Aspectos Reprodutivos, Citogenotoxicidade E Diversidade Genética De Erythrina Fusca Lour

UNIVERSIDADE DO ESTADO DE MATO GROSSO CARLOS ALBERTO REYES MALDONADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

ROSIELI BARBOZA BISPO

Aspectos reprodutivos, citogenotoxicidade e diversidade genética de Erythrina fusca Lour

ALTA FLORESTA MATO GROSSO – BRASIL FEVEREIRO – 2019

ROSIELI BARBOZA BISPO

Aspectos reprodutivos, citogenotoxicidade e diversidade genética de Erythrina fusca Lour

Dissertação apresentada à Universidade do Estado de Mato Grosso Carlos Alberto Reyes Maldonado, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação

em Genética e Melhoramento de Plantas, para obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profª. Dra. Ana Aparecida Bandini Rossi Coorientador: Prof. Dr. Nilo Leal Sander

ALTA FLORESTA MATO GROSSO – BRASIL FEVEREIRO – 2019

“Aprender é a única coisa que a mente nunca se cansa, nunca tem medo e nunca se arrepende.”

Leonardo da Vinci

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Dedico esta, bеm como todas аs minhas demais conquistas, a meus pais Alirio e Maria, as minhas irmãs Rosimara, Rosimeire e Liliane, que sempre me apoiaram; e a meus avós

Luiz e Josefa meus melhores е maiores presentes...

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente а Deus, por se fazer tão presente na minha vida dando-me sempre força e fé. À Universidade do Estado de Mato Grosso Carlos Alberto Reyes Maldonado (UNEMAT) e ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas (PGMP) pela oportunidade concedida. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pela concessão da bolsa de estudo. A professora Dr. Carolina Joana da Silva pela oportunidade de participar do, projeto nº 441563/2016-3, Dinamicas Ecologicas na Planice de Inundação do Alto Paraguai, do Programa de Pesquisa Ecológica de Longa Duração (PELD). À professora Dra. Ana Aparecida Bandini Rossi pela paciência na orientação е pelo incentivo qυе tornaram possível а conclusão deste trabalho. Ao meu coorientador Dr. Nilo Leal Sander pelo auxilio nas coletas, pelas dicas e pela colaboração na realização deste trabalho. A todos os professores do programa PGMP, qυе foram tão importantes nesse período de aprendizado. Aos meus familiares pelo incentivo е pelo apoio constante. Аоs meus amigos e colegas do programa PGMP, pelas alegrias e tristezas compartilhadas. Com vocês o caminho se tornou mais agradável. Aos colegas do laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular pela colaboração durante a execução da pesquisa e pelos momentos de risadas e descontração compartilhados. A todos aqueles que mesmo distantes torceram e acreditaram em mim. MUITO OBRIGADA!

BIOGRAFIA

Rosieli Barboza Bispo, filha de Alirio Messias Bispo e de Maria Conceição Barboza Bispo, irmã de Marciele Aparecida Bispo, Rosimara Barboza Bispo, Rosimeire Barboza Bispo e Liliane Barboza Bispo, nasceu em Alta Floresta - Mato Grosso no dia 22 de agosto de 1992. Em 2010 terminou o terceiro ano no Ensino médio na Escola Estadual Tancredo de Almeida Neves situada na cidade de Carlinda-MT. No ano de 2011 ingressou no curso de Licenciatura plena em Ciências Biológicas pela Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus de Alta Floresta, o qual concluiu em 2016 sob a orientação da Profª. D.Sc. Ana Aparecida Bandini Rossi. Em 2017, iniciou o Mestrado no Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento de Plantas – UNEMAT – Campus de Alta Floresta, o qual concluiu em 2019, também com a orientação da Profª. Dra. Ana Aparecida Bandini Rossi.

SUMÁRIO

RESUMO ...... ix ABSTRATC ...... x 1. INTRODUÇÃO GERAL...... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 4 2.1. O gênero Erythrina L...... 4 2.2. Aspectos gerais Erythrina fusca ...... 5 2.3. Plantas medicinais ...... 6 2.4. Teste Allium cepa ...... 7 2.5. Meiose ...... 8 2.6. Viabilidade Polínica ...... 9 2.7. Palinologia ...... 9 2.8.1. Marcadores Moleculares ...... 11 4. CAPITULOS ...... 20 4.1. CAPITULO 1 ...... 20 CITOTOXIDADE E GENOTOXIDADE DE EXTRATOS AQUOSOS DE Erythrina fusca LOUR. SOBRE O CICLO CELULAR DE Allium cepa L...... 20 INTRODUÇÃO ...... 20 MATERIAL E MÉTODOS ...... 22 Área de Coleta ...... 22 Montagem do Experimento e Preparo dos Extratos aquosos ...... 23 Teste Allium cepa L...... 24 Análise estatística ...... 26 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 27 Efeito dos extratos aquosos da casca de Erythrina fusca ...... 27 Extratos aquosos da raiz de Erythrina fusca ...... 31 Analise comparativa do efeito dos extratos aquosos do tipo decocto e infuso obtido da raiz e casca de Erythrina fusca com os controles positivo e negativo...... 34 CONCLUSÕES ...... 36 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 37 4.2. CAPITULO 2...... 40 CARACTERIZAÇÃO FLORAL, PALINOLOGIA E ÍNDICE MEIOTICO EM Erythrina fusca LOUR...... 40 INTRODUÇÃO ...... 40 vii

MATERIAL E MÉTODOS ...... 42 Área de estudo ...... 42 Diagnose morfológica das flores de E. fusca ...... 43 Morfologia do pólen ...... 44 Razão pólen/óvulo (P/O) ...... 46 Viabilidade polínica e Citoquimica...... 46 Índice meiótico ...... 48 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 49 Diagnose morfológica de flores de E. fusca ...... 49 Morfologia polínica ...... 51 Razão pólen/óvulo (P/O) ...... 52 Viabilidade e Citoquímica ...... 53 Índice meiótico ...... 55 CONCLUSÕES ...... 58 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ...... 59 4.3. CAPITULO 3...... 63 DIVERSIDADE GENÉTICA DE Erythrina fusca LOUR. NATIVA DO PANTANAL MATO- GROSSENSE ...... 63 INTRODUÇÃO ...... 63 MATERIAL E MÉTODOS ...... 65 Área de estudo ...... 65 Extração e Quantificação de DNA...... 66 Amplificação de locos ISSR ...... 67 Análise dos fragmentos amplificados ...... 68 Porcentagem de Polimorfismo ...... 68 Conteúdo de Informação Polimórfica ...... 69 Índice de Jaccard ...... 69 Análise de agrupamento ...... 69 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 71 CONCLUSÕES ...... 82 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 83 5. CONCLUSÕES GERAIS ...... 87

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RESUMO

BISPO, ROSIELI BARBOZA; M.Sc.; Universidade do Estado de Mato Grosso; fevereiro de 2019. Aspectos reprodutivos, citogenotoxicidade e diversidade genética de Erythrina fusca Lour. Orientadora: Ana Aparecida Bandini Rossi. Conselheiro: Nilo Leal Sander.

A Erythrina fusca Lour é uma espécie arbórea pertencente a família Fabaceae. Têm propriedades medicinais com relatos de utilização em casos de febre, hepatite, malária, reumatismo, dor de dentes e fraturas. Também é considerada uma planta ornamental devido a beleza de suas flores a qual é recomendada para paisagismo em geral. Entretanto, há uma carência de estudos científicos sobre a espécie. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo geral trazer informações sobre a E. fusca, no que diz respeito ao seu potencial citogenotóxico, aspectos reprodutivos e diversidade genética. Para as análises de citogenotoxicidade foram coletadas raízes e casca do caule de E. fusca com ocorrência natural no Pantanal Mato-Grossense, município de Cáceres, e avaliadas diferentes concentrações dos extratos do tipo decocto e infuso da raiz e casca do caule, sobre o ciclo celular das raizes de bulbos de Allium cepa. Para as análises relacionadas aos aspectos reprodutivos foram coletados flores e botões florais em diferentes estágios de desenvolvimento, os quais foram utilizados para caracterização floral, palinologia, viabilidade polínica e índice meiótico. Para a investigação da diversidade genética foram realizadas reações de PCR com 10 primers ISSRs, a partir do DNA extraído de folhas jovens de 35 indivíduos de E. fusca, coletados na região do pantanal município de Cáceres- MT. Os resultados demonstraram que os extratos obtidos da raiz e da casca do caule de E. fusca apresentam potencial citogenotóxico sobre as células do meristema apical de Allium cepa. A espécie E. fusca apresenta sistema reprodutivo do tipo xenogâmico obrigatório, alta taxa de viabilidade polínica, índice meiótico regular e apresenta amido e lipídio como substâncias de reserva no pólen. O uso de marcadores moleculares ISSRs foi eficiente para análise da diversidade genética entre os 35 indivíduos de Erythrina fusca coletados na região do Pantanal do estado do Mato Grosso, sendo estes fontes promissoras de recursos genéticos que podem ser selecionados, para uso em programas de pré-melhoramento e projetos de restauração florestal e conservação da espécie. A maior parte da diversidade genética encontrada está dentro dos grupos, evidenciando que há um fluxo gênico entre indivíduos mais distantes geograficamente e que o intercâmbio de material genético entre os indivíduos mais distantes pode estar sendo realizado por meio da polinização efetuada pelas aves ou por meio das sementes transportadas pelo rio Jauru e Paraguai ou por meio de espécies ictias.

Palavras chave: Açacurana, marcador ISSR, Palinologia, Pantanal.

ABSTRATC

BISPO, ROSIELI BARBOZA; M.Sc .; Universidade do Estado de Mato Grosso; February 2019. Reproductive aspects, cytotoxotoxicity and genetic diversity of Erythrina fusca Lour. Advisor: Ana Aparecida Bandini Rossi. Counselor: Nilo Leal Sander.

Erythrina fusca Lour is a species of tree belonging to the Fabaceae family. It has medicinal properties with reports of use in cases of fever, hepatitis, malaria, rheumatism, toothache and fractures. It is also considered an ornamental plant due to the beauty of its flowers which is recommended for landscaping. However, there is a lack of scientific studies about the species, so this work had as general objective bringing information about E. fusca, regarding its cytotoxotoxic potential, reproductive aspects and genetic diversity. For cytotoxicity analyzes, roots and bark of the E. fusca stem were collected from plants with natural occurrence in Mato Grosso Pantanal, in the town of Cáceres. Different concentrations of extracts of the decoction and infusion of root and stem bark were evaluated, based on with the cell cycle of Allium cepa bulb roots. For analyzes related to the reproductive aspects, flowers and floral buds were collected at different stages of development, which were used for floral characterization, palynology, pollen viability and meiotic index. For the investigation of genetic diversity, PCR reactions were performed with 10 ISSRs primers, based on the DNA extracted from young leaves of 35 individuals of E. fusca, collected in the Pantanal region of Cáceres-MT. The results demonstrated that the extracts obtained from the root and stem bark of E. fusca have a cytotoxic potential on the apical meristem cells of Allium cepa. The species E. fusca presents a xenogamic reproductive system, high pollen viability, regular meiotic index and presents starch and lipid as reserve substances in pollen. The use of ISSRs molecular markers was efficient for the genetic diversity analysis among the 35 individuals of Erythrina fusca collected in the Pantanal region of Mato Grosso state. They are promising sources of genetic resources that can be selected for use in pre- breeding programs and forest restoration and species conservation projects.Most of the genetic diversity found is within the groups, evidencing that there is a gene flow between individuals more geographically distant and that the exchange of genetic material between the more distant individuals can be carried out through the pollination done by the birds, seeds transported by Jauru and Paraguay rivers or by ichthy species.

Key words: Açacurana, ISSR marker, Palinologia, Pantanal.

1. INTRODUÇÃO GERAL

O Pantanal Mato-Grossense faz parte da Bacia do Alto Paraguai e constitui- se na maior planície inundável contínua da América do Sul, localizando-se na porção central da América do Sul, (15° 45´ a 22° 15´ S; 54° 5´ a 58° W) (Mourão et al., 2018). Abrange, além do Brasil, a Bolívia e o Paraguai, com a maior parte de sua área em terras brasileiras, equivalente a 138.183 km² de extensão (Ferreira, 2013). Em território nacional ele ocupa os estados do Mato Grosso (35,36%) e Mato Grosso do Sul (64,64%), acerca de 1.500 quilômetros a oeste do oceano atlântico (Guimarães et al., 2014), sendo os municípios de Corumbá, Poconé, Cáceres e Aquidauana considerados os que mais contribuem em área para a formação do bioma (Ferreira, 2013). O clima do Pantanal é classificado como tropical úmido, com verão chuvoso de outubro a abril e inverno seco de maio a setembro, que pode ser dividida em período de cheia, período de seca e período de vazante (Guimarães et al., 2014), o que torna o Pantanal um ecossistema único. O clima é quente e úmido no verão, com temperatura média de 25°C (mínima de 15°C e máxima de 34°C), e a umidade relativa média é de 82% (Guimarães et al., 2014). A Erythrina fusca é uma espécie nativa do Pantanal-matogrossense. No município de Cáceres ela é conhecida como Abobral. Pertence a família Fabaceae, apresenta ocorrência em quatro continentes (América, África, Ásia e Oceania), é nativa e distribuída nos trópicos úmidos da América Central e América do Sul (Orwa et al., 2009). No Brasil, ocorre na região Amazônica em solos pantanosos ao longo de rios (Lorenzi, 2002). Têm inúmeras propriedades medicinais (Cordero e Boshier, 2003), e é considerada uma planta ornamental devido a beleza de suas flores a qual é recomendada para paisagismo em geral (Lorenzi, 2002). É utilizada também em sistemas agroflorestais para sombreamento em plantações como o cacau (Marques et al., 2012). Com a observação das plantas ao longo dos anos, as suas formas de uso são passadas tradicionalmente para as gerações seguintes mantendo viva a cultura local (Lorenzi e Matos, 2002). Atualmente, o uso de plantas medicinais está cada vez mais difundido pelo valor econômico ou social (Bezerra et al., 2016). Porém, esse consumo deve ser controlado, com o objetivo de evitar possíveis efeitos nos

1 organismos vivos, já que estes estão frequentemente expostos a substâncias mutagênicas que podem causar alterações celulares (Louvatel et al., 2014). O potencial genotóxico e citotóxico das plantas podem ser determinados por meio de substâncias que têm a capacidade de promover alterações metabólicas celulares bem como de induzir alterações no material genético, podendo estas serem de origem natural ou antropogênicas (Cardoso, 2018). Para avaliação desses efeitos, destaca-se o sistema Allium cepa, aplicado para o estudo dos efeitos de extratos vegetais por ser uma alternativa barata e eficiente, que consiste em avaliar alterações na divisão celular por meio da avaliação de danos cromossômicos e distúrbios no ciclo e índice mitótico de células meristemáticas de cebola (Louvatel et al., 2014). O conhecimento sobre o sistema reprodutivo e a taxa de cruzamento de uma população é um instrumento de valor para o manejo de uma espécie (Souza, 2015). Neste sentido, os estudos de estabilidade meiótica e viabilidade dos grãos de pólen, tornam-se relevantes, pois além de auxiliar no manejo das espécies, permitem indicar o potencial de cruzamento da planta (Love, 1951). O estudo da viabilidade polínica se constitui em um dos fatores de suma importância em análises de fluxo gênico e em programas de melhoramento genético de plantas (Martins et al, 1981), pois através dele é possível verificar a eficiência do gameta masculino na fertilização (Biondo e Battistin, 2001). Análise morfológica de grãos de pólens se constitui um mecanismo eficaz para subsidiar a certificação de sua origem botânica, pois evidencia a presença de conjuntos polínicos característicos de determinadas plantas (Stanski et al., 2016), gerando informações sobre a identidade genética e parentesco de genótipos que são importantes para a exploração do germoplasma, visando a utilização máxima da diversidade genética (He et al.,1995). Nas últimas décadas, a degradação e o desaparecimento de florestas naturais têm causado sérias perdas de biodiversidade. Um indicador importante da biodiversidade é o nível de diversidade genética (Shachak et al., 2008) que é reconhecida como componente chave para a sobrevivência a longo prazo de uma espécie (Gapare, 2014). Estudos de caracterização genética de populações naturais são essenciais para definir estratégias de conservação e exploração racional das espécies (Gonçalves et al., 2014). Além disso, uma das formas de verificar a

2 distribuição da variabilidade em populações naturais é com o uso de marcadores moleculares. Os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) são utilizados com sucesso para estimar a diversidade (Reddy et al., 2002) e variabilidade genética, inter e intraespecifica, em uma gama de espécies de plantas, o que o torna uma ferramenta bastante útil em programas de melhoramento e estudos de diversidade (Lorenzoni et al., 2014). Sendo assim, esta dissertação está estruturada em três capítulos. O capítulo 1 tem o objetivo de o potencial citotóxico e genotóxico de extratos aquosos da casca do caule e da raiz de E. fusca, utilizando o teste A. cepa. O capítulo 2 tem como objetivo avaliar o índice meiótico, a viabilidade e a morfologia polínica de E. fusca. O capítulo 3 tem como objetivo avaliar a diversidade genética entre 35 indivíduos de E. fusca, com ocorrência natural no Pantanal Mato-Grossense, por meio de marcadores moleculares ISSR.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Pantanal A posição geográfica do bioma pantanal é bem peculiar, fazendo o elo entre biomas como Amazônia, Cerrado, Chaco Boliviano e Paraguaio (Brasil, 1997). A sua vegetação constitui um mosaico de espécies resultantes da influência dos grandes biomas que o circundam, dos fatores edáficos e regime hidrológico. Todos esses fatores associados são responsáveis pela alta biodiversidade característica do Pantanal (Brasil, 1997). Assim como a vegetação influencia o clima da região, o regime de chuvas e os períodos secos que ocorrem na planície pantaneira também são decisivos para o sucesso da maioria das espécies vegetais. As plantas do Pantanal são capazes de exibir ajustes fisiológicos em função da disponibilidade hídrica e de suportar condições climáticas muito diversas. Assim, as espécies conseguem manter-se distribuídas pelos diferentes pontos da planície exibindo características próprias que são fundamentais para o equilíbrio do ecossistema (Guimarães et al., 2014).

2.2. O gênero Erythrina L. O gênero Erythrina L. é pantropical com cerca de 120 espécies (Schrire, 2005), dessas, 20 espécies têm ocorrência na América do Sul e 11 no Brasil, sendo que duas espécies são endêmicas (Erythrina verna Vell. e Erythrina speciosa Andr) (Martins, 2014). O grande número de espécies, a grande diversidade morfológica e a ampla distribuição geográfica fazem da Erythrina um grupo de estudo desafiador, tanto em termos de taxonomia como de filogenia (Martins, 2014). As espécies de Erythrina possuem hábito arbóreo e arbustivo, ramos e caule geralmente armados, folhas trifolioladas e estipelas glandulares; as flores são variáveis em tamanho e forma (Neill, 1993). A polinização é realizada por beija-flores (Bruneau, 1997), pássaros em geral (Kass, 1994), abelhas (Ragusa-Neto, 2002) e lagartos (Sazima et al., 2005). A diversidade na morfologia floral no gênero pressupõe-se que está associada às diferenças nos sistemas de polinização (Bruneau, 1997). O agente polinizador

4 também pode variar de acordo com o local e habitat que a espécie se encontra (Martins, 2014). Os frutos e as sementes apresentam uma grande diversidade morfológia e adaptações para diferentes mecanismos de dispersão. As sementes de E. fusca, E. variegata e E. velutina são flutuantes e dispersadas por correntes oceânicas, e E. subumbrans tem frutos alados e dispersados pelo vento (Neill, 1988).

2.3. Aspectos gerais Erythrina fusca A espécie Erythrina fusca Lour (Abobral), pertence taxonomicamente à família Fabaceae. É uma árvore espinhosa, de 20-30 metros de altura, de copa globosa baixa. O tronco é curto e muito ramificado, de 60-80 centimetros de diâmetro. As folhas são alternas, compostas trifolioladas, com folíolos glabros e coriáceos. Apresenta inflorescências em racemos terminais. Suas flores, de cor laranja, apresentam uma larga pétala superior que protege o néctar e o pólen floral enquanto ainda está fechada (Cotton, 2001). Cada árvore floresce por quatro a seis, semanas, produzindo entre cinquenta e duas mil flores por dia (Cotton, 2001). Tais florações têm sido apontadas como importantes fontes alimentares para as aves do Pantanal de Mato Grosso (Parrini e Raposo, 2010) por ocorrer na estação seca quando outros alimentos estão escassos (Cotton, 2001). O fruto é um legume indeiscente de 15-25 cm de comprimento (Lorenzi, 2002). A E. fusca é a espécie mais difundida do gênero e a única que ocorre em quatro continentes, sendo nativa e distribuída nos trópicos úmidos da América Central (Panamá, Costa Rica, Nicarágua, Honduras e Guatemala) e América do Sul (Colômbia, Venezuela, Peru, Bolívia e Brasil) (Cordero e Boshier, 2003) (Figura1).

Figura 1. Distribuição mundial da Erythrina fusca. Fonte: Orwa et al., 2009.

No Brasil, ocorre na região Amazônica em solos pantanosos ao longo de rios, sendo frequente às margens do Rio Solimões no Estado do Amazonas. No Espírito Santo e sul da Bahia foi introduzida para sombreamento da lavoura de cacau (Lorenzi, 2002). Apresenta propriedades medicinais sendo utilizada em casos de febres, hepatite, malária, reumatismo, dor de dentes e fraturas (Cordero e Boshier, 2003). Extratos da casca e raízes são ingeridos para evitar beribéri. Além disso, é uma espécie pioneira que cresce, frequentemente, nas margens externas de áreas de inundação periódica, mas pode suportar seca prolongada sem perder as folhas e manter a ciclagem de nutrientes. Na América Central é utilizada como árvore de sombra para Coffea arabica e Theobroma cacao, devido à sua adaptação às áreas úmidas (Cordero e Boshier, 2003). Estudos de ciclagem de nutrientes em áreas cultivadas com C. arabica e T. cacao à sombra desta espécie, provaram o seu valor na Costa Rica, Brasil e Venezuela, sendo preferível a outras espécies devido ao rápido estabelecimento e alta produção de biomassa (Alvim e Nair, 1986). O desenvolvimento das plantas de E. fusca, em condições de campo, é considerado bastante rápido, podendo atingir mais de 3 m de altura aos 2 anos de idade (Lorenzi, 2002).

2.4. O uso de plantas medicinais No Brasil, mesmo com a grande quantidade de medicamentos industrializados e incentivo da indústria farmacêutica para a utilização destes 6 medicamentos, grande parte da população prefere utilizar plantas medicinais para para tratar suas infermidades (Badke et al., 2011). Apesar das plantas medicinais apresentarem propriedades benéficas, é preciso ter o controle quanto a sua utilização, pois diversos estudos relatam que algumas plantas medicinais podem apresentar substâncias maléficas podendo ser nocivo à saúde (Frescura, 2012). Por conta disso, é necessário investigar através de testes biológicos se as drogas vegetais possuem caráter citogenotoxico, ou seja, se ela é capaz de alterar o ciclo celular humano ou danificar seu material genético (Neves, 2013). Segundo a Organização Mundial de Saúde, apesar da imensa variedade de espécies vegetais, estima-se que apenas 15 a 17% têm sido cientificamente estudadas para a avaliação de suas qualidades, segurança e eficácia (Lessa, 2017). A identificação de plantas medicinais para a análise de sua mutagenicicidade é muito importante para a manutenção da saúde, pois, as plantas que apresentam propriedades mutagênicas requerem cuidados quanto ao seu uso. Por outro lado, as plantas com potencial antimutagênico podem ser consideradas interessantes para uso terapêutico (Verschaeve e Van Staden, 2008).

2.5. Teste Allium cepa Atualmente, há uma gama de indicadores biológicos de citogenotoxicidade de extratos de plantas medicinais utilizados em laboratório, dentre eles podemos citar o uso de bactérias, insetos, peixes, poliquetas, anfíbios, roedores, humanos e espécies vegetais. Dentre as espécies vegetais utilizadas o Allium cepa é o mais utilizado pela comunidade científica (Lessa, 2017). A confiabilidade do teste Allium cepa apresenta probabilidade de 82% sendo superior aos resultados mostrados em roedores (Rank e Nielsen, 1993). Testes com A. cepa se torna eficiente devido a sua constante divisão celular e possibilitar a avaliação de diferentes concentrações de plantas medicinais podendo observar em parâmetros macroscópicos como turgescência, mudança de cor, formato, textura, espessura, comprimento da raiz e em parâmetros microscópicos como anáfases prematuras, aderências cromossômicas, pontes, fragmentação e perdas cromossômicas, e micronúcleos, que são indicadores de eventuais mutações no conteúdo genético celular (Nascimento, 2010).

O Allium cepa é uma espécie universal, sempre disponível, cultivável em qualquer época do ano, possui desenvolvimento rápido, suas raízes são macias e com meristema abundante, suas células e cromossomos são grandes, o que permite a observação por microscópio óptico (Almeida, 2014). Outra vantagem do Allium cepa é que o processo de divisão celular de suas raízes assemelha-se em muito ao processo de divisão celular humano. A execução de testes de citogenotoxicidade de plantas medicinais com a utilização de Allium cepa como bioindicador é bem simples e não exige equipamento sofisticado. A eficácia do teste já comprovada por vários estudos de espécies vegetais como Prunus myrtifolia (pessegueiro–domato) (Trapp et al., 2015), Cochlospermum regium (algodão-do-cerrado) (Ports et al., 2016), Aristolochia elegans (jarrinha) (Paula et al., 2015), Plectranthus barbatus ( malva- santa) (Bezerra et al., 2016) .

2.6. Meiose A meiose é um evento de alta estabilidade evolutiva, controlado muitos genes, e que resulta na redução do número cromossômico para a formação de gametas (Karsburg e Battistin, 2006). A variabilidade genética garantida na prófase meiótica favorece a adaptação das espécies nos mais variados ambientes e sua perpetuação pela descendência (Auler et al., 2006). O estudo do comportamento meiótico em espécies não melhoradas ou em fase de melhoramento é de grande importância (Diegues et al., 2015), pois espécies não melhoradas podem apresentar comportamento meiótico instável entre os genótipos e muitas irregularidades nas fases da meiose e pós-meiose. Isso pode ocassionar baixa fertilidade dos gametas masculinos (Damasceno- Junior et al., 2010), devido ao surgimento de grãos de pólen anormais, ou inviáveis, resultantes de aberrações estruturais e numéricas, que ocorrem durante a meiose (Horner e Palmer, 1995). A fecundação é uma das formas de garantir a sobrevivência de uma espécie. Assim, o conhecimento do curso da meiose de um organismo vai informar se a espécie possui gametas viáveis, capazes de gerar descendentes (Gerônimo, 2014). Uma das formas de conhecer o comportamento meiótico de uma espécie é calcular seu índice Meiótico (IM). Esse índice analisa os produtos pós-meióticos,

8 como as tétrades, tríades, díades, monade e políade. Com o curso normal da meiose, esperam-se maiores números de tétrades normais.

2.7. Viabilidade Polínica Estudos de viabilidade dos grãos de pólens são de suma importância, para o melhor entendimento da dispersão dos gametas masculino nas espécies vegetais (Corrêa et al., 2005), pois auxilia estudos taxonômicos, ecológicos e palinológicos, além de apresentar informações básicas para conservação e melhoramento genético (Auler et al., 2006) e na agricultura. Amaral et al. (2014) enfatizam que testes de viabilidade polínica pode confirmar a fertilidade masculina e servir como indicativo de êxito em cruzamentos intra e interespecíficos. A fertilidade masculina pode ser determinada através de várias técnicas. Atualmente os métodos mais utilizados na avaliação da viabilidade polínica são os métodos diretos, como a indução de germinação in vitro (Alcaraz et al., 2011) e in vivo (Fakhim et al., 2011) ou métodos indiretos, como a coloração do pólen (Abdelgadir et al., 2012). A avaliação comparativa de diferentes corantes é recomendada na tentativa de se obter resultados mais confiáveis na determinação da viabilidade polínica (Lins et al., 2017). Dentre os corantes mais utilizados destacam-se lugol, sudan IV, carmim acético e solução de Alexander, eficientes em coras as substâncias presentes nos grãos de pólens ou estruturas celulares responsáveis por corar substâncias constituintes do grão de pólen e estrutura celular. (Báez et al.,2002; Rodriguez-Riano e Dafni, 2000).

2.8. Palinologia Os estudos sobre os grãos de pólen começaram a evoluir com a melhoria nos aparelhos ópticos a partir do século XIX e XX (Wodehouse, 1935). Atualmente o estudo do grão de pólen passou de um simples apêndice da Taxonomia Vegetal para constituir uma ciência à parte a chamada Palinologia (Gasparino e Cruz- Barros, 2018). A Palinologia é definida como a ciência que estuda os grãos de pólen e esporos, tratando das suas estruturas e formações com sua dispersão e preservação sob certas condições ambientais (Moore e Webb, 1978).

Nos estudos palinológicos, a principal técnica utilizada é a acetólise proposta por Erdtman 1952 citado por Hesse e Waha (1989), que consiste em uma solução de anidrido acético e ácido sulfúrico na proporção de 9:1, para a eliminação do conteúdo celular para observação da parede externa do pólen (Martins et al., 2002). Efeitos similares a acetólise são obtidos depois da ebulição em HCL concentrado e lavagem com 10% de KOH (Hesse e Waha, 1989), no entanto essa metodologia não permite a observação de grãos completamente transparentes (Erdtman,1943). A acetólise lática é outro método empregado para o estudo dos grãos de pólen (Raynal e Raynal, 1971). Esta técnica é utilizada quando os grãos de pólen são muito frágeis e não resistem à acetólise tradicional, consistindo na diminuição de anidrido acético e o acréscimo de ácido láctico tornando a mistura acetolítica mais fraca (Gasparino e Cruz-Barros 2006). Essa metodologia permite observar, no microscópio, a saída do conteúdo protoplasmático antes que o grão de pólen se deforme (Moreira et al., 2005).

2.9. Diversidade genética O modo como a diversidade genética é partilhada dentro e entre as populações é de extremo interesse para a conservação dos recursos genéticos e fundamental para o manejo racional dos recursos de populações naturais (Weir, 1990). Muitas espécies que sofrem com o processo de fragmentação são fontes importantes de produtos naturais biologicamente ativos e a perda da diversidade genética implica na diminuição das chances de identificar produtos com potencial utilização econômica e a manutenção da espécie em seus hábitats (Gonçalves et al., 2014). A diversidade genética é uma base de sustentabilidade que fornece matéria- prima para adaptação, evolução e sobrevivência, especialmente sob condições ambientais e de doenças em mudança (Reed e Frankham, 2003). Portanto o conhecimento do quanto existe de variação genética e como ela está distribuída geograficamente em cada espécie é necessário para a caracterização de seu status de conservação (Santos et al., 2017). Neste contexto, os planos de conservação in situ e ex situ devem considerar a variação genética intraespecífica como critério fundamental para o

10 desenvolvimento de estratégias de conservação eficientes (Eckert et al., 2008). Considerando o cenário atual de desmatamento continuo e mudanças climáticas globais, é crescente a importância de estudos com essa finalidade (Fernades, 2008).

2.8.1. Marcadores Moleculares Com os avanços da biotecnologia, o surgimento dos marcadores moleculares possibilitou a discriminação genotípica de forma eficaz, pois permite o estudo da variação genética em nível de DNA (Souza, 2015). A partir do surgimento dos marcadores moleculares e da constante evolução das técnicas neles baseados, principalmente em relação à capacidade de detecção de polimorfismo, acessibilidade e facilidade de execução, tem ocorrido importante avanço do conhecimento aplicado ao melhoramento genético e a genética de populações. Nesta última, a principal contribuição dos marcadores moleculares consiste na detecção dos níveis de diversidade genética das populações de interesse, informação essencial para a elaboração de programas de conservação genética (Fernandes, 2008). As técnicas moleculares são ágeis no processo de análise da variabilidade e seleção, principalmente quando se trabalha com espécies perenes, não a necessidade de que a planta complete seu ciclo reprodutivo para efetuar as análises, não sofrem interferência do meio e apresentam alta eficiência para discriminação de materiais (Ferreira e Grattapraglia, 1998). Diferentes tipos de marcadores moleculares encontram-se disponíveis para a detecção da variabilidade genética a nível de DNA, como por exemplo, RAPD, AFLP, ISSR, SSR, RFLP, SNPs entre outros, visando a detecção de polimorfismo genético (Agarwal et al., 2008; Caetano, 2009). Dentre esses marcadores, os ISSR (Inter simple sequence repeat) amplificam sequências interregiões microssatélites. Apesar de serem marcadores dominantes, não sendo possível detectar o genótipo heterozigoto, são mais robustos que os RAPDs, pelo fato de seus primers serem mais específicos (Liu e Jonathan, 2001). A eficácia desses marcadores é confirmada com a vasta utilização dessas técnicas nos estudos de conservação genética e no melhoramento de plantas (Souza, 2015) como, por exemplo, nas espécies: Theobroma grandiflorum (cupuaçuzeiro) (Silva et al., 2016), Erythrina velutina Willd

(mulungu) (Gonçalves et al., 2014), Elaeis guineensis Jacq (dendê) (Chagas et al., 2015). O princípio da técnica é baseado em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) e envolvem amplificações de segmentos de DNA presente numa região de distância amplificável entre duas regiões repetidas de microssatélites idênticas orientadas em direções opostas. As amplificações não requerem informação da sequência do genoma e conduz a multilocos e altos padrões polimórficos (Barth et al., 2002). ISSR é uma técnica simples rápida e eficiente. Os produtos amplificáveis são geralmente de 200-2000 pb de comprimento e apresentam alta reprodutibilidade possivelmente devido ao uso de primers longos (16 a 25pb) com temperatura de anelamento variando de 45º a 60º (Bornet e Branchard, 2001). Os ISSRs representam uma das classes de marcadores moleculares desenvolvida a partir da necessidade de explorar repetições microssatélites sem a utilização de sequenciamento do DNA. Além de apresentam um grande potencial para determinar diversidade intra-genômica e inter-genômica em relação a outros indicadores (Zietkiewicz et al., 1994). Os marcadores ISSRs amplificam segmentos entre regiões repetidas de DNA de forma aleatória (Ng e Tan, 2009), são facilmente detectados usando poucos equipamentos, são bastante variáveis e fornecem grande número de dados por um custo razoável para o pesquisador (Borba et al., 2005).

3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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4. CAPITULOS

4.1. CAPITULO 1

CITOTOXIDADE E GENOTOXIDADE DE EXTRATOS AQUOSOS DE Erythrina fusca LOUR. SOBRE O CICLO CELULAR DE Allium cepa L.

INTRODUÇÃO As plantas constituem uma rica fonte de compostos e substâncias que podem interagir com o nosso organismo atuando de forma benéfica, preventiva ou curativa (Guidoti et al, 2014). A família Fabaceae possui uma variedade de espécies reconhecidas por suas propriedades medicinais, dentre as quais podemos citar a Amburana cearenses (Cumarú), Anadenanthera colubrina (Angico), Bauhinia cheilantha (Mororó), Bowdichia virgilioides (Sucupira), Hymenaea courbaril (Jatobá), Mimosa tenuiflora (Jurema preta), Poincianella pyramidalis (Catingueira) e Senna obtusifolia (Mata pasto) (Costa e Marinho, 2016), além de muitas espécies do gênero Erythrina (Schleier et al, 2016) com a Erythrina crista-galli, Erythrina falcata (Merlugo et al., 2015), Erythrina mulungu e Erythrina velutina (Palumbo et al., 2016). O gênero Erythrina é conhecido pela bioprodução de alcalóides, flavanonas, isoflavonas e pteropcarpanos (Nkengfack et al, 1994). Entre as espécies do gênero Erythrina encontra-se a Erythrina fusca Lour. (Abobral), é uma espécie arbórea, nativa do pantanal mato-grossense, reconhecida por suas propriedades medicinais, com relatos de utilização em casos de febre, hepatite, malária, reumatismo, dor de dentes e fraturas (Cordero e Boshier, 2003). Existe uma crença popular embasada na ideia de que produtos de origem natural, especialmente os advindos de plantas medicinais não oferecem riscos à saúde humana (Albertasse et al, 2010). No entanto, o uso indiscriminado aliado à falta de conhecimento sobre o efeito dessas plantas no organismo, pode causar danos à saúde (Frescura, 2012), pois as plantas podem conter compostos químicos com potencial para alterar o material genético causando danos diversos (Figueiredo, 2014) como aumento ou redução no índice de devisão celular e uma série de inrregulariedades no processo nas fases da mitose.

Assim torna-se necessário investigar, por meio de testes biológicos, se as plantas medicinais a serem utilizadas possuem potencial citogenotoxico, ou seja, se é capaz de promover alterações no ciclo celular (Neves, 2013). Os níveis de citotoxicidade de um composto ou substância podem ser determinados pelo aumento ou decréscimo do índice mitótico das células meristemáticas de um organismo teste (Maschio, 2009) e por observações macroscópicas, com alteração de cor, formato, tamanho da raiz e deformidade (Longhin, 2008). A genotoxicidade pode ser medida pela observação de irregularidades e aberrações cromossômicas por meio de análises microscópicas (Figueiredo, 2014). O sistema Allium cepa é uma metodologia eficaz e comumente utilizada para a determinação de toxicidade de extratos de plantas medicinais por meio de observações dos efeitos mutagênicos, genotóxicos e citotóxicos dos extratos sobre as células meristemáticas de raízes de cebola (Lessa et al, 2017). O teste A. cepa é validado pelo Programa Internacional de Segurança Química (IPCS, OMS) e pelo Programa Ambiental das Nações Unidas (UNEP), sendo considerado um instrumento de extrema eficiência para avaliar efeitos citogenotóxicos de substancias químicas e amostras ambientais (Leme e Marin-Morales, 2009). Devido à importância das plantas medicinais na prevenção e tratamento de enfermidades e ausência de trabalhos que informem sobre a citogenotoxicidade da espécie Erythrina fusca, este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o potencial citotóxico e genotóxico de extratos aquosos da casca do caule e da raiz de E. fusca, utilizando o teste A. cepa.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de Coleta O material vegetal para preparo dos extratos foi coletado na Estação Ecológica de Taiamã, localizada entre os meridianos W 57º 24’ e W 45° 40’ e paralelos S 16° 48’ e S 16° 58’ (Figura 1C), na região do pantanal, município de Cáceres, MT (Frota et al, 2017). Este estudo foi realizado no âmbito do projeto PELD (n°441563/2016-3) O município de Cáceres encontra-se localizado na mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso, à 209,70 km da capital Cuiabá (Figura 1A e B), e abrange uma área de 24.398 km2 (IBGE, 2017). O clima é do tipo AW, marcadamente sazonal, com temperatura média entre 24 e 26 °C e precipitação pluviométrica com variação entre 1.300 a 1.600 mm anualmente (Alvares et al, 2013).

Figura 1. Localização geográfica da área de Coleta. (A) Localização do estado de Mato Grosso na América do Sul; (B) Localização do munícipio de Cáceres no estado de Mato Grosso, Brasil e (C) Localização da Estação Ecológica Taiamã no município de Cáceres.

A vegetação da região é classificada como Floresta Estacional Semidecidual Aluvial, formação encontrada na depressão pantaneira margeada pelo rio Paraguai (Veloso et al,1991).

Montagem do Experimento e Preparo dos Extratos aquosos Os experimentos de citotoxicidade e genotoxicidade foram realizados no Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular (GenBioMol) e as análises das lâminas foram realizadas no Laboratório Didático I, Centro de Tecnologia da Amazônia Meridional (CETAM) da Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT), campus de Alta Floresta, MT. Para o preparo dos extratos aquosos foram coletadas casca do caule e raízes de E. fusca, os quais foram pesados em balança de precisão no GenBioMol (Figura 2).

Figura 2. Partes de Eritrina fusca utilizadas no preparo dos extratos. Cascas do caule (A) e raízes (B).

Foram preparadas cinco concentrações de extratos aquosos do tipo infuso (EAI) e do tipo decocto (EAD) a partir da raiz e da casca do caule de E. fusca. Utilizando 32 g de casca ou da raiz em 400 mL de água destilada obteve-se o extrato de maior concentração (80 mg mL-1) e a partir desse extrato, por diluição em água, foram obtidas as demais concentrações dos extratos (40; 20, 10 e 5 mg mL-1). A

água destilada foi utilizada como controle negativo e o glifosato diluído a 1%, como controle positivo. O extrato aquoso do tipo infuso foi obtido a partir do aquecimento da água até o ponto de fervura (100 ºC), sendo então vertida sobre a parte da planta a ser avaliada (casca ou raiz) e abafada por 10 minutos. Para obtenção do extrato aquoso do tipo decocto, a água, juntamente com a parte da planta a ser avaliada, foi aquecida e mantida em fervura por cinco minutos. Em seguida, os extratos ficaram em repouso e ao atingir a temperatura ambiente, foram filtrados e diluídos.

Teste Allium cepa L. O teste A. cepa foi realizado utilizando-se a metodologia de tratamento descontínuo (Belcavello et al, 2012), onde os bulbos foram previamente colocados em água destilada por 72 horas para emissão de raízes e posteriormente expostos aos extratos por um período de 48 horas, conforme metodologia proposta por Babich et al. (1997). Os bulbos de A. cepa, foram submetidos a cinco concentrações (5; 10; 20; 40 e 80 mg mL-1) de extratos aquosos do tipo infuso e decocto da raiz e da casca do caule de E. fusca. Os experimentos da casca e da raiz foram conduzidos separadamente em delineamento inteiramente casualizado (DIC) e os bulbos organizados em um esquema fatorial 2 x 5 + 2, sendo dois tipos de extrato (EAI, EAD), cinco concentrações e dois tratamentos controle (água destilada e glifosato 1%), com 5 repetições cada. Os bulbos foram mantidos em câmara de germinação do tipo B.O.D. (Biochemical Oxygen Demand), em temperatura de 25 °C ± 2. Após as 48 horas de exposição nos extratos foram selecionadas, ao acaso 10 raízes de cebolas em cada concentração dos EAI, EAD e dos controles positivos e negativos, para mensuração do comprimento das raizes com auxílio de paquímetro digital (Mitutoyo), para análise do Crescimento do sistema radicular (CSR). Foram coletadas também aproximadamente trinta raízes em cada concentração de cada um dos extratos avaliados e fixadas em solução de Carnoy (3:1, etanol: ácido acético), por 24 horas em temperatura ambiente, sendo então

24 transferidas para álcool 70% e mantidas sob-refrigeração (± 4 ºC) até o momento de uso, para análise da genotixicidade. O potencial citotóxico foi avaliado a partir do crescimento das raízes (CSR) e da análise do índice mitótico (IM), enquanto que o potencial genotóxico foi avaliado a partir da frequência de alterações cromossômicas e/ou anormalidades nas fases da divisão celular. No preparo das lâminas para avaliação do potencial citotóxico e genotóxico, as raízes foram lavadas em água destilada por cinco minutos, hidrolisadas em HCl 1N por 15 minutos e, novamente lavadas em água destilada por cinco minutos. Para confecção de cada lâmina, utilizou-se o meristema apical das raízes, sendo este corado com orceína acética 2%. Com auxílio de um bastão de vidro o meristema foi fragmentado e posteriormente, coberto com lamínula. Para avaliação do IM foram preparadas oito lâminas por concentração de cada um dos extratos avaliados, assim como dos controles negativo e positivo. Foram analisadas 250 células por lâmina, totalizando 2.000 células por tratamento e 10.000 células por extrato. As lâminas foram avaliadas com auxílio de microscópio óptico em amplitude de 400X, observando-se as células em interfase, prófase, metáfase, anáfase e telófase (Figura 3), bem como a ocorrência de alterações celulares. O registro fotográfico foi realizado utilizando uma câmera digital CMOS (1.3 MP), colorida, acoplada ao microscópio e para captura e edição de imagem utilizou-se o software TSview.

Figura 3. Fases da mitose observadas nas raízes de bubos de Allium cepa sob extratos aquosos de Eritrina fusca. (I) interfase, (P) prófase, (M) metáfase, (A) anáfase e (T) telófase.

Para o cálculo do índice mitótico (IM) foi utilizada a fórmula proposta por Pires et al. (2001) (1):

nº de células em mitose IM = ( ) X 100 (1) nº total de células avaliadas

Análise estatística A normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Lilliefors. Os resultados referentes à variável IM foram transformados por meio da fórmula Arco Seno √푥/100, pois não apresentaram distribuição normal (Vasconcelos et al. 2012). Os dados referentes ao CSR também não apresentaram distribuição normal e foram transformados no programa Genes (Cruz, 2013), pela formula: Raiz cubica (X+K). Então os dados normais foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Para o fator concentração dos extratos foram ajustadas regressões polinomiais, sendo que a escolha do modelo foi realizada com base no maior valor do coeficiente de determinação (R2) e no menor desvio padrão da média. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa Genes (Cruz, 2013). 26

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Efeito dos extratos aquosos da casca do caule de Erythrina fusca O resultado da análise de variância (ANOVA) demonstrou que houve interação entre extratos e concentrações nas duas variáveis analisadas (CSR e IM) nos bulbos de A. cepa, sugerindo efeito citotóxico das concentrações entre os extratos. Para os fatores extrato e concentração, separadamente, a ANOVA revelou efeito significativo apenas dos extratos (infuso e decocto) da casca de E. fusca sobre o crescimento do sistema radicular e sobre o índice mitótico das raízes de bulbos de A. cepa (tabela 1); evidenciando uma diferença entre o efeito dos dois extratos (AEI e EAD).

Tabela 1. Resultado da Análise de Variância (ANOVA) para o crescimento do sistema radicular (CSR) e Índice mitótico (IM) das raízes de bulbos de Allium cepa expostos a extratos aquosos (infuso e decocto) da casca do caule de Erythrina fusca Fonte de Variação CSR IM QM GL QM GL Extrato 1,9600** 1 0,5226** 1 Concentração 0,0677ns 5 0,0591ns 5 Extrato X Concentração 0,3493* 5 0,1329** 5 Residuo 0,1348 90 0,0033 70 CV (%) 12,38 21,02 Média Geral 2,97 0,28 ns;**;*: não significativo e significativo a nível de 1% e 5% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F. GL (Grau de Liberdade); QM (Quadrado Médio); CV (Coeficiente de variação).

Os bulbos de A. cepa responderam de forma distinta quanto ao crecimento do sistema radicuar (CSR), quando expostos aos diferentes extratos aquosos do tipo infuso e decocto da casca do caule de E. fusca, quando comparados ao controle negativo (Figura 4). O extrato tipo infuso estimulou o crescimento das raízes, enquanto o EAD inibiu o crescimento. De acordo com as médias do CSR.

Figura 4. Crescimento das raízes dos bulbos de A. cepa após exposição a diferentes concentrações (mg mL-1) de extratos da casca de Erythrina fusca. (A) extrato aquoso do tipo infuso, (B) Extrato aquoso do tipo decocto.

O extrato do tipo infuso da casca do caule de E. fusca estimulou o CSR dos bulbos de Allium cepa apresentando médias acima do controle negativo (0 mg mL-1) em todas as concentrações (5, 10, 20, 40 e 80 mg mL-1) (Figura 5A). Diferente dos resultados obtidos por Bueno et al. (2014) que observaram redução no CSR de Allium cepa com o aumento das concentrações do extrato tipo infuso do caule de Aristolochia cymbifera Mart. & Zucc (Jarrinha). Assim como Reis et al. (2016) avaliando efeito citotóxico da casca do caule de Stryphnodendron adstringens (Barbatimão). Já o extrato do tipo decocto (Figura 5B) inibiu o CSR apresentando médias mais próximas do controle positivo (linha pontilhada) para as concentrações de 10, 20 e 80 mg mL-1, enquanto a concentração de 5 mg mL-1 estimulou o crescimento das raízes, tendo uma média de crescimento superior a média do controle negativo.

50 EAD 50 EAI y = 0.0544x + 29.491 y = -0.0335x + 25.227 40 40 R² = 0.0922 R² = 0.0735

30 30

20 20 CSR (mm) CSR

10 10 CSR (mm) CSR 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -1 -1 A Concentração (mg mL ) B Concentração (mg mL )

Figura 5. Crescimento do sistema radicular (CSR) de bulbos de Allium cepa expostos ao extrato aquoso do tipo infuso (A) e dococto (B) da casca de Erythrina fusca. A linha tracejada representa a média do CSR do controle positivo e ⧳ o erro padrão da média.

Segundo Shishkova et al. (2008) o crescimento radicular pode ser regulado pela combinação entre atividades de divisão celular em meristemas mitoticamente ativos e a elongação celular que acontece nas regiões proximais dos ápices das raízes. No presente estudo o CSR teve mais influência da elongação celular do que da divisão celular, posto que não houve correspondência entre o CSR e o IM. Na análise do IM pode-se observar que o EAI da casca de E. fusca, promoveu redução na divisão celular, apresentando um índice mitótico inferior ao controle negativo para as concentrações de 5, 10, 20 e 40 mg mL-1 e um aumento no IM na concentração de 80 mg mL-1 (Figura 6A). O EAD promoveu efeito contrário ao EAI, ocasionando aumento do índice mitótico nas concentrações de 10, 20 e 40 mg mL-1 e redução no IM nas concentrações de 5 e 80 mg mL-1 (Figura 6B). A maior atividade antiproliferativa do EAI pode estar relacionada a técnica de extração dos extratos, pois a não fervura desse tipo de extrato evita a perda de substâncias e maior obtenção de aleloquímicos, demonstrando que os efeitos dos extratos dependem do método de preparo, pois a quantidade e a variedade de aleloquímicos podem variar conforme o método utilizado para sua obtenção (Rocha et al, 2018). Oliveira et al. (2016) também observou diferença no efeito dos extratos de Dicksonia sellowiana (xaxim) dependendo da técnicas utilizada. Assim como Cardoso (2018) trabalhando com Zingiber officinale (gengibre) e Maltezo (2018) em estudos com Artemisia absinthium (losna).

20 EAD

15 EAI

y = 0,0059x2 - 0,4357x + 8,4469 16 10 R² = 0,7135 12 2 8 y = -0,006x + 0,4959x + 8,0203 5 R² = 0,6323 4

0 0 Índice Mitótico (%) Mitótico Índice Índice Mitótico (%) Mitótico Índice 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -1 A Concentração (mg mL-1) B Concentração (mg mL ) Figura 6. Índice mitótico (IM) de bulbos de Allium cepa expostos ao extrato aquoso do tipo infuso (A) e dococto (B) da casca de Erythrina fusca. A linha tracejada representa a média do IM do controle positivo e ⧳, o erro padrão da média.

Quanto aos efeitos genotóxicos foram observadas 10 células com irregularidades mitóticas no EAI e 15 células no EAD. Sugerindo um efeito genotóxico maior do EAD da casca do caule de E. fusca sobre as raízes de Allium cepa (Tabela 2). Segundo Galvão (2015) algumas irregularidades podem ser corrigidas pelo próprio mecanismo de reparo das células, mas, quando não reparadas ou reparadas erroneamente, originam mutações gênicas e cromossômicas podendo neste caso causar danos ao organismo. Portanto, recomenda-se cuidado ao utilizar as cascas do caule de E. fusca no preparo tipo infuso e decocto para uso como fitoterápico.

Tabela 2. Número de irregularidades por concentração encontradas nos extratos infuso e decocto da casca de Eritrina fusca

Concentrações Infuso IA Decocto IA CN 0 0,00 0 0,00 5 mg mL-1 4 0,04 1 0,01 10 mg mL-1 0 0,00 5 0,05 20 mg mL-1 4 0,04 3 0,03 40 mg mL-1 0 0,00 5 0,05 80 mg mL-1 2 0,02 1 0,01 CP 5 0,05 5 0,05 Total 10 0,1 15 0,15 *O total não inclui células observadas no CN e no CP.; CN: Água destilada; CP: Glifosato 1%; IA: índice de alteração.

As irregularidades observadas em ambos extratos (decocto e infuso) da casca de E. fusca foram: Anáfase com ponte, metáfase irregular e metáfase com adesão cromossômica (Figura 7).

Figura 7. Irregularidades mitóticas observadas em células meristemáticas radiculares de Allium cepa submetidas a diferentes concentrações e extratos da casca de Erythrina fusca. (A) Anáfase com ponte, (B) metáfase irregular, (C) metáfase com adesão cromossômica. Barra = 28 µm.

Extratos aquosos da raiz de Erythrina fusca A Análise de Variância (ANOVA) para os extratos da raiz de E. fusca (tabela 3) revelou efeito significativo entre o EAI e o EAD, sobre o índice mitótico de Allium cepa, e interação entre extratos e concentrações no IM, sugerindo diferença no efeito dos extratos (EAI e EAD) e diferença no IM das concentrações entre os extratos.

Tabela 3. Resultado da Análise de Variância (ANOVA) para o crescimento do sistema radicular (CSR) e Índice mitótico (IM) das raízes de bulbos de Allium cepa expostos a extratos aquosos (infuso e decocto) da raiz de Erythrina fusca Fonte de Variação CSR IM QM GL QM GL Extrato 0,9551ns 1 0,4151** 1 Concentração 0,0552ns 5 0,0779ns 5 Extrato X Concentração 0,2130ns 5 0,0420** 5 Residuo 0,1702 90 0,0067 70 CV (%) 14,96 28,00 Média Geral 2,76 0,29 ns,**: não significativo e significativo a 1% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F. GL (Grau de Liberdade); QM (Quadrado Médio); CV (Coeficiente de variação).

Os bulbos de A. cepa responderam de forma distinta quanto ao CSR, quando expostos aos diferentes extratos aquosos do tipo infuso e decocto da raiz de E. fusca, quando comparados ao controle negativo (Figura 8). O extrato tipo infuso estimulou o crescimento das raízes, enquanto o EAD provocou um efeito contrário. De acordo com as médias do CSR.

Figura 8. Crescimento das raízes dos bulbos de A. cepa após exposição a diferentes concentrações (mg mL-1) de extratos da raiz de Erythrina fusca. (A) extrato aquoso do tipo infuso, (B) extrato aquoso do tipo decocto.

O EAI da raiz de E. fusca, promoveu redução na divisão celular, apresentando um IM inferior ao controle negativo para as concentrações de 5, 10, 20 e 40 mg mL-1 e superior na concentração de 80 mg mL-1 (Figura 9A). O EAD estimulou o IM nas concentrações de 10, 40 e 80 mg mL-1 (Figura 9B). Esses resultados podem ser atribuídos ao fato de que extratos obtidos a partir de uma mesma planta, e até mesmo da mesma parte vegetal, podem promover efeitos diferentes de acordo com o método de extração de metabolitos utilizado (Cardoso, 2018). Portanto ao avaliar diferentes metodologias é necessário considerar fatores como tipo de extrato, tempo da extração, temperatura, natureza do solvente, concentração do solvente e polaridade (Ncube et al., 2008). Santos et al. (2013) salienta que extratos do tipo decocto são mais eficazes na extração de metabólitos de partes duras e de natureza lenhosa, enquanto os extratos do tipo infuso se mostram mais eficiente na extração de metabólitos das partes moles do vegetal. Porém, neste estudo as duas metodologias apresentaram eficiência na extração de

32 metabólitos posto que ambas provocaram alterações significativas no índice mitótico de Allium cepa.

21 EAI 21 EAD

18 2 18

y = 0,004x - 0,2015x + 61503 15 R² = 0,7084 15 12 12 9 9 6 6 y = -0,0009x2 + 0,1514x + 10,123 3 3 R² = 0,732

0 0 Índice Mitótico (%) Mitótico Índice 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (%) Mitótio Índice 0 10 20 30 40 50 60 70 80 -1 A Concentração (mg mL-1) B Concentração (mg mL )

Figura 9. Índice mitótico de bulbos de Allium cepa expostos ao extrato aquoso do tipo infuso (A) e decocto (B) da raiz de Erythrina fusca. A linha tracejada representa a média do IM do controle positivo e ⧳, o erro padrão da média.

Nas análises da genotoxidade dos extratos obtidos das raízes de E. fusca, observou-se a ocorrência de 20 células no EAI e 10 células no EAD apresentando irregularidades. Sugerindo um efeito genotóxico maior do Infuso da casca de E. fusca sobre as raízes de Allium cepa (Tabela 4). Recomende-se a utilização de menores concentrações de raízes de E. fusca no preparo de infusos e decoctos a serem utilizados como fitoterápicos, uma vez que todas as concentrações avaliadas apresentaram alterações no IM mitótico de A. cepa e ou presença de células anormais.

Tabela 4. Número de irregularidades por concentração encontradas nos extratos infuso e decocto da raíz de E. fusca

Concentrações Infuso IA Decocto IA CN 1 0,01 1 0,01 5 mg mL-1 0 0,00 2 0,02 10 mg mL-1 3 0,03 1 0,01 20 mg mL-1 5 0,05 1 0,01 40 mg mL-1 5 0,05 1 0,01 80 mg mL-1 7 0,07 5 0,05 CP 0 0,00 0 0,00 Total 20 0,2 10 0,1 *O total não inclui células observadas no CN e no CP.; CN: Água destilada; CP: Glifosato 1%; IA: índice de alteração.

As irregularidades observadas entre ambos os tratamentos foram: Anáfase com cromossomo isolado, Anáfase com ponte, Anáfase irregular e metáfase com adesão cromossômica (Figura 10).

Figura 10. Irregularidades mitóticas observadas em células meristemáticas radiculares de Allium cepa submetidas a diferentes concentrações e extratos da raiz de Erythrina fusca. (A) anáfase com cromossomo isolado, (B) anáfase com ponte, (C) anáfase irregular, (D) metáfase com adesão cromossômica. Barra = 28 µm.

Analise comparativa do efeito dos extratos aquosos do tipo decocto e infuso obtido da raiz e casca de Erythrina fusca com os controles positivo e negativo Ao comparar as médias do IM das raízes de Allium cepa entre os tratamentos, constatou-se diferença estatística entre as médias do EAI obtidas da casca e da raiz de E. fusca em relação ao controle negativo, evidenciando a inibição da divisão celular e o efeito antiproliferativo dos extratos, sendo o EAI da casca do caule de E. fusca o que apresentou maior citotoxicidade, uma vez que não diferiu significativamente do controle positivo (Tabela 5), tornando-se portanto o método de preparo de chá mais prejudicial e menos recomendado. Já o CSR apresentou diferença estatística apenas para o extrato do tipo decocto da casca do caule de E. fusca apresentando média superior ao controle negativo (Tabela 5).

Tabela 5. Resultado do teste de média para o índice mitótico (IM) e para o crescimento do sistema radicular (CSR) entre os controles positivo e negativo e os extratos de Erythrina fusca utilizados no teste Allium cepa Casca do caule Raiz Tratamentos

IM CSR IM CSR Controle Negativo1 11,10 a 24,70 b 10,55 a 22,22 a EAI 4,52 b 24,29 b 5,84 b 22,02 a EAD 12,60 a 32,14 a 13,27 a 23,57 a Controle Positivo2 3,10 b 17,47 c 1,85 c 17,34 b

Médias seguidas de mesma letra minúscula na vertical não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). 1Água destilada; 2Glifosato 1%; (EAI) Extrato aquoso do tipo infuso, (EAD) Extrato aquoso do tipo Decocto.

Os resultados deste estudo demonstram que a forma de obtenção dos extratos de uma mesma parte da planta pode promover diferentes respostas sobre um organismo, o que evidencia a necessidade de alertar a sociedade quanto à forma de preparo dos fitoterápicos tradicionais, pois as formas de extração do composto podem influenciar negativamente no tratamento, causando efeitos adversos (Maltezo, 2018). As alterações no índice mitótico promovidas pelos tipos de extratos de E. fusca diferiram estatisticamente entre si (Tabela 5), sendo que o EAI exerceu maior efeito inibitório sobre o índice mitótico do que o EAD, tanto para casca quanto para a raiz de E. fusca, indicando seu potencial terapêutico para estudos que visem a inibição do ciclo celular de enfermidades como tumores cancerígenos e infecções virais. Porém, sempre há necessidade de estudos de identificação dos fitoquímicos presentes em plantas medicinais, bem como uma análise mais acurada da sua toxicidade, para orientação quanto ao uso adequado e para o direcionamento de pesquisas voltadas para produção de medicamentos (Cardoso, 2018).

CONCLUSÕES

Os extratos aquosos do tipo infuso obtidos da raíz e da casca de E. fusca possuem potencial citotóxico sobre o ciclo de Allium cepa inibindo a divisão celular nas concentrações de 5 mg mL-1, 10 mg mL-1, 20 mg mL-1 e 40 mg mL-1 . O extrato aquoso do tipo infuso da casca do caule de E. fusca apresentou maior citotoxicidade, sendo o método mais prejudicial e menos recomendado para fins medicinais. O extrato aquoso do tipo decocto apresentou efeito citotóxico apenas quando obtido da casca do caule de E. fusca, estimulando o crescimento das raízes de Allium cepa em comparação ao controle negativo. Todos os extratos utilizados apresentaram potencial genotóxico e todas as concentrações avaliadas apresentaram alterações no IM de A. cepa e ou presença de células anormais. Dessa forma sugere-se maior cautela quanto à forma de preparo do chá do tipo infuso da raiz e da casca do caule de E. fusca, uma vez que que ambos ocasionaram redução significativa no IM de A. cepa. Para os extratos do tipo decocto da casca do caule de E. fusca as concentrações menos recomendada são de 10 mg mL-1 e 40 mg mL-1 . Para os extratos do tipo infuso da casca do caule de E. fusca. as concentrações de 5 mg mL-1 e 20 mg mL-1 são as menos recomendadas. Para o extrado do tipo decocto obtido da raiz de E. fusca a concentração menos recomendada é a de 80 mg mL-1 e para o extrato infuso da raiz de E. fusca as concentrações menos recomendadas são 20 mg mL-, 40 mg mL-1 e 80 mg mL-1, pois essas concentrações demonstraram maior potencial genotoxico.

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4.2. CAPITULO 2

CARACTERIZAÇÃO FLORAL, PALINOLOGIA E ÍNDICE MEIOTICO EM Erythrina fusca LOUR.

INTRODUÇÃO No Brasil, Erythrina fusca Lour ocorre em vegetação predominantemente amazônica, em margens de rios e áreas brejosas, na região Norte e Centro-oeste. A espécie foi introduzida na região Nordeste e Sudeste para diferentes finalidades econômicas como o sombreamento de plantações de cacau (Martins, 2014). A palavra Erythrina tem origem grega “erythros” que significa vermelho, e se refere a cor vermelha viva das flores das espécies do gênero (Schrire, 2005), porém existem outras cores de flores. Os híbridos que ocorrem na natureza apresentam ampla a diversidade genética e consequentemente a diversidade morfológica no gênero (Neill, 1988). As características morfológicas das plantas representadas por componentes estruturais podem ser empregadas com confiança na identificação das espécies (Lawrence, 1973). Além dos componentes macromorfológicos utilizados para a identificação de plantas como folhas, flores, frutos etc., existem também os componentes micromorfológicos como os grãos de pólen, estes por sua vez são morfologicamente distintos entre as espécies de plantas, sendo essas diferenças relacionadas com a sua forma de dispersão, com estruturas que favoreçam a fixação em animais ou a sua dispersão pelo vento ou água (Erdtman, 1966). Estas variações morfológicas podem ser identificadas quanto ao tamanho, forma, simetria, e estruturas da parede externa (Lacourse e May, 2012). O grão de pólen é um corpúsculo formado dentro das anteras, responsável por guardar o gametófito masculino, apresenta parede externa quimicamente estável e morfologia variada. Sua parede tem função de proteger o gametófito masculino e de reconhecer o estigma compatível para germinação (Soler e Nolla, 2002). Devido a grande diversidade morfológica dos grãos de pólens, estudos palinológicos são realizados com o objetivo de caracterizar pólens e identificar a qual espécie pertence, contribuindo com a melissopalinologia, farmacognosia, paleobotânica,

40 paleoecologia, bromatologia, farmacologia, fitoecologia, zooecologia, sedimentologia, medicina legal, taxonomia vegetal, toxicologia, entre outras (Takeda et al., 2001), além de servir de parâmetro em estudos de diversidade genética (Souza et al., 2010). A estimativa da viabilidade polínica é um dos fatores importantes para a análise de fluxo gênico nas plantas porque evidencia o potencial masculino de reprodução da espécie e pode ser útil em estudos taxonômicos, ecológicos, genéticos e palinológicos (Frescura et al., 2012). Além de ter grande relevância para seleção de genótipos para programas de melhoramento, pois os grãos de pólen viáveis influenciam diretamente no sucesso da fertilização (Cabral et al., 2013). O sucesso reprodutivo de uma espécie depende em grande parte da regularidade da meiose, pois esta informa se há produção de gametas viáveis para a reprodução (Wijnker e Jong, 2008). No entanto, esse evento é controlado por vários genes, podendo então causar desarmonia e anormalidade da meiose, resultando em produtos pós-meióticos anormais que causam infertilidade nas plantas (Souza et al., 2003). Tratando-se de estudos de viabilidade, um dos métodos mais utilizados é o teste colorimétrico. Na literatura não há um teste de viabilidade global que utiliza um corante especifico, por isso a importância de se testar vários tipos de corante a fim de encontrar o mais adequado para cada espécie (Hister e Tedesco, 2016). Informações sobre a citoquímica, a viabilidade e a morfologia dos grãos de pólen podem fornecer esclarecimentos a respeito da propagação da espécie auxiliando em programas de melhoramento, na conservação dos seus recursos genéticos, bem como na elucidação de características que propiciem um melhor entendimento taxonômico e biossistemático. Diante do exposto, o presente trabalho foi realizado com objetivo de fazer um estudo reprodutivo, com enfoques na determinação do índice meiótico e na caracterização de aspectos morfológicos, citoquímicos e viabilidade dos grãos de pólen de E. fusca provenientes da região do pantanal do estado de Mato Grosso, a fim de obter informações que poderão colaborar com futuros programas de pré- melhoramento, conservação de recursos genéticos e identificação da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo As coletas do material vegetal de E. fusca, flores e botões florais em vários estádios de desenvolvimento (Figura 1) foram realizadas na Estação Ecológica de Taiamã, município de Cáceres- MT (Figura 2), durante o mês de julho de 2018. As análises foram conduzidas no Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular (GenBioMol) da Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT), campus de Alta Floresta- MT.

Figura 1. Botões florais de Erythrina fusca em diferentes fases de desenvolvimento (A-D); flor de Erythrina fusca em antese (E).

A Estação Ecológica de Taiamã é uma Unidade de Conservação de proteção integral (Brasil, 2000). Encontra-se na bacia do alto rio Paraguai, localizada entre os meridianos W 57º 24’ e W 45° 40’ e paralelos S 16° 48’ e S 16° 58’, e ocupa uma área de 11.555 ha do Pantanal Mato-grossense, entre os rios Paraguai e Bracinho (Frota et al., 2017). Possui, em seu entorno, uma zona de amortecimento (‘campo’) protegida por uma Instrução Normativa (09/2009) e uma Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) (Brasil/MMA, 2017).

Figura 2. Área de estudo. Localização do estado de Mato Grosso na América do Sul e do munícipio de Cáceres no estado de Mato Grosso, Brasil (A); Localização da Estação Ecológica de Taiamã no município de Cáceres e detalhes da reserva (B e C).

Diagnose morfológica das flores de E. fusca Foram coletadas flores abertas de cinco indivíduos, com ocorrência natural na Estação Ecológica Taiamã, região do pantanal do município de Cáceres, MT. O material coletado foi fixado em um mix de solução carnoy (álcool: ácido acético – 3:1) e mantido em temperatura ambiente por 24 horas, posteriormente transferido para álcool 70% e mantidos sob-refrigeração até a sua utilização. A diagnose foi realizada no Laboratório de Morfologia Vegetal do Herbário da Amazônia Meridional (HERBAM) da UNEMAT. As descrições foram elaboradas em conformidade com os procedimentos usuais de taxonomia, mediante a análise macromorfológica do material coletado, com auxílio de estereomicroscópio (Zeiss), e as medidas pertinentes tomadas a partir de 5 flores utilizando-se papel milimetrado e régua. A nomenclatura morfológica foi baseada nas obras de Souza e Lorenzi (2008) e Radford et al. (1974). A ilustração do material foi realizada no Herbário VIC, da Universidade Federal de Viçosa (UFV), Minas Gerais.

Morfologia do pólen Para análise da morfologia polínica foi utilizado o método de acetólise proposto por Erdtman (1952). As anteras de botões em pré-antese fixados em carnoy foram emersas em microtubos de 1,5 mL, contendo 1 mL de ácido acético por 20 minutos. Após este período, os tubos foram centrifugados a 3.000 rotações por minutos (rpm), durante 5 minutos. Posteriormente, o ácido acético foi descartado, sendo acrescentado no microtubo 1 mL da solução acetólica na proporção 9:1 (anidrido acético: ácido sulfúrico), com o intuito de eliminar o conteúdo celular, facilitando a visualização e o reconhecimento dos caracteres morfológicos. Em seguida, os microtubos permaneceram em banho-maria por 2 minutos, a 100 ± 2 ºC. O material foi centrifugado a 3.000 rotações por minuto, durante 5 minutos. Posteriormente a mistura acetólica foi descartada, sendo acrescentado ao microtubo 1 mL de água destilada e 100 µL de ácool etílico. O material foi novamente centrifugado por 5 minutos e o sobrenadante descartado. Depois foi acrescentado 1 mL de água destilada e glicerina na proporção de 3:1 por duas horas. Posteriormente as lâminas foram montadas e observadas por meio de microscópio binocular com uma magnitude de 400 X. As mensurações dos grãos de polens foram realizadas em fotos tiradas no mesmo dia da preparação das lâminas, com o intuito de evitar possíveis problemas de intumescimento, que podem ocorrer com o passar do tempo (Salgado-Labouriau, 1973), uma vez que os grãos de pólen tendem a aumentar de tamanho depois de submetidos ao processo de acetólise (Faegri e Deuse, 1960). Foram obtidas medidas dos eixos polar e equatorial em vista equatorial e do eixo equatorial em vista polar dos grãos de pólen e da espessura das camadas da exina (sexina e nexina). Foram realizadas 25 medições de cada característica examinada de no mínimo, cinco pólens por lâmina. Para classificar os grãos de pólen de acordo com sua forma, foi utilizada a relação entre o eixo polar e o eixo equatorial (P/E) em vista equatorial conforme a classificação de Erdtman (1952) (Tabela 1).

Tabela 1. Classificação dos grãos de pólen com base na razão relação entre o eixo polar e o eixo equatorial (P/E) Classes de Pólen P/E Denominação 0,50 Peroblato 0,50 – 0,74 Oblato

0,75 – 0,87 Suboblato 0,88 – 0,99 Oblato-esferoidal Subesferoidal 1,00 Esférico

1,01 – 1,14 Prolato-esferoidal 1,15 – 1,33 Subprolato 1,34 – 2,00 Prolato 2,00 Perprolato

A classificação do tamanho dos grãos de polens foi baseada no comprimento do maior eixo (Barth, 1964) (Tabela 2).

Tabela 2. Classificação dos grãos de pólens de Erythrina fusca quanto ao tamanho baseada no comprimento do maior eixo Classes Tamanho (µm) Muito pequenos <10 Pequenos 10 - 25 Médios 25 - 50 Grandes 50 - 100 Muito grandes 100 - 200 Gigantes >200

As imagens dos grãos de pólen foram capturadas utilizando uma câmera digital CMOS (1.3 MP), colorida, acoplada ao microscópio, com o auxílio do software TSview e posteriormente analisados e mensurados utilizando-se o programa Anati Quanti 2® UFV (Aguiar et al., 2007).

Razão pólen/óvulo (P/O) A estimativa da razão pólen/óvulo (P/O) foi realizada de acordo com a metodologia proposta por Cruden (1977), representada pela seguinte formula:

nº total de pólens presentes em uma antera X nº total de anteras do botão floral P/O = nº de óvulos presentes no botão floral

A estimativa do número de grãos de pólen por flor foi realizada de acordo com a metodologia sugerida por Dafni (1992) com modificações, em que esmagou- se uma antera de um botão floral em pré- antese sobre uma lâmina em seguida a antera foi imersa em uma solução contendo: 900 µL de etanol 70%, 3 gotas de azul de metileno, 4 gotas de detergente, com volume final ajustado para 1000 µL e agitados em vortex. Foram preparadas 6 laminas com 10 µL de solução em cada lâmina e por meio de microscópio binocular e foram contabilizados todos os grãos de polens presentes na lâmina e assim calculado o número médio de polens na antera. A partir da média da razão P/O foi realizada a inferência sobre o sistema reprodutivo de E. fusca, com base na classificação proposta por Cruden (1977) com a seguinte modificação: retirada da clestogamia como sistema reprodutivo e subatituição do termo xenigamia por autogamia (Tabela 3).

Tabela 3. Sistema reprodutivo com base na razão pólen/óvulo Sistema Reprodutivo Razão pólen/óvulo Cleistogamia 2,7 – 5,4 Autogamia obrigatória 18,1 – 39,0 Autogamia facultativa 31,9 – 396,0 Xenogamia facultativa 244,7 – 2.588,0 Xenogamia obrigatória 2.108,0 – 195.525,0

Viabilidade polínica e Citoquímica Para a análise da viabilidade polínica e citoquímica da espécie foram coletados botões florais de E. fusca em pré- antese de seis indivíduos e fixados em solução de álcool etílico e ácido acético na proporção de 3:1, e mantidos por 24

46 horas a temperatura ambiente e posteriormente, transferidos para álcool 70% e armazenados sob refrigeração até o momento do preparo das lâminas. No preparo das lâminas foi depositada uma antera em cada lâmina macerada e corada com os corantes: carmim acético 2%, reativo de Alexander, sudan IV e lugol. Para cada um dos corantes foram montadas 8 lâminas, e contabilizados 250 grãos de pólens por lâmina, totalizando 2.000 grãos de pólen contabilizados por corante, pelo método de varredura, utilizando um microscópio binocular em magnitude de 400x. A viabilidade polínica foi estimada por meio da percentagem de grãos de pólen viáveis obtidos pela equação:

nº de grãos viaveis Viabilidade do pólen (%) = ( ) × 100 nº total de grãos contados

Os dados obtidos foram submetidos a teste de normalidade Lilliefors e não houve a necessidade de transformação dos dados, pois os mesmos apresentaram distribuição normal (Vasconcelos et al., 2012). E em seguida os dados foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa Genes (Cruz, 2013). Com o intuito de avaliar a presença de substâncias de reserva nos grãos de pólen, utilizaram-se as técnicas citoquímicas de acordo com Baker e Baker (1979). Para a obtenção dos grãos de pólen, anteras maduras foram fragmentadas sobre lâminas com o auxílio de bastão de vidro. Logo após, foi feita a adição de uma gota do corante Lugol (para a identificação de amido), sendo considerados grãos de pólen amido positivo os que apresentaram coloração marrom e grãos de pólen amido negativos os que não apresentaram coloração. O mesmo foi realizado para o corante Sudan IV (para a identificação de lipídios), sendo considerado lipídio positivo os grãos de pólen corados em vermelho e lipídio negativos os que não apresentaram coloração. Para os diferentes corantes, a fim de obter uma amostragem ao acaso, utilizou-se o método de varredura. A contagem polínica foi feita através da utilização de 8 lâminas/corante e 250 pólens/lâmina, totalizando 2.000 células por corante. A contagem das células foi feita utilizando microscópio binocular Carl Zeiss. A captura das imagens foi realizada utilizando uma câmera

47 digital CMOS (1.3 MP), colorida, acoplada ao microscópio e para captura e edição de imagem utilizou-se o software TSview.

Índice meiótico Para a determinação do índice meiótico foram coletados botões florais de E. fusca em diferentes estádios de desenvolvimento. Em seguida, foram fixados em solução Carnoy (etanol e ácido acético) na proporção de 3:1 respectivamente. Após 24 horas, os botões foram transferidos para álcool 70% e armazenados em freezer até o momento do uso. Para o preparo das lâminas os botões florais foram previamente mensurados com paquímetro digital, com intuito de identificar o tamanho dos botões florais que apresentavam produtos pós-meiótico. Foram preparadas oito lâminas, sendo contabilizadas 250 células por lâmina, perfazendo um total de 2.000 produtos pós-meiótico. Para cada lâmina utilizou-se uma antera que, após maceradas, foram coradas com Orceína Acética e contabilizados o número de produtos pós-meióticos encontrados, podendo ser: mônades, díades, tríades, tétrades e políades. Na análise, tétrades com quatro células de tamanho igual foram consideradas normais. As células foram contabilizadas em microscópio óptico em magnitude de 400x. Para estimativa do índice meiótico (IM) foi utilizada a equação proposta por Love (1951):

nº total de tetrades IM = ( ) X 100 nº total de células avaliadas

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diagnose morfológica de flores de E. fusca A espécie E. fusca apresenta flores 5-mera, gamossépalo, pedicelo 1,4- 1,8x0,4 cm, avermelhado, esparsamente puberulento; cálice 1,2-1,3x1,7-1,8 cm, campanulado, cartáceo, puberulento, apícula subapical 2-3 mm comprimento, giba presente; estandarte 5,6-6x5-5,4 cm, obovado, ápice emarginado, base truncada, glabro, não ressupinado, alaranjado; alas 2-2,8x1,3-1,6 cm, livres, obovadas, falcadas, ápice arredondado, alaranjadas, aurícula ausente; pétalas da quilha 3x1,2- 2 cm, unidas, ápice obtuso, glabras, alaranjadas, falcadas, aurículas ausentes; androceu com 10 estames, diadelfo, tubo estaminal 3-3,1 cm comprimento., creme, anteras 4-4,5x1 mm, dorsifixas, estreitamente elípticas, deiscência rimosa, com nectário composto por 10 lóbulos tubulares, carnosos; ginóforo 1-1,5 cm comprimento, seríceo; ovário 1,8-2,1 cm comprimento, falcado, seríco, 12-13 óvulos; estilete 2-2,1 cm comprimento, glabro; estigma cilíndrico. Os detalhes morfológicos de flor de E. fusca podem ser observados na ilustração botânica apresentada na Figura 3. Foram verificadas algumas variações morfológicas das flores de E. fusca em relação as descrições encontradas para a espécie. Neste estudo foi observada a presença de 10 lóbulos tubulares no nectário das flores e variação de 12-13 óvulos, e coloração laranjada nas pétalas, enquanto que Martins (2014), observou 8 lóbulos tubulares no nectario e variação de 8-10 óvulos, coloração creme nas pétalas. Conforme Neill (1993), as flores de Erythrina são predominantemente vermelhas, rosa ou laranja, mas alguns indivíduos principalmente os cultivados têm cores diferentes como amarelo esverdeado, brancas ou pálidas. Essas variações podem estar relacionadas a fatores ambientais ou ao surgimento de novos híbridos na espécie.

Figura 3. Ilustração botânica da flor de E. fusca. A) flor; B) estandarte; C) alas; D) pétalas da quilha; E) androceu; F) gineceu; G) ovário com corte longitudinal evidenciando os óvulos. Ilustração: Reinaldo A. Pinto.

Pequenas variações no tamanho do cálice, estandarte, pétalas da quilha também foram observadas. Segundo Krukoff e Barneby (1974), todas as espécies do gênero Erythrina apresentam diversidade na estrutura floral, principalmente em tamanho e forma. O cálice apresenta variações morfológicas que foram utilizadas para determinar a classificação infragenérica. Segundo Kass (1994), a polinização por pássaros e a facilidade de hibridação entre as espécies de Erythrina resultaram em uma quantidade considerável de diversidade morfológica no gênero.

Morfologia polínica Os grãos de pólen de E. fusca foram classificados como 3-porados (Figura 4B), corroborando com a descrição de Buril (2011) para Erythrina velutina Willd. A Rede de Catalagos Palinologicos (RCPol) (2019) estudando grãos de polens de Erythrina falcata e Buril (2011) em estudos com E. velutina, descreve o formato dos pólens como suboblato, diferenciando-se do formato dos pólens de E. fusca encontrado neste estudo, classificado como oblato-esferoidal, apresentando 68 a 81 μm de diâmetro equatorial e 65 a 78 μm de eixo polar (Tabela 4). A sexina observada em E. fusca é do tipo reticulada com retículo heterobrocado (Figura 4C), concordante com a sexina de E. falcata (RCPol, 2019). A exina de E. fusca possui média de 3,39 µm. Quanto ao tamanho, os pólens de E. fusca foram classificados como grandes, com média do maior eixo de 75,64 µm, diferente das características observadas por Buril (2011), na espécie E. velutina, onde classificou os pólens como médios, diferindo também dos pólens de E. falcata que foi classificado como pequeno por RCPol (2019). Segundo Moore e Webb (1978), variações na forma dos grãos de pólens é considerado normal, podendo ocorrer até mesmo dentro de uma mesma espécie.

Tabela 4. Medidas dos pólens de Erythrina fusca Medidas Mín.- Máx x ± sx (μm) IC 95% (μm) CV (%) (µm) Diâmetro Equatorial (VE) 68 - 81 75,64 ± 2,36 74,59 - 76,58 3,12 Eixo Polar (VE) 65 - 78 74,64 ± 2,48 73,34 – 75,63 3,32 Nexina 1,1 - 1,9 1,43 ± 0,25 0,97 – 0,99 17,51

Sexina 1,3 - 2,4 1,95 ± 0,26 1,32 – 1,53 13,45

Exina 2,4 - 4,1 3,39 ± 0,41 1,83 – 2,06 12,35

P/E 0,96 - 1,03 0,98 ± 0,01 3,20 – 3,56 1,79 x = média; sx = desvio padrão da média; IC = intervalo de confiança; CV (%) = coeficiente de variação; VE = Vista Equatorial; VP = Vista Polar; P/E = Razão entre eixo polar sobre diâmetro equatorial; I.A.P.= Índice de área polar.

Figura 4. Fotomicrografias dos grãos de pólen de Erythrina fusca submetidos ao método de acetólise. A) Vista equatorial. B) Vista polar. C) Detalhe da superfície (ornamentação). Barra = 9 μm.

Razão pólen/óvulo (P/O) A razão pólen/óvulo de E. fusca foi de 48.846,15 indicando que a espécie apresenta sistema reprodutivo do tipo xenogamico obrigatório, De acordo com Cruden (1977), as espécies xenogâmicas apresentam protandria, são auto- incompatíveis e a maioria necessita de um polinizador. O conhecimento do sistema reprodutivo das espécies fornece informações importantes para os programas de melhoramento genético e para a compreensão do processo de domesticação (Facanali et al., 2009). Conforme Gomes et al. (2001), o conhecimento da estrutura floral e da biologia reprodutiva auxiliam na escolha da técnica adequada de emasculação e polinização, aumentando assim o sucesso dos cruzamentos em programas de melhoramento.

Viabilidade e Citoquímica Os testes colorimétricos utilizados (reativo de Alexander, carmim acético, sudan IV e lugol) para a avaliação da viabilidade polínica de E. fusca foram eficientes em distinguir os polens viáveis dos inviáveis conforme demonstrado na Figura 5.

Figura 5: Grãos de pólens viáveis e inviáveis de Erythrina fusca; A) Corados com reativo de Alexander; B) Corados com Carmim acético C); corados com Sudan; D) IV Corados com Lugol. V = viável e I = inviável. Barra =17 µm.

O corante reativo de Alexander corou a parede celular de verde claro- azulado e o protoplasma de púrpura. Segundo Alexander (1980) o Reativo de Alexander apresenta coloração diferenciada dos polens viáveis e inviáveis, devido à utilização simultânea de verde malaquita e fucsina ácida. O verde malaquita tem afinidade pela celulose presente na parede celular, corando-a de verde, enquanto que o protoplasma é corado pela fucsina ácida. Dessa maneira, por não apresentarem protoplasma, os grãos de pólen inviáveis coram-se de verde. O carmim acético apresentou coloração avermelhada para os polens viáveis, enquanto que os inviáveis não foram corados. A coloração dos polens viáveis ocorre devido à reação do corante com o material genético existente no citoplasma (Pagliarini e Pozzobon, 2004). O Sudan IV apresentou coloração uniforme de vermelho-alaranjado para os pólens viáveis enquanto os inviáveis apresentaram coloração desuniforme ou pólens não corados. Este corante tem como função corar lipídios presentes nas células. Os grãos de pólens viáveis corados com Lugol apresentam coloração marrom escuro enquanto os inviáveis apresentam coloração marrom claro- amarelada. A coloração marrom dos pólens viáveis é possível devido uma reação química que acontece entre o iodo e moléculas de amido (Pagliarini e Pozzobon, 2004).

Foi verificado diferença estatística entre os corantes utilizados em relação a porcentagem de viabilidade polínica (Tabela 5). Todos os corantes utilizados neste estudo apresentaram viabilidade acima de 95%, o que indica que a espécie E. fusca apresenta alto percentual de viabilidade polínica. De acordo com Souza (2002), valores de viabilidade polínica menores de 30% reportam baixa viabilidade dos grãos de polens, valores de 31 a 69% correspondem à viabilidade média e valores acima de 70% indicam viabilidade alta.

Tabela 5. Média de viabilidade dos grãos de pólen de Erythrina fusca corados com os corantes: Reativo de Alexander, Carmim acético, Sudan IV e Lugol Corantes % de viabilidade Reativo de Alexander 98,85 a Carmim Acético 98,20 ab Sudan IV 96,35 bc Lugol 95,05 c Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey 5%.

O Reativo de Alexander e o Carmim Acético apresentaram as maiores médias de viabilidade polínica com 98,84% e 98,20% respectivamente, não diferindo estatisticamente entre si. Estes corantes permitem avaliar a integridade de estruturas celulares como núcleo e parede celular (Peñaloza et al., 2005). Apesar de ambos reportarem alta viabilidade para a espécie, o Reativo de Alexander é o mais recomendado para as análises de viabilidade polínica de E. fusca, por apresentar uma melhor distinção visual entre os pólens viáveis e inviáveis. As menores médias de viabilidade polínica foram apresentadas pelos corantes Sudan IV (96,35) e Lugol (95,05). Apesar do sudan IV e do Lugol serem utilizados por muitos autores para a estimativa da viabilidade polínica, estes são mais recomendados para à detecção de substâncias constituintes dos grãos de pólen, como lipídios e amido, que podem estar presentes tanto em grãos de pólen maduros como nos abortados (Rodriguez-Riano e Dafni 2000). A eficiência desses dois corantes para analise citoquimica foi comprovada por Bitencourt (2016) trabalhando com Schinus terebinthifolia Raddi (Aroeira-vermelha) e por Roelis (2018) em estudos com Bertholletia excelsa (Castanheira-do-Brasil). O teste

54 citoquímico, neste estudo, revelou que a espécie E. fusca possuí amido e lipídio como substancias de reserva em seus grãos de pólens. Segundo Backer e Backer (1979) os grãos de pólen amido positivo fazem parte do processo evolutivo das plantas para evitar que insetos não polinizadores se alimentem dos grãos de pólen. Pacini et al. (2006) relata que a presença de amido como substância de reserva auxilia na manutenção da viabilidade do grão de pólen, o que pode ter contribuído para a alta viabilidade encontrada neste estudo (Tabela 5). A presença de lipídios nos grãos de pólen promove melhor aderência dos grãos com as anteras e com o estigma, também os protege contra radiação UV perda de água e mantém os grãos de pólen unidos durante o transporte (Pacini e Hesse, 2005). Estudos realizados por Wang et al. (2004) relatam que praticamente todas as angiospermas apresentam pólens com lipídios na sua composição, sendo esta macromolécula importante para a atração de polinizadores. Estudos realizados por Parini e Raposo (2010) revelam que as aves das famílias Psittacidae, Trochilidae, Coerebidae, Thraupidae e Icteridae atuam como potenciais polinizadores de E. fusca no Pantanal, apresentando comportamento não destrutivos em suas visitas. A espécie E. fusca possui flores hermafroditas, desta forma quando as aves inserem o bico por entre as pétalas para sugar o néctar, tocam eventualmente em anteras e estigmas, contribuindo assim para o transporte de pólen das plantas (Parini e Raposo, 2010). Diante das análises citoquímicas realizadas é possível sugerir que os grãos de pólen da E. fusca possuem adaptações para evitar insetos que não sejam polinizadores e têm maior resistência à desidratação, característica importante para uma espécie típica de clima tropical.

Índice meiótico O tamanho médio dos botões florais com células em pós-meiótico variou de 10,8 a 11,5 mm. Na análise do índice meiótico, foram observadas apenas tétrades e tríades (Figura 6), outros produtos pós-meióticos (mônade, díade e políade) não foram encontrados.

Figura 6. Produtos pós-meióticos observados em Erithrina fusca. A) tríade; B) tétrade normal. Barra= 14 µm.

Os níveis de irregularidades meióticas em E. fusca foi baixos, uma vez que o Índice Meiótico (IM) foi de 98,45%, apresentando um maior número de tétrades normais (1.969) e uma pequena taxa de tríades (31) (Tabela 6). Segundo Love (1949), IM acima de 80% indica regularidade meiótica, resultando na formação de tétrades. Logo o IM obtido (98,45%,) e a grande quantidade de tétrades encontradas neste estudo indicam que a espécie E. fusca possui regularidade meiótica. Característica favorável para programas de melhoramento.

Tabela 6. Produtos pós-meióticos de Erythrina fusca observados em lâminas com auxílio de microscópio óptico com objetiva de 40x Repetição Normais Tríades Total %IM 1 250 0 250 100 2 250 0 250 100 3 249 1 250 99,60 4 242 8 250 96,80 5 243 7 250 97,20 6 248 2 250 99,20 7 245 5 250 98,00 8 242 8 250 96,80 Total 1.969 31 2000 - Média 246,26 3,87 - 98,45

A alta porcentagem do índice meiótico obtido para E. fusca foi concordante com o percentual de viabilidade obtido para a espécie. Conforme Lima et al. (2016) a meiose regular gera como resultado um alto percentual de tétrades normais e consequentemente alta viabilidade polínica. A estabilidade desse processo pode ser verificada através do índice meiótico, que indica o quanto a divisão celular meiótica foi estável e regular (Pereira et al., 2017). Segundo Battistin e Mattos (2002), o alto 56

índice meiótico e o alto índice de viabilidade polínica, confirmam a regularidade meiótica na microsporogênese da espécie e caso a mesma regularidade ocorrer na megasporogênese, esta espécie não apresentará problemas em termos de viabilidade de sementes e produção, contribuindo desta forma, para a manutenção de novas gerações.

CONCLUSÕES Os grãos de pólen de E. fusca possuem formato oblato-esferoidal, são 3- porados e apresentam sexina reticulada com retículo heterobrocado. A espécie E. fusca apresenta sistema reprodutivo do tipo xenogâmico obrigatório, sendo esse sistema de reprodução típico de espécies que necessitam de um polinizador efetivo. A alta taxa de viabilidade polínica encontrada para E. fusca foi concordante com a alta porcentagem do índice meiótico observada na espécie, sendo o Reativo de Alexander o corante mais recomendado para as análises de viabilidade polínica de E. fusca. A análise citoquimica indicou que E. fusca possui amido e lipídio como substancias de reserva em seus grãos de pólen, características importantes para o sucesso reprodutivo da espécie.

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4.3. CAPITULO 3

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Erythrina fusca LOUR. NATIVA DO PANTANAL MATO-GROSSENSE

INTRODUÇÃO A espécie Erythrina fusca Lour. É utilizada na produção de bens e serviços, tais como: sombreamento de culturas perenes, produção de forragem e adubo verde (Lorenzi, 2002). Além de ser uma espécie promissora para recuperação de áreas degradadas e sistemas agroflorestais (Miranda e Valentim, 2000), sendo uma planta típica de matas ciliares e pântanos (Parrini e Raposo, 2010). Informações sobre a diversidade genética de espécies nativas, dentro e entre populações, são indispensáveis para o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a domesticação e incorporação dessas espécies nos sistemas produtivos regionais, bem como para dar suporte a planos de conservação dos recursos genéticos (Costa et al., 2011) e subsidiar projetos de restauração florestal e programas de melhoramento que utilizam espécies nativas. Neste contexto, ferramentas moleculares são úteis em estudos de espécies nativas destinadas à exploração comercial, programas de melhoramento genético e de conservação. As técnicas de biologia molecular relacionadas a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) vem se destacando em estudos de diversidade, pois permite a identificação de ampla variabilidade intra e interespecíficas (Lorenzoni et al., 2014). O uso de marcadores moleculares possibilita uma avaliação precisa dos materiais vegetais, uma vez que detectam o polimorfismo diretamente ao nível do DNA, sem influência do ambiente (Souza, 2001). Desta forma, os marcadores moleculares são de grande valia em pesquisas relacionadas a seleção e análise de variabilidade genética de materiais vegetais para compor bancos de germoplasma (Pereira e Pereira, 2006). Os bancos de germoplasma podem manter, por um longo período, sementes, gametas, embriões e células somáticas em condições viáveis de uso. Aliados à programas de conservação, esses bancos de genes podem fornecer

63 e receber material genético em potencial (Trounson et al., 1998), ou que tenham importantes características biológicas a serem preservadas (Hiemstra et al., 2005), ou ainda espécies localmente adaptadas ou em risco de extinção (Ramos et al., 2011). Dentre as diversas técnicas moleculares, os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) tem sido utilizados com bastante sucesso para revelar o polimorfismo genético em muitas espécies vegetais (Almeida Júnior et al., 2010), tais como Bertholletia excelsa (castanha-do-brasil) (Ramalho et al., 2016), Plathymenia reticulata Benth (Vinhático) (Souza et al., 2017), Theobroma speciosum Willd. ex Spreng (cacauí) e Theobroma subincanum Mart. (cupuí) (Rossi et al., 2017). Os marcadores ISSRs não necessitam do conhecimento prévio do genoma da espécie, são marcadores moleculares dominantes, ou seja, não diferenciam os indivíduos heterozigotos dos homozigotos, porém, tem a vantagem de analisar locos múltiplos em uma única reação de PCR (Preczenhak, 2013). São considerados marcadores amplamente variáveis devido à grande ocorrência e distribuição no genoma (Ellegren, 2004), mostrando-se úteis em estudos genéticos, especialmente de diversidade genética e das relações de indivíduos proximamente relacionados (Salimath et al., 1995). Neste contexto o presente estudo objetivou avaliar a diversidade genética entre 35 indivíduos de E. fusca, com ocorrência natural no Pantanal Mato- Grossense, por meio de 10 marcadores moleculares ISSR.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo A coleta do material foliar para extração de DNA total foi realizada na região do pantanal, município de Cáceres, localizado na mesorregião Centro-Sul do Estado de Mato Grosso (Figura 1).

Figura 1. Localização geográfica dos pontos de coleta de Erythrina fusca. Localização do estado de Mato Grosso na América do Sul e do munícipio de Cáceres no estado de Mato Grosso, Brasil (A e B); Localização dos indivíduos de Erythrina fusca no município de Cáceres (C).

Coleta do Material vegetal Foram amostrados 35 indivíduos, dos quais foram coletadas 5 folhas jovens de cada individuo em duas localidades do município de Cáceres.; 28 indivíduos situados na Estação Ecologica deTaiamã e 7 indivíduos situados nas proximidades do rio Jauru (Latitude 16º 7’57.58’’S Longitude 58º0’38.70’’O). O rio Jauru é um dos principais afluentes da margem direita do rio Paraguai (WWF-Brasil, 2008).

Todo material foliar coletado foi identificado e acondicionado em saco plástico com sílica gel e levado ao Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular (GenBioMol), Campus Universitário da UNEMAT de Alta Floresta-MT.

O material foliar foi lavado em água corrente e levemente secado com papel toalha, posteriormente foi armazenado em freezer – 20ºC até o momento da extração do DNA.

Extração e Quantificação de DNA O DNA genômico total foi extraído no Laboratório de Genética Vegetal e Biologia Molecular (GenBioMol), na Universidade do Estado de Mato Grosso (UNEMAT), campus de Alta Floresta, MT. Para a extração do DNA utilizou-se aproximadamente 100 mg de folhas, seguindo o método descrito por Doyle e Doyle (1987) com algumas modificações como aumento na concentração CTAB de 2% para 5%, de β-mercaptoetanol de 0,2% para 3% e acréscimo de polivinilpirrolidona (PVP) 2% no tampão de extração. O tempo de incubação foi de 30 minutos, com agitação suave a cada 10 minutos. O tecido foliar foi triturado com adição de nitrogênio líquido e auxilio de almofariz e pistilo de porcelana. O material triturado foi transferido para microtubos de 2 mL, ao qual foram adicionados 800 μL de tampão de extração CTAB (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1,4 M cloreto de sódio; 20 mM EDTA; 5% CTAB; 2% polivinilpirrolidona (PVP) e 3% β-mercaptoetanol). Após adição do CTAB, o material foi homogeneizado em agitador vortex Kasvi e incubado, em banho-maria, por 30 minutos à 65 °C, sendo realizada inversão manual a cada 10 minutos. Após o período de incubação, os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm em microcentrífuga Novatecnica (NT 800), por 10 minutos. Em seguida, a fase aquosa foi transferida para um novo microtubo de 1,5 mL ao qual foi adicionado 700 μL de clorofórmio: álcool isoamílico 24:1 (v:v). A mistura foi homogeneizada em vortex e centrifugada por 10 minutos à 12.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo de 1,5 mL e precipitado em 500μL de álcool isopropílico gelado (-20ºC) por aproximadamente 3 horas em freezer à -20°C. Após este período, o material foi centrifugado a 12.000 rpm por 10 minutos e o precipitado foi lavado duas vezes com álcool etílico a 70% (v:v) e uma vez com álcool etílico a 95% (v:v). 66

Depois da secagem, o precipitado foi ressuspendido em 40 μL de TE 0,1 mM (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0) com 0,12 μL de RNAse na concentração de 40 µg mL-1. A solução foi incubada em banho-maria a 35ºC por 30 minutos. Posteriormente, os microtubos foram armazenados em geladeira (4ºC) por 24 h e depois em freezer (-20ºC). A qualidade e a quantificação do DNA foram avaliadas por meio da técnica de eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (10 mg mL-1). A quantificação foi realizada por meio da comparação visual com marcadores de pesos moleculares de DNA padrão (lambda) com 100 ng μL-1. O DNA quantificado foi diluído para a obtenção das soluções de trabalho a 10 ng μL-1.

Amplificação de locos ISSR Inicialmente foram realizados testes de amplificação com três indivíduos de E. fusca com 30 primers ISSR desenvolvidos pela University of British Columbia (UBC). Com base na intensidade, polimorfismo e repetitividade das bandas, foram selecionados 10 primers contendo de 15 a 18 pares de base (Tabela 1) para a caracterização molecular dos 35 indivíduos. Tabela 1. Primers de ISSR utilizados na caracterização molecular dos 35 indivíduos de Erythrina fusca, suas respectivas sequências e temperaturas de anelamento Nome do primer Sequência (5’ – 3’) TA (°C)

UBC 808 – Di(AG)83’C AGAGAGAGAGAGAGAGC 52

UBC 809 – Di(AG)83’G AGAGAGAGAGAGAGAGG 54

UBC 811 – Di(GA)83’C GAGAGAGAGAGAGAGAC 54

UBC 834 – Di(AG)83’YT AGAGAGAGAGAGAGAGYT* 52

UBC 842 – Di(GA)83’YG GAGAGAGAGAGAGAGAYG* 52

UBC 855 – Di(AC)83’YT ACACACACACACACACYT* 52

UBC 857– Di(AC)83’YG ACACACACACACACACYG* 52

UBC 864 – Tri(ATG)6 ATGATGATGATGATGATG 52

UBC 868 – Tri(GAA)6 GAAGAAGAAGAAGAAGAA 52

UBC 880 – Penta(GGAGA)3 GGAGAGGAGAGGAGA 52 *Y = C ou T; TA = Temperatura de Anelamento.

As reações de amplificação (PCR) foram realizadas em um volume final de 13 μL, contendo 1 μL de DNA (± 20 ng), 1,5 μL de tampão I0 10x phoneutria (500 mM KCl; 100 mM Tris-HCL pH 8,4; 1% Triton X-100), 1,5 μL de MgCl2 (25 mM), 1,5 67

μL de primer (0,002 mM), 1,5 μL de dNTP (1 mM de cada dNTP) e 0,12 μL de Taq polimerase (5 U μL-1) e água Mili-Q. As reações de amplificação via PCR, foram realizadas em termociclador AerisTM utilizando o programa proposto por Oliveira et al. (2016) com modificação no número de ciclos de 40 para 35. As condições de amplificação foram as seguintes: 1 min e 30 seg a 95°C (desnaturação inicial); 35 ciclos de 40 segundos a 94°C (desnaturação); 45 segundos a 52ºC e 54°C dependendo do primer utilizado (anelamento); 2 minutos a 72°C (extensão) e 7 minutos a 72°C (extensão final). A temperatura de anelamento variou de acordo com o primer utilizado. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, com tampão de corrida TBE 1X, em cuba horizontal LCH 20x25 (Loccus Biotecnologia®) sob voltagem constante de 80 V por, aproximadamente, quatro horas. A coloração do gel foi realizada por imersão em solução de brometo de etídio (0,6 µg mL-1) por 20 minutos, sob agitação constante. Para comparação dos tamanhos dos fragmentos amplificados foi utilizado o marcador de 100 pb DNA Ladder Kappa. Em seguida, os géis foram visualizados, fotografados em transiluminador com luz UVB LTB-20x20 STi, fotodocumentador e software L-Pix STi (Loccus Biotecnologia®).

Análise dos fragmentos amplificados Os produtos amplificados constituíram a matriz de presença (1) e ausência (0) de bandas. Os dados foram obtidos pela avaliação visual das bandas nos 35 indivíduos estudados. Como o marcador ISSR é dominante, assumiu-se que cada banda representa o fenótipo em um loco bi-alélico (Williams et al., 1990).

Porcentagem de Polimorfismo A partir da matriz binária foi calculada a porcentagem de polimorfismo obtida com cada primer utilizado, por meio da equação 1:

푛푏푝 P = × 100 (1) 푛푡푏

Onde P corresponde a porcentagem de polimorfismo; nbp o número de bandas polimórficas; ntb o número total de bandas.

Conteúdo de Informação Polimórfica O PIC (Conteúdo de Informação Polimórfica) de cada primer foi calculado conforme proposto por Rezende et al (2009) (equação 2): 2 PICprimer = 1 – Σi. Σj Pij (2) Onde, onde Pi é a frequência do alelo “p” no loco “pi” e Pij é a frequência do alelo p, do loco i, no primer j.

Índice de Jaccard A matriz de dissimilaridade genética entre cada par de indivíduos foi calculada por meio do índice de Jaccard (equação 3). Esse coeficiente consiste na comparação do número de presenças de bandas iguais e o número total de bandas amplificadas, excluindo o número de ausências conjuntas (Meyer et al, 2004).

Dij = 1 - Sij (3)

Onde

푎 Sij = 푎+푏+푐

Em que ‘a’ equivale ao número de casos em que ocorre a presença da banda em ambos os indivíduos; ‘b’ ao número de casos em que ocorre a presença da banda somente no indivíduo i; ‘c’ ao número de casos em que ocorre a presença da banda somente no indivíduo j.

Análise de agrupamento A matriz gerada pelo índice de Jaccard foi utilizada para realizar a análise de agrupamento dos 35 indivíduos avaliados, por meio dos métodos hierárquicos UPGMA, Vizinho mais Próximo ou Ligação Simples (SL) e WARD, sendo calculado o coeficiente de correlação cofenética (CCC), estresse e distorção, e a partir desses dados foi selecionado o método de agrupamento mais consistente e que melhor explicou a divergência do material em estudo. A matriz de distâncias gerada pelo coeficiente aritmético do Índice de Jaccard também foi utilizada para o agrupamento dos indivíduos pelo método de Otimização de Tocher. Para essas analises utilizou- se o software GENES (Cruz, 2013).

O programa “Structure” (Pritchard et al., 2000), baseado em estatística bayesiana foi utilizado para inferir o número de grupos (K), nos quais os indivíduos encontram-se estruturados. Foram realizadas 20 corridas para cada valor de K, 200.000 interações iniciais (“burn-ins”) e 500.000 simulações de Monte Carlo via Cadeias de Markov (MCMC). Para definição do K mais provável em relação aos propostos, foram utilizados os critérios descritos por Pritchard e Wen (2004) e Evano et al. (2005). As relações genéticas entre todos os indivíduos avaliados foram visualizadas através da Análise de Coordenadas Principais (PCoA), obtida por distância genética, usando o programa GenAIEx (Peakall e Smouse, 2012). Para caracterização da variabilidade genética entre os grupos genéticos constituídos pela análise bayesiana foi calculada a diversidade genética de Nei (He) (Nei, 1978), o índice de diversidade de Shannon (I) (Lewontin,1972) e o percentual de locos polimórficos (%P) a partir da análise da matriz binária de presença e ausência, utilizando o programa POPGENE 1.32 (Yeh et al., 2000). A diversidade genética entre e dentro dos grupos foi demonstrada a partir da AMOVA (Análise de Variância Molecular), com auxílio do programa GenAIEx (Peakall e Smouse, 2012).

RESULTADOS E DISCUSSÃO Os 10 primers de ISSR utilizados amplificaram 74 fragmentos dos quais 43 foram polimórficos. A quantidade de fragmentos por primer variou de 4 (UBC 842 e UBC 857) a 13 (UBC 809 e UBC 811), com média de 7,4 bandas por primer (Tabela 2). Segundo Alves et al. (2007), a maioria das espécies arbóreas tropicais apresentam um grande número de alelo por loco. Gonçalves et al. (2014) trabalhando com 40 indivíduos de Erythrina velutina Willd., e onze primers obtiveram média de 13,54 bandas por primer de ISSR. Souza et al. (2016) estudando diversidade genética de 20 indivíduos de E. velutina e oito primers de ISSR obtiveram média de 59, 87 bandas por primer, superior à média obtida neste estudo. O número mínimo de bandas polimórficas (2) foi revelado pelos primers UBC 857 e UBC 868, enquanto o primer UBC 809 revelou o número máximo de bandas polimórficas (8) (Tabela 2).

Tabela 2. Primers ISSR utilizados, número total de bandas amplificadas (NTB), número de bandas polimórficas (NBP), porcentagem de polimorfismo (% P) e conteúdo de informação polimórfica (PIC) Primer NTB NBP %P PIC UBC 808 5 5 100 0,16 UBC 809 13 8 61,53 0.21 UBC 811 13 7 53,84 0,18 UBC 834 9 5 55,55 0,23 UBC 842 4 3 75 0,11 UBC 855 5 3 60 0,19 UBC 857 4 2 50 0,10 UBC 864 5 4 80 0,17 UBC 868 11 2 18,18 0,06 UBC 880 5 4 80 0,45 Total 74 43 58,11 - Média 7,4 4,3 - 0,18

Os 10 primers utilizados revelaram um total de 58,11% de polimorfismo, diferente de Gonçalves et al. (2014) em estudos de diversidade genética de E. velutina, que obtiveram 78,52% de polimorfismo e Souza et al. (2016) também em estudos com E. velutiva obtiveram 84,96% de polimorfismo. A porcentagem de polimorfismo encontrada neste estudo indica que os 10 primer utilizados foram eficientes para avaliar a diversidade genética entre indivíduos e populações de E. fusca. O perfil eletroforético de 18 indivíduos de E. fusca avaliados com o primer UBC 811 está demonstrado na Figura 2.

Figura 2. Perfil eletroforético do DNA extraído de 18 indivíduos de Erythrina fusca utilizando o primer UBC 811. M = marcador de 100 pb.

Os valores de dissimilaridade genética variaram de 0,0577 a 0,3617, sendo os indivíduos 3 e 4 os mais similares e os indivíduos 2 e 28 os mais divergentes. Tanto os indivíduos mais similares quanto os mais divergentes estão localizados geograficamente na Estação Ecológica Taiamã (Figura 3).

Figura 3. Distribuição geográfica dos 35 indivíduos de Erythrina fusca coletados na região do pantanal do município de Cáceres - MT. Localização dos pontos de coleta (A). Identificação dos indivíduos coletados nas proximidades do rio Jauru (B). Identificação dos indivíduos coletados na Estação Ecológica Taiamã (C). As cores (vermelha, azul e verde) que estão representando os indivíduos correspondem aos grupos genéticos da análise bayesiana (Figura 5A).

O método de agrupamento UPGMA foi selecionado dentre os três métodos testados por apresentar maior coeficiente de correlação cofenética (CCC), menor distorção e estresse conforme indicado por Cruz e Carneiro (2003) (Tabela 3), sendo o método que melhor representou a diversidade genética entre os indivíduos. O CCC evidenciou associação de 76% entre as distâncias obtidas na matriz de dissimilaridade e a matriz cofenética. Valores de CCC superiores a 0,7 são considerados satisfatórios e valores inferiores a este demonstra que o método de agrupamento é inadequado para resumir a informação do conjunto de dados (Rohlf, 1970), sendo portando inviável a utilização dos métodos SL e WARD neste estudo.

TABELA 3. Coeficiente de Correlação Cofenética (CCC), estresse e distorção dos Métodos UPGMA, Vizinho mais próximo (SL) e Ward Método de agrupamento CCC Distorção (%) Estresse (%) UPGMA 0,76 2,87 16,93 SL 0,60 64,66 43,71 WARD 0,60 - -

Os resultados deste trabalho foram concordantes com os de Gonçalves et al. (2014) em avaliação da diversidade genética de E. velutina, que também obteveram alta correlação cofenética com o método UPGMA. Assim como Tiago et al. (2016) em estudos de diversidade genética em Hymenaea courbaril L. (Fabaceae). O método UPGMA utiliza as médias aritméticas (não ponderadas) das medidas de dissimilaridade, o que evita caracterizar a dissimilaridade por valores extremos entre os individuos analisados. A construção dos dendrogramas é estabelecida pelos modelos ajustados de menor dissimilaridade (Cruz et al., 2004) O resultado obtido pelo método de agrupamento UPGMA com os 35 indivíduos de E. fusca, utilizando ponto de corte (0,199 – 80%) estabelecido pelo procedimento de Mojena (1977), permitiu a formação de seis grupos (Figura 4).

Figura 4. Dendrograma obtido pelo método UPGMA e complemento aritmético índice de Jaccard como medida de dissimilaridade, em 35 indivíduos de Eritrina fusca com base em marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats).

O grupo I (GI) foi o mais representativo composto por quinze dos trinta e cinco indivíduos avaliados, o grupo II (GII) foi composto por quatorze indivíduos neste grupo foram alocados os dois genótipos mais similares (3 e 4), porém a formação de subgrupos no GI e no GII indica que há diversidade genética dentro dos grupos (Figura 4). O grupo III (GIII) e o grupo IV (GIV) foram compostos por dois indivíduos (18 e 25, 29 e 33, respectivamente). Os grupos V (GV) e VI (GVI) foram os mais divergentes alocando apenas um indivíduo em cada grupo (2 e 9, respectivamente) (Figura 4). A análise de agrupamento gerado pelo método de Tocher (Tabela 4) propiciou a formação de doze grupos distintos, sendo que o grupo I foi o mais representativo, composto por 42,85% dos indivíduos avaliados. O grupo II foi composto por 20% dos indivíduos avaliados, enquanto os grupos III, IV e V foram compostos por 5,71 % cada um. Os demais grupos (VI, VII, VIII, IX, X, XI e XII) foram constituídos por apenas um genótipo cada um (2,86%). Segundo Elias et al (2007), o método de Tocher tem como princípio manter a homogeneidade dentro dos grupos e a heterogeneidade entre os grupos. Sendo assim os grupos VI, VII, VIII, IX, X, XI e XII são os que apresentaram maior diversidade genética, posto que cada grupo foi formado por apenas um indivíduo. Os dois últimos grupos foram compostos pelos indivíduos 9 e 2 respectivamente, esses dois acessos também ficaram alocados separadamente no dendrograma obtido pelo método UPGMA (Figura 4). A concordância entre esses dois métodos sugere que estes sejam os indivíduos mais divergentes do total analisado, podendo ser indicados para futuros trabalhos que visem a conservação dos recursos genéticos intraespecíficos, composição de bancos de germoplasma e programas de pré- melhoramento.

Tabela 4. Agrupamento pelo método de Tocher, baseado na matriz de dissimilaridade de Jaccard a partir da análise molecular por meio dos marcadores ISSR dos 35 indivíduos de Erythrina fusca. Grupos Indivíduos % de indivíduos

I 3, 4, 17, 15, 1, 21, 22, 32, 35, 27,23, 11, 31, 30, 24 42,85 II 7, 10, 14, 12, 13, 6, 16 20 III 20, 25 5,71 IV 29, 33 5,71 V 19, 28 5,71 VI 34 2,86 VII 26 2,86 VIII 18 2,86 IX 8 2,86 X 5 2,86 XI 9 2,86 XII 2 2,86

Total 35 100%

A análise bayesiana realizada no programa Structure para determinar a estrutura genética de acordo com o método ΔK descrito por Evanno et al. (2005) indicou a formação de três grupos (K=3). O grupo I reuniu seis indivíduos, o grupo II reuniu quatorze indivíduos e o grupo III quinze indivíduos (Figura 5A). Diferente dos resultados do UPGMA (Figura 4) e do Método de Tocher (Tabela 4) que indicaram um número maior de grupos. Melo et al. (2015) também obteve a formação de 3 grupos pela analise bayesiana, estudando 37 indivíduos de E. velutina com 11 primers.

Figura 5. Relação dos agrupamentos obtidos pela análise bayesiana e pelo método hierárquico UPGMA. (A) Agrupamento utilizando a análise bayesiana (K=3). (B) Dendrograma de dissimilaridade genética obtido pelo método UPGMA.

Ao analisar conjuntamente as informações entre o agrupamento UPGMA e a Análise Bayesiana (Structure) (Figura 5), observa-se uma concordância nos agrupamentos entre os dois métodos, em que os grupos II e III do Structure reuniram o maior número de indivíduos e foram compostos pelos mesmos indivíduos do grupo I (GI) e grupo II (GII) do UPGMA. No Grupo I da análise Bayesiana, ficaram alocados os demais indivíduos de E. fusca, correspondendo aos grupos GIII, GIV, GV e GVI do UPGMA. O agrupamento do Structure (Figura 5A) e o Método Hierárquico UPGMA (Figura 5B) não refletiram uma estrutura geográfica em relação à diversidade genética (Figuras 4 e 5-A). Observa-se que os indivíduos mais distantes 77 geneticamente (2 e 28) não estão geograficamente tão distantes (Figura 3). Enquanto que os indivíduos mais distantes geograficamente (29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35) coletados na margem do rio Jauru compartilham material genético com os indivíduos da Estação Ecológica Taiamã. Parini e Raposo (2010) revelam que as aves das famílias Psittacidae, Trochilidae, Coerebidae, Thraupidae e Icteridae atuam como potenciais polinizadores de E. fusca no Pantanal, apresentando comportamento não destrutivos em suas visitas. Essa similaridade entre indivíduos geograficamente distantes pode estar relacionada com o fato da polinização da E. fusca ser realizada por aves. Segundo Parini e Raposo (2010) as aves das famílias Psittacidae, Trochilidae, Coerebidae, Thraupidae e Icteridae atuam como potenciais polinizadores de E. fusca no Pantanal. Estas aves possuem voos de longa distância, e se deslocam com maior frequência entre diferentes indivíduos, o que acaba promovendo fluxo polínico (Leite e Machado, 2009) e consequentemente fluxo gênico entre os indivíduos. Segundo Orwa et al. (2009), as sementes de E. fusca flutuam na água podendo ser facilmente dispersas pelas correntes aquáticas, sendo assim a dinâmica entre o rio Jauru e o rio Paraguai também pode estar auxiliando na dispersão das sementes. Estudos realizados por Furlan et al. (2017) sobre a dieta de peixes na Estação Ecologica taiamã revela a presença de sementes inteiras de E. fusca no trato digestório de peixes das espécies Piaractus mesopotamicus e Brycon hilarii, o que indica a possibilidade de dispersão das sementes de E. fusca também estar sendo influenciada pelas espécies íctias. Segundo Coles e Foweler (1976) espécie que apresentam alta diversidade dentro das populações e baixa diversidade genética entre as populações possui fluxo gênico de longa distância, se, contudo o fluxo de genes for limitado e a troca gênica entre arvores vizinhas for comum, pode ocorrer alta proporção de endogamia dentro das populações e alta diversidade entre as populações. Dessa forma podemos concluir que há fluxo gênico de longa distância entre os 35 indivíduos de E. fusca analisados, uma vez que a maior diversidade genética está dentro dos grupos e, portanto, pode-se afirmar que a Estação Ecologica Taiamã salvaguarda a diversidade genética da espécie, e que sua manutenção é essencial para para a sobrevivência da mesma.

A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) distribuiu os indivíduos em dois grupos, não corroborando com a analise bayesiana. Os dois primeiros eixos explicam 26,71% da variação total, com a primeira coordenada (Coord.1) e a segunda coordenada (Coord.2) representando 15,57 e 11,14% da variação total, respectivamente (Figura 6).

Figura 6. Dispersão gráfica a partir da análise das coordenadas principais dos 35 indivíduos de Erythrina fusca coletados na região do pantanal, Cáceres, MT.

O índice de diversidade genética de Nei (He) total para os três grupos formados pela análise Bayesiana, foi de 0,16, com o número de alelos observados (Na) de 1,58, e os alelos efetivos (Ne) de 1,25. O índice de Shannon (I) atingiu o valor de 0,25 e a porcentagem de polimorfismo foi de 58,11 (Tabela 5). Os valores encontrados para o He e o I são indicativos de que há diversidade genética dentro da população.

Tabela 5. Número de indivíduos (N) e parâmetros genéticos para os três grupos (K = 3), conforme determinado pelo Structure para os 35 indivíduos de Eritrina fusca. Parâmetros Grupo I Grupo II Grupo III Total N 6 14 15 35 Na 1,40 (0,49) 1, 36 (0,48) 1,39 (0,49) 1,58 (0,50) Ne 1,27 (0,36) 1,22 (0,36) 1,16 (0,28) 1,25 (0,30) He 0,15 (0,20) 0,12 (0,19) 0,10 (0,16) 0,16 (0,17) I 0,23 (0,29) 0,18 (0,27) 0,16 (0,24) 0,25 (0,25) %P 40,54 36,49 39,19 58,11 N: Número de indivíduos; Na: Número de alelos observados; Ne: Número de alelos efetivos; He: Distância genética de Nei; I: Índice de diversidade de Shannon e %P: Percentual de locos polimórficos. Os números entre parênteses representam o desvio-padrão.

O maior índice de diversidade genética de Nei (He) e de Shannon (I) foi encontrado para o Grupo I (0,15 e 0,23, respectivamente) (Tabela 5). Mesmo possuindo o menor número indivíduos, este grupo também apresentou os maiores valores de Na (1,40), Ne (1,27) e %P (40,54%). Soares (2016) também observou altos valores de parâmetros genéticos no grupo menos representativo em estudos com Hancornia speciosa (mangaba). A análise de variância molecular (AMOVA) revelou que a maior parte da variação genética está dentro dos grupos (83%) (Tabela 6). A distribuição da diversidade genética pode ser influenciada por vários traços da história e com o sistema de reprodução das espécies (Nybom e Bartish, 2000). Conforme Hamrick e Godt (1996) as espécies alógamas possuem alta diversidade genética dentro da população e baixa diversidade entre as populações. Dessa forma, este resultado era esperado para a espécie, uma vez que a E. fusca é xenogâmica obrigatória e apresenta auto-incompatibilidade.

Tabela 6. Análise de Variância Molecular (AMOVA) dos três grupos (k= 3), conforme determinado por análise bayesiana para os 35 indivíduos de Erythrina fusca, com uso de dez (10) primers ISSR. Fonte de variação GL SQ CV VT (%) Fst P Entre grupos 2 44,224 1,390 17 0,169 0,001 Dentro dos grupos 32 219,519 6,860 83 Total 34 263,743 8,250 100 Componente de Variância (CV), Variância Total (VT) e Probabilidades de ter um componente de variância maior que os valores observados ao acaso (P).

Segundo Ferreira e Valera (1987) o estabelecimento de áreas de conservação in situ nas florestas tropicais é muito difícil devido a sua grande diversidade e à ausência de estudos para se estabelecer bases sólidas. O conhecimento sobre a diversidade genética permite compreender melhor processos adaptação, evolução das espécies, principalmente sobre mudanças ambientais e doenças (Neto, 2004). Desta forma o conhecimento da diversidade genética de E. fusca pode auxiliar no manejo e implementação estratégias de conservação não apenas in situ mas também ex situ dado que a conservação ex situ deve ser vista como uma ferramenta complementar das estratégias in situ (IUDZG, 1993).

CONCLUSÕES

Os 35 indivíduos de Erythrina fusca coletados na região do Pantanal do estado do Mato Grosso apresentam diversidade genética e são fontes promissoras de recursos genéticos que podem ser selecionados, para uso em programas de melhoramento e projetos de restauração florestal. A maior parte da diversidade genética encontrada está dentro dos grupos, evidenciando que há um fluxo gênico entre indivíduos mais distantes geograficamente e que o intercâmbio de material genético entre os indivíduos mais distantes pode estar sendo realizado por meio da polinização efetuada pelas aves ou por meio das sementes transportadas pelo rio Jauru e Paraguai. Ou ainda, por de espécies íctias.

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5. CONCLUSÕES GERAIS

Os extratos aquosos do tipo infuso da raiz e da casca do caule de E. fusca apresenta efeito citotóxico, inibindo a divisão celular do meristema apical de Allium cepa na maioria das concentrações, sendo que o extrato da casca do caule apresentou maior citotoxicidade, e a metodologia de obtenção de extrato menos recomendada para uso fitoterápico. O extrato aquoso do tipo decocto apresentou efeito citotóxico apenas quando obtido da casca do caule de E. fusca, estimulando o crescimento das raízes de Allium cepa em comparação ao controle. Todos os extratos utilizados apresentaram potencial genotóxico, sugerindo maior cautela, da população, quanto a forma de preparo do chá de E. fusca para fins medicinais, uma vez que todas as concentrações avaliadas apresentaram alterações no IM de A. cepa e ou presença de células anormais. A espécie E. fusca apresenta sistema reprodutivo do tipo xenogâmico obrigatório, alta taxa de viabilidade polínica, índice meiótico regular. Possui amido e lipídio como substância de reserva nos grãos de pólen. Os marcadores moleculares ISSRs foram eficientes para análise de diversidade genética entre os 35 indivíduos de Erythrina fusca coletados na região do Pantanal do estado do Mato Grosso, sendo estes fontes promissoras de recursos genéticos que podem ser selecionados para o uso em programas de melhoramento e projetos de restauração florestal. A maior parte da diversidade genética encontrada está dentro dos grupos, evidenciando que há um fluxo gênico entre indivíduos mais distantes geograficamente e que o intercâmbio de material genético entre os indivíduos mais distantes pode realizar-se por meio da polinização efetuada pelas aves ou por meio das sementes transportadas pelo rio Jauru e Paraguai ou por meio de espécies ictias. A diversidade genética encontrada neste estudo indica que a espécie E. fusca tem grandes chance para se adaptar a mudanças ambientais que possam ocorrer, garantindo desta forma, a manutenção das futuras gerações. Os resultados deste estudo podem contribuir para as estratégias de conservação in vitro e compor uma coleção de trabalho afim de facilitar os estudos de pré-melhoramento de genótipos de E. fusca. 87