CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA CAMPUS GUANAJUATO

Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp ., identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris

T E S I S QUE PRESENTA M.C. Norma Alejandra Mancilla Margalli

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Irapuato, Guanajuato, México, 2006

Este trabajo titulado Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp ., identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris fue realizado en el Laboratorio de Química de Productos Naturales del Departamento de Biotecnología y Bioquímica del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Campus Guanajuato, bajo la asesoría de la Dra. Mercedes G. López.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mercedes G. López, por su asesoría, por e y especialmente por su inmensurable apoyo (científico, moral y económico). Oportuno que dirigió el

A los sinodales Dr. Luis E. González de la Vara, Dr. John Paul Délano F, Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa y Dr. Edgar Quero Gutiérrez, por sus valiosas aportaciones que enriquecieron el presente trabajo.

Al CONACyT, por apostarle a la ciencia y ayudar económicamente a estudiantes que desean un México competitivo.

A todo el personal del Cinvestav-Guanajuato, al área administrativa (Dora Elia Anguiano), de intendencia (Daniel y Bertha) y de biblioteca (Mary Carmen Ruíz) por su trato amable y su trabajo siempre oportuno y eficiente.

Al Prof. Sjef Smeekens, de la Universidad de Utrecht, Holanda, por brindarme amablemente la oportunidad de explorar en su laboratorio un campo científico nuevo para mí.

A Tita Ritsema por sus finas atenciones y la paciencia con la que compartió y dirigió parte de este trabajo.

Al Gobierno de los Países Bajos por el otorgamiento de la Beca Huygens que me permitió realizar una estancia doctoral en la Universidad de Utrecht.

Al CONACyT por el otorgamiento de una beca mixta, que sin lugar a dudas, fue de bastante provecho para la calidad de la presente investigación.

A la Dra. Petra Mischnick de la Universidad Técnica de Braunschweig, Alemania, por su apoyo y asesoría en la química de carbohidratos.

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A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa del Instituto Potosino de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, por la oportunidad de hacer mil intentos en su laboratorio.

A mis amigos del laboratorio: Lulú Macías, Blanca Aguilar, María Luisa Martínez, Tere Carrillo, Isadora Jiménez, Octavio Carrillo, Claudia y Judith Urias, por su apoyo y entusiasmo contagiante.

A Tita Ritsema, Auke Verhaar, Fatima Rahmani, Anja van Dijken, Marcel Proveniers, Jolanda Schuurmas, Anika Wiese, Henriette Schluepmann y Bas Dekkers, por su hospitalidad, por mostrarme las maravillas de su país y por hacerme sentir como en casa en un lugar con una cultura diferente

A mis cubanos Lázaro Hernández, Yanetsi Borroto, Yanet Tambara, José Angel y Rolando, porque su hermandad y cariño me han servido de soporte.

A mis amigos de siempre Lorena, Jimmy, Isis, Pedro y Lulú, por su longeva amistad.

A mis papás, José Trinidad y Norma Ofelia, por su gran cariño y apoyo incondicional.

A mis hermanos, Popo, Pity, Betito y Kiko, por toda la vida recorrida.

A mi esposo, Juan, por todo su amor y por los momentos compartidos.

A mis abuelitos, tíos y primos.

A la pequeña Ana y Caellou, por llenar de alegría nuestras vidas.

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ÍNDICE

Página I. RESUMEN 1 II. INTRODUCCIÓN 2 III. OBJETIVOS 5 IV. ANTECEDENTES AGAVES Y DASYLIRION 1.1. Clasificación taxonómica 6 1.1.1. Agavaceae 7 1.1.2. Nolinaceae 8 1.2. Distribución 10 1.3. Descripción de los géneros y características delimitantes de las familias Agavaceae y Nolinaceae 13 1.3.1. Agave 14 1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul 15 1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth 15 1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini 16 1.3.1.4. Agave cantala 16 1.3.1.5. Agave fourcroydes 16 1.3.2. Dasylirion 17 1.4. Importancia económica y científica 1.4.1. Usos tradicionales 18 1.4.2. Usos ornamentales 18 1.4.3. Obtención de fibras naturales 18 1.4.4. Obtención y caracterización de fitoquímicos 19 1.4.5. Elaboración de bebidas alcohólicas 19 1.4.5.1. Bebidas fermentadas 20 1.4.5.2. Bebidas destiladas 20 1.4.6. Elaboración de edulcorantes fructosados 22 1.4.7. Utilización del bagazo 22 1.4.8. Propagación in vitro 24 1.5. Influencia de la zona geográfica en los agaves 25 1.6. Adaptación de los agaves 29 1.6.1. Adaptación morfológica 30 1.6.1. 1. Hojas 30 1.6.1.2. Raíces 31 1.6.1.3. Tallo 33 1.6.2. Adaptación fisiológica 33 1.6.2.1. Metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) 33 1.6.2.2. Bioquímica del metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) 34 1.6.2.3. Acumulación de fructanos 39 FRUCTANOS 2.1. Estructura 40 2.1.1. Métodos analíticos 43 2.1.2. Especificidad estructural 44 2.2. Metabolismo 45

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2.2.1. Complejidad metabólica 50 2.2.2. Caracterización bioquímica 50 2.2.3. Caracterización molecular 55 2.2.4. Familia GH32 57 2.3. Fisiología de los fructanos 60 2.3.1. Carbohidratos de reserva 60 2.3.2. Desarrollo vegetal 60 2.3.3. Defoliación 62 2.3.4. Descarga apoplástica 64 2.3.5. Ajuste osmótico 64 2.3.6. Tolerancia al frío 64 2.3.7. Tolerancia a sequía 67 2.3.8. Defensa contra patógenos 69 2.4. Potencial biotecnológico de los fructanos 71 V. JUSTIFICACIÓN 73 VI. HIPÓTESIS 73 VII. MATERIALES Y MÉTODOS 74

A) Material Biológico 1. Regiones 74 2. Edad 74 3. Muestreo 74 B) Metodología 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Determinación espectrofotométrica 1.1.1. Extracción de carbohidratos totales 77 1.1.2. Determinación de carbohidratos totales 77 1.1.3. Determinación de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 77 1.1.4. Determinación de fructanos 79 1.1.5. Determinación de almidón 81 1.2. Extracción de fructanos 82 1.3. Caracterización de fructanos 1.3.1. Cromatografía en capa fina 82 1.3.2. Cromatografía líquida de alta resolución 83 1.3.3. Derivatización de fructanos a alditol acetatos parcialmente metilados 84 1.4. Caracterización de fructanos de Agave tequilana 88 1.4.1. Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 88 1.4.2. Resonancia magnética nuclear de carbono 13 88 1.4.3. Resonancia magnética nuclear de protón 89 2. Identificación de actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de fructanos 2.1. Extracción de proteínas 89 2.2. Estrategias de purificación 89 2.2.1. Cromatografía de afinidad 90 2.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico 90

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2.2.3. Cromatografía de hidroxiapatita 91 2.2.4. Cromatografía de exclusión en gel 91 2.3. Cuantificación de proteínas 92 2.4. Ensayos enzimáticos 92 2.5. Separación electroforética 92 3. Identificación y aislamiento de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Aislamiento e identificación de secuencias codificantes 3.1.1. Extracción de ácido ribonucleico (ARN) 93 3.1.2. Geles de agarosa 94 3.1.3. Electroforesis en “microchip” 94 3.2. Obtención de secuencias complementarias por transcripción reversa 95 3.2.1. Diseño de oligonucleótidos iniciadores 95 3.2.2. Amplificación de secuencias complementarias 95 3.2.3. Elución y purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN) a partir de bandas de agarosa 97 3.2.4. Preparación de células competentes 97 3.2.5. Clonación y transformación 99 3.2.6. Purificación de plásmidos 99 3.2.7. Confirmación de la secuencia en el plásmido 101 3.2.8. Identificación de las secuencias 101 3.3. Aislamiento de ADNc completo de la secuencia 101 3.3.1. Amplificación rápida del extremo 5´ del ADN complementario (5´-RACE) 102 3.3.2. Amplificación rápida del extremo 3´ del ADN complementario (3´-RACE) 104 3.3.3. Ligación y clonación del ADNc completo 104 3.4. Expresión en Pichia pastoris 104 3.4.1. Eliminación del péptido señal y secuencia de terminación 106 3.4.2. Propagación del vector 106 3.4.3. Transformación de Pichia pastoris y análisis de expresión 107 VIII. RESULTADOS 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Patrón de carbohidratos no estructurales 108 1.2. Factores ontogénicos 109 1.3. Influencia del ambiente en el patrón de carbohidratos no estructurales 110 1.4. Función de los fructanos en la sequía 113 1.5. Presencia de almidón 114 1.6. Perfil cromatográfico de fructanos 1.6.1. Cromatografía en capa fina 116 1.6.2. Cromatografía líquida de alta resolución 118 1.7. Análisis de enlaces por derivatización 121 1.7.1. Cuantificación de los glicosil-derivados 126 1.7.2. Significancia de la diversidad estructural de fructanos 129 1.8. Caracterización de fructanos de A. tequilana 130 1.8.1. Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 130 1.8.2. Resonancia magnética nuclear de carbono 13 130

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1.8.3. Resonancia magnética nuclear de protón 135 1.9. Estructuras propuestas para fructanos en Agave y Dasylirion 138 1.10. Posibles implicaciones de la presencia de fructanos en agaves y dasylirion 139 2. Identificación de actividades metabólicas involucradas en el metabolismo de fructanos de agave y dasylirion 2.1. Estrategia Cromatográfica I 141 2.1.1. Cromatografía de afinidad 141 2.1.2. Cromatografía de intercambio aniónico 143 2.1.3. Cromatografía de hidroxiapatita 145 2.1.4. Cromatografía de exclusión en gel 148 2.1.5. Identificación putativa de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos 149 2.2. Estrategia Cromatográfica II 151 2.2.1. Extracto crudo 151 2.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico 155 2.2.3. Cromatografía de afinidad 160 2.2.4. Actividades fructosiltransferasas identificadas en agaves y dasylirion 161 3. Aislamiento e identificación de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Extracción de ácido ribonucleico 163 3.2. Amplificación de fragmentos de ácido desoxiribonucleico complementario (ADNc) a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 163 3.3. Identidad de los fragmentos amplificados 165 3.4. Amplificación del ADNc completo de la fructosiltransferasa de Agave tequilana ( atft ) 3.4.1. Amplificación de los extremos terminales 3´ y 5´ 172 3.4.2. Determinación de la orientación de los insertos en el vector 174 3.4.3. Ligación del ADNc completo de atft 176 3.5. Análisis de la secuencia atft 178 3.5.1. Uso de codones del ADNc de atft 180 3.5.2. Identificación de la proteína madura 180 3.5.3. Glicosilhidrolasa 32 186 3.6. Expresión heteróloga de atft 188 3.6.1. Construcción del vector pGAPZ αC-atft 188 3.6.2. Análisis de expresión 189 3.6.3. Identidad de la AtFT 192 IX. CONCLUSIONES 195 X. PERSPECTIVAS 196 XI. APÉNDICES A.- Preparación de soluciones 198 B.- Análisis de fragmentación de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA) 200 C.- Desplazamientos químicos de 13 C-fructanos 207 D.- Secuencias aisladas 212 XII. REFERENCIAS 217

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ÍNDICE DE FIGURAS

Página Figura 1. Mayahuel 6 Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion 8 Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae 11 Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae 12 Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel 23 Figura 6. Influencia de factores abióticos en la asimilación de CO 2 en A. lechuguilla 26 Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilación de CO 2 en A. tequilana 27 Figura 8. Áreas óptimas, subóptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 28 Figura 9. Cambios en la velocidad de respiración durante sequía en raíces de lluvia y establecidas en A. deserti 32 Figura 10. Diferencia de temperatura entre el área foliar (de maíz o agave) y el aire circundante 33 Figura 11. Metabolismo ácido de las crassulaceas 35 Figura 12 . Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM 38 Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos 42 Figura 14. Rango de grados de polimerización (DP) en especies que acumulan fructanos 45 Figura 15. Diferentes vías biosintéticas de fructanos en plantas superiores 48 Figura 16. Regulación de la actividad de fructosiltransferasas 54 Figura 17. Alineamiento de proteínas pertenecientes a las familias GH32 y G68 57 Figura 18. Mecanismos catalíticos de las glicosilhidrolasas 59 Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores 61 Figura 20. Efecto de la defoliación en el metabolismo de fructanos 63 Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrés por frío 66 Figura 22. Fructanos en estrés por sequía 68 Figura 23. Modelo propuesto de la participación de fructanos en la resistencia a patógenos 70 Figura 24. Esquema general de trabajo 76 Figura 25. Programa de elución utilizado en la separación cromatográfica de fructanos de Agave y Dasylirion 83 Figura 26. Metodología de derivatización de carbohidratos a PMAA 85 Figura 27. Diseño de oligonucleótidos degenerados 98 Figura 28. Vector pGEM-T Easy 100 Figura 29. Amplificación de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE) 102 Figura 30. Mapa del vector pGAPZ αC 105 Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles 109 Figura 32. Presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion 115 Figura 33. Cromatografía en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion 117 Figura 34. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos) 119 Figura 35. Perfil de elusión, utilizando cromatografía de gases, de fructanos de Agave y Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados 122 Figura 36. Comparación de fructanos derivatizados en tres especies vegetales 123 Figura 37. Cuantificación de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas 127 Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana 131 Figura 39. Espectro de 13 C-RMN de fructanos de A. tequilana 131 Figura 40. Espectros de 13 C-RMN de fructanos en Asparagales 135 Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahilia variabilis y Agave tequilana 136 Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion 139 Figura 43. Cromatografía de afinidad a concanavalina A 142

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Figura 44. Cromatografía de intercambio aniónico 144 Figura 45. Cromatografía de hidroxiapatita 146 Figura 46. Cromatografía de exclusión en gel 148 Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante 150 Figura 48. Perfil cromatográfico de fructanos sintetizados por el extracto crudo de A. potatorum 152 Figura 49. Cromatografía de intercambio aniónico 156 Figura 50. Actividades hidrolíticas de la fracción Q0 157 Figura 51. Perfil cromatográfico de productos del ensayo enzimático de las fracciones de intercambio aniónico de A. potatorum 158 Figura 52. Productos de la acción enzimática de las fracciones afines a concanavalina A 160 Figura 53. Modelo propuesto para la biosíntesis de fructanos en Agave y Dasylirion 162 Figura 54. Extracción de ARN 164 Figura 55. Amplificación de fragmentos con oligonucleótidos degenerados 165 Figura 56. Análisis de restricción de productos amplificados con oligonucleótidos degenerados 166 Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas 168 Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequila na con enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 170 Figura 59. Amplificación rápida de los extremos del DNAc de atft mediado por la ARN ligasa 173 Figura 60. Orientación de los insertos At5´- y At3´-RACE en el vector pGEM-T Easy 175 Figura 61. Estrategia de clonación para la obtención del plásmido pGEM T-atft 177 Figura 62. Digestión y análisis de restricción 178 Figura 63. Árbol filogenético sin raíz de enzimas del metabolismo de fructanos 179 Figura 64. Predicción del péptido señal en AtFT 182 Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT 184 Figura 66. Perfil cromatográfico de productos generados de AtFT excretada al medio Extracelular 190 Figura 67. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT contenida en la fracción celular 192

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ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave 9 Tabla 2. Composición del aguamiel y pulque 21 Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM 25 Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 29 Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a frío extremo 29 Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitación de A. tequilana y A. deserti sometidos a sequía 31 Tabla 7. Comparación de parámetros fisiológicos de Zea mays y Agave americana 34 Tabla 8. Clasificación taxonómica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas 37 Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas 41 Tabla 10. Predominancia estructural de fructanos según la especie 46 Tabla 11. Propiedades cinéticas de distintas fructosiltransferasas 51 Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion 75 Tabla 13. Determinación enzimática de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 78 Tabla 14. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados 96 Tabla 15. Identificación de fructanos eluídos en un sistema cromatográfico intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC-PAD) 120 Tabla 16. PMAA en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa 125 Tabla 17. Contribución relativa de compuestos derivatizados en los fructanos 128 Tabla 18. Correlación entre diferentes compuestos derivatizados 128 Tabla 19. Desplazamientos químicos de 13 C-RMN de fructanos 133 Tabla 20. Desplazamientos químicos de 1H-RMN de fructanos 137 Tabla 21. Calibración de la columna de exclusión y estimación de pesos moleculares de las fracciones proteínicas 149 Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1- kestotriosa como sustrato 153 Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 167 Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft 181

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ABREVIATURAS UTILIZADAS DEPC Dietil pirocarbonato d.i. Diámetro interno dATP Adenosin desoxitrifosfato dCTP Citocin desoxitrifosfato dGTP Guanidin desoxitrifosfato DMSO Dimetil sulfóxido dNTP Mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP dTTP Tiamin desoxitrifosfatos DTT Ditiotreitol e.r.c. Respuesta efectiva de carbono (effective response of carbon) EPI Índice productivo ambiental (environmental productive index) FOS Fructo-oligosacáridos GC-FID Cromatografía de gases acoplado a detector de ionización en flama (gas chromatography coupled to flame ionization detector) GC-MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (gas chromatography coupled to mass spectrometry) GH Glicosilhidrolasa HPAEC-PAD Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplado a detector de pulso amperométrico (high performance anionic exchange chromatography-pulse amperometric detector) HPLC Cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography) Inv-CW Invertasa de pared celular (invertase-cell wall) Inv-V Invertasa vacuolar IOS Inulo-oligosacáridos KD Coeficiente de distribución de la masa molecular Kh Conductividad hidráulica 1-KES 1-Kestotriosa ( O-α-D-Glc p-(1-2)-O-β-D-Fruf-(2-1)-β-D-Fru f) 6-Kes 6-Kestotriosa ( O-α-D-Glc p-(1-2)-O-β-D-Fru f-(6-2)-β-D-Fru f) 6G-Kes 6-Glucosa-kestotriosa o neokestosa ( O-β-D-Fru f-(2-6)-O-α-D-Glc p-(1-2)-β-D-Fru f) 6-KES 6-Kestosa exohidrolasa PAHBAH Hidracida del ácido p-hidroxibenzoico PAR Radiación fotosintéticamente activa (photosynthetically active radiation) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) PH “Process hardiness” PMAA Alditol acetato parcialmente metilado (partially methylated alditol acetate) RMN Resonancia magnética nuclear TAE Buffer Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1mM TE Buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0. TFA Ácido trifluoroacético (Trifluoroacetic Acid) TLC Cromatografía en capa fina (thin layer chromatography)

xii I. RESUMEN β Dasylirion Agave tequilana in vivo Agave tequilana Pichia pastoris

1 II. INTRODUCCIÓN Agave vera cruz Agave tequilana β β inulina levanos β graminanos inulina- levano-neoserie

2 Thyphula incarnata, T. ishikariensis Microdochimm nivale Dasylirion Dasylirion .

3 Agave Dasylirion

4 III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Agave Dasylirion OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Agave Dasylirion . 2. 3. Agave tequilana

5 IV. ANTECEDENTES

1.- AGAVES Y DASYLIRION Dasylirion . metl Dasylirion Mayahuel Agave Dasylirion 1.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Figura 1. Mayahuel.

6 sensu stricto

1.1.1. AGAVACEAE A. americana A. vivipara A foetida Furchraea A. virginica Manfreda Agave Furcraea Yucca Agavaea Furcraea Littaea Manfreda Polianthes Yucca Hesperalöe Agave Beschorneria, Furcraea, Manfreda, Polianthes Prochnyanthes rbc Agave Littaea Agave

7 1.1.2. NOLINACEAE Beaucarnea Calibanus Dasylirion Nolina DIVISIÓN Angisoperma CLASE Liliopsida ÓRDEN Asparagales FAMILIA Agavaceae Nolinaceae SUBFAMILIA Agavoideae GÉNERO Beschorneria Yucca Beucarnea Furcraea Hesperalöe Calibanus Manfreda Nolina Polianthes Dasylirion Prochynathes Agave SUBGÉNERO Littaea Agave

Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion .

8 Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave . Subgénero Grupos Características No. Ejemplos especies Littaea attenuata, bakeri, pedunculifera, chrysoglossa, ocahui, vilmoriniana, yuccaefolia bracteosa, ellemeetiana, guiengola colimana, felgeri, filifera, geminiflora, multifilifera, ornithobroma, schidigera albomarginata, ensifera, ghiesbreghtii, horrida, kerchovei, lechuguilla, lophanta, pelona, pumilla parviflora, polianthiflora, schotti, toumeyana celsii, chiapensis, pendula, polyacantha, warelliana dasyliroides, striata, stricta arizonica, utahensis Agave americana, franzosini, lurida, oroensis, scabra, scaposa aurea, capensis, promontorii bovicornuta, calodonta, cupreata, hookeri, inaequidens, jaiboli, maximiliana avellanidensis, cerulata, deserti, gigantensis, margaritae, mckelveyana, moranni, sobria applanata, chrysantha, colorata, flexispina, fortiflora, murpheyi, palmeri atrovirens, congesta, hiemiflora, hurteri, lagunae, pachycentra, potatorum

9 gypsophila, marmorata, nayaritensis, zebra gracilipes, guadalajarana, havardiana, neomexicana, parrasana, parryi aktites, angustifolia, cantala, fourcroydes karwinskii, macroacantha, tequilana macroculmis, mapisaga, salmiana, tecta, ragusae desmettiana, kewensis, neglecta, sisalana, weberi, shawii, sebastiana

1.2. DISTRIBUCIÓN Beschcorneria Furcraea Polianthes Prochnyanthes

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Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae.

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Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae.

12 Beaucarnea 1.3. DESCRIPCIÓN DE LOS GÉNEROS Y CARACTERÍSTICAS DELIMITANTES DE LAS FAMILIAS AGAVACEA Y NOLINACEAE tequilana Agave Furcraea Dasylirion Agave

13 1.3.1. AGAVE A. tequilana A. fourcroydes A. deserti A. tequilana A. deserti

14 1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul A. tequilana A. tequilana 1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth A. angustifolia A. angustifolia

15 1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini A. potatorum tobala papalometl A. potatorum 1.3.1.4. Agave cantala A. cantala 1.3.1.5. Agave fourcroydes A. fourcroydes

16 A. fourcroydes 1.3.2. DASYLIRION Dasylirion dasys lily Dasylirion D. quadrangulatum Dasylirion D. wheeleri Dasylirion Dasylirion Dasylirion Dasylirion

17 1.4. IMPORTANCIA ECONÓMICA Y CIENTÍFICA 1.4.1. USOS TRADICIONALES

1.4.2. USOS ORNAMENTALES A. americana A. angustifolia, A. cantala A. americana, A. lurida

1.4.3. OBTENCIÓN DE FIBRAS NATURALES A. angustifolia A. fourcroydes A. sisalana A. fourcroydes A. sisalana A. lechuguilla A. peacockii

18 Dasylirion 1.4.4. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE FITOQUÍMICOS A. vilmoriana, A. cerulata, A. lechuguilla, A. lophanta, A. colimani A. schidigera A. sisalana, A. fourcroydes A. angustifolia A. lechuguilla A. intermixta A. americana A. salmiana A. vilmoriana D. wheeleri 1.4.5. ELABORACIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS

19 1.4.5.1. BEBIDAS FERMENTADAS octli A. salmiana, A. mapisaga, A. atrovirens, A. hookeri A. americana Bacterium Lactobacillus Leuconostoc Pseudomonas Streptococcus Diplobacter Bacillus Saccharomyces Pichia

1.4.5.2. BEBIDAS DESTILADAS A. tequilana

20 Saccharomyces cerevisiae × A. angustifolia A. palmeri A. angustifolia, A. potatorum, A. cantala A. karwinskii Dasylirion A. fourcroydes Tabla 2. Composición de aguamiel y pulque

Compuesto Aguamiel Pulque

21 Hypopta agavis

1.4.6. ELABORACIÓN DE EDULCORANTES FRUCTOSADOS ° 1.4.7. UTILIZACIÓN DE BAGAZO

22 Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel.

23 1.4.8. PROPAGACIÓN in vitro in vitro A. sisalana A. victoria-reginae A. tequilana in vitro A. tequilana in vitro A. fourcroydes A. potatorum A. cupreata A. parrasana in vitro

24 1.5. INFLUENCIA DE LA ZONA GEOGRÁFICA EN LOS AGAVES A. deserti A. salmiana A.lechuguilla A. tequilana

A. lechuguilla r r r − − ≈ −

Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM.

Especie Productividad (kg/m -2 año -1) A. deserti A. fourcroydes A. salmiana A. lechuguilla Opuntia ficus-indica Ananas comosus

25

Figura 6. Influencia de factores abióticos en la asimilación de CO 2 en A. lechuguilla . ψ, A) Ο- ψ (ψ <  B) C) D) A. tequilana

26 ° A. tequilana

Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilación de CO 2 en A. tequilana . µ µ µ

27

Figura 8. Áreas óptimas, subóptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en el estado de Jalisco.

28 1.6. ADAPTACIÓN DE LOS AGAVES ° °

Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco. Variable Óptima Subóptima Marginal ° < > ° < > >

Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a frío extremo. Especie Temperatura Especie Temperatura A. americana A. parryi A. angustifolia A. parviflora A. attenuata A. pelona A. bovicornuta A. salmiana A. cerulata A. scabra A. chrysantha A. schidigera A. datylio A. schotti A. deserti A. shawii A. desmettiana A. sisalana A. filifera A. striata A. fourcroydes A. tequilana A. geminiflora A. toumeyana A. havardiana A. utahensis A. lechuguilla A. victoriae-reginae A. lophantha A. vilmoriana A. macrocantha A. weberi A. marmorata A. zebra A. murpheyi D. acrotriche A. neomexicana D. leiophyllum A. ocahui D. quadrangulatum A. palmeri D. texanum A. parrasana D. wheeleri

29 1.6.1. ADAPTACIÓN MORFOLÓGICA 1.6.1.1. HOJAS

K A. deserti vs

K A. tequilana A. deserti,

K vs

ψ

30 Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitación de A. tequilana y A. deserti sometidos a 100 días de sequía. Sequía ψψψsuelo ψψψfoliar Decremento Transpiración ψψψfoliar Decremento Transpiración (días) (MPa) (MPa) en Kh (%) (mol m -2día -1) (MPa) en Kh (%) (mol m -2día -1) A. A. tequilana A. tequilana A. deserti A. deserti A. deserti tequilana ψ K

A. deserti A. tequilana

1.6.1.2. RAÍCES Dasylirion A..deserti

31

Figura 9. Cambios en la velocidad de respiración durante sequía en raíces de lluvia y establecidas en A. deserti . µ µ µ µ ψ

ψ

32 1.6.1.3. TALLO

1.6.2. ADAPTACIÓN FISIOLÓGICA 1.6.2.1. METABOLISMO ÁCIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM) A. americana A. americana,

10 Agave americana

8 Zea mays

6

4

2

0

Diferencia de Temperatura (°C) 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

-2

-4 Hora

Figura 10. Diferencia de temperatura entre el área foliar (de maíz o agave) y el aire circundante.

33 Tabla 7. Comparación de parámetros fisiológicos de Zea mays y Agave americana . Zea mays Agave americana

1.6.2.2. BIOQUÍMICA DEL METABOLISMO ÁCIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)

A. deserti

34 Cloroplasto

Figura 11. Metabolismo ácido de las crasuláceas.

35 i).- ii ).- iii ).- iv ).-

36 A. guadalajarana A. sisalana

A. deserti Tabla 8. Clasificación taxonómica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas. Clasificación Principal No. Principal Especies analizadas Decarboxilasa especies Carbohidrato analizadas de almacén Magnoliopsida (Dicotiledónea) Mesembryantheum crystallinum Opuntia aurantiaca Clusia rosea Kalanchoe tubiflora, pinnata, daigremontiana Xerosicyos danguyi Hoya carnosa Stapelia gigantea Liliopsida (Monocotiledónea) Agavaceae Agave guadalajarana Fourcroya humboldtiana Sansevieria hahnii Aloe vera Aloe arborescens Vanilla planifolia Portea petropolitana Ananas comosus

37

Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM. A) B) C) D)

38 vs A. tequilana

1.6.2.3. ACUMULACIÓN DE FRUCTANOS β

39 2. FRUCTANOS Inula helenium Dahlia variabilis Helianthus tuberosus Hordeum vulgare Phleum pratense Agave Bacillus levaniformans ≈ Aspergillus, Penicillium Fusarium Acetabularia Bacillus Erwinia Pseudomonas, Aceobacter, Streptococcus Actynomices

2.1. ESTRUCTURA β

40

Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas.

Familias Especies Región de mayor distribución estimadas Monocotiledóneas Dicotiledóneas ≈

41

Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos. β i).-Inulina f β Cichorium intybus Helianthus tuberosus Cynara scolymus Taraxacum officinale Dahlia variabilis Polymnia sonchifolia ii ).- Levano β Phleum pratense Dactylis glomerata Streptococcus mutans

42 iii ).- Graminano Triticum aestivum Hordeum vulgare iv ).- Inulina neoserie β Asparagus officinalis Allium cepa v).-Levano neoserie β Avena sativa Lolium vi ).-n n n α

2.1.1. MÉTODOS ANALÍTICOS

43

2.1.2. ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL Echinops ritro Triticum, Secale, Hordeum Elytrigia Avena Lagurus,

44 Phormium tenax P. cookianum Cordyline australis Agave vera cruz Allium cepa Asparagus officinalis 2.2. METABOLISMO H. tuberosus

Figura 14. Rango de grados de polimerización (DP) en especies que acumulan fructanos. A) B)

45 Tabla 10. Predominancia estructural de los fructanos según la especie. Especie Estructura Rango promedio DP Referencia ASTERALES > Cichorium intybus n 157, 201 Helianthus tuberosus n 157, 58 Taraxacum officinale n 157, 58 Cynara scolymus 157, 76 Dahlia variabilis 157 POALES Tribu Triticeae Triticum aestivum 20 Hordeum vulgare 20 Tribu Bromeae Bromus tectorum 20 Tribu Aveneae Avena sativa 20, 224 Lagurus ovatus 20 Tribu Poeae Lolium rigidum 20, 148 Lolium perenne 148 Dactylis glomerata 20, 148 ASPARAGALES Alliaceae Allium sativa 215 Allium cepa 215 Allium amploprasum 215 Asparagaceae Asparagus officinalis 180 Agavaceae Agave vera cruz 51 Agave deserti 228 Phormiaceae Phormium tenax 182 Phormium cookianum 182 Bulbinella hookeri 183

β F → F

46

⇔ > > β Agave vera cruz, in vitro β in vivo

β

F ⇔ F ≥ β β

47 Figura 15. Diferentes vías biosintéticas de fructanos en plantas superiores. de novo

48 Poa ampla F → F F → F

F → F β

→ ≥ β β

49 β 2.2.1. COMPLEJIDAD METABÓLICA in vitro in vivo 2.2.2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA de novo Lolium temulentum

50 Tabla 11. Propiedades cinéticas de distintas fructosiltransferasas. Enzima Origen P.M. pI pH T° Donador Aceptor Producto Comentario Referencia (kDa) op op Helianthus > 102 tuberosus Hordeum 113 vulgare + Helianthus > 112 tuberosus > > Cichorium > > 206 intybus > > > > > Hordeum > + 53 vulgare + Allium 59 cepa Asparagus 201 officinalis Triticum 213 aestivum Cichorium β( >β( + 48 intybus

51 Cichorium intybus Dactylis > > glomerata Lolium 119 perenne > > Beta + 213 vulgaris Triticum + 215 aestivum Triticum 212 aestivum Arabidopsis 45 thaliana Arabidopsis 45 thaliana

52 in vitro

53

Figura 16. Regulación de la actividad de fructosiltransferasas. A) B) A) µ µ B)  µ ´´ µ  µ C) D) C) D)

54 → vs L. temulentum H. vulgare n Lolium perenne Lolium > Lolium perenne

2.2.3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

55 ≈ ≈ ≈ in planta Bacillus subtilis Campanula rapunculoides Arabidopsis thaliana β

56 2.2.4. FAMILIA GH32 ≈ Zymomonas mobilis Bacillus sp. β

. I II

Gd-LsdA APHAAD---TPQWRPVLHFSPA AYWMNDPNGP ILLDGV YHLFYQYAPGSMTWGHPSWGHA 89 Bs-Lev ADAADSSYYDEDYRPQYHFTPE ANWMNDPNGM VYYAGE YHLFYQYHPYGLQWGPMHWGHA 81 Tm-Inv ------MFKPNYHFFPI TGWMNDPNGL IFWKGK YHMFYQYNPRKPEWGNICWGHA 49 Dc-Inv PSYPWTNDMLSWQRTSFHFQPQ ENWMNDPNGP LFHMGW YHLFYQYNPDSAIWGNITWGHA 177 Ao-Inv GQYPWTNKMLSWQRTGFHFQPE KNWMNDPNGP LYYKGW YHFFYQYNPNAAVWGDIAWGHA 164 Ac-6GFFT -EFPWTNDMLAWQRCGFHFRTV RNYMNDPSGP MYYKGW YHLFYQHNKDFAYWGNITWGHA 117 . : ** . :****.* : * **:***: ** ****

III

Gd-LsdA TSTDLLHWTEHGVAIAATP --GEEIFSGSLVPDPLNRSGLGSTDAPPLLAFHTSVFHDNP 147 Bs-Lev VSKDLVTWEHLPVALYPDE --KGTIFSGSAVVDKNNTSGFQTGKEKPLVAIYT------132 Tm-Inv VSDDLVHWRHLPVALYPDD ETHG------VFSGSAVEKDGKMFLVYTY--YRDP 95 Dc-Inv ISRDLINWLHLPFAMQPDQ --WYDING------VWTGSATILPDGKIVMLYTG--DTDD 226 Ao-Inv VSKDLLSWRHLPLAMVPDR --WYDING------VWTGSATILPDGRIIMLYTG--ATNE 213 Ac-6GFFT VSRDLINWQHLPVAVGPDH --WYDISG------VWTGSIIVVSEDRVVMLFTG--GTKS 166 * **: * . .*: . ..: . .. :. ..* .

IV

Gd-LsdA AHPDGTQAQSVSVSHDGGFTWRPYAH-NPVLTLHPDSR--QFRDPS VFWYQD-GGC.... 199 Bs-Lev QDREGHQVQSIAYSNDKGRTWTKYAG-NPVIP-NPGKK--DFRDPK VFWYEK-EKK.... 183 Tm-Inv THNKGEKETQCVAMSENGLDFVKYDG-NPVISKPPEEGTHAFRDPK ---VNRSNGE.... 147 Dc-Inv LVQVQNLAYPANLSDPLLLDWIKYPD-NPVMFPPPGIGSTDFRDPT TAWIGP-DGK.... 280 Ao-Inv SVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDA NPILVPPPGVGATDFRDPT TAWFEPSDST.... 269 Ac-6GFFT FDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRDDFRDPN PIWYNASEST.... 221 : **:: * ****.

V VI

Gd-LsdA WLDHGADQYATT LFA... 320 ..... EVA LHLVVDRASVELFAND GVLRMTDLIFPP 507 Bs-Lev WTDYGRDFYAAV SWS... 295 ..... KVK LRIFVDRSSVEVFGND GKQVITDIILPD 484 Tm-Inv LLDHGTDFYAAQ TFF... 246 ..... --RIRAFLDSCSVEFFFND S-IAFSFRIHPE 407 Dc-Inv RLDYG-KYYASK TFY... 402 ..... SLS MRLLVDHSIVESFAQG GRTVITSRVYPT 619 Ao-Inv RYDLG-KFYASK TFY... 396 ..... TLS LRILVDHSIVESFAQG GRASATSRVYPT 615 Ac-6GFFT RYDWG-KFYASR TFF... 354 .... TFA VRILVDHSVIESFAMG GRTSATSRAYPT 572 :: .:* . :* * .. : * * . **: : .

Figura 17. Alineamiento de proteínas pertenecientes a las familias GH32 y GH68. Glucanoacetobacter diazotrophicus Bacillus subtilis Thermotoga maritima Daucus carota Asparagus officinalis Allium cepa )

57 Termotoga maritima C. intybus Bacillus subtilis Gluconoacetobacter diazotrophicus β Streptococcus salivarius

58 β β

Figura 18. Mecanismos catalíticos de las glicosilhidrolasas. A) B)

59

2.3. FISIOLOGÍA DE LOS FRUCTANOS 2.3.1. CARBOHIDRATO DE RESERVA 2.3.2. DESARROLLO VEGETAL

60 Vernonia herbaceae Hemerocallis Phippsia algida Campanula rapunculoides

Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores. A) Actividad enzimática y acumulación de fructanos en tubérculos de Polymnia sonchifolia (Asteraceae); B) Expresión de fructosiltransferasa en distintos tejidos de Triticum aestivum (Poaceae). Modificada de Itaya et al., 2002 y Van den Ende et al., 2005.

61 n C. rapunculoides

2.3.3. DEFOLIACIÓN Vernonia herbaceae V. herbacea

62

Figura 20. Efecto de la defoliación en el metabolismo de fructanos. A) Lolium perenne B) C) Cichorium intybus D)

63 2.3.4. DESCARGA APOPLÁSTICA

2.3.5. AJUSTE OSMÓTICO Lachenalia minima 2.3.6. TOLERANCIA AL FRÍO

64

≈ vs Phleum pratense

65

Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrés por frío A) B) C) D)

66 2.3.7. TOLERANCIA A SEQUÍA Festuca arundinacea Phleum pratense Lolium perenne Festuca arundinacea

ψ

ψ

67

Figura 22. Fructanos en estrés por sequía. A-D) Lolium perenne E) ∆ € • F) t t t t t .

68

β

α

αβ t

βα t

2.3.8. DEFENSA CONTRA PATÓGENOS

69

Figura 23. Modelo propuesto de la participación de fructanos en la resistencia a patógenos. β

70 2.4. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FRUCTANOS

Lactobacillus, Bifidobacteria Enterococcus Escherichia Clostridium

71 Lactobacillus Bifidobacteria

72 V. JUSTIFICACIÓN

VI. HIPÓTESIS

Agave Dasylirion

73 VII. MATERIALES Y MÉTODOS

A. MATERIAL BIOLÓGICO 1. Regiones Dasylirion 2. Edad Dasylirion 3. Muestreo A. tequilana

74

Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion .

Región LosAltos, Pénjamo, Ures, Matatlán, SolaVega, SolaVega, Mérida, Pegüis, Jalisco Guanajuato Sonora Oaxaca Oaxaca Oaxaca Yucatán Chihuahua tequilana tequilana angustifolia angustifolia potatorum cantala fourcroydes Dasylirion °

75 Determinación Estructural de Fructanos, Identificación de sus Actividades Enzimáticas y Expresión de sus ADNc en Pichia pastoris

Agave tequiillana A. angustiifolliiaA. canatalla A. potatorum A. fourcroydesDasylliiriion

A. tequiillana Piichiia pastoriis

Figura 24. Esquema general de trabajo.

76 B. METODOLOGÍA

1. COMPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE ALMACÉN EN AGAVES Y DASYLIRION 1.1. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA 1.1.1. EXTRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES

1.1.2. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES µ µ

λ

1.1.3. DETERMINACIÓN DE D-GLUCOSA, D-FRUCTOSA Y SACAROSA →

77 Tabla 13. Determinación enzimática de D-Glucosa, D-Fructosa y Sacarosa. Blanco para D- Determinación de Blanco para Determinación Glc y D-Fru D-Glc y D-Fru Suc de Suc µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ λ

µ µ µ µ

λ µ µ

λ β

→ λ

∆ i).- DETERMINACIÓN DE D-GLUCOSA × ×∆ I ε× × × ε λ

78 ∆ ii ).- DETERMINACIÓN DE D-FRUCTOSA → →

∆ ∆ ∆

∆

∆ iii ).- DETERMINACIÓN DE SACAROSA

→

∆

∆

∆

1.1.4. DETERMINACIÓN DE FRUCTANOS

79 µ µ β Bacillus subtilis Klebsiella pneumoniae µ

µ µ µ λ µ µ µ µ p µ µ µ ∆ × × × × × × × II ∆ µ µ µ

80 µ 1.1.5. DETERMINACIÓN DE ALMIDÓN Agave Dasylirion µ α µ µ λ µ µ µ µ µ ∆ × × × × × III ∆ µ

81 µ µ 1.2. EXTRACCIÓN DE FRUCTANOS < > 1.3. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS 1.3.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC) µ ×

82 1.3.2. CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN DE INTERCAMBIO ANIÓNICO ACOPLADO A DETECTOR DE PULSO AMPEROMÉTRICO (HPAEC-PAD) µ µ µ i ii iii

Figura 25. Programa de elución utilizado en la separación cromatográfica de fructanos de Agave y Dasylirion .

83 1.3.3. DERIVATIZACIÓN DE FRUCTANOS A ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS (PMAA) µ i).- METILACIÓN

÷

µ

ii ).- EXTRACCIÓN DE PRODUCTOS METILADOS

84 i) Metilación

ii ) Hidrólisis

iii ) Reducción

iv ) Acetilación

Figura 26. Metodología de derivatización de carbohidratos a alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA).

85

g iii ).- HIDRÓLISIS µ °

g iv ).- REDUCCIÓN

µ °

v).- ACETILACIÓN µ µ °

86 vi ) EXTRACCIÓN DE ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS

vii ) IDENTIFICACIÓN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS)

µ µ viii ) CUANTIFICACIÓN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A UN DETECTOR DE IONIZACIÓN EN FLAMA (GC-FID) µ

87

1.4. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS DE A. tequilana Weber var. azul (JALISCO) A. tequilana

1.4.1. ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR IONIZACIÓN/DESORCIÓN POR LÁSER ASISTIDA POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS) × λ 1.4.2. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE CARBONO 13 A. tequilana

µ

88 1.4.3. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN

A. tequilana µ

2. IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO DE FRUCTANOS

2.1. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

β

2.2. ESTRATEGIAS DE PURIFICACIÓN

89 2.2.1. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD × λ ≈ α 2.2.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO × λ <

90 2.2.3. CROMATOGRAFÍA DE HIDROXIAPATITA × µ

2.2.4. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL) × γ

IV

91 2.3. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS µ µ

2.4. ENSAYOS ENZIMÁTICOS 2.5. SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA ×

92 3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIÓN EN Pichia pastoris

3.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICADORAS

3.1.1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO RIBONUCLEICO

i)MÉTODO DE PRECIPITACIÓN CON CLORURO DE LITIO µ µ µ µ µ µ

93 ii ).- MÉTODO DE TRIZOL (Gibco, BRL) µ 3.1.2. GELES DE AGAROSA µ µ 3.1.3 ELECTROFORESIS EN “MICROCHIP” µ µ

94 3.2. OBTENCIÓN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS (ADNc) POR TRANSCRIPCIÓN REVERSA

µ

µ µ µ µ µ µ µ µ µ E. coli pol Moloney murine µ E. coli

3.2.1. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORES A. americana A. striata 3.2.2. AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS

95 µ µ × µ µ µ µ Thermophilus aquaticus µ µ µ Tabla 14. Secuencia de oligonucleótidos utilizados. Oligonucleótido Secuencia Dirección ´´ ´´ ´´ ´´ ´´ ´´ ´ ´´ ´ ´´ ´ ´´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ ´ Cla Xba ´ + + + + + + + + +

96 3.2.3. ELUCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR BANDAS DE AGAROSA µ µ

3.2.4. PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES E. coli α λ µ

97

Figura 27. Diseño de oligonucleótidos degenerados. + + + + + + + + +

98 3.2.5. CLONACIÓN Y TRANSFORMACIÓN µ µ µ * γ β µ µ E. coli α µ µ µ β 3.2.6. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS (MINIPREPARACIONES) µ µ

A)

99

B)

Figura 28. Vector pGEM-T Easy. A) E. coli β Amp lac B) E. coli β lac α

100 µ µ

3.2.7. CONFIRMACIÓN DE LA SECUENCIA EN EL PLÁSMIDO Eco ´↓´ Not ´ ↓´ µ µ µ Eco Not µ λ 3.2.8. IDENTIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS (Blast) 3.3. AISLAMIENTO DEL ADNc COMPLETO DE LA SECUENCIA CODIFICANTE ´ ´

101 3.3.1. AMPLIFICACIÓN RÁPIDA DEL EXTREMO 5´ DEL ADN COMPLEMENTARIO (5´-RACE) i).- ELIMINACIÓN DE ARNm TRUNCADOS O INCOMPLETOS µ × µ µ µ µ µ µ λ

Figura 29. Amplificación de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE). ´´´´´´

102 ii ).- HIDRÓLISIS DE LA ESTRUCTURA CAP DE LOS ARNm µ × µ µ µ

iii ).- LIGACIÓN CON EL ADAPTADOR 5-RACE ´ µ × µ µ µ iv ).-TRANSCRIPCIÓN REVERSA v).- AMPLIFICACIÓN POR PCR ´ ´´ ´ ´

103 3.3.2. AMPLIFICACIÓN RÁPIDA DEL EXTREMO 3´ DEL ADN COMPLEMENTARIO (3´-RACE) ´ ´ ´´ ´ ´

3.3.3. LIGACIÓN Y CLONACIÓN DEL ADNc COMPLETO E. coli α Bsh Age ´↓´ E. coli α

3.4. EXPRESIÓN EN Pichia pastoris Pichia pastoris α sh ble

104 α

Figura 30. Mapa del vector pGAPZ αααC. α Saccharomyces cerevisiae myc aox S. cerevisiae Sh ble P. pastoris Sh ble E. coli Sh ble Streptoalloteichus hindustanus S. cerevisiae Sh ble E. coli

105 3.4.1. ELIMINACIÓN DEL PÉPTIDO SEÑAL Y SECUENCIA DE TERMINACIÓN Cla Bsu 1 ´ ↓´ ´ Xba ´↓´ ´ α Cla Xba α 3.4.2. PROPAGACIÓN DEL VECTOR E. coli α µ E. coli P. pastoris µ Avr Xma ´ ↓´

106 3.4.3. TRANSFORMACIÓN DE Pichia pastoris Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN P. pastoris µ λ P. pastoris [ ] [ ] [

] P. pastoris µ α Avr µ P. pastoris atft α

107 VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. COMPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE ALMACÉN EN AGAVES Y DASYLIRION 1.1. PATRÓN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES Lolium perenne A. tequilana A. deserti Agave Dasylirion A. angustifolia A. fourcroydes

108 Carbohidratos totales Fructanos Sacarosa Fructosa Glucosa

1000

900

800

700

600

500

mg/g DM 400

300

200

100

0 At-J At-G Aa-S Aa-O Ac-O Ap-O Af-Y Dsp-C Dv

Agave Dasylirion Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles.

1.2. FACTORES ONTOGÉNICOS

109 Hemerocallis Phippsia algida Campanula rapunculoides 1.3. INFLUENCIA DEL AMBIENTE EN EL PATRÓN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES

110 A. angustifolia A. tequilana A. tequilana vs A. tequilana

111 vs

A. tequilana ∼ µ ∼ µ ∼ ∼ ∼

µ ∼ µ

112 1.4. FUNCIÓN DE LOS FRUCTANOS EN LA SEQUÍA Festuca arundinacea Lolium perenne Triticum aestivum

113 Agave deserti A. deserti

1.5. PRESENCIA DE ALMIDÓN A. vera cruz A. deserti Asparagus officinalis, Allium vineale A.ursinum Phormium . Hordeum vulgare Poa × jemtlandica

114

Figura 32. Presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion . Dahlia variabilis

A. deserti, A. deserti sac Bacillus subtilis

115 i fvs p ii vs iii vs iv

1.6. PERFIL CROMATOGRÁFICO DE FRUCTANOS 1.6.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC) <

116

Figura 33. Cromatografía en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion .

117 1.6.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (INTERCAMBIO ANIÓNICO ACOPLADO A DETECTOR DE PULSO AMPEROMÉTRICO (HPAEC-PAD) A. tequilana A. potatorum A. angustifolia β iα p ≥ Nx Nx

118

Figura 34. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos).

119 . β

Tabla 15. Identificación de fructanos eluídos en un sistema cromatográfico intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC-PAD). Pico Tipo de fructano Nombre Achicoria Cebolla Agave spp.

× × × × × × N3 × × × × × 1y6 G-kestotetraosa × × N4 × × × × × 1,1y6 G-kestopentaosa/ × × 1y1,6 G-kestopentaosa N5 1,1,6 G-kestopentaosa × × × × × × × × × × × × × × × × Nx ×

120 1.7. ANÁLISIS DE ENLACES POR DERIVATIZACIÓN DE FRUCTANOS A ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS (PMAA) > i) Dahlia variabilis β ft α α pt

121

Figura 35. Perfil de elusión, utilizando cromatografía de gases, de fructanos de Agave y Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados.

122

Figura 36. Comparación de fructanos derivatizados en tres especies vegetales. Agave angustifolia Allium cepa Dahlia variabilis

123 β β f ββ f ii ) Allium cepa β ft vs α α pi α pt αit iii ) Agave y Dasylirion Agave Dasylirion αt β f β

124 Tabla 16. Alditol acetatos parcialmente metilados identificados en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa .

Pico Tr a Compuesto derivatizado Tipo de enlace b Patrón de fragmentación c β ft β ft α pt →β f →β f d → →β + f α pi β f , a bt i c d D. variabilis A. cepa

125 β β f β Agave Dasylirion β β f β f β f β f β f

1.7.1. CUANTIFICACIÓN DE LOS GLICOSIL-DERIVADOS Agave Dasylirion α pt

126 Fru-terminal Glc-terminal Fru (2-6) Fru (2-1) Glc-interna Ramificación

100

80

60 mol % 40

20

0 At-J At-G Aa-S Aa-O Ac-O Ap-O Af-Y Dsp-C

Figura 37. Cuantificación de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas Allium cepa

αit αt β β β f β

127 Tabla 17. Contribución relativa de compuestos derivatizados en los fructanos. Grupo DP t-ααα-D- i-ααα-D- t-βββ-D- (2-6)-βββ-D- (2-1)-βββ-D- 1,6-di-βββ-D- Estimado Glcp Glc p Fru f Fru f Fru f Fru f I II III Standard αit

Tabla 18. Correlación entre diferentes compuestos derivatizados. Grupo DGlc-i/DGlc-t βββ(2-1)/ βββ (2-6) βββ (2-6)/1,6-di-Fru Fru-t/1,6-di-Fru I II III αit

128 ft A. deserti A. tequilana 1.7.2. SIGNIFICANCIA DE LA DIVERSIDAD ESTRUCTURAL DE FRUCTANOS Agropyron cristatum A. angustifolia A. potatorum A. cantala

129 Dasylirion A. fourcroydes A. cantala A. tequilana A. tequilana

1.8. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS EN A. tequilana Weber var. azul (JALISCO) A. tequilana 1.8.1. ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR IONIZACIÓN/DESORCIÓN POR LÁSER ASISTIDA POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS) + + + 1.8.2. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 13 C

130

Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana . +

Figura 39. Espectro de 13 C-RMN de fructanos de A. tequilana .

131 ∼ β f β f δ β f δ β ft δ fiβ β f iββ f δ β δ α pi δ β ft α pi ∼ δ β f ∼δ δ > > > δ

132 Tabla 19. Desplazamientos químicos de 13 C-RMN. Carbono A. tequilana Sacarosa 1-Kestotriosa Nistosa DP5 inulina D.variabilis F1 F2 F3 F4 F5 F6 G1 G2 G3 G4 G5 G6 β β

133 ∼ Asparagus officinalis Cordyline australis ∼ Pucinella peisonis ∼ δ β f δβ f δ U. maritima P. peisonis Agropyron repens β δ δ α p-i δ δ β f C. australis, U. maritima Phormium Cordyline australis Phormium Urginea maritima

134

Figura 40. Espectros de 13 C-RMN de fructanos en Asparagales. Agave tequilana Phormium Urginea maritima Cordyline australis

1.8.3. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN δ

135

Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahlia variabilis y Agave tequilana δ δ δ δ δ δ δ

136 Tabla 20. Desplazamientos químicos de 1H-RMN. 1H Suc 1-Kes 6G-Kes 6-Kes 6G-Kes Suc Dalia

G1 G2 G3 G4 G5 G6 F1 F3 F4 F5 F6

δ δ

137 δ 1.9. ESTRUCTURAS PROPUESTAS PARA FRUCTANOS EN Agave Y Dasylirion Allium Phormium Cordyline Urginea Agave

≥ β β f A. vera cruz ∼ iα p

138

Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion . A) B) α ≥

Urginea maritima → fβ → α p U. maritima f β β f 1.10. POSIBLES IMPLICACIONES DE LA PRESENCIA DE FRUCTANOS EN AGAVES Y DASYLIRION

139

140 2. IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y DASYLIRION

2.1. ESTRATEGIA CROMATOGRÁFICA I 2.1.1. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

λ α α µ µ

141

Figura 43. Cromatografía de afinidad a concanavalina A. A) Agave tequilana Agave angustifolia α B) A. tequilana +

in vitro in planta

142 in vitro + in vitro 2.1.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO β

143

Figura 44. Cromatografía de intercambio aniónico. A) A. tequilana A. angustifolia B) A. tequilana +

144 > 2.1.3. CROMATOGRAFÍA DE HIDROXIAPATITA

145

Figura 45. Cromatografía de hidroxiapatita. i) HA-LQ3 ii ) HA-EQ3 β

146 β iii ) HA-LQ4

∼

∼ iv ) HA-EQ4 β Lolium perenne

147 2.1.4. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL) β

Figura 46. Cromatografía de exclusión en gel.A) γ B) C) Agave tequilana

148 ×+ vs A. tequilana

2.1.5. IDENTIFICACIÓN PUTATIVA DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO DE FRUCTANOS EN Agave tequilana (JALISCO) Tabla 21. Calibración de la columna de exclusión y estimación de pesos moleculares de las proteínas en la fracción QO. Proteína PM (kDa) log PM Ve Ve/Vo Kav Conc. (mg/mL) Azul dextran Catalasa × γγγ-Globulina Seroalbúmina Lisozima Q0-A Q0-B Q0-C

149

Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE). Agave tequilana ∼ ∼

150 2.2. ESTRATEGIA CROMATOGRÁFICA II A. potatorum 2.2.1. EXTRACTO CRUDO µ A. potatorum µ in planta in vivo in vitro in planta in vitro N3

151 N

Figura 48. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos sintetizados por enzimas presentes en el extracto crudo de A. potatorum .

Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1- kestotriosa como sustrato. Nx

152 Fracción + Sustrato A.angustifolia A. tequilana A. potatorum Dasylirion spp. + N3 N4 N3 N4 N3 N4 + N3, N4 N3 N4 N3 N4 + N3 N4 N3 N4 N3 N4 + N3 N4 N3 N4 N3 N4 + N3 N3 N4 + N3 N4 N3 N4 N3 N4 + N3 N4 + N3 N4 N3 N4 N3 N4 N3 N4 + N3 N4 N3 N4 + N3 N4 N3 N4 N3 N4 N3 N4

153 in vitro in vivo A. potatorum in planta β β β β

154 Lolium 2.2.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO i) Fracción Q0 → + + → + → +

155 ii ) PROBABLES ISOFORMAS DE 1-SST + → + iii ) Fracción Q1

Figura 49. Cromatografía de intercambio aniónico.

156

Figura 50. Actividades hidrolíticas de la fracción Q0. Lolium perenne

157

Figura 51. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de productos del ensayo enzimático de las fracciones de intercambio aniónico de A. potatorum . Allium Asparagus Agave iv ) Fracción Q2

158 Saccharomyces cerevisiae v) Fracción Q3

159

2.2.3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD α

Figura 52. Productos de la acción enzimática de las fracciones afines a concanavalina A. α

160 in planta 2.2.4. ACTIVIDADES FRUCTOSILTRANSFERASAS IDENTIFICADAS EN AGAVES Y DASYLIRION

161

Figura 53. Modelo propuesto para la biosíntesis de fructanos en Agave y Dasylirion.

162 3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIÓN EN Pichia pastoris

3.1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (ARN) µ µ vs µ µ 3.2. AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ÁCIDO DESOXIRIBONUCLEICO COMPLEMENTARIO (ADNc) A TRAVÉS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) µ µ ∼ ∼

163 E. coli α

Figura 54. Extracción de ARN. A) B) C) D)

164

Figura 55. Amplificación de fragmentos con oligonucleótidos degenerados.

3.3. IDENTIDAD DE LOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

165 Figura 56. Análisis de restricción de productos amplificados con oligonucleótidos degenerados. Eco A. tequilana Poa secunda i ii iii

166 Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas con el metabolismo de fructanos . Enzima Especie * pI No. aminoácidos No. Accesión Abreviatura banco de datos Cichorium intybus Taraxacum officinale Helianthus tuberosus Cynara scolymus Allium cepa Allium sativum Festuca arundinacea Lolium perenne Triticum aestivum Agropyron cristatum Poa secunda Lolium temulentum Lolium perenne Hordeum vulgare Triticum aestivum Cichorium intybus Helianthus tuberosus Cynara scolymus Echinops ritro Viguiera discolor Lolium perenne Lolium perenne Triticum aestivum Triticum aestivum Allium cepa Asparagus officinalis Lolium perenne Daucus carota Allium cepa Asparagus officinalis Tulipa gesneriana Zea mays Cichorium intybus Cichorium intybus Cichorium intybus Campanula rapunculoides Triticum aestivum Triticum aestivum Triticum aestivum Hordeum vulgare Triticum aestivum Beta vulgaris Arabidopsis thaliana Nicotiana tabacum Triticum aestivum

167

Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas. A. tequilana

Oriza sativa

168 At-FEH ----YHFQPPRN WI NDPNG PMYYNGIYHLFYQYNPYGAVWG----NIVWAHSVSTDMINWKALEPAIYPSKPFDVNGCWSGSATILPGN-KPAILYTGIDPQNR—QVQNIAFPKNLSDPYLREW 117 At-Inv ------WGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW 77 At-FT ----YHFQPPRYFM SDPSGP VYYKGWYHFFYQHNAKAAFWG----NIAWGHAASRDLLNWVHLPLAVEPDHWYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSGPLLMEW 117 Ci-1SST QRSAYHFQPDKNFI SDPDGP MYHMGWYHLFYQYNPESAIWG----NITWGHSVSRDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYTGNA—YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEW 225 Ht-1SST QRSTYHFQPDKNFI SDPDGP MYHMGWYHLFYQYNPQSAIWG----NITWGHSVSKDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYSGNA—YDLSQVQCLAYAVNSSDPLLIEW 213 Ac-1SST QRTGYHFQPPNHFM ADPNAA MYYKGWYHFFYQYNPNGSAWDY---SISWGHAVSKDMIHWLHLPVAMVPDHWYDSKGVWSGYATTLPDG-RIIVLYTGGT—DQLVQVQNLAEPADPSDPLLIEW 203 Ta-1SST QWQRTGYHFQPDKYY QNDPNG PVYYGGWYHFFYQYNPSGSVWEP-QIVWGHAVSKDLIHWRHLPPALVPDQWYDIKGVLTGSITVLPDG-KVILLYTGNT—ETFAQVTCLAEPADPSDPLLREW 242 Acr-6SFT QRSSYHFQPAKNYM SDPDGL LYYGGWYHMFYQYNPVGTDWAD---GMAWGHAVSRNLVQWRTLPIAMKPDQWYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGATN-DWYVEATCLALPADPNDPLLRRW 207 Hv-6SFT QRSGYHFQTAKNYM SDPNG LMYYRGWYHMFYQYNPVGTDWDD---GMEWGHAVSRNLVQWRTLPIAMVADQWYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGATN-ASAVEVQCIATPADPNDPLLRRW 206 Cs-1FFT ERTAFHFQPAKNFI YDPNG PLFHMGWYHLFYQYNPYAPFWG----NMTWGHAVSKDMINWFELPIALAPTEWYDIEGVLSGSTTILPDG-RIFALYTGNT—NDLEQLQCKAVPVNASDPLLVEW 208 Ci-1FFT ERTAYHFQPAKNFI YDPNG PLFHMGWYHLFYQYNPYAPIWG----NMSWGHAVSKDMINWFELPVALTPTEWYDIEGVLSGSTTALPNG-QIFALYTGNA—NDFSQLQCKAVPLNTSDPLLLEW 209 Lp-1FFT QRTGFHFQPEKN WM NDPNG PVYYKGWYHLFYQYNPEGAIWGN---KIAWGHAVSRDMLRWRHLPIAMFPDQWYDINGAWSGSATVLPDG-RIVMLYTGST—NASVQVQCLAFPSDPSDPLLTNW 245 Ac-6GFT QRCGFHFRTVRNYM NDPSG PMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWG----NITWGHAVSRDLINWQHLPVAVGPDHWYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGT—KSFDQSINLAEAADPSDPLLLKW 190 Ao-6GFFT QRAGFHFRTVKNYM NDPSG PMYYKGWYHLFYQHNPNYAYWG----DISWGHAVSRDLLNWFHLPVAVKPDRWYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGT—KEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEW 187 Ac-Inv QRTGFHFQPVKN WM NDPNG PLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWG----NIAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW 269 Ao-Inv QRTGFHFQPEKN WM NDPNG PLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWG----DIAWGHAVSKDLLSWRHLPLAMVPDRWYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADLSDPLLLEW 237 Dc-Inv QRTSFHFQPQEN WM NDPNG PLFHMGWYHLFYQYNPDSAIWG----NITWGHAISRDLINWLHLPFAMQPDQWYDINGVWTGSATILPDG-KIVMLYTGDT—DDLVQVQNLAYPANLSDPLLLDW 250 Zm-Inv LRTGYHFQPPKN WI NDPNA PMYYKGWYHFFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPALRPSIPGDRYGCWSGSATVLPDGGGPVIMYTGVDHPDINYQVQNVAYPKNVSDPLLREW 173 Ci-1FEH YRTGFHFQPPKN WI NDPNG PMYFNGVYHLFYQYNPYGPLWG----NISWGHSISYDLVNWFLLEPALSPKEPYDINGCLSGSATILPGP-RPIILYTGQDVNNS—QVQNLAFPKNLSDPLLKEW 161 Cr-1FEH YRTGYHFQPPQN WM NDPNG PMYYKGVYHFFYQYNPNGPLFGD---IMIWGHSVSYDLVNWIHIDPAIYPTDPADINSCFSGSATFLPGY-KPVMLYTGLDTEKR—QVQNLAVPKNLSDPFLREW 166 Lp-FEH YRTAYHFQPPKN WI NDPNG PMYYNGIYHEFYQYNPNGSLWG----NIIWGHSVSTDLINWIPVEPAIERDIPSDISGCWTGSATIISGD-QPIIIYTG-ADKENR-QLQNIVLPKNKSDPYLREW 163 Hv-1&6FEH YKTAFHFQPAKN WM NDPSG PMYFNGIYHEFYQYNLNGPIFG----DIVWGHSVSTDLVNWIGLEPALVRDTPSDIDGCWTGSVTILPGG-KPVIIYTG-GNIDQH-QTQNIAFPKNRSDPYLREW 183 Ta-6KEH YRTAYHLQPPKN WI NDPCG PMYYNGIYHEFYQYNPDGSFNPNTSYNIVWGHSVSTDLVNWITLEPAIEPDTPNDIKGCWSGSATIVSGD-QPVIIYTGVIDIEKH-QVQNIALPKNRSDPYLREW 177 Bv-6FEH YRTAYHFQSPKN WM NDPNG PMIYKGIYHLFYQYYPYDPVWHT---EIVWGHSTSTDLINWTQQPIALSPSEPYDINGCWSGSITILPQN-KPVILYTGINNKNY—QVQNLALPKNLSDPYLKEW 176 Ta-CWI LRTGYHFQPPKH WI NDPNG PMYYKGLYHLFYQYNPKGAVWG----NIIWAHSVSTDLVDWVALEPGIYPSKPFDINGCWSGSATILPNG-VPVIMYTGIEPKET—PSAERRVPGQPLRPFLRKW 162 Zm-CWI LRTGYHFQPPMN WI NDPNA PLYYKGWYHLFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPAIYPSIPSDKYGCWSGSATILEDG-TPAILYTGIDRADINYQVQVLALPKDASDPLLREW 173 ...... *.*: * ::: * .: * . :* : :::* . : . * *

169 At-FEH VKP-DYNPIIA---PV-NGINASAFRDPTTAWHGPD-GHWRLVIGSKRK----HRGMAIMYRSRDFINWIRAKHPLHSANG-TGM WECI ------192 At-Inv KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGM WECV ------154 At-FT IKYDA-NPVLH----PPRGIGLKDFRDPNPVWYNSLESTWYVVAGSKNDSL-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLH-AVDIVGM WECV ------198 Ci-1SST KKYEG-NPILF----PPPGVGYKDFRDPSTLWMGP-DGEWRMVMGSKHNETI---GCALVYRTTNFTHFELNEEVLH-AVPHTGM WEC VD LYPVSTTHT 326 Ht-1SST KKYEG-NPVLL----PPPGVGYKDFRDPSTLWSGP-DGEYRMVMGSKHNETI---GCALIYHTTNFTHFELKEEVLH-AVPHTGM WECVD LYPVSTVHT 314 Ac-1SST KKSNG-NPILM----PPPGVGPHDFRDPFPVWYNESDSTWHMLIGSKDD---NHYGTVLIYTTKDFETYTLLPDILHKTKDSVGM LECVD LYPVATTGN 310 Ta-1SST VKHPA-NPVVF----PPPGIGMKDFRDPTTAWFDESDGTWRTIIGSKNDSD--HSGIVFSYKTKDFLSYELMPGYMYRGPKGTGE YECID LYAVGGGRK 346 Acr-6SFT TKHPA-NPIIW----SPPGIGTKDFRDPMTPWYDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVEN-TGE WECID FYPVGGGG- 307 Hv-6SFT TKHPA-NPVIW----SPPGVGTKDFRDPMTAWYDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVR-TGE WECID FYPVGRRS-- 302 Cs-1FFT VRYDA-NPILY----APSGIGLTDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIIGTKRNTT----GLVLVYHTTDFTNYVMLDEPLH-SVPNTDM WECVD LYPVSTTNDS 308 Ci-1FFT VKYEN-NPILF----TPPGIGLKDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIMGTKINRT----GLVLVYHTTDFTNYVMLEEPLH-SVPDTDM WECVD LYPVSTINDS- 309 Lp-1FFT TKYEG-NPVLY----PPPHVGEKDFRDPTTAWYDGSDGMWRIVIGSKDNRR---AGMALTYKTKNFHDFELVPGVLHRVPA-TGM WECID LYPVGGARGID 353 Ac-6GFT IKYDN-NPILW----PPPGIVRDDFRDPNPIWYNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLH-SVDKVGM WECVE VYPVATTGPL- 302 Ao-6GFFT VKYDEVNPVLR----PPPGIGLTDFRDPNPIWYNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLH-SVDHVGM WECVD LFPVASSGPL- 297 Ac-Inv KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGM WECVD FYPVATADSSH 376 Ao-Inv TKVDDANPILV----PPPGVGATDFRDPTTAWFEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLH-TVKHVGM WECID FYPIATSGAG- 344 Dc-Inv IKYPD-NPVMF----PPPGIGSTDFRDPTTAWIGP-DGKWRITIGSKVNKT----GISLMYKTTDFITYELLDNLLH-AVPGTGM WECVD FYPVSVTVSN- 350 Zm-Inv VKP-SHNPVIV---PE-GGINATQFRDPTTAWRGPGPEQWRLLVGSAAGSS-PPRGVAYVYRSRDFRRWRRVRRPLHSAP--TGM WECPD FYPVSKGGAPR 282 Ci-1FEH IKW-SGNPLLT--PVDD--IKAGQFRDPSTAWMGPD-GKWRIVIGSEID----GHGTALLYRSTNGTKWIRSKKPLHFSSK-TGM WECPD FYPVTNGDKKG 261 Cr-1FEH VKH-KANPIMT-TPEG---VKADDFRDPSTAWLGYD-GKWRVLVGSKKN----DLGVAYLYQSKDFVKWERFDYPLMSMME-TST WECPD FFPVSVSSTNG 267 Lp-FEH TKA-GNNPVIQ---PVGPGLNASQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAELN----GYGAALLYKSQDFLNWTRVDHPLYSSNA-SSM WECPD FFAVLPGNSGG 265 Hv-1_6FEH IKA-ANNPVLR---PDEPGMNVIEFRDPTTGWIGPD-GHWRMAVGGELN----GYSAALLYKSEDFLNWTKVDHPPYSHNG-SNM WECPD FFAALPGNNGG 285 Ta-6KEH TKA-GNNPVIQ---SGVPGLNSGQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAQLN----GYGAALLYKSEDFLNWTRVDHPLYSSNA-SIM LECLD FFAVLPGSNNG 280 Bv-6FEH IKL-PQNPLMAGTPTNNNNINASSFRDPSTAWQLSD-GKWRVIVGTQQG----KRGLAVLFTSDDFVKWNNTGNPLHSTEG-NGI WECPD FFPVYVGKSLG 280 Ta-CWI VKP-DYNPIIN---PD-HGINASAFRDPTTAWYGPD-GHWRLVVGSKEN----MRGIAVLYRSRDFRRWIKAHHSLHAG-L-TGM WECPD FYPVAVAGGRR 271 Zm-CWI EKPEEYNPVAT---PAAGGINATQFRDPTTAWRHAG--HWRMLVGSVRG----ARGMALVYRSRDFRKWTKAKHPLHSAAL-TGM WECPD FFPVS-GPGLQ 275 : **: : :*** . * * . : : : **

Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos. Se muestra únicamente el alineamiento en la región donde el ADNc fue amplificado. *, indica que los residuos son idénticos; :, indica que hay una sustitución conservada y ., indica la existencia de un sustitución semi-conservada. Las abreviaturas son como se indica en la Tabla 23.

170 L. perenne β β β [ ] Agropyron crystatum β Chenopodium rubrum

171 ↓ 3.4. AMPLIFICACIÓN DEL ADNc COMPLETO DE LA FRUCTOSILTRANSFERASA (atft ) 3.4.1. AMPLIFICACIÓN DE LOS EXTREMOS TERMINAL 5´ Y 3´ atft ´´ atft ´ Figura 59. Amplificación rápida de los extremos del ADNc de atft mediado por la RNA ligasa (RACE).A) i ii iii ´´ Bsh ´↓´ i B) atft C) ´ ´ Not ´ ↓´

172 173 ´ ´´ ´´ E. coli α Not ´ ↓´ Bsh ´↓´ 3.4.2. DETERMINACIÓN DE LA ORIENTACIÓN DE LOS INSERTOS EN EL VECTOR ´´ Bsh Sal ´↓´ ´´´´ →´ Sal Bsh ∼ ∼´ ←´

174

Figura 60. Orientación de los insertos At5´- y At3´-RACE en el vector pGEM-T Easy. A) B) ´´ Sal Bsh C) ´´

175 ∼ ∼ → ∼ ∼ ← ∼ ∼ ´´ Sal Bsh ´ ∼ ´ ∼ ´ ´ ←´´´ →´

3.4.3. LIGACIÓN DEL ADNc COMPLETO DE atft ´´ ´ Not Bsh Not Bsh 1 2 3 Not Bsh ´ →´ 2 3 ´ Bsh Sal 4 ∼ 5 ∼ Bsh Sal Not ´ ´´ Not Sal

176 Not Sal Not Bsh Sal Bsh ´´ E. coli α

Figura 61. Estrategia de clonación para la obtención del plásmido pGEM-T atft ´´ A. tequilana

177

Figura 62. Digestión y análisis de restricción. A) Distintas clonas del plásmido pGEM- T At5´RACE digeridas con Not I y Bsh TI; clonas del plásmido pGEM-T At3´RACE digeridas con Sal I y Bsh TI; el vector pGEM-T que contiene 15 pb de la región empalmada (proveniente de la digestión de At3´-RACE) digerido con Not I; B) Análisis de restricción de distintas clonas del plásmido pGEM-T atft digeridas con Not I. Not

3.5. ANÁLISIS DE LA SECUENCIA atft atft ´ ´ ´ ´ atft atft

178

Figura 63. Árbol filogenético sin raíz de enzimas del metabolismo de fructanos. Las secuencias analizadas corresponden a proteínas inmaduras traducidas a partir de su ADNc. Las secuencias fueron alineadas con el programa clustal W (http//www.ebi.ac.uk/clustalW) y el programa TREEVIEW fue utlizado para crear el árbol filogenético.

179 L. perenne

3.5.1. USO DE CODONES DEL ADNc DE atft atft Agave tequilana atft 3.5.2. IDENTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA MADURA α atft α

180 Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft . 1era posición 2a Posición 3era posición (extremo 5´) (extremo 3´) T C A G T T C Phe 20 Tyr 27 Cys 4 Alto 1 A Trp 18 G

C T C His 20 A G Leu 64 Pro 35 Glc 16 A T C Asn 25 Ser 44 A Ile 27 Met 9 G Thr 41 Lys 23 Arg 27 G T C Asp 38 A G Val 56 Ala 54 Glu 34 Gly 53

∼ ∼ [ ]

181

Figura 64.- Predicción del péptido señal en AtFT. A) B)

182

Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT.

183 ↓ AtFT -MGSQ---DVESARSLHAPIVG------SPPPRRTLTLRSLSLALSVVAFLLAAALLLSKSGSVPNPNQGL 61 Ac-6GFFT -MDAQ---DIESR----HPLIG------ARPRRR--ALRSLSILLAAALLLGLVLFYANGTGSGTAVD--- 52 Ao-6GFFT ----M---ATSLQ----APILG------SRPPRR--TLRFLSFALFSALVLVVASFSSRKSESGSGLR--- 49 Hv-6SFT -MGSH---GKPPLPYAYKPLPS---DAADGK----RTGCMRWSACATVLTASAMAVVVVGATLLAGLRMEQAVD- 64 Acr-6SFT -MGSHTMPGKPPLPYAYKPLLSGTTDEANGQ----RTGCTRRRVCAAMLTASAMVVVVVAAAFLARARVDKVVN- 69 Ci-1SST -MASS------TTATTPLILRDETQICPQLAGSPVGRRLSMANVLSGILVFVLVICVLVAVIHDQSQQIMATN-- 66 To-1SST -MASS------TTAATPLILHND------STPRRRLSLAKLLSGIPVAVLVIFALVTVILNQSQHTSATGNI 59 Lp-1FFT -MESR----SIPGAYAYEPLPHSS-DDAHGHDDRRSAGGVRWRACAAVLAASALVVFVVAST-LAGSRVDRVAVD 68 Ac-Inv -MSSD---DLESPPSSYLPIPPSD---EFHDQPPPLRS--WLRLLSIPLALMFLLFLATFLSNLESPPSDSGLVS 66 Ao-Inv MASSR---DVESPPTSYAPLPSDD---EQRPGSAPPRS--RLRLIAIAMPPILLLALAAALF-LSGSGAVTDLVA 66 : : : .

AtFT ------DAILAPLPQSGAGL GEE----DYPF 82 Ac-6GFFT ------PVRVD N----EFPW 62 Ao-6GFFT ------SGSVEP----EYAW 59 Hv-6SFT ------EEAA AGGFPW 73 Acr-6SFT ------EEAAGG-FPW 78 Ci-1SST ------NHQGGDKPTSAATFTAPLLQVDLKRVPGKLE 97 To-1SST ------DFHGGDKPSSDTTFTE-MVPEELKQVLIKLE 90 Lp-1FFT VAAMPALSETARSRGK------DAGVSEKTSGAADEMGFLGAGSGAD ADGFPW 115 Ac-Inv DPVTFDVNPAVVRRGKDAGVSDKTSGVDSGFVLDPVAVDANSVVVHRGKDAGVSDKTSGVDSGLLKDSPLGPYPW 141 Ao-Inv GPSP-DTMPEIVR------TDRGVEEGVSSKSSGAGPGLLTSVSHGQYPW 109

I II III AtFT TTKMLQWQ HTGF HF QPPRYFMSDPSG PVYYK GWHHFFYQHN AKAAFWGN-IA WGHAASRDLL NWVHLPLAVEPDH 156 Ac-6GFFT TNDMLAWQ RCGF HF RTVRNYMNDPSG PMYYK GWYHLFYQHN KDFAYWGN-IT WGHAVSRDLI NWQHLPVAVGPDH 136 Ao-6GFFT TNQMLTWQ RAGF HF RTVKNYMNDPSG PMYYK GWYHLFYQHN PNYAYWGD-IS WGHAVSRDLL NWFHLPVAVKPDR 136 Hv-6SFT SNEMLQWQ RSGY HFQTAKNYMSDPNG LMYYR GWYHMFYQYN PVGTDWDDGME WGHAVSRNLV QWRTLPIAMVADQ 148 Acr-6SFT SNEMLQWQ RSSY HFQPAKNYMSDPDG LLYYG GWYHMFYQYN PVGTDWADGMA WGHAVSRNLV QWRTLPIAMKPDQ 153 Ci-1SST SNADVEWQ RSAY HFQPDKNFISDPDG PMYHM GWYHLFYQYN PESAIWGN-IT WGHSVSRDMI NWFHLPFAMVPDH 171 To-1SST SNAGVEWE RSAY HFQPDKNFISDPDG PMYHM GWYHLFYQYN PESAIWGN-IT WGHSISRDMI NWFHLPFAMVPDH 163 Lp-1FFT SNAMLQWQ RTGF HFQPEMNWMNDPNG PVYYR GWYHLFYQYN PEGAVWGN-IA WGHAVSRDLV HWRHLPLAMVPDQ 189 Ac-Inv TNQMLSWQ RTGF HFQPVKNWMNDPNG PLYYK GWYHFFYQYN PEGAVWGN-IA WGHAVSRDLV HWTHLPLAMVPDQ 215 Ao-Inv TNKMLSWQ RTGF HFQPEKNWMNDPNG PLYYK GWYHFFYQYN PNAAVWGD-IA WGHAVSKDLL SWRHLPLAMVPDR 183 :. : *:: .:**:. ::.**.* :*: ****:***:* : * : : ***: *:::: * **.*: .*:

AtFT WYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSDPLLMEWIKYDA-NPVLHPPRGIGLK DF 229 Ac-6GFFT WYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGT--KSFDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRD DF 207 Ao-6GFFT WYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGT--KEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEWVKYDEVNPVLRPPPGIGLT DF 206 Hv-6SFT WYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGAT-NASAVEVQCIATPADPNDPLLRRWTKHPA-NPVIWSPPGVGTK DF 220 Acr-6SFT WYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGAT-NDWYVEATCLALPADPNDPLLRRWTKHPA-NPIIWSPPGIGTK DF 225 Ci-1SST WYDIEGV MTGSATVLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYK DF 242 To-1SST WYDIEGV MTGSATMLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYK DF 234 Lp-1FFT WYDINGVWTGSATVFPDG-QIIMLYTGNA--YDLAQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYK DF 260 Ac-Inv WYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRWKKSE-ANPILVPPPGIGDK DF 286 Ao-Inv WYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDANPILVPPPGVGAT DF 255 **** * :** :..:. : *::** :. : :* . : .*.** .* * **:: .* *: **

IV v AtFT RDPNPVW YNSS ESTWYVVVGSK NDS L-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLHAVDIVGM WECVDLYPV ATAG-PL 302 Ac-6GFFT RDPNPIW YNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLHSVDKVGM WECVEVYPV ATTG-PL 280 Ao-6GFFT RDPNPIW YNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLHSVDHVGM WECVDLFPV ASSG-PL 279 Hv-6SFT RDPMTAW YDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVRTGE WECIDFYPV GRRS--- 292 Acr-6SFT RDPMTPW YDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVENTGE WECIDFYPV GGGG--- 297 Ci-1SST RDPSTLW MGP-DGEWRMVMGSKHN---ETIGCALVYRTTNFTHFELNEEVLHAVPHTGM WECVDLYPV STTHTNG 313 To-1SST RDPSTLW RGP-DGDWIMIMGSKHN---QTIGCALVYRTSNFTHFELSEEPLHAVPHTGM WECVDLYPV STTHTNG 305 Lp-1FFT1 RDPTTAW FDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGM WECIDFYPV GGK---- 329 Lp-FFT2 RDPTTAW FDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGM WECIDFYPV GGK---- 329 Ac-Inv RDPTTAW YEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILHAVERVGM WECVDFYPV ATADSSH 358 Ao-Inv RDPTTAW FEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLHTVKHVGM WECIDFYPI ATSG-AG 326 *** . * :: : .*:*. * *::* *.:* * ** * .* ***::.:*:.

184

VII VIII AtFT VGRALEN----SVPAGENVKHVLKAGLNDEW HDYYAIGTYD REANKWTPDDEIIDVGIGL RYDWGKFYAS RTFYD 373 Ac-6GFFT LHKAIDNFDVDRVLDRSTVKHVLKASMNDEW HDYYAIGTFD PIGNKWTPDDETVDVGIGL RYDWGKFYAS RTFFD 355 Ao-6GFFT IGRGLD----RSMMLADNVKHVLKASMNDEW HDYYAIGSYD VATHRWVPDDESVDVGIGM RIDWGKFYAS RTFYD 350 Hv-6SFT ------SDNSSEMLHVLKASMDDER HDYYSLGTYD SAANTWTPIDPELDLGIGL RYDWGKFYAS TSFYD 355 Acr-6SFT ------SENSSEVLHVLKASMDDER HDYYSLGTYD SAANIWTPIDPELDLGIGL RYDWGKFYAS TSFYD 360 Ci-1SST LDMK------DNGPNVKYILKQSGDEDR HDWYAVGTFD PEKDKWYPDDPENDVGIGL RYDYGKFYASKTFYD 379 To-1SST LDMM------DNGPNVKYILKQSGDEDR HDWYAIGSFD PINDKWYPDDPENDVGIGL RYDYGKFYASKTFYD 371 Lp-1FFT ------NGSEELYVIKESSDDDR HDWYTLGKYD AAANTFTAADPENDLGIGL RYDWGKFYATKTFYD 390 Ac-Inv ANHGLDP----SARPSPAVKHVLKASMDDDR HDYYAIGTYD PAQNTWVPDDASVDVGIGL RYDWGKFYASKTFYD 429 Ao-Inv ANRGLDP----SVRPSKLVKHVLKESSDDDR QDWYAIGTYD PDTNKWTPDDESLDVGIGL RYDLGKFYASKTFYD 397 . :::* . ::: :*:*::*.:* . : . * *:***:* * *****: :*:*

AtFT PVKQRRVLWGYVGETDSREVDIRKGWASVEGLARTVLFDEKTGTNLLTWPVEEVESLRMT-SK NFS NVIISPGTT 447 Ac-6GFFT PLKQRRIIWGYIGEVDSQKADIAKGWASLQGIPRSVLYDVKTGTNVLTWPIEEMEGLRMA-RKDFSGIKIKKGST 429 Ao-6GFFT PVKERRVMWGYVGETDSGDADVAKGWASFQGIPRTVLFDVKTGTNVLTWPIEEVESLRMT-RKDFSDIVVNKGST 424 Hv-6SFT PAKNRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTVALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELTDVTINTGSV 429 Acr-6SFT PAKKRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTIALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELSDVTLNTGSL 434 Ci-1SST QHQKRRVLWGYVGETDPPKSDLLKGWANILNIPRSVVLDTQTGTNLIQWPIEEVEKLRSTKYDEFKDVELRPGSL 454 To-1SST QHKSRRVLWGYVGETDPPKDDLLKGWANMLNIPRTIVLDTVTGTNLIQWPIDEVENLRSKKYDEFKDVELRPGSI 401 Lp-1FFT PAKNRRVLWGWIGETDSERADVAKGWASLMSIPRTVELDEKTRTNLIQWPVEELETLRIK-STDLGGVTIDHGSV 464 Ac-Inv HAKKRRILWSWIGETDSETADIAKGWASLQGVPRTVLLDVKTGSNLITWPVVEIESLRTR-PRDFSGITVDAGST 503 Ao-Inv QEKKRRVLWGWIGESDSESADILKGWASLQGIPRTVLYDLRTGSNLITWPIEEVESLRSN-LHDFSGITIDKGST 471

:.**:: .::** *. *: ****.. .:.*:: * * :*:: **: *:* ** :: .: : *:

AtFT VQL-DIGDANQLDIVAEFEIKKEELEAVIEA--DVTY NCS TSGGAATRGLLGPFGLLVLANED-LTEQTATYFYV 518 Ac-6GFFT VELSDFGDAFQIDIEAEFTISKEALEATIEA--DVGYNCSSSGGAAIRGTLGPFGLLVLANQD-LTENTATYFYV 501 Ao-6GFFT VEL-HVGDANQLDIEAEFEMDKDALETAIEA--DIGYNCSSSGGAVSRGVLGPFGLFVLANQD-LTELTATYFYV 495 Hv-6SFT IHI-PLRQGTQLDIEASFHLDASAVAALN EA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEQTAVYFYV 501 Acr-6SFT VHV-PLRQGTQPDIEATFHLDAAAVAALNEA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEKTAVYFYV 506 Ci-1SST VPL-EIGTATQLDISATFEIDQKKLQSTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAN-RSEQLPVYFYI 525 To-1SST IPL-EIGSATQLDIMATFEIDEKMLESTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAK-RSEQLPVYFYI 517 Lp-1FFT YPL-PLHRATQLDIEASFRIDTATVAALNEA--DVGYNCSTSGGSANRGALGPFGLLVLADG--KAEQTAVYFYV 534 Ac-Inv FKL-DVGGAAQLDIEAEFKISSEELEAVKEA--DVSYNCSSSGGAAERGVLGPFGLLVLANQD-LTEQTATYFYV 574 Ao-Inv FHL-DVHGAAQLDIEAEFKINEESLSAEAENGTGVMYNCSGGGGAAERGLLGPFGLLVLANSD-LTEQTAAYFYV 485

: . . * ** * * :. : : * .: :**: . *:. ** *****:.*** . * ..***:

AtFT GRGTDGSLQTHLCQDELRSSKAYNIVKRVVGHTVPVLAGEMLSLRILVDHSIVESYAQGGRASTTSRVYPTEAIY 593 Ac-6GFFT SKGIDGSLITHFCQDETRSSKANDIVKRVVGGTVPVLDGETFAVRILVDHSVIESFAMGGRTSATSRAYPTEAIN 576 Ao-6GFFT SRATDGSLHTHLCHDEMRSSKANDIVKRVVGGTFTVLDGELLSLRILVDHSIVESFAQGGRTSATSRVYPTEAIY 570 Hv-6SFT SRGLDGGLHTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLDGEALSMRVLVDHSIV QGFDMGGRTTMTSRVYPMES-Y 575 Acr-6SFT SRGLDGGLQTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLGGEAFSMRVLVDHSIV QGFAMGGRITMTSRVYPMEA-Y 580 Ci-1SST AKDTDGTSKTYFCADESRSSTDKDVGKWVYGSSVPVLGGENYNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY 600 To-1SST AKNTDGSSKTYFCADESRSSMDKSVGKWVYGDSVPVLEGEKHNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY 592 Lp-1FFT AKGLDGTLQTHFCHDESRSTLARDVVKRVVGYTVPVLDGEAFSVRVLVDHSIVESFAMGGRSTATSRVYPTEAIY 609 Ac-Inv SRGMDGGLNTHFCQDEKRSSKASDIVKRIVGHSVPVLDGESFALRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY 649 Ao-Inv SRGVDGELQTHFCQDEMRSSKANDIVKSVVGGTVPVLKGETLSLRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY 604 .: ** * :* ** **: .: * : * :..** ** :*:*****:::.: *** ***.** ::

AtFT EGARVFLFN NAT AATVIGKSVKIWHM NST HDTICHYPSLKAQ------635 Ac-6GFFT SAARVFLFNNATGVDVIAESVKIWQMNSTYNDFYHF------612 Ao-6GFFT ERARVFLFNNATGATITAKAVKVWQMNSTSNQYYPFTSSN------610 Hv-6SFT QEARVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDDGMYLHQVLESRH 625 Acr-6SFT QEAGVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDAYMYVR------623 Ci-1SST GAAKIFLFNNATGISVKVS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS------640 To-1SST GAAKLFLFNNATGISVKAS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS------632 Lp-1FFT GAAGAYLFNNATGGSVTVEKLVVHEMDSSYNQIFMADDL------648 Ac-Inv NNARVFVFNNATGAKVTAQSLKVWHMSTAINEIYDPATSVM------690 Ao-Inv SSAKVFLFNNATGASITAQSLKIWHMNSTLSRPFDFNDGAQAQ------662 * ::*****. : . : : .* :

185

3.5.3. GLICOSILHIDROLASA 32 β [ ][ ] [ ][ ][ ][ ] β Festuca arundinacea

186 _ β Glucanacetobacter diazotrophicus Streptococcus salivarius Lolium perenne L. perenne

187

3.6. EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE atft Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris P. pastoris aox

3.6.1. CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR pGAPZ αααC-atft atft Cla Xba α

188 α E. coli Avr P. pastoris

3.6.2. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN ´ α S. cerevisiae P. pastoris α

189

Figura 66. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT excretada al medio extracelular. A) B) C) D)

190

Figura 67. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT contenida en la fracción celular. A) B) C) D)

191 L. perenne P. pastoris + + + atft L. perenne

3.6.3. IDENTIDAD DE LA AtFT

192 vs vs atft β β atft

193 P. pastoris atft

194 IX. CONCLUSIONES

• β α • • in vitro • • A. tequilana atft atft Pichia pastoris Asparagus officinalis y Allium cepa •

195 X. PERSPECTIVAS i).- ii ).- β iii ).- β iv ).-

196 v).- vi ).-

197 XI. APÉNDICES APÉNDICE A. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Reactivo revelador de carbohidratos: Solución Bradford (stock): Reactivo de Bradford (reactivo de trabajo):

Buffer McIlvaine: µ

Buffer de afinidad: µ

Buffer de intercambio aniónico: µ

Buffer de exclusión: Gel separador:  ´´ Gel concentrador:   Buffer de muestra: Solución de tinción: Solución de desteñido: Buffer de extracción de ADN: Buffer TE: Buffer TAE: Buffer de extracción de ARN:

198 Bromuro de etidio: µ Buffer de carga:

Buffer de transcripción: Buffer de PCR: Medio Luria Bertani:

Buffer de ligación 10 ×××: Buffer O +: Medio YPD:

199 APÉNDICE B. ANÁLISIS DE FRAGMENTACIÓN DE PMAA

β ft

200 α pt

201 fβ

202 fβ

203 + fβ → →

204 α pi

205 β f

206 APÉNDICE C. DESPLAZAMIENTOS QUÍMICOS DE 13 C-FRUCTANOS β β

Carbono Suc Suc 1-Kes 1-Kes 6-Kes 6-Kes 6G-Kes 6G-Kes 6G-Kes F1 F2 F3 F4 F5 F6 G1 G2 G3 G4 G5 G6

207

Carbono Nis FFGF FGFF Inulina Inulina Inulina C. intybus C. intybus H.tuberosus β β β F1 F2 F3 F4 F5 F6 G1 G2 G3 G4 G5 G6

208

Carbono P. sochifolia Levano Levano F. arundinacea P. peisonis P. pratense A. cepa T. aestivum β β β β β β F1 F2 F3 F4 F5 F6 G1 G2 G3 G4 G5 G6

209

Carbono A. repens A. officinalis Phormium C. australis U. maritima tenax/cookianum F1 F2 F3

210 F4 F5 F6 G1 G2 G3 G4 G5 G6

211 APÉNDICE D. SECUENCIAS AISLADAS

TAC CAT TTC CAG CCA CCG CGA AAT TGG ATC AAC GAT CCA Y H F Q P P R N W I N D P AAT GGA CCA ATG TAT TAT AAT GGC ATC TAC CAC CTC TTC N G P M Y Y N G I Y H L F TAT CAG TAC AAC CCC TAC GGT GCA GTG TGG GGC AAC ATT Y Q Y N P Y G A V W G N I GTG TGG GCC CAC TCA GTT TCA ACG GAC ATG ATC AAT TGG V W A H S V S T D M I N W AAG GCA CTC GAA CCC GCG ATC TAC CCG TCC AAA CCC TTT K A L E P A I Y P S K P F GAC GTT AAC GGG TGC TGG TCC GGG TCG GCT ACC ATC CTC D V N G C W S G S A T I L CCG GGT AAC AAA CCC GCC ATC CTC TAC ACG GGT ATC GAC P G N K P A I L Y T G I D CCG CAA AAC AGG CAG GTC CAA AAC ATT GCG TTC CCA AAA P Q N R Q V Q N I A F P K AAC CTG TCC GAC CCG TAT CTT CGC GAA TGG GTC AAA CCC N L S D P Y L R E W V K P GAT TAC AAC CCG ATA ATT GCC CCC GTC AAC GGG ATC AAC D Y N P I I A P V N G I N GCT AGT GCG TTC CGC GAC CCG ACA ACG GCC TGG CAC GGT A S A F R D P T T A W H G CCG GAC GGG CAC TGG AGG CTG GTG ATT GGG AGC AAG AGG P D G H W R L V I G S K R AAG CAC AGG GGG ATG GCC ATC ATG TAC CGG AGC CGG GAC K H R G M A I M Y R S R D TTT ATT AAC TGG ATC CGG GCG AAG CAC CCG TTA CAC TCT F I N W I R A K H P L H S GCT AAC GGT ACG GGT ATG TGG GAA TGC ATT A N G T G M W E C I

Secuencia At-FEH.

212 TGG GGC CAT GCT GTA TCC AGA GAC CTA GTC CAC TGG ACT W G H A V S R D L V H W T CAC CTA CCC CTA GCC ATG GTC CCA GAC CAA TGG TAC GAC H L P L A M V P D Q W Y D ATC AAC GGC GTC TGG ACC GGG TCG GCC ACC ATC CTA CCG I N G V W T G S A T I L P GAC GGC CAA ATC GTC ATG TTG TAC ACC GGG GCC ACC AAC D G Q I V M L Y T G A T N GAA TCG GTC CAA GTC CAG AAC TTA GCG GTC CCA GCA GAT E S V Q V Q N L A V P A D CAG TCC GAC ACG TTA CTC CTG AGA TGG AAG AAG TCC GAG Q S D T L L L R W K K S E GCC AAC CCC ATC CTG GTC CCT CCC CCA GGC ATA GGG GAC A N P I L V P P P G I G D AAG GAC TTC AGG GAC CCC ACC ACA GCA TGG TAC GAA CCT K D F R D P T T A W Y E P TCC GAC GAC ACA TGG CGC ATC GTG ATC GGC TCC AAG GAC S D D T W R I V I G S K D TCC TCC CAT AGC GGC ATC GCC ATC GTC TAC AGC ACC AAG S S H S G I A I V Y S T K GAC TTC ATC AAC TAC AAA CTC ATC CCT GGG ATC CTC CAT D F I N Y K L I P G I L H GCG GTG GAG CGG GTT GGT ATG TGG GAA TGC GTT A V E R V G M W E C V

Secuencia At-Inv.

213 TAC CAT TTC CAG CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC Y H F Q P P R Y F M S D P AGC GGT CCC GTG TAC TAC AAG GGT TGG TAC CAT TTC TTC S G P V Y Y K G W Y H F F TAC CAA CAC AAT GCA AAA GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT Y Q H N A K A A F W G N I GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT GAC CTC CTC AAC TGG A W G H A A S R D L L N W GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG GAA CCG GAC CAT TGG TAT V H L P L A V E P D H W Y GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC TCA GTT GCG GTA TTA D I E G D W T G S V A V L CCT GAT GGT CGG GTC ATA ATG CTA TTC ACT GGT GGT ACC P D G R V I M L F T G G T GGT GCG AAT GAG CTG GCA CAG GTC GTC AAT CTT GCG GTG G A N E L A Q V V N L A V GCT GCC GAT CCC TCG GGT CCA CTC CTG ATG GAA TGG ATC A A D P S G P L L M E W I AAG TAT GAT GCA AAC CCA GTG CTG CAT CCT CCG CGT GGC K Y D A N P V L H P P R G ATC GGC CTC AAG GAC TTC AGG GAC CCC AAT CCA GTC TGG I G L K D F R D P N P V W TAT AAC TCA TTA GAA TCC ACA TGG TAC GTA GTG GCT GGC Y N S L E S T W Y V V A G TCC AAG AAT GAT TCA TTA TCC CAC ACT GGT ATT GCT CTT S K N D S L S H T G I A L GTT TAC ACC ACC AAA GAC TTT CTC TCC TAC ACT CTC CTC V Y T T K D F L S Y T L L CCC GGT GTC CTC CAC GCT GTT GAT ATT GTC GGC ATG TGG P G V L H A V D I V G M W GAG TGC GTT GA E C V

Secuencia At-FT.

214

TGCGTTTGCTGGCTTTG ATGAAAGTGTCTCAACCCTTCACCCATTTTCTTCACTTGGTCG M K V S Q P F T H F L H L V GGTGTTATTACGCTCACCGGCGGTGA CCTCACCACC ATG G GC TCG CAG GAC G C Y Y A H R R Alto M G S Q D GTC GAG TCT GCT CGC TCG CTG CAC GCC CCC ATC GTC GGT TCC CCT V E S A R S L H A P I V G S P CCT CCG CGG AGG ACG TTA ACG TTA AGA TCA CTC TCC CTC GCC CTG P P R R T L T L R S L S L A L TCC GTC GTC GCC TTC CTC CTT GCT GCG GCC CTT TTA CTC AGT AAG S V V A F L L A ⇓⇓⇓ A A L L L S K TCG GGT TCG GTT CCG AAC CCG AAT CAA GGA CTG GAT GCA ATA TTG S G S V P N P N Q G L D A I L GCT CCA TTA CCG CAA TCG GGT GCG GGT TTG GGT GAG GAG GAC TAC A P L P Q S G A G L G E ↓↓↓ E D Y CCG TTT ACC ACT AAG ATG CTG CAG TGG CAG CAC ACC GGG TTC CAT P F T T K M L Q W Q H T G F H TTC CAA CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC AGC GGT CCC GTG F Q P P R Y F M S D P S G P V TAC TAC AAG GGT TGG CAC CAT TTC TTC TAC CAA CAC AAT GCA AAA Y Y K G W H H F F Y Q H N A K GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT A A F W G N I A W G H A A S R GAC CTC CTC AAC TGG GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG GAA CCG GAC D L L N W V H L P L A V E P D CAT TGG TAT GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC TCA GTT GCG GTA H W Y D I E G D W T G S V A V TTA CCT GAT GGT CGG GTC ATA ATG CTA TTC ACT GGT GGT ACC GGT L P D G R V I M L F T G G T G GCG AAT GAG CTG GCA CAG GTC GTC AAT CTT GCG GTG GCT GCC GAT A N E L A Q V V N L A V A A D CCC TCG GAT CCA CTC CTG ATG GAA TGG ATC AAG TAT GAT GCA AAC P S D P L L M E W I K Y D A N CCA GTG CTG CAT CCT CCG CGT GGC ATC GGC CTC AAG GAC TTC AGG P V L H P P R G I G L K D F R GAC CCC AAT CCA GTC TGG TAT AAC TCA TCA GAA TCC ACA TGG TAC D P N P V W Y N S S E S T W Y GTA GTG GTT GGC TCC AAG AAT GAT TCA TTA TCC CAC ACT GGT ATT V V V G S K N D S L S H T G I GCT CTT GTT TAC ACC ACC AAA GAC TTT CTC TCC TAC ACT CTC CTC A L V Y T T K D F L S Y T L L CCC GGT GTC CTC CAC GCC GTT GAT ATT GTC GGC ATG TGG GAG TGT P G V L H A V D I V G M W E C GTC GAT CTC TAT CCC GTA GCA ACT GCA GGT CCT TTA GTT GGC CGG V D L Y P V A T A G P L V G R GCT CTT GAA AAT TCG GTG CCA GCC GGA GAA AAC GTT AAA CAT GTG A L E N S V P A G E N V K H V TTG AAA GCA GGC TTG AAT GAC GAG TGG CAT GAT TAC TAT GCG ATC L K A G L N D E W H D Y Y A I

215 GGG ACG TAT GAT CGA GAA GCA AAC AAA TGG ACC CCG GAT GAT GAG G T Y D R E A N K W T P D D E ATT ATT GAC GTC GGA ATT GGG TTG AGA TAT GAT TGG GGC AAA TTT I I D V G I G L R Y D W G K F TAC GCG TCA AGG ACG TTT TAC GAT CCT GTA AAA CAG AGG AGG GTG Y A S R T F Y D P V K Q R R V CTA TGG GGG TAT GTT GGG GAA ACT GAT AGT AGG GAA GTT GAC ATT L W G Y V G E T D S R E V D I CGG AAG GGT TGG GCT TCA GTC GAG GGC CTT GCG CGA ACA GTG TTG R K G W A S V E G L A R T V L TTT GAC GAA AAA ACA GGG ACC AAC CTC CTC ACT TGG CCA GTT GAG F D E K T G T N L L T W P V E GAG GTG GAA AGC CTC AGG ATG ACC AGC AAA AAT TTC AGC AAC GTG E V E S L R M T S K N F S N V ATC ATC AGC CCG GGA ACC ACT GTC CAG CTC GAC ATT GGT GAT GCG I I S P G T T V Q L D I G D A AAT CAG CTG GAC ATA GTT GCC GAG TTT GAG ATT AAA AAA GAG GAA N Q L D I V A E F E I K K E E CTT GAG GCT GTC ATC GAG GCC GAT GTC ACC TAC AAC TGC AGC ACC L E A V I E A D V T Y N C S T AGC GGT GGT GCT GCC ACC CGA GGC CTG CTT GGA CCT TTT GGT CTG S G G A A T R G L L G P F G L CTT GTG CTT GCA AAT GAG GAT CTC ACT GAG CAG ACT GCG ACC TAC L V L A N E D L T E Q T A T Y TTT TAT GTT GGT AGG GGA ACT GAT GGC AGT CTG CAG ACT CAC TTG F Y V G R G T D G S L Q T H L TGC CAG GAT GAA TTG AGG TCA TCC AAG GCC TAC AAC ATC GTT AAG C Q D E L R S S K A Y N I V K AGG GTG GTA GGG CAC ACG GTT CCG GTG CTT GCT GGT GAA ATG TTG R V V G H T V P V L A G E M L TCT TTA AGA ATA CTG GTG GAT CAC TCA ATT GTG GAG AGC TAT GCT S L R I L V D H S I V E S Y A CAA GGA GGT AGG GCA TCC ACC ACA TCT CGC GTG TAC CCA ACT GAA Q G G R A S T T S R V Y P T E GCA ATC TAT GAG GGG GCA CGA GTC TTT CTC TTC AAC AAC GCG ACT A I Y E G A R V F L F N N A T GCA GCC ACT GTG ATC GGC AAG AGT GTG AAG ATA TGG CAT ATG AAC A A T V I G K S V K I W H M N TCC ACA CAC GAC ACT ATC TGT CAC TAC CCC AGC CTG AAA GCT CAA S T H D T I C H Y P S L K A Q TGA GACACTCAAAACTCCATATTCTATGTGTTATTGTTGTCATTATCATTGATTGGCAT Alto GTTTCATTTAAGAGGACAATGTATCCGAGTTATATCGGTCCGTTGATGTTTCTCGAGTTC GAGCAGCTATAGCTCATATTCCTTCACTTTGAAGGTTGGTGTTTGCAGTACGATATGCAC CATTTCTAGTAGAAAATATCCTGGTTGATAATGCCTAAAAAAAAAA

Secuencia AtFT. ⇓ ↓´´ ´

216 XII. REFERENCIAS

Addison, R.F.; Ackman, R.G. J. Gas Chromatogr Alberto, F.; Bignon, C.; Suizenbacher, G.; Henrissat, B.; Czjzek, M. β Thermotoga maritima J. Biol. Chem. Altenbach, D.; Nüesch, E.; Meyer, A.D.; Boller, T.; Wiemken, A. FEBS Lett. Amiard, V.; Morvan-Bertrand, A.; Billard, J.P.; Hault, C.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne − J. Exp. Bot Amiard, V.; Morvan-Bertrand, A.; Billard, J.P.; Hault, C.; Keller, F.; Prud´homme, M.P. Plant Physiol. Anderson, K.; Li, S.C.; Li, Y.T. Anal. Biochem Archer, B.J.; Johnson, S.K.; Devereux, H.M.; Baxter, A.L. Br. J. Nutr. Asega, A.F.; Machado de Carvalho, M.A. Vernonia herbacea Plant Physiol. Biochem. Aspinall, G.O.; Das Gupta, P.C. Agave vera cruz Hirst Proc. Chem Soc Backstrand, J.R.; Allen, H.L.; Black, A.K.; de Mata, M.; Pelto, G.H. Am. J. Nutr Bancal, P.; Gibeaut, D.M.; Carpita, N.C. Science and technology of fructans Bais, H.P.; Ravishankar, G.A. Cichorium intybus J. Sci. Food Agric Barredo-Pool, F.A.; Piven, M.M.; Borges-Argáez, I.C.; Herrera, J.L.; Castillo, J.A.; Herrera, G.; Robert, M.L. Agave fourcroydes IV Simposio internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae. Los Agaves de importancia económica en México Batista, F.R.; Hernández, L.; Fernández, J.R.; Arrieta, J.; Menéndez, C.; Gómez, R.; Támbara, Y.; Pons, T. Acetobacter diazotrophicus Biochem. J Bautista-Justo, M.; García-Oropeza, L.; Barboza-Corona, J.E.; Parra-Negrete, L.A. Agave tequilana Acta Universitaria Bendtsen, J.D.; Nielsen, H.; von Heijen, G.; Brunak, S. J. Mol. Biol. Bertrand, A.; Castonguay, Y.; Nadeau, P.; Laberge, S.; Michaud, R.; Bélanger, G.; Rochette, P. J. Exp. Bot.

217 Bieleski, R.L. Plant Physiol Bogler, D.J. Dasylirion Bol. Soc. Bot. México Bonnett, G.D.; Sims, I.M.; Simpson, R.J.; Cairns, A.J. New Phytol Bosch-Guha, P. Fundamentos y casos exitosos de la biotecnología moderna en México Bradford, M. Anal. Biochem. Brasch, D.J.; Fankhauser, B.L.; Mc Donald, A.G. Cordyline australis Carbohydr. Res Cairns, A.J.; Ashton, J.E. in vitro New Phytol. Cairns, A.J. New Phytol. Cairns, A.J.; Ashton, J.E. New Phytol Cairns, A.J.; Nash, R.; Machado-de Carvahlo, M.A.; Sims, I.M. Phleum prattense New Phytol Cairns, A.J.; Cookson, A.; Thomas, B.J.; Turner, L.B. Lolium temulentum J. Plant Physiol Cairns, A.J.; Begley, P.; Sims, I.M. Lolium temulentum J. Plant Physiol Carpita, N.C.; Shea, E.M. Analysis of carbohydrates by GLC and MS Carpita, N.C.; Housley, T.L.; Hendrix, J.E. Carbohydr. Res Carpita, N.C.; Shea, E.M. Analysis of carbohydrates by GLC and MS Cedeño, M. Rev. Biotechnol Chalmers, J.; Lidgett, A.; Cummings, N.; Cao, Y.; Forster, J.; Spangenberg, G. Plant Biotechnol. J. Chambert, R.; Petit-Glatron, M.F. Bacillus subtilis Biochem. J. Chatterton, N.J.; Harrison, P.A. Poa ampla. New Phytol Chatterton, N.J.; Harrison, P.A. J. Plant Physiol. Christopher, J.T.; Holtum, J.A. Plant Physiol Ciucanu, I.; Kerek, F. Carbohydr. Res Cregg, J.M.; Tsschopp, J.F.; Stillman, C.; Siegel, R.; Akong, M.; Craig, W.S.; Buckholz, R.G.; Madden, K.R.; Kellaris, P.A.; Davies, G.R.; Smiley, B.L.; Cruze, J.; Torregrossa, R.; Velicelebi, G.; Thill, G.P. Pichia pastoris. Biol. Technol.

218 Cushman, J.C.; Bohnert, H.J. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol Dahlgren, R.M.T.; Clifford, H.T.; Jeo, P.F. The families of the monocotyledons. Structure, evolution and taxonomy. Darbyshire, B.; Henry, R.J. Allium New Phytol De Bruyn, A.; Van Loo, J. Carbohydr. Res. De Coninck, B.; Le Roy, K.; Francis, I.; Clerens, S.; Vergauwen, R.; Halliday, A.M.; Smith, S.M.; Van Laere, A.; Van den Ende, W. Plant, Cell Environ De Gara, L.; de Pinto, M.C.; Moliterni, V.M.C.; D ′′′Egidio, M.G. Triticum durum J. Exp. Bot Delzenne, N.M. Proc. Nutr. Soc. De Roover, J.; Van Laere, A.; De Winter, M.; Timmermans, J.W.; Van den Ende, W. Cichorium intybus. Physiol. Plant De Roover, J.; Vandenbranden, V.; Van Laere, A.; Van den Ende, W. Cichorium intybus Plant J. Dood, A.N. ; Borland, A.M.; Haslam, R.P. ; Griffiths, H. ; Maxwell, K. J. Exp. Bot. Dorland, L.; Kammerling, J.P.; Vliegenthart, J.F.G.; Satyanarayana, M.N. Agave vera cruz. Carbohydr. Res Dubois, M.; Gilles, K.A.; Hamilton, J.K.; Rebers, P.A.; Smith, F. Anal. Chem. Duchateau, N.; Bortlik, K.; Simmen, U.; Wiemken, A.; Bancal, P. Plant Physiol Edelman, J.; Jefford, T.G. Helianthus tuberosus New Phytol. Eguiarte, L.E. sensu Bol. Soc.Bot. México Ehrler, W.L. Agave americana Physiological systems in semiarid environments. Equiza, M.A.; Miravé, J.P.; Tognetti, J.A. Ann. Bot Ernst, M.; Chatterton, N.J.; Harrison, P.A. New Phytol Ernst, M.; Chatterton, N.J.; Harrison, P.A.; Matitschka, G. Allium J. Plant Physiol. Fujishima, M.; Sakai, H.; Ueno, K.; Takahashi, N.; Onodera, S.; Benkeblia, N.; Shiomi, N. in vivo. New Phytol. Gallagher, J.A.; Cairns, A.J.; Pollock, C.J. Lolium temulentum J. Exp. Bot

219 García-Mendoza, A.; Galván, R. Bol. Soc. Bot. Mex García-Mendoza, A. Conservación de plantas en peligro de extinción. Diferentes enfoques Gaudet, D.A.; Laroche, A.; Yoshida, M. Physiol. Plant. Gebbing, T. Triticum aestivum New Phytol Gentry, H.S. Gerrits, N. Gil-Vega, K.; González-Chavira, M.; Martínez-de la Vega, O.; Simpson, J.; Vandemark, G. Agave tequilana Euphytica Gioanetto, F.; Franco, E. IV Simposio internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae. Los Agaves de importancia económica en México Goetz, M.; Roitsch, T. Plant J. Gorbunoff, M.J.; Timasheff, S.N Anal. Biochem. Goto, K.; Fukai, K.; Hikida, J.; Nanjo, F.; Hara, Y. Polymnia sonchifolia Biotech. Biochem Graham, E.A.; Nobel, P.S. Agave deserti J. Exp. Bot Gupta, A.K.; Kaur, N. Carbohydrate Reserves in Plants –synthesis and regulation. Hartsock, T.L.; Nobel, P.S. Nature Hellwege, E.M.; Raap, M.; Gritscher, D.; Willmitzer, L.; Heyer, A.G. Cynara scolymus Helianthus tuberosus FEBS Lett. Hellwege, E.M.; Czapla, S.; Jahnke, A.; Willmitzer, L.; Heyer, A.G. Solanum tuberosus Cynara scolymus PNAS Hendry, G. New Phytol. Hendry, G.A.F. . New Phytol Hendry, G.A.F; Wallace R.K. Science and technology of fructans Henry, R.J.; Darbyshire, B. Allium cepa. Phytochemistry Henson, C.A.; Livingston III, D.P.  Plant Physiol

220 Herrera, J.L.; Herrera, G.; Ojeda, G.; Castillo, E.; Robert, M.L. Agave fourcroydes IV Simposio internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae. Los Agaves de importancia económica en México Hincha, D.K.; Hellwege, E.M.; Heyer, A.G.; Crow, J.H. Eur. J. Biochem. Hincha, D.K.; Zuther, E.; Hellwege, E.M.; Heyer, A.G. Glycobiology Hjelm, U.; Ögren, E Physiol. Plant Hochstrasser, U.; Lüscher, M.; De Virgilio, C.; Boller, T.; Wiemken, A. Pichia pastoris FEBS Lett. Hopkins, W.G. Introduction to plant physiology Iñiguez-Covarrubias, G.; Díaz-Teres, R.; San Juan-Dueñas, R.; Anzaldo-Hernández, J., Rowel, R.N. . Bioresour. Technol Iñiguez-Covarrubias, G.; Díaz-Teres, R.; San Juan-Dueñas, R.; Anzaldo-Hernández, J., Rowel, R.N. Agave tequilana . Bioresour. Technol Irish, M.; Irish, G. Izaguirre-Mayoral, M.L.; Marys, E.; Olivares, E.; Oropeza, T. Agave sisalana J. Exp. Bot Jin, J.M.; Zhang, Y.J.; Yang, C.R. Agave americana Chem. Pharm. Bull. Itaya, N.M.; Machado de Carvahlo, M.A.; Figueiredo-Ribeiro, R.C.L. Polymnia sonchifolia Physiol. Plant Jain, R.G.;Rusch, S.L.; Kendall, D.A. J. Biol. Chem Jorgensen, A.D.; Picel, K.C.; Stamoudis, V.C. Anal. Chem. Karsten, H.D.; MacAdam, J.W. Crop. Sci Kaur, N.; Gupta, A.K. J. Biosci Kawakami, A.; Yoshida, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. Kerepesi, I.; Galiba, G. Crop Sci Kingston-Smith, A.; Walker, R.P.; Pollock, C.J. J. Exp. Bot. Kingston-Smith, A. . Trends Plan Sci Koops, A.J.; Jonker. H.H. Helianthus tuberosus Plant Physiol

221 Koroleva, O.A.; Farrar, J.F.; Tomos A.D.; Pollock, C.J. Plant Physiol Lasseur, B.; Lothier, J.; Djoumad, A.; De Coninck, B.; Smeekens, S.; Van Laere, A.; Morvand-Bertrand, A.; Van den Ende, W.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne J. Exp. Bot. Lidgett, A.; Jennings, K.; Johnson, X.; Guthridge, K.; Jones, E.; Spangenberg, G. Lolium perenne J. Plant Physiol Linton, M.J.; Nobel, P.S. Agave deserti Agave tequilana Int. J. Plant Sc Liu, J.; Waterhouse, A.L.; Chatterton, N.J. Carbohydr. Res. Livingston III, D.P.; Henson, C. Plant Physiol López, M.G.; Dufour, M.G. Gas chromatography-olfactometry. The state of the art López, M.G.; Mancilla-Margalli, N.A.; Mendoza-Díaz, G. Agave tequilana J. Agric. Food Chem. López-Munguía, A. Fundamentos y casos exitosos de la biotecnología moderna en México Lu, C.; Koroleva, O.A.; Farrar, J.F.; Gallagher, J.; Pollock, C.J.; Tomos, A.D. in situ Plant Physiol Lüscher, M.; Erdin, C.; Sprenger, N.; Hochstrasser, U.; Boller, T.; Wiemken, A. Helianthus tuberosus. FEBS Lett. Lüscher, M.; Hochstrasser, U.; Boller, T.; Wiemken, A. Hordeum vulgare New Phytol Lüscher, M.; Hochstrasser, U.; Voguel, G.; Aeschbacher, R.; Galati, V.; Nelson, C.J.; Boller, T.; Wiemken, A. Plant Physiol Machado de Carvalho, M.A.; Dietrich, S.M.C. Vernonia herbacea New Phytol. Mancilla-Margalli, N.A. Agave tequilana Mancilla-Margalli, N.A.; López, M.G. Agave Dasylirion J Agric. Food Chem Martínez-Fleites, C.; Tarbouriech, N.; Ortiz-Lombardia, M.; Taylor, E.; Rodríguez, A.; Ramírez, R.; Hernández, L.; Davies, G.J. Gluconacetobacter diazotrophicus Martinez-Nöel, G.M.; Tognetti, J.A.; Pontis, H.G. Planta

222 Marx, S.P.; Nösberger, J.; Frehner, M. β β Helianthus tuberosus New Phytol. McCleary, B.V.; Murphy, A.; Mugford, D.C. J. AOAC McCleary, B.V.; Monaghan, D.A. J. AOAC Meijer, W.J.M.; Mathijssen, E.W.J.M.; Borm, G.E.L. Science and technology of fructans Menéndez, C.; Hernández, L.; Selman, G.; Mendoza, M.F.; Hevia, P.; Sotolongo, M.; Arrieta, J.G. Escherichia coli Gluconacetobacter diazotrophicus Curr. Microbiol Monti, A.; Amaducci, M.A.; Pritoni, G.; Venturi, G. Cichorium intybus J. Exp. Bot. Morvan-Bertrand, A.; Boucaud, J.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne J. Exp. Bot. Morvan-Bertrand, A.; Boucaud, J.; Le Saos, J.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne Planta Müller, J.; Aeschbacher, R.A.; Sprenger, N.; Boller, T.; Wiemken, A. Plant Physiol. Nagaraj, V.J.; Altenbach, D.; Galati, V.; Lüscher, M.; Meyer, A.D.; Boller, T.; Wiemken, A. New Phytol Nikam, T.D.; Bansude, G.M.; Aneesh Kumar, K.C. Agave sisalana Plant Cell Rep Nobel, P.S. Agave deserti Oecologia Nobel, P.S. Agave deserti Bot. Gaz Nobel, P.S. Nobel, P.S. Am. J. Bot. Nobel, P.S. Nobel, P.S.; Meyer, S.E. Agave salmiana Physiol. Plant Nobel, P.S.; Quero, E. Agave lechuguilla Nobel, P.S.; Castañeda, M.; North, G.; Pimienta-Barrios, E.; Ruiz, A. Agave tequilana J. Arid Environ Ojeda, L.; Ludlow, B. Bol. Soc. Bot. México Orthen, B. Lachenalia minima Physiol. Plant Orthen, B.; Whermeyer, A. Galanthus nivalis. Physiol. Plant

223 Palma, F.J. Bol. Soc. Bot. México Palta, H.A.; Nobel, P.S. Agave deserti J. Exp. Bot. Parsons, J.R.; Darling, J.A. Agave Bol. Soc. Bot. México Parvanova, D.; Ivanov, S.; Konstantinova, T.; Karanov, E.; Atanassov, A.; Tsuetkov, T.; Alexieva, V.; Djilianov, D. Plant Physiol. Biochem. Pavis, N.; Chatterton, N.J.; Harrison, P.A.; Baumgartner, S.; Praznik, W.; Boucaud, J.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne. New Phytol Pavis, N.; Boucaud, J.; Prud´homme, M.P. Lolium perenne. New Phytol Peña-Álvarez, A.; Díaz, L.; Medina, A.; Labastida, C.; Capella, S.; Vera, L.E. J. Chromatogr. A. Pilon-Smit, E.A.H.; Ebskamp, M.J.M.; Paul, M.J.; Jeuken, M.J.W.; Weisbeek, P.J.; Smeekens, S.C.M. Plant Physiol. Pimienta-Barrios, E.; Robles-Murguía, C.; Nobel, P.S. Agave tequilana Biotropica Pimienta-Barrios, E.; Nobel, P.S.; Zañudo-Hernández, J.; García, J. Agave tequilana IV Simposio internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae. Los Agaves de importancia económica en México. Pollock, C.J. New Phytol. Pollock, C.; Farrar, J.; Tomos, D.; Gallagher, J.; Lu, C.; Koroleva, O. J. Exp. Bot. Pons, T.; Naumoff, D.G.; Martínez-Fleites, C.; Hernández, L. β Proteins Praznik, W.; Beck, R.H.F. J. Chromat. Praznik, W.; Spies, T.; Hofinger, A. Triticum aestivum. Carbohydr. Res. Quero, E.; Nobel, P.S. Agave lechuguilla J. Appl. Ecol Reddy, A.; Maley, F. J. Biol. Chem. Rehm, J.; Willmitzer, L.; Heyer, A.G. Aspergillus foetidus. J. Bacteriol Ritsema, T.; Smeekens, S.C.M. J. Plant Physiol. Ritsema, T.; Joling, J.; Smeekens, S.C.M. New Phytol

224 Ritsema, T. ; Verhaar, A. ; Vijn, I. ; Smeekens, S. β Plant Mol. Biol. Ritsema, T.; Verhaar, A.; Vijn, I.; Smeekens, S. Plant Mol. Biol Roberfroid, M.B. Br. J. Nutr. Ruiz-Corral, J.A.; Pimienta-Barrios, E.; Zañudo-Hernández, J. Agave tequilana Agrociencia Ruvalcaba-Ruiz, D.; Rodríguez-Garay, B. Agave tequilana BMC Plant Biol. Sáenz, M.T.; García, M.D.; Quiles,A.; Ahumada, M.C. Agave intermixta Cissus sicyoides Phytother. Res Salazar, A.; Hernández, J.L.; Méndez, L.; Jaques-Hernández, C. in vitro Agave potatorum IV Simposio internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae. Los Agaves de importancia económica en México Santacruz-Ruvalcaba, F.; Gutiérrez-Pulido, H.; Rodríguez-Garay, B. in vitro Agave parrasana Plant Cell Tiss. Org. Cult Santamaría, J.M.; Herrera, J.L.; Robert, M.L. Agave tequilana Plant Growth Reg Satyanarayana, M.N. Agave vera cruz Ind. J. Biochem. Biophys. Satyanarayana, M.N. Agave vera cruz Ind. J. Biochem. Biophys. Satyanarayana, M.N. Agave vera cruz Ind. J. Biochem. Biophys. Schulte, P.J.; Nobel, P.S. J. Exp. Bot. Shiomi, N. Asparagus officinalis Carbohydr. Res. Shiomi, N. Carbohydr. Res. Shiomi, N.; Onodera, S.; Chatterton, N.J.; Harrison P.A. Agric. Biol Chem Shiomi, N. Asparagus officinalis New Phytol Sims, I.M.; Pollock, C.J.; Horgan, R. Lolium temulentum Phytochemistry Sims, I.M.; Cairns, A.J.; Furneaux, R.H. Phytochemistry Sims, I.M. Phytochemistry Solhaug, K.A.; Aares, E. Phippsia algida Physiol. Plant. Song, D.D.; Jacques, N.A. Streptococcus salivarius Biochem. J. Spies, T.; Praznick, W.; Hofinger, A.; Altmann, F.; Nitsch, E.; Wutka, R. Urginea maritima Carbohydr. Res.

225 Spollen, W.G.; Nelson, C.J. Plant Physiol Sprenger, N.; Bortlik, K.; Brandt, A.; Boller, T.; Wiemken, A. 1995. PNAS Sprenger, N.; Schellenbaum, L.; Van Dun, K.; Boller, T.; Wiemken, A. FEBS Lett. Srinivasan, M.; Bathia, I.S. Agave vera cruz Biochem. J. St John, J.A.; Sims, I.M.; Bonnett, G.D.; Simpson, R.J. Lolium rigidum. New Phytol St John, J.A.; Simpson, R.J.; Bonnett, G.D.; Tanner, G.J. Lolium rigidum. New Phytol Suzuki, M. Science and technology of fructans Sweet, D.P.; Shapiro, R.H.; Albersheim, P. Carbohydr. Res Tabaei-Aghdaei, S.R.; Pearce, R.S.; Harrison, P. J. Exp. Bot. Trípodi, K.E.J.; Podestá, F.E. Plant Physiol Trujillo, L.E.; Banguela, A.; País, J.; Támbara, Y.; Arrieta, J.G.; Sotolongo, M; Hernández, L. Gluconacetobacter diazotrophicus Pichia pastoris. Afinidad Turner, L.B.; Cairns, A.J.; Armstead, I.P.; Ashton, J.; Skot, K.; Wittaker, D.; Humphreys, M.O. Lolium perenne New Phytol Ueno, K.; Onodera, S.; Kawakami, A.; Yoshida, M.; Shiomi, N. Asparagus officinalis New Phytol Valenzuela, A. Van den Ende, W.; Van Laere, A. Cichorium intybus New Phytol Van den Ende, W.; Van Laere, A. Cichorium intybus New Phytol. Van den Ende, W.; Van Laere, A. De-novo in vitro Cichorium intybus Planta Van den Ende, W.; Van Laere, A. in vitro J. Exp. Bot Van den Ende, W.; Van Wonterghem, D.; Verhaert, P.; Dewil, E.; Van Laere, A. Cichorium intybus Planta Van den Ende, W.; Van Wonterghem, D.; Dewill, E.; Verhaert, P.; De Loof A.; Van Laere, A. Cichorium intybus Physiol. Plant

226 Van den Ende, W.; De Roover, J.; Van Laere, A. In vitro Physiol. Plant Van den Ende, W.; Michiels, A.; Van Woterghem, D.; Vergauwen, R.; Van Laere, A. Taraxacum officinale Plant Physiol Van den Ende, W.; Michiels, A.; De Roover, J.; Van Laere, A. The Scientific World J. Van den Ende, W.; Clerens, S.; Vergauwen, R.; Van Riet, L.; Van Laere, A.; Yoshida, M.; Kawakami, A. β Plant Physiol. Van den Ende, W.; De Coninck, B.; Clerens, S.; Vergauwen, R.; Van Laere, A. ´ Beta vulgaris Plant J Van den Ende, W.; De Coninck, B.; Van Laere, A. Trends Plant Sci. Van den Ende, W.; Yoshida, M.; Clerens, S.; Vergauwen, R.; Kawakami, A. Triticum aestivum New Phytol. Van Laere, A.; Van den Ende, W. Plant Cell Env Van Loo, J.; Coussement, P.; De Leenheer, L.; Hoebregs, H.; Smits, G. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. Van Waes, C.; Baert, J.; Carlier, L.; Van Bockstaele. Cichorium intybus J. Sci. Food Agric Vereyken, I.J.; Van Kuik, J.A.; Evers, T.H.; Rijken, P.J.; de Kruiff, B. Biophys. J. Vereyken, I.J.; Chupin, V.; Hoekstra, F.A.; Smeeknes, S.C.J.; de Kruiff, B. Biophys. J. Vergauwen, R.; Van den Ende, W.; Van Laere, A. Campanula rapunculoides J. Exp. Bot. Vergauwen, R.; Van Laere, A.; Van den Ende, W. Plant Physiol. Verhaest, M.; Van den Ende, W.; Yoshida, M.; Le Roy, K.; Peeraer, Y.; Sansen, S.; De Ranter, C.J.; Van Laere, A.; Rabins, A. Cichorium intybus Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. Verhaest, M.; Van den Ende, W.; Le Roy, K.; De Ranter, C.J.; Van Laere, A.; Rabins, A. Cichorium intybus Plant J. Vijn, I.; van Dijken, A.; Sprenger, N.; van Dun, K.; Weisbeek, P.; Wiemken, A.; Smeekens, S. Cichorium intybus Allium cepa Plant J. Vijn, I.; Smeekens, S. Plant Physiol.

227 Von Heijne, G. Nucl. Acids Res. Von Heijne, G.; Abrahmsén, L. FEBS Lett. Wack, M.; Blaschek, W. Echinacea purpurea Carbohydr. Res Wang, N.; Nobel, P.S. Agave deserti Plant Physiol Wang, C.; Van den Ende, W.; Tillberg, J.E. Planta Waterhouse, A.; Chatterton, N.J. Science and Technology of fructans Wei, J.Z.; Chatterton, N.J.; Larson, S.R.; Wang, R.R.C. Genome Wei, J.Z.; Chatterton, N.J. Agropyron cristatum J. Plant Physiol. Withers, S.G.; Aebersold, R. Prot. Sci Woodhouse, R.M.; Williams, J.G.; Nobel, P.S. Agave deserti Amer. J. Bot Woodhouse, R.M.; Williams, J.G.; Nobel, P.S. Agave deserti Oecologia Yang, J.; Zhang, J.; Wang, Z.; Zhu, Q.; Liu, L. Planta

228