Les directives actuelles, pour le traitement de la plupart des maladies dépressives, émises par l’Association de Psychiatrie Américaine et l’Association Britannique pour la Psychopharmacologie, suggèrent que les inhibiteurs de MAO doivent être considérés comme des agents de second choix après les inhibiteurs sélectifs du recaptage de la 5-HT et des agents tricyclique en raison de leurs nombreux effets secondaires. De plus, les inhibiteurs des MAO sont indiqués pour certains désordres de l’anxiété : la phobie sociale, le trouble de panique, le stress post-traumatique et les troubles obsessionnels compulsifs (TOCs) (Jenike et al. 1983). D’autre part, le déprenyl a été initialement testé sur des cas de troubles d’hyperactivité et de déficit d’attention (ADHD) associé avec le syndrome de Tourette. Cette approche a eu un
72 Premième étude grand succès avec une amélioration générale des symptomes de l’ADHD et une amélioration des TOCs (Jankovic 1993; Feigin et al. 1996). En ce qui concerne la maladie de Parkinson, le rationnel d’utiliser des inhibiteurs de la MAO-B se base sur le concept que la DA est préférentiellement désaminée par cette isoenzyme dans le système dopaminergique nigrostriatal humain. Ainsi, l’augmentation des taux de DA due aux inhibiteurs de MAO-B devrait compenser le déficit en ce neurotransmetteur dans le nigrostriatum (Cesura and Pletscher 1992; Knoll 2000). L’augmentation liée à l’âge de l’activité MAO-B, ainsi que les effets protecteurs de ses inhibiteurs sont considérés comme des bases rationnelles pour utiliser les inhibiteurs de la MAO-B dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. Bien que les effets thérapeutiques de ces inhibiteurs dans le cadre de la maladie d’Alzheimer aient été contestés par de récentes analyses (Birks and Flicker 2003), plusieurs expériences pré-cliniques soutiennent le concept selon lequel le blocage des MAO induit une amélioration cognitive. Enfin, aux vues des nombreuses similarités entre la maladie de Parkinson et les autres désordres dégénératifs comme la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington, le deprenyl et la rasagiline ont été testé dans ces deux maladies. Malgré des résultats prometteurs sur des modèles animaux, les résultats cliniques ne sont pas encore encourageants.
Sélectivité Réversibilité Antidepresseur Iproniazide A+B Irréversible Phénelzide A+B Irréversible Isocarboxazide A+B Irréversible Tranylcypromide A+B Irréversible Nialamide A+B Irréversible Clorgyline A Irréversible Moclobémide A Réversible Brofaromide A+B Réversible Pargyline A+B Irreversible En cours de développement Ladostigil A+B (sélectif du cerveau) Irréversible M30 A+B (sélectif du cerveau) Irréversible
73 Premième étude
Befloxatone A Réversible Anti-Parkinsonien Sélégiline (déprényl) B Irréversible Rasagiline (azilect, agilect) B Irréversible Lasabémide B Réversible En cours de développement M30 A+B (sélectif du cerveau) Irréversible Ladostigil A+B (sélectif du cerveau) Irréversible Tableau X: inhibiteurs réversibles et irréversibles des MAO utilisés ou ayant été utilisé en médecine
b. Le diabète
Il a été montré que les MAO, et plus spécifiquement la MAO-B, sont présentes dans les îlots de Langerhans de différentes espèces mammifères telles que le lapin, le hamster doré et le rat (Feldman and Chapman 1975) et dans les cellules β pancréatiques (Adeghate and Donath 1990). Le pancréas exocrine contient également les MAO et plus particulièrement la MAO-A. Les taux sériques de tryptophane sont diminués dans le diabète. L’étude de Luiten et collaborateurs montre que l’activité MAO disparaît dans les îlots dans un modèle de rat diabétique (Luiten et al. 1986). De mêmet, une réduction de 53% de l’activité MAO a été observée dans les îlots des hamsters diabétiques (Quansah et al. 1981). Toutes ces observations soutiennent l’hypothèse que les MAO pourraient jouer un rôle dans le diabète. En effet, les inhibiteurs des MAO de type hydrazine tels que phenelzine, nialamide et aproniazide, potentialisent la libération d’insuline stimulée par le glucose par les îlots pancréatiques de lapin. Enfin, l’augmentation du contenu en adrénaline et noradrénaline dans les tissus pancréatiques doit contribuer à la diminution de la sécrétion d’insuline observée dans le diabète. Puisque le diabète induit expérimentalement est associé à une augmentation de l’adrénaline et de la noradrénaline et une diminution de HIAA, ces substrats et produits des MAO pourraient être utilisés comme marqueurs biochimiques du diabète. Une corrélation a été observée entre l’adrénaline sérique et l’hémoglobine glycosylée (Bilo et al. 1991). Les
74 Premième étude produits de dégradation (ammonium, peroxyde d’hydrogène) de la réaction catalysée par les MAO doivent causer des dommages structuraux dans la cellule bêta pancréatique. Ces perturbations du métabolisme des catécholamines doivent jouer un rôle dans la pathogenèse des complications aiguës et chroniques du diabète.
Ainsi, les MAO de par leur distribution peuvent jouer un rôle dans différentes pathologies. Mais depuis quelques années, ce sont les EROs qu’elles génèrent lors de la dégradation de leur substrat qui suscitent un grand intérêt. En effet, il a été montré que ces EROs jouent un rôle dans la régulation cellulaire ce qui ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques.
75 Premième étude
II/ MATERIEL ET METHODES
A/ APPROCHES IN VITRO
1/ Culture primaire de cellules souches mésenchymateuses
Les cellules sont obtenues à partir de rats mâles de souche consanguine Lewis de 200 à 250 g (Harlan, France). Les fémurs sont prélevés et un lavage du canal médullaire est réalisé avec 10 ml de milieu complet : MEM (Invitrogen, France) additionné de 10% de sérum de veau foetal (SVF, Invitrogen, France) et de 1 % de pénicilline/streptomycine (Invitrogen, France) afin de récupérer les cellules de la moelle osseuse. La suspension cellulaire obtenue est centrifugée (400 g, 5 min) et le culot est repris dans du milieu complet. Les cellules sont ensemencées à 10000 cellules/cm2. Un premier rinçage 3 jours après la culture suffit pour purifier la culture en cellules souches mésenchymateuses (CSMs) par simple adhérence au plastique.
2/ PCR semi-quantitative
Les ARN sont isolés à partir des CSMs en utilisant le kit nucleospin (Macherey Nagel, Allemagne) et les cDNA sont synthétisés à partir de 1µg d’ARN total en utilisant la reverse transcriptase SuperScript II (Invitrogen, France). Les PCR sont réalisées dans 20 µl de tampon de reaction contenant 17 µl de PCR Platinium Mix (Invitrogen, France), 1µg de cDNA et 1µg de primers spécifiques. Les conditions de la PCR ont été les suivantes : 4 min à 94°C suivies par des cycles de 30 sec de dénaturation à 94°C, 30 sec d’hybridation à 60°C et enfin 30 sec d’extension à 72°C. Les produits de PCR ont été confirmés sur un gel d’agarose à 1% et visualisés sous une lampe à UV après marquage par le bromure d’éthidium. Les primers utilisés sont les suivants : SERT : 5’- AGTGCTGTCAGAGTGTAAGGA-3’/ 5’- GCGCCCAGGCTATGATGGTGTT-3’ MAO-A : 5’- ATGACGGATCTGGAGAAGCC-3’ / 5’-TGCCTCACATACCACAGGAAC-3’. MAO-B : 5’- TTAGATAATTTGTGTGGGTTGAGAGAA-3’ / 5’- AAGAAAACAAAAGAACCCAGAAATTATT-3’.
76 Premième étude
3/ Western blot
L’extraction protéique est réalisée par la lyse des cellules dans un tampon (Tris 50 mM,
MgCl2 2,5 mM, EDTA 2 mM, phényl méthyl sulfonyl fluoride 0,1 mM, aprotinine et leupeptine 2 µg/ml). Les protéines (30 ou 50 µg) sont dénaturées (5 min, 95°C) dans du tampon 5X de Laemmli (Tris-HCl 160 mM pH 6,8 ; β-mercaptoéthanol 12,5 % ; bleu de bromophénol 0,0025 %) et séparées par électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide à 12 %. Elles sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose (NEN Life Science Products) par électrotransfert liquide (Transblot SD - Bio-Rad Laboratories, France). La membrane est saturée dans du Tris Buffer Salt - Twenn (TBS-T) 0,1 % avec 1 % de BSA (1 heure, Amersham Biosciences, France), puis hybridée avec l’anticorps primaire souhaité. La membrane est incubée avec l’anticorps secondaire approprié, couplé à la peroxydase (1/10000e, 45min, Tebu, France). Après trois rinçages au TBS-T 0,1 %, la membrane est mise en contact avec le réactif de révélation (Kit ECLTM, Amersham Biosciences, France). Les anticorps primaires utilisés sont : - anti- BCl2 (1: 500; Santa Cruz Biotechnology, USA)
- anti- MAOA (1: 400; Santa Cruz Biotechnology, USA)
- anti- MAOB (1:400; Santa Cruz Biotechnology, USA) - anti-b-FGF (1:500, Santa Cruz Biotechnology, USA) - anti- Actin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA) - anti-ERK2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA)
4/ Dosage de l’activité MAO
Les extraits protéiques (50 µg) sont incubés à 37°C pendant 20 min en présence de 400 µM de [14C] serotonine ou de 200 µM de β[14C] phenylethylamine pour mesurer respectivement les activités MAO-A et MAO-B (Maurel et al. 2003). Pour déterminer les activités non spécifiques, la clorgyline (Sigma, France) et le déprenyl (Sigma, France), inhibiteur de la MAO-A et de la MAO-B respectivement, ont été utilisé (0.1 µM). La réaction est stoppée par l’addition de 100 µl d’HCL 4N à 4°C. Les produits de la réaction sont extrait (avec 92% d’efficacité) avec 1ml d’ethyl acetate/ toluène (v/v), et la radioactivité contenue dans la phase organique est comptée avec un compteur à scintillation.
77 Premième étude
5/ Evaluation de l’apoptose
L’apoptose a été évaluée par un double marquage avec du Syto 13 (1µmol/L, Invitrogen, France) et de l’iodure de propidium (6 µg/mL, Molecular Probes, USA) pendant 15 min à 37°C. Les cellules sont ensuite examinées avec un microscope à fluorescence, les cellules apoptotiques sont caractérisées par une condensation et une fragmentation du noyau.
6/ Dosage de la production de peroxyde d’hydrogène
La production d’H2O2 à été mesurée par chimioluminescence (CL) sur les CSMs (5µg) grattées dans de l’HBSS. Les cellules sont ensuite mises en présence de luminol (30 µM) et de Horse Radish Peroxidase (0.1 U/µl) et la CL est mesurée par un luminomètre contrôlé thermostatiquement (37°C). La génération de la CL induite par la tyramine (30 µM), un substrat commun des MAO, est mesurée continuellement pendant 1H.
B/ ANALYSES STATISTIQUES
Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. Les comparaisons statistiques entre les différentes valeurs sont réalisées en utilisant le test de student pour les comparaisons entre 2 groupes ou une ANOVA suivie d’un test de Tuckey pour les comparaisons de plus de 2 groupes. Une valeur P<0.05 est considérée comme statistiquement différente.
78 Premième étude
III/ RESULTATS
Les résultats et la discussion de ce travail sont reportés dans l’article suivant :
79 Premième étude
PREMIERE ETUDE
PUBLICATION N°1 (Stem Cells and Development, 2010)
CARACTERISATION DES MONOAMINES OXIDASES DANS LES CELULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES : ROLE DANS LA GENERATION DE PEROXYDE D’HYDROGENE ET DANS L’APOPTOSE DEPENDANTE DE LA SEROTONINE
E. Trouche, C. Mias, MH. Seguelas, C. Ordener, D. Cussac and A. Parini
80 Premième étude
Characterization of monoamine oxidases in mesenchymal stem cells: role in hydrogen peroxide generation and serotonin-dependent apoptosis
E. Trouche(1), C. Mias(1), MH. Seguelas(1), C. Ordener(1), D. Cussac(1,2) and A. Parini# (1,2)
(1) INSERM; U858; F-31432 Toulouse, France (2) Université de Toulouse; UPS; Faculté des Sciences Pharmaceutiques; F-31000 Toulouse, France
# corresponding author : Angelo Parini, I2MR, INSERM U858, CHU Rangueil, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Email: angelo.parini@ inserm.fr, Tel: 33-5-61-32-36-01, FAX: 33-5-62-17-25-54
Running title: Monoamine oxidases and serotonin in MSCs
81 Premième étude
LIST OF ABBREVIATIONS
DNA: DeoxyriboNucleic Acid FCS: Fetal Calf Serum HBSS: Hank’s Balanced Salt Sodium HCL: HypoChloric Acid
H2O2: Hydrogen peroxide MAOs: MonoAmine Oxidases MSCs: Mesenchymal Stem Cells MEM: Minimum Essential Medium PCR: Polymerase Chain Reaction RNA: RiboNucleic Acid ROS: Reactive Oxygen Species SERT: Serotonin Transporter 5-HT: Serotonin
82 Premième étude
ABSTRACT
Early death of grafted bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) represents a major limit to their use in cell therapy of solid organs. It is well known that oxidative stress plays a major role in cell death. We have recently shown that the serotonin-degrading enzyme monoamine oxidase A (MAO-A) generates large amount of hydrogen peroxide (H2O2) responsible for cell apoptosis. Hydrogen peroxide generation requires 5-HT internalization into the cell and its degradation by MAO-A. In the present study we investigated whether MAO-A is expressed in MSCs and we defined its role in serotonin-dependent MSCs apoptosis. RT-PCR analysis and Western blots showed that the serotonin transporter (SERT) and the two MAO isoenzymes, A and B, are expressed in MSCs. As shown by enzyme assays using [14C]serotonin or [14C]β-phenylethylamine as selective MAO-A or MAO-B substrates, MAO-A is largely predominant in MSCs. Incubation of MSCs with the MAO substrate tyramine led to a time-dependent generation of H2O2 that was prevented by the MAO inhibitor pargyline. Finally, exposure of the cells to serotonin promoted an increase in MSCs apoptosis prevented by pargyline and the SERT inhibitor imipramine. The pro-apoptotic effect of serotonin was associated to a decrease in the expression of the anti-apoptotic factor Bcl2. In conclusion, these results show for the first time that the 5-HT-degrading enzyme MAO-A is an important source of H2O2 in MSCs and plays a major role in 5-HT-dependent MSCs apoptosis.
83 Premième étude
INTRODUCTION
Mesenchymal stem cells (MSCs) are progenitor cells that can be isolated from different tissues, in particular from bone marrow and adipose tissue [1-3]. Results obtained in our and other laboratories showed that direct injection of MSCs into the tissue is associated to a functional recovery of ischemic kidney [4] and heart [5]. In particular, MSCs protect against both chemical and ischemia reperfusion damage and promote repair process in models of acute renal injury [6,7]. Although intraparenchymal injection allows to concentrate MSCs within the injured organ, its use is limited by the extensive early death of grafted cells [8-10]. Different mechanisms have been involved in this phenomenon including hypoxia, inflammation and oxidative stress [11-13]. The importance of reactive oxygen species (ROS) in death of grafted cells has been supported by studies showing that prevention of oxidative stress through pharmacological approaches [7] or genetic modifications [14] allowed increasing MSCs survival after graft. At present, the intracellular sources of ROS and their involvement in MSCs death have not been clearly identified. Recently, we have shown for the first time that, in different cell types [15-17], the mitochondrial enzyme monoamine oxidases (MAOs) generate large amount of hydrogen peroxide (H2O2). Based on genetic criteria, substrate specificity and inhibition by selective compounds, MAOs have been classified in two isoenzymes, MAO-A and MAO-B [18,19]. Both catalyze the oxidative deamination of biogenic and dietary amines [20] and are primarily involved in the degradation of neurotransmitters within the central nervous system. There are also implicated in the metabolism of biogenic amines in peripheral tissues and vascular cells [20-22]. MAO-A and MAO-B oxidize dopamine, norepinephrine and tyramine whereas serotonin (5-HT) is the preferred substrate for MAO-A and phenylethylamine is the preferred substrate for MAO-B. The control of substrate availability has been considered as the major feature of MAOs in the central nervous system and in the periphery. Our recent studies allowed demonstrating the existence of an additional function of MAO-A. Indeed, we showed that H2O2 produced by MAO-A during 5-HT degradation plays a major role in cardiomyocytes apoptosis in vitro and in vivo [23]. Based on our and other results, it is now accepted that 5-HT may act through two different mechanisms: one, the receptor-dependent, involves stimulation of specific 5-HT receptors; the other, the MAO-A-dependent, requires 5-HT internalization into the cell, its degradation by MAO-A and H2O2 generation.
84 Premième étude
Recent studies demonstrated that MSCs are a target of 5-HT. Indeed, it has been shown that
5-HT, through activation of 5-HT2 receptors, regulate neuroplasticity [24] and proliferation of MSCs [25]. In the present study we investigated whether MAO-A is expressed in MSCs and we defined its role in serotonin-dependent MSCs apoptosis.
85 Premième étude
MATERIALS AND METHODS
Cell culture. Marrow aspirate were obtained from femurs cavity of Lewis rats (Harlan, France) weighting 180-200g. Bone marrow from femurs cavity was flushed with MEM medium (ABCYs, France) containing 10% FCS and 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, USA) and the cell suspension was centrifuged (400 g, 5 min). Then, cells were plated in culture flasks (200000 cell / cm2). Non-adherent cells were removed after 72 hours and MSCs were recovered by their capacity to adhere highly to plastic culture dishes. MSCs were then routinely cultured and were used for the experiments after passage 3. Most adherent cells expressed CD90, CD29, CD106 and were negative for CD34, CD45 and CD31.
RT- PCR. Total RNA was isolated from MSCs, or H9C2 using nucleospin kit (Macherey Nagel, Germany) and cDNA was synthesized from 1µg total RNA using SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, USA). PCR was performed in 20µl reaction buffer containing 17µl PCR Platinium Mix (Invitrogen), 1µg cDNA, 1µg of specific primers. PCR conditions were as follows: 4min at 94°C, followed by cycles of denaturation (30sec, 94°C), 30sec annealing at 60°C, and 30sec extension at 72°C. PCR products were confirmed on a 1% agarose gel and visualized under UV light after ethidium bromide staining. Followed primers (sense / antisense) were used (Eurogentec, Belgium): SERT-F AGTGCTGTCAGAGTGTAAGGA, SERT-R GCGCCCAGGCTATGATGGTGTT; MAOA-R: ATGACGGATCTGGAGAAGCC MAOA-F: TGCCTCACATACCACAGGAAC; MAOB-R: TTAGATAATTTGTGTGGGTTGAGAGAA, MAOB-F: AAGAAAACAAAAGAACCCAGAAATTATT. For mRNA expression of SERT, H9C2 cells have been used as a positive control. The H9C2 cardiomyocyte-like cell line (American Type Culture Collection, Molsheim, France) is a rat embryonic myoblast-derived cell line commonly used as an in vitro model of cardiomyocyte biology that shows similar hypertrophic and apoptotic responses as those seen in primary adult and neonatal cardiomyocytes [26].
86 Premième étude
Apoptosis evaluation. Apoptosis was assessed by double staining cells with Syto 13 (1µmol/L, Molecular Probes) and propidium iodide (6 µg/mL, Molecular Probes) for 15 minutes at 37°C. Cells were then examined with a fluorescent microscope, and apoptotic cells were characterized by condensed, fragmented nuclear regions. A total of 300 cells were counted for each condition.
Western blot. For Western-blot (WB), proteins were extracted from MSCs and prepared from rat brain and liver lysates. WB analyses were performed with samples normalized for protein concentration. Membranes were probed with anti-rabbit Bcl2 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, USA) or anti-rabbit MAO-A (1:400; Santa Cruz Biotechnology, USA) or anti- goat MAO-B (1:400; Santa Cruz Biotechnology, USA) or anti-goat actin (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA) antibodies. Following several washes in Tris-buffered saline-Tween (0.2%), membranes were incubated to anti-rabbit or anti-goat secondary antibody (1:10000; Santa Cruz Biotechnology). Expression of Bcl2 is compared to expression of actin.
H2O2 production assay. As previously reported, the luminol-amplified chemiluminescence assay is a sensitive procedure to measure the specific contributions of MAO-A and MAO-B to H2O2 production [27].
H2O2 production was measured by chemiluminescence assay on MSCs scrapped in HBSS (5 µg) in the presence of luminol (30 µM) and Horse Radish peroxydase (0,1U/µl) by using a thermostatically (37°C) controlled luminometer (Mithras, Berthold, France). The generation of chemiluminescence triggered with tyramine (30 µM), a common MAO substrate, was monitored every 20 seconds during 60 minutes.
Assays of MAO activity. Crude extracts of proteins (50 µg) were incubated at 37°C for 20 min, in the presence of 3.125 to 400 µM of [14C]serotonin or 100 or 200 µM of [14C]β-phenylethylamine to measure MAO-A and MAO-B activities, respectively [28]. To define the non specific activities, the MAO-A inhibitor clorgyline and the MAO-B inhibitor deprenyl were used (0.1µM). The reaction was ended by the addition of 0.1 mL of HCL 4N at 4°C. The reaction product was
87 Premième étude extracted (efficiency 92%) with 1mL of ethyl acetate/toluene (v/v), and the radioactivity contained in the organic phase was counted in a liquid scintillation spectrometer.
Statistical analysis. Results are expressed as mean ± SEM. Statistical comparison of the data was performed using the t-test for comparison between two groups or one-way ANOVA and post hoc Tukey’s test for comparison of more than two groups. A value of P<0.05 was considered significant.
88 Premième étude
RESULTS
Expression of 5-HT transporter and monoamine oxidases in MSCs.
Serotonin transport into the cell and its degradation by MAO-A is necessary for H2O2 generation. RT-PCR performed on mRNA obtained from rat MSCs showed the expression of mRNA encoding for the 5-HT transporter SERT (serotonin transporter), and for the two isoforms of monoamine oxidases (MAOs), MAO-A and MAO-B (Figure 1, panel A and B, respectively). As shown in Figure 1C, Western blot analysis performed on MSCs lysates revealed two proteins with the apparent molecular weight expected for MAO-A and MAO-B (approximately 61 and 60 kDa, respectively). The expression of both MAO-A and MAO-B where confirmed by radioenzyme assay using [14C]5HT and [14C]β-PEA as substrates for MAO-A and MAO-B, respectively (Figure 1D higher panel) and by dose response using [14C]5HT (Figure 1D lower panel). Results indicated that the two isoforms were found into MSCs with a higher expression of the MAO-A.
H2O2 production by MAOs in MSC.
In order to determine whether MAOs are a source of ROS in MSCs, H2O2 production was assessed using a continuous luminol-amplified chemiluminescence assay. We have previously shown that this technique allows the measurement of H2O2 generation by MAOs in intact cells using the MAO-A/MAO-B substrate tyramine [27]. As shown in Figure 2, incubation of MSCs with tyramine (30 µM) led to a time-dependent increase in chemiluminescence. This effect was prevented by pre-incubation of MSCs with the irreversible MAO inhibitor pargyline (5 µM). H2O2 generation was also observed using higher tyramine concentrations (300 µM and 2mM). However, this effect was observed only within 5 minutes after tyramine addition and rapidly declined with time probably because of MSCs death (data not shown).
These results indicate that MAOs are able to produce H2O2 during substrate degradation.
5-HT treatment induced apoptosis of MSC. In these experiments, we investigated whether MAOs are involved in 5-HT-dependent MSCs apoptosis. Cell apoptosis was evaluated by analysis of DNA fragmentation and the measure of cell incorporation of two fluorescence dyes SYTO-13, a permeant DNA intercalating green- colored probe, and propidium iodide, a nonpermeant intercalating orange probe. Apoptotic
89 Premième étude and necrotic cells were discriminated by green (SYTO-13) and orange (propidium iodide) staining, respectively. Cell treatment with increasing concentrations of 5-HT for 24 h induced a significant increase (25 to 40% for 5-HT 10µM) in the number of SYTO-13–stained cells as compared to untreated cells (Figure 3A). In contrast, 5-HT treatment did not increase cell staining by propidium iodide, the marker of necrotic cells. Exposure of MSCs to 5-HT (10 µM) at different times (3, 6, 12 and 24 hours) induced a time dependent increase in apoptosis (Figure 3B). As we and others have demonstrated that 5-HT could induce apoptosis through a receptor- independent pathway, we have decided to clarify the involvement of MAOs in 5-HT-induced apoptosis. MSCs have been pretreated with the pargyline (5µM, 24 hours) before 5-HT treatment and results indicated that inhibition of MAO activity prevented apoptosis (Figure 3C). Furthermore, use of the imipramine (10-7 M), a serotonin uptake inhibitor and SB206553 (0.1 µM, 1 hour), a 5-HT2B antagonist also prevented the pro-apoptotic effect of 5-HT on MSCs. These results show that, in order to induce MSCs apoptosis, 5-HT needs to be internalized into the cells and metabolized by MAO-A and that 5-HT2B receptor could play a role in this mechanism.
Effect of serotonin on Bcl-2 and Bax expression and mitochondrial cytochrome C release in MSCs. Apoptotic processes could be associated to mitochondrial dysfunction involving members on the Bcl-2 protein family such as the anti-apoptotic protein Bcl-2 and the pro-apoptotic protein Bax. Exposure of MSCs to 5-HT (10 µM, 24 hours) promoted an increase in cell apoptosis (Figure 3B) which was associated to a decrease in Bcl-2 expression (Figure 4A). This effect was partially prevented when MSCs were pretreated with pargyline (5 µM, 24 hours). We next examined the effect of serotonin on Bax expression (Figure 4B). Western blot analysis showed that incubation of MSCs with 5-HT did not modify the level of Bax protein. Release of cytochrome C from mitochondria to cytosol is a critical step of the mitochondrial dependent cell apoptosis. As shown in Figure 4C, MSCs treatment with 5HT (10 µM, 24 hours) induced the increase in cytosolic cytochrome C as defined by Western-blotting. Altogether, these results indicate that 5-HT induces MSCs apoptosis through a MAO-A dependent mechanisms. This effect could involve ROS generation concomitant to a
90 Premième étude decrease in the amount of the anti-apoptotic factor Bcl-2 that could contribute to cell apoptosis.
91 Premième étude
DISCUSSION
In the present work we showed the expression of the 5-HT degrading enzyme MAO-A in bone marrow MSCs and its role in H2O2 generation. In addition, we demonstrated that MAO- A is involved in 5-HT-dependent MSC apoptosis. Monoamine oxidase A is widely distributed in the body. Whilst the function of MAO-A has been extensively investigated in the central nervous system, less is known concerning its role in the periphery. As in neuronal cells, MAO-A in the liver [29] and in the lung [30], is involved in the clearance of 5-HT. In other cell types, as cardiomyocytes, we showed that MAO-A also participates to the cell effects of 5-HT [15]. The MAO-A-dependent effects of 5- HT requires 5-HT transport into the cell and its metabolism by MAO-A. Our results show for the first time that this mechanism of action of 5-HT exists in MSCs. Indeed, we showed that two partners necessary for the receptor-independent effects of 5-HT, SERT and MAO-A, are expressed in MSCs. As previously reported for cardiomyocytes, 5-HT induced MSC apoptosis and this effect was prevented by the SERT inhibitor imipramine, by the MAO inhibitor pargyline and more surprisingly by SB 206553. We may explain these very intriguing results by interactions between 5-HT receptors and SERT. Indeed, studies have showed that activation of 5-HT receptors could trigger the phosphorylation of SERT by PKC, PKG or p38. These kinases modulate the SERT membrane expression and, consequently, promote a reduction or an acceleration of the kinetics of 5-HT uptake [31-33]. Furthermore, in platelets, SERT-mediated accumulation of 5-HT results in “transamidation” to small GTPases such as Rho-A and Rho-4 [34]. In this case, 5-HT2A receptors synergizes with SERT. Consistent with these results, we also showed that 5-HT decreased the expression of the antiapoptotic protein Bcl2 through a MAO-A dependent mechanisms. These results show that 5-HT and MAO-A may behave as proapoptotic factors in MSCs. The relevance of 5-HT/MAO-A-mediated apoptosis of MSCs in vivo is supported by different observations. In the periphery, 5-HT is mainly stored in platelet and released by activated platelets. Platelet activation occurs in different pathological situations manageable by cell therapy and characterized by the increase in circulating or local 5-HT. In the heart, several studies showed that 5-HT accumulates during ischemia-reperfusion (I/R), and contributes to the progression of myocardial injury and dysfunction [35-37]. In addition, circulating 5-HT concentrations also increase in chronic diseases such as diabetes [38,39] and atherosclerosis [40,41] and could be elevated because of blood platelets involvement in
92 Premième étude immune-inflammatory processes [42-44]. Based on our results, it is conceivable that the 5-
HT/MAO-A pathway and the consequent H2O2 generation may contribute to the death of MSCs after intraparenchymal injection. Further studies will be necessary to confirm this possibility. The demonstration of the expression of MAO-A and of the apoptotic effects of 5HT in MSCs may exceed the field of cell therapy. Indeed, during the last years, several studies showed that 5HT plays a critical role in proliferation of MSCs [25] and in the function of MSC-derived cells such as osteoblasts [45] and fibroblasts [46]. In addition, recent studies indicate that 5HT also plays an important role in differentiation and survival of bone marrow hematopoietic cells [47]. Recent studies reported that ROS are implicated in the reduction of MSCs numbers and differentiation capacity associated with aging [48,49]. Interestingly, it has been also shown that the tissue MAO-A expression and activity increases with age [50,51].
Therefore, MAO-A appears to be a potential candidate to the increase in H2O2 generation during MSCs aging. Based on these and our results, it is conceivable that 5-HT and MAO may play an important role in the regulation of bone marrow cells in physiological and pathological situations.
In conclusion, we have shown for the first time the expression of the 5-HT-degrading pathway SERT/MAO-A in MSCs and its involvement in 5-HT-dependent MSCs apoptosis. These results open new perspective in the comprehension of the role of MAO-A in the regulation of 5-HT effects in MSCs and its involvement in physiological and pathological processes.
93 Premième étude
Figure 1: Serotonin transporter expression and MAOs expression/ activities in MSCs. A: SERT mRNA expression in mesenchymal stem cells was defined by RT-PCR. H9C2 cells have been used as positive control. MSCs RT- are relative to negative control in which reverse transcriptase Superscript II was omitted. B: MAO-A and MAO-B mRNA expression in mesenchymal stem cells. mRNA from brain is used as positive control. C: Protein expression of MAO-A and MAO-B was determined by Western blot in MSCs lysates. Homogenates of rat liver and brain where used as positive control of MAO-A and MAO-B respectively. D: MAO activities were determined using [14C] 5-HT (400 µM) and [14C]β-PEA (200 μM) as a specific substrates for MAO-A and MAO-B, respectively (upper panel). A dose response for MAO-A activity was realised with [14C] 5-HT (3.125 to 400 μM) in the lower panel. Results are expressed as the difference between total and non-specific activities, the latter being defined in the presence of selective inhibitors clorgyline (10− 7 M) and deprenyl (10− 7 M) for MAO-A and MAO-B, respectively. These experiments have been done on three different MSCs preparation isolated from bone marrow of Lewis rat.
94 Premième étude
Figure 2: MAO-dependent H2O2 production in MSCs lysates. Generation of chemiluminescence was monitored for 60 min after the addition of tyramine (30 µM) to MSCs as described in “Materials and Methods” section. MSCs were preincubated with pargyline (5 µM, 20 min) before tyramine addition. The plot is representative of four separate experiments. *P < 0.05 vs. pargyline-treated MSCs.
95 Premième étude
Figure 3: Time and dose dependent effects of 5-HT on apoptosis. Cell nuclei were double stained with SYTO-13 and propidium iodide, allowing discriminating normal cells from cells undergoing apoptosis or necrosis by fluorescence microscopy. A: Photomicrographs of MSCs treated with increasing concentration of 5-HT (5, 10, 50 or 100 µM) for 24 hours. B: Photomicrographs of MSCs treated with 5-HT (10 µM) for different times (3, 6, 12 and 24 hours). C: Photomicrographs of MSCs pre-treated or not with pargyline (5 µM, 24 hours), imipramine (0,1 µM, 1 hour) or SB206553 (0.1 µM, 1 hour) before addition of 5-HT (10 µM, 24 hours). Lower panels showed the quantification of apoptotic cells illustrated in upper panels. Results are mean±SEM from 3 independent MSCs preparations isolated from bone marrow of Lewis rat. ***P<0.001 vs control, # P<0.05 vs 5-HT (10 µM).
96 Premième étude
Figure 4: Effect of 5-HT on Bcl-2 / Bax expression and cytochrome C release in MSCs. A-B: MSCs were pretreated or not with pargyline (5 µM, 24 hours) before the addition of 5- HT (10 µM, 24 hours). The expression of Bcl-2 (panel A) and Bax (panel B) proteins were determined by Western blot in cell lysates (upper panel). Actin expression was used to confirm equal loading of the extracts. Lower panel showed a quantification of Western blot data. Results are mean±SEM from 3 independent experiments. C: Western blot analysis of the cytochrome C (Cyt C) in mitochondria and the cytosol of MSCs. MAO A and ERK 1/2 were used as markers of mitochondria and cytosol, respectively. *P<0.05 vs control.
97 Premième étude
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102 Deuxième étude
DEUXIEME ETUDE : Stratégie d’optimisation de la thérapie cellulaire à l’aide d’une biomatrice
103 Deuxième étude
I/ INTRODUCTION
L’utilisation de biomatériau est devenue une nouvelle voie de recherches pour la thérapie cellulaire. Elle permet en effet de greffer les cellules encapsulées dans des particules ou ensemencées sur des matériaux support tels que des matrices de collagène ou de fibrine. Les matériaux peuvent être des polymères naturels ou synthétiques. Les caractéristiques physiques, chimiques, biochimiques, biomécaniques et de dégradation des biomatériaux dépendent de leur domaine d’application. Le point le plus important pour que la thérapie soit efficace est la biocompatibilité à long terme du biomatériau. La microencapsulation des cellules peut être un outil important pour améliorer la survie des cellules après la greffe dans le cas de la thérapie cellulaire des organes solides. En effet, elle permet d’éviter l’injection intraparenchymateuse des cellules. Lors de ce type d’injection, les cellules subissent d’importantes contraintes mécaniques au moment du passage dans la seringue puis au travers de la paroi de l’organe. Ces contraintes peuvent en partie expliquer la mort précoce des cellules après la greffe. De plus, une fois injectées les cellules se trouvent en amas et leur apport en oxygène et en nutriments semble plus difficile. Ainsi, microencapsuler les CSMs et déposer ces microparticules à la surface des organes solides semble être une stratégie prometteuse pour préserver la survie des cellules tout en améliorant leur activité paracrine.
Dans cette étude nous avons tout d’abord déterminé la faisabilité d’encapsuler les CSMS dans des microsphères d’alginate et des microcapsules d’alginate poly(Lysine)-alginate (APA). Pour cela, nous avons comparé la morphologie, la résistance mécanique et la stabilité des microparticules. Puis nous avons évalué la viabilité, la fonctionalité et la différenciation des CSMs. Enfin, nous avons vérifié la pertinence de la greffe des microparticules dans les organes solides. Dans ce but, nous avons développé un modèle de greffe sous la capsule rénale de rat. Après la greffe nous avons surveillé la fonction rénale des rats puis lors de l’euthanasie nous avons contrôlé l’intégrité des microparticules sous la capsule rénale et la présence de cellules à l’intérieur de celles-ci. .
104 Deuxième étude
A/ LES HYDROGELS
On distingue principalement deux grandes classes de polymères : les polymères naturels et les polymères synthétiques. Les premiers présentent l’avantage d’être souvent parfaitement bicompatibles, biodégradables et permettent les interactions cellulaires intrinsèques. Cependant, du fait de leur origine, des problèmes de reproductibilité de lots peuvent apparaitre. De plus, ils nécessitent une purification plus approfondie pour se débarrasser des impuretés et des endotoxines qui peuvent transmettre des maladies ou agissent comme des adjuvants en suscitant la réponse immunitaire. Enfin, la panoplie de leurs propriétés mécaniques est limitée. Les polymères synthétiques, eux, ont l’avantage majeur de posséder des propriétés chimiques et mécaniques contrôlables et reproductibles. De plus, ils présentent moins de dangers d’immunogénicité et de transmissions de maladies létales (Saito et al. 2005). Toutefois, la plupart d’entre eux ne se dégradent pas dans les conditions physiologiques et l’utilisation de composés chimiques toxiques dans leur synthèse ou leur transformation exige de nombreuses étapes de purification.
Polymère Caractéristiques principales Polymères naturels Alginate Gélifie rapidement en présence des cations divalents (Ca2+, Ba2+). Se complexe facilement avec des polycations par liaisons électrostatiques pour former une membrane. Peut être dégradé chimiquement par des agents chélateurs non complexés avec un polycation. Agarose Polymère neutre et naturel. Gélifie par une baisse de température (vers 25-30 °C). Forme des gels relativement faibles mécaniquement Collagène Composant majeur de la MEC des tissus Forme des gels thermostatiquement réversibles.; Peut délivrer de nombreux facteurs de croissance (Tabata et al. 2000) Les gels formés ont peu de forces physiques, ils sont immunogéniques et peuvent êtres chers selon leur origine ; Soies Protéines fibreuses composées de séquences répétitives de domaines cristallins et amorphes (Gosline et al. 1999).
105 Deuxième étude
Naturellement produites par les araignées et les autres insectes ; Gélatine Forme dénaturée du collagène, composée de molécules simple brin Biocompatible Forme facilement des gels par changement de température. Souvent utilisée pour la délivrance de protéines (Young et al. 2005). De nombreuses modifications chimiques ont été réalisées pour améliorer les propriétés mécaniques des gels formés (Choi et al. 1999) ; Fibrine Joue un rôle important dans la cicatrisation naturelle et a souvent été utilisée comme adhésif chirurgical (Laurens et al. 2006). Le gel de fibrine est formé par la polymérisation du fibrinogène en présence de thrombine. Les gels de fibrine peuvent être utilisés comme transporteurs autologues de protéines puisqu’ils peuvent être produits à partir du sang du patient. Leur principal inconvénient est leur faible force mécanique ; Acide hyaluronique Composant glycosaminoglycane (GAG) de la MEC dans le corps dégradable par la hyaluronidase. Plus spécialement présent lors de la cicatrisation et dans le liquide synovial des articulations. Peut former des hydrogels par différentes méthodes de réticulations covalentes (Leach and Schmidt 2005). Les propriétés mécaniques des hydrogels formés sont faibles ; Chitosan Préparé par N-déacétylation de la chitine habituellement obtenue à partir de la carapace des crevettes et des crabes. Excellente biocompatibilité et faible toxicité (Lin et al. 2005). Facilement soluble en présence d’acide (pH <5-6) mais généralement insoluble en conditions neutres ; Polymères synthétiques HEMA-MMA Copolymère synthétique. (hydroxyéthyl Non-soluble dans l’eau, ce qui oblige de recourir à l’utilisation des méthacrylate-méthyl solvants organiques cytotoxiques. méthacrylate) Se transforme en gel par la précipitation (l’extraction du solvant).
106 Deuxième étude
Gel très stable dans les fluides aqueux/physiologiques. PEG (polyéthylène Connu pour défavoriser l’adsorption des protéines et l’adhésion glycol) et dérivés cellulaire à la surface des biomatériaux. Se transforme en gel par la photopolymérisation in situ. Poly(ethylene oxide) Bonne biocompatibilité et faible toxicité (PEO) Peut être utilisé pour la délivrance de protéines (Zhao and Harris 1998). Polyacrylamide Peut être synthétisé et réticulé avec des protéines natives, des oligodeoxyribonucléotides ou des protéines bi-spiralées pour former des hydrogels (Obaidat and Park 1996), Poly(vinyl alcool) Physiquement réticulé par gélifications successives de solutions (PVA) aqueuse de polymères (Cascone 1995) ou réticulés chimiquement avec du glutaraldéhyde (Nuttelman et al. 2001), du succinyl chloride, de l’adipoyl chloride et du sebacoyl chloride (Orienti et al. 2002) pour former des hydrogels. Poly(propylene L’homopolymère poly(propylene fumarate) (PPF) est un polyester fumarate-co- hydrophobique linéaire dégradé par hydrolyse de la liaison ester ethylene glycol) Forme des hydrogels quand il est synthétisé comme un bloc de (P(PF-co-EG) copolymère avec PEG et réticulé chimiquement (Suggs et al. 1999) ou après exposition aux UV (He et al. 2000), Utilisé comme transporteur injectable pour l’ingénierie osseuse et des vaisseaux sanguins (Suggs and Mikos 1999). Polymères d’α- Formulé en 3-dimensions avec une grande densité en pores hydroxy esters interconnectés Classiquement utilisé comme transporteur de facteurs osteoinducteurs (Yoneda et al. 2005). Poly(acrylic acid) Perméabilité et l’hydrophilie des gels formés dépendants de l’agent de réticulation Non dégradables dans les conditions physiologiques. Polyphosphazene Organometallite dégradable dans les conditions physiologiques. Deux types d’hydrogels peuvent être synthétisés à partir des polyphosphazenes : les ioniques et les non-ioniques. Polypeptides Synthétisés pour mimer les protéines naturelles
107 Deuxième étude
Préparés en utilisant le N-carboxyanhydride comme monomère de départ et de nombreux polypeptides et copolypeptides Peuvent être synthétisés à partir de différentes combinaisons d’acides aminés. Tableau XI : Polymères se transformant en hydrogels et utilisés pour la microencapsulation de cellules ou de tissus
B/ ARCHITECTURE MACROMOLECULAIRE
La grande majorité des biomatériaux destinés à la thérapie cellulaire sont à base d’hydrogels (Li 1998; Uludag et al. 2000; Agnihotri et al. 2004). Les hydrogels sont des réseaux tridimensionnels composés de chaines polymères très hydrophiles et réticulées. Les hydrogels présentent plusieurs avantages comme matériaux de base pour les biomatrices (Li 1998; Uludag et al. 2000) : - en fonction de leur processus de gélification, certains peuvent former facilement des billes ; - ils sont souvent transparents, ce qui permet la visualisation des cellules à l’intérieur ; - plusieurs hydrogels naturels peuvent être formés dans des conditions « douces » qui n’ont pas d’effet néfaste sur la viabilité cellulaire ; - les propriétés mécaniques plastiques et la souplesse des gels minimisent l’irritation des tissus locaux entourant l’implant ; - leur hydrophilie leur assure une tension interfaciale minimale entre la surface de la biomatrice et les fluides/tissus de l’hôte, ce qui a pour effet d’empêcher l’adsorption des protéines et l’adhésion des cellules ; - ils sont très perméables aux substances de faibles poids moléculaires, tels que les nutriments et les métabolites, ce qui assure leur libre diffusion.
C/ MICROENCAPSULATION
L’encapsulation des cellules est une technique prometteuse pour délivrer des biomolécules au niveau de sites spécifiques notamment au niveau du système nerveux
108 Deuxième étude central. En effet, de nombreuses études ont montré l’intérêt de l’encapsulation dans des modèles de maladie de Parkinson, d’Alzheimer, de Huntington ou de douleur chronique. De plus, elle permet la transplantation de cellules non-humaines, ce qui est un grand avantage si l’on considère les ressources limitées en donneur.
a Le concept d’immunoisolement
Le terme d’immunoisolement défini la protection des cellules ou des tissus transplantés contre le système immunitaire de l’hôte. Cet immunoisolement est médié par une membrane semi-perméable qui empêche les composants du système immunitaire de reconnaître et d’attaquer subséquemment le greffon encapsulé. Pour assurer la survie et le fonctionnement des cellules encapsulées, la membrane doit simultanément assurer la diffusion libre des nutriments et de l’oxygène provenant du sang, des déchets métaboliques et du produit thérapeutique qui sont générés par les cellules encapsulées. Les greffes autologues étant très restrictives pour l’obtention du greffon, l’utilisation de cellules ou tissus allo- ou xénogéniques dans le cadre de la thérapie cellulaire permet d’augmenter considérablement le nombre de donneurs. Cependant, elle nécessite de traiter le receveur avec des immunosuppresseurs. Pour éviter ce traitement, la technique d’encapsulation a été proposée (Lim and Sun 1980) afin de créer un immunoisolement des cellules moins contraignante et plus efficace. En effet, même si elle est efficace pour prévenir le rejet hyper-aigu lors des allogreffes, l’immunosuppression pharmacologique ne parvient pas à éviter le rejet rapide des xénogreffes (Lanza et al. 1991; Rowe 1996). Cependant, les allogreffes d’organes sous traitement immunosuppresseur ont une efficacité restreinte puisque la moitié des transplants échouent dans les cinq ans (Emerich et al. 1992). De plus, pour des maladies telles que Huntington ou Parkinson, la source tissulaire allogène la plus appropriée provient des fœtus ce qui pose de nombreux problèmes éthiques. L’immunoisolement des cellules permet donc d’envisager de nouvelles options thérapeutiques.
109 Deuxième étude
Figure18 : Concept d’immunoisolement (D’après Li, 1998)
b. Biocompatibilité des microparticules
La biocompatibilité des microparticules est également influencée par des imperfections de nature physique. De Vos et collaborateurs ont démontré l’importance de la taille des implants puisqu’en diminuant le diamètre des microcapsules de 800 à 500 µm, ils observent une diminution du nombre d’îlots de Langerhans mal encapsulés (De Vos et al. 1996). La morphologie des microcapsules joue également un rôle pour leur biocompatibilité puisqu’une sphère parfaite, une forme lisse et une membrane sans irrégularité sont requises pour prévenir les réactions indésirables de l’hôte (Lanza et al. 1991). Jusqu’à présent, les microsphères ont été peu étudiées dans le cadre de la thérpie cellulaire. Les chercheurs ont se sont orientés préferentiellement vers les microcapsules en raison de l’immunoisolement qu’elles confèrent. Or, dans le cadre de l’utilisation de CSMs, cellules immunomodulatrices, cet immunoisolement n’est pas neccessaire. Ainsi, la biocompatibilité des microsphères seules reste à éclaircir pour notre étude même s’il est sous-entendu que l’absence de membrane serait favorable.
110 Deuxième étude
D/ ALGINATE
Parmi tous les polymères, l’alginate est encore celui qui est le plus utilisé en thérapie cellulaire en raison notamment de sa non-toxicité, de sa biocompatibilité, de sa dispersion aisée dans l’eau en formant une solution visqueuse, de sa capacité à se transformer en gel très rapidement dans les conditions physiologiques ainsi que sa capacité de se complexer facilement avec d’autres polymères.
1/ Structure
Les alginates sont des polysaccharides obtenus à partir d'une famille d'algues brunes : les laminaires. En plus de leur utilisation pour la production de microparticules, ils sont aussi utilisés dans de nombreux autres domaines : industrie (épaississants, gélifiants, émulsifiants et stabilisants de gelées alimentaires, produits de beauté, peintures et encres d'imprimerie), médecine (prises d'empreintes dentaires), cinéma (reproduction des parties du corps humain). Ils peuvent être purifiés sans perte de leur composition moléculaire. Au cours de ces dernières années, plusieurs techniques de purification d’alginate ont été décrites telles que la filtration, la précipitation et l‘extraction (Klock et al. 1994; De Vos et al. 1997; Bunger et al. 2003). D’un point de vue chimique, (cf. Figure 16) les alginates sont des polysaccharides constitués d’enchaînements linéaires de résidus d’acides β-D- mannuronique (M) et d’acides α-L- guluronique (G) liés en 1-4 selon des proportions et des arrangements variables (Silva et al. 2006). Classiquement, des séquences homopolymériques de résidus D- mannuronique (blocs M-M) et des séquences similaires de résidus guluroniques (blocs G-G) sont séparées par des séquences mixtes (blocs M-G).
111 Deuxième étude
Figure 19. Structure chimique (A) de l’acide mannuronique et de l’acide guluronique ; (B) de l’alginate
L’alginate se gélifie selon le modèle de « la boite à œufs » (cf. Figure 17) dans une solution riche en cations divalents (le plus souvent du Ca2+) (Grant G.T. 1973). Généralement, le sel de cation divalent le plus utilisé pour la gélification homogène de l’alginate est le chlorure de calcium. Il est très soluble dans l’eau et offre une bonne disponibilité des ions calcium. Il a été montré que 90% des ions sodium contenus dans une solution d’alginate de sodium peuvent être facilement déplacés par des ions calciques (Seely and Hart 1974). L’alginate de sodium se transforme alors en alginate de calcium qui gélifie. Les propriétés des microsphères d’alginate dépendent du type d’ions divalent, du rapport acide mannuronique/ acide guluronique, de l’enchainement des blocs (M-M, G-G, M-G), de l’alginate ainsi que de sa masse moléculaire et de sa concentration (Stabler et al. 2001). En effet, l’affinité de l’alginate pour les différents ions est variable. Ils peuvent être classés dans l’ordre décroissant suivant leur affinité : Pb2+=Cd2+> Ba2+ > Ca2+ = Sr2+ >> Mg2+ (Seely and Hart 1974). Haug et collaborateurs ont montré que l’affinité pour l’ion calcium varie avec les types d’alginates (Haug and Larsen 1969). Les alginates riches en acide guluronique ont une affinité supérieure à ceux riches en acide manuronique. Les blocs G-G sont caractérisés par la formation d’une liaison sélective et forte avec les ions calcium (Rokstad et al. 2003). De plus, en 2006, une étude a montré que les ions Ca2+ ont une affinité plus spécifique pour les
112 Deuxième étude blocs G et MG que les ions Ba2+ pour les blocs G et M ou les ions Sr2+ pour les blocs G (Morch et al. 2006).
Figure 20 : Gélification de l’alginate par les ions calcium et le modèle en boite à œufs
Dans notre étude, nous avons choisi de l’alginate type M car c’est celui qui intéragit le plus avec la poly-L-lysine (par la suite nommée polylysine) ce qui permet d’obtenir une membrane rigide et ainsi la formation de capsules.
2/ Biocompatibilité
La réponse de l’hôte contre l’alginate est influencée par les procédures de production (souplesse, stabilité, forme, mode de dégradation) mais aussi par des facteurs de nature chimique et physique. En effet, dans le cas de l’alginate la pureté est un facteur important pour la biocompatibilité puisqu’il contient des composants inflammatoires. Ainsi, plus l’alginate est pur, plus les microcapsules sont stables, lisses et par conséquent biocompatibles (Klock et al. 1994; De Vos et al. 1997; Juste et al. 2005). Des études ont montré que la biocompatibilité de l’alginate dépendait de son contenu en acide α-L- guluronique : plus il est élevé, moins bonne est la biocompatibilité (de Vos et al. 2002). Cependant, la composition de l’alginate comme facteur influençant sa biocompatibilité est à l’heure actuelle encore controversée. En effet, Soon-Shiong et collaborateurs (Soon-Shiong
113 Deuxième étude et al. 1991) observent une croissance trop rapide des cellules dans 90% des microcapsules formulées avec de l’alginate type M alors que Clayton et collaborateurs ont, eux, montré que l’acide guluronique est associé à une fibrose des microcapsules (Clayton et al. 1991). De la même façon, DeVos et collaborateurs ont observé que les microcapsules préparées à partir d’alginate type M ne provoque pas de réponse immunitaire chez l’hôte à long terme après implantation alors que les microcapsules préparées à partir d’alginate type G provoquent une réponse inflammatoire sévère (de Vos et al. 2002).
Enfin, l’alginate est souvent utilisé sous forme de microcapsules APA possédant une membrane semi-perméable de polylysine. Or, récemment des équipes ont mis en évidence que l’adsorption des immunoglobulines sur ces microcapsules ne serait influencée ni par leur composition chimique ni par la pureté de l’alginate utilisé, mais serait principalement dépendante de la présence de la membrane de polylysine (Ponce et al. 2006; Tam et al. 2009). Ainsi, pour obtenir des microcapsules avec une meilleure biocompatibilité d’autres types de polycations ont été étudiés tels que la poly-D-lysine (PDL) ou la ploy-L-orthonine (Brunetti et al. 1991). Cependant, les résultats obtenus sont peu probants c’est pourquoi ils sont peu utilisés.
3/ Les microparticules d‘alginate
Ce terme est employé pour désigner une encapsulation dans des particules de taille allant de 0.3 à 1.5 mm (Uludag et al. 2000). On parle de microsphères lorsqu’il s’agit de microparticules pleines et de microcapsules lorsqu’elles sont constituées d’un cœur et d’une membrane. Quand le coeur est liquéfié on parle de microcapsule creuse. Elles possèdent plusieurs avantages : - leur taille et leur forme sphérique leur confèrent une meilleure résistance, - leur rapport volume/surface est meilleur et permet une meilleure diffusion des molécules à bas poids moléculaire au travers de la membrane. Cependant, au vu de leur petit volume interne et pour améliorer leur efficacité il faut en implanter un grand nombre ou augmenter la concentration en cellules et leur retrait est difficile.
114 Deuxième étude
Après gélification des gouttelettes d’alginate dans une solution de calcium, les gouttelettes d’alginate sont transformées en billes rigides par gélification dans une solution riche en cations divalents (le plus souvent du Ca2+). Ce sont les microsphères. Après la gélation, une membrane est formée autour des billes en suspendant celles-ci dans une solution de poly(L-lysine) (PLL). On obtient ainsi des microcapsules. Pendant cette étape, la PLL se lie aux séquences G des molécules d’alginate synthétisant ainsi une membrane de polyélectrolytes. En faisant varier la masse moléculaire, la concentration de PLL et le temps de contact avec l’alginate on peut moduler la porosité de la membrane de la capsule. Mais le type, la concentration de l’alginate utilisé et la température d’incubation ont aussi une influence. Ensuite, les microcapsules sont suspendues dans une solution d’alginate ou d’autres molécules chargées négativement pour lier les résidus PLL chargés positivement encore présents à la surface de la capsule. Cette étape a pour but d’améliorer la stabilité et la biocompatibilité de la capsule. L’étape finale consiste à liquéfier le cœur (alginate-calcium) de la microcapsule par l’ajout d’un séquestrant du calcium tel que le citrate de sodium, l’ethylene glycol-bis(β-aminolethyl ether) ou l’acide N,N,N’-tetraacetique (Goosen et al. 1985; Fritschy et al. 1991). A cette étape sont produites les microcapsules APA avec un cœur liquide. Cette étape permettrait d’améliorer la croissance des cellules encapsulées (Lim and Sun 1980; Darrabie et al. 2001).
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Figure 21 : Les différentes modalités de préparation de microparticules avec de l’alginate
115 Deuxième étude
II/ MATERIEL ET METHODES
A/ APPROCHES IN VITRO
1/ Culture primaire de cellules souches mésenchymateuses
Les CSMs ont été préparées par le mêm technique que celle décrite dans la première étude (cf. p 78).
2/ Microencapsulation des CSMs
Les CSMs, au 3ème passage, sont décollées avec la trypsine, comptées et centrifugées. Les microsphères et les microcapsules sont produites selon la méthode de Goosen et collaborateurs avec des modifications (Goosen et al. 1985) en conditions stériles. En bref, une solution d’alginate de sodium à 1.4 % (w/v) est préparée en diluant l’alginate dans du NaCL 150mM, le pH est tamponné à 7.4 avec de l’HEPES 12.5 Mm. Les cellules sont suspendues dans cette solution d’alginate de sodium à 4x106 ou 2x106 cellules/ml d’alginate. Les microsphères d’alginate homogènes sont produites par extrusion à travers un encapsulateur Inotech IE-50R équipé d’une buse vibrante de 300 µm. La suspension alginate-cellules est ensuite placée dans une solution de 1% CaCl2, 2H2O, 0.4% NaCl, 12.5 mM HEPES, pH 7.4 continuellement agitée. Les microsphères sont gélifiées pendant 20 min puis rincées avec de l’HEPES et soit transférées dans du milieu de culture (cas des microsphères d’alginate), soit revêtues d’une membrane par incubation dans du PLL 0.1 % w/v dans 150 mM NaCl, 12.5 mM HEPES, pH 7.4 sous agitation. Dans ce cas, une couche extérieure d’alginate est ensuite appliquée par 10 min d’incubation dans une solution diluée d’alginate (0.1 % w/v) sous agitation (cas des microcapsules d’APA). Enfin, les microcapsules sont traitées avec du citrate de sodium à 55 mM pour liquéfier le cœur d’alginate puis lavées avec un tampon salin. Les études ont été réalisées sur les deux types de microparticules : microsphères et microcapsules.
116 Deuxième étude
Figure 22 : Schéma de l’encapsulateur IE-50R (Inotech)
Légende : 1/ Seringue et suspension cellulaire……….11/ Générateur électrique 2/ Oscilloscope………………………………..12/ Stroboscope 3/ Embout seringue...... 14/ Bécher réactionnel 4/ Générateur électro-magnétique…………...15/ Enceinte de récupération des microcapsules 5/ Buse vibrante…………………………………M/ Agitateur 6/ Anneau chargé……………………………….S/ Pousse seringue 8/ Panier récupérateur des déchets
117 Deuxième étude
3/ Morphologie et stabilité des particules au cours du temps
La taille et la morphologie des microparticules sont examinées régulièrement au microscope optique. La stabilité des particules vides a été étudiée pendant 35 jours à 37°C dans du PBS par des observations visuelles et au microscope optique. L’intégrité des microparticules a également été évaluée. Quand les membranes commencent à se rompre leur forme change : elles ne sont plus sphériques mais aplaties et ridées puisque leur contenu est libéré dans le milieu.
4/ Microscopie électronique à balayage (MEB)
L’analyse en MEB de la surface et de la section transversale des microparticules vides et sèches a été réalisée avec un microscope électronique à balayage (Leo 435 VP). Les échantillons de microparticules sont montés sur un porte échantillon en aluminium avec de l’adhésif puis métallisés avec de l’argent. Les spécimens sont observés à 10 kV d’accélération.
5/ Résistance mécanique
La résistance mécanique des microparticules à été évaluée sur les microsphères ou les microcapsules obtenues avec une aiguille de 0.8 mm selon le même protocole. A intervalles définis, les microparticules ont été soumises à des tests de compression standard dans un texturomètre TA-XT2 (Stable Microsystems, Grande Bretagne). En bref, la résistance mécanique des microparticules est déterminée comme la force necessaire (g) requise pour compresser les microparticules à 30 %. L’appareillage consiste en une sonde mobile se déplaçant verticalement, de haut en bas à vitesse constante et prédéfinie (0.5 mm/s). La force exercée par la sonde sur les microparticules est enregistrée comme fonction de déplacement permettant ainsi de tracer la courbe. Les résultats sont exprimés comme la moyenne de la force maximale en grammes pour au moins 5 observations différentes. L’intégrité des microparticules après le test a été vérifiée par observation microscopique.
118 Deuxième étude
6/ Test de la viabilité cellulaire
La viabilité des CSMs encapsulées à été réalisée en utilisant le kit LIVE/DEADR Viability/Cytotoxicity (FluoProbes, France) pendant le mois suivant leur fabrication. Rapidement, les microparticules sont rincées deux fois avec du PBS et du MEM (v/v). Les microparticules sont ensuite incubées pendant 30 min avec une solution contenant 2 µM d’hodimère-3 d’éthidium et 1 µM de calcéine AM. Les microparticules sont ensuite rincées dans du PBS et observées au microscope confocal (Leica Microsystems, Allemagne). La viabilité cellulaire est déterminée à partir des images obtenues au microscope confocal après le marquage, les noyaux morts apparaissent rouges et les cytoplasmes vivants sont verts. Certaines CSMs présentent des transformations apoptotiques ainsi leur noyau est de couleur jaune orange ce qui révèle une co-localisation de la fluorescence dans les spectres verts et rouges. La viabilité cellulaire est estimée par le ratio des pixels verts sur le nombre total de pixels.
7/ Différenciation des CSMs encapsulées en chondrocytes
Les microcapsules sont cultivées dans des plaques 6 puits. Après 2 jours, le milieu de culture est remplacé par le milieu chondrogénique contenant 1% de sérum de veau fœtal (Invitrogen, USA), 50µg/ml d’ascorbate-2-phosphate, 40µg/ml de proline (Sigma, France), 3mM de pyruvate (Sigma, France), d’ITS+ (BD Biosciences, Grande Bretagne), 100mM de dexamethasone, 10ng/ml de transforming growth factor-β3 recombinat (TGF-β3, R&D Systems, USA) et 200ng/ml bone morphogenic protein-2 recombinant (R&D Systems , USA). Le milieu est changé 3 fois par semaine. Au bout de 21 jours, l’alginate est dissous avec du citrate (50mM) et les cellules sont ensemencées sur des lamelles.
8/ Western blot
Les western blot sont réalisés comme décrit dans la première étude (cf. p79). Les anticorps primaires utilisés sont : - anti-b-FGF (1:500, Santa Cruz Biotechnology, USA)
119 Deuxième étude
- anti-ERK2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA)
9/ Immunocytochimie
Les cellules sont fixées au PFA 4% (10 min, température ambiante) puis incubées avec le bleu alcian (1%, 30 min) ou saturées dans du TBS-T / 1% lait (1 heure). Elles sont ensuite mises à incuber avec l’anticorps primaire : anti-PS100 couplé à la peroxydase (HRP, 1/200e, 1h). Un anticorps secondaire de souris (1/600e, 20 min, Santa Cruz Biotechnology, USA). Une contre coloration des noyaux à l’hematoxiline est ensuite réalisée (1/2, 1 min).
B/ APPROCHES IN VIVO
1/ Modèle animal pour la transplantation des microcapsules
Des rats Lewis (Harlan, France) pesant de 180 à 200 g ont été utilisés comme receveurs allogéniques des CSMs microencapsulées dans de l’alginate. Pour la transplantation, les rats sont anesthésiés par inhalation d’isoflurane / oxygène (3/97). Dix microcapsules ont été transplantées sous la capsule rénale. Pour cela on procède à une incision de la capsule puis les microcapsules sont déposées à l’aide d’un cathéter. Les animaux sham sont soumis à la même procédure chirurgicale mais sans transplantation. Les reins sont ensuite collectés 8 ou 25 jours après la transplantation.
120 Deuxième étude
Capsule rénale Microcapsules
Cathéte r
Figure 23 : Transplantation de microcapsules sous la capsule rénale de rats
2/ Évaluation de la fonction rénale : dosage de l’urée et de la créatinine plasmatiques
Le sang prélevé 48 heures ou 2 mois après la greffe est centrifugé (10860 g, 10 min) et le plasma est récupéré afin de réaliser les dosages de l’urée et de la créatinine plasmatiques (analyseur biochimique MIRA).
3/ Imunohistochimie
Les reins, prélevés 8 ou 25 jours après la greffe, sont inclus dans la paraffine et des coupes histologiques sont réalisées (6 µm). Les coupes sont déparaffinées (3 bains de toluène, 5 min), puis réhydratées par 3 bains successifs d’éthanol (100°, 95° et 50°, 5 min) et un bain d’eau (5 min). Les lames sont ensuite digérées à la trypsine puis mises à incuber avec l’anticorps souhaité. Trois rinçages dans du TBS-T (1X) sont effectués (5 min). Avant le montage, les coupes sont déshydratées par 3 bains successifs d’éthanol 50°, 95° et 100°, 5 min) suivis de 2 bains de toluène (5 min).
121 Deuxième étude
L’anticorps primaire utilisé est l’anti-mouse PS100 dilué au 1:200 (Abcys, USA) Les tissus sont marqués avec une solution d’hématoxyline/éosine, une solution de rouge Sirius (marquage du collagène), une solution de rouge Alizarin (marquage du dépôt de calcium) ou une solution de bleu Alcian (marquage de l’accumulation de matrice extracellulaire).
C/ ANALYSES STATISTIQUES
Les résultats sont exprimés en moyenne +/- SEM. Les comparaisons statistiques entre les différentes valeurs sont réalisées en utilisant le test de student pour les comparaisons entre 2 groupes ou une ANOVA suivie d’un test de Tuckey pour les comparaisons de plus de 2 groupes. Une valeur P<0.05 est considérée comme statistiquement différente.
122 Deuxième étude
III/ RESULTATS
Les résultats et la discussion de ce travail sont reportés dans l’article suivant « Evaluation of alginate microspheres for mesenchymal stem cells engrafment on solid organ » actuellement soumis à Cell Transplantation.
123 Deuxième étude
DEUXIEME ETUDE
PUBLICATION N°2 (Cell Transplantation, en révision)
EVALUATION DES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ENCAPSULEES DANS DES MICROSPHERES D’ALGINATE POUR LA GREFFE DANS LES ORGANES SOLIDES
E. Trouche, S. Girod, C. Mias, F. Tortosa, MH. Seguelas, Ceccaldi C., D. Calise, A. Parini,
D. Cussac and B. Sallerin
124 Deuxième étude
Evaluation of alginate microspheres for mesenchymal stem cells engraftment on solid organ. E. Trouche(1), S. Girod(2,3), C. Mias(1), F. Tortosa(1,2), C. Ceccaldi(1), MH. Seguelas(1), D. Calise(1), A. Parini(1,2), D. Cussac (1,2)$ and B. Sallerin$# (1,2)
(1) INSERM; U858; F-31432 Toulouse, France (2) Université Toulouse; UPS; Faculté des Sciences Pharmaceutiques; F-31062 Toulouse, France (3) CIRIMAT, UPS-INPT-CNRS 5085, F-31062, Toulouse, France $ DC and BS contributed equally to this work
# corresponding author : Brigitte Sallerin , I2MR, INSERM U858, CHU Rangueil, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Email: sallerin@ cict.fr, Tel: 33-5-65-25-68-43, FAX: 33-5- 65-25-98-16
Running head: Mesenchymal stem cells in alginate microspheres
125 Deuxième étude
ABSTRACT Mesenchymal stem cells (MSCs) may be used as a cell source for cell therapy of solid organ due to their differentiation potential and paracrine effect. Nevertheless, optimisation of MSCs based therapy needs to develop alternative strategies to improve cell administration and efficiency. One option is the use of alginate microencapsulation which presents an excellent biocompatibility and an in vivo stability mainly as alginate-poly (L-lysine)-alginate microcapsule (APA). As MSCs are hypoimmunogenic, it was conceivable to produce microparticles with (APA microcapsules) or without (alginate microspheres) a surrounding protective membrane. Therefore, the aim of this study was to determine the most suitable microparticles to encapsulate MSCs for engraftment on solid organ. First, we compared the two types of microparticles with 4 x 106 MSCs/ ml of alginate. Results showed that each microparticle has distinct morphology and mechanical resistance but both remained stable over time. However, as MSCs exhibited a better viability in microspheres than in microcapsules, the study was pursued with microspheres. We demonstrated that viable MSCs were still able to produce the paracrine factor b-FGF and did not present any chondrogenic or osteogenic differentiation, processes sometimes reported with the use of polymers. We then proved that microspheres could be implanted under the renal capsule without degradation with time or inducing impairment of renal function. In conclusion, these microspheres behave as an implantable scaffold whose biological and functional properties could be adapted to fit with clinical applications.
Key words: Mesenchymal stem cells, alginate, microspheres
126 Deuxième étude
INTRODUCTION
Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent stem cells derived from bone marrow stroma. They have the ability to form a variety of mesenchymal tissues including bone, fat, cartilage and non-mesenchymal tissues like neuron, kidney and heart (9,11,22,31,47). Recent studies have shown that most of the therapeutical effects of MSCs are related to the secretion of paracrine factors (13,40). These findings supported the idea that direct intraparenchymal injection would allow to concentrate the paracrine factors produced by MSCs within the injured organ. Systemic administration is easy but there is little quantity of cells reaching the organ. However, the intraparenchymal administration is characterized by the early death of grafted cells (18,24,33,39,41) and in the case of their survival they potentially differentiate in unsuitable phenotypes. A way to protect MSCs and take advantage of their paracrine properties could be their inclusion in biomatrix. This could 1) prevent the mechanical stress, 2) diminish the negative influence of the injured environment on grafted cells, 3) easily manipulate and deliver the cells near the organ and 4) better follow the phenotype of the grafted cells. This goal may be achieved through the microencapsulation of MSCs in biomatrices and administration of this scaffold. The design of the microparticles has to be optimized for permeability, stability and biocompatibility and easiness of injection and integration. The advantage of natural polymers in comparison to synthetic polymers is that they induce less cytotoxicity or inflammatory reactions (16). Alginate is the most commonly employed polymer for cell encapsulation because of its excellent biocompatibility and an in vivo stability (3,35,45). Alginate is a polysaccharide isolated from brown algae found in costal waters around the globe (15). It is a linear copolymer composed of β-D-mannuronic acid and α-L-guluronic acid that can be easily transformed into a gel by binding the guluronic acids with a divalent cation such as calcium (36). As alginate is composed of two different acids, according to the percentage of each other, its gel structure varies and could affect cell survival. Classically, cells are encapsulated in microcapsules with a semipermeable membrane, generally polylysine (PLL), which allows nonautologous cells to be implanted into the host animal. This membrane protect the cell from immune mediators and allows the release of beneficial factor from the microcapsule. Previous results from our laboratory have shown that adrenal medullary bovine chromaffin cells could be encapsulated in microcapsules of alginate-poly-L-lysine (APA) with a liquefied inner core (23). This procedure was associated to an increase in the viability of functional cells. The immune rejection of
127 Deuxième étude
MSCs is less frequent as these cells are poor immunogenic (1,4,12,42). Thus, we hypothesized that microspheres could also be suitable for MSCs encapsulation. However, little is known concerning viability and functionality of MSCs in microspheres. In addition, the use of alginate microspheres graft for cell therapy of solids organs has still not extensively been investigated. Indeed, microspheres present a different mechanical behavior than microcapsules consequently complications could impact the implantation procedure. Thus, we designed a strategy based on the encapsulation of MSCs in alginate microspheres or microcapsules in order to determine which one was the most appropriated for cell therapy. We first evaluated the stability and mechanical parameters of microparticles. Then, we tested MSC viability and functionality in microparticles. We also determined the effect of alginate on MSCs differentiation. Finally, we studied the feasibility of grafting alginate-encapsulated MSCs under the rat renal capsule.
128 Deuxième étude
MATERIALS AND METHODS
Cell culture. Marrow aspirate were obtained from femurs cavity of Lewis rats (Harlan, France) weighting 180-200g. Bone marrow from femurs cavity was flushed with MEM medium (ABCYs, France) containing 10% FCS and 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen, USA) and the cell suspension was centrifuged (400 g, 5 min). Then, cells were plated in culture flasks (200000 cell / cm2). Non-adherent cells were removed after 72 hours and MSCs were recovered by their capacity to adhere highly to plastic culture dishes. MSCs were then routinely cultured and were used for the experiments.
MSCs encapsulation. Rat MSCs, (passage 3), were lifted with trypsin, counted and centrifugated. Microspheres and microcapsules were produced by the method of Goosen et al., with modifications (6) under sterile conditions. We used sterile ultrapur sodium alginate with 54 % β-D-mannuronic acid (type M alginate) with an apparent viscosity of 141 mPas.s (Pronova, SLM 100, Novamatrix, Norway). Briefly, a 1.4% w/v sodium alginate solution was prepared by dispersing alginate in NaCl 150 mM, buffered to pH 7.4 with 12.5 mM HEPES. Cells were resuspended in this sodium alginate solution at a density of 2.5 x 106 or 4 x 106 cells/ml alginate. Homogeneous alginate microspheres were produced by extruding through an encapsulator (Inotech IE-50R, Switzerland), equipped with a 300 µm vibrating nozzle, the alginate-cell suspension into a solution of 1% CaCl2, 2H2O, 0.4% NaCl, 12.5 mM HEPES, pH 7.4 which was continuously swirled. Microspheres were gelled for at least 20 minutes, then rinced with HEPES buffer and either transfered into culture medium (case of alginate microspheres) or coated by incubating in 0.1% w/v PLL, 150 mM NaCl, 12.5 mM HEPES, pH 7.4 under gentle agitation. In the latter case, an outer alginate layer was subsequently applied by 10 minutes incubation in a dilute (0.1% w/v) alginate solution in saline buffer under gentle agitation (case of APA microcapsules). Finally, microcapsules were treated with 55 mM sodium citrate to liquefy the inner alginate core, and washed extensively with saline buffer. Both types of microparticles: microspheres and microcapsules were studied.
Microspheres and microcapsules were incubated in culture medium at 37°C in 5% CO2 and 95% humidity. At specified days post-encapsulation, they were collected and further
129 Deuxième étude analyzed. In order to characterize their morphology and properties, control microparticles (without cells) were also prepared according to the same protocol.
Particles morphology and stability over time. Microparticles size and morphology were routinely examined with a light microscope. The stability of control microparticles was studied for 35 days at 37°C in saline buffer both visually and by light microscopic observation. In the case of microcapsules, their integrity was assessed.
Scanning electron microscopy (SEM). SEM analysis of the surface and cross-section of dried controls microparticles was performed with a scanning electron microscope (Leo 435 VP). The microparticle samples were mounted on an aluminum sample mount and sputter coated with silver. The specimens were observed at a 10 kV accelerating voltage.
Mechanical resistance. The mechanical resistance of the microparticles was evaluated on microspheres or microcapsules obtained with a 0.8 mm needle according to the same protocol. At defined time intervals, the microparticles were submitted to a standardized compression test in a TA- XT2 texture analyzer (Stable Microsystems, UK). Briefly, the compression resistance of the microparticles was determined as the main force (g) required to generate a 30% compression of a sample of microparticles. The apparatus consisted of a mobile probe moving vertically, up and down at constant and pre-defined velocity (0.5 mm/s). The force exerted by the probe on the microparticles was recorded as a function of the displacement, leading to a force versus strain curve. The results are expressed as the average maximal mechanical force in grams from at least 5 independent observations. The integrity of the microparticles after the test was assessed by microscopic observation.
Cell viability assay. The viability of encapsulated cells was assessed using a LIVE/DEADR Viability/Cytotoxicity kit (FluoProbes, France) for 35 days following microencapsulation. Briefly, microparticles were rinsed twice with phosphate buffered saline and MEM (v/v). Microparticles were then incubated for 30 min with a solution containing 2 µM ethidium homodimer-3 and 1 µM calcein
130 Deuxième étude
AM. Microparticles were then rinsed with phosphate buffered saline and observed using a confocal microscope (Leica Microsystems, Germany). Cell viability was determined from confocal images as previously described (21). After staining, cells appear with red nuclei and lived cells with green cytoplasm. Some population of MSC exhibited apoptotic transformation so their nuclei looked yellow-orange, revealing the colocalization of fluorescence in green and red spectral regions. The cell viability was estimated by the ratio of green pixels to the total number of lightened pixels.
Western-blot. For Western-blot (WB), MSCs were extracted of microspheres thought an incubation with citrate (50 µM) and centrifugation. Then MSCs proteins were extracted from pelleted MSCs. WB analyses were performed with samples normalized for protein concentration. Membranes were probed with anti-b-FGF (1:500; Santa Cruz Biotechnology, USA) or anti- ERK2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA) antibodies. Following severals washes in Tris-buffered saline-Tween (0.2%), membranes were incubated to horseradish peroxidase- conjugated anti-rabbit secondary antibody (1:10000; Santa Cruz Biotechnology). Expression of b-FGF is related to the expression of ERK2.
Chondrogenic phenotype of encapsulated MSCs. Mesenchymal stem cells encapsulated in microspheres where cultured in high-glucose Dubelcco’s modified Eagle’s medium (ABCYs, France) with 1% fetal bovine serum (Invitrogen, USA), antibiotics, modified or not with ascorbate-2-phosphate(50µg/ml, Sigma, France), proline (40µg/ml, Sigma), pyruvate (3mM, Sigma), ITS+ (1X, BD Biosciences, USA), dexamethasone (100mM, Sigma), transforming growth factor-β3 (10ng/ml, TGF-β3, R&D Systems, USA) and recombinant bone morphogenic protein-2 (200ng/ml, R&D Systems). Medium was replaced twice weekly. On day 21, 31, 51, 57, 61, MSCs were harvested from microspheres after incubation with citrate (50 µM). Cells were then centrifugated, resuspended with cultured medium and then were seeded on slices to perform immunocytology.
131 Deuxième étude
Immunocytology. For in vitro differentiation, cells where stained with Alizarin Red or Alcian Blue coloration using standard methods. For chondrocytes detection, cells were incubated (1hour, RT) with an anti-PS100 rabbit antibody (1:200, ABCYs, France).
Animals transplantation and histology. Experimental animals were handled in accordance with the European animal care guidelines. Four Lewis rats (Harlan, France) weighting 180-200g were used for allogenic recipients of MSC-alginate. For transplantation, rats were anesthetized with isoflurane/oxygen inhalation (3/97). A total of 18 microspheres containing 4 x 106 MSCs were transplanted under the renal capsule. Sham-operated animals were subjected to the same surgical procedure without transplantation. Kidney sections were collected 25 days after MSC injection. After euthanasia, kidneys were collected, fixed in paraformaldehyde (4%), dehydrated and then embedded in paraffin. Paraffin sections (10 µm) were stained with hematoxylin/eosin.
Statistical analysis. Results are expressed as mean ± SEM. Statistical comparison of the data was performed using the t-test for comparison between two groups or one-way ANOVA and post hoc Tukey’s test for comparison of more than two groups. A value of P<0.05 was considered significant.
132 Deuxième étude
RESULTS
Morphology and stability of the alginate microparticles. Morphology and stability of two types of microparticles, microspheres and microcapsules, were examinated using optical and electron microscopy. Under optical microscopy, all cell- loaded microparticles had a uniform and spherical morphology as shown in Figure 1 (panels A and B). Concerning microcapsules (Figure 1B), a smooth refringent ring, corresponding to the continuous transparent alginate-PLL membrane, could be observed. All of these microparticles present an average diameter between 500 and 710 µm with alginate microspheres slightly bigger than microcapsules. The examination showed that MSCs appeared evenly distributed throughout the microparticles which remained stable in saline buffer and in culture media over the study. In order to demonstrate that the microcapsules had a liquefied core, intact microparticles were dried and then observed by electron microscopy (Figure 1, panels C and D). In these conditions, microcapsules appeared no longer spherical, as they would appear if they had a solid core, but flattened with a highly wrinkled surface (Figure 1 panel D). Because they became fragile upon drying, some of them were broken, clearly showing that initial capsules were hollow and only constituted of a membrane surrounding a liquefied core.
Mechanical resistance. In order to complete the study of microparticles morphology and stability, we have determined their mechanical resistance. The resistance and durability of the microparticles were studied by submitting them to a standardized mechanical stress. Figure 1 (panel E) shows the evolution of the maximal mechanical force (g) required to compress the beads of 30% of their height with time. This test of resistance to compression was chosen to evaluate the microparticles mechanical resistance, as it has been demonstrated to be more sensitive to small variations than a simple rupture test (26). In all cases, until day 35 post- encapsulation, resistance to compression of microparticles remained stable. As expected, forces required to compress microspheres are higher than microcapsules, although the latter exhibited a more elastic behaviour. These results show that mechanical resistance of the two types of microparticles was unchanged with time (until day 35). In contrast, their mechanical behavior appeared quite different and could play a role in microparticle behavior post implantation.
133 Deuxième étude
In vitro viability of encapsulated MSCs. In order to evaluate the effect of the different microparticles on the viability of MSCs, microspheres and microcapsules have been followed for 35 days post-encapsulation after loading with 4 x 106 MSCs / ml of alginate . Microparticles were stained with ethidium homodimer-3 and calcein followed by 3D reconstitutions performed using confocal microscopy. The viability of MSCs has been quantified by automatic cell counting. This quantification shows that viability of MSCs was poorly affected in microspheres (Figure 2, panels A and D, green cytoplasm) until day 35 (85. 6 +/- 4.8%) whereas it significantly decreased (64, 6 +/- 3.4%, 49, 3 +/- 4.9 % on day 5 and 35 respectively) in microcapsules (Figure 2, panels B and D). These results led us to select microspheres rather than microcapsules for the next steps of our study.
In vitro functionality of encapsulated MSCs in microspheres. Several studies have shown that MSCs are able to secrete number of cytokines that may explain their beneficial effects. Among these factors, we and others have shown that b-FGF mediates part of the paracrine effects of MSCs. We have examined the production of b-FGF in microencapsulated MSCs 7 days post-encapsulation (Figure 3). Results showed that b- FGF remains detectable in microencapsulated MSCs and the amount of protein was not significantly different from that of non-encapsulated MSCs. These results indicated that, as showed for cultured MSCs, viable microencapsulated MSCs are able to produce b-FGF.
In vitro differentiation of microencapsulated MSCs. Some studies have investigated the possible differentiation of matrix encapsulated-MSCs into mesodermal lineages and more particularly into the chondrogenic and osteogenic phenotypes. We have compared the degree of chondrogenic differentiation of MSCs harvested from microspheres (4x 106 million MSCs/ ml alginate) to MSCs growth in chondroinductive medium. Results showed that in all conditions, MSCs extracted from microspheres at 21, 31, 51, 56 and 61 days after encapsulation and replaced in culture were negative for Alcian blue staining (Figure 4, panel A) nor labeled for PS100 (Figure 4, panel B). Furthermore, 56 days after encapsulation and growth into standard medium, MSCs extracted from microspheres were also negative for Alizarin red (Figure 4, panel C), a marker of osteogenic differentiation.
134 Deuxième étude
Implantation of microencapsulated MSC in rats. As we have observed that microspheres are less elastic than microcapsules, we have evaluated the feasibility of manipulating and implanting microspheres at the surface of solid organ without degradation. Therefore, we have developed a model based on a deposition of microspheres under the renal capsule (Figure 5, panel A). Optical observations showed that microspheres are still intact and did not migrate out of the renal capsule 25 days after graft (Figure 5, panel B). Analysis of histological preparations stained with hematoxilin/eosine coloration showed detectable MSCs in microspheres 25 days after graft (Figure 5, panel C, dark arrow). No evidence of malignant invasion or inflammation was found in any of the specimens but we observed an accumulation of cells around microspheres with histological characteristics of a scar formation. This phenomenon is in agreement with others results (17). In order to evaluate the effect of the graft on renal function, we have compared plasma urea and creatinin of grafted and sham rats (Figure 5, panel D). Results indicated that no significant differences could be observed between the two groups until day 25 post graft. Altogether, these results indicate that microspheres may be manipulated and grafted onto a solid organ, for a long period, without any significant degradation or impairment of the renal function.
135 Deuxième étude
DISCUSSION Microencapsulation of cells could be a promising strategy to improve cell survival after graft on solid organ. Indeed, it allows avoiding intraparenchymal injection of cells protecting them from mechanical stress, oxidative and inflammatory environment. Various polymers have been tested for microencapsulation such as alginate, agarose, fibrin or collagen (8). We have chosen type M alginate as De Vos et al. observed that microcapsules prepared with purified M alginate remained free of any significant foreign body response for prolonged periods of time after implantation (3) while microcapsules prepared with high-G alginate were consistently associated with low recovery rates and extensive overgrowth of inflammatory cells. Another parameter that could be modulated is the type of microparticle used. In this study, we have investigated both microcapsules and microspheres in order to define the most suitable for MSCs encapsulation before graft. Our results showed that they presented differences in their morphologies and their mechanical resistance but both remained stable over time. Moreover, our results indicated that microspheres were associated with a higher survival rate of MSCs when compared to microcapsules. The higher survival of MSCs in microspheres could be explained by their need of adherence as they are immobilized in the alginate matrix while they are in suspension in microcapsules. Furthermore, Tam et al have showed that the extent of immunoglobulin adsorption on alginate microcapsules was highly dependent on the presence of the polylysine membrane, indicating that positive charges of the polycation are mainly responsible for the binding of immunoglobulin (30,38). Since IgG, IgM and IgA are known to be opsonizing proteins that lead to complement activation upon their adsorption to foreign surfaces, we decided to proceed with alginate microspheres. Altogether these results present an interest for future clinical approaches as microspheres are easier to obtain than microcapsules and would consequently facilitate patient’s graft. The fact that encapsulated MSCs are still functional in these microspheres is important because beneficial effects of MSCs are mainly due to their paracrine activity (46). The last unknown data remained their ability to be grafted on solid organs. In a recent study, RGD-alginate microspheres were grafted in bone (7) but nothing is known about their graft at the surface of solid organ like heart or kidney. Another study has shown that intramyocardial injection of microcapsules could be done (44,48) but we have preferred avoiding intraparenchymal graft and the consecutive mechanical stress imposed to cells. So, we developed a protocol based on the graft of microspheres under the renal capsule (32). This site has been chosen as we have previously shown that MSCs administration could have beneficial effects on kidney
136 Deuxième étude recovery, in a model of renal ischemia-reperfusion, through a paracrine activity (20). Furthermore, this site of graft has already been validated for the transplantation of encapsulated pig islets with a better biocompatibility than for the intraperitoneal route (5). Our in vivo approach shows that it is possible to graft microspheres and to follow them during several weeks without any microspheres degradation and impact on renal function. The small and uniform microspheres tested offer many advantages when compared to intraparenchymal injection or bigger scaffolds: a higher degree of biocompatibility, a reduced total implant volume, a better diffusion of cellular paracrine secretion, an improved cell oxygenation, a potential access to different implantation site (27,28) and a concentration of the grafted cells in a dedicated zone. Moreover, it would be possible to retrieve microspheres after graft or to use biodegradable polymers to release cells if they have to engraft into the organ. Recent studies demonstrated that variations of cell density in various scaffold may influence chondrogenic differentiation of MSCs (10,37). According with this observation, we have verified whether cell density has an impact on MSCs viability, functionality and differentiation in alginate microspheres. In a first step, we produced alginate microspheres with 2.5 x 106 or 4 x 106 MSCs/ ml of alginate (Figure 6). Results showed no differences in viability and in differentiation between the two cell densities. Nevertheless, b-FGF production was increased in higher concentrated microspheres. These results led us to choose higher concentrated microspheres for our study. Encapsulating MSCs in alginate microspheres would be a promising approach to improve cell survival after their graft in a solid organ. However, concerning the heart, it could be difficult to implant microspheres. Recent studies have proposed to use patches to repair infarcted cardiac tissue (2,14,25,29,34,43). In our laboratory, we have already showed that intramyocardial graft of pharmacologically modified MSCs improves cardiac function (19). To further enhance MSCs viability after graft and consequently MSCs efficiency it could be interesting to combine the easiness of engineering highly biocompatible alginate scaffolds with beneficial effects of MSCs.
137 Deuxième étude
Figure 1: Characterization of alginate microparticles. A-B: Microspheres (A) and microcapsules (B) size and morphology examined with a light microscope (objective x 2 and x 10 respectively). C-D: Scanning electron microscopy of microspheres (C) and microcapsules (D, bars 100 µm). E: Measurement of the mechanical force needed to compress the beads of 30% of their height with time.
138 Deuxième étude
Figure 2: In vitro viability of MSCs in alginate microparticles. A-B: Resulting confocal image of encapsulated MSCs in microspheres (A) and in microcapsules (B) after 2 µM ethidium homodimer-3 (red fluorescence) and 1 µM calcein (green fluorescence) labeling (bars 50 µm). C: Representative correlation plot for images presented in panels A and B. Pixels were counted to evaluate cell viability in gate 3. D: Quantitative analysis of confocal images. ***P < 0.001 vs. microspheres.
139 Deuxième étude
Figure 3: Production of cytokines by MSCs in alginate microspheres. In vitro expression of b-FGF by the MSCs entrapped in microspheres. The same quantity of protein was loaded and the histogram shows the ratio of b-FGF/ERK2.
140 Deuxième étude
Figure 4: In vitro differentiation of MSCs in microspheres. Immnunocytochemistry on MSCs extracted from microspheres and replaced in culture. A: Alcian blue staining at day 21, 31, 51, 61. B: PS100 immunostaining at the same days. C: Alizarin red staining at day 56 post encapsulation. (bars 50 µm).
141 Deuxième étude
Figure 5: In vivo implantation of microspheres. A: Injection of MSCs microspheres (white arrow) under the renal capsule. B: Localization of MSCs-microspheres (white arrow) under the renal capsules 25 days after graft (A and B, bars 5 mm). C: Hematoxylin/eosin staining of renal histological sections showing microsphere (MSCs, arrow) 25 days after graft (bars 100 µm). D: Plasmatic urea and creatinin concentrations in rats grafted with microparticles.
142 Deuxième étude
Figure 6: Effects of cell density on MSCs behavior in microspheres. Microspheres were produced with a density of 2.5 x 106 MSCs/ml. A: Evaluation of MSCs viability in microspheres. B: In vitro expression of b-FGF by the MSCs entrapped in microspheres. C: Alcian blue staining and PS100 immunostaining at day 21, 31, 51, 61 post encapsulation (bars 50 µm).
143 Deuxième étude
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148 Deuxième étude
IV/ CONCLUSION
Dans cette deuxième étude, nous avons montré que les CSMs peuvent être encapsulées dans des microsphères d’alginate et que ces microsphères peuvent ensuite être greffées in vivo dans des organes solides. Nos résultats montrent que par rapport aux microcapsules, les microsphères présentent des différences de morphologie et de propriétés mécaniques mais que leur résistance au cours du temps est identique. D’autre part, nous avons démontré que la viabilité des CSMs était meilleure dans les microsphères que dans les microcapsules. Ces résultats combinés à la faible immunogénicité des CSMs nous ont permis de valider ce modèle. Nous avons ensuite étudié la fonctionnalité des CSMs dans les microsphères. De nombreuses études ont montré que les CSMs ont une activité paracrine importante et qu’elles sécrètent notamment le b-FGF. Nos résultats montrent que les CSMs encapsulées produisent autant de b-FGF que les cellules non encapsulées. D’autre part, comme les CSMs sont connues pour se différentier en chondrocytes ou en ostéocytes lorsqu’elles sont condensées nous avons donc contrôlé si la culture des CSMs dans les microsphères n’influençait pas leur différenciation. Lles marquages réalisés au cours de l’étude ont prouvé qu’il n’y avait pas de différenciation des CSMs en chondrocytes ni en ostéocytes. Enfin, nous avons testé la faisabilité de greffer les microsphères sous la capsule rénale de rat. Un mois après la greffe, les microsphères sont retrouvées intactes sur leur site de greffe et la fonction rénale des rats n’est pas altérée par la greffe. En conclusion, dans cette deuxième étude, nous avons validé l’encapsulation des CSMs dans les microsphères tout en permettant de maintenir les CSMs fonctionnelles et indifférenciées. De plus la greffe de ces microsphères dans un organe solide, le rein, est sure. La microencapsulation des CSMs dans les microsphères pourrait donc permettre d’optimiser la greffe dans le cadre de la thérapie cellulaire des organes solides.
149 Conclusion générale
CONCLUSION GENERALE
150 Conclusion générale
Notre travail a consisté à étudier i) si les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) étaient capables d’internaliser et de dégrader la sérotonine, ii) l’effet de différentes concentrations en 5-HT sur la survie des CSMs, iii) la faisabilité d’encapsuler les CSMs dans des microparticules d’alginate, iv) la fonctionnalité et la différenciation des CSMs dans ces microsphères et v) la possibilité de greffer ces microsphères contenant les CSMs dans les organes solides.
Plusieurs équipes ont développé des stratégies permettant d’améliorer la survie des cellules souches greffées dans le parenchyme d’organes solides. Le plus souvent, il s’agit d’approches de thérapie génique combinées à la thérapie cellulaire. Mais une autre stratégie pour améliorer la survie cellulaire après la greffe pourrait être de protéger les cellules de l’environnement tissulaire, en les protégeant des augmentations de certains facteurs (la 5- HT par exemple) qui peuvent apparaitre dans diverses pathologies. Plusieurs études ont montré que la 5-HT pouvait influencer le comportement des CSMs (neuroplasticité, prolifération) via ses récepteurs et plus particulièrement via le récepteur 5-HT2. Mais ces études n’ont pas exploré l’effet non récepteur dépendant de la 5-HT dans les CSMs. Or, celles-ci possèdent le transporteur de la 5-HT et la monoamine oxydase A ce qui démontre qu’elles sont capables d’internaliser la 5-HT et de la dégrader. La dégradation de la 5-HT par la MAO-A génère du peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui peut exercer des effets délétères sur les cellules. Nos résultats montrent pour la première fois que la voie de dégradation de la 5-HT SERT/MAO-A est exprimée dans les CSMs.
Un des effets que l’H2O2 peut exercer sur les cellules est l’induction de l’apoptose. Bien qu’il est été démontré que suivant la concentration utilisée, la 5-HT pouvait avoir des effets différents (prolifération ou apoptose) sur les cardiomyocytes, les effets de différentes concentrations en 5-HT sur les CSMs ont été peu étudiés. Un traitement avec de fortes concentrations en 5-HT induit une diminution du marquage par le Syto 13 et une augmentation de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl2. Ces effets de la 5-HT étant reversés par la pargyline, un inhibiteur des MAO et par l’imipramine, un inhibiteur de SERT. Ces résultats montrent que la voie de dégradation de la 5-HT SERT/MAO-A est impliquée dans l’apoptose des CSMs induite par la 5-HT.
151 Conclusion générale
Une autre stratégie pour améliorer la survie cellulaire se développe depuis quelques années, c’est la microencapsulation des cellules. La plupart des études portent sur des microcapsules à membrane semi-perméable fournissant un immunoisolement aux cellules. Cependant, cette membrane pose des problèmes de biocompatibilité puisque le polymère utilisé pour sa fabrication peut être impliqué dans des phénomènes de rejet. Comme les CSMs sont peu immunogènes, on peut se contenter de les encapsuler dans des microsphères ce qui permet de simplifier le protocole de fabrication. Ces microsphères les protègeront des contraintes mécaniques lors de la greffe et les concentreront pour amplifier leur effet paracrine. Mais nous avons du déterminer si ces microsphères étaient adaptées aux CSMs car leur utilisation est encore peu étudiée. Ainsi, malgré des différences morphologiques et de propriété mécaniques, les microsphères et les microcapsules restent stables au cours du temps. En revanche, les CSMs présentent une meilleure survie dans les microsphères que dans les microcapsules. Ces résultats montrent que l’encapsulation des CSMs dans les microsphères est plus efficace que leur encapsulation dans les microcapsules pour notre application.
En plus d’améliorer la survie cellulaire, la microencapsulation des CSMs a pour but de potentialiser leur activité paracrine en les concentrant au site de la greffe. En effet, de nombreux travaux indiquent que les CSMs sécrètent un large panel de cytokines telles que VEGF, HGF, b-FGF et l’angiopoétine. Dans notre étude, nous avons montré que l’encapsulation des CSMS dans les microsphères ne modifiait pas leur production de b-FGF en comparaison avec les CSMs non encapsulées. De plus, des études ont montré que la configuration des cellules à l’intérieur des microparticules pouvait influencer leur différenciation en lignage chondrocytaire. Nos résultats ne montrent aucune différenciation des CSMS en chondrocytes dans les microsphères au cours de l’étude. Les CSMs sont donc viables, fonctionnelles et ne se différencient pas dans les microsphères d’alginate testées.
La dernière incertitude vis-à-vis des microsphères était la possibilité de les greffer sur les organes solides car jusqu’à maintenant elles ont été greffées essentiellement au niveau de l’os. Les contraintes mécaniques étant différentes pour les organes solides, il fallait s’assurer que les microsphères ne se dégraderaient pas au cours du temps. Nos résultats montrent que les microsphères contenant les CSMs peuvent être facilement greffées sous la capsule
152 Conclusion générale rénale de rat, que cette greffe n’a pas d’impact sur leur fonction rénale, qu’elle n’induit pas de réponse immune chez le receveur et que les microsphères sont retrouvées intactes un mois après la greffe. Ainsi, la greffe de microsphères dans les organes solides est faisable et sure pour le receveur. En conclusion, ces travaux ont permis de démontrer que deux stratégies peuvent être envisagées afin d’améliorer la survie des cellules au moment de leur greffe. Elles visent la régulation des interactions cellules greffées/environnement cellulaire en se plaçant soit après la greffe soit au moment précis de la greffe. On peut vouloir interférer avec les modifications biochimiques qui ont lieu dans l’organe lésé et qui sont délétères pour les cellules comme l’augmentation des taux de 5-HT. Mais on peut également encapsuler les cellules pour les protéger des contraintes mécaniques subies lors de la greffe tout en maintenant leur activité paracrine.
Des travaux de l’équipe ont montré que les CSMs peuvent moduler le phénotype des fibroblastes cardiaques ainsi que leur habilité à dégrader la matrice extracellulaire (Mias et al. 2009). D’autre part, des études ont proposé l’utilisation de patchs pour implanter les cellules au niveau du cœur (Wei et al. 2007). En effet, le cœur est plus difficile d’accès que le rein et même si des équipes ont pu greffer des microcapsules en intramyocardique, notre système de dépôt semble mal adapté à cet organe. Nos travaux ayant montré que les CSMs survivent bien et restent fonctionnelles dans des implants d’alginate, nous avons décidé de développer des patchs d’alginate ensemencés avec les CSMs et transplantés dans le cœur.
153 Conclusion générale
Schéma récapitulatif
Cellules souches mésenchymateuses (CSMS) Mort précoce dans les 48H
Effet de l’environnement tissulaire sur les Protéger les CSMS de
5-HT en conditions pathologiques Microsphères d’alginate
Apoptose Survie Activité paracrine Greffe
Amélioration survie après greffe Potentialisation thérapie cellulaire
154 Annexe – Autres publications
Annexe - Autres publications
155 Annexe – Autres publications
TROISIEME ETUDE
PUBLICATION N°3
LE PRÉTRAITEMENT EX-VIVO PAR LA MÉLATONINE AMÉLIORE LA SURVIE, L’ACTIVITÉ PRO-ANGIOGÉNIQUE/MITOGÉNIQUE ET L’EFFICACITE GLOBALE DES CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES INJECTÉES DANS LE REIN ISCHÉMIÉ.
Mias C, Trouche E, Seguelas MH, Calcagno F, Dignat-George F, Sabatier F, Piercecchi- Marti MD, Daniel L, Bianchi P, Calise D, Bourin P, Parini A and Cussac D.
156 Annexe – Autres publications
157 Annexe – Autres publications
158 Annexe – Autres publications
159 Annexe – Autres publications
160 Annexe – Autres publications
161 Annexe – Autres publications
162 Annexe – Autres publications
163 Annexe – Autres publications
164 Annexe – Autres publications
165 Annexe – Autres publications
QUATRIEME ETUDE
PUBLICATION N°4
LES CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES FAVORISENT LA SECRETION DE METALLOPROTEINASES PAR LES FIBROBLASTES CARDIAQUES ET REDUISENT LA FIBROSE VENTRICULAIRE APRES UN INFARCTUS DU MYOCARDE
Mias C, Lairez O, Trouche E, Roncalli J, Calise D, Seguelas MH, Ordener C, Piercecchi- Marti MD, Auge N, Salvayre AN, Bourin P, Parini A, Cussac D.
166 Annexe – Autres publications
167 Annexe – Autres publications
168 Annexe – Autres publications
169 Annexe – Autres publications
170 Annexe – Autres publications
171 Annexe – Autres publications
172 Annexe – Autres publications
173 Annexe – Autres publications
174 Annexe – Autres publications
175 Annexe – Autres publications
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