UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE Ecole doctorale : Sciences de l’environnement

INTERACTIONS ENTRE VIRUS GEANTS, VIROPHAGES ET BACTERIES AU SEIN DE L’AMIBE : CONSEQUENCES SUR LEUR ISOLEMENT

THESE

Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE Le 24 septembre 2013

Par Meriem SLIMANI

Pour obtenir le grade de Docteur de L’Université de la Méditerranée SPECIALITE : ENVIRONNEMENT ET SANTE

Membres du Jury de la Thèse : Professeur Philippe Colson Président du Jury Professeur Bernard La Scola Directeur de Thèse Professeur Raymond Ruimy Rapporteur Professeur Hervé Lecoq Rapporteur

REMERCIEMENTS

Est venu le moment d’écrire les remerciements. Ça y est, c’est la fin d’un long périple.

Je tiens à remercier en premier chacun des membres du jury,

M. le Pr. Raymond Ruimy, M. le Pr. Hervé Lecoq, de m’avoir fait l’honneur d’être les rapporteurs de ma thèse, et d’avoir accepté de faire partie de mon jury de soutenance

Je tiens à remercier M. le Professeur Didier Raoult de m’avoir accueillie dans son laboratoire pendant quatre années extraordinairement enrichissantes.

Un grand merci à M. le Professeur Bernard La Scola pour avoir dirigé ce travail de thèse.

Je remercie M. le Professeur Philippe Colson d’avoir accepté de présider mon jury de thèse.

Je remercie sincèrement Isabelle Pagnier de m’avoir aidée à finaliser mon travail

Je remercie Christelle Desnues de m’avoir soutenue durant ces 4 ans et toute son équipe Laura, Mickael, Sonia, Priscilla.

Mes remerciements vont ensuite pour l'ensemble des personnes du laboratoire qui ont années au sein du laboratoire.

été là et pour vos encouragements.

Je remercie Mondher et Hanane pour leur soutien sans faille.

Et mes derniers remerciements sont pour toute ma Famille, mes parents qui ont toujours su me soutenir et m’encourager, dans mes

études, et aussi dans ma vie ; mon frère Lyes et ma sœur Inès pour leurs soutien, je sincèrement remercie Isabelle et Lionel Michaut

à mes cousins et cousines

SOMMAIRE

RESUME p. 2

ABSTRACT…………………………………………………………………………...... …… p .4

INTRODUCTION…………………………………………………...... p. 7

EXPOSE BIBLIOGRAPHIQ…………………………………………………………………UE: p. 23

Avant-proposL’Endosymbiose chez les protozoaires dans le milieu naturel… p. 25 I. Introduction .. p. 30 II. La classification………………………………………………………………………. des protozoaires p. 36 III. ……………………………………………………………… p. 46 III.1. Endosymbiose primaire ………………………………….. p. 48 III.2.L’endosymbiose chez les protozoaires………………………… Endosymbiose secondaire ou tertiaire p. 56 IV. ………………………………………térien au style de vie ………………….. p. 59 V. ConclusionAdaptation de l’endosymbionte bac p. 61 de l’hôte……………………………………………………………………… ………………………………………………………………….. EXPOSE DES TRAVAUX p. 73

Article de recherche: A decade of improvements in Mimiviridae and Marseilleviridae isola p. 75

Article de recherche: A disinfection proceduretion from amoeba…… for isolating giant viruses from the environment...... p. 89

Article de recherche: Amoeba as a battlefield for bacteria, p.101 giant viruses and virophages…………………………………………………Discussion et Conclusion p.109

Références bibliographiques……………………………………………….… p.117

…………………………………...... RESUME

Les virus sont présents dans tous les écosystèmes, et sont les entités les plus abondantes dans le milieu marin. Bien que nous associons systématiquement virus aux maladies, la plupart d’entre eux coexistent cependant en équilibre avec leur hôte. Les virus sont associés à tous les règnes de la vie, même les virus qui affectent d'autres virus (virophages). La définition d'aujourd'hui d'un virus chez les virologues, c'est qu'un virus est un parasite génétique qui utilise des systèmes cellulaires pour sa propre réplication. Les hôtes les plus couramment utilisées par les virus que nous avons étudiés sont principalement des protozoaires. Ainsi, les font l’objet de nombreuses études et sont utilisés pour isoler de nouvelles espèces intracellulaires (virus, bactéries). Ces espèces ont évolué de manière à résister aux effets consécutifs à la phagocytose ou à l’ingestion dans des vacuoles, et restent viable dans le cytoplasme de l’amibe, et ont le potentiel de se multiplier dans les parasites. Dans cette étude, nous avons dans un premier temps étudier les diverses interactions existantes entre virus Acanthamoeba polypaghaga Mimivirus (APMV) et des bactéries au sein de l’amibe. Pour cela, nous avons choisi un système original basé sur la co-culture de APMV, soit seul ou en combinaison avec deux autres microorganismes isolés individuellement à partir de l’amibe. Il s’agit d’une bactérie intracellulaire stricte (BABL1) et le virophage de APMV (Sputnik). Cela nous a permis de mettre en évidence, d’une

- 2 -

part la capacité du virophage à moduler la virulence d’APMV tout en révélant, d’autre part, la bataille qui a lieu entre eux au cours de l'infection de l'hôte. Dans un deuxième temps, nous avons examiné l'activité virucide des biocides couramment utilisés en pratique clinique pour la désinfection des équipements hospitaliers. APMV et Marseillevirus montrent une grande résistance aux biocides chimiques, en particulier l’alcool. Seule la température de 75°C et le glutaraldéhyde ont réussi à réduire les titres d’APMV et Marseillevirus à des niveaux indétectables. Après dessiccation ou exposition aux rayonnements Ultraviolets, APMV et Marseillevirus ont démontré leur stabilité durable. Précédent le pré-traitement des échantillons de l'environnement par l'éthanol à 70°, a permis la disparition des contaminants bactériens sans réduire la charge virale, permettant leur isolement sur amibe, sans avoir besoin d’utiliser des antibiotiques, qui peuvent avoir un effet délétère sur les amibes.

- 3 -

ABSTRACT

Viruses are found in all ecosystems, and are the most abundant entities found in the marine environment. Although we systematically link viruses to diseases, most of them co-exist in equilibrium/harmony with their host. Viruses are associated with all realms of life, even the viruses which affect other viruses (virophages). Today's definition of a virus among virologists is that a virus is a genetic parasite that uses cellular systems for its own replication. The most common guest/hosts cells used by the viruses we studied are primarily protozoa. For this reason, Amoeboza are the subject of many studies and are used to isolate new intracellular species (viruses, bacteria). These species have evolved to resist phagocytosis or ingestion in vacuoles and to remain viable in the cytoplasm of the amoeba, and have the potential to multiply within the parasites.

In this study, we first examined the various interactions taking place between the virus Acanthamoeba polypaghaga Mimivirus (APMV) and bacteria within the amoeba. We chose an original system based on a co-culture of APMV either alone or in combination with two other organisms isolated from amoeba, i.e a strict intracellular bacterium (BABL1) and the virophage of APMV (Sputnik). This allowed us to highlight, on the one hand, the possibility to modulate the virulence of APMV while revealing, on the other hand, the battle which occurs between them during the infection of the host.

- 4 -

We then examined the virucidal activity of biocides commonly used in clinical practice for the disinfection of hospital equipment. APMV and Marseillevirus show high resistance to chemical biocides, especially to alcohol. Only a temperature of 75°C or glutaraldehyde were able to reduce APMV and Marseillevirus titres to undetectable levels. Whether dried or under ultraviolet, APMV and Marseillevirus demonstrated their lasting stability. Previous pre-treatment of environmental samples by ethanol 70° allowed disappearance of bacterial contaminating bacteria without reducing giant virus load allowing their isolation on amoeba without need the use of antibiotic that may have a deleterious effect on amoebae.

- 5 -

- 6 -

INTRODUCTION Les amibes sont des protozoaires unicellulaires ubiquistes de l’environnement que l’on retrouve communément dans l’eau ou le sol. L’augmentation récente du nombre de kératites, liée lenti omniprésence de cet organisme dans l’environnement, largement facilitée par la résistance désinfection et la dessiccation (cf. Fig.1)

Fig.1. Arbre de parcimonie sans Racines (algorithme de Parcimonie SEA) basée sur les données brutes de séquençage de l'ARNr 18S Acanthamoeba région variable 1 et 2 (Krishna K, 2011).

- 7 -

Acanthamoeb

Plusieurs études ont démontré que certaines bactéries résistaient aux effets de la phagocytose et avaient la capacité d'infecter les amibes, de s'y multiplier, conduisant ainsi à la lyse cellulaire de ces dernières (Greub, 2004). (cf. Fig. 1)

Fig. 2. Internalization des bactéries par Acanthamoeba. (Ruqaiyyah S, 2012).

- 8 -

Les bactéries ne sont pas les seuls microorganismes capables d’infecter les amibes puisqu’en 2003, un virus géant de plus de 400 nm de diamètre, entouré de fibrilles d’environ 150 nm à la surface de sa capside icosaédrique (cf. Fig. 3), a été isolé à partir d’une amibe (La Scola, 2003). Ce virus nommé Acanthamoeba polyphaga Mimivirus (ou Mimivirus) a un diamètre deux fois et demi plus gros que celui des plus gros virus connus.

Fig. 3 : Analyse par microscopie électronique de APMV internalisé. (Ghigo E, 2008)

deux parties et leur positionnement dans l’arbre de la vie (cf. Fig. 4).

- 9 -

Fig. 4 : gène

certains virus. L’étude de son cycle réplicatif révèle une phase d’éclipse typique des virus (Suzan-Monti, 2007). Cette phase d’éclipse définit le

- 10 -

cycle viral dans lequel le virus entier entre dans la cellule, disparait et réapparait en nombreuses copies. Mimivirus se réplique au sein d’usines à virus géantes formées dans le cytoplasme de l’amibe et sa multiplication aboutit dans un premier temps à la production de virions en masse et dans un second temps à la lyse de son hôte, l’amibe, en quelques heures. Le séquençage complet de son génome a mis en évidence qu’il était essentiellement constitué d’ADσ de type double brin et peu d’ARσ, qu’il avait une taille de 1,2 Mb, et aussi la présence de gènes d’origine bactérienne vraisemblablement acquis par transfert horizontal (Raoult D,2004). (cf. Fig. 5)

Fig. 5. L'analyse du génome des microorganismes qui vivent dans les amibes révèle un melting pot de l'évolution. (Moliner, 2010)

- 11 -

permis d’être

lui attribuant un role clé e. nouveaux éléments découvertes récentes d’autres virus M s virales de M

environnementaux afin d’ap leur position parmi les virus et de mieux comprendre leur ro

- 12 -

Fig. 6 : (Eucaryotes, Eubacteries, et Arc 2004).

D’autres recherches visant à isoler d’autres Mimivirus ont été menées à partir d’échantillons d’eau de tours aeroréfrigérantes ainsi que d’eaux issues de l’environnement : lacs, rivières, fontaines, mer et réseaux d’eaux d’hôpitaux, mais aussi a partir d’échantillons issus du sol (terre, terreaux …). Ceci a permis l’isolement d’un grand nombre de virus géants, de différentes tailles, allant de 150 à 600 nm, associés parfois ou non à des virophages. Ces virophages ont également été une autre découverte qui a bouleversé le monde viral dans son ensemble.

- 13 -

Ce sont les premiers « virus de virus » à avoir été décrits. Le premier à avoir été isolé était associé à Mamavirus : Sputnik (Desnues C, 2010). (cf. Fig. 7).

Fig. 7 : . (Angélique C, 2012)

Ils n’ont aucune autonomie propre dans l’amibe, et pour se multiplier, sont nécessairement associés à un virus géant de type Mimivirus. Ils utilisent en effet l’usine à virus générée par le virus

- 14 -

géant pour leur propre multiplication. Ils sont de plus responsables de la formation de nombreuses formes abortives ou anromales de Mimivirus au cours de leur multiplication dans l’usine à virus. Les virus géants associés aux amibes se divisent en 2 familles, différenciées morphologiquement par la taille de leur capside et de leurs fibrilles : les Mimiviridae, et les Marseilleviridae. Les Mimiviridae sont des virus dont la capside fait environ 400 à 450 nm de diamètre, entourés de longues fibrilles qui peuvent aboutir à une taille totale de particule virale allant de 600 à 650 nm de diamètre. Récemment, une reclassification a permis de distinguer parmi eux trois sous-groupes (Colson P (a), 2013): le sous-groupe A, dont le représentant principal est Mimivirus, le sous-groupe B, représenté par Moumouvirus (Yoosuf N, 2012), et le sous-groupe C, dont un des représentants est le premier Mimiviridae à avoir été isolé à partir d’un prélèvement clinique, LBA111 (Saadi H, 2013). Les Marseilleviridae sont une famille récemment définie (Colson P (b), 2013), qui se subdivise également en trois sous-groupes : celui des Marseillevirus qui est le premier représentant à avoir été isolé (Boyer M, 2009), celui de Lausannevirus (Thomas V, 2011), et celui de Tunisvirus (Boughalmi M, 2013). Ce sont des virus plus petits, dont la capside mesure entre 150 et 200 nm, et ne sont pas entourés fibrilles. Mimivirus a la capacité d’infecter des macrophages humains (Ghigo E, 2008). Ces cellules de la réponse immune sont impliquées dans l’élimination des agents pathogènes, ce qui laisse penser que Mimivirus pourrait résister à leur effet lytique. Sa potentiel

- 15 -

implication lors d’une épidémie de pneumonie (La Scola B, 2005), ainsi que de nombreuses études de sérologie et de biologie moléculaire ont montré qu’il était un agent pathogène potentiellement nuisible pour l’homme (Vincent A, 2009 ; Costa C, 2012 ; Bousbia S, 2013). Son implication potentielle en pathologie humaine justifie l’importance d’étudier son écologie au sein des amibes, en interaction avec d’autres microorganismes, ainsi que sa capacité de résistance à divers traitements décontaminants. L’amibe représente un très bon modèle pour l’étude des interactions symbiotiques interspécifiques (positives, neutres ou négatives), car de nombreuses espèces sont capables de les coloniser, et il a été montré à plusieurs reprises que des échanges de matériel génétique peuvent exister entre tous ces microorganismes (Raoult, 2010, Bertelli, 2012) Dans le cadre de cette thèse, j’ai dans un premier temps effectué un travail bibliographique permettant de définir et de resituer les interactions biologiques qui peuvent exister entre les différents règnes du vivant. Cet exposé général cible ensuite principalement les relations symbiotiques qui existent entre les protozoaires et les bactéries. Ceci m’a permis ensuite d’introduire la problématique du travail sur l’association au sein de l’amibe de différents microorganismes. En effet, dans un deuxième temps, je me suis attachée à étudier la relation très particulière qui existe dans l’amibe entre les virus géants, les virophages, et une bactérie intracellulaire des amibes,

- 16 -

choisie pour son association stricte avec les amibes du genre Acanthamoeba. Ce travail a fait l’objet d’une publication scientifique qui a été acceptée dans la revue Journal of Virology. Enfin, dans une dernière partie, j’ai étudié les différents niveaux de résistance des virus géants face à divers traitements biocides, chimiques ou physiques. Ce travail a fait l’objet d’une publication soumise à la revue Intervirology. En plus de déterminer la capacité de résistance des virus géants, ce travail a permis de mettre au point une technique de décontamination des échantillons environnementaux à l’éthanol, permettant leur isolement plus rapide et plus spécifique. Ceci a fait également l’objet d’une publication dans la revue Intervirology, qui recense les progrès effectués ces 10 dernières années dans l’isolement des virus géants à partir de prélèvements d’origines diverses.

- 17 -

Références bibliographiques

Campocasso, A., & La Scola, B. (2012). Virus géants associés aux amibes. Virologie, 16(1), 6-17.

Boughalmi, M., Saadi, H., Pagnier, I., Colson, P., Fournous, G., Raoult, D., & La Scola, B. (2013). High throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental microbiology.‐

Boyer, M., Yutin, N., Pagnier, I., Barrassi, L., Fournous, G., Espinosa, L., ... & Raoult, D. (2009). Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(51), 21848- 21853.

Bousbia, S., Papazian, L., Saux, P., Forel, J. M., Auffray, J. P., Martin, C., ... & La Scola, B. (2013). Serologic Prevalence of Amoeba- Associated Microorganisms in Intensive Care Unit Pneumonia Patients. PloS one, 8(3), e58111.

Bertelli, C., & Greub, G. (2012). Lateral gene exchanges shape the genomes of amoeba-resisting microorganisms. Frontiers in cellular and infection microbiology, 2. Desnues, C., & Raoult, D. (2010). Inside the lifestyle of the virophage. Intervirology, 53(5), 293-303.

Colson, P.(b), De Lamballerie, X., Yutin, N., Asgari, S., Bigot, Y., Bideshi, D. K., ... & Raoult, D. (2013). “Megavirales”, a proposed new order for eukaryotic nucleocytoplasmic large DNA viruses. Archives of virology, 1-5.

Colson, P.(a), Pagnier, I., Yoosuf, N., Fournous, G., La Scola, B., & Raoult, D. (2012). “Marseilleviridae”, a new family of giant viruses infecting amoebae. Archives of virology, 1-6.

- 18 -

Costa, C., Bergallo, M., Astegiano, S., Terlizzi, M. E., Sidoti, F., Solidoro, P., & Cavallo, R. (2011). Detection of mimivirus in bronchoalveolar lavage of ventilated and nonventilated patients. Intervirology, 55(4), 303-305.

Ghigo, E., Kartenbeck, J., Lien, P., Pelkmans, L., Capo, C., Mege, J. L., & Raoult, D. (2008). Ameobal pathogen mimivirus infects macrophages through phagocytosis. PLoS pathogens, 4(6), e1000087.

Greub, G., & Raoult, D. (2004). Microorganisms resistant to free- living amoebae. Clinical Microbiology Reviews, 17(2), 413-433.

Khairnar, K., Tamber, G. S., Ralevski, F., & Pillai, D. R. (2011). Comparison of molecular diagnostic methods for the detection of Acanthamoeba spp. from clinical specimens submitted for keratitis. Diagnostic microbiology and infectious disease, 70(4), 499-506.

La Scola, B., Marrie, T. J., Auffray, J. P., & Raoult, D. (2005). Mimivirus in pneumonia patients. Emerging infectious diseases, 11(3), 449.

La Scola, B., Audic, S., Robert, C., Jungang, L., de Lamballerie, X., Drancourt, M., ... & Raoult, D. (2003). A giant virus in amoebae. Science, 299(5615), 2033-2033.

Moliner, C., Fournier, P. E., & Raoult, D. (2010). Genome analysis of microorganisms living in amoebae reveals a melting pot of evolution. FEMS microbiology reviews, 34(3), 281-294.

Raoult, D., Audic, S., Robert, C., Abergel, C., Renesto, P., Ogata, H., ... & Claverie, J. M. (2004). The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science, 306(5700), 1344-1350.

Raoult, D., & Boyer, M. (2010). Amoebae as genitors and reservoirs of giant viruses. Intervirology, 53(5), 321-329.

- 19 -

Siddiqui, R., & Khan, N. A. (2012). War of the microbial worlds: Who is the beneficiary in Acanthamoeba–bacterial interactions?. Experimental Parasitology, 130(4), 311-313.

Saadi, H., Pagnier, I., Colson, P., Cherif, J. K., Beji, M., Boughalmi, M., ... & Raoult, D. (2013). First isolation of Mimivirus in a patient with pneumonia. Clinical Infectious Diseases.

Suzan-Monti, M., La Scola, B., Barrassi, L., Espinosa, L., & Raoult, D. (2007). Ultrastructural characterization of the giant volcano-like virus factory of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus. PLoS One, 2(3), e328.S ONE 2007;2:e328.

Thomas, V., Bertelli, C., Collyn, F., Casson, N., Telenti, A., Goesmann, A., ... & Greub, G. (2011). Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environmental microbiology, 13(6), 1454-1466.

Vincent, A., La Scola, B., Forel, J. M., Pauly, V., Raoult, D., & Papazian, L. (2009). Clinical significance of a positive serology for mimivirus in patients presenting a suspicion of ventilator-associated pneumonia. Critical care medicine, 37(1), 111-118.

Yoosuf, N., Yutin, N., Colson, P., Shabalina, S. A., Pagnier, I., Robert, C., ... & Koonin, E. V. (2012). Related giant viruses in distant locations and different habitats: Acanthamoeba polyphaga moumouvirus represents a third lineage of the Mimiviridae that is close to the megavirus lineage. Genome biology and evolution, 4(12), 1324-1330.

- 20 -

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1: Arbre de parcimonie sans racines (algorithme de parcimonie SEA) basée sur les données brutes de séquençage de l'ARNr 18S Acanthamoeba région variable 1 et 2. L'analyse de bootstrap a été faite sur 100 répétitions. Branches plus longues indiquent un plus grand nombre de changements dans le taxon au noeud ancestral hypothétique. Les isolats 4 Acanthamoeba (฀) de notre population à l'étude provenaient de différents patients. Plusieurs souches de référence et des isolats provenant de différents lieux géographiques ont également été inclus à titre de comparaison.

Figure 2: Internalization des bactéries par Acanthamoeba. Les bactéries intracellulaires non pathogènes sont tués et utilisés comme source de nourriture, tandis que les bactéries pathogènes échappent aux mécanismes de destruction intracellulaire, et survivrent ou se multiplient dans Acanthamoeba.

Figure 3: Analyse par microscopie électronique de APMV internalisé. APMV (500 UFP par macrophage) a été incubé avec des macrophages RAW 264.7 pour différentes périodes. A: APMV Isolé.

Figure 4

CroV: Cafeteria roenbergensis virus, APMV: Acanthamoeba polyphaga mimivirus, ACMV : Acanthamoeba castellanii mamavirus, PoV-01 : Pyramimonas orientalis virus 01, PpV-01 : Phaeocystis pouchetii virus 01, CeV-01 : Chrysochromulina ericina virus 01, HaV- 01 : Heterosigma akashiwo virus 01, EhV-86 : Emiliana huxleyi virus 86, OtV5 : Ostreococcus tauri virus 5, ATCV-1 : Acanthocystis turfacea virus 1, PBCV- 1 : bursarium chlorella virus 1, ESV-1 : Ectocarpus siliculosus virus 1, FirrV-1 : Feldmannia irregularis virus 1, MV : Marseillevirus, FV3 : Frog virus 3, LDV : Lymphocystis disease virus, ISKNV : Infectious spleen and kidney necrosis virus, IIV-3 : Invertebrate iridiscent virus 3, CIV : Chilo iridiscent virus, DpAV4 : Diadromus pulchellus ascovirus 4a, HvAV3 : Heliothis virescens ascovirus 3e, TnAV2 : Trichoplusia ni ascovirus 2c, HcDNAV : circularisquama DNA virus,

- 21 -

ASFV : African swine fever virus, VV : Vaccinia virus, FPV : Fowlpox virus, MCV : Molluscum contagiosum virus, AMV : Amsacta moorei entomopoxvirus, MSV : Melanoplus sanguinipes entomopoxvirus.

Figure 5 : L'analyse du génome des microorganismes qui vivent dans les amibes révèle un melting pot de l'évolution. Une voie évolutive pour créer de nouveaux agents pathogènes au sein des amibes. Présence d'ADN d'origines diverses au sein des amibes favorise l'échange d'ADN conduisant à la création de génomes chimères. Aanthamoeba polyphaga mimivirus est un exemple d'un nouveau pathogène viral qui possède (violet), amibienne (bleu) et de l'ADN hétérologue bactérienne (rouge et vert) probablement acquises dans le cadre de son hôte amibienne par transfert horizontal de gènes.

Figure 6 : Un arbre phylogénétique des espèces dans les trois domaines de la vie (Eucaryotes, Eubacteria et Archaea) et Mimivirus. L'arbre a été préférée à l'utilisation d'un maximum comme méthode de vraisemblance sur la base des séquences concaténées de sept séquences protéiques universellement conservées: arginyl-ARNt synthétase (COG0018), la méthionyl-ARNt synthétase (COG0143), tyrosyl-ARNt syn-thetase (COG0162), l'ARN polymérase II plus grande sous-unité (COG0086), l'ARN polymérase II deuxième plus grande sous-unité (COG0085), PCNA (COG0592), et exonucléase 5-3 (COG0258). L'alignement contient 3164 sites sans insertions et des suppressions. Les pourcentages de bootstrap sont indiqués le long des branches. Arbres similaires ont été obtenus avec l'utilisation d'une variété d'autres approches.

Figure 7 .

- 22 -

EXPOSE

BIBLIOGRAPHIQUE

- 23 -

- 24 -

L’Endosymbiose chez les protozoaires dans le milieu naturel

Avant-propos

Quelques définitions Dans un écosystème coexistent de nombreuses espèces entre lesquelles il existe de nombreuses interactions biologiques. Ces dernières sont de 2 types : 1. Interactions intra spécifiques Ce sont les relations qu'ont les individus entre eux au sein d'une même espèce. 2. Interactions interspécifiques Ces sont les relations qu'ont entre eux des individus de deux ou plusieurs espèces différentes. On distingue plusieurs types de relations interspécifiques : Le Neutralisme : en écologie, il s’agit pour des espèces, du fait de cohabiter sur un même territoire sans exercer d'influence entre elles. Par exemple, c'est le cas de la musaraigne et du cerf dans une forêt. La Compétition : elle désigne la rivalité entre espèces vivantes pour l'accès aux ressources du milieu. La Prédation : la prédation correspond à une interaction temporaire, le temps que la proie soit capturée, puis dévorée par le prédateur. La prédation est très courante, et dans la nature les prédateurs jouent un rôle essentiel dans le maintien des équilibres écologiques.

- 25 -

L’Amensalisme : il s’agit d’une interaction biologique entre deux espèces dans laquelle une espèce inhibe le développement de l'autre. L'amensalisme est observé le plus souvent chez les végétaux. Un organisme peut aussi secréter une substance qui est nocive pour l'autre organisme. Par exemple, le champignon Penicillium peut produire des composés antibiotiques comme la pénicilline et inhiber la croissance des bactéries alentours. Les relations symbiotiques sont non-compétitives et comprennent la symbiose, le mutualisme, le commensalisme, le parasitisme, et le mimétisme. Tous les types de symbiose sont très efficaces et permettent d'atteindre un équilibre dans l'écosystème. Le mutualisme est une relation dans laquelle les deux espèces tirent avantage de l'association. Le commensalisme est une relation avantageuse pour l’un et neutre pour l'autre. Le terme parasitisme est généralement utilisé lorsqu’un des organismes (symbionte) porte atteinte ou vit aux dépens d'un autre organisme (hôte). La symbiose C’est l’association intime et durable entre deux ou plusieurs éléments. Les organismes sont qualifiés de symbiontes ; le plus gros peut être nommé Hôte. La symbiose n'est pas une association à bénéfices réciproques (« gagnant et gagnant ») comme habituellement énoncé. Elle l'est dans le sens où « survivre c'est transformer les inconvénients en avantages et éviter que les avantages deviennent des inconvénients ». La symbiose est une association à caractère obligatoire ou non et à avantages et/ou inconvénients

- 26 -

réciproques et partagés, entre partenaires ("locaux") avec des bénéfices ("globaux") sont pour la nouvelle entité émergente. La symbiose peut être de deux types : • L’ectosymbiose : le symbionte vit à la surface de l'hôte (ce qui inclut la paroi intestinale et les conduits des glandes exocrines) • L'endosymbiose : le symbionte est situé dans l'espace intercellulaire, intracellulaire (intra vacuolaire ou libre dans le cytoplasme). La coopération au sein de la mer, prend parfois une forme très inhabituelle. Quelques crevettes impériales font partie des nombreuses espèces de crevettes nettoyeuses qui vivent en symbiose avec d'autres animaux. Avec un peu d'attention, on la trouvera facilement à la surface des holothuries (concombre de mer), des étoiles de mer ou dans les branchies des grands nudibranches (danseuse espagnole). Elles y trouvent refuge et nourriture. Le Mutualisme : il s’agit d’une relation symbiotique dans laquelle le symbionte et l’hôte tirent tous les deux profit de l’association. C’est une interaction entre deux ou plusieurs espèces, cette association est facultative car les deux partenaires peuvent vivre l’un sans l’autre; à l’inverse du commensalisme, il y a une adaptation chez les deux espèces associées, car la modification de l’une peut influer sur la survie et la reproduction de l’autre. C’est le cas de la bactérie Wolbachia qui, par exemple, impliquée dans une relation mutualiste avec des vers parasites du système lymphatique et des tissus cutanés chez les vertébrés où elle participe au bon développement de

- 27 -

l’embryogénèse du nématode. En retour, Wolbachia a besoin de la filaire pour assurer son métabolisme. Le Commensalisme : c’est une relation symbiotique où une espèce fournit une protection pour d'autres espèces moins mobiles ou plus vulnérables. Les bactéries commensales du corps humain colonisent habituellement des sites spécifiques : par exemple Escherichia coli vit dans le colon chez l'homme et bénéficie des éléments nutritifs, de la chaleur, du milieu, et n’est généralement pas pathogène pour son hôte. C’est un type d’interaction biologique naturelle entre deux êtres vivants dans laquelle l'hôte fournit une partie de sa propre nourriture au commensal : il n’obtient en revanche aucune contrepartie évidente de ce dernier (le bénéfice de cette relation est à sens unique). Le commensalisme est une exploitation non-parasitaire d'une espèce vivante par une autre espèce, c’est une association non destructrice pour l’hôte, ce qui le différencie du parasitisme; ce dernier peut tout à fait continuer à vivre et évoluer en présence du commensal et, le plus souvent, « ignore » tout de la relation. Les survies des deux organismes ne sont pas interdépendantes. Le Parasitisme : c’est un terme qui vient du grec παά / para, « à côté » et ῖο / sitos, « blé, pain ». C’est une relation biologique symbiotique dont un des protagonistes (le parasite) tire un profit (en se nourrissant, en s'abritant ou en se reproduisant) aux dépens de son hôte. Les organismes qui ne sont pas parasites sont qualifiés de « libres ». On trouve des parasites dans l'ensemble du monde vivant : les virus sont considérés comme des parasites obligatoires. Certains

- 28 -

embranchements sont composés quasi exclusivement de parasites (exemple: les plathelminthes monogènes), bien que la plupart comportent à la fois des espèces parasites et libres (exemple : les nématodes). Les parasites sont parfois eux-mêmes victimes d'autres parasites, qui sont alors dits hyperparasites. Le plus souvent, les parasites sont nocifs pour l'organisme hôte. Les ectoparasites vivent à l'extérieur de l'hôte et endoparasites vivent à l'intérieur de l'hôte. Chaque fois que les organismes partagent les ressources de l'environnement, il y aura concurrence pour la nourriture et le territoire. Les organismes sont contraints d'occuper des niches spécifiques dans l'environnement, afin d'éviter le gaspillage d'énergie en compétition. Les organismes sauront également éviter la concurrence par le biais des relations de coopération au sein de l'écosystème. Réf. (1), (2), (3).

- 29 -

I. Introduction Dans le monde naturel, aucun organisme vivant ne peut vivre dans l'isolement absolu. Tous les organismes sont en interaction les uns avec les autres à travers une large variété de mécanismes. Les interactions qu’entretien un organisme avec son environnement sont essentiel à sa survie et au fonctionnement de l'écosystème dans son ensemble. La compréhension des interactions entre les organismes est donc une étape clé dans l'élucidation des processus biologiques. Dans la nature, il existe une grande variété d’interactions biologiques. Elles peuvent impliquer des individus de la même espèce et sont alors appelées interactions intraspécifiques. Elles peuvent également impliquer des individus d'espèces différentes, et on parle d’interactions interspécifiques (Werner EE, 1984). La caractérisation des interactions biologiques peut être basée sur leur mécanisme, ou sur la force, la durée et la direction de leurs effets (Wootton JT, 2005). Ainsi, les interactions biologiques peuvent être de différentes natures, caractérisées par l’intensité de l’interdépendance des organismes impliqués : symbiose, mutualisme, commensalisme, parasitisme, compétition et neutralisme sont principalement retrouvées dans la nature. La symbiose est un phénomène fréquent et important dans le monde vivant. Le mot « symbiose » vient d’un terme grec qui signifie « vivre ensemble », et il est utilisé pour décrire l'association entre deux ou plusieurs espèces d'organismes différents (De Barry, 1879 ; Cassier, 1998). L'interaction entre les organismes peut être permanente,

- 30 -

longue ou de courte durée (Mercot, 2009). Les organismes qui sont impliqués dans une symbiose peuvent en tirer un bénéfice (Wang, 2012), être lésés (Mitreva, 2009), ou ne pas être affectée par l'association. Les associations symbiotiques sont omniprésentes dans la nature, on en trouve entre bactéries, virus (Roossinck, 2011) ou encore entre les champignons et l'homme (Hooper, 2012). La symbiose peut être obligatoire (Shigenobu, 2011), et dans ce cas ni l’endosymbionte ni l'hôte ne peuvent survivre sans l'autre. Elle peut être également facultative, et alors elle concerne des organismes qui peuvent vivre librement l’un sans l’autre (Epstein, 2012). Les relations entre microorganismes peuvent être classées selon l’effet qu’elles ont sur les organismes concernés Si elles sont bénéfiques pour les deux organismes on parle de mutualisme. (Joyce, 2011). Si l’un des organismes en profite et que l'autre n'est pas significativement aidé ou lésé, on parle de commensalisme. Si la relation est néfaste pour l'un des deux organismes, au bénéfice de l'autre, il s’agit d’une relation de parasitisme ou de compétition, et si cet effet néfaste se traduit par la consommation de l’un des organismes par l’autre, il s’agit d’un phénomène de prédation. Les principaux types d’interactions entre espèces sont représentées par un (0), (+) ou (-) indiquant si les deux espèces concernées ont des effets nuls, positifs, ou négatifs respectivement. Par exemple, le commensalisme est (+, 0), le mutualisme est (+, +) et le parasitisme est (-, +). Cependant, ce sont des descriptions très simplistes et les exceptions à la règle sont fréquentes. (cf. Fig. I. 1)

- 31 -

Fig I. 1 . représentation schématique des différentes interactions interspécifiques pouvant être retrouvées dans la nature

- 32 -

Les relations symbiotiques peuvent être aussi classées en fonction de la localisation du symbionte par rapport à son hôte. L’endosymbiose est la forme la plus intime de la symbiose, c’est une relation dans laquelle le symbiote, partenaire intracellulaire, vit dans le tissu de l’hôte, deuxième partenaire symbiotique vivant (Mavingui, 2012). La symbiose fournit au symbionte un milieu nutritif riche dans un environnement protégé. La théorie endosymbiotique établi que certains organites de la cellule eucaryote, en particulier les mitochondries et les chloroplastes sont des endosymbiontes d’origine bactérienne (Emelyanov, 2003). Ces associations auraient conduit à l'acquisition par les eucaryotes de la machinerie métabolique de la respiration cellulaire et de la photosynthèse. A l’opposé, l’ectosymbiose est une relation dans laquelle le symbiote vit à la surface du corps de son hôte (Rinke, 2006). La mise en place d'une relation endosymbiotique semble généralement être établie par l’hôte, pour compenser ses capacités métaboliques et biochimiques limitées, ce qui lui permettra de prospérer dans un environnement ou selon un régime jusque-là inaccessible (Hoffmeister, 2003). La symbiose a joué un rôle crucial dans l'évolution des organites cellulaires comme les mitochondries et les chloroplastes, grâce à des associations impliquant des organismes procaryotes (Emelyanov, 2003). Ces associations ont conduit à l'acquisition par les eucaryotes de la machinerie métabolique de la respiration cellulaire et de la photosynthèse des endosymbiontes.

- 33 -

Pour les protozoaires, l’Endosymbiose est un phénomène clé car ce sont des représentants de lignées eucaryotes ayant évolué après l'acquisition de mitochondries et de chloroplastes par cette dernière. Le mot protozoaires a été défini par Goldfuss en 1818 (Imam, 2009), et signifie « les premiers animaux ». Il s’agit d’un groupe comprenant des organismes eucaryotes unicellulaires. Ce sont des protistes unicellulaires, pouvant disposer d’organites complexes (vacuoles, flagelles, cils), souvent hétérotrophes (par opposition aux protistes à affinité végétale), ils ingèrent leurs nourritures par pinocytose (engloutissant liquides / particules par invagination de la membrane plasmique) et / ou par phagocytose (engloutissant les grosses particules, qui peuvent nécessiter des interactions spécifiques) (Khan, 2009). Les protozoaires se reproduisent soit de manière asexuée par fission binaire (la cellule mère se divise par mitose en deux cellules filles), par fission multiple (la cellule mère se divise en plusieurs cellules filles), ou par la formation de spores ; soit sexuellement par conjugaison (deux cellules se rejoignent, les noyaux fusionnent pour produire une descendance par bourgeonnement ou fission) (Khan, 2006) Il existe plus de 200 000 espèces de protozoaires, dont près de 10 000 sont des parasites présents chez les invertébrés et dans presque toutes les espèces de vertébrés. Ils vivent dans l'eau, les sols humides ou à l'intérieur d'un organisme (dans le mucus pulmonaire, l'intestin, ou la panse de certains animaux...). Ils sont connus pour être responsables

- 34 -

de nombreuses maladies telles que la malaria et certaines dysenteries, comme l'amibiase. Ces organismes pathogènes causent des maladies majeures dans les pays tropicaux. Le paludisme est due à un parasite du genre , propagée par la piqûre de certaines espèces de moustiques anophèles ; la maladie du sommeil est provoquée par un trypanosome (protozoaire flagellé), qui est transmis par la piqûre de la mouche tsé-tsé ; la maladie de Chagas, provoquée par Trypanosoma cruzi, un trypanosome qui est transmis par des réduves, et la leishmaniose due au genre Leishmania de la famille des Trypanosomatidae sont transmises par la piqûre de certaines espèces de phlébotomes (Imam, 2009). Les protozoaires sont omniprésents dans la nature, car ils ont été isolés dans presque tous les habitats possibles. La plupart d'entre eux ne nourrissent par phagocytose, et beaucoup sont impliqués dans des associations symbiotiques. Chez l'homme, certaines espèces sont considérées comme des commensaux, d'autres sont des agents pathogènes en particulier pour les patients immunodéprimés, notamment les patients atteints du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) (Andreani, 2012). Les protozoaires sont les plus anciens organismes vivants et beaucoup d'entre eux ont évolué grâce aux associations symbiotiques. En outre ils ont joué un rôle important dans l'évolution de certains agents pathogènes humains, bactérien ou virale. Dans cette revue, nous allons discuter de l'interaction entre endosymbionte et hôte protozoaire en mettant l'accent sur l’endosymbionte bactérien des protozoaires. Grâce

- 35 -

à différents exemples, nous allons discuter des modifications et des adaptations qui ont contribué à développer et maintenir leur mode de vie à long terme.

II. La Classification des protozoaires : La classification des protozoaires est restée très controversée pendant une longue période, cependant 16 phylums ont été identifiés selon le catalogue of life 2013.  Le Acritarcha connu comme étant un organisme unicellulaire fossile (-3.2 millions d’année), pouvant être des kystes d’algues unicellulaires ancêtres des dinoflagellés.  Le phylum , comprend la classe des et la classe des . Ce sont des organismes unicellulaires parasitant des cellules animales, et formant des spores. Leur structure se compose d’un complexe apical permettant l’entrée dans la cellule hôte, et souvent d’une unique organelle, l’apicoplast. Certaines formes gamétaires peuvent avoir des flagelles ou des pseudopodes. Le genre (B. divergens, B. microti) qui est transmis par piqûre de tique (cf. fig. II.1), est le plus important agent causal de la babésiose. (Mosqueda, 2012).

Fig. II. 1. Vue au microscope de Babesia à l'intérieur des globules rouges. Réf. (4)

- 36 -

 Le phylum , est un groupe de rhizaires comprenant la plupart des protozoaires amiboïdes ou flagellés qui se nourrissent par des pseudopodes fileux (filopode). La plupart sont hétérotrophes mais ne disposent pas de vrai cytostome (bouche). Ils vivent dans les sols, en mer ou en eau douce. Certains sont devenus photosynthétiques en assimilant une algue verte. Leur plan de construction ancestral correspond à un prédateur amoeboflagellé phagotrophique avec un flagelle antérieur et un flagelle postérieur. Ce phylum comprend la classe des Chlorarachniophyceae (ex : espèce Clorarachnion reptans cf. Fig.II. 2) et la classe des Phytomyxea (Cavalier-Smith T, 2003).

Fig. II. 2 Cellule Amiboides du genre Lotharella amoeboformis, espèce Clorarachnion reptans extending many filose pseudopodia. (scale bar =10 um).(Ishida K., 2000)

 Le phylum Choanozoa, contient la classe des , aussi appelé . La plupart semblent plus proches des animaux que des champignons. Les Choanozoa ont été décrits comme possédant un cil postérieur (Cavalier Smith T, 2009). Il comprend des protozoaires nus avec un mode phagotrophique, ‐ caractérisés par une forme filiforme longue (filose) ou par des projections cellulaires (Cavalier-Smith T (a,b), 1998 ; Tong SM,

- 37 -

1997 ; Cavalier-Smith T, 2003), souvent impliqués dans l'alimentation. D'autres de ces protozoaires ont des parois cellulaires rigides, et sont saprotrophes (nécrophages, c'est à dire mangeant de la nourriture putride) et parasites (Shigenobu S, 2000).

 Le Phylum des Ciliophora, comprend la classe des Ciliatea. Les ciliés sont de grandes cellules simples, quelques- unes atteignent 2 mm de longueur, ce sont un groupe de protozoaires, caractérisés par la présence de poils appelés cils, qui sont diversement utilisées pour la mobilité, pour la reptation ou l’attachement, ainsi que pour l'alimentation et l’interaction avec le milieu extérieur. Les Ciliés sont l'un des plus importants groupes de protistes et comprend certains des protozoaires les plus complexes connus comme les Paramécies, et les genres (cf. Fig. II. 3), (cf. Fig. II. 4) et (cf. Fig. II. 5). Ils sont communément retrouvés dans presque tous les milieux aquatiques, dans les lacs, les étangs, les océans, les rivières et les sols.

Fig. II. 3. Stentor coeruleus cellule entière (les algues dans la cellule ont récemment ingérés euglénoïdes) (Lobban C, 2007)

- 38 -

Fig. II. 4. Vue du côté droit d'un individu typique Spirostomum Teres, spécimen vivant. Barres d'échelle: A, E = 100 um (Jang, 2012)

Fig. II. 5. Vorticella sp. Vorticella est un sessile, peritrich ciliées. La tige n'est pas branchée. Forme souvent des groupes, mais pas des colonies.Réf (5)

Les Ciliés présentent de nombreux membres ectosymbiotiques et endosymbiotiques, ainsi que certains parasites obligatoires et opportunistes. La plupart sont holozoique mais quelques formes sont des parasites et causent des dommages à leurs hôtes, y compris humains, comme coli, agent de la balantidose. Plusieurs espèces de parasites peuvent causer de graves problèmes pour les poissons d'aquarium et des poissons d’élevage. Certaines espèces sont pathogènes comme Anophryoides haemophila, l’agent causal de la maladie de Hodgkin Bumper, une affection grave des homards en captivité (Cawthorn, 1997).

- 39 -

 Le Phylum des Dinophyta, avec la Classe des , est généralement retrouvé dans les habitats marins sous forme de plancton (Gomez F, 2005) et dans les eaux douces (Taylor F, 2008). Leurs populations sont réparties en fonction de la température, la salinité ou la profondeur. Beaucoup de dinoflagellés sont connus pour être photosynthétiques, mais une grande partie d'entre eux sont en fait mixotrophes, combinant la photosynthèse et l'ingestion de proies (Stoecker D, 1999). Les dinoflagellés sont le plus grand groupe d’eucaryotes marins, après les diatomées (Edwards, 1993). Certains dinoflagellés sont des prédateurs d'autres protozoaires, et d’autres peuvent être des parasites.

 Le Phylum des , avec les classes des Euglenida et des trypanosomatidae, est un grand groupe de protozoaires flagellés. Ils comprennent une grande variété d’espèces libres, ainsi que quelques parasites importants, dont certains infectent les humains. Bien que certains membres de ce phylum, comme Euglena sp. (cf. Fig. II. 6) soient autotrophes, un certain nombre d'espèces hétérotrophes provoquent des maladies graves chez l'homme comme Trypanosoma sp. (cf. Fig. II. 7) qui est l’agent causal de la maladie du sommeil (Odiit M, 1997) et de la maladie de Chagas (Blum JA, 2008). Ces pathologies entraînent la mort dans environ la moitié des cas, et des lésions cérébrales permanentes chez beaucoup de patients.

- 40 -

Fig. II. 6. Euglena sp, cellules avec de nombreux chloroplastes discoïdes, de nombreux petits grains de forme d'anneau et de nombreux pigments orange disperser dans le cytoplasme. Réf. (6)

Fig. II. 7. Trypanosoma sp. Parasites dans les frottis de sang d'un patient atteint de trypanosomiase africaine. Réf (7)

 Le Phylum des Flagellata, est représenté par des protozoaires qui se déplacent à l'aide de flagelles similaires à des cils (cf. Fig. II.8), mais beaucoup plus long et souvent seul. Une caractéristique intéressante de ce groupe est la présence de "l'œil" dénommé stigma. Cet organite n'est pas un vrai œil, il offre une sensibilité à la lumière et à l'obscurité, une caractéristique très importante pour cette créature photosynthétique.

Fig. II. 8. Flagellata. Réf (8)

- 41 -

 Le Phylum des Labyrinthista, avec la Classe des Labyrinthulea, comprend des champignons dont les zoospores portent deux flagelles. Il regroupe des parasites d’animaux, des agents pathogènes pour les mollusques sans coquille (Howard D, 2002).

 Le Phylum des Mycetozoa, avec les classes des Acrasiomycetes, Dictyosteliomycetes, Myxomycetes et Protosteliomycetes, regroupe des organismes eucaryotes unicellulaires nucléés. Le cycle de vie des mycétozoaires est caractérisé par une alternance de formes unicellulaires, amiboïdes (la myxamibe) ou flagellées (le myxoflagellé), et de phases pluricellulaires, ou plurinucléées. Les mycétozoaires affectionnent les milieux humides et riches en matière organique en décomposition. Hétérotrophes, ils absorbent les bactéries et les particules en décomposition par phagocytose. En général, ils se multiplient par simple mitose, mais lorsque les conditions environnementales deviennent défavorables, ils forment des amas cellulaires qui produisent des spores haploïdes dans un organe bien différencié, le sporocarpe. (Fiore-Donno, 2010).

 Le Phylum des , comprend la Classe des . Ce sont des parasites, leurs modes d’alimentation se fait par myzocytose (aspiration de l'intérieur des cellules plutôt que de les engloutir par phagocytose). Ils possèdent généralement des alvéoles corticales bien développées (Cavalier-Smith T, 2006).

- 42 -

 Le Phylum des Parabasalia, constitue un clade de protozoaires flagellés dépourvus de mitochondries (Bui ET, 1996). Certains parabasalides comme Trichonympha (cf. Fig. II. 9) vivent comme mutualistes dans les intestins des termites (Ohkuma M, 2005) et des cafards, où ils produisent, avec l’aide d’endosymbiontes bactériens, des enzymes qui décomposent le bois (cellulase) principal élément du régime alimentaire de leur hôte. D'autres sont des pathogènes humains comme Richomonas vaginalis est un parabasalide qui provoque une maladie sexuellement transmissible chez l'homme. (Carlton, 2007).

Fig. II. 9. Trichonympha. Réf. (9)

 Le Phylum des , contient la classe des Heterolobosea. La plupart des Percolozoa sont des bactérivores retrouvés dans le sol, l'eau douce, et les matières fécales. Il existe quelques formes marines et parasitaires, qui peuvent devenir pathogènes et sont souvent fatales pour l'homme comme Naegleria fowleri (cf. Fig. II. 10), agent causal de la méningo- encéphalite amibienne primitive (Page, 1985).

- 43 -

Fig. II. 10. Image microscopique montrant Naegleria fowleri infection du cerveau. Réf. (10)

Ce groupe est étroitement lié à celui des Euglenozoa, et partage avec eux la caractéristique inhabituelle mais non unique d'avoir des mitochondries à crêtes discoïdes. Généralement elles sont sous forme amiboïde lorsque la nourriture est abondante, et sous forme flagellée pour la locomotion rapide. Tous les membres peuvent se présenter sous les deux formes (Cavalier-Smith T, 1991).

 Le Phylum des Sarcomastigophora, contient les classes des Phytomastigophora et des Zoomastigophora. Il comprend de nombreuses formes abondantes et écologiquement importantes. Tous sont unicellulaires autotrophes ou hétérotrophes (Levine, 1980), ils sont munis de flagelles ou de pseudopodes, comportant un seul type de noyau, leur reproduction est essentiellement asexuée. Certains sont munis de chloroplastes et ont une affinité végétale (Protozool J, 1965).

- 44 -

 Le Phylum des Xenophyophora, contient la classe des Psamminida, et a été découvert par des scientifiques britanniques dans l'Atlantique Nord. Ce phylum contient le plus grand spécimen unicellulaire jamais trouvé. Il s'agit d'un xenophyophore marin globulaire de 10 cm à 20 cm de diamètre, Syringammina fragilissima (cf. Fig. II. 11). Depuis il est considéré comme le «géant» du monde protozoaire aquatique. Ils semblent se nourrir à l'aide de pseudopodes en engloutissant leurs nourritures d'une manière similaire aux amibes (Levin L, 1994; Margulis L, 1998).

Fig. II. 11. Syringammina fragilissima. Réf. (11)

 Le dernier phylum n’a pas encore été nommé, mais il regroupe 7 embranchements distincts : les Classes des Acantharia, Filosia, Granuloreticulosea, Haplosporea, Heliozoa, & Sporozoa.

- 45 -

III. L’endosymbiose chez les protozoaires Si les endosymbioses des mitochondries et des plastes ont été les plus importantes pour l'évolution des eucaryotes, elles ne sont pas les seules. En effet, les endosymbioses intracellulaires se poursuivent actuellement et continuent de permettre des adaptations supplémentaires. Elles sont probablement liées à la capacité des eucaryotes à faire des endocytoses qui facilitent l'accès à l'intérieur de la cellule. Beaucoup d'organismes comptent sur les relations symbiotiques, dans lequel deux espèces dépendent les uns des autres pour leur survie. τn ne connaît qu’un seul exemple d'endosymbiose bactérie/bactérie avec la présence d'une eubactérie à l'intérieur d'une autre eubactérie : il s’agit de la symbiose entre les bactéries Tremblaya princeps et Moranella endobia Elles sont impliquées dans une relation de symbiose triple avec les insectes parasites Coccoidea (Cochenille). En effet, cet insecte parasite doit transformer la sève de la plante en éléments nutritifs, mais n'a pas la capacité de le faire seul. Il s'appuie sur la bactérie Tremblaya princeps pour gérer le processus de conversion, mais cette bactérie ne peut pas tout faire non plus. Tremblaya princeps gère une partie de la conversion en acides aminés, puis elle s’en remet à une deuxième bactérie, plus petite, Moranella endobia. Cette bactérie vit à l'intérieur de Tremblaya princeps, et possède le complément nécessaire pour transformer la sève de la plante en éléments nutritifs. La cochenille doit s'appuyer sur ces deux bactéries pour se nourrir. (Mc Cutcheon, 2011).

- 46 -

Les endosymbioses les plus connues sont de type eucaryote/eubactérie ou eucaryote/eucaryote ou une combinaison des deux. En effet, dans certains cas, un même hôte peut héberger plusieurs symbiotes. Les hôtes partenaires dans ces relations sont donc généralement les eucaryotes, en raison de leur plus grande taille de cellule, la phagocytose et la limite des capacités métaboliques, tandis que les endosymbiotes partenaires peuvent soit être des procaryotes ou des eucaryotes (Keeling, 2009). L'inventaire des endosymbioses est loin d'être terminé mais nous savons cependant que pratiquement tous les groupes d'eucaryotes ont la possibilité de porter des symbiontes. Pour l'endosymbionte, le milieu intracellulaire des eucaryotes offre un milieu riche et protégé, des infections virales par exemple. Pour l’hôte, les avantages sont de natures diverses: capacité de synthétiser des matières carbonées, des acides aminés, des métabolites secondaires toxiques ou de fixer l'azote... (Udvardi U, 2013). Une grande variété de fonctions physiologiques intervient dans le monde endosymbiotique. La durée et l’intensité de l'association permettent le classement des endosymbiotes, qui peuvent êtres obligatoires ou facultatifs. L’endosymbiote primaire est obligatoire et semble issue d’une longue histoire évolutive avec l'hôte alors que les associations plus récentes avec l’hôte sont facultatives avec la possibilité de revenir à la vie libre (Baumann, 2005).

- 47 -

III.1. Endosymbiose primaire :

 Définition : c’est une association obligatoire dans laquelle l’endosymbionte procaryote est englouti par un hôte généralement eucaryote. Dans le cadre de l'acquisition de plastes, l’endosymbiose mène à des plastes primaires (Gould, 2008). Très répandues, elles permettent aux bactéries d'occuper une niche protégée et aux eucaryotes d'acquérir des capacités métaboliques qu'ils n'ont pas normalement. (cf. Fig. III. 1. 1)

- 48 -

Fig. III. 1. 1. Résumé de l'ensemble des symbioses eucaryotes/eubactéries connues actuellement. D'après Nature Reviews in Genetics 2008

- 49 -

 Exemples:

A. Symbionte fixateurs d’azote N2  Rhopalodia gibba est une algue microscopique, une diatomée pennée de la famille des Epithemiaceae (Geitler, 1977) qui porte dans son cytoplasme des "corps sphéroides" qui dérivent de cyanobactéries (cf. Fig. III. 1. 2) Fig. III. 1. 2. Corps sphéroïde (Prechtl J, 2004) (a) Ultrastruture d'un corps sphéroïde. (b) Fraction du corps sphéroïde de gradients de Percoll, montrant que les corps sphéroïdes peuvent être isolés sans contamination cellulaire importante. SM, membrane symbiontophoric; SBM1, la membrane interne du corps sphéroïde; SBM2, la membrane extérieure du corps sphéroïde.

La cyanobactérie est proche de la cyanobactérie libre « Cyanothece », mais ne semble pas pouvoir être cultivée hors de la cellule hôte. Elle est transmise au cours de divisions. Il s'agit donc plus d'une organelle que d'un symbionte. Elle ne fait pas de photosynthèse mais fixe l'azote atmosphérique, et ceci pendant le jour. Chez les cyanobactéries, il y a une incompatibilité entre la photosynthèse productrice d'oxygène et la fixation de l'azote atmosphérique, très sensible aux oxydations. Ainsi, si les eucaryotes ne sont pas capables de fixer l'azote N2, il existe de

- 50 -

nombreuses symbioses (chez d'autres diatomées, des invertébrés...) avec des cyanobactéries fixatrices d'azote (Nowack, 2010). Un autre très connue se fait entre les bactéries du genre Rhizobium et les légumineuses, ou les bactéries du genre Frankia et autres huit familles de plantes (dont les rosacées) (Wang E T, 2000).

 Les Rhizobium sont localisées chez les espèces de légumineuses au niveau de nodules racinaires. La formation des nodules est initiée par l’infection du tissu méristématique par ces bactéries d’origine environnementale. Cet organe se compose en son centre de cellules hébergeant les symbiontes qui forment la zone infectée, puis d’une couche cellulaire périphérique très dense de petites cellules qu’on appelle la couche limite (boundary layer). Cette couche étant très peu perméable à l’oxygène, les concentrations en

O2 dans la zone infectée sont très faibles (<1µM). Ces conditions anoxiques sont nécessaires à la fixation de l’azote par les nitrogénases bactériennes, qui catalysent la réduction de l’azote atmosphérique (σ2) en ammonium (σH3). L’existence d’une autre couche, plus externe, dont les cellules augmentent de volume en

fonction des concentrations d’τ2 atmosphérique garantit le maintien de l’anoxie quelles que soient les concentrations en oxygène dans l’environnement (Parsons, 1990).

- 51 -

B. Endosymbionte fixateur de Méthanogènes Les Ciliés anaérobies se trouvent dans les sédiments aquatiques anoxiques à travers le monde, ils vivent en symbiose dans les entrailles de nombreux animaux, en particulier, ceux qui s'appuient sur la fermentation des bactéries pour la digestion de la matière végétale structurelle ( Fenchel, 1991 ). Beaucoup de ciliés anaérobies vivant en liberté sont connus pour contenir des archées méthanogènes endosymbiotiques, par exemple contortus, Trimyema sp. et Cyclidium porcatum. Ces ciliés contiennent des symbiontes appelés hydrogénosomes, soit des organites qui produisent du H2, et qui sont censés avoir été dérivés d’archées, Toutefois, en raison de l'absence de données génomiques pour ces endosymbiontes, la nature des associations reste spéculatif. Ces symbioses semblent avoir un caractère facultatif pour les deux partenaires. Un aspect intéressant des symbioses est leur diversité morphologique. Dans M. contortus, la paroi cellulaire de l’endosymbionte semble être dépouillée, ce qui va de pair avec une augmentation de sa taille. L’endosymbionte de Trimyema conserve sa paroi cellulaire mais change de taille et de forme pour former une grande structure stellaire. (Nowack, 2010).

C. Endosymbionte sécréteur de toxine  Rhizopus microsporus est un champignon Zygomycète du sous- embranchement des Mucoromycotina qui détruit les jeunes pousses de riz et peut causer des graves pertes de rendement (cf. Fig. III. 1. 3). En fait, ce champignon vit en symbiose avec une

- 52 -

bactérie du genre Burlkhoderia qui produit une toxine, la Rhizoxine, un polykétide. Cette toxine est responsable de la destruction des pousses (Castillo D, 2010). La bactérie peut être cultivée indépendamment du champignon mais lorsque le champignon est séparé de ses bactéries, il devient incapable de former ses spores:

Fig. III. 1. 3. Microscopie de Cultures de R. microsporus (A) aspect typique montrant des hyphes de type sauvage, columellae et sporanges globuleux avec des spores. (B) La souche guéri ne fait pas les bars sporangia. Barres d'échelle 30 μm. (Partida-Martinez, 2007) La réintroduction de bactéries rend le champignon de nouveau capable de les différencier. Plusieurs autres champignons vivent en symbiose avec des bactéries sans que l'on en connaisse les avantages respectifs. Il existe de nombreux autres exemples de bactéries conférant la capacité de produire des toxines. Certains tuniciers (animaux "chordés" apparentés aux vertébrés) sont associés à des

- 53 -

cyanobactéries (à la fois sous forme d'ectosymbioses et d'endosymbioses) leur permettant à la fois une autonomie alimentaire mais aussi probablement une protection car ces animaux accumulent des toxines d'origine cyanobactérienne (Neveux J, 1988). De nombreux dinoflagellés portent aussi des bactéries endosymbiotiques qui semblent être à l'origine des toxines qu'ils excrètent. Enfin, chez les paramécies (ciliés), des bactéries se transmettant avec le cytoplasme au cours de la reproduction sexuée et produisent des toxines tuant les paramécies dépourvues de bactéries (les particules kappa). (Meyer E, 2005)

D- Endosymbiontes Photosynthetiques Les symbiontes cyanobactériens des Gloméromycètes de l’espèce « Geosiphon pyriforme» (cf. Fig. III. 1. 4), et les symbiontes de l’amibe Cercozoa Paulinella chromatophora (cf. Fig. III. 1. 5) représentent des endosymbioses nutritionnelles de type "plastes" indépendantes de l’endosymbiose primaire principale et visiblement moins abouties

Fig. III. 1. 4. Cyanobactéries Nostoc Symbiontes de Geosiphon Nostoc est un organisme procaryote réalisant la photosynthèse et fixant l’azote Ref. (12)

- 54 -

Fig. III. 1. 5. Paulinella Chromathophora Affichant ses deux chromatophores. Réf. (13)

Dans le cas de Geosiphon pyriforme, les cyanobactéries (du genre Nostoc sp.) peuvent vivre indépendamment du champignon alors que celui-ci a besoin d’elles pour survivre. Celles-ci ne sont pas transmises par les spores au cours de la reproduction du champignon (Kluge M, 2008). Dans le cas de Paulinella, les "plastes" sont appelés chromatophores, les comparaisons de séquences indiquent une origine du chromatophore indépendante par rapport à l’endosymbiose primaire des autres eucaryotes photosynthétiques. Comme, ils échangent des métabolites avec leur cellule hôtes, certains les considèrent comme de vrais plastes (Nowack EC, 2008). Ces symbioses bactériennes commencent à être très étudiées car elles pourraient aider dans la lutte contre certains fléaux en particulier chez les insectes et les nématodes ou aider à l'amélioration des rendements de fixation du gaz carbonique. En effet, dans certains cas, l'association est obligatoire et la mort des bactéries entraîne la disparition de l'hôte. Un traitement avec des antibiotiques suffit alors pour se débarrasser du parasite.

- 55 -

III.2. Endosymbiose secondaire ou tertiaire :

 Définition : c’est un processus dans lequel une cellule eucaryote engloutit une autre cellule eucaryote qui est elle-même en endosymbiose primaire. C’est une relation très étroite entre un endosymbionte eucaryote photosynthétique et un hôte eucaryote. Généralement facultative, cette symbiose mène à l’acquisition de plastes tertiaires. (Archibald, 2009)  Exemples :  Les zooxanthelles sont algues unicellulaires, symbiontes d'invertébrés marins et les zoochlorelles sont des chlorophycées du genre Chlorella, endosymbiontes d’invertébrés d'eau douce ou de protozoaires (Todd, 2012). Ces symbioses peuvent représenter les premières étapes d’endosymbiose secondaires. σéanmoins, pour beaucoup d’entre elles, les larves d'invertébrés ne reçoivent pas les symbiontes de leurs parents et les acquièrent elle-même. Les membres du genre Chlorovirus sont des virus cytopathogènes qui infectent certains isolats d’algues vertes unicellulaires apparentées à la chlorelle. Le Paramecium bursaria chlorella virus (PBCV1) est le virus prototype du genre ; il infecte la chlorelle, une algue normalement associée de façon endosymbiotique et héréditaire au protozoaire P. bursaria (Van Etten JL, 2003). La chlorelle endosymbiotique, aussi appelée zoochlorelle, est résistante à l’infection virale : seules les algues séparées du cilié sont sensibles à l’infection. À

- 56 -

l’heure actuelle, le cycle biologique de ces algues unicellulaires et leur mode d’association et de dissociation avec P. bursaria sont mal définis (Markine-Goriaynoff ,2005).  Hatena arenicola, est un flagellé, qui entretient une relation endosymbiotique avec une algue verte intracellulaire du genre Néphroselmis ayant conservé son noyau et son réseau de membranes internes. Elle possède un plaste 10 fois plus gros que celui des espèces vivant librement. Le flagellé, lorsqu’il se divise, donne naissance à une cellule avec l’algue et une autre sans algue (Nowack, 2010)

N: noyau. S: Symbiont. La barre d'échelle est de 10 um

- 57 -

Cela donne naissance à deux cellules différentes, une photo- autotrophe (F) et l'autre phagotrophe (E):

Fig. III. 2. 1. Répartition inégale du plaste lors de la division de H. arenicola. (Okamoto N, 2006)

La forme sans algue possède un appareil « buccal » qui lui permet de phagocyter une autre algue. Si l'algue est de la bonne espèce, son plaste grossit et l’appareil « buccal » régresse. Le flagellé devient alors dépendant de son algue pour son alimentation. - acidotum est un dinoflagellé non-photosynthetique, dépourvu de plaste et qui ingère des endosymbiontes, algues bleu-vert appelés Cryptophytes.

Fig. III. 2. 2. Microscope optique des dinoflagellés Gymnodinium acidotum. (a) G. acidotum abrite des plastids bleu-vert-, transitoires qui sont issus d'unealgue cryptophyte. (Kim E, 2010)

- 58 -

Les chloroplastes des Cryptophytes et d'autres organites sont séquestrés pendant plusieurs semaines dans le cytoplasme des Dinoflagellés et restent dans une symbiose obligatoire utilisés par l’hôte pour la photosynthèse. Les modifications ultra-structurales et physiologiques drastiques se produisent dans les organelles des Cryptophytes pendant la période de rétention dans les dinoflagellés qui sont au final digérés. (Larsen J, 1988). -Les Foraminifères sont des protistes amiboides, qui peuvent avoir une relation symbiotiques avec les dinoflagellés, diatomées, chlorophytes, rhodophytes, chrysophytes et . Ces symbiontes résident dans le cytoplasme de l'hôte enfermé dans une vacuole symbiote (Richardson 2001 ; Holzmann, 2006).

IV- Adaptation de l’endosymbionte bactérien au style de vie de l’hôte Afin de développer une relation symbiotique à long terme, l’endosymbionte et son hôte co-évoluent pour s'adapter à la nouvelle situation. A. Adaptation du symbionte : Il semble que le génome de l’endosymbionte devient plus petit au cours du processus d'adaptation (Boyer M, 2011), par la perte de gènes qui étaient devenus inutiles dans le nouvel environnement (Moya, 2008). Pour la plupart, il s’agit de gènes de réparation de l’ADσ et de la régulation transcriptionnelle. En revanche, les gènes

- 59 -

impliqués dans la réplication de l'ADN, la transcription et de traduction et tous les composants essentiels de la machine translocation des protéines sont maintenus (Shigenobu, 2000). De même, les gènes du métabolisme bactérien, à la base de la relation symbiotique nécessitent d’être conservés. La taille du génome des bactéries endosymbiotiques se situe entre 0,4 et 1,9 Mo (Nowack, 2010). Cette réduction consiste en la perte de gènes de la voie de la biosynthèse et de la fonction de réglementation qui ne sont pas essentiels pour mener une vie intracellulaire, car ces pertes sont compensées par les fonctions de l’hôte (Moya, 2008). Certains endosymbiontes bactériens semblent avoir des systèmes d’adaptation particuliers qui leur permettent d'éviter ou de résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Le polymorphisme des protéines de membrane externe semble également contribuer à la tolérance des bactéries symbiotiques. La modification de la structure de la surface utilisée pour la reconnaissance peut être une stratégie de fuite comme le montre pour la bactérie à Gram négatif Sodalis glossinidus, l’endosymbionte de la glossine, ou mouche tsé-tsé (Wernegreen, 2002 ; Weiss, 2008). D’autres endosymbiontes bactériens, telles que Wolbachia (Bourtzis, 2000) et Spiroplasma peuvent soit ne pas déclencher une réponse immunitaire, soit peut interférer activement avec le système immunitaire de l'hôte, empêchant ainsi une réponse immunitaire.

- 60 -

B. Adaptation de l’hôte : Alors que la réduction génomique est nécessaire pour l'adaptation de l’endosymbionte, celle de l’hôte se fait par des moyens différents : le développement de nouvelles cellules spécialisées où l’endosymbionte va survivre, le développement du système de contrôle le contrôle de la croissance des populations symbiotiques et se développe et la modification de la réponse immunitaire pour maintenir l’endosymbiote et éviter son élimination (Ghedin, 2007). Les processus d'adaptation cités sont les plus importants développés par les hôtes. L’acquisition d’une nouvelle structure est un caractère commun de tous les grands exemples de symbioses. Cette structure doit permettre à l’hôte d’héberger les symbiontes tout en assurant les échanges nécessaires au maintien de la relation symbiotique. Les adaptations morphologiques de l’hôte sont plus ou moins importantes. Elles vont de la simple réorganisation cellulaire à l’extension d’un organe préexistent, voire l’établissement d’une nouvelle structure. Ce paragraphe présente quelques adaptations au travers d’exemples représentatifs.

Conclusion Le succès évolutif des endosymbioses est évident au vu de la vaste gamme de groupes eucaryotes qui ont créé des associations endosymbiotiques. Les endosymbiontes des protozoaires peuvent effectuer une multitude de nouvelles fonctions biochimiques dans les cellules hôtes, tels que la photosynthèse, la fixation d'azote, recyclage

- 61 -

de l'azote, la méthanogénèse ou l'oxydation des sulfures. En contrepartie, l’hôte protozoaire fournit à l’endosymbionte un environnement nutritif protégé. Des associations existant dans la nature pourraient révéler de nouvelles perspectives fascinantes concernant l'évolution et la diversité des eucaryotes et des procaryotes, associations qui ne peuvent être obtenues en utilisant des modèles classiques d’études des organismes. Les tentatives visant à isoler et étudier ces associations endosymbiotiques en culture devraient être encouragés. Une culture représente une base indispensable pour examiner le cycle de vie d'une endosymbiose et, avec lui, de déterminer la stabilité de l'association et son caractère permanent ou périodique, obligatoire ou facultatif. L’étude phylogénétique, qui ne dépend pas nécessairement de la disponibilité d'une culture, peut aider à comprendre la spécificité d'une relation symbiotique et d'élucider son histoire évolutive. Pour une bonne compréhension du rôle physiologique d'un endosymbionte, l’étude des génomes est indispensable. Des recherches plus approfondies pourraient également aider à comprendre le processus complexe de l'évolution des organites qui ont marqué la vie sur cette planète.

- 62 -

References bibliographiques (1) Symbionts, Parasites, Hosts, and Cooperation - MarineBio.org". MarineBio , Conservation Society. Web. Wednesday, July 24, 2013 (2) Extraits tirés du livre Écologie chimique par Alain Fuchs, président du CNRS http://www.cnrs.fr/inee/communication/ actus/docs/DP_Ecologie_chimique.pdf (4) Centers for Disease Control and Prevention http://phil.cdc.gov/phil/details.asp?pid=5943 (5) Droplet, a website devoted to microscopy of protozoa http://www.pirx.com/droplet/gallery/vorticella/vorticella15.jpg (6) Microbial Digital Specimen Archives http://protist.i.hosei.ac.jp/pdb/images/mastigophora/euglena/uniden tifed/Other_Euglena_2.jpg. (7) Centers for Disease Control and Prevention/Dr. Myron G. Schultz http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/03122002/00002/PHIL_613_lore s.jpg. (8) http://adesahy.blogspot.fr/2010/12/reproduksi.html (8) (9) Taxa of Life/J. Holt & C. http://comenius.susqu.edu/biol/202/ assignments/week-6/week06.htm (10) Centers for Disease Control and Prevention http://i1.tribune.com.pk/wp-content/uploads/2013/05/553441- naegleriafowleri-1369341831-147-640x480.jpg (11) New Scientist Media Centre http://www.newscientist.com/article/dn18468-zoologger-living- beach-ball-is-giant-single-cell.html#.UifHDGRJX9I. (12) Dépt de Biologie et Centre d’Études σordiques Université Laval, Québec,Canada Dr. Warwick Vincent. http://www.cen.ulaval.ca /merge/index.php?url=21213. (13) How an Earns Tenure, American society of Microbiology by S. Marvin Friedman, 2012. http://schaechter.asmblog.org/.a/6a00d8341c5e1453ef016767992d 89970b-320wi

- 63 -

Andreani,G., Lodge,R., Richard,D., and Tremblay,M.J. (2012). Mechanisms of interaction between protozoan parasites and HIV. Curr. Opin. HIV. AIDS 7, 276-282. Archibald J. M. (2009). The puzzle of plastid evolution. Curr. Biol. 19, R81–R88 Baumann,P. (2005). Biology bacteriocyte-associated of sap-sucking insects. Annu. Rev Microbiol. 59, 155-189. Blum, J. A., Zellweger, M. J., Burri, C., & Hatz, C. (2008). Cardiac involvement in African and American trypanosomiasis. The Lancet Infectious Diseases, 8(10), 631-641. Bourtzis,K., Pettigrew,M.M., and O'Neill,S.L. (2000). Wolbachia neither induces nor suppresses transcripts encoding antimicrobial peptides. Insect Mol. Biol. 9, 635-639. Boyer, M., Azza, S., Barrassi, L., Klose, T., Campocasso, A., Pagnier, I., ... & Raoult, D. (2011). Mimivirus shows dramatic genome reduction after intraamoebal culture. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(25), 10296-10301. Bright, M., & Bulgheresi, S. (2010). A complex journey: transmission of microbial symbionts. Nature Reviews Microbiology, 8(3), 218-230. Bui, ET; Bradley, PJ; Johnson, PJ (1996). "A common evolutionary origin for mitochondria and hydrogenosomes.". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 (18): 9651–6. Carlton, J. M., Hirt, R. P., Silva, J. C., Delcher, A. L., Schatz, M., Zhao, Q., ... & Gupta, A. (2007). Draft genome sequence of the sexually transmitted pathogen Trichomonas vaginalis. Science, 315(5809), 207-212. Castillo D. M. ; Pawlowska T.E (2010). Molecular biology and evolution A., Oxford University Press, vol. 27, n° 3, pp. 622-636

- 64 -

Catalogue of Life, 28 janury 2013, classification of protozoa. Cavalier-Smith T, Chao EE (2003). "Phylogeny and classification of phylum Cercozoa (Protozoa)". 154 (3–4): 341–58 Cavalier-Smith,T. (a) (1998). A revised six- system of life. Biol. Rev Camb. Philos. Soc. 73, 203-266. Cavalier‐Smith, T. (2009). "Megaphylogeny, cell body plans, adaptive zones: causes and timing of basal radiations". The Journal of eukaryotic microbiology 56 (1): 26–33 Cavalier-Smith T (b) (1998). Neomonada and the origin of animals and fungi. In: Coombs GxGH, Vickerman K, Sleigh MA, Warren A, editors. Evolutionary relationships among Protozoa. London: Chapman and Hall. pp. 375–407. Cavalier-Smith T (2003). Protist phylogeny and the high-level classification of Protozoa. Eur J Protistol 39: 338–348. Cavalier-Smith T (2006). Protozoa: the most abundant predators on earth. Microbiology today.pp.168 Cavalier-Smith, T. (1991). "Cell diversification in heterotrophic ". In D.J. Patterson & J. Larsen. The Biology of Free-living Heterotrophic Flagellates. Oxford University Press. pp. 113–131. Cawthorn,R.J. (1997). Overview of "bumper car" disease--impact on the North American lobster fishery. Int. J. Parasitol. 27, 167-172. De Bary A (1879) Die Erscheinung der symbiose. Verlag von Karl J. Trubner, Strassburg Douglas, A. E. (1998). Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annual review of entomology, 43(1), 17-37. Edwards, L.E., (1993): Chapter 7: . In: Lipps, J.H. (ed.), Fossil Prokaryotes and . Boston: Blackwell Scientific Publications, 105-129.

- 65 -

Emelyanov,V.V. (2003). Mitochondrial connection to the origin of the eukaryotic cell. Eur. J. Biochem. 270, 1599-1618. EnTao, W., Martínez-Romero, E., & Triplett, E. W. (2000). Phylogeny of root-and stem-nodule bacteria associated with legumes. Prokaryotic nitrogen fixation: a model system for the analysis of a biological process., 177-186. Epstein,B., Branca,A., Mudge,J., Bharti,A.K., Briskine,R., Farmer,A.D., Sugawara,M., Young,N.D., Sadowsky,M.J., and Tiffin,P. (2012). Population genomics of the facultatively mutualistic bacteria Sinorhizobium meliloti and S. medicae. PLoS. Genet. 8, e1002868. Fiore-Donno, A. M., Nikolaev, S. I., Nelson, M., Pawlowski, J., Cavalier-Smith, T., & Baldauf, S. L. (2010). Deep phylogeny and evolution of slime moulds (Mycetozoa). Protist, 161(1), 55-70. Geitler, L. (1977). Zur Entwicklungsgeschichte der Epithemiaceen Epithemia, Rhopalodia und Denticula (Diatomophyceae) und ihre vermutlich symbiotischen Sphäroidkörper. Plant Systematics and Evolution, 128(3-4), 259-275.Gould S. B., Waller R. R., McFadden G. I. 2008. Plastid evolution. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 491–517. Ghedin, E., Wang, S., Spiro, D., Caler, E., Zhao, Q., Crabtree, J. et al. (2007) Draft genome of the filarial nematode parasite Brugia malayi. Science 317: 1756-1760. Gómez, F. (2005). A list of free-living species in the world’s oceans. Acta Botanica Croatica, 64(1), 129-212. Hoffmeister,M. and Martin,W. (2003). Interspecific evolution: microbial symbiosis, endosymbiosis and gene transfer. Environ. Microbiol. 5, 641-649. Holzmann M. ,Berney C. ,Hohenegger J. (2006). identification moléculaire des endosymbionts diatomées dans nummulitid foraminifères . Symbiose 42 , 93 - 101

- 66 -

Hooper,L.V., Littman,D.R., and Macpherson,A.J. (2012). Interactions between the microbiota and the immune system. Science 336, 1268- 1273. Howard, D. H. (Ed.). (2002). Pathogenic fungi in humans and animals. CRC Press. Imam, T. S. (2009). The complexities in the classification of protozoa: a challenge to parasitologists. Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 2(2), 159-164.Jeremiah D. Hackett, Donald M. Anderson, Deana L. Erdner, and Debashish Bhattacharya, Dinoflagellates: a remarkable evolutionary experiment, Am. J. Bot. October 2004 91:1523-1534. Ishida K., N. Ishida, and Y. Hara (2000). Lotharella amoeboformis sp. nov.: a New Species of Chlorarachniophytes from Japan. Phycological Research 48(4):221-230. Jang, S. W., Kwon, C. B., & Shin, M. K. (2012). First Records of Two Spirostomum (Heterotrichea: Heterotrichida: Spirostomidae) from Korea. Journal of Animal Systematics, Evolution and Diversity, 28(1), 29-35. Joyce,S.A., Lango,L., and Clarke,D.J. (2011). The Regulation of Secondary Metabolism and Mutualism in the Insect Pathogenic Bacterium Photorhabdus luminescens. Adv. Appl. Microbiol. 76, 1- 25. Keeling, P. J. (2009). Chromalveolates and the Evolution of Plastids by Secondary Endosymbiosis1. Journal of Eukaryotic Microbiology, 56(1), 1-8. Khan, N. A. (2009). Acanthamoeba: biology and pathogenesis. The Publisher. Khan, N. A. (2006). Acanthamoeba: biology and increasing importance in human health. FEMS microbiology reviews, 30(4), 564- 595.

- 67 -

Kluge, M. (2008). Ecophysiology: Migrations Between Different Levels of Scaling. In Progress in Botany (pp. 5-34). Springer Berlin Heidelberg. Larsen, J. (1988). An ultrastructural study of poecilochroum (Dinophyceae), a phagotrophic dinoflagellate feeding on small species of cryptophytes. Phycologia, 27(3), 366-377. Levine, N. D., Corliss, J. O., Cox, F. E. G., Deroux, G., Grain, J., Honigberg, B. M., ... & Wallace, F. G. (1980). A Newly Revised Classification of the Protozoa*. Journal of Eukaryotic Microbiology, 27(1), 37-58. Levin, L. A. (1994). Paleoecology and ecology of xenophyophores. Palaios, 32-41. Lobban, C. S., Hallam, S. J., Mukherjee, P., & Petrich, J. W. (2007). Photophysics and Multifunctionality of Hypericin Like Pigments in Ciliates: A Phylogenetic Perspective. Photochemistry and photobiology, 83(5), 1074-1094. ‐ Kim, E., & Archibald, J. M. (2010). Plastid evolution: gene transfer and the maintenance of'stolen'organelles. BMC biology, 8(1), 73. McCutcheon, J. P., & von Dohlen, C. D. (2011). An interdependent metabolic patchwork in the nested symbiosis of mealybugs. Current Biology, 21(16), 1366-1372. Margulis, L., & Schwartz, K. V. (1998). Five kingdoms: an illustrated guide to the phyla of life on earth. Mavingui, P., Moro, C. V., Tran-Van, V., Wisniewski-Dyé, F., Raquin, V., Minard, G., ... & González, V. (2012). Whole-genome sequence of Wolbachia strain wAlbB, an endosymbiont of tiger mosquito vector Aedes albopictus. Journal of bacteriology, 194(7), 1840-1840.

- 68 -

Mercot,H. and Poinsot,D. (2009). Infection by Wolbachia: from passengers to residents. C. R. Biol. 332, 284-297. Meyer, É., & Beisson, J. (2005). Épigénétique: la paramécie comme modèle d’étude. M/S: médecine sciences, 21(4), 377-383. Mitreva,M., Smant,G., and Helder,J. (2009). Role of horizontal gene transfer in the evolution of plant parasitism among nematodes. Methods Mol. Biol. 532, 517-535. Mosqueda,J., Olvera-Ramirez,A., Aguilar-Tipacamu,G., and Canto,G.J. (2012). Current advances in detection and treatment of babesiosis. Curr. Med. Chem. 19, 1504-1518. Markine-Goriaynoff, N., & Vanderplasschen, A. (2005). Les glycosyltransférases virales. Virologie, 9(1), 35-48. Moya,A., Pereto,J., Gil,R., and Latorre,A. (2008). Learning how to live together: genomic insights into prokaryote-animal symbioses. Nat. Rev Genet. 9, 218-229. Neveux, J., Duclaux, G., Lafargue, F., Wahl, M., & Devos, L. (1988). Pigments of some symbiotic cyanobacteria. Vie et milieu, 38(3-4), 251-258. Nowack, E., Melkonian, M., & Glöckner, G. (2008). Chromatophore Genome Sequence of Paulinella Sheds Light on Acquisition of by . Current Biology, 18(6), 410-418. Nowack, E. C., & Melkonian, M. (2010). Endosymbiotic associations within protists. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 365(1541), 699-712.Fenchel T. ,Finlay B. J. 1991a La biologie de ciliates anaérobies vivant en liberté . Eur. J. Protistol. 26 , 201 - 215 . Nowack, E. C., & Melkonian, M. (2010). Endosymbiotic associations within protists. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 365(1541), 699-712.

- 69 -

Odiit M, Kansiime F, Enyaru JC (1997) Duration of symptoms and case fatality of sleeping sickness caused by Trypanosoma brucei rhodesiense in Tororo, Uganda. East Afr Med J 74: 792–795. Ohkuma M, Iida T, Ohtoko K, et al (2005). "Molecular phylogeny of parabasalids inferred from small subunit rRNA sequences, with emphasis on the Hypermastigea". Mol. Phylogenet. Evol. 35 (3): 646– 55. Okamoto, N., & Inouye, I. (2006). < i> Hatena arenicola gen. et sp. nov., a Undergoing Probable Plastid Acquisition. Protist, 157(4), 401-419. Page, F.C.; R.L. Blanton (1985). "The Heterolobosea (Sarcodina: Rhizopoda), a new class uniting the Schizopyrenida and Acrasidae (Acrasida)". Protistologica 21: 121–132. Parsons, R., and Day, D.A. (1990) Mechanisms of soybean nodule adaptations to different oxygen pressure. Plant Cell and Environment 13: 501-512. Partida-Martinez, L. P., Monajembashi, S., Greulich, K. O., & Hertweck, C. (2007). Endosymbiont-dependent host reproduction maintains bacterial-fungal mutualism. Current biology, 17(9), 773- 777. Prechtl J, Kneip C, Lockhart P, Wenderoth K, Maier U-G (2004) Intracellular Spheroid Bodies of Rhopalodia gibba Have Nitrogen- Fixing Apparatus of Cyanobacterial Origin. Mol. Biol. Evol. 21, 1477- 1481. Richardson, S. L. (2009). Endosymbiont change as a key innovation in the adaptive radiation of Soritida (Foraminifera). Rinke,C., Schmitz-Esser,S., Stoecker,K., Nussbaumer,A.D., Molnar,D.A., Vanura,K., Wagner,M., Horn,M., Ott,J.A., and Bright,M. (2006). "Candidatus Thiobios zoothamnicoli," an

- 70 -

ectosymbiotic bacterium covering the giant marine Zoothamnium niveum. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2014-2021. Roossinck,M.J. (2011). The good viruses: viral mutualistic symbioses. Nat. Rev Microbiol. 9, 99-108. Shigenobu,S., Watanabe,H., Hattori,M., Sakaki,Y., and Ishikawa,H. (2000). Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature 407, 81-86. Shigenobu,S. and Wilson,A.C. (2011). Genomic revelations of a mutualism: the pea aphid and its obligate bacterial symbiont. Cell Mol. Life Sci. 68, 1297-1309. STOECKER, D. K. (1999). Mixotrophy among Dinoflagellates1. Journal of Eukaryotic Microbiology, 46(4), 397-401. Taylor, F. J. R.; Hoppenrath, M.; Saldarriaga, J. F. (2008). "Dinoflagellate diversity and distribution". Biodiv. Cons. 17: 407– 418. Todd, John E. Parkinson, and Robert K. Trench. 2012. . 2012,Tree of Life Symbiodinium web. http://tolweb.org/Symbiodinium/126705 Tong, S. M. (1997). Heterotrophic flagellates and other protists from Southampton Water, UK. Ophelia, 47(2), 71-131. Udvardi, M., & Poole, P. S. (2013). Transport and Metabolism in Legume-Rhizobia Symbioses. Annual review of plant biology, 64, 781-805. Van Etten, J. L. (2003). Unusual life style of giant chlorella viruses. Annual review of genetics, 37(1), 153-195. Wang E. T. et E. Martinez-Romero E. (2000). Phylogeny of root and stem nodule bacteria associated with legumes. Dans. Prokaryotic nitrogen fixation, a model system for the analysis of a biological

- 71 -

process. Triplett, E. W. (Eds.) Horizon Scientific, Wymondham Norfolk, England.. Wang, D., Yang, S., Tang, F., & Zhu, H. (2012). Symbiosis specificity in the legume–rhizobial mutualism. Cellular Microbiology, 14(3), 334-342. Weiss, B. L., Wu, Y., Schwank, J. J., Tolwinski, N. S., & Aksoy, S. (2008). An insect symbiosis is influenced by bacterium-specific polymorphisms in outer-membrane protein A. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(39), 15088-15093. Wernegreen,J.J. (2002). Genome evolution in bacterial endosymbionts of insects. Nat. Rev Genet. 3, 850-861. Werner, E. E., & Gilliam, J. F. (1984). The ontogenetic niche and species interactions in size-structured populations. Annual review of ecology and systematics, 15, 393-425. Wootton, J. T., & Emmerson, M. (2005). Measurement of interaction strength in nature. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 419-444.

- 72 -

EXPOSE DES TRAVAUX

- 73 -

- 74 -

REVUE In Press: Intervirology 2013

A decade of improvements in Mimiviridae and Marseilleviridae isolation from amoeba

Isabelle Pagnier, Dorine-Gaelle Ikanga Reteno, Hanene Saadi, Mondher Boughalmi, Morgan Gaia, Meriem Slimani, Tatsiana Nto, Meriem Bekliz, Philippe Colson, Didier Raoult, Bernard La Scola Intervirology 2013; 56: 354–363

URMITE, UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Aix Marseille Université, Marseille, France Corresponding author: Prof. Bernard La Scola, Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE), UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Aix Marseille Université, Faculté de médecine, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille cedex 05, France Tel: 33 4 91 32 43 75 Fax: 33 4 91 38 77 72 E-mail: [email protected] Keywords: Mimivirus, Marseille virus, Megavirus, Megavirales, virophage, Acanthamoeba

- 75 -

- 76 -

RESUME L’utilisation de la technique de coculture sur amibes aux amibes. En effet, les amibes étant des protozoaires phagocytaires se nourrissant des bactéries environnantes, cultiver des échantillons polymicrobiens sur amibes a permis de sélectionner les microorganismes ayant la capacité de se multiplier à l’intérieur des amibes, à l’exclusion de ceux qui sont digérés par elles. En 2001 cette technique a permis ainsi l’isolement d’un petit coque Gram positif par TJ Rowbotham,

positi

exceptionnel.

ment Marseillevirus, et Mamavirus. Dans les années suivantes, nous avons accumulé une grande collection unique au monde de virus géants par l'amélioration de la technique, avec l'utilisation de combinaisons d'antibiotiques pour éviter la

- 77 -

contamination bactérienne de l'amibe, l'élaboration de stratégies de dépistage préliminaire des échantillons par des méthodes moléculaires, et en utilisant une méthode d'isolation à haut débit développée par notre groupe. Le traitement préalable des échantillons au moyen d’éthanol a également permi d’améliorer la technique de co- culture. Basé sur l'inoculation de près de 7.000 échantillons, notre collection comporte actuellement 43 souches de Mimiviridae (14 en lignée A, 6 dans la lignée B, et 23 dans la lignée C) et 17 souches de Marseilleviridae isolées de divers milieux, dont 3 d'origine humaine.

- 78 - Please indicate the disclosure statement. Thank you Intervirology 2013;56:354–363 P u b l i s h e d o n l i n e : ԏ ԏ ԏ DOI: 10.1159/000354556

A Decade of Improvements in Mimiviridae and Marseilleviridae Isolation from Amoeba

Isabelle Pagnier Dorine-Gaelle Ikanga Reteno Hanene Saadi Mondher Boughalmi Morgan Gaia Meriem Slimani Tatsiana Nto Meriem Bekliz Philippe Colson Didier Raoult Bernard La Scola

Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE), Aix-Marseille Univ e r s i t é , M a r s e i l l e, F r a n c e

K e y W o r d s throughput isolation of new isolates to improve the record Mimivirus · Marseillevirus · Megavirus · M e g a v i r a l e s · of giant virus distribution in the environment and the deter- Virophage · Acanthamoeba mination of their pangenome. © 2013 S. Karger AG, Basel

A b s t r a c t Since the isolation of the first giant virus, the M imivirus, by Introduction T.J. Rowbotham in a cooling tower in Bradford, UK, and after its characterisation by our group in 2003, we have continued Mimivirus, the first giant virus identified, was isolated to develop novel strategies to isolate additional strains. By from an amoeba in Bradford, UK, in the 1980s during the first focusing on cooling towers using our original time-con- investigation of a pneumonia outbreak by T.J. Rowbo- suming procedure, we were able to isolate a new lineage of tham while he was trying to isolate Legionella-like bacte- giant virus called Marseillevirus and a new Mimivirus strain rial pathogens that infect amoebae [1, 2]. Acanthamoeba called Mamavirus. In the following years, we have accumu- polyphaga Marseillevirus was isolated in France 5 years lated the world’s largest unique collection of giant viruses by later during work to isolate other strains of mimiviruses improving the use of antibiotic combinations to avoid bacte- [3] . Those two viruses are the founding members of two rial contamination of amoeba, developing strategies of pre- new viral families. Members of the two new viral families liminary screening of samples by molecular methods, and are the largest known viruses based on the sizes of their using a high-throughput isolation method developed by our capsid and genome. Mamavirus, another member of the group. Based on the inoculation of nearly 7,000 samples, our Mimiviridae, was later isolated and found to harbour a collection currently contains 43 strains of Mimiviridae (14 in virophage [4] , and other members of the Marseilleviridae lineage A, 6 in lineage B, and 23 in lineage C) and 17 strains have been recovered from the Seine River [5] and from of Marseilleviridae isolated from various environments, in- human stool [6] . The isolation of several strains of the gi- cluding 3 of human origin. This study details the procedures ant viruses made it possible to classify them as members used to build this collection and paves the way for the high- of a new order of Megavirales [7]. This order is divided

© 2013 S. Karger AG, Basel Prof. Bernard La Scola 0300–5526/13/0566–0354$38.00/0 Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE) UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université E-Mail [email protected] 27, boulevard Jean-Moulin, FR–13385 Marseille Cedex 05 (France) www.karger.com/int E-Mail bernard.la-scola @ univ-amu.fr

IINT354556.inddNT354556.indd 335454 004.09.20134.09.2013 114:51:384:51:38 into two distinct groups. The first group contains the internal organs from the rest of the body. The digestive tract and Mimiviridae family, which is divided into 3 lineages (A, internal organs were crushed together with 3 ml of PAS buffer, and the suspension was homogenised. A solution consisting of 4 anti- B and C), and the Marseilleviridae family [8] . The second biotics (ciprofloxacin at 4 mg/l, vancomycin at 4 mg/l, colimycin is represented by the single Cafeteria roenbergensis virus at 500 IU/l and rifampicin at 4 mg/l) and 1 antifungal (Fungizone CroV, which is found in a unicellular marine biflagellate at 100 mg/l) was added to the suspensions to prevent bacterial and [9] . However, the first three isolates of Megavirales were fungal contamination. The homogenised suspensions were then obtained from fastidious amoeba coculture procedures washed in PAS buffer to remove traces of the antimicrobial solu- tion. The pellets were resuspended in PAS buffer and used for co- on water samples from cooling towers. For many years, culture with amoebae [15] . we have tried to improve our isolation procedures and have tested many biotopes to investigate the distribution Cocultures of giant viruses. We report herein the cumulative results Primary Procedure. The amoebae A. polyphaga (strain Linc AP- of this work, which have enabled the isolation of 18 strains 1) or A. castellanii were cultivated in PYG medium (proteose pep- tone, yeast extract, glucose) and subcultured every 2 days until con- of Marseilleviridae and 45 strains of Mimiviridae from fluent cell monolayers were obtained. For inoculation, a culture of diverse environments, including human samples. amoeba was rinsed in PAS buffer using successive low-speed cen- trifugations at 2,000 rpm for 10 min. The amoebae were counted in counting slides and were adjusted to 5 × 105 amoebae/ml in PAS. Methods The amoebal suspensions were distributed in 12-well microplates and 100 μl of the sample suspensions were inoculated into the wells. Sampling and Preparation of Samples Amoebal microplates were screened with an inverted microscope A variety of samples were used when seeking amoeba- associated to detect amoebal lysis. The cocultures were then subcultured onto giant viruses, including water, soil, insect, stool or human respira- a fresh amoebal microplate suspension and the subcultures were tory samples. The different types of samples analysed for the pres- also screened for amoebal lysis. The lysed cocultures were shaken ence of giant viruses are summarised in figure 1 . In the original pro- to suspend the remaining amoebae, and 100 μl of the suspension cedure, 500- to 1,000-ml water samples stored in sterile bottles were was cytocentrifuged at 800 rpm for 10 min. The slides were stained kept at 4° before processing. Samples were then filtered through a using Gram and Gimenez stains. When the presence of viruses was 0.22-μm-pore filter to concentrate all microorganisms larger than suspected, bacteria were removed from the culture using an appro- this size, and the filters were vortexed in 1–2 ml of sterile Page’s priate antimicrobial agent or by filtration through 0.8-µm-pore fil- amoebal saline (PAS) buffer [1, 3, 10]. Next, to isolate ‘small’ giant ters. The presence of the giant virus was assessed by electron mi- viruses, 0.22-µm-pore membranes were replaced by 0.1-µm-pore croscopic observation of cultures negatively stained with a 1% am- membranes [6] . Other samples from tap water and biofilms were monium molybdate suspension. The giant virus was then measured, sampled using sterile swabs and were directly vortexed in 1–2 ml of and the size enabled primary classification into the Mimiviridae sterile PAS [11] . The latest improvement for simplifying the water group (capsid size of approximately 450 nm) or the Marseilleviri- sampling procedure involved sampling 10–50 ml of water followed dae group (capsid size of approximately 200 nm). Following clas- by a high-speed centrifugation step (15,000 rpm for 10 min). This sification, the single virus amoeba culture was subcultured for end- procedural modification concentrated the microorganisms and was point dilution cloning and further analyses. Nearly all cultures re- faster than the original filtration procedure. quired antibiotics to eliminate bacterial contamination. Due to this For soil samples, each 15- to 100-gram sample was mixed with necessity, the method was improved by the systematic use of anti- 50–150 ml of sterile water. Decantation was performed for 24– biotics in the early stages of the procedure. This primary procedure 48 h at 4° followed by filtration through Whatman paper and then has been described previously [3, 10]. through a 0.1-µm membrane. The membranes were then added to Antibiotic-Directed Procedure. Amoebal microplates were pre- 1 ml of PAS and vortexed following the same procedure as that pared with amoebae under the same conditions as described above. used for the water samples [11–13] . Each sample was inoculated onto amoebal microplates with both The same principle used for the soil samples was applied to the colistin at 500 UI/l and vancomycin at 10 mg/l. The cocultures processing of stool samples. Briefly, 50 ml of water was added to were subcultured onto a fresh amoebal microplate suspension. The approximately 1 g of stool sample, decantation was then carried primary cultures and subcultures were screened daily for cyto- out for 24–48 h at 4°, and the supernatants were filtered through a pathogenic effects using an inverted microscope and 100-µl sam- 0.1-µm membrane. The membranes were then added to 1 ml of ples of resuspended amoebae were cytocentrifuged. The slides PAS and vortexed [6] . were stained with Gimenez and Gram stains followed by addition- For the respiratory samples such as sputum or bronchoalveolar al Hemacolor staining (Merck, Darmstadt, Germany) if obvious lavage, mechanical breakdown of the cells was performed by pass- viral factories inside the amoebae were noticed. On day 7 of the ing the samples through syringes of 0.33 mm diameter (bioMéri- culture, 50 µl of each coculture was systematically subcultured eux, Marcy l’Etoile, France). The samples were then inoculated onto axenic media, buffered charcoal yeast extract agar and Co- directly onto the amoebal monolayer for giant virus research [14]. lumbia sheep blood agar plates to evaluate and eliminate residual Other types of samples, such as samples from insect larvae or bacterial contamination. The antimicrobial susceptibility of the leeches, required more specific treatments. The animals were first isolates was tested using a disk diffusion assay with gentamicin, rinsed with 96% ethanol to sterilise their exterior, then washed cotrimoxazole, erythromycin, rifampicin, doxycycline and cipro- with sterile PAS and dissected to separate the digestive tract and floxacin. If bacterial overgrowth was moderate, the antibiotics that

Improvements in Mimiviridae and Intervirology 2013;56:354–363 355 Marseilleviridae Isolation from Amoeba DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 335555 004.09.20134.09.2013 114:51:424:51:42 Fig. 1. A collection of giant viruses isolated in our laboratory from 6,989 samples according to the origin of the samples and grouped by species/genotype.

proved to be effective on the isolated bacteria were added to the at 4 mg/l and amphotericin B at 100 mg/l. Agar plates were pre- subcultures. If bacterial overgrowth was massive and destroyed the pared by adding 15 g of agar (Research Organics, Cleveland, amoeba monolayer, the sample was re-inoculated and supple- Ohio, USA) to a 1-litre solution of PAS medium followed by ster- mented with one or more of the effective antibiotics. In cases in ilisation in an autoclave. The agar medium was supplemented which the bacterial overgrowth was due to bacteria that did not before solidification with the same antibiotic cocktail as de- grow on agar plates, different antibiotics were tested on subcul- scribed above and 50-ml volumes were distributed into square tures or re-inoculations until complete decontamination was Petri dishes (23.5 × 23.5 cm; Dominic Deutscher, Brumath, achieved. When bacterial decontamination was evident, the cul- France). After solidification, the agar was coated with a mono- tures were treated as previously described with the single isolated layer of amoebae diluted to 2 × 10 6 amoeba/ml, and a drop of virus. This antibiotic-directed procedure has been described previ- viral enrichment supernatant was inoculated on the monolayer. ously [11] . After incubation, as a virus multiplied, a lysis plaque could be High-Throughput Procedure. As described above, the initial visualised with the naked eye ( fig. 2). The lysis plaques were mea- enrichment step consisted of inoculating 100 µl of the samples sured, and the agar under the plaque was cut and divided into onto an amoeba monolayer in 12-well microplates without the small pieces, resuspended in 1 ml of PAS, vortexed and filtered addition of antibiotics. A subculture was made after 3 days on a through a 1.2-µm-pore filter before inoculation with fresh amoe- fresh amoebal culture with the addition of antibiotics. The anti- bae in PAS buffer. After this step, single viruses in suspension biotic cocktail used was improved and consisted of ciprofloxacin were treated as previously described. This high-throughput pro- at 4 mg/l, vancomycin at 4 mg/l, colimycin at 500 IU/l, rifampicin cedure has been described previously [12] .

356 Intervirology 2013;56:354–363 Pagnier et al. DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 335656 004.09.20134.09.2013 114:51:424:51:42 b

Fig. 2. Illustration of plaque lysis using the high-throughput method of stained agar plates according to Gaia et al. [13] . a The cross indicates the sites of inoculation and the squares 1 and 2 indicate the area of lysis for 2 samples, whereas positive controls are located in area 3. Magnification of lysis ob- tained by Mimivirus ( b ) and Marseillevirus a (c ). c

Additional Enrichment by Blind Subculture Combined with the probe systems. The tentative detection of mimiviruses from group High-Throughput Procedure. This method uses ciprofloxacin at 20 C was performed on 156 soil samples. The primer-probe system mg/l, vancomycin at 10 mg/l, imipenem at 10 mg/l and thiabenda- was designed to target a gene encoding a hypothetical protein from zole at 50 mg/l (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). the group C Mimiviridae system CE7-1675721 ( table 1 ). DNA ex- Thiabendazole was used to avoid fungal contamination, which of- traction was performed as described above, and real-time PCR was ten occurs with soil samples. Thiabendazole replaced amphoteri- performed by adding 5 µl of DNA to an amplification mix contain- cin B because it showed a higher toxicity for amoebae. The cocul- ing 12.5 µl of 2× QuantiTect Probe PCR Master Mix, 0.5 µl of Taq- ture procedure consisted of a primary coculture step using the new Man probe and 0.5 µl (0.2 µmol) of both reverse and forward prim- antibiotic cocktail for 3 days at 32°. After the 3-day antibiotic treat- ers in a final reaction volume of 25 µl. Amplifications were per- ment step, filtration through 0.8-µm-pore membranes was used to formed on a thermocycler Light Cycler (Roche, Meylan Cedex, reduce fungal contamination when thiabendazole treatment was France) with an initial enzyme activation step (95°, 10 min) fol- not sufficient. Plates were then subcultured onto a fresh amoebal lowed by 40 cycles of denaturation (95°, 30 s) and hybridisation/ monolayer with the same antimicrobial agent cocktail with the elongation (60°, 1 min). More recently, we developed primer-probe omission of thiabendazole. An additional enrichment step was systems to extend the preliminary molecular detection to all Mimi- added to the previous procedure by subculturing onto a fresh viridae (groups A, B and C) and Marseilleviridae. DNA extraction amoeba monolayer containing the same antibiotic cocktail. After was performed with the automated extraction system EZ1 Virus this final enrichment step, the culture supernatants were inocu- MiniKit v.2 (Qiagen GmbH) following the manufacturer’s instruc- lated onto amoebal monolayers deposited on agar plates, as de- tions. Real-time PCR was performed by adding 5 µl of DNA to the scribed for the previous high-throughput method. amplification mix containing 12.5 µl of 2× QuantiTect Probe PCR Master Mix, 0.5 µl of TaqMan probe, and 0.5 µl (0.2 µmol) of both Molecular Screening of Samples reverse and forward primers in a final reaction volume of 25 µl. The In several studies, we intended to improve the effi ciency of the reactions were run on a CFX96 TM thermocycler (BioRad Labora- culture yield by selecting the samples to be inoculated based on an tories Inc., Hercules, Calif., USA) with an enzyme activation step initial molecular screening step. In an initial study [13], 9 0 s o i l s a m - (95°, 15 min) followed by 44 cycles of denaturation (95°, 30 s) and ples were screened by standard PCR using primer pairs specifically hybridisation/elongation (60°, 1 min). targeting the three lineages (A, B and C) of Mimiviridae. The prim- ers used were targeted to the beta subunit of the DNA polymerase PCR Primary Characterisation (polB) based on the genome sequencing of Mimivirus and Te r r a 2 As explained above, the initial identification of giant viruses was for group A, Moumouvirus for group B, and Courdo11 and Terra1 first based on the direct observation of the culture suspension. First, for group C ( table 1 ). The viral DNA was extracted from the sam- samples stained with Gram or Hemacolor stains were observed un- ples using a QIAGEN© QIAmp Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilde, der a light microscope at 100× magnification. Second, negative Germany) according to the manufacturer’s instructions. Standard staining was performed using a 1% solution of ammonium molyb- PCR amplification was performed and the PCR products were vi- date and observation under an electron microscope. Because of the sualised under UV light after migration on an agar gel stained with design and application of the specific primer-probe systems listed ethidium bromide. In a second study, we modified the detection of in table 1 , amplification and sequencing of viral genes allows a more giant viruses using real-time PCR with TaqMan specific primer- precise preliminary classification of the newly isolated viruses into

Improvements in Mimiviridae and Intervirology 2013;56:354–363 357 Marseilleviridae Isolation from Amoeba DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 335757 004.09.20134.09.2013 114:51:434:51:43 Table 1. Sequences of different primers and probes used to amplify specific genes of Mimiviridae groups A, B and C, and Marseillevirus

Group Primer/probe Sequence (5 –3 ) Viral group Target gene

A Mimi-TJA01F 5 -GCAGCCCTTTGACACTT-3Ԣ Ԣ mimiviridae A polB Mimi-TJA01R 5 -CATGCGGGAGTTGGAGA-3 mimiviridae A Mimi-TJA02F 5Ԣ-GAAAATGGTGAAGAGAAAACTGA-3Ԣ mimiviridae A Mimi-TJA02R 5Ԣ-ACCAGGATAAATGGATGCAA-3Ԣ mimiviridae A CE11-TE1-01F 5Ԣ-AGTTACCCAACCACAAGAAGA-3 Ԣ mimiviridae C CE11-TE1-01R 5Ԣ-CAGAAGGACTAACAAAAGAACCA-3Ԣ mimiviridae C CE11-TE1-01F 5Ԣ-AAAATATTGGGGACGTTGGTG-3Ԣ mimiviridae C CE11-TE1-01R 5Ԣ-ATGGAAGACTGGCTGTTGAAA-3 Ԣ mimiviridae C VA10-01F 5Ԣ-AAGGGGACAAGGAGTTAAAATAT-3Ԣ mimiviridae B VA10-01R 5Ԣ-TAGATATACGTTTGGTTTTGGAGTGA-3Ԣ mimiviridae B Ԣ Ԣ C A865F2 5Ԣ-TGGATACATTGATGGTTGATAA-3 Ԣ mimiviridae A hypothetical A865R1 5 -TTTCGACTTTACACTTGGGATTG-3 mimiviridae A protein A865 Prb2 FAM-TTATGAAAAACCTAATCCAGAAGATT-TAMRAԢ Ԣ mimiviridae A Ԣ Ԣ C groupeB_for 5 -GAGCTATAATTGGGGCAACG-3 mimiviridae B intergenic groupeB_rev 5 -TCTTATTAAAAGATTCCTGTTTGACA-3 mimiviridae B region Mimi_groupeB_FAM_MGB FAM-AATTTATTTAATCCTTTACCAAAACCA-MGBԢ Ԣ mimiviridae B Ԣ Ԣ B/C CE7-1675721FPr2 5 -TAATTTTATATTCAACACCAAGG-3 mimiviridae C hypothetical CE7-1675721RPr1 5 -CCAATGACCTATCGTTGG-3 mimiviridae C protein CE7-1675721 Prb1 FAM-CTTGGTCTAACAACCAAACACTA-TAMRAԢ Ԣ mimiviridae C Ԣ Ԣ C Mars_Fwd1 5 -TCTGGGAGTGGGCTTTATCT-3 marseilleviridae hypothetical Mars_Rev1 5 -AGGGTAATGACCTCGGGTA-3 marseilleviridae protein Mars_Pr1 FAM-AGGATTGAACCTTCGCTGTTAC-TAMRAԢ Ԣ marseilleviridae Ԣ Ԣ

the Mimiviridae groups A, B or C, or Marseilleviridae group. DNA tower [4] . In addition, the first Marseillevirus strain was was extracted from the positive culture samples using the automat- also found in the water of a cooling tower in 2009 [3]. In ed extraction system EZ1 Virus MiniKit v.2 (Qiagen GmbH). Real- 2010, La Scola et al. [11] isolated 3 new strains of Mimi- time PCR was performed as described above using a CFX96 TM ther- mocycler (BioRad Laboratories Inc.), and sequencing was conduct- virus (Moumouvirus, Monve and Bus) and 2 new strains ed using the same primers that were used for amplification. of Marseillevirus (Cannes8 and Cannes9) from 39 cool- ing water samples. During the same study, other types of environmental water was investigated, and the authors Results were able to isolate 8 strains of Mimiviridae and 1 strain of Marseilleviridae (Saintcharles) from 53 freshwater Number of Isolated Strains samples, such as fountains, lakes, rivers and hospital wa- Since the isolation of the first giant virus, Mimivirus, ter. Moreover, La Scola et al. [11] tested 2 soil samples and methodological improvements have led to the isolation of 10 seawater samples. Both soil samples were positive for 43 strains of Mimiviridae (14 from lineage A, 6 from lin- Mimiviridae (Terra1 and Terra2), and 2 out of the 10 sea- eage B and 23 from lineage C) and 17 strains of Marseil- water samples were positive for Mimiviridae (Pointe- leviridae (fig. 1 ). They are all classified within group I of rouge1 and Pointerouge2). This was the first time that Megavirales, which includes the Marseilleviridae and giant viruses were isolated from an ecological system oth- Mimiviridae lineages A, B and C [7] . er than from the water of a cooling tower. Based on the observation that giant viruses can also be found in other Nature of the Positive Samples environments, a study was performed focusing on hyper- After the isolation of the first Mimivirus in 2003 from saline water and soil samples from Tunisia [12] , and an- the water of an air conditioning system, the second strain, other study focused on diverse soil samples collected named A. castellanii Mamavirus, was found in a cooling around Marseille, in the south of France [13] . Both stud-

358 Intervirology 2013;56:354–363 Pagnier et al. DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 335858 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44 Table 2. Main features of Mimiviruses and Marseilleviruses isolated in our laboratory

Family Name Source Country/region Capsid GenBank Genome Refer- size accession size (nt) ence (nm) no.

Mimiviridae (n = 43) Group A (n = 14) A. polyphaga Cooling tower water UK (Bradford) 400 NC_014649 1,181,549 [1, 2] Mimivirus A. castellanii Cooling tower water France (Paris) 450 JF801956 1,191,693 [4] Mamavirus

Terra2 Soil France (Marseille) 370 – 1,170,000 [11] Pointe-Rouge2 Seawater France (Marseille) 500 – 1,160,000 [11] Cher Rivers and lakes France (Tours) 420 ––[11] Fauteuil Hospital water France (Marseille) 600 – 1,180,000 [11] Longchamps Decorative fountain France (Marseille) 450 – 1,103,000 [11] water

Lactours Rivers and lakes France (Tours) 450 – 1,180,000 [11] Pointe-Rouge1 Seawater France (Marseille) 390 – 1,146,000 [11] Lentille Lens liquid France (Marseille) 500 JF979182 1,220,000 [11]

Marais Swamp France (Aubagne) –– 1,197,000 NP Univirus Compost France (Marseille) –– 1,087,000 NP Hirudovirus Leech France (Marseille –– – NP Montadette2 Soil France (Martigues) –– – NP Group B (n = 6) Moumouvirus Cooling tower water France (Rousset) 420 JX962719 1,021,421 [11] Monve Cooling tower water France (Puget sur Argens) 390 JN885994- 1,015,033b [11] JN886001

Ochan Compost France (Marseille) –– 1,026,000 NP Goulette Seawater Tunisia (Tunis) –– 1,026,000 [10] Istres Soil France (Istres) –– – NP Cassis49 Soil France (Cassis) –– – NP Group C (n = 23) Courdo7 Rivers and lakes France (Saint-Raphaël) 400 JN885990- 1,170,106b [11] JN885993

Terra1 Soil France (Marseille) 420 – 1,230,000 [11] Montpellier Decorative fountain France 370 – 1,225,000 [11] water (Montpellier)

Courdo11 Rivers and lakes France (Saint-Raphaël) 450 – 1,245,674 [11] Courdo5 Rivers and lakes France (Marseille) 400 ––[11] Bus Cooling tower water France (Marseille) 400 – 1,227,000 [11] Mont1 Soil (mountain) Tunisia (Tunis) –– – [10] LBA111 Broncholalveolar lavage Tunisia –– 1,230,519 [13] Avenue9 Soil Tunisia (Tunis) –– 1,214,000 [10] Afrovirus Soil France (Aubagne) –– – NP Montadette1 Soil France (Martigues) –– – NP Balcon Soil France (Marseille) –– – NP Terrain en Soil France (Marseille) –– – NP construction

Boug1 Chott (hypersaline soil) Tunisia (Gafsa) –– – [10] Shan Stool Tunisia (Tunis) –– – NP Cornil Soil France (Marseille) –– – NP Saint Pierre Stagnant water France (Marseille) –– – NP Borély Stagnant water France (Marseille) –– – NP Capucin Stagnant water France (Marseille) –– – NP Potager Soil France (Marseille) –– – NP Feuillage Soil France (Martigues) –– – NP Luminy43 Water France (Marseille) –– – NP Sète Soil France (Sète) –– – NP

Improvements in Mimiviridae and Intervirology 2013;56:354–363 359 Marseilleviridae Isolation from Amoeba DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 335959 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44 Table 2 (continued)

Family Name Source Country/region Capsid GenBank Genome Refer- size accession size (nt) ence (nm) no.

Marseilleviridae (n = 17) Marseillevirus (n = 2) Marseillevirus Cooling tower water France (Cannes) 190 JF979175.1 374,000 [3]

Senegalvirus Stool Senegal – JF909596- 386,000 [9] JF909602

Tunisvirus (n = 1) Fontaine2 Fountain water Tunisia (Ariana) – JX484143 382,000 [10] Unassigned (n = 14) Cannes8 Cooling tower water France (Cannes) 190 JF979175.1 374,000 [11]

Cannes9 Cooling tower water France (Cannes) 150 ––[11] Saint-Charles Decorative fountain France (Marseille) 230 – 376,000 [11] water

Seb1 eau Sebkha (hypersaline water) Tunisia (Tunis) –– – [10] Seb1 sol Soil (hypersaline soil) Tunisia (Tunis) –– – [10] Seb6 sol Soil (hypersaline soil) Tunisia (Tunis) –– – [10] Seb2 sol Soil (hypersaline soil) Tunisia (Tunis) –– – [10] Oued1 River Tunisia (Bézert) –– – [10] Cité1 Soil Tunisia (Kef) –– – [10] Rivière1 River (Majerda) Tunisia (Kef) –– – [10] Puit1 Well water Tunisia (Cap Bon) –– – [10] Hammam1 Hammam water Tunisia (Tunis) –– – [10] Sidi thabet Soil Tunisia (Ariana) –– – [10] Insectomime Diptere larvae Tunisia –– – [14] NP = Unpublished data.

ies resulted in the isolation of Mimiviridae and Marseil- lanii , and an 18% positive identification rate was achieved. leviridae in all of the environments that were sampled. In 2012, the development of high-throughput methods Moreover, both studies led to the isolation of virophages: helped to process a greater number of samples. Of the Sputnik 3 [13] and Sputnik 4 [12] . Later, we explored the 1,000 samples that were screened, 15 were positive (1.5% possibility that giant viruses were eventually found in hu- positive) for giant viruses (4 Mimiviridae and 11 Marseil- man samples (respiratory and stool samples) and animals leviridae) [12] . (i.e. insects and leeches), which further expanded the known ecological niches of giant viruses [14, 15] . Culture Procedure with Preliminary Molecular Detection Direct Culture Procedure The first study using the culture procedure with pre- The first isolation of giant viruses was conducted by liminary molecular detection was conducted with stan- directly inoculating a sample onto amoeba without a pre- dard PCR using primer pairs designed for Mimiviridae liminary detection step. The isolation of Mimivirus in lineages A, B and C. This initial study led to 9 positive 2003 was performed following this protocol; later, the iso- identifications from 90 soil samples (8 from lineage A and lation of Mamavirus and Marseillevirus resulted from the 1 from lineage C); a 10% positive hit rate. Three of the direct inoculation of a large sample volume of cooling positive samples could be isolated after culture; 2 of these tower water that was concentrated by filtration. After the belonged to lineage A (Univirus, Marais) and 1 belonged direct inoculation findings, we began to set up prospec- to lineage B (Ochan). More recently, the primary molecu- tive studies of giant viruses using an antibiotic-directed lar detection system was improved by using a primer- procedure. The first prospective study occurred in 2010 probe system that targets lineage C of Mimiviridae. Using [11] and led to the isolation of 19 giant viruses (16 Mimi- this detection strategy, 11 positive samples were detected viridae and 3 Marseilleviridae) by cocultivating 105 envi- in 156 soil samples (17% positive hit rate), and 8 out of 11 ronmental samples, including cooling tower water, fresh positive samples were cultivated (Potager, Montadette1, environmental water and soil with the amoeba A. castel- Montadette2, Balcon, Sete, Terrain, Feuillage and Istres;

360 Intervirology 2013;56:354–363 Pagnier et al. DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 336060 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44 table 2 ). Surprisingly, the molecular characterisation of lated, A. polyphaga Mimivirus, was found in the water of the 8 cultivated viruses using the specific primer-probe an air conditioning system. Cooling towers represent a systems listed in the table 1 showed that Montadette2 be- very specific ecological system and are mostly closed sys- longs to lineage A and Istres to lineage B of Mimiviridae. tems that only slowly renew circulating water. In addition, The last molecular detection system using the primer- the temperatures are favourable for several microorgan- probe system included targets for lineages A and B of isms, particularly protozoa such as amoebae [16] . M o r e - Mimiviridae and for Marseilleviridae. The completed over, in those systems, amoebae and other microorganisms molecular detection system detected 4 positive samples have the capacity to form biofilms, which are ideal for mi- from 68 samples (5.9% positive hit rate), and all positive crobial development and are difficult to remove. The spec- samples were in Mimiviridae lineage C. All 4 could be ificity of the cooling tower ecosystem could result in the cultivated (Cornil, Saintpierre, Borely and Capucin). In best environment for the development of giant viruses be- our last series of 96 environmental samples, we tested the cause of their specific link to amoebae. Therefore, the first same primer-probe systems for detection in parallel and studies of Mimiviridae were performed on cooling tower direct cultivation using isolation with additional enrich- water systems [3, 4] . However, the first giant virus pros- ment by blind subculture. No sample was positive by pecting study focused not only on cooling tower water but PCR, but 15 (15.6%) were positive by culture; all were also on other types of environmental samples, such as Mimiviridae and included 13 from lineage A, 1 from lin- freshwater, seawater and soil [11] . Based on this study, we eage B (Cassis49) and 1 from lineage C (Luminy43). noticed that giant viruses are ubiquitously distributed in all the environments studied (18% positive samples). The first procedure used to isolate the viruses was empirical and Discussion based on the use of antibiotics specifically adapted to the bacterial contamination encountered. The first step lead- In Marseille, during the last decade, the first 8 giant ing to an improvement in the giant virus isolation proce- virus isolates were isolated from cooling tower water dure was to decontaminate the coculture using adapted (5 mimiviruses and 3 marseilleviruses). Later, screening antibiotic cocktails, including antifungal agents. These of diverse environmental systems led to virus isolation cocktails were improved to exhibit better antimicrobial ef- from freshwater (13 Mimiviridae, 7 Marseilleviridae) and ficiency and to decrease toxicity against amoebae. common soil (18 Mimivirus, 2 Marseillevirus). However, A second improvement was used to increase the num- more unexpected environments led to the isolation of gi- ber of samples that could be tested in parallel by establish- ant viruses, in particular seawater, hypersaline water and ing a high-throughput system [12] . This adaptation of the soils (5 Mimiviridae and 4 Marseilleviridae). In parallel, agar plate method was based on the observation that the during a culturomic study of the human gut in 2012, the presence of viruses can be detected by the naked eye first giant virus isolated from a human sample was found through direct observation of a lysis plaque around the in the stool of a healthy Senegalese patient (Senegalvirus, inoculation point of the enriched culture on an amoebal belonging to the Marseilleviridae) [6] . Another study per- monolayer. This phenomenon had already been observed formed in 2013 on respiratory samples of patients with for chlorella viruses on agar plates coated with monocel- pulmonary infection resulted in the isolation of the first lular algae [17] , and the method could be adapted to strain of Mimiviridae in a human sample (LBA111) [14] , amoebae infected with giant viruses. The combination of and this study used the high-throughput method de- high-throughput screening and the visual plaque assay scribed by Boughalmi et al. [12] . With the same method, led to the rapid isolation of 15 positive samples out of another giant virus (Shanvirus) was isolated from a stool 1,000 total samples. The difference in efficiency com- sample and was classified in lineage C of Mimiviridae. A pared with the previous study (18 vs. 1.5% positive sam- Mimiviridae lineage A (Lentille) was found in contact ples) can be explained by the fact that the samples were lens washing solution, which is related to the human en- largely taken from extreme environments, such as hyper- vironment. More recently, two strains of giant viruses iso- saline water or soil. The higher amount of Marseilleviri- lated from animals were found in a leech (Hirudovirus, dae can also be explained by the use of preliminary filtra- Mimiviridae lineage A) and in the larvae of the Diptera tion through 0.8-µm-pore filters, which is the same meth- Eristalis tenax (Insectomime, Marseilleviridae) [15] . od that led to the isolation of Senegalvirus, the first giant The first investigation of giant viruses focused on t h e virus isolated from a human stool sample [6]. However, water in cooling towers because the first giant virus iso- the low rate of positive samples in cultures spurred the use

Improvements in Mimiviridae and Intervirology 2013;56:354–363 361 Marseilleviridae Isolation from Amoeba DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 336161 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44 of a second improvement to the method: the addition of week) was an improvement, we believe that a higher- a preliminary molecular detection step. Indeed, only the throughput procedure (i.e. testing up to 500 samples per PCR-positive samples were cultivated, and in nearly all week) cannot be achieved using the current technique, cases, the detected virus could be isolated. The first PCR which is time consuming and not amenable to automa- system focused on Mimiviridae and used standard PCR tion. For future work, we believe that the combination of with primer pairs based on the sequences of the beta sub- liquid culture of amoebae in microplates with one or unit of the Mimiviridae DNA polymerase (polB) from more blind enrichment steps and the detection of amoe- each lineage. The couple Mimivirus-Terra2, Moumouvi- bal lysis by an automated flow cytometer will be the best rus, and the couple Courdo11-Terra1 were used to design strategy for optimal high-throughput analysis. Converse- primer pairs for lineages A, B and C, respectively. From ly, the use of ethanol to decontaminate samples without this study, 9 PCR-positive samples from the initial 90 killing viruses, especially mimiviruses, should be a suit- samples (10%) were tested in culture, and 3 of them led able alternative to the use of antibiotics in situations to the isolation of a giant virus (Univirus, Marais and where cultures need to be performed on non-axenic pro- Ochan). However, the specificity of those primer pairs for tozoa [22, 23] . A unique proposed alternative was pub- the targeted group was not optimal and led to the design lished in a report related to the isolation of Megavirus of primer-TaqMan probes targeting all three lineages of chilensis [24] . In this work, the authors incubated their Mimiviridae as well as the Marseilleviridae. The first test- liquid sample for 1 month in the dark with a source of ed primer-probe targeted lineage C and led to the isola- carbon, thus allowing heterotrophic bacteria to multiply. tion of 8 Mimiviridae in 11 PCR-positive samples from In this system, the heterotrophic bacteria serve as the food 156 environmental samples. We expected that those 8 vi- source for the protozoa present in the sample, thus ex- ruses would belong to lineage C, but, surprisingly, 1 was panding the virus population. This technique will have to a lineage A isolate (Montadette2) and 1 was a lineage B be compared to blind enrichment, which is easier and isolate (Istres). It is possible that several viruses were pres- quicker to perform. However, we believe that the best ent in the same samples and that molecular detection am- strategy for isolating these giant viruses would be to sam- plified one of them, whereas culture led to the isolation of ple biofilms, where the amoeba hosts are concentrated, another. The next step in culture improvement was to test rather than free water. the three other primer-probe systems (Mimiviridae lin- eage A and B, and Marseillevirus). Using all four primer- probe systems, a series of 68 samples were analysed, and Disclosure Statement 4 were PCR positive for lineage C of Mimiviridae and resulted in cultivation of the correct lineage C viruses ԏ ԏ ԏ . (Cornil, Saintpierre, Borely and Capucin). Currently, it is difficult to draw conclusions concerning the actual distri- bution of giant viruses in the environment. Our studies confirm the results of metagenomic data that has identi- References 1 La Scola B, Audic S, Robert C, Jungang L, de fied sequences related to these viruses in many environ- Lamballerie X, Drancourt M, Birtles R, Cla- ments [18, 19], including humans [20] . Moreover, we re- verie JM, Raoult D: A giant virus in amoebae. Science 2003; 299: 2033. cently isolated a giant virus closely related to Marseillevi- 2 Raoult D, Audic S, Robert C, Abergel C, Re- rus from a human sample that did not grow on amoebae nesto P, Ogata H, La Scola B, Suzan M, Cla- but did grow on cells, which demonstrates that the panel verie JM: The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science 2004; 306: 1344–1350. of hosts is likely not limited to Acanthamoeba , the only 3 Boyer M, Yutin N, Pagnier I, Barrassi L, Four- host utilised to isolate giant viruses up to this point [21] . nous G, Espinosa L, Robert C, Azza S, Sun S, Rossmann MG, Suzan-Monti M, La Scola B, Giant viruses are likely ubiquitous, as are their amoe- Koonin EV, Raoult D: Giant Marseillevirus bal hosts, throughout a variety of environments. This is highlights the role of amoebae as a melting because it was possible to isolate giant viruses from all of pot in emergence of chimeric microorgan- isms. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: the biotopes we tested, including extreme environments. 21848–21853. In the future, it is likely that improvements in the spe- 4 La Scola B, Desnues C, Pagnier I, Robert C, cific antibiotic cocktail and antibiotic concentration will Barrassi L, Fournous G, Merchat M, Suzan- Monti M, Forterre P, Koonin E, Raoult D: The increase efficiency. However, although the high-through- virophage as a unique parasite of the giant

put procedure (allowing 50–100 samples to be tested per mimivirus. Nature 2008; 455: 100–104.

362 Intervirology 2013;56:354–363 Pagnier et al. DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 336262 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44 5 Thomas V, Bertelli C, Collyn F, Casson N, 12 Boughalmi M, Saadi H, Pagnier I, Colson P, 18 Kristensen DM, Mushegian AR, Dolja VV, Telenti A, Goesmann A, Croxatto A, Greub Fournous G, Raoult D, La Scola B: High- Koonin EV: New dimensions of the virus G: Lausannevirus, a giant amoebal virus en- throughput isolation of giant viruses of the world discovered through metagenomics.

coding histone doublets. Environ Microbiol Mimiviridae and Marseilleviridae families in Trends Microbiol 2010; 18: 11–19.

2011; 13: 1454–1466. the Tunisian environment. Environ Micro- 19 Steward GF, Preston CM: Analysis of a viral

6 Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, biol 2013; 15: 2000–2007. metagenomic library from 200 m depth in Pagnier I, Robert C, Bittar F, Fournous G, 13 Gaia M, Pagnier I, Campocasso A, Fournous Monterey Bay, California constructed by di-

Gimenez G, Maraninchi M, Trape JF, Koonin G, Raoult D, La Scola B: Broad spectrum of rect shotgun cloning. Virol J 2011; 8: 287. EV, La Scola B, Raoult D: Microbial cul- Mimiviridae virophage allows its isolation us- 20 Colson P, Fancello L, Gimenez G, Armougom

turomics: paradigm shift in the human gut ing a Mimivirus reporter. PLoS One 2013; F, Desnues C, Fournous G, Yoosuf N, Million microbiome study. Clin Microbiol Infect 8:e61912. M, La Scola B, Raoult D: Evidence of the

2012; 18: 1185–1193. 14 Saadi H, Pagnier I, Colson P, Cherif JK, Beji megavirome in humans. J Clin Virol 2013; 57: 7 Colson P, de Lamballerie X, Fournous G, M, Boughalmi M, Azza S, Armstrong N, Rob- 191–200. Raoult D: Reclassification of giant viruses com- ert C, Fournous G, La Scola B, Raoult D: First 21 Popgeorgiev N, Boyer M, Fancello L, Monteil posing a fourth of life in the new order isolation of Mimivirus in a patient with pneu- S, Robert C, Rivet R, Nappez C, Azza S, Chia-

Megavirales. Intervirology 2012; 5 5 : 321–332. monia. Clin Infect Dis 2013; 57:e127–e134. roni J, Raoult D, Desnues C: Giant Blood 8 Colson P, Pagnier I, Yoosuf N, Fournous G, 15 Boughalmi M, Pagnier I, Aherfi S, Colson P, Marseillevirus recovered from asymptomatic La Scola B, Raoult D: ‘Marseilleviridae’, a new Raoult D, La Scola B: First isolation of Mar- blood donors. J Infect Dis 2013, E-pub ahead family of giant viruses infecting amoebae. seillevirus in the Diptera Syrphidae Eristalis of print.

Arch Virol 2013; 158: 915–920. tenax . Intervirology 2013;ԏ ԏ :ԏ ԏ – ԏ ԏ . 22 Campos RK, Andrade KR, Ferreira PC, Bon- 9 Fischer MG, Allen MJ, Wilson WH, Suttle CA: 16 Pagnier I, Merchat M, La Scola B: Potentially jardim CA, La Scola B, Kroon EG, Abrahao JS: Giant virus with a remarkable complement of pathogenic amoeba-associated microorgan- Virucidal activity of chemical biocides against genes infects marine zooplankton. Proc Natl isms in cooling towers and their control. Fu- mimivirus, a putative pneumonia agent. J

Acad Sci USA 2010; 107: 19508–19513. ture Microbiol 2009; 4: 615–629. Clin Virol 2012; 55: 323–328. 10 La Scola B, Barrassi L, Raoult D: Isolation of 17 Fitzgerald LA, Wu PK, Gurnon JR, J Biffinger 23 Slimani M, Pagnier I, Boughalmi M, Raoult D, new fastidious α-Proteobacteria and Afipia fe- JC, Ringeisen BR, Van Etten JL: Isolation of La Scola B: Alcohol disinfection procedure for lis from hospital water supplies by direct plat- the phycodnavirus PBCV-1 by biological la- isolating giant viruses from contaminated

ing and amoebal co-culture procedures. ser printing. J Virol Methods 2010; 167: 223– samples. Intervirology 2013;ԏ ԏ :ԏ ԏ –ԏ ԏ .

FEMS Microbiol Ecol 2000; 34: 129–137. 225. 24 Arslan D, LeGendre M, Seltzer V, Abergel C, 11 La Scola B, Campocasso A, N’Dong R, Four- Claverie JM: Distant Mimivirus relative with nous G, Barrassi L, Flaudrops C, Raoult D: a larger genome highlights the fundamental Tentative characterization of new environ- features of Megaviridae. Proc Natl Acad Sci

mental giant viruses by MALDI-TOF mass USA 2011; 108: 17486–17491.

spectrometry. Intervirology 2010; 53: 344–353.

Improvements in Mimiviridae and Intervirology 2013;56:354–363 363 Marseilleviridae Isolation from Amoeba DOI: 10.1159/000354556

IINT354556.inddNT354556.indd 336363 004.09.20134.09.2013 114:51:444:51:44

ARTICLE DE RECHERCHE In Press: Intervirology 2013

A disinfection procedure for isolating giant viruses from the environment

Meriem Slimani1,2, Isabelle Pagnier1, 2, Didier Raoult1, 2 and Bernard La Scola1,2 Intervirology 2013; 56: 434–440

1 Aix-Marseille Univ., Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE) UM 63 CNRS 7278 IRD 198 INSERM U1095, Faculte de Medecine de Marseille, France 2 IHU Méditerranée Infection, Pôle des Maladies Infectieuses et Tropicales Clinique et Biologique, Fédération de Bactériologie-Hygiène- Virologie, Centre Hospitalo-Universitaire Timone, Assistance Publique Hôpitaux de Marseille, Marseille, France

- 89 -

- 90 -

RESUME Les co-cultures d’échantillons avec des amibes du genre Acanthamoeba ont précédemment permis d’isoler de nombreuses bactéries intracellulaires. Cette méthode a également permis d’isoler le premier virus géant de la famille des Mimiviridae (Mimivirus) , le premier membre d’une nouvelle famille de virus géants, les Marseilleviridae (Marseillevirus) et le premier virophage associé aux Mimiviridae (Sputnik associé à Mamavirus) Depuis, de nombreux représentants de chacune de ces familles ont pu être isolés à partir de prélèvement d’origines diverse, en utilisant des techniques de plus en plus évoluées de co-cultures sur amibes. L'isolement des virus par la co-culture d’amibe a eu dans les premiers temps un faible rendement en raison de la présence de nombreux contaminants bactériens. L’utilisation des antibiotiques pour réduire ces contaminations a été limitée par la fragilité des amibes vis-à-vis des agents antimicrobiens à des concentrations trop élevées. Récemment, nous avons mis au point une méthode à haut débit pour isoler les virus géants en détectant des plages de lyse sur des géloses recouvertes d’amibes. Toutefois, cette procédure inclut toujours l’utilisation d’antibiotiques à différentes étapes. Notre travail a eu pour but de tester plusieurs protocoles de décontamination des échantillons pour éliminer dès le départ les bactéries présentes dans les prélèvements. Pour cela, nous avons testé différentes procédures : exposition aux UVs, glutaraldéhyde, dessiccation, traitements thermiques et traitements à l’éthanol. Ces traitements ont été appliqués

- 91 -

à des suspensions virales de 3 Mimiviridae et de Marseillevirus, aisni qu’à une suspension bactérienne d’E. coli servant de témoin d’efficacité. Le traitement par l’éthanol à 70% pendant 5 minutes s’est distingué des autres car il n'a pas réduit de manière significative le titre de particules virales viables alors qu'il a permi de tuer efficacement les bactéries E. coli. Afin de mesurer l’efficacité de ce traitement sur de véritables échantillons polymicrobiens, il a été appliqué à des prélèvements environnementaux préalablement testés et révélés positifs pour des virus géants. Nous avons ainsi effectivement pu isoler de façon spécifique les virus géants présents dans les échantillons, en ayant préalablement éliminé les bactéries contaminantes. Cette technique de décontamination par l’éthanol pourra être utilisée dans le futur pour pré-traiter les échantillons d’environnement polymicrobiens, afin d’augmenter le rendement d’isolement des virus géants dans ce type de prélèvements.

- 92 - Please indicate a Disclosure Statement.

Intervirology 2013;56:434–440 ԏ ԏ ԏ DOI: 10.1159/000354566 ԏ ԏ ԏ P u b l i s h e d o n l i n e : ԏ ԏ ԏ

Alcohol Disinfection Procedure for Isolating Giant Viruses from Contaminated Samples

a, b a, b a, b M e r i e m S l i m a n i Isabelle Pagnier Mondher Boughalmi a, b a, b Didier Raoult Bernard La Scola

a Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE) UM63, CNRS 7278, IR D 1 9 8 , b INSERM U1095, Faculté de Médecine de Marseille, Aix-Marseille Université, and IHU Méditerranée Infection, Pôle des Maladies Infectieuses et Tropicales Clinique et Biologique, Fédération de Bactériologie-Hygiène-Virologie, Centre Hospitalo-Universitaire Timone, Assistance Publique-Hôpitaux de Marseille, Marseille , France

K e y W o r d s Our results demonstrate that ethanol treatment can be used Giant viruses · Megavirales detection · Disinfectio n to evaluate large collections of environmental samples for protocols the presence of giant viruses and to provide insight into un- derstanding their ecology. This study should also facilitate the isolation of giant viruses using other species of protozoa A b s t r a c t in addition to Acanthamoeba s p p . © 2013 S. Karger AG, Basel Objective: Giant viruses of the Megavirales o r d e r h a v e b e e n neglected in the literature because they are removed from samples during viral purification for viral metagenomic studies. Isolation via amoeba coculture has low efficiency Introduction and is extremely time-consuming. Thus, our objective was to improve Megavirales detection and recovery by using a The discovery of the ability of free-living amoebae to new protocol that will eliminate most bacteria present in en- be infected by a large variety of microorganisms has led vironmental samples while preserving giant virus viability. to the use of amoebae for the culture of uncommon bac- Methods: In this study, we tested the ability of a number o f teria [1–3] . The interest in amoebae for the culture of in- disinfection protocols to kill contaminating bacteria. These tracellular microorganisms was stimulated by the discov- treatments were ethanol, UV irradiation, desiccation, glutar- ery of Acanthamoeba polyphaga mimivirus (APM), the aldehyde and thermal shock. Results: Of all the treatments, first known giant virus, which has a complex genome a brief ethanol treatment did not significantly reduce the (more than 1,000 genes) [4] and is the same size as a small titer of viable viral particles of Acanthamoeba polyphaga bacterium (400 nm) [5]. APM forms a large virus factory mimivirus o r Marseillevirus , whereas it efficiently killed Esch- for multiplication within the amoeba [6] . The first isola- erichia coli . This treatment was applied to environmental tion of a giant virus was inadvertently achieved during the samples that previously tested positive for giant viruses and investigation of a pneumonia epidemic via amoebal co- was shown to eliminate contaminating bacteria, whereas it culture in search of Legionella spp., and it prompted a allowed for the isolation of the giant viruses. Conclusion: prospective search that led to the isolation of a new giant

© 2013 S. Karger AG, Basel Prof. Bernard La Scola 0300–5526/13/0566–0434$38.00/0 UM63, CNRS 7278, IRD 198, INSERM U1095 Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université E-Mail [email protected] 27, boulevard Jean-Moulin, FR–13385 Marseille Cedex 5 (France) www.karger.com/int E-Mail bernard.la-scola @ univ-amu.fr

IINT354566.inddNT354566.indd 443434 004.09.20134.09.2013 114:58:584:58:58 virus resembling Mimivirus, named Mamavirus [7] . This of antibiotics that have deleterious effects on amoebae, we isolation was followed by the isolation of an additional investigated the possibility of using diverse types of pre- giant virus, Marseillevirus, which was the first member of treatment to kill contaminating overgrowth of bacteria a new family of amoeba-associated viruses [8] . Sputnik, a without killing the APM or Marseilleviridae. small virus that infects the viral factory of Mamavirus, was concomitantly identified, which led to the novel con- cept of a virophage [7] . Subsequently, two additional vi- M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ruses of the Marseilleviridae family were isolated using Coculture the same coculture method: Lausannevirus, which has The giant viruses used in this study were the original strain of novel genomic features, was isolated from the Seine (Par- APM (M1) [5] ; a bald form of Mimivirus that was obtained after is) [9] , and Senegalvirus was isolated from the stool of a 150 culture passages of the original strain (M4) [18] ; an additional healthy patient from Senegal [10] . These early studies had viral strain of the Mimiviridae family, Pointerouge1 (PR) [11] , and the original strain of Marseillevirus (MV) [8] . The four viruses a low rate of virus isolation and were characterized by la- were grown in an A. polyphaga suspension (strain Linc AP-1) in borious methods using amoeba cocultures. Subsequent to the nutritive medium PYG (proteose peptone yeast extract). The the initial studies, the use of a modified approach of co- amoebae were lysed after 3 days of incubation at 32°, and the cul- ture supernatant containing the viruses was distributed into 50-ml culture with the addition of a number of antibiotics on ® 105 environmental samples led to the isolation of 19 new Falcon tubes. After centrifugation for 10 min at 2,000 rpm, the pellets containing the amoebal cysts and debris were removed, and giant viruses [11] . Three of these viruses belonged to the the supernatants were collected and filtered through a 0.8-μm filter Marseillevirus family, and 16 were assigned to the APM to remove the remaining small amoebal debris. The filtered viral family. One of the latter giant viruses, Lentille virus, had supernatant was distributed into 50-ml tubes and frozen at –80° genome virophage integrated in its genome [12] . Several until use. To assess the efficiency of the antimicrobial treatments, isolates have been obtained using the original techniques, we used a strain of Escherichia coli bacterium (ATCC 25922) as a control. The bacteria were grown on Columbia agar medium with including Megavirus chilensis [13] , which is larger than 5% sheep blood (Biomerieux, Marcy l’Etoile, France); after 24 h of Mimivirus , leading to the designation of the proposed incubation at 37°, the cells were harvested and resuspended in new Megavirales order [14] . These authors used a novel PAS, vortexed, distributed into 50-ml tubes and frozen at –80° un- enrichment procedure, although the isolation procedure til use. The viruses were titrated using an end-point dilution meth- was roughly identical to our approach [13] . M. chilensis is od. The suspensions were serially diluted (1/10) in PAS buffer, and 50 µl of each dilution was inoculated onto 450 µl of an amoebal a member of the genomic group C of APM and corre- suspension calibrated at 5 × 10 5 amoebae/ml aliquoted into a 24- sponds to Courdo11, which was previously isolated using well microplate. We inoculated 4 wells per dilution to a final vol- our multiantibiotic approach [11] . The antibiotic-based ume of 500 µl per well. The plates were incubated for 4–6 days at approach improved the rate of isolation in environmental 32° to determine the highest dilution that led to amoebal lysis in samples by inhibiting the growth of bacteria within and one or two of the four replicate wells. We considered this dilution to correspond to the inoculation of 1 microorganism per well. The outside of the amoebae. Up to eight antibiotics (i.e. coli- bacteria were titrated using an end-point dilution method, and the mycin, vancomycin, gentamicin, cotrimoxazole, erythro- presence of bacteria was verified by growth on the agar plates. The mycin, rifampin, doxycycline and ciprofloxacin) could be samples were serially diluted (1/10) in PAS buffer, and 100 µl of combined to inhibit the bacterial overgrowth that inhibits each suspension was inoculated onto Columbia agar medium with the growth of viruses [11] . A number of antibiotics or 5% sheep blood (Biomerieux) and incubated at 37°. After 24 h of incubation, the colony-forming units (CFU) were counted, and combinations of antibiotics negatively affected the growth the highest dilution leading to the growth of less than 10 CFU/plate of the amoebae, which is one of the likely reasons that so was used to quantify the number of viable bacteria in each suspen- few viruses have been effectively isolated despite their sion. After titration, the viral and bacterial suspensions were ad- high abundance in the environment, as predicted by nu- justed to a concentration of 10 7 viruses or bacteria/ml for further merous metagenomic studies [15, 16] . In a previous work, experimentation. we briefly investigated the potential resistance of APM to Disinfecting Treatments different treatments and demonstrated that APM contin- A number of disinfection methods were identified based on ued to be infectious after 1 year at 4, 25 or 32° in Page’s previously published research [5, 17] and the practicality of each amoebal saline (PAS) buffer and was not affected by 48 h treatment application in the context of routine laboratory proce- of desiccation [6] . In a recent work, the resistance of APM dures. We selected ethanol disinfection, ultraviolet light exposure, desiccation, thermal inactivation and glutaraldehyde exposure. All to a number of chemical biocides, especially alcohol solu- of the treatments were tested for several exposure durations. All tions, was demonstrated [17] . In this work, to simplify viruses and bacteria were pelleted via centrifugation at 5,000 rpm and expedite the isolation of viruses by avoiding the use for 30 min, the supernatants were removed, and the pellets were

Procedure for Isolating Giant Viruses Intervirology 2013;56:434–440 435 from Contaminated Samples DOI: 10.1159/000354566

IINT354566.inddNT354566.indd 443535 004.09.20134.09.2013 114:59:014:59:01 treated with 30, 40, 50, 60 and 70% ethanol for 5 and 10 min, re- Results spectively. For exposure to ultraviolet light, 1 ml of each virus or bacterium was uniformly deposited in a Petri dish and exposed to UV light under aseptic conditions at 15 W intensity and a distance Disinfection Treatments of 12 cm. Each microorganism received 5, 10, 15, 20 and 30 min of For the ethanol treatment, we observed that bacte- UV exposure. For the desiccation treatment, 1 ml of viral or bacte- rial contamination persisted when concentrations rial suspension was deposited in Petri dishes and allowed to dry ranging from 30 to 60% ethanol and exposure times of under aseptic conditions for 48–96 h until complete desiccation 5 and 10 min were used (fig. 1 a–d). The application of was observed. The dried pellets were resuspended in 1 ml of PAS. For the thermal treatment, 3 temperatures were tested: 55, 65 and 70% ethanol with an exposure time of 5 and 10 min led 75°. For each temperature, 1 ml of microbial suspension was placed to the elimination of bacterial contamination (fig. 1 e). in a water bath at the given temperature and incubated for 20 and For UV exposure at 0–15 min, a number of bacteria re- 30 min. The exposure to glutaraldehyde was performed by adding mained viable, whereas the bacteria were eliminated af- 80 µl of a glutaraldehyde solution to 1 ml of microbial suspension ter exposure for 20 and 30 min (fig. 2 a). After 96 h of for a final concentration of 2%. The suspensions were incubated for 5 min in the dark and centrifuged for 30 min at 5,000 rpm. The desiccation, no bacteria were detected on the agar plate supernatants were discarded and the pellets were resuspended in (fig. 2 b). After exposure to a solution of glutaraldehyde, 1 ml of PAS. After the treatments, we obtained 1 ml of each viral the bacteria were completely inactivated after 5 min of or bacterial suspension for each disinfection trial. The suspensions incubation in the dark (fig 2c). For thermal inactiva- were centrifuged again, and the pellets were resuspended in 1 ml tion, the bacteria were inactivated after 20 and 30 min of PAS buffer. The final suspensions were used for the titration of microorganisms. For the viruses and bacteria, the titrations were of incubation at all three temperatures: 55, 65 and 75° performed using an end-point dilution method, as described (fig. 2 d–f). Regarding the viruses, 30% ethanol did not above. All of the concentration results are expressed in log [C]. lower the number of viable virus particles for all of the viruses. The ethanol treatment from 40 to 60% had a Isolation of Viruses from Environmental Samples small effect on the viability of viral particles in a number From our collection of environmental samples, we selected 2 environmental water samples that were previously shown to be of cases. We could observe a small decrease of 1 log [C] positive for giant viruses. One sample was positive for a Marseille- after 5 min for M4 and MV with 40% ethanol and after virus-like giant virus (Seb1Sol), and the other was positive for a 10 and 5 min for M4 and MV with 50% ethanol. Using Mimivirus-like giant virus (Goulette1) [19] . The 1-ml samples a 60% ethanol titer, a small loss of 1 log [C] of the viable were centrifuged at 15,000 rpm for 30 min, and the pellets were virus particles was observed for M1 and PR after 10 min treated with 250 µl of 30, 40, 50, 60 and 70% ethanol for 5 and 10 min, respectively. The samples were centrifuged again for 30 min of incubation. For M4 and MV, the amount of viable at 15,000 rpm, and the pellets were resuspended in 250 µl of PAS. virus decreased by 2 log [C] after 10 min of incubation. A sterility control was performed by inoculating 50 µl of this sus- For a 70% ethanol titer, we observed a partial loss of vi- pension on Columbia agar medium with 5% sheep blood (Bio- able viral particles, the effect being less important for merieux) and on BCYE agar (Oxoïd, Dardilly, France). A volume M1 and PR: a 1 log [C] decrease was observed after 5–10 of 100 µl of each sample was inoculated onto an amoebal mono- layer at a concentration of 5 × 10 5 amoebae/ml seeded in 24-well min of incubation. For M4 and MV, the amount of vi- microplates. After 3–5 days of incubation at 32°, 10 µl of each co- able viruses decreased by 2 log [C] and 3 log [C] after 5 culture was inoculated on a non-nutritive agar plate coated with and 10 min of incubation, respectively (fig. 1). Irradia- amoebae at a concentration of 2 × 10 6 amoebae/ml. This method tion with UV light led to a loss of viable viral particles allowed for the observation of a lysis plaque on the agar after 12 h for all virus types. The decrease in viability with increas- of incubation at 32° in the presence of giant viruses, as previously described [19] . An identical experiment was performed for both ing UV exposure was approximately identical for all of samples using sterile water substituted for 30, 40, 50, 60 and 70% the viruses, with a relatively greater resistance observed ethanol to serve as a control for the efficiency of the treatment. The for PR and M1 (fig. 2 a). Desiccation had no effect on control for the ethanol treatment was performed on Columbia the viability of the giant viruses, with the exception of agar medium with 5% sheep blood (Biomerieux) and on BCYE MV, in which case the viability was decreased by 2 log agar (Oxoïd). [C] and 3 log [C] after 48 and 96 h of desiccation, re- Virus Characterization spectively (fig. 2 b). The thermal treatments at 75° led to After the appearance of a lysis plaque on the agar coated with the complete inactivation of all tested viruses. At 65°, the amoebae, the plaque was cut around the perimeter and shaken we observed a small residual level of viable viruses for in PAS buffer to resuspend the viruses in the buffer. This suspen- the original strain of Mimivirus, M1, and for PR, the sion was inoculated onto a fresh amoebal monolayer and, after lysing the amoebae, the supernatant was observed using electron second Mimiviridae used in this study. The other vi- microscopy. Negative staining was performed, as previously de- ruses, M4 and MV, were completely inactivated after 20 scribed, to prepare these samples for electron microscopy [6] . min of incubation at 65°. At 55°, all of the viruses were

436 Intervirology 2013;56:434–440 Slimani /Pagnier /Boughalmi /Raoult / DOI: 10.1159/000354566 La Scola

IINT354566.inddNT354566.indd 443636 004.09.20134.09.2013 114:59:014:59:01 8 8

6 6

4 4

2 2

0 0 a M1 M4 PR MV EC b M1 M4 PR MV EC

8 8

6 6

4 4

2 2

0 0 c M1 M4 PR MV EC d M1 M4 PR MV EC

8

6

0 min 4 5 min 10 min

2

0 e M1 M4 PR MV EC

Fig. 1. The effect of ethanol on the giant viruses M1, M4, PR and the log of the microbial concentration. The assay was performed MV. A strain of the bacterium E. coli (EC) was used as a control using various exposure times. a Ethanol 30%. b Ethanol 40%. for treatment efficiency. The infectivity of the microorganisms was c Ethanol 50%. d Ethanol 60%. e Ethanol 70%. measured using an end-point dilution method and expressed as

resistant to the treatment, and a small reduction of the Treatment of Environmental Water Samples with number of MV particles was observed after 30 min of Ethanol incubation (fig. 2 d–f). The treatment by exposure to After treating the samples with 30, 40, 50, 60 and 70% glutaraldehyde led to the inactivation of all the viruses, ethanol for 5 min, using sterile water as a control, the ef- Mimivirus M1 and M4, PR and MV, after 5 min of in- ficiency of the treatment was assessed via growth on Co- cubation (fig. 2c). lumbia agar with 5% sheep blood and on BCYE agar. For

Procedure for Isolating Giant Viruses Intervirology 2013;56:434–440 437 from Contaminated Samples DOI: 10.1159/000354566

IINT354566.inddNT354566.indd 443737 004.09.20134.09.2013 114:59:014:59:01 8 0 min 5 min 10 min 15 min 20 min 30 min 8 0 min 20 min 30 min

6 6

4 4

2 2

0 0 a M1 M4 PR MV EC d M1 M4 PR MV EC

8 0 h 48 h 96 h 8 0 min 20 min 30 min

6 6

4 4

2 2

0 0 b M1 M4 PR MV EC e M1 M4 PR MV EC

8 0 min 5 min 8 0 min 20 min 30 min

6 6

4 4

2 2

0 0 c M1 M4 PR MV EC f M1 M4 PR MV EC

Fig. 2. The effect of several inactivation treatments on the giant of UV irradiation using various exposure times. b Effect of desic- viruses M1, M4, PR and MV. A strain of the bacterium E. coli (EC) cation using various desiccation times. c Effect of glutaraldehyde was used as a control for treatment efficiency. The infectivity of the at 2% over a 5-min duration. Effect of thermal inactivation at 55 microorganisms was measured using an end-point dilution meth- (d ), 65 (e ) and 75° (f ), under several incubation times. od and expressed as the log of the microbial concentration. a Effect

the samples treated with sterile water, we observed the ciency of the treatment for all bacterial species present in growth of bacterial strains in the samples. For the samples the samples. After the different ethanol treatments, the treated with 30–60% ethanol, the control agar plates were samples were washed in PAS buffer and inoculated in the contaminated after 48 h of incubation at 32°. After treat- coculture onto an amoebal monolayer. After an enrich- ment with 70% ethanol, the agar plates remained sterile ment stage of 3 days, the cocultures were inoculated on after 48 h of incubation at 32°, demonstrating the effi- non-nutritive agar plates coated with a confluent amoebal

438 Intervirology 2013;56:434–440 Slimani /Pagnier /Boughalmi /Raoult / DOI: 10.1159/000354566 La Scola

IINT354566.inddNT354566.indd 443838 004.09.20134.09.2013 114:59:014:59:01 Fig. 3. Non-nutritive agar plate coated with a concentrated amoebal suspension. For the Goulette1 and Seb1Sol samples, a lysis plaque is observable; for the negative control, no lysis plaque can be observed. The lysis plaques are indicated by arrows.

monolayer and incubated at 32°. After 1 day, the presence od for isolating amoeba-associated viruses. This method of giant viruses was apparent, as indicated by the forma- allowed for the isolation of many giant viruses, but bacte- tion of a lysis plaque on the agar surface (fig. 3 ). This effect rial contamination was a consistent problem, and we pre- was observed for the sample containing Goulette1 and the sume that viral culturing often failed. Based on the results sample containing Seb1sol. The analysis of the lysis from several metagenomic studies, we expected a higher plaques via electron microscopy after the subculture con- proportion of giant viruses in the environment to have firmed the presence of giant viruses. In the Goulette1 been cultured [15, 16, 21, 22]. We aimed to alleviate this sample, we observed a giant Mimivirus-like virus with a constraint by developing a pretreatment process that capsid size of 450 nm, and in the Seb1Sol sample, we de- could eliminate bacterial contamination without altering tected a giant virus resembling Marseillevirus with a cap- giant viruses. We could disregard glutaraldehyde and sid size of 220 nm. high-temperature treatment because bacteria and viruses are effectively eliminated by those treatments. Low-tem- perature treatment allowed for the elimination of bacteria Discussion while maintaining the viability of Mimiviridae and Mar- seillevirus; this step required a minimum of 20 min. Des- The efficiency of all the tested treatment methods was iccation for 24 h did not effectively eliminate bacteria, and assessed using the effective inactivation of the bacterium a longer desiccation duration was effective regarding bac- E. coli . The treatments had variable effects on the viruses. teria and Marseillevirus. The compromise between ob- We noted that PR and M1 showed a greater resistance to taining efficacy against bacteria (requiring a short time of the treatments than the other two strains. The degener- manipulation and having no effect on the viability of vi- ated bald form of M4 Mimivirus and MV were more frag- ruses) was observed using the ethanol treatment. After ile, especially regarding the thermal and desiccation treat- 5 min of contact with a 70% ethanol solution, the bacteria ments. It is possible that the presence of fibrils on M1 and were completely inactivated; a loss of 1 log [C] of M1 and PR confers a protective effect to the virus [18] . The pur- PR was observed and, for the more fragile M4 and MV, pose of our study was to find an efficient method to isolate we observed a loss of 2 log [C]. We employed the 70% giant amoeba-associated viruses from environmental ethanol method for the treatment of samples known to be samples. The isolation of Mimiviridae and Marseilleviri- positive for giant viruses. These 2 positive samples were dae was dependent on the use of a number of antibiotic used in the previous isolation via a high-throughput treatments to avoid bacterial contamination [5, 7–11, 13] . method of Seb1sol and Goulette1 [19]. We determined The classic technique of coculture with an amoeba, which that after an enrichment stage in coculture with amoebae, involves labor-intensive and time-consuming procedures the viruses were viably present on the nutritive agar plate such as numerous Gimenez stainings [20] and the use of when using the identical high-throughput method. A ly- several antibiotic treatments, was the only available meth- sis plaque was observed at the inoculation point of the

Procedure for Isolating Giant Viruses Intervirology 2013;56:434–440 439 from Contaminated Samples DOI: 10.1159/000354566

IINT354566.inddNT354566.indd 443939 004.09.20134.09.2013 114:59:014:59:01 coculture using the positive samples, and this lysis plaque viral strains and facilitate understanding of the ecology contained viruses that could be observed in the coculture and environmental presence of amoeba-associated virus- after re-inoculation via electron microscopy with nega- es. Ethanol pretreatment could also be adapted to the tive staining. We demonstrated that a direct treatment of classic saline buffer coculture with other protozoa in ad- the samples with a 70% ethanol solution could facilitate dition to Acanthamoeba spp. the elimination of bacteria and could, more specifically, target the isolation of giant viruses. In the future, a com- bination of ethanol pretreatment of the sample and the Disclosure Statement use of a recently described high-throughput system of isolation [19] could lead to the isolation of many more ԏ ԏ ԏ .

References

1 Birtles RJ, Rowbotham T, Raoult D, Harrison 9 Thomas V, Bertelli C, Collyn F, Casson N, 15 Ghedin E, Claverie JM: Mimivirus relatives in

TG: Phylogenetic diversity of intra-amoebal Telenti A, Goesmann A, Croxatto A, Greun the Sargasso sea. Virol J 2005; 2: 62. legionellae as revealed by 16S rRNA gene se- G: Lausannevirus, a giant amoebal virus en- 16 Yau S, Lauro FM, DeMaere MZ, Brown MV,

quence comparison. Microbiology 1996; 142: coding histone doublets. Env Microbiol 2011; Thomas T, Raftery MJ, Andrews-Pfannkoch

3525–3530. 13: 1454–1466. C, Lewis M, Hoffman JM, Gibson JA, Cavic- 2 Adeleke A, Pruckler J, Benson R, Rowbotham 10 Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, chioli R: Virophage control of antarctic algal T, Halablab M, Fields B: Legionella -like ame- Pagnier I, Robert C, Bittar F, Fournous G, host-virus dynamics. Proc Natl Acad Sci USA

bal pathogens – phylogenetic status and pos- Gimenez G, Maraninchi M, Trape JF, Koonin 2011; 108: 6163–6168. sible role in respiratory disease. Emerg Infect EV, La Scola B, Raoult D: Microbial cul- 17 Campos RK, Andrade K, Ferreira PC, Bon-

Dis 1996; 2: 225–230. turomics: paradigm shift in the human gut jardim CA, La Scola B, Kroon E, Abrahao J: 3 Greub G, Raoult D: Microorganisms resistant microbiome study. Clin Microbiol Infect Virucidal activity of chemical biocides against

to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 2012; 18: 1185–1193. Mimivirus, a putative pneumonia agent. J

2004; 17: 413–433. 11 La Scola B, Campocasso A, N’Dong R, Four- Clin Virol 2012; 55: 323–328. 4 Raoult D, Audic S, Robert C, Abergel C, Re- nous G, Barrassi L, Flaudrops C, Raoult D: 18 Boyer M, Azza S, Barrassi L, Klose T, Campo- nesto P, Ogata H, La Scola B, Suzan M, Cla- Tentative characterization of new environ- casso A, Pagnier I, Fournous G, Borg A, Rob- verie JM: The 1.2-megabase genome sequence mental giant viruses by MALDI-TOF mass ert C, Zhang X, Desnues C, Henrissat B, Ross-

of Mimivirus. Science 2004; 306: 1344–1350. spectrometry. Intervirology 2010; 53: 344– mann MG, La Scola B, Raoult D: Mimivirus 5 La Scola B, Audic S, Robert C, Jungang L, de 353. shows dramatic genome reduction after intra- Lamballerie X, Drancourt M, Birtles R, Cla- 12 Desnues C, La Scola B, Yutin N, Fournous G, amoebal culture. Proc Natl Acad Sci USA

verie JM, Raoult D: A giant virus in amoebae. Robert C, Azza S, Jardot P, Monteil S, Cam- 2011; 108: 10296–10301.

Science 2003; 299: 2033. pocasso A, Koonin EV, Raoult D: Proviro- 19 Boughalmi M, Saadi H, Pagnier I, Colson P, 6 Suzan-Monti M, La Scola B, Barrassi L, Espi- phages and transpovirons as the diverse mob- Fournous G, Raoult D, La Scola B: High- nosa L, Raoult D: Ultrastructural character- ilome of giant viruses. Proc Natl Acad Sci throughput isolation of giant viruses of the

ization of the giant volcano-like virus factory USA 2012; 109: 18078–18083. Mimiviridae and Marseilleviridae families in of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus . PLoS 13 Arslan D, Legendre M, Seltzer V, Abergel C, the Tunisian environment. Environ Micro-

One 2007; 2:e328. Claverie JM: Distant Mimivirus relative with biol 2013; 15: 2000–2007. 7 La Scola B, Desnues C, Pagnier I, Robert C, a larger genome highlights the fundamental 20 Gimenez DF: Staining Rickettsiae in yolk-sac

Barrassi L, Fournous G, Merchat M, Suzan- features of Megaviridae. Proc Natl Acad Sci cultures. Stain Technol 1964; 39: 135–140.

Monti M, Forterre P, Koonin E, Raoult D: The USA 2011; 108: 17486–17491. 21 Yamada T: Giant viruses in the environment: virophage as a unique parasite of the giant 14 Colson P, de Lamballerie X, Fournous G, their origins and evolution. Curr Opin Virol

Mimivirus. Nature 2008; 455: 100–104. Raoult D: Reclassification of giant viruses 2011; 1: 58–62. 8 Boyer M, Yutin N, Pagnier I, Barrassi L, Four- composing a fourth domain of life in the new 22 Claverie JM, Grzela R, Lartigue A, Bernadac

nous G, Espinosa L, Robert C, Azza S, Sun S, order Megavirales. Intervirology 2012; 55: A, Nitsche S, Vacelet J, Ogata H, Abergel C: Rossmann MG, Suzan-Monti M, La Scola B, 321–332. Mimivirus and Mimiviridae: giant viruses Koonin EV, Raoult D: Giant Marseillevirus with an increasing number of potential hosts, highlights the role of amoebae as a melting including corals and sponges. J Invertebr

pot in emergence of chimeric microorgan- Pathol 2009; 101: 172–180.

isms. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 21848–21853.

440 Intervirology 2013;56:434–440 Slimani /Pagnier /Boughalmi /Raoult / DOI: 10.1159/000354566 La Scola

IINT354566.inddNT354566.indd 444040 004.09.20134.09.2013 114:59:024:59:02

- 100 -

ARTICLE DE RECHERCHE In Press: Intervirology 2013

Amoebae as battlefields for bacteria, giant viruses and virophages

Meriem Slimani, Isabelle Pagnier, Didier Raoult, and Bernard La Scola

Journal of Virology (2013) 87(8):4783-5.

Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE), UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Aix Marseille Université, Faculté de médecine, Université de la Méditerranée, Marseille, France.

Keywords: Mimivirus, amoeba, Acanthamoeba, BABL1 bacterium

- 101 -

- 102 -

RESUME Les Amibes libres sont des protozoaires unicellulaires que l’on retrouve dans de nombreux habitats divers et variés comme la terre, l’eau, les interfaces mer et terre etc. De ce fait, ils côtoient de nombreux types de microorganismes, depuis les virus jusqu’aux bactéries. Plusieurs études ont déjà montré que certains de ces microorganismes peuvent entrer dans les amibes et y survivre voire même se multiplier. On peut ainsi considérer les amibes comme des réservoirs de bactéries environnementales. Au cours de procédures de co-culture utilisées pour isoler des micro- organismes associés aux amibes, nous avons souvent obtenu des amibes infectées par plusieurs types de micro-organismes différents Afin d’étudier les relations entre l’amibe libre et plusieurs types de microoganismes, nous avons fait dans cette étude des essais de coinfection simultanées des amibes du genre Acanthamoeba polyphaga avec un virus géant de l’espèce Acanthamoeba polyphaga Mimivirus et une bactérie pathogène intracellulaire stricte, nommée provisoirement BaBl-1. Cette dernière n’a pas encore été décrite et sa caractérisation est en cours. Nous avons confirmé que Mimivirus était rapidement pathogène pour les amibes, tandis que BABL-1 seule a un pouvoir pathogène plus modéré, et plus lent. Lorsque les amibes sont infectées simultanément par Acanthamoeba polyphaga Mimivirus, et BABL-1, cette dernière est systématiquement perdue après plusieurs repiquage en série, et les

- 103 -

amibes subissent l’effet pathogène du virus en moins de temps que lorsuq’il est seul Nous avons également voulu tester les effets de Mimivirus sur les amibes en présence d’un virophage, afin de voir si ce dernier pouvait favoriser la coinfection par la bactérie BABL-1. Nous avons confirmé la capacité de Mimivirus à lyser les amibes, et à inhiber la croissance de BABL-1, en présence ou non du virophage. Lorsque les amibes sont infectées à la fois par Mimivirus et par un virophage, le taux de croissance du virus géant est moins efficace, et la croissance de BABL1 diminue tout au long des repiquages. La capacité du virophage à moduler la virulence de Mimivirus représente un modèle d’interférence pour plusieurs micro-organismes dans les amibes et met en lumière la concurrence qui se produit entre eux lors de l’infection.

- 104 - Amoebae as Battlefields for Bacteria, Giant Viruses, and Virophages

Meriem Slimani, Isabelle Pagnier, Didier Raoult and Bernard La Scola J. Virol. 2013, 87(8):4783. DOI: 10.1128/JVI.02948-12. Published Ahead of Print 6 February 2013. Downloaded from

Updated information and services can be found at: http://jvi.asm.org/content/87/8/4783

These include: http://jvi.asm.org/

REFERENCES This article cites 13 articles, 5 of which can be accessed free at: http://jvi.asm.org/content/87/8/4783#ref-list-1

CONTENT ALERTS Receive: RSS Feeds, eTOCs, free email alerts (when new articles cite this article), more» on June 10, 2013 by INIST-CNRS BiblioVie

Information about commercial reprint orders: http://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtml To subscribe to to another ASM Journal go to: http://journals.asm.org/site/subscriptions/ Amoebae as Battlefields for Bacteria, Giant Viruses, and Virophages

Meriem Slimani, Isabelle Pagnier, Didier Raoult, Bernard La Scola Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE), UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Aix Marseille Université, Faculté de Médecine, Marseille, France

When amoebae are simultaneously infected with Acanthamoeba polyphaga Mimivirus (APM) and the strictly intracellular BABL1 bacterium, the latter is always lost after serial subculturing. We showed that the virophage Sputnik 1, by reducing APM fitness, preserved BABL1 growth in acute and chronic models. This capability of a virophage to modulate the virulence of mimi- viruses highlights the competition that occurs between them during natural host infection. Downloaded from

moebae are predators that are able to phagocytize particles survival and multiplication and access to nutrients. In our previ- Athat are over 0.5 ␮m in size without distinction, and they can ous studies assessing the isolation of new microorganisms using also act as hosts to several different microorganisms that may co- amoebic coculturing, we have commonly discovered amoebae exist simultaneously (1). Unlike allopatric specialized intracellular with multiple infections, such as infection with a giant virus mem- pathogens, microorganisms that survive phagocytosis by an ber of the Megavirales (3) and an amoebal pathogenic bacterium amoeba experience a sympatric lifestyle with species from differ- that is lytic in pure coculture, which we provisionally named http://jvi.asm.org/ ent phyla (2). They are also faced with constraints similar to those BABL1 (unpublished data). Based on its 16S rRNA gene sequence, of other environmental bacteria, including the competition for this bacterium is a member of the delta-epsilon group of Proteo- bacteria (GenBank access number GQ495224), and the analyses of its genome sequence and physiology are under way. Following the discovery of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus (APM) (4), we isolated a mamavirus, a small virus named Sputnik, that infected not amoebae but the APM virus factory (5). Based on the charac- on June 10, 2013 by INIST-CNRS BiblioVie teristics of bacteriophages, this new type of virus was termed a “virophage” (6). Because the virophage modulates the growth of APM, we aimed to determine whether the lytic effects of APM could be tempered by a virophage and thus promote coinfection with other bacterial species, such as BABL1. Indeed, when APM and BABL1 are isolated together, BABL1 is lost after several sub- cultures. The microorganisms that were used in this work included the Acanthamoeba polyphaga strain Linc-AP1, the original APM strain, the first strain of Sputnik virophage isolated (5), the BABL1 bacterium, and an isolate of Legionella anisa (7). A schematic rep- resentation of the procedures used to perform coinfections is pre- sented in Fig. 1. We first studied the growth of the BABL1 bacte- rium, APM, and Sputnik-infected APM alone or in coinfections in Acanthamoeba polyphaga. The amoebae were inoculated with the infectious agents in 10 ml of proteose peptone-yeast extract-glu- cose medium (PYG). After 1 h of incubation, the supernatants were removed to remove nonphagocytized microorganisms, and the amoebae were rinsed in Page’s amoeba saline (PAS) buffer and resuspended in 10 ml of PYG. This time point was designated H0. For the BABL1 bacterium, after 8 h of incubation, the cocultures were centrifuged for 10 min at 2,000 rpm, and the pellets of BABL1-infected amoebae were resuspended in 10 ml of fresh PYG and inoculated with APM or Sputnik-infected APM as described

Received 23 October 2012 Accepted 29 January 2013 FIG 1 A schematic representation of cocultures. (a) Coinfection of A. Published ahead of print 6 February 2013 polyphaga with Acanthamoeba polyphaga Mimivirus (APM), Sputnik alone, Address correspondence to Bernard La Scola, [email protected]. and Sputnik-infected APM; (b) coinfection of A. polyphaga with BABL1 and Copyright © 2013, American Society for Microbiology. All Rights Reserved. superinfection with APM, Sputnik alone, and Sputnik-infected APM; (c) chronic coinfection of A. polyphaga with BABL1 or L. anisa and superinfection doi:10.1128/JVI.02948-12 with APM or Sputnik-infected APM.

April 2013 Volume 87 Number 8 Journal of Virology p. 4783–4785 jvi.asm.org 4783 Slimani et al.

TABLE 1 Primers used in real-time PCRa Germany) according to the manufacturer’s instructions. The real- Primer time PCR experiments incorporated specific primers for each Target name Sequence agent being detected (Table 1). These molecular tests were per- Mimivirus R322 L 5=-AAACAGGTGCACCAACATCA-3= formed in triplicate. The results are expressed as logarithms of the R322 R 5=-GGTTTCCATTTTGACCCAAG-3= microorganism concentration (logC) based on a quantification scale that correlated the cycle threshold (CT) to the number of Sputnik Sputcap F 5=-GAGATGCTGATGGAGCCAAT-3= DNA copies. All of the tests were performed in triplicate. Sputcap R 5=-CATCCCACAAGAAAGGAGGA-3= The concentration of the amoeba A. polyphaga alone showed an increase of approximately 1.5 logC after 32 h (data not shown). BABL1 B-sp4F 5=-GACAATGAAGTTATAGGTGCTAAAAA-3= bacterium B-sp4R 5=-TGATGTCCAAAATGTACACCTGA-3= The growth kinetics of the BABL1 bacterium showed an increase of 2.5 logC. Regarding APM, after a short increase, the amoebic a PCR was performed using a LightCycler instrument (Roche Biochemicals, Mannheim,

Germany) in a final volume of 30 ␮l, with 15 ␮l of the SYBR green kit (LightCycler fast- population began to decrease, with a loss of approximately 1 logC, Downloaded from start DNA Master SYBR green I; Roche, Germany), 9.4 ␮l of distilled water, 1.6 ␮l of whereas APM showed an increase of 3.5 logC (data not shown). It MgCl2,1␮l of each primer, and 2 ␮l of extracted DNA. The amplification conditions was also confirmed that the virophage alone had no effect on were as follows: initial denaturation step at 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of amoebal growth (data not shown). When combined with APM, denaturation for 15 s at 95°C, annealing for 5 s at 60°C, and elongation for 15 s at 72°C, with fluorescence detection in single mode. The specificity of PCR amplification was the concentration of Sputnik increased markedly by 4 logs over 32 assessed by testing all of the primer pairs on the BABL1 bacterium, APM, Sputnik- h, the growth of APM was less efficient (2.5 logC), and the popu- infected APM, and uninfected A. polyphaga. In each specific quantification reaction, lation levels of the amoebae remained stable (data not shown), sterile distilled water and DNA extracted from A. polyphaga were used as negative confirming the negative effects of the virophage on APM. When controls.

the BABL1 bacterium-infected A. polyphaga was superinfected http://jvi.asm.org/ with APM, the level of BABL1 bacteria remained stable until 24 h above. These 8 h of preincubation with the BABL1 bacterium were and then decreased, whereas APM multiplication was comparable necessary to perform coinfection studies, because if they are inoc- to that observed when alone (Fig. 2a). When they were superin- ulated simultaneously, APM multiplication is so rapid that it fected with Sputnik-infected APM, the BABL1 and A. polyphaga would mask BABL1 bacterium multiplication (4). Sampling was population changes were comparable to those observed with performed every 8 h to determine the concentration of the infec- BABL1 alone (Fig. 2b) and thus “preserved” compared with those tious agents in addition to the amoeba counts, and samples were of APM superinfection alone (Fig. 2a). Taken together, these re- stored at Ϫ20°C. The concentrations of infectious agents were sults were in agreement with our observation of the loss of BABL1 on June 10, 2013 by INIST-CNRS BiblioVie measured using real-time PCR. DNA from the frozen samples was bacterium in subcultures when isolated together with APM. To extracted using the QIamp DNA minikit from Qiagen (Hilden, confirm this, we performed chronic coinfection with BABL1 bac-

FIG 2 The growth kinetics of BABL1 and Acanthamoeba polyphaga Mimivirus (APM) infected by the Sputnik virophage within A. polyphaga. The amoebic concentration was measured by counting amoebae in culture and expressed as the log of the concentration in amoebae/ml. The BABL1 bacterium and virus concentrations, which were measured by quantitative real-time PCR, are represented as logC. (a) The growth kinetics of APM and the BABL1 bacterium in A. polyphaga; (b) the growth kinetics of APM, the Sputnik virophage, and BABL1 bacterium in A. polyphaga; (c) the chronic coinfection of A. polyphaga with APM and the BABL1 bacterium; (d) the chronic coinfection of A. polyphaga with APM, the BABL1 bacterium, and the Sputnik virophage.

4784 jvi.asm.org Journal of Virology Virophages in Amoebae terium and APM or Sputnik-infected APM (Fig. 1). Inoculations long been considered to exist alone in their hosts without any were performed as described above and were performed in dupli- contact with other agents. Recent data that have been obtained cate. At 72-hour intervals up to 23 days, the culture was vortexed, from the genome analysis of amoeba-associated agents, in accor- and 1 ml was removed and stored at Ϫ20°C. The remainder of the dance with the results that are presented here, show competition culture was centrifuged at 2,000 rpm for 10 min, and the resulting between microorganisms with regard to their host-infecting abil- pellet was resuspended in 10 ml of fresh PYG medium. After 5 ities. subcultures, the BABL1 bacterium became undetectable, while the concentration of APM remained stable (Fig. 2c). In contrast, coin- REFERENCES fection with the BABL1 bacterium and Sputnik-infected APM re- 1. Raoult D, Boyer M. 2010. Amoebae as genitors and reservoirs of giant sulted in the concentration of BABL1 bacterium remaining stable viruses. Intervirology 53:321–329. until the end of the experiment (Fig. 2d). In this model, the APM 2. Moliner C, Fournier PE, Raoult D. 2010. Genome analysis of microor- concentration was lower than in the previous experiment. How- ganisms living in amoebae reveals a melting pot of evolution. FEMS Mi- Downloaded from ever, in a similar model using L. anisa, we observed an equilibrium crobiol. Rev. 34:281–294. 3. Colson P, Lde Fournous XG, Raoult D. 2012. Reclassification of giant between the virus and bacteria, even in the absence of a virophage viruses composing a fourth domain of life in the new order Megavirales. to modulate APM (data not shown), suggesting that the mecha- Intervirology 55:321–332. nism observed with BABL1 is not common to all amoeba-associ- 4. La Scola B, Audic S, Robert C, Jungang L, Lde Drancourt XM, Birtles ated microorganisms and not related to the initial APM concen- R, Claverie JM, Raoult D. 2003. A giant virus in amoebae. Science 299: tration. 2033. 5. La Scola B, Desnues C, Pagnier I, Robert C, Barrassi L, Fournous G, The ability of the virophage to modulate APM virulence pro- Merchat M, Suzan-Monti M, Forterre P, Koonin E, Raoult D. 2008. vides evidence against the theory that Sputnik is a simple satellite The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. Nature http://jvi.asm.org/ and fuels the debate on the real nature of virophages (8–10). Ad- 455:100–104. ditionally, some satellite viruses, such as adeno-associated satellite 6. Desnues C, Raoult D. 2010. Inside the lifestyle of the virophage. Intervi- virus type 4, have been shown to interfere with their helper virus rology 53:293–303. 7. La Scola B, Mezi L, Weiller PJ, Raoult D. 2001. Isolation of Legionella (11). Our study reveals a model of how different microorganisms anisa using an amoebal coculture procedure. J. Clin. Microbiol. 39: within amoebae modulate the population of their hosts and the 365–366. populations of other microorganisms that coexist within these 8. Desnues C, Raoult D. 2012. Virophages question the existence of satel- hosts. For example, we observed that the serial subculturing of lites. Nat. Rev. Microbiol. 10:234. 9. Fischer MG. 2011. Sputnik and Mavirus: more than just satellite viruses.

APM in the absence of competitor microorganisms led to the on June 10, 2013 by INIST-CNRS BiblioVie Nat. Rev. Microbiol. 10:78. emergence of a bald form of the virus that lacked surface fibers and 10. Krupovic M, Cvirkaite-Krupovic V. 2011. Sputnik and Mavirus: not replicated in a morphologically different type of viral factory (12). more than satellite viruses. Nat. Rev. Microbiol. 9:762–763. These changes were associated with dramatic genome reductions, 11. Yau S, Lauro FM, DeMaere MZ, Brown MV, Thomas T, Raftery MJ, suggesting that APM had lost unnecessary genes that were likely Andrews-Pfannkoch C, Lewis M, Hoffman JM, Gibson JA, Cavicchioli R. 2011. Virophage control of Antarctic algal host-virus dynamics. Proc. involved in surviving alongside competitors. In our work, we Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108:6163–6168. showed that the virophage has the ability to regulate, through the 12. Boyer M, Azza S, Barrassi L, Klose T, Campocasso A, Pagnier I, control of APM, its amoebic host and competing bacteria. This Fournous G, Borg A, Robert C, Zhang X, Desnues C, Henrissat B, type of regulation of giant viruses and their eukaryotic hosts by Rossmann MG, La SB, Raoult D. 2011. Mimivirus shows dramatic virophages has also been suggested as a model of alga-virus-vi- genome reduction after intraamoebal culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108:10296–10301. rophage interactions leading to an increased frequency of blooms 13. Parks WP, Casazza AM, Alcott J, Melnick JL. 1968. Adeno-associated during polar summer light periods in a hypersaline meromictic satellite virus interference with the replication of its helper adenovirus. J. lake in Antarctica (13). In fact, obligate intracellular agents have Exp. Med. 127:91–108.

April 2013 Volume 87 Number 8 jvi.asm.org 4785

DISCUSSION ET CONCLUSION

Dans ce travail, nous avons étudié dans un premier temps les interactions entre Mimivirus, un virophage de type Sputnik, et une bactérie intracellulaire stricte d’amibes, BABL1, dans les amibes, seuls ou en collectivité. Ainsi, lors de la présence de BABL1, Mimivirus est compétitif, il empêche la croissance normale de la bactérie BABL1 et finit par l’éliminer de l’amibe au cours de repiquages successifs. Toutefois, en présence du virophage, la bactérie BABL1 a montré le même taux de croissance que sans Mimivirus. Ceci suggère que la présence du virophage inhibe la croissance de Mimivirus, rétablissant ainsi la croissance de la bactérie BABL1.. La capacité du virophage à moduler la virulence du Mimivirus fournit un soutien contre la théorie que Sputnik est un satellite simple et nourrit le débat sur la nature réelle de virophages. (Desnues C (a), 2012 ; Fischer(b), 2011 ; Krupovic M, 2011).

Ces travaux illustrent la manière dont les différents micro-organismes, phagocytés par les amibes, modulent la population qui coexiste au sein de ces hôtes. Les interactions entre les microorganismes transitant et se croisant régulièrement au sein de l’amibe sont complexes et aboutissent à des phénomènes de régulations et de compétitions entre ces différents microorganismes.

- 109 -

Par ailleurs, il a été observé précédemment que le repiquage en série de Mimivirus en l'absence de micro-organismes concurrents a conduit à l'émergence d'une forme mutée du virus, qui a perdu la plupart des fibrilles de surface, et qui produit des types d’usines à virus morphologiquement différentes (Boyer M, 2011). Ces changements morphologiques ont été associés à une réduction dramatique du génome, suggérant que le Mimivirus a perdu des gènes inutiles qui ont été probablement impliqués dans sa survie aux côtés de concurrents. La régulation des virus géants et de leurs hôtes eucaryotes par les virophages a été également rapportée suite à la découverte d’un autre type de virophage dans un lac méromictique hypersalé en Antarctique (Yau S, 2011). En utilisant des analyses métagénomiques, les auteurs ont découvert un virophage et son hôte viral de type phycodnavirus, infectant des algues phototrophes. Ce virophage réduit la mortalité globale de l'algue, donc augmente sa fréquence des proliférations pendant des périodes de lumière d'été polaire. Cette ingérence du virophage est donc un élément important de la réglementation prédateur-proie. Un autre exemple est le virophage Mavirus qui infecte le virus CroV (Cafeteria rhoenbergensis virus). C’est un virus géant phylogénétiquement proche de Mimivirus, et qui est un phagocyté par le flagélé marin Cafeteria rhoenbergensis (Fischer (a), 2011). L’echange de géne a façonné les génomes des eucaryotes par l’existance à l'origine de l'ADN Maverick transposon (Fischer(a), 2011).

- 110 -

En effet, des séquences de Mavirus ont été identifiées dans Polysphondylium pallidum, qui est un moule dictyostélide. Au cours de l'évolution, l'ancêtre de P. pallidum a pu intégrer l'ancêtre de Mavirus pour se protéger contre les virus géants. Ces échanges de gènes survenant dans les amibes, entre les microorganismes bactériens et viraux (réels ou ancêtres des pathogènes intracellulaires courants), tels que Rickettsia bellii, les virus géants (Mimivirus ou Marseillevirus) et leurs hôtes eucaryotes, ont été fréquemment identifiés lors des analyses du génome des pathogènes intra-amibiens (Boyer M, 2009 ; Ogata H, 2006 ; Raoult D, 2004 ; Bertelli, 2012). Un phénomène de conjugaison a été récemment identifié in vivo entre Bartonella rattaustraliani et Rhizobium radiobacter dans A. polyphaga, faisant intervenir un système de sécrétion de type IV (Saisongkorh W ,2010). En fait, les agents intracellulaires obligatoires ont longtemps été considérés comme existant seuls chez leurs hôtes, sans aucun contact avec d'autres microorganismes. Des données récentes obtenues à partir des analyses du génome de microorganismes associés aux amibes ont montré que des interactions complexes entre les micro-organismes entre eux et avec leur hôte existent réellement. Ce comportement a des similarités avec les modèles d'interactions pathogène-pathogène (Shirtliff, 2009, Singer, 2010), qui sont des événements universellement reconnus (Telfer, 2010). Un autre exemple d’influence entre microorganismes associés est celui de Legionella pneumophila ou de Mycobacterium avium, qui sont plus pathogène

- 111 -

chez l'homme, ou qui développent de plus grandes capacités de résistance, ou d’acquisition de facteurs de virulences lorsqu’elle sont en association avec les amibes (Cirillo, 1999 ; Danelishvili, 2007 ; Greub G, 2004). Suite à ces études centrées sur les interactions de différents microorganismes, dont Mimivirus, dans les amibes, nous avons souhaité améliorer les techniques d’isolement des virus géants en ciblant la co-existence naturelle de différents microorganismes à l’intérieur des amibes. Ainsi, dans le but d'isoler de nouveaux Mimiviridae de l'environnement, nous avons utilisé une technique de co-culture avec des amibes, classiquement utilisée pour isoler les virus géants. Avec cette méthode, l'isolement de virus associés aux amibes était dépendant de l'utilisation d'un certain nombre de traitements antibiotiques pour éviter la contamination bactérienne (Desnues C (b), 2012 ; Boughalmi, 2012). Elle a permis l'isolement de nombreux virus géants, mais la contamination bactérienne reste un problème, qui fait que l’isolement a probablement échoué à de nombreuses reprises. τr selon les résultats de plusieurs études de métagénomique, un plus grand pourcentage d’isolement des virus géants dans l'environnement devrait être attendu, par rapport à ce qui est réellement constaté en culture (Yamada T, 2011). Nous avons souhaité dans notre étude apporter une amélioration de la technique en amont, c'est-à-dire au niveau de la décontamination bactérienne de l’échantillon lui-même. Des protocoles d’échantillonnage différents ont été validés avant d’effectuer les co-cultures.

- 112 -

Dans un premier temps, nous avons travaillé sur des souches virales et bactériennes, afin de déterminer leurs niveaux de résistance à divers traitements chimimques et physiques d’inactivation. L'efficacité de toutes les méthodes de traitement testées a été vérifiée en utilisant une souche bactérienne d’E. coli. Les traitements ont eu des effets variables sur les virus. Nous avons constaté que les souches originales de Mimiviridae a montré une plus grande résistance aux traitements qu’une souche mutée de Mimivirus et qu’une souche de Marseillevirus.Ces deux dernières souches étaient en effet plus fragile, en particulier en ce qui concerne les traitements thermiques et à la dessiccation. Il est possible que la présence de fibrilles sur les Mimiviridae natifs leur confère un effet protecteur contre le virus (Campos, 2012). Nous avons inclus dans nos protocoles de traitement la glutaraldéhyde et le traitement thermique à haute température, car les bactéries et les virus sont généralement efficacement éliminés par ces traitements. La glutarhaldéhyde a éliminé indifféremment les bactéries et tous les virus, et ne fait donc pas un bon candidat au prétraitement des échantillons d’environnement. Les traitements thermiques permettent l'élimination des bactéries tout en maintenant la viabilité de Mimiviridae et Marseillevirus mais ceci exigeait un temps de décontamination minimum de 20 minutes. La dessiccation pendant 24 heures n’a pas permi d'éliminer efficacement les bactéries, et pendant 48h, elle a été efficace pour les bactéries et pour Marseillevirus.

- 113 -

Parmi tous ces résultats, le meilleur compromis entre l'efficacité contre les bactéries, le meilleur temps de manipulation et l’absence, ou le faible effet sur la viabilité du virus a été trouvée avec le traitement de l'éthanol. En effet, après 5 minutes de contact avec une solution d'éthanol à 70%, les bactéries ont été complètement inactivées; une légère perte de Mimiviridae a été observée, et une perte légèrement plus importante, mais malgré tout relativement faible a été observée pour le Mimivirus muté et pour Marseillevirus. Un tavail similaire a été réalisé dans un autre laboratoire a confirmé nos résultats (Campos, 2012). L’utilisation de ce traitement à l'éthanol à 70% a été faite directement sur des échantillons connus précédemment pour être positifs pour les virus géants. Après application de co-culture à haut débit, ces deux échantillons ont effectivement permis l’isolement des virus qui étaient attendus. Ainsi, nous avons démontré qu'un traitement direct des échantillons avec une solution d'éthanol à 70% pourrait faciliter l'élimination des bactéries et pourrait, en particulier, cibler l'isolement des virus géants. À l'avenir, une combinaison d'éthanol en pré-traitement de l'échantillon et l'utilisation d'un système de haut-débit améliorés pourrait conduire à l'isolement de nombreuses souches virales et de faciliter la compréhension de l'écologie dans l'environnement des virus associés aux amibes. D’autres supports cellulaires de co-culture sont en cours de mise au point au laboratoire, et le fait de pré-traiter directement l’échantillon directement avant culture permet de s’affranchir des effets indésirables, et variables en fonction des cellules utilisées, que peuvent avoir les différents

- 114 -

traitements biocides utilisés dans les co-cultures, notamment les agents antimicrobiens. Cela pourra être aussi intéressant dans le future, si nous voulons utiliser comme nouveau support de culture des protozoaires non axéniques qui ont servi de bouclier pour survivre sous forme trophozoites.

- 115 -

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Boughalmi, M., Saadi, H., Pagnier, I., Colson, P., Fournous, G., Raoult, D., & La Scola, B. (2013). High throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental microbiology. ‐

Boyer, M., Azza, S., Barrassi, L., Klose, T., Campocasso, A., Pagnier, I., ... & Raoult, D. (2011). Mimivirus shows dramatic genome reduction after intraamoebal culture. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(25), 10296-10301.

Boyer, M., Yutin, N., Pagnier, I., Barrassi, L., Fournous, G., Espinosa, L., ... & Raoult, D. (2009). Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(51), 21848-21853.

Campos, R. K., Andrade, K. R., Ferreira, P. C. P., Bonjardim, C. A., La Scola, B., Kroon, E. G., & Abrahão, J. S. (2012). Virucidal activity of chemical biocides against mimivirus, a putative pneumonia agent. Journal of Clinical Virology.

Cirillo, J. D., Cirillo, S. L., Yan, L., Bermudez, L. E., Falkow, S., & Tompkins, L. S. (1999). Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infection and immunity, 67(9), 4427-4434.

Danelishvili, L., Wu, M., Stang, B., Harriff, M., Cirillo, S., Cirillo, J., ... & Bermudez, L. E. (2007). Identification of Mycobacterium avium pathogenicity island important for macrophage and amoeba infection. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(26), 11038-11043.

Desnues, C. (a), & Raoult, D. (2012). Virophages question the existence of satellites. Nature Reviews Microbiology, 10(3), 234-234.

Desnues, C.(b), La Scola, B., Yutin, N., Fournous, G., Robert, C., Azza, S., ... & Raoult, D. (2012). Provirophages and transpovirons as the diverse mobilome of giant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(44), 18078-18083.

- 116 -

Fischer (a), M. G., & Suttle, C. A. (2011). A virophage at the origin of large DNA transposons. Science, 332(6026), 231-234.

Fischer (b), M. G. (2011). Sputnik and Mavirus: more than just satellite viruses. Nature Reviews Microbiology, 10(1), 78-78.

Greub, G., & Raoult, D. (2004). Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clinical Microbiology Reviews, 17(2), 413-433.

Ogata, H., La Scola, B., Audic, S., Renesto, P., Blanc, G., Robert, C., ... & Raoult, D. (2006). Genome sequence of Rickettsia bellii illuminates the role of amoebae in gene exchanges between intracellular pathogens. PLoS genetics, 2(5), e76.

Raoult, D., Audic, S., Robert, C., Abergel, C., Renesto, P., Ogata, H., ... & Claverie, J. M. (2004). The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science, 306(5700), 1344-1350.

Saisongkorh, W., Robert, C., La Scola, B., Raoult, D., & Rolain, J. M. (2010). Evidence of transfer by conjugation of type IV secretion system genes between Bartonella species and Rhizobium radiobacter in amoeba. PloS one, 5(9), e12666.

Shirtliff, M. E., Peters, B. M., & Jabra Rizk, M. A. (2009). Cross kingdom interactions: Candida albicans and bacteria. FEMS Microbiology Letters, 299(1), 1-8. ‐ ‐

Singer, M. (2010). Pathogen-pathogen interaction: a syndemic model of complex biosocial processes in disease. Virulence, 1(1), 10-18.

Telfer, S., Lambin, X., Birtles, R., Beldomenico, P., Burthe, S., Paterson, S., & Begon, M. (2010). Species interactions in a parasite community drive infection risk in a wildlife population. Science, 330(6001), 243-246.

Yamada, T. (2011). Giant viruses in the environment: their origins and evolution. Current Opinion in Virology, 1(1), 58-62.

Yau, S., Lauro, F. M., DeMaere, M. Z., Brown, M. V., Thomas, T., Raftery, M. J., ... & Cavicchioli, R. (2011). Virophage control of antarctic algal host–virus dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(15), 6163-6168.

- 117 -