2019 Tese Irpinto.Pdf

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

ISABELA RIBEIRO PINTO

EFICÁCIA DE UM FLAVONOIDE (FISETINIDOL) OBTIDO DO CAULE DE Bauhinia pulchella E SEU DERIVADO SEMI-SINTÉTICO (PALMITATO DE FISETINIDOL) EM UM ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE PERIODONTITE EM RATAS

SOBRAL 2019

ISABELA RIBEIRO PINTO

EFICÁCIA DE UM FLAVONOIDE (FISETINIDOL) OBTIDO DO CAULE DE Bauhinia pulchella E SEU DERIVADO SEMI-SINTÉTICO (PALMITATO DE FISETINIDOL) EM UM ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE PERIODONTITE EM RATAS

Tese de Doutorado submetida à avaliação da banca examinadora do Curso de Doutorado em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia da Universidade Federal do Ceará como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia em Saúde.

Orientadora: Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra Brayner.

Co-orientadora: Profa. Dra. Hellíada Vasconcelos Chaves.

SOBRAL 2019

ISABELA RIBEIRO PINTO

EFICÁCIA DE UM FLAVONOIDE (FISETINIDOL) OBTIDO DO CAULE DE Bauhinia pulchella E SEU DERIVADO SEMI-SINTÉTICO (PALMITATO DE FISETINIDOL) EM UM ENSAIO PRÉ-CLÍNICO DE PERIODONTITE EM RATAS

Tese de Doutorado submetida à avaliação da banca examinadora do Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia da Universidade Federal do Ceará como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia em Saúde. Aprovada em: 15/02/2019. BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Mirna Marques Bezerra Brayner Orientadora Universidade Federal do Ceará (UFC)

Profa. Dra. Hellíada Vasconcelos Chaves Co-orientadora Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dr. José Roberto Viana Silva Examinador Universidade Federal do Ceará (UFC/RENORBIO)

Profa. Dra. Francisca Clea Florenço de Sousa Examinador Universidade Federal do Ceará (UFC/RENORBIO)

Prof. Dra. Ana Liza Paz Souza Batista Examinador Universidade Federal do Ceará (UFC)

Prof. Dr. Vicente de Paulo Teixeira Pinto Examinador Universidade Federal do Ceará (UFC)

Ao meu irmão, Henrique Daniel (in memoriam), por todo incentivo, o meu amor e minha eterna gratidão.

AGRADECIMENTOS

À Deus, com Sua graça, a cada instante está olhando pra minha vida e cuidando de mim, de forma pessoal e amorosa. Posso sentir isso através de tudo que tem me proporcionado. Até nas coisas que não encontrei, Deus permitiu que eu me transformasse. Aos meus pais, Vilany e Cícero, pela presença perto de mim e pelo esforço constante para o alcance dos meus sonhos. Aos meus irmãos, Henrique (in memoriam) e Ismael, pelo apoio. Não há amor maior que esse. Às minhas orientadoras, Profa. Mirna e Profa. Hellíada, pelas inúmeras experiências compartilhadas que me guiaram pelos caminhos da pesquisa científica, por compartilhar seus conhecimentos e experiências acadêmicas. Por terem me fortalecido quando as dúvidas desse trabalho e as incertezas me deixavam menos confiante e quando o resultado do projeto “Doutorado Sanduíche” não foi como esperado. A frase “A virtude está no meio” pode ser perfeitamente aplicada à essa união (Profa. Mirna e Profa. Hellíada). É precioso ter uma orientação guiada sob a bondade e a paciência. Aos professores, José Roberto, Ana Liza e Hellíada Chaves, pelas valiosas contribuições durante o exame de qualificação, que direcionaram os caminhos na reta final desta pesquisa. Aos professores que gentilmente aceitaram compor a Banca Examinadora: Profa. Clea, Profa Ana Liza, Prof. Vicente e Prof. José Roberto. À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), que me concedeu a bolsa de estudos e propiciou as condições de permanência e conclusão do curso de doutorado e as Instituições de fomento, que possibilitaram o desenvolvimento desse trabalho. Uma palavra de agradecimento à Universidade Federal do Ceará e à Faculdade de Medicina/Sobral-UFC. São mais de 10 anos (graduação até aqui) construindo uma relação de pesquisa, amor e respeito pela universidade e por tudo que a UFC alcança. Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (RENORBIO/UFC) e ao coordenador vigente, Prof. Ivanildo, pela atenção dispensada em diversos momentos durante o doutorado. Ao Laboratório de Síntese Química, coordenado pela profa. Gilvandete Santiago, pela colaboração com o trabalho. Ao prof. Marcos Reinaldo, pela atenção e disponibilidade. Ao NEMPI e NPDM pelo suporte na realização de metodologias empregadas na pesquisa.

Um agradecimento aos integrantes do Laboratório de Farmacologia (LAFS/UFC - Sobral). Foram inúmeras experiências compartilhadas entre aqueles que passaram ou ainda permanecem no laboratório, aprendizados nas rodas de conversa e grupos de estudo, amizades foram construídas, descoberta de afinidades, almoços divertidos, boas conversas e surpresas de amor. Cada integrante do LAFS está guardado no meu coração. Em especial, agradeço aos alunos de Iniciação Científica: Andressa (me acompanha desde o mestrado), Arielle, Pedro Ivo, Renato Daniel, Dayane e Sebastian, que tiverem um comprometimento com o trabalho de uma forma admirável. Nossos experimentos, mesmo nos finais de semana, eram leves, produtivos, havia muita dedicação e sempre era finalizado com uma boa música, cantada por nós mesmos. Pra mim, esses momentos me faziam agradecer mais ainda por fazer parte dessa equipe e reforçar o que eu acredito, ciência e amor! Não posso deixar de agradecer à técnica do LAFS, Nayara, pela ajuda nos experimentos, pela companhia diária, pelos convites que eu fazia e nunca eram recusados, pela positividade e pelo cuidado e zelo com o nosso laboratório. Com certeza, o desenvolvimento desse trabalho tornou-se melhor com o seu trabalho. À amiga que encontrei através da UFC-Sobral, Jordânia. É preciso ter sempre “um” alguém nos lugares que vá, alguém que lhe acolha quando os dias não estão bem e os desafios parecem ser do tamanho de uma montanha, e o melhor de tudo, quando não puder oferecer nada, oferece uma oração. Que sorte que encontrei esse alguém em Sobral. Ao amigo, Anderson Weiny, pelos encontros cheios de alegria e a disponibilidade em sempre ajudar. Os melhores momentos durante os quatro anos do doutorado, lembro-me da presença do Anderson ao meu lado. Aos amigos Jackson, Luana, Taiã e Lais, por compartilhar boas experiências e reflexões profissionais e pessoais. Ao Johnathan, por se importar com meus propósitos e me ajudar, de uma forma tão gentil e carinhosa. Às cobras, Auri, Vívian, Raquell, Priscila, Milena e Naty, pelos conselhos ditos com carinho, pelo incentivo quanto ao crescimento pessoal e pelo valor que dão à tudo que está relacionado à mim. À Ellen e Lilly, pelo convívio familiar que me proporcionaram durante os quatro anos do doutorado. Aos familiares, tios e primos, por compreenderem minha ausência. Às amigas de infância Débora, Samara, Livia, Alana, Priscila, Kássia, por torcerem pelos meus sonhos e incentivarem minhas decisões.

Aos professores da FIED e à Instituição, por colaborar com momentos que despertam mais ainda o meu amor pela docência e me ensinarem valores que levarei ao longo da construção dessa caminhada. Aos meus alunos, por permitirem que nossos papéis se invertam, e eles se colocam como alguém que me ensina sobre o respeito, a desafiar limitações e a compreender experiências individuais. Muito obrigada!

“Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu.” Eclesiastes 3:1 Tenha fé!

RESUMO

A periodontite é uma doença inflamatória que culmina na perda dentária. Sua patogênese envolve a presença de bactérias e a resposta imune/inflamatória do hospedeiro, cuja interação pode determinar a geração de citocinas, óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio. Muitas espécies do gênero Bauhinia são utilizadas na medicina popular em virtude de suas atividades anti-inflamatórias, analgésicas e antioxidantes. Vários compostos foram isoladas de espécies de Bauhinia. Fisetinidol, um flavonoide da classe das flavan-3-ol, é um metabólito secundário obtido a partir do extrato etanólico do caule de Bauhinia pulchella. A partir do Fisetinidol, foi sintetizado pelo nosso grupo de pesquisa um derivado semi-sintético, Palmitato de Fisetinidol. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do Fisetinidol e Palmitato de Fisetinidol em um modelo de periodontite em ratas Wistar. A periodontite foi induzida por meio de um fio de nylon 3.0 em torno dos segundos molares superiores esquerdos, e os animais foram tratados (via oral) uma vez ao dia durante 11 dias com Fisetinidol (0,0001 ou 0,001 mg/kg) ou Palmitato de Fisetinidol (0,01 ou 0,1 mg/kg), ou veículo (salina). Aos 11 dias, os animais foram eutanasiados, sob anestesia, e as maxilas removidas para análise morfométrica através do software ImageJ®. O tecido gengival foi coletado para quantificação dos níveis de IL-1β, IL-8/CINC-1, atividade mieloperoxidase (MPO) (ELISA); superóxido dismutase (SOS), catalase (CAT) e Nitrito/Nitrato (ensaio espectrofotométrico); e análise da expressão gênica (qRT-PCR) de IL-1β, IL-6, RANK, RANK-L e OPG. Ainda, amostras de sangue periférico foram coletadas para dosagem de fosfatase alcalina óssea, transaminases e creatinina. Para análise estatística, os dados paramétricos analisados por ANOVA seguido por Tukey ou Games-Howell, enquanto que os dados não paramétricos foram expressos como mediana e avaliados pelo teste Kruskall-Wallis seguido do teste de Dunn’s (p<0,05). Os resultados mostraram que o Fisetinidol (0,0001 ou 0,001 mg/kg) e Palmitato de Fisetinidol (0,1 mg/kg) reduziram (p<0,05) a perda óssea alveolar. O Palmitato de Fisetinidol (0,1 mg/kg) diminuiu os níveis de IL1-β e IL-8/CINC-1, nitrito/nitrato, e aumentou atividade de SOD e CAT. Ainda, o Palmitato de Fisetinidol reduziu a expressão gênica de IL-6 e RANK e aumentou de OPG. Não houve diferença estatística (p>0,05) entre os grupos quanto aos níveis de TGO, TGP, e FAT. Estes resultados demonstram que Fisetinidol e Palmitato de Fisetinidol reduzem a reabsorção óssea alveolar em ensaio pré-clínico de periodontite, e que o provável mecanismo de ação do Palmitato de Fisetinidol ocorre através da redução de mediadores inflamatórios e do estresse oxidativo. Palavras-chave: Periodontite. Flavonoide. Reabsorção óssea. Estresse oxidativo. Citocinas.

ABSTRACT

Periodontitis is a inflammatory disease that culminates in tooth loss. Its pathogenesis of periodontitis involves the presence of bacteria and the immune/inflammatory host response, whose interaction may determine the generation of inflammatory mediators, including cytokines, nitric oxide and reactive oxygen species. Many species of the Bauhinia genus are used in folk medicine because of their anti-inflammatory activities anti-inflammatory, analgesic and antioxidant. Several classes of compounds have been isolated from Bauhinia species, especially flavonoids. Fisetinidol, flavonoid of the class of flavan-3-ol, is a secondary metabolite obtained from the stem of the ethanolic extract of Bauhinia pulchella. From Fisetinidol, a semi-synthetic derivative, (-)-fisetinidol palmitate, was synthesized by our research group. Therefore, the aim of this study are to evaluate the efficacy of Fisetinidol and (-)-fisetinidol palmitate in a model of periodontitis in Wistar rats. Periodontitis were induced in Wistar rats by placing a nylon thread ligature around second upper left molars and treated (per os) once a day during 11 days with Fisetinidol (0,0001 or 0,001 mg/kg) or (-)-fisetinidol palmitate (0,01 or 0,1 mg/kg) or vehicle (saline). At the 11th day, the animals were terminally anesthetized and the maxillae were excised for morphometric analysis using ImageJ® software. The gingival tissue were collected to quantify the IL-1β, IL-8/CINC-1 levels (ELISA); superoxide dismutase, catalase, nitrite/nitrate (spectrophotometric assay); and analysis of genetic expression IL-6, RANK, and OPG (qRT-PCR). Also, samples from peripheral blood samples were collected to evaluate bone-specific alkaline phosphatase, and transaminases and creatininae dosages. The parametric data were analyzed by (ANOVA) and Tukey or Games-Howell. For non-parametric data, the results were expressed in median and evaluated by the Kruskall-Wallis test followed by the Dunn's test (p <0.05). Fisetinidol (0.0001 or 0.001 mg/kg) and (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) significantly reduced alveolar bone loss. (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) decreased IL1-β and IL-8 / CINC-1, nitrite/nitrate levels and increased SOD and CAT activity. It was also able to reduce the gene expression of IL-6, RANK and increased the expression of OPG. Statistical differences (p> 0.05) were not observed in the ALT, AST and FAT between the groups. These results suggest that Fisetinidol and (-)-fisetinidol palmitate reduced alveolar bone resorption in a pre-clinical periodontitis assay, and that the likely mechanism of action of (-)-fisetinidol palmitate occurs through the reduction of inflammatory mediators and oxidative stress.

Keywords: Periodontitis. Flavonoids. Bone resorption. Oxidative Stress. Cytokines.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CAT Catalase DNA Ácido desoxirribonucleico ERO Espécies reativas de oxigênio GSH Glutationa reduzida GSH Px Glutationaperoxidase

H2O2 Peróxido de hidrogênio IL-10 Interleucina 10 IL-1β Interleucina 1 beta IL-6 Interleucina 6 IL-8 Interleucina 8 iNOS Óxido nítrico sintase induzível LPS Lipopolissacarídeo M-CSF fator estimulador de colônia de macrófago MMP Metaloproteinase de matriz MPO Mieloperoxidase mRNA Ácido ribonucleico mensageiro NF-kB Fator nuclear kapa B NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintase - O2 Ânion superóxido OH- Radical hidroxila OPG Osteoprotegerina

PGE2 Prostaglandina E2 PTH Hormônio da Paratireoide RANK Receptor ativador do fator nuclear kapa B RANKL Ligante do receptor do fator nuclear kapa B SOD Superóxido dismutase TIMP Inibidor tecidual de metaloproteinase TNF - α Fator de Necrose Tumoral alfa

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA...... 14 2.1 Periodontite ...... 14 2.1.1 Perda óssea alveolar na Periodontite e aspectos imunológicos...... 17 2.1.2 Periodontite e as citocinas ...... 20 2.1.3 Periodontite e o Estresse oxidativo...... 22 2.1.4 Periodontite e o Óxido Nítrico...... 22 2.2 Periodontite experimental em ratos...... 23 2.3 Utilização de produtos naturais pelas comunidades...... 25 2.3.1 Família Fabaceae...... 26 2.3.2 Gênero Bauhinia...... 27 2.3.3 Bauhinia pulchella Benth...... 28 3 JUSTIFICATIVA...... 31 4 HIPÓTESE...... 34 5 OBJETIVOS...... 35 5.1 Objetivo Geral...... 35 5.2 Objetivo Específicos...... 35 6 CAPÍTULO I-PATENTE...... 36 7 CAPÍTULO II-ARTIGO...... 69 8 CONCLUSÃO...... 91 REFERÊNCIAS...... 92 ANEXO A- DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DO PROJETO “EFEITO DO FLAVONOIDE FISETINIDOL OBTIDO DE Bauhinia pulchella (Fabacae) E DE UM DERIVADO SEMI-SINTÉTICO OBTIDO A PARTIR DA BIOTRANSFORMAÇÃO DO FISETINIDOL NO MODELO EXPERIMENTAL DE PERIODONTITE EM RATAS: ANÁLISE DO ENVOLVIMENTO DE CITOCINAS, ÓXIDO NÍTRICO E METALOPROTEINASES DE MATRIZ” PELA CEUA...... 103

1 INTRODUÇÃO

A periodontite é uma doença inflamatória crônica multifatorial resultante da perturbação da homeostase entre a microbiota subgengival e as defesas do hospedeiro. É caracterizada por infiltração de leucócitos, perda de tecido conjuntivo, reabsorção de osso alveolar e formação de bolsa periodontal, com a consequente destruição dos tecidos de suporte dos dentes e alterações potencialmente irreversíveis, representando um grave problema de saúde pública, sendo a segunda principal causa de perda de dentes em adultos (ARAUJO et al., 2007; SANZ e VAN WINKELHOFF 2011). Apresenta-se como um fator de risco significante para as doenças cardiovasculares (aterosclerose, dislipidemia), cerebrovasculares e indução do parto prematuro (GUARIGUATA, 2014; PIHLSTROM et al., 2005). A periodontite também influencia no controle metabólico e aumento de complicações diabéticas (LALLA, 2011). No que se refere aos indicadores socioeconômicos, a renda e escolaridade, apresentam uma importante associação com a doença periodontal, já que os indivíduos com baixo nível socioeconômico têm uma maior ocorrência de perda de inserção, de profundidade de sondagem, de sangramento gengival e de quantidade de biofilme dental. Assim, tais fatores são influenciados diretamente pela ausência de hábitos de higiene bucal, de recursos para financiar tratamentos minimamente eficazes para essa população ou de instrução para a busca por atendimento público (OPPERMANN, 2015; SCHUCH et al., 2015; BOING et al, 2005; PION et al., 2006; ARAÚJO, SUKEKAVA, 2007; BARBOSA et al 2009). Os problemas bucais, como a perda dentária, têm afetado a qualidade de vida das pessoas, portanto, têm grande impacto tanto no aspecto biológico (mastigação) quanto no psicossocial, através da auto-estima, aceitação social, comunicação e desfiguração facial (EKE , 2012; GIFT; REDFORD, 1992). Um crescente grupo de pesquisas sugere que a patogênese da periodontite envolve a presença de bactérias (biofilme oral), fatores ambientais e a resposta imune/inflamatória do hospedeiro (TOMINARI et al., 2012; SLOTS, 2013; HUANG et al. ,2016). A interação entre esses eventos leva à geração de mediadores pró-inflamatórios, como citocinas (TNF-α, IL-6, IL-1β), prostaglandinas, óxido nítrico e produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) que são responsáveis pela amplificação e manutenção da resposta inflamatória, levando, em última instância, à destruição do osso alveolar (ARAÚJO et al.,2013; HATIPOGLU et al, 2015; ANBINDER et al., 2016).

A terapia mecânica e os procedimentos cirúrgicos têm sido utilizados para tratar a periodontite (WANG et al., 2014). No entanto, podem ser necessárias terapias adjuntas, como o uso de antibióticos e anti-inflamatórios não esteroidais. Contudo, a principal desvantagem desses agentes é o desenvolvimento de resistência bacteriana e toxicidade gástrica/renal. Na tentativa de superar essas limitações, a procura de novos agentes quimioterapêuticos mais seguros continua. Os fitoquímicos isolados das plantas são considerados boas alternativas aos produtos químicos sintéticos (HALA et al.,2015; ALVIANO e ALVIANO, 2009; CHANDRA et al., 2015; RAMESH et al., 2016). Muitas espécies do gênero Bauhinia têm sido largamente utilizadas na medicina popular para tratamento de diabetes (TROJAN-RODRIGUES et al.,2002). As plantas deste gênero pantropical demonstraram possuir várias atividades biológicas, como analgésicos, antipiréticos, anti-inflamatórios (ZAKARIA et al.,2016; GUPTA et al.,2005), antimaláricos (MOHAMED et al., 2009; BOONPHONG et al.,2007), antimicrobianos e antioxidante (PANDEY et al.,2015; MISHRA et al., 2013; AHMED et al., 2012; JAIN et al., 2008). Várias classes de compostos foram isoladas de espécies de Bauhinia, incluindo bibenzilos, esteroides, triterpenoids derivados de oxepina, alcaloides (MAIA NETO et al.,2008), cianoglucósidos (SILVA et al.,2013) e especialmente flavonoides (CECHINEL FILHO, 2009). Flavanas-3-ol, também conhecido como fisetinidol, fazem parte do complexo grupo da subclasse dos flavonoides (MENA et al., 2014). Os benefícios dos compostos contendo bioativos, como fisetinidol, têm sido avaliados pela capacidade de reduzir os efeitos apresentados em processos inflamatórios (MONAGAS et al.,2010). A grande biodiversidade de produtos naturais permite com maior frequência o isolamento e identificação de compostos bioativos e tais metabólitos podem ser utilizados na síntese de novos fármacos. Além disso, estudos pré-clínicos e clínicos que apontem a abordagem fisiopatológica da periodontite e a utilização de fitofármacos, como também, a eficácia e os benefícios dessa terapêutica, ainda são insuficientes (ARA et al., 2018). Neste sentido, este estudo se propõe a investigar a eficácia e segurança do Fisetinidol e Palmitato de Fisetinidol em um modelo de periodontite em ratas.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Periodontite As doenças periodontais exibem uma considerável prevalência na população mundial e no Brasil e essa condição inflamatória pode ser reversível, a depender do estágio ou diagnóstico da doença. A gengivite é uma inflamação na gengiva marginal, sendo uma situação reversível, uma forma leve da doença periodontal e derivada da presença de microrganismos patogênicos, que culminam no aumento do fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular, assim como, na presença de leucócitos polimorfonucleares no tecido conjuntivo do periodonto (ORUBA 2017; BOTTURA 2011). No momento em que a inflamação alcança os tecidos de suporte do dente e é constatada perda de inserção do periodonto, destruição do colágeno, formação de bolsa periodontal, evidencia-se a periodontite (SOCRANSKY et al., 1984; ALBANDAR, 1990; SLOTS 2013; WINNING et al., 2015). É uma doença infecto-inflamatória, de alta prevalência, presente em torno de 90% da população mundial (KAYAL, 2013; PETERSEN,2012) e no Brasil a prevalência é de 79% (ARAÚJO e SUKEKAVA, 2007), sendo considerada a segunda principal causa de perda dentária (KAYAL, 2013). Tratando-se das alterações no sistema estomatogmático, tais como, mastigação, crescimento e desenvolvimento, deglutição e fonação, a periodontite pode levar ao desequilíbro desse sistema e afetar a qualidade de vida do indivíduo (CHENG , 2017). Como também, além de afetar as estruturas períodontais, o início e a progressão da periodontite está associada com distúrbios sistêmicas como: doenças cardiovasculares (WANG, 2019; TONETTI, 2017; ROMANDINI et al., 2018), diabetes (LALLA , 2011; TABOR et al., 2002), indução de partos prematuros (MCCUAIG et al., 2018) e doenças reumáticas (CHENG , 2017; NAZIR, 2017). A etiologia da periodontite é complexa e multifatorial, assumindo grande destaque o desequilíbrio do biofilme dental que estimula o processo imunoinflamatório do hospedeiro, culminando na destruição do tecido ósseo (DARVEAU, 2010; KINANE et al., 2017). A higiene oral inadequada gera um aumento da quantidade de microrganismos no biofilme e modificações no sistema ecológico local, promovendo o aparecimento de novas espécies de bactérias, fungos e vírus. Além das alterações das bactérias do microambiente bucal durante a instalação da doença, predominantemente gram-negativa, anaeróbica e proteolítica, sendo antes gram-positivas, facultativas e sacarolíticas (LOPEZ-PIRIZ, 2007), a evolução da

periodontite também pode estar associada à condições ambientais, como nível socioeconômico e susceptibilidade genética (Figura 1) (KINNEY, 2007). Figura 1 - Fisiopatologia da periodontite.

Fonte: Adaptado de KOMINE-AIZAWA et al., 2018.

O envolvimento de espécies bacterianas Porphyromonas gingivalis (KAJIYA, M. et al., 2010), Treponema denticola, Tannerella forsythia, Campylo bacterrectus, Eubacterium nodatum, Prevotella spp., Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius e Fusobacterium nucleatum (MENEZES et al., 2005) está relacionado com o desenvolvimento da periodontite. Assim, estudos apontam que a presença dessas bactérias estão envolvidas com a disbiose da microbiota oral, causando o aumento da perda de inserção e da profundidade da bolsa periodontal (AMALIYA et al., 2015). De fato, apesar do envolvimento de bactérias na etiopatologia da doença, a resposta imune-inflamatória e a susceptibilidade do hospedeiro determinarão a progressão da periodontite. Assim, o edema gengival, a infiltração de leucócitos e a liberação de mediadores inflamatórios como citocinas e espécies reativas do oxigênio (EROs) são processos que levarão à formação de bolsas periodontais, dano tecidual e reabsorção óssea (MENEZES et al., 2005; TEIXEIRA et al., 2017). A primeira resposta no combate às bactérias patogênicas do periodonto é formada pelos neutrófilos poliformonucleares. Em seguida, os macrófagos e linfócitos alcançam o local da infecção, detectam e fagocitam o microrganismo invasor, liberando substâncias inflamatórias e antibacterianas, tais como lisozima, lactoferrina, fosfatase alcalina, mieloperoxidase (MPO) e espécies reativas de oxigênio (MIYASAKI; NEMIROVSKIY, 1997; BASCONES-MARTÍNEZ et al., 2009). Contudo, com a insistência do estímulo inflamatório, ocorre a amplificação e perpetuação da resposta inflamatória e a destruição tecidual. Outros elementos, como célula de Langerhans, participam do processo de defesa contra agentes infecciosos. Tal célula migra para o tecido linfoide regional a fim de realizar a apresentação aos linfócitos, iniciando o desenvolvimento de imunidade específica protetora (Figura 2) (BENAKANAKERE et al., 2012). Quando os linfócitos alcançam o local da inflamação, as células B se transformam em células plasmáticas produtoras de anticorpos. A população das células T estão relacionadas com a destruição óssea na doença periodontal ao promoverem a diferenciação das células em Th1 e Th2. Desta forma, é fundamental o entendimento de que células Th1 e Th2 são importantes na resposta do hospedeiro e podem ter consequências no desenvolvimento e/ou progressão da doença periodontal (KAWAI et al., 2006). A resposta Th1 levará à produção de citocinas inflamatórias (TGF-α, IL-1, IL-6, MMPs, PGE2), que iniciarão a destruição do tecido periodontal. As células Th2 são responsáveis pela produção de citocinas anti-inflamatórias (TGF-α, IL-4, IL-10 e IL-12). A resposta à proteção contra a

periodontite depende da relação entre a quantidade e avidez dos anticorpos e do tipo de antígeno e da duração do estímulo (TENG, 2003).

Figura 2 - Respostas imunes na periodontite crônica.

Fonte: Adaptado de KINANE et al., 2017. As interações patógeno-hospedeiro que ocorrem na fenda gengival e no local da bolsa periodontal são caracterizadas pela infiltração de neutrófilos e por células polimorfonucleares, que é influenciada pelos gradientes quimiotáticos criados pelas bactérias e pela resposta inflamatória e infiltração linfocitária que acompanham a apresentação do antígeno da célula dendrítica. O ambiente pró-inflamatório resultante inclui citocinas, como fator de necrose tumoral (TNF), interleucinas (IL-1 β e IL-17), interferon-γ (IFNγ) e fator de crescimento transformador-β (TGFβ), No entanto, os neutrófilos são eventualmente sobrecarregados pela magnitude e persistência do biofilme microbiano e acabam por ser mortos ou sofrem apoptose ou necrose quando interagem com bactérias dentro da fissura gengival.

2.1.1 Perda óssea alveolar na periodontite e aspectos imunológicos O tecido ósseo é um tipo especializado do tecido conjuntivo, vascularizado, dinâmico, multifuncional, metabolicamente muito ativo e com capacidade particular de permanente remodelação e regeneração (BUCKWALTER et al.,1996; KNESER et al.,2006).

É responsável pelo suporte mecânico do esqueleto; locomoção e proteção; reservatório mineral, regulando a homeostase de íons cálcio no sangue e armazenamento de fosfato. Essa diversidade funcional é controlada por fatores sistêmicos, como as citocinas (CHARLES, 2014). Além disso, as células que compõem o tecido ósseo são osteoblastos, osteoclastos, células mesenquimais osteoprogenitoras e osteócitos. Os osteoclastos, responsáveis pela reabsorção do osso, são células grandes com até 50 núcleos, sintetizadas a partir da fusão de células mononucleares e apresentam-se com uma borda pregueada adjacente à matriz óssea (VAN’T HOF; RALSTON, 2001; TAT et al., 2009; DEGUCHI et al., 2016). Os osteoblastos, células que sintetizam a matriz óssea, são células mononucleadas, de origem mesenquimal, constituída de colágeno tipo I, osteocalcina, osteopontina, proteoglicanas, fosfoproteínas. Tais elementos atuam, mutuamente, fornecendo um alicerce que permite a deposição de sais minerais (KATCHBURIAN et al., 2002). Além disso, essas células secretam fatores de regulação que comandam proliferação, diferenciação e atividade osteoblástica, como interleucina-6 (IL-6) e fatores de crescimento. Possuem, também, receptores para hormônios, como triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), estrogênios, glicocorticoides, insulina e vitamina D (1,25-Dihidroxivitamina D3) (SODEK et al., 2000). A capacidade de remodelação do osso é possível pela participação dos osteoblastos e osteoclastos, no qual existe uma harmonia entre as atividades dessas células para garantir que os espaços de reabsorção produzidos pelos osteoclastos sejam preenchidos com a síntese da matriz óssea produzida pelos osteoblastos, logo, a homeostase óssea será mantida durante a remodelação (ALGATE, 2016; ZHAO, 2017). Caso a atividade osteoclástica prevaleça a reabsorção se transformará em uma condição patológica, como periodontite (SCHETT, 2009). O ciclo de remodelação óssea, uma série alinhada de eventos, caracterizada pela reabsorção seguida da formação óssea, inicia-se quando os osteoclastos secretam ácidos e enzimas proteolíticas na superfície óssea e promovem o processo de reabsorção do osso que sofreu dano. A substituição óssea inicia-se com a fase de reabsorção osteoclástica e, em seguida, reposição osteoblástica, no qual é sintetizado uma nova matriz óssea (VAN’T HOF; RALSTON, 2001; TAT et al., 2009). Entretanto, a maior parte das condições patológicas inflamatórias que atingem o osso, levando ao aumento da reabsorção óssea, apresentam-se devido ao desequilíbro no processo de remodelação, favorecendo os osteoclastos (TEITELBAUM, 2000).

Os marcadores bioquímicos de remodelação óssea são importantes na análise da efetividade de novos fármacos para o tratamento de doenças relacionadas ao tecido ósseo, pois são capazes de avaliar com maior sensibilidade as alterações do osso, retratam a formação ou a reabsorção óssea e são úteis no entendimento sobre fisiopatologia das doenças osteometabólicas (SARAIVA e LAZARETTI-CASTRO, 2002). A fosfatase alcalina óssea (FAO) é encontrada na membrana plasmática dos osteoblastos, e sua atividade está interligada com a formação óssea, além disso, encontra-se em níveis alterados na periodontite (GOES et al., 2012; MENEZES et al., 2012; SOUSA et al., 2016). Portanto, a medida da fosfatase alcalina óssea pode ser utilizada como um marcador da atividade na doença ou como um padrão de resposta à terapia (SARAIVA; LAZARETTI-CASTRO, 2002). O eixo fundamental de regulação óssea envolve a participação do RANK (receptor ativador NF-kB), do RANKL (ligante RANK) e da OPG (osteoprotegerina) e tem sido apontado como fundamental no controle da maturação dos osteoclastos. O RANKL é produzido pelos osteoblastos e pertence à família dos receptores do TNF. Após a ligação do RANKL ao seu receptor (RANK), que está localizado nas células pré-osteoclásticas, ocorre a diferenciação e a formação de osteoclastos maduros multinucleados, denominando tal processo de osteoclastogênese (NAKASHIMA et al., 2011; ALGATE et al., 2016). A osteoclastogênese é influenciada por uma série processos que abrangem a ação de citocinas pró-inflamatórias, bem como, o eixo de regulação comum RANK, RANKL e OPG. Dessa forma, a via RANK/ RANKL e OPG representam moléculas importantes no metabolismo ósseo e estão envolvidas em lesões inflamatórias (GOES et al., 2012; GOES et al., 2015; ANDRADE et al., 2008; COCHRAN, 2008). A OPG é também membro da família do TNF, produzida e liberada pelos osteoblastos e conhecida como fator inibidor dos osteoclastos, atuando com efeito inibitório do processo de maturação dos pré-osteoclastos. A OPG liga-se com alta afinidade ao RANKL nos osteoblastos, impedindo a ativação de RANK na superfície dos osteoclastos e inibição da reabsorção óssea (TAT et al., 2009). A ligação do RANKL ao pré-osteoclasto ocorre no estágio em que estas células de origem hematopoiéticas se diferenciam em unidade formadora de colônia de granulócitos e macrófagos (UFC-GM). Assim, na presença de fator estimulante de colônia de macrófagos (FSCM) ocorrerá a promoção da diferenciação de pré-osteoclastos em osteoclastos maduros. Porém, quando os níveis de OPG são maiores que a expressão de RANKL, OPG liga-se ao

RANKL, impedindo sua ligação ao seu receptor, resultando na diminuição da maturação dos osteoclastos e apoptose dos osteoclastos maduros (COCHRAN, 2008), ver Figura 3. Durante a inflamação, a osteoclastogênese pode ser modulada por citocinas pró- inflamatórias, com aumento de RANK-L e diminuição de OPG. Portanto, a fisiopatologia da periodontite é fortemente influenciada pela geração de citocinas (NORA SILVA et al., 2015;GRAVES, 2008; REID; HOLEN, 2009; GOES et al., 2012; ARAUJO et al., 2014).

Figura 3 - Representação esquemática da ação do sistema RANK/RANKL/OPG.

Fonte: Adaptado a partir de NORA SILVA et al., 2015. Com o aumento da ligação de RANKL ao seu receptor RANK (encontrado na superfície dos pré-osteoclastos) levam a fusão e diferenciação dessas células em osteoclastos maduros multinucleados ,e, subsequentemente, aumento da reabsorção do osso. Por outro lado, a ação de RANKL pode ser bloqueada pela OPG. A ligação de OPG ao RANKL impede sua interação com RANK, inibindo assim todos os eventos moleculares que levariam à diferenciação dos osteoclastos e reabsorção óssea.

2.1.2 Periodontite e as citocinas Estudos demonstram que as citocinas são importantes mediadores relacionados à patogênese da periodontite, no qual níveis elevados no sulco gengival estão associadas à gravidade da doença. As citocinas que ganham destaque na resposta inflamatória da periodontite são a IL-1β e TNF-α. Estas citocinas, ao se ligarem em seus receptores específicos, estimulam reações de sinalização intracelular e processos catabólicos, sendo peças chaves no processo inflamatório. Dessa forma, tais citocinas atuam de forma direta e harmônica promovendo a degradação da matriz do tecido ósseo e recrutamento ou ativação de

células osteoclásticas, culminando na reabsorção óssea (TOKER, 2017; MOREIRA, 2007; HENDERSON, 2003) O estímulo que desencadeia a periodontite é a presença do biofilme microbiano que provoca uma resposta imune-inflamatória no hospedeiro. O início e a manutenção dessa inflamação acontece por meio dos mediadores pro-inflamatórios como as citocinas (TNF-α e IL-1β) e quimiocinas (IL-8) que são continuamente produzidas por células imunes (TEIXEIRA et al., 2017; RIBEIRO et al., 2018). O efeito do TNF-α sobre a osteoclastogênese é atuar nos precursores de osteoclastos, promovendo o aumento da produção de M-CSF (Fator Estimulador de Colônia de Macrófago) e RANK-L em células mesenquimais (ZHANG, 2008; HAN et al., 2018). Estudos em roedores e primatas mostraram que o TNF-α desempenha papel fundamental no processo inflamatório, na reabsorção do osso alveolar e na perda de inserção do tecido conjuntivo (GARLET et al., 2006). Esses resultados corroboram com os já encontrados no nosso grupo de pesquisa, que demonstrou que essa citocina modula a resposta imune- inflamatória durante o curso evolutivo da periodontite em ratos (LIMA et al., 2000; LIMA et al., 2004). A IL-1 β é sintetizada por macrófagos, células β, neutrófilos, fibroblastos e células epiteliais (DINARELLO, 1988; KJELDSEN et al., 1993). A IL-1β estimula a produção de mediadores catabólicos do tecido conjuntivo e do osso, incluindo a própria IL-1β, IL-6, TNF-

α, prostaglandina E2 (PGE2) e metaloproteinases de matriz (MMP). Esses fatores contribuem para a perpetuação da degradação do tecido conjuntivo, bem como, com o recrutamento e ativação dos osteoclastos (BOCH et al., 2001; KARIMBUX et al., 2012; HIRANO et al et al., 2015). Além da estimulação osteoclástica, esta citocina também exerce quimiotaxia para neutrófilos e macrófagos (HIRANO et al., 2015). A interleucina-8 (IL-8) é uma quimiocina frequentemente associada à inflamação. Muitos estudos demonstraram que a expressão de IL-8 está aumentada nos tecidos periodontais inflamados. Além disso, níveis elevados de IL-8 foram encontrados no fluido crevicular de pacientes com periodontite. Além das citocinas IL-1β, TNF- α e IL-8, a IL-6 tem sido demonstrada em tecidos gengivais em indivíduos com periodontite, mostrando uma correlação positiva com essa doença (STEFANI, 2013). A IL-6 também é um estimulador potente da diferenciação de osteoclastos e reabsorção óssea, como também, um inibidor de formação óssea (MOREIRA,

2007). Com isso, é possível afirmar que a IL-6 pode ser um potencial alvo na modulação do processo osteoclástico apresentado na periodontite (VILMA et al, 2008).

2.1.3 Periodontite e o estresse oxidativo Muitos estudos experimentais têm mostrado uma associação positiva entre estresse oxidativo e periodontite. O estresse oxidativo é decorrente de um desequilíbrio persistente entre a geração de espécies moleculares intensamente reativas (oxigênio e nitrogênio) e susbtâncias antioxidantes, levando a um dano celular. As Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) causam danos teciduais como peroxidação lipídica, dano ao DNA, dano proteico e oxidação de enzimas importantes, como também, agem como moléculas sinalizadoras ou mediadores inflamatórios (CHAPPLE e MATTHEWS, 2007). As substâncias antioxidantes podem efetivamente impedir a oxidação induzida por EROS (SIES 1997). Em condições fisiológicas, o dano tecidual pode ser prevenido pela ação neutralizante de substâncias antioxidantes às EROS. As EROS são neutralizados na célula pela ação de enzimas como a catalase (CAT), a superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH Px), e também antioxidantes não enzimáticos como a glutationa reduzida (GSH) e vitaminas C e E (DAHIYA et al., 2013; TRIVEDI; LAL, 2017). Contudo, quando a inflamação persiste, a produção de EROS eleva-se devido à resposta do sistema imunológico inato, por ação dos neutrófilos e macrófagos e, com isso, a atividade antioxidante torna-se insuficiente para combater os altos níveis de EROS, levando ao estresse oxidativo e dano tecidual (MITTAL et al., 2014). Estudos apontam que a periodontite provoca uma produção excessiva de EROS no periodonto (LING et al., 2016). Com a progressão da periodontite, as EROS produzidas como resultado da inflamação periodontal difundem-se na corrente sanguínea provocando a oxidação de várias moléculas no sangue (TOMOFUJI et al., 2007). A compreensão dessa associação pode esclarecer a patogênese da periodontite, a sua interação com a inflamação sistêmica e levar a novas estratégias terapêuticas.

2.1.4 Periodontite e óxido nítrico As evidências sugerem, também, a participação do radical livre, óxido nítrico, na resposta inflamatória da periodontite. O óxido nítrico participa de diversos processos fisiológicos como a modulação do tônus e da integridade cardiovascular, neurotransmissão, coagulação sanguínea, e atividade oxidativa que contribui para a eliminação de microrganismos. Por outro lado, os efeitos do óxido nítrico podem envolver a injúria tecidual

ativadas por citocinas, via produção pela NOSi e levando à redução da remodelação óssea (KIRZIOĞLU et al.,2018) A infecção bacteriana associada à resposta inflamatória na periodontite são potentes indutores de síntese de NO. Estudos relatam que a inibição de síntese de NO diminui a reabsorção óssea em modelos animais (LEITÃO et al., 2005). Logo, o papel do NO é controverso, se por um lado altas concentrações de NO, tais como aquelas produzidas após estimulação de citocinas pró-inflamatórias, possuem potente efeito inibitório no crescimento e diferenciação dos osteoblastos (RALSTON et al., 1994; DAMOULIS et al., 1994). Por outro lado, mostraram que pequenas quantidades de NO, as quais são produzidas constitutivamente pelos osteoblastos, podem atuar como estimulador do crescimento e diferenciação do próprio osteoblasto (BUTTERY et al., 1999; MANCINI et al., 2000).

2.2 Peridontite experimental em ratos Os modelos de animais são valiosos na busca por novos alvos farmacológicos. A periodontite induzida por ligadura é um modelo experimental bem estabelecido. Nesse modelo, a ligadura serve como depósito de biofilme dental, o que leva à periodontite, resultando em perda óssea (DE LIMA et al.,2000). Tal modelo animal, apesar das limitações, apresenta características semelhantes aos humanos, como a estrutura e a organização dos tecidos periodontais. É possível observar, também, as alterações clínicas e histopatológicas apresentadas durante a periodontite, assim como, aspectos relacionados à interação sistêmica envolvendo bactérias, fatores ambientais e a resposta imuno/inflamatória do hospedeiro podem ser avaliados de forma mais complexa em modelos animais (LEITÃO et al, 2005; BEZERRA et al.,2000; HAJISHENGALLIS et al.,2015; STRUILLOU et al.,2010). As vantagens dos estudos em modelos animais podem ser o fácil manuseio e a disponibilidade de variação controlada de condições fisiológicas, microbiológicas e imunológicas, podendo ser parâmetros utilizados para avaliar a patogênese da periodontite ou as ferramentas terapêuticas utilizadas nessa condição (KUHR et al., 2004; GASPERSIC et al., 2008). Quando se refere às patologias periodontais, os roedores são os animais mais amplamente estudados nos experimentos pré-clínicos, pois suas principais vantagens são: tamanho, menor custo, controle da idade e características genéticas, como também, facilidades de manipulação e controle da microbiota. Dentre os roedores, o mais utilizado é o rato (Rattus novergicus albinus) (ROBINSON et al., 1991), pois a anatomia da junção

dentogengival da região de molares é muito semelhante aquela descrita no homem, tornando o estudo experimental da periodontite nestes animais bastante válido (SOUZA et al., 2005). Nesse caso, a indução da periodontite pode ser realizada por diferentes métodos como a administração de uma dieta rica em sacarose, a inoculação experimental de microrganismos periodontopatogênicos ou a indução através da colocação de um fio de algodão posicionado na margem gengival, estratégia conhecida como: indução por ligadura (BEZERRA et al., 2000; GEMMEL et al., 2002; RODINI, 2005; ABE et al., 2013). Algumas bactérias periodontopatogênicas utilizadas na indução da periodontite em ratos são Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotela intermédia e Fusobacterium nucleatum. Também, é possível inocular o tecido gengival com lipopolissacarídeos (LPS) para estimular a liberação de mediadores inflamatórios e promover a indução do processo inflamatório e ativação dos osteoclastos (GEMMEL et al., 2002). Na doença periodontal induzida por ligadura ao redor da região cervical do segundo molar direito haverá uma resposta à agressão mecânica provocando achatamento e deslocamento dos tecidos gengivais mesial e distal, bem como, o dano tecidual pela ulceração causada no epitélio juncional. O acúmulo gradual de biofilme associado à ruptura da integridade tecidual propicia o deslocamento de microrganismos em direção aos tecidos mais profundos, gerando processo inflamatório periodontal, que é geralmente caracterizado por períodos de inflamação aguda, com migração de células inflamatórias, seguidos por perda de tecido conjuntivo e períodos de inflamação crônica (RODINI, 2005). Os parâmetros clínicos e microscópicos da periodontite em ratos são semelhantes àqueles observados no homem, com sangramento gengival. Na análise microscópica, o epitélio juncional apresenta alterações graduais como formação de cristas epiteliais, ulceração e migração apical. Além disso, no tecido conjuntivo subjacente, ocorre destruição de fibras colágenas, atividade osteoclástica aumentada e presença de infiltrado inflamatório contendo linfócitos e macrófagos (HENNEMAN et al., 2012). Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem realizando estudos utilizando um modelo experimental em ratos em que a periodontite pode ser induzida, reproduzida e facilmente mensurável por colocação de ligadura no segundo molar superior esquerdo (BEZERRA et al., 2000; LIMA et al., 2000; LEITÃO et al, 2004; MARTINS et al., 2016). Este modelo é altamente reprodutível, no qual, a ligadura atua como um trauma mecânico sobre a área dento-gengival reduzindo, assim, a integridade do tecido e permitindo que haja interação entre biofilme bacteriano e hospedeiro, induzindo a perda óssea alveolar. Tal perda

óssea pode iniciar com 3 dias após a indução, atingindo um máximo entre os dias 7 e 11, e declinando no dia 14. Embora ocorra essa redução da perda óssea ao longo do tempo, o dano tissular é irreversível, comprometendo a fisiologia do sistema estomatognático (LIMA et al, 2000). Além disso, é válido enfatizar que na literatura vários trabalhos foram realizados com ratas fêmeas e que foi assegurada a reprodução do modelo, sugerindo, portanto, que o nível de estrogênio não afeta a quantidade de osso alveolar, demonstrando que a indução da periodontite por ligadura em fêmeas reproduz os mesmos sinais clínicos e inflamatórios da periodontite induzida em machos (LEITÃO et al., 2005; MENEZES et al., 2012; TEIXEIRA et al., 2017; RIBEIRO et al., 2018). Desta forma, este modelo representa uma importante estratégia para o estudo da fisiopatologia da reabsorção óssea in vivo, uma vez que é possível quantificar a perda óssea, permitindo avaliar os efeitos de ferramentas farmacológicas. Tal compreensão quanto aos fenômenos inflamatórios envolvidos no mecanismo de lise óssea pode levar à busca por terapêuticas alternativas, que permitam alterar o curso evolutivo de doenças ósseas inflamatórias, como a periodontite.

2.3 Utilização de produtos naturais pelas comunidades O território brasileiro abrange uma grande parte do continente sul americano e possui uma variedade de climas, contribuindo para o desenvolvimento de diferentes regiões biogeográficas e levando à uma diversidade da flora, da fauna e dos microrganismos. Através da disponibilidade de matéria prima, de inovação e tecnologia e da geração de negócios é possível explorar a biodiversidade. Diante dessa realidade, a investigação farmacológica da biodiversidade brasileira, a pesquisa de novos recursos genéticos e o interesse por plantas medicinais vêm ganhando destaque (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006). O aumento no interesse por plantas medicinais impactou no setor econômico, incluindo os mercados nacional e internacional, no qual do total global de US$ 320 bilhões em vendas anuais de produtos farmacêuticos, o mercado de fitoterápicos movimenta cerca de US$ 20 bilhões todos os anos (ETHUR et al 2011). O conhecimento sobre produtos naturais é, muitas vezes, o único recurso terapêutico de variadas comunidades e grupos étnicos em todo o mundo. O estudo do uso popular de recursos naturais de uma região contribui sobremaneira como alternativa econômica para as populações desfavorecidas que nela reside. O uso de plantas medicinais e os fitoterápicos estão inseridos entre as principais práticas terapêuticas, Alternativas-Complementares em saúde e, ao longo

da história, a população brasileira vem utilizando esses recursos nos seus cuidados com a saúde, na Medicina Tradicional ou nos programas públicos de fitoterapia no SUS, alguns com mais de 20 anos de existência (BRASIL, 2012), como é o caso do Programa Farmácias Vivas (1983), idealizado pelo professor Francisco José de Abreu Matos, no Ceará. Nesse cenário, as propostas e iniciativas do Ministério da Saúde para viabilizar o uso racional de fitoterápicos possuem um grande potencial para refletir de forma positiva na saúde da população e contribuir para uma maior adesão terapêutica por ser uma opção terapêutica segura e acessível, valorizada pela comunidade e com baixo potencial para causar reações adversas (ANTONIO; TESSER; MORETTI-PIRES, 2014). É importante acrescentar que a análise científica da toxicidade e eficácia de muitas plantas ainda é um fator limitante para que essa utilização não proporcione riscos à saúde do paciente, sendo possível constatar que, apesar da rica biodiversidade, a real capacidade terapêutica das plantas medicinais necessitam de um investigação científica (MATSUDA et al., 2010). O estudo dos extratos de plantas com efeito antibacteriano para uso no tratamento de doenças relacionadas aos tecidos orais vêm aumentando devido o crescimento do setor fitoterápico, a multiresistência das cepas aos antibióticos e aos efeitos colaterais apresentados pelos fármacos convencionais utilizados na terapia (SILVA et al., 2006; AGRA et al., 2007). Logo, o reconhecimento de novas fontes naturais de compostos químicos visando o desenvolvimento de fitofármacos trará benefícios à economia de países em desenvolvimento, contribuindo sobremaneira para o acesso da comunidade à medicamentos seguros e de baixo custo, com potencial terapêutico confirmado no aspecto científico, mediante a realização de pesquisas que comprovem as atividades farmacológicas e/ou toxicológicas, promovendo uma maior autonomia no gerenciamento de políticas de saúde pública (YOKOYAMA et al., 2011).

2.3.1 Família Fabaceae A família Fabaceae (ou Leguminosae) está amplamente distribuída nos ecossistemas florestais brasileiros, encontrada na maioria dos ambientes, em vegetações variadas, e podem apresentar variações interessantes de crescimento. É considerada umas das maiores famílias de Angiospermas, compreendendo aproximadamente 727 gêneros e 19.325 espécies (LEWIS et al., 2005; STEVENS 2006). Sua catalogação no Brasil apresenta 200 gêneros e 1500 espécies de leguminosas (SOUSA, LORENZI, 2005). Foram reconhecidas três subdivisões, como as subfamílias Caesalpinioideae, Mimosoideae e Faboideae (Papilinioideae) (QUEIROZ 2009; POLHILL et al. (1981).

A família Fabaceae podem apresentar-se como ervas, arbustos, árvores ou até mesmo lianas; com desenvolvimento perenes ou anuais e com grandes espécies vegetando em florestas ou herbáceas encontradas em campos (POLHILL et al.,1981). Em sua diversidade, caracterizam-se por possuir folhas compostas e alternas, com flores pentâmeras, períginas ou hipóginas, geralmente bissexuadas e simetria variada, flores e o fruto típico é o legume (CRONQUIST, 1981; SOUZA & LORENZI ,2005; STEVENS, 2006). A versatilidade desta família representa um destaque no setor econômico, podendo ser utilizada como alimento; corantes; atuam como adubos ao associarem-se a bactérias fixadoras de nitrogênio; forragem para animais; plantas medicinais ou ornamentais, utilizadas na arborização e decoração de ambientes, como a tipuana (Tipuana tipu Benth.), o flamboyant (Delonix regia Bojer.), a pata-de-vaca (Bauhinia variegata L.), dentre outras (SOUZA, LORENZI ,2005).

2.3.2 Gênero Bauhinia Entre as inúmeras espécies de interesse medicinal, encontra-se as plantas do gênero Bauhinia (Figura 4). O gênero Bauhinia está presente na região tropical de todos os continentes, por isso é considerado pantropical e apresenta em torno de 500 espécies (SOARES, 2008). Os estudos fitoquimicos e farmacológicos realizados com as folhas, flores e caule dessas plantas indicam que as mesmas são constituídas, principalmente de glicosidios esteroídicos, triterpenos, lactonas e flavonoides (CECHINEL FILHO, 1998). Compostos flavonoides têm sido isolados e identificados de espécies B.candicans, B. forficata, B.guianensis, B. manca, B. purpúrea, B. reticulata, B.splendens, B.variegata (SILVA, CECHINEL FILHO, 2002). As propriedades biológicas de espécies de Bauhinia têm sido investigadas em estudos e demonstradas suas atividades analgésicas, diuréticas, adstringente (SHANG 2009); antioxidante e citotóxica (ADEROGBA et al., 2007); atividade antimutagênica (REID et al., 2006); anti-inflamatória (RAO et al.,2008) e moduladora da resposta imune (GHAISAS et al., 2009).

Figura 4. Fotos de uma espécie de Bauhinia registrado em Sobral-CE.

Fonte: Isabela Ribeiro Pinto (2019)

A relevância para a biodiversidade no Brasil é destaque, visto que, estudos revelam que diversas espécies de Bauhinia são utilizadas na medicina popular no tratamento de numerosas enfermidades. Informações etnofarmacológicas apontam que o uso da Bauhinia galpinii tem sido empregada no tratamento da diarreia e infertilidade (SAMIE et al., 2010), Bauhinia variegata Linn. está associada ao tratamento de Diabetes, úlcera, disenteria e diarreia, e, Bauhinia petersiana Bolle utilizada na dismenorreia (PAREKH, CHANDRA, 2007). Dentre essas espécies, encontram-se a Bauhinia pulchella e seu uso tradicional para o tratamento da diabetes (SILVA; CECHINEL FILHO, 2002).

2.3.3 Bauhinia pulchella Benth. Bauhinia pulchella Benth. é uma planta leguminosa, nativa do Brasil, popularmente conhecida como “pata-de-vaca”, mororó-de-boi”, “mororó-da-chapada”, “embira-de-bode”. É encontrada nos estados do Piauí, Bahia, Ceará, Maranhão, Rio Grande do Norte, Tocantins, Rondônia, Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul, principalmente em regiões geográficas como Caatinga, Cerrado e Amazônia (VAZ ,2003; QUEIROZ, 2009).

A espécie Bauhinia pulchella Benth. apresenta-se como arbusto, com folhas com dois lóbulos até 4,5 cm, flores com pedicelo até 1cm de comprimento, sementes 5-8 x 3,5-5 mm, gineceu 8cm comprimento, legume deiscente, estipulas rudimentares, nectários extraflorais subuliformes, folhas subopositifolias, cálice fendido na antese em 3-5, lobos ovado-elíticos a obovados ou suborbiculados, coluna estaminal internamente tomentosa na região distal, indumento foliar na face inferior formado de tricomas curtos e apressos, até quase glabras, nervuras secundárias e terciárias pouco conspícuas, além disso, ovário tomentelo com tricomas glandulares (VAZ 2003).

Sousa et al. (2016) apresentaram atividade larvicida e atividade citotóxica contra linhagem de células cancerígenas apresentadas pelo óleo essencial da Bauhinia pulchella Benth. O estudo de Lopes et al. (2016) demonstraram que condensados taninos de Bauhinia pulchella Benth. apresentaram atividade anti-helmintica e reduziram infecções gastrointestinais (LOPES et al. , 2016).

Figura 5. Foto de um espécime de Bauhinia pulchella em São Benedito-Ce.

Fonte: Jarbas Lima de Carvalho (2013) A atividade terapêutica de preparações de plantas medicinais é atribuída a diversos fitoquimicos (metabolitos secundários) como fenólicos, terpenoides ou alcaloides (AHMED, 2012). Fenolicos são fitoquimicos caracterizados pela presença do anel aromático contendo substituintes fenol ou polifenois. Flavonoides pertencem ao extenso grupo dos polifenois e possuem diversas atividades biológicas, como anti-inflamatória, anti-ulcera, anticancer, antiviral, antibacteriana, antiespasmódica, neuroprotetora, redução pressão sanguínea

(CASSIDY, et al., (2011), anti-trombótica e anti-aterosclerotica tem sido atribuídas a esses compostos (MIDDLETON et al., 2000). Portanto, propriedades anti-inflamatórias, correlacionadas com atividade antioxidante, tem sido verificadas nessa classe de metabólitos (MACKENZIE et al., 2004). O reconhecimento do potencial antioxidante dos flavonoides pode, portanto, ser responsável por suas ações benéficas (PIETTA, 2000). Flavan-3-ol ou flavanol, conhecido popularmente como fisetinidol, são a classe de compostos mais complexas de flavonoides, variando de simples monômeros, oligômeros e polímeros (MENA et al., 2014). O interesse em flavan-3-ols foi despertado pela verificação de seu potencial benefício nos efeitos na saúde humana, observados em estudos epidemiológicos (BITTNER, 2013). Dentre as propriedades relevantes relatadas por essa classe de substâncias pode-se destacar os efeitos de fisetinidol em doenças crônicas que envolvem inflamação e muitas atividades biológicas evidenciadas em estudos de cultura de células ou modelos animais (MENA et al., 2014). Foi relatado que fisetinidol pode ser encontrados em cereais, legumes, frutas, legumes, cacau, uvas e maçãs (YANG et al., 2012). Neste sentindo, as plantas têm apresentado altas concentrações de flavan-3 ol. A ocorrência natural de fisetinidol no cerne de Prosopis glandulosa derivados de mecanismos de dimerização oxidativa de certos metabólitos foi reportada por Jacobs et al. (1983). Mena P. et al., (2014) apresentaram um estudo sobre duas famílias de compostos de polifenois, nomeados antocianinas e fisetinidol e seus efeitos na redução de processos inflamatórios. Estudos demonstraram que fisetinidol contribuem para a redução do estresse oxidativo devido a capacidade de capturar espécies reativas de oxigênio, o que pode melhorar a inflamação. Uma relação inversa entre a ingestão de flavan-3-ols (monomérico e oligômico) e a doença cardíaca isquêmica e a incidência de cânceres também foram encontradas (ARTS, et al, 2000). Compostos de fisetinidol têm sido obtidos de frutas de R. laevigata (YOSHIDA et al., 1989) e raízes de Rosa henryi (YOSHIDA et al., 1992) e Rosa multiflora (PARK et al.,2010). No estudo de Carvalho (2014), a análise dos dados espectroscópicos obtidos e posterior comparação com registros na literatura permitiram identificar o flavonoide da classe das flavana-3-ol (Fisetinidol) denominado 2-(3’,4’-diidroxifenil)-cromano-3,7-diol (Figura 6). Tal composto foi obtido através de tratamentos cromatograficos em gel de sílica a partir do extrato etanólico do caule de Bauhinia pulchella Benth., coletadas em Maio de 2013, no município de São Benedito-Ce, Brasil. Posteriormente, após uma reação de acilação do

Fisetinidol, obteve-se o derivado semi-sintético, Palmitato de Fisetinidol, um composto sólido à temperatura ambiente, mais estável quimicamente e mais apolar (Figura 7).

Figura 6. Estrutura do Fisetinidol.

Fonte: Carvaho 2014.

Figura 7. Estrutura do Palmitato de Fisetinidol.

Fonte: Carvaho 2014.

3 JUSTIFICATIVA A periodontite é uma doença inflamatória crônica, que representa um grave problema de saúde pública, sendo uma doença extremamente incapacitante por ocasionar mobilidade e perda dentária, afetando diretamente a qualidade de vida dos indivíduos acometidos por essa patologia (SANZ ,VAN WINKELHOFF 2011; ARAUJO et al., 2007). O estudo da periodontite por meio de modelos animais que mimetizem os principais achados clínicos desse processo patológico poderá contribuir para o esclarecimento do papel da resposta imune-inflamatória do hospedeiro na evolução dessa doença, fomentando o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para o manejo de uma doença de etiopatogenia complexa e multifatorial, representando um conforto para os pacientes (BEZERRA et al., 2000; LIMA et al., 2000; LEITÃO et al., 2004). Ademais, projetos que visem estudar o perfil farmacológico de plantas medicinais comumente usadas pela comunidade (desde ensaios pré-clínicos de toxicidade até a validação de sua segurança e eficácia) devem ser considerados estratégias prioritárias pelas instituições nacionais de fomento à pesquisa, visto que a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (Decreto Presidencial 5.813 de 22/6/2006) apresenta como marcos conceituais: inclusão social e regional, desenvolvimento industrial e tecnológico, além do uso sustentável da biodiversidade brasileira e da valorização do conhecimento tradicional das comunidades tradicionais. Muitos estudos vêm sendo cada vez mais realizados a fim de comprovar a eficiência de metabólitos secundários em um sistema biológico, seja in vitro ou in vivo. E em paralelo, a ciência caminha com a medicina popular a fim comprová-la. E o mesmo ocorre com as plantas pertencentes ao gênero Bauhinia, que pela população de diferentes partes do mundo tem encontrado respaldo nos estudos científicos, na qual comprovam a eficácia destas plantas em vários modelos experimentais. Neste contexto, alguns efeitos biológicos ou farmacológicos, como antifúngicos, antibacterianos, analgésicos, antiinflamatórios e especialmente antidiabéticos, são relatados na literatura, comprovando e justificando o uso destas espécies na medicina popular (RAO et al., 2008; GHAISAS et al., 2009). Embora muitos compostos, incluindo alcaloides, terpenoides, esteroides, estilbenos, mas principalmente flavonoides, tenham sido isolados e identificados nestas espécies, são raros os estudos que relacionam tais compostos aos efeitos biológicos indicados. Neste sentido, o estudo da possível eficácia e segurança do Fisetinidol, um flavonoide, obtido a partir do extrato etanólico do caule de Bauhinia pulchella, bem como seu derivado

semissintético, Palmitato de Fisetinidol (obtido através de uma reação de O-acilação com cloreto de palmitoíla), em um modelo de periodontite em ratas poderá contribuir para a identificação de uma nova abordagem terapêutica para o manejo desse processo nosológico. Destarte, esse projeto busca contribuir para a compreensão da complexa rede de eventos bioquímicos que formam a base da fisiopatologia da periodontite, na perspectiva do desenvolvimento de opções terapêuticas que possam alterar o curso evolutivo dessa doença, aumentando a adesão do paciente e as chances de êxito da terapia, contribuindo para uma melhor qualidade de vida dos pacientes portadores destes processos inflamatórios crônicos. Contudo, este projeto também abriu um leque de possibilidades de ensaios com derivados do Fisetinidol, uma vez que é possível realizar a síntese do acetato, A, propanoato, B, butanoato, C, pentanoato, D, bem como outros ésteres, E, derivados do Fisetinidol (Figura 8).

Figura 8. Possibilidades de síntese de outros derivados.

Fonte: Própria autora.

4 HIPÓTESE

1) Fisetinidol e Palmitato de Fisetinidol reduzem perda óssea inflamatória em ratas com periodontite 2) Os animais tratados com Palmitato de Fisetinidol não apresentam sinais de toxicidade.

5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral Avaliar a eficácia de um flavonoide (Fisetinidol) obtido do caule de Bauhinia pulchella e seu derivado semi-sintético (Palmitato de Fisetinidol) em um ensaio pré-clínico de periodontitie em ratas.

5.2 Objetivos Específicos  Analisar a eficácia de Fisetinidol e Palmitato de Fisetinidol sobre a perda óssea alveolar em ratas submetidas à periodontite;  Dosar os níveis de fosfatase alcalina óssea em ratas submetidas à indução de periodontite e tratadas com Palmitato de Fisetinidol;  Dosar a atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) em tecido gengival de ratas submetidas à indução da periodontite e tratadas com Palmitato de Fisetinidol;  Estudar a participação das citocinas IL-1β e IL-8/CINC-1 em tecido gengival de ratas submetidas à indução da periodontite e tratadas com Palmitato de Fisetinidol;  Investigar por qRT-PCR a expressão gênica de IL-1β, IL-6, RANK, RANK-L e OPG no tecido gengival de ratas submetidas à indução da periodontite e tratadas com Palmitato de Fisetinidol;  Investigar a atividade antioxidante do Palmitato de Fisetinidol através da análise da atividade das enzimas Superóxido dismutase (SOD) e Catalase (CAT) e níveis de Nitrito/nitrato em tecido gengival de ratas submetidas à indução da periodontite;  Examinar a toxicidade de Palmitato de Fisetinidol em ratas submetidas à indução da periodontite e tratadas durante 11 dias através da análise das dosagens séricas de marcadores bioquímicos (fosfatase alcalina, creatinina, alanina amino transferase – ALT e aspartato amino transferase – AST) e análise histopatológica do coração, fígado, estômago e rim.

6 CAPÍTULO I

Solicitação de depósito de Patente junto ao Instituto Nacional da Propriedade Intelectual (INPI), através da Coordenadoria de Inovação Tecnológica (CIT) da Pró- Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da UFC – Número do Processo: BR 10 2018 073535 7

Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado de Adição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT

Número do Processo: BR 10 2018 073535 7

Dados do Depositante (71)

Depositante 1 de 1 Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica CPF/CNPJ: 07272636000131

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa

Endereço: Av da universidade, 2853 - Benfica

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: 60710-780 País: Brasil

Telefone: (85)3366-9434

Fax: (85) 3366-9941

Email: [email protected]

Dados do Pedido

Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI)

Título da Invenção ou Modelo de Utilidade (54): PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO PALMITATO DE FISETINIDOL E SEU USO COMO AGENTE ANALGÉSICO E ANTIRREABSORTIVO Resumo: A presente invenção particularmente se aplicada insere à área no de campo síntese da química, orgânica, e descreve processo de obtenção do palmitato de fisetinidol(2) e seu uso como agente analgésico e antirreabsortivo. Figura a publicar: 5

Dados do Inventor (72)

Inventor 1 de 17

Nome: HELLIADA VASCONCELOS CHAVES

CPF: 84184930387 Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física:

Pesquisador Endereço: curso de odontologia ufc -campus Sobral

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 2 de 17

Nome: ISABELA RIBEIRO PINTO

CPF: 60131029371 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador

Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 3 de 17

Nome: JORDANIA MARQUES DE OLIVEIRA FREIRE

CPF: 02304719350

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 4 de 17 Nome: LUZIA HERMINIA TEIXEIRA DE SOUSA

CPF: 02693958300 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 5 de 17

Nome: SEBASTIÃO CARLOS DE SOUSA OLIVEIRA

CPF: 03002823384

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 6 de 17 Nome: DINA ANDRESSA MARTINS MONTEIRO

CPF: 04340907359 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 7 de 17

Nome: GILVANDETE MARIA PINHEIRO SANTIAGO

CPF: 11776650344

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av humberto monte s/n

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 8 de 17 Nome: ARIELY MARQUES OLIVEIRA DE MENESES

CPF: 07228123379

Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Pesquisador

Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100 Cidade: SOBRAL

Estado: CE CEP:

País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 9 de 17

Nome: MIRNA MARQUES BEZERRA

CPF: 87708124468

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: rua coronel nunes de melo 1000

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 10 de 17 Nome: KARUZA MARIA ALVES PEREIRA

CPF: 78033977353

Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Pesquisador

Endereço: rua demiro farias S/n Cidade: Fortaleza

Estado: CE CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 11 de 17

Nome: MARIA ELISABETE AMARAL DE MORAES

CPF: 09041389334

Nacionalidade: Brasileira Qualificação Física: Pesquisador

Endereço: rua coronel nunes de melo 1000 Cidade: Fortaleza

Estado: CE CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 12 de 17 Nome: RAQUEL CARVALHO MONTENEGRO

CPF: 45633312368 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: rua coronel nunes de melo 1000

Cidade: Fortaleza Estado: CE CEP:

País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 13 de 17

Nome: GERARDO CRISTINO FILHO

CPF: 16416678349

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 14 de 17 Nome: VICENTE DE PAULO TEIXEIRA PINTO

CPF: 35992700315 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av comandante maurocelio rocha pontes 100

Cidade: SOBRAL Estado: CE CEP:

País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 15 de 17

Nome: LEÔNCIO MESQUITA DE SOUSA

CPF: 80628664320

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av humberto monte s/n

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 16 de 17 Nome: MARCOS REINALDO DA SILVA

CPF: 01063126347 Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av humberto monte s/n

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Inventor 17 de 17

Nome: AURÉLIO DE OLIVEIRA MONTEIRO

CPF: 60041486366

Nacionalidade: Brasileira

Qualificação Física: Pesquisador Endereço: av humberto monte s/n

Cidade: Fortaleza Estado: CE

CEP: País: BRASIL

Telefone:

Fax:

Email: [email protected]

Documentos anexados

Tipo Anexo Nome

Relatório Descritivo RELATORIO DESCRITIVO palmitato fisetinidol.doc.pdf Reivindicação REIVINDICAÇÕES_palmitato fisetinidol

(1).pdf Desenho DESENHO palmitato fisetinidol.pdf

Resumo RESUMO palmitato

fisetinidol.pdf Comprovante de pagamento de GRU 200 comprovante de gru depsoito.pdf

COMPROVANTE DE ACESSO comprovante de acesso .pdf

Acesso ao Patrimônio Genético

Declaração Positiva de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invenção foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio Genético Brasileiro, realizado a partir de 30 de junho de 2000, e que foram cumpridas as determinações da Lei 13.123 de 20 de maio de 2015, informando ainda:

Número da Autorização de A3B2C24 Acesso:

Origem do material genético e do conhecimento tradicional associado, quando for o caso

PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO PALMITATO DE FISETINIDOL E SEU USO COMO AGENTE ANALGÉSICO E ANTIRREABSORTIVO

Declaração de veracidade

Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas e verdadeiras.

PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO PALMITATO DE FISETINIDOL E SEU USO COMO AGENTE ANALGÉSICO E ANTIRREABSORTIVO Campo da invenção:

[1] A presente invenção se insere no campo da química, particularmente aplicada à área de síntese orgânica, e descreve o processo de obtenção do composto Palmitato de Fisetinidol (2) assim obtido e seu uso como agente analgésico e antirreabsortivo. Fundamentos da invenção: [2] Fisetinidol(1), um flavonoide da classe das flavan-3- ol, é um metabólito secundário obtido a partir de espécies do gênero Bauhinia, tais como B. ungulata, B. pulchella, B. acuruana e B. cheilantha, pertencentes à família Fabaceae, subfamília Caesalpinoideae da ordem Fabales, e apresenta atividade antioxidante. O derivado semi-sintético palmitato de fisetinidol (2) desta invenção foi obtido a partir do fisetinidol (1), isolado de Bauhinia pulchella. Palmitato de fisetinidol (2) é um composto sólido à temperatura ambiente e mais estável quimicamente que o fisetinidol (1).

[3] Diversas espécies do gênero Bauhinia são utilizadas na medicina popular no tratamento de enfermidades como diabetes, infecções, dor e inflamação. Estudos revelam que as plantas desse gênero apresentam diversas atividades tais como antitumoral, antipirética, anti-úlcera, antimalárica e propriedades antioxidantes. Essas atividades farmacológicas são atribuídas à presença de terpenos, esteroides, alcaloides e principalmente, flavonoides em suas composições químicas. A atividade citotóxica contra células cancerígenas foi apresentada pelo óleo essencial de Bauhinia pulchella, através da presença de constituintes como β-pineno, α-pineno, E-cariofileno, óxido de cariofileno.

[4] Estudos demonstraram que substâncias derivadas do gênero Bauhinia apresentam ação antinociceptiva, antifúngica, antibacteriana e anti-inflamatória no modelo da formalina.Compostos do gênero Bauhinia,contendo flavonoides e taninos se mostraram eficientes em reduzir efeito nociceptivo em contrações abdominais induzida pelo ácido acético em ratos, atenuando as duas fases no modelo de formalina;além disso,apresenta atividade anti-inflamatória em modelos de edema de pata induzida por histamina e carragenina através da modulação da regulação

ouliberação de mediadores pró-inflamatórios reduzindo, consequentemente, a resposta nociceptiva e inflamatória.

Estado da Técnica: A presente invenção trata-se de um método para isolamento do fisetinidol (1) e obtenção de palmitato de fisetinidol (2) a partir do produto natural (1).

[5] O processo de obtenção da presente invenção tem como vantagem a utilização de um flavonoide natural modificado estruturalmente em apenas um passo reacional, gerando o composto bioativo. O uso desse composto bioativo em ensaios experimentais de dor e inflamação óssea traz uma nova molécula com efeito analgésico e antirreabsortivo para a terapêutica da periodontite e que não apresenta toxicidade. A saber, a periodontite representa um grave problema de saúde pública, sendo responsável pela perda de dentes em adultos. O agravamento e cronificação do quadro clínico pode causar afastamentos no trabalho e diminuição das interações sociais, com consequente diminuição da qualidade de vida. Apesar da alta prevalência, ainda não há terapêuticas efetivas, sendo necessária a busca por novos fármacos, daí a importância da presente invenção, trazendo uma nova molécula com efeito analgésico nessa dor. Breve descrição da invenção:

A presente invenção descreve o processo de obtenção do palmitato de fisetinidol (2) assim obtido e seu uso como agente analgésico e antirreabsortivo. [6] Processo de obtenção do palmitato de fisetinidol (2) caracterizado por compreender as etapas de: a) Dissolver (-)-fisetinidol (30,3 mg; 0,11 mmol)em piridina (1,5 mL) e clorofórmio (2 mL) à temperatura ambiente e adicionar cloreto de palmitoíla (1 mL; 3,3 mmol) e 4,4-dimetilamino piridina (DMAP) em quantidades catalíticas; b) Manter a mistura reacional obtida na etapa (a) sob agitação magnética à temperatura ambiente por 19 horas, com monitoramento por cromatografia em camada delgada;

c) Diluir a solução obtida na etapa (b) com diclorometano (20 mL), transferir a mesma para um funil de separação, lavar sucessivamente com solução saturada de sulfato de cobre (4 x 10 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (1 x 10 mL), secar com sulfato de sódio anidro; d) Remover o solvente do meio reacional obtido na etapa (c) em evaporador rotativo; e e) Purificar o produto reacional obtido em (d) por cromatografia em gel de sílica (44,33 g), utilizando-se uma mistura de hexano:acetato de etila (90:10), como eluente.

[7] Composto tem fórmula estrutural: C79H134O9 e é denominado Palmitato de fisetinidol(2)ser para tratar dor e inflamação óssea.

Breve descrição das figuras:

[8] A Figura 1 refere-se ao esquema reacional do processo de obtenção do palmitato de fisetinidol (2). [9] A Figura 2 refere-se à estrutura molecular do palmitato de fisetinidol (2). [10] A Figura 3 refere-se ao ensaio experimental que demonstra atividade analgésica do palmitato de fisetinidol. [11] A Figura 4 refere-se à avaliação da perda óssea alveolar do palmitato de fisetinidol.

Descrição detalhada da invenção

[12] A presente invenção trata-se de um processo de obtenção do composto palmitato de fisetinidol (2) que compreende as seguintes etapas: a) Dissolver (-)-fisetinidol (1) (30,3 mg; 0,11 mmol)em piridina (1,5 mL) e clorofórmio (2mL) à temperatura ambiente e adicionar cloreto de palmitoila (1 mL; 3,3 mmol)e 4,4-dimetilamino piridina (DMAP) em quantidades catalíticas;

Dados de RMN 13C do fisetinidol (1) (CD3OD, 75 MHz):  82,96 (C-2); 68,81(C-3); 33,10 (C-4); 131,28 (C-5); 109,47 (C-6); 157,84(C-7); 103,62 (C-8); 156,13(C- 9);112,58(C-10);132,24 (C-1’); 115,11 (C-2’); 146,22 (C-3’ e C-4’); 116,13(C-

5’);119,87(C-6’);Dados de RMN 1H do fisetinidol (CD3OD, 300 MHz):  4,64 (d, J = 7,2 Hz, H-2); 4,00 (dt, J= 7,6 e 5,2 Hz, H-3); 2,68 (dd, J = 15,7 e 8,0 Hz, H-3a);2,87 (dd, J = 15,7 e 5,0 Hz, H-3b); 6,86 (s, H-5); 6,34(dd; J = 8,2 e 2,4 Hz, H-6); 6,29 (d, J = 2,3 Hz, H-8);6,83 (d, J = 1,9 Hz, H-2’); 6,76 (d, J = 8,0 Hz, H-5’);6,71 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz, H-6’).

b) Manter a mistura reacional obtida na etapa (a) sob agitação magnética à temperatura ambiente por 19 horas, com monitoramento por cromatografia em camada delgada; c) Diluir a solução obtida na etapa (b) com diclorometano (20 mL), transferir a mesma para um funil de separação, lavar sucessivamente com solução saturada de sulfato de cobre (4 x 10 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (1 x 10 mL), secar com sulfato de sódio anidro; d) Remover o solvente do meio reacional obtido na etapa (c) em evaporador rotativo; e e) Purificar o produto reacional obtido em (d) por cromatografia em gel de sílica (44,33 g), utilizando-se uma mistura de hexano:acetato de etila (90:10), como eluente. [13] Adicionalmente é objeto da presente invenção o palmitato de fisetinidol (2)(46,0 mg; 0,0374 mmol; 35,4%). O rendimento do produto purificado palmitato de Fisetinidol (2) foi de 35,4% (46,0 mg). Dados de RMN 13C do palmitato de fisetinidol (2)(CDCl3, 75 MHz):  77,66 (C-2); 68,83 (C-3); 130,12 (C-5); 114,59 (C-6); 153,79 (C-7); 109,89 (C-8); 150,32 (C-9);116,44 (C-10); 136,60 (C-1’); 121,66 (C-2’); 142,11 (C-3’); 142,22 (C-4’); 123,62 (C-5’); 124,22(C-6’); 173,08 (C=O); 172,23 (C=O); 170,88 (C=O); 170,84(C=O); 34,42; 34,24; 34,07; 31,95; 29,73; 29,69; 29,63;29,52; 29,48; 29,39; 29,34; 29,29; 29,24; 29,20; 29,19;29,13; 29,01; 28,29; 24,99; 24,95; 24,92; 24,81; 22,71;14,12; Dados de RMN 1H do palmitato

de fisetinidol (2) (CDCl3, 300 MHz):  5,22 (d, J = 5,6 Hz, H-2); 5,34 (dd, J= 10,8 e 5,5, H-3); 3,06 (dd, J = 16,4 e 4,3 Hz, H-4 eq.);2,86 (s, H-5) dd, J = 16,4 e 6,0 Hz, H-4 ax.); 7,31 (s, H-5); 6,70 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz, H-6); 6,74 (sl, H-8); 7,28(d, J = 5,1 Hz, H-2’); 7,20 (d, J = 6,9 Hz, H-5’); 7,06 (d,J = 8,2 Hz, H-6’); 2,59-2,54 (m, 10H), 2,28 (t, J = 7,4 Hz, 3H), 1,81-1,73(m), 1,65-1,30 (m), 0,93 (t, J = 6,7 Hz).

[14] O composto N-[4-(4’-O-acetil-α-L-raminosiloxi)benzil]- 2-(piridinil-4- carbonil)hidrazina-1-carbotioamida (MC-D7) tem aplicação como analgésico. Exemplo de concretização Avaliação da atividade analgésica do Palmitato de Fisetinidol [15] Foi avaliada a atividade analgésica e a redução da perda óssea alveolar do palmitato de fisetinidol em modelo de hipernocicepção inflamtatória induzida por formalina na periodontite em ratos. [16] Foram utilizados ratos Wistar machos com massa corpórea entre 170 a 220 g provenientes do Biotério Central do Campus do Pici e do Biotério Setorial da UFC – Campus de Sobral. [17] Os animais foram mantidos em caixas de plástico com livre acesso à água e comida a uma temperatura média de 22

±2°C obedecendo a ciclos de claro-escuro de 12h. O experimento foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA - UFC Campus Sobral) (Protocolo número 12/15). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais assim como o número de animais utilizados em acordo com as diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL/COBEA) e normas internacionais (Guide for care and use of laboratory animals - NIH publication 85-23, revised 1985). [18] A periodontite experimental (PE) foi induzida como descrito anteriormente (BEZERRA et al., 2002). Resumidamente, os animais foram anestesiados com ketamina e xilazina (90:10 mg/kg, i.p.), e um fio de sutura de nylon esterilizado (3.0 Nylpoint, Ceará, Brasil) foi colocado em torno do segundo molar maxilar esquerdo. Para permitir a passagem do fio, foi utilizado um guia através dos espaços interproximais mesial e distal do 2º molar esquerdo do animal. Os grupos experimentais foram compostos por n=6. Aos 11 dias após a indução da periodontite, as maxilas foram removidas para análise morfométrica. Para a quantificação da reabsorção óssea as duas hemiarcadas foram montadas em blocos de cera de abelha e fotografadas em alta resolução. As imagens digitalizadas foram analisadas com software ImageJ® para a quantificação da perda óssea alveolar (LIMA et al., 2004). [19] Para avaliação do comportamento nociceptivo, salina (50µL) ou formalina 0,5% (50µL) foram aplicadas na região do lábio superior esquerdo do animal. O procedimento ocorreu entre 6:00 e as 16:00 em uma sala silenciosa mantida a 23 ± 2°C (Rosland, 1991). Os ratos foram colocados individualmente por 10 minutos em uma câmara de madeira espelhada (30 x 30 x 30 cm) com vidro na parte frontal para minimizar o estresse. Após anestesia com isoflurano (3%, 30s), cada animal recebeu 50 μL de formalina (0,5%), dissolvido em solução salina estéril, ou 50 μL de solução salina (0,9%) no lábio superior esquerdo. A injeção foi realizada com uma agulha de calibre 30 conectada a uma seringa de Hamilton de 50μL de acordo com o método descrito anteriormente (Clavelou et al., 1995). Após os ratos recuperarem a consciência, aproximadamente 30s, voltaram à câmara de teste para um período de

55 observação de 45 minutos. Um examinador treinado avaliou as respostas nociceptivas através do número total acumulado de segundos que o animal utilizou esfregando a região orofacial de forma assimétrica com a parte dianteira ou traseira ipsilateral e do número de levantadas de cabeça. Todos os testes usaram o estudo duplo-cego em que a pessoa que injetou as soluções não será a mesma pessoa que avaliou as respostas comportamentais (Luccarini et al., 2006). [20] Um primeiro grupo de animais passou pelo procedimento descrito acima e recebeu solução salina a 0,9% (1 mL/200 g de peso) via oral durante 11 dias e recebeu à injeção de solução salina a 0,9% (50 μL) no lábio superior esquerdo, correspondendo ao grupo salina utilizado como controle, representado em branco no gráfico da figura 3. [21] Um segundo grupo de animais passou pelo procedimento descrito acima e recebeu solução salina a 0,9% (1 mL/200 g de peso) via oral durante 11 dias e recebeu à injeção de formalina 0,5% (50 μL) no lábio superior esquerdo, representado em branco na segunda coluna no gráfico da figura 3, e foi nomeado como Grupo Salina+Formalina 0,5%. [22] Um terceiro grupo de animais passou pelo procedimento descrito acima, foram submetidos a DP e receberam solução salina a 0,9% (1 mL/200 g de peso) via oral durante 11 dias e injeção de formalina 0,5% (50 μL) no lábio superior esquerdo, representado em branco na terceira coluna no gráfico da figura 3, e foi nomeado como Grupo DP (Doença Periodontal+Formalina 0,5%). [23] Outros dois grupos de animais foram submetidos a DP e receberam cada grupo uma dose diferente de palmitato de fisetinidol durante 11 dias. Após esse período, receberem a injeção de Formalina do modo descrito acima. Foi administrado durante 11 dias palmitato de fisetinidol nas doses de 0,01 ou 0,1 mg/kg por via oral, em dois grupos de animais, respectivamente, representado nas colunas em preto no gráfico da figura 3. [24] Os grupos descritos acima foram submetidos a avaliação da perda óssea alveolar. As doses de palmitato de fisetinidol (0,01 ou 0,1 mg/kg, via oral), em dois grupos, respectivamente, estão representados nas colunas em preto no gráfico da

56 figura 4.

Ensaio de toxicidade subcrônica

[25] Foi realizado também ensaio de segurança do palmitato de fisetinidol para avaliar e mensurar se o composto apresentava alguma toxicidade, local ou sistêmica, assim como morbimortalidade.

[26] A toxicidade subcrônica (doses repetidas), que consistiu na administração dose de 0,01 ou 0,1 mg/kg palmitato de fisetinidol, (via oral), de acordo com o peso do animal, durante 14 dias consecutivos, no mesmo horário. A observação dos mesmos parâmetros comportamentais de morbimortalidade foi realizada, porém durante 15 minutos seguidos diariamente, subsequentemente à administração do palmitato de fisetinidol ou substância controle. Visando observar se houve alterações de comportamento que pudessem indicar morbidade e também mortalidade, a saber: piloereção, agressividade, sonolência, contorção abdominal, lambidas, cambalhotas, agitação, pulsão sexual, perda de peso e morte (VAL et al., 2014).

[27] No 15º dia os animais foram anestesiados com quetamina+xilasina e, em seguida, os animais foram eutanasiados. A fim de avaliar alterações não detectáveis a olho nu ou por meios laboratoriais naqueles animais que não apresentaram alterações comportamentais, foi realizada, após a eutanásia, a remoção do coração, fígado, baço e rim para a realização da análise microscópica por patologista, realizadas em microscópio óptico acoplado a um sistema de captura de imagens digitais. Os aumentos utilizados foram: 100x, para aspectos morfológicos gerais e 400x, para análise detalhada dos eventos histológicos, tanto celulares quanto na matriz extracelular (MEC), com análise cega de grupos experimentais (fármacos- teste), seguindo a norma ISO 10993-11. A Figura 5 mostra a taxa de sobrevida dos animais. O grupo 0,01 ou 0,1 mg/kg palmitato de fisetinidol e Salina (ambos) não apresentaram mortalidade nos animais.O palmitato de fisetinidol não apresentou nenhuma morte, o que significa este derivado pode ser considerado seguro para o uso em experimentos e possivelmente em humanos.Para saber se o uso do

57 palmitato de fisetinidol em repetidas poderia causar alterações no comportamento que possam estar relacionadas à taxa de mortalidade, as alterações comportamentais durantes os 14 dias foram avaliadas. A Tabela 1 mostra as alterações comportamentais. Os grupo 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol não apresentaram alterações comportamentais, de maneira semelhante ao grupo controle Salina. [27] Para corroborar com estes dados foi realizada a análise histopatológica de quatro órgãos, a saber: coração, baço, fígado e rim. [28] A Figura 6 mostra que nos órgãos animais dos grupos tratados com Salina e doses 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol não apresentaram sinais de toxicidade ou mortalidade. Os órgãos tiveram sua morfologia geral preservada. Coluna 1: estômagos dos grupos Salina e doses de 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol. Os parâmetros avaliados como edema, perda de células, lesão hemorrágica e infiltrado inflamatório não apresentaram alterações no grupo salina. A análise da mucosa gástrica dos animais tratado com as doses 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol apresentou discreta perda de células, contudo os outros parâmetros analisados não houve alterações significativas quando comparado ao animal não tratado (DP+FORMALINA), que apresentou significativa perda de células(círculo preto) e edema (círculo azul). Coluna 2: coração dos grupos salina e 0,01 ou 0,1 mg/kg de Palmitato de fisetinidol. No grupo salina, os cardiomiócitos apresentaram aspectos morfológicos dentro do padrão de normalidade. O grupo tratado com 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol apresentou poucas áreas hemorrágicas. Em relação aos grupos tratado com 0,1 ou 0,01 os parâmetros como presença de vasos congestos e tumefação celular encontraram-se dentro da normalidade. Coluna 3: fígado dos grupos salina e doses 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol. O grupo tratado com 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol apresentou poucos vasos congestos (setas azuis, quando houver). Porém, em relação à presença de áreas hemorrágicas e de tumefação celular, os grupos tratados com doses de 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol foram semelhantes ao grupo salina e não apresentaram alterações morfológicas. Coluna 4:

58 rim dos grupos Salina e doses 0,01 ou 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol. O grupo tratado com 0,01 mg/kg de palmitato de fisetinidol apresentou alguns vasos congestos. O grupo tratado com a dose de 0,1 mg/kg de palmitato de fisetinidol apresentou-se dentro do padrão morfológico de normalidade. [29] O quadro 1 refere-se às alterações comportamentais nos animais durante o ensaio de segurança. Alterações Salina (Nº de 0,01 mg/kg de 0,1 mg/kg de Comportamentais animais que palmitato de palmitato de apresentaram fisetinidol fisetinidol alterações) (Nº de (Nº de animais que animais que apresentaram apresentaram alterações) alterações)

Piloereção - - -

Agressividade - - -

Sonolência - - -

Contorção - - - Abdominal

Lambidas - - -

Cambalhotas - - -

Agitação - - -

Pulsão Sexual - -

Perda de Peso - -

Morte - -

REIVINDICAÇÕES [1] Processo de obtenção do palmitato de fisetinidol (2) caracterizado por compreender as etapas de: a) Dissolver (-)-fisetinidol (30,3 mg; 0,11 mmol)em piridina (1,5 mL) e clorofórmio (2 mL) à temperatura ambiente e adicionar cloreto de palmitoíla (1 mL; 3,3 mmol) e 4,4-dimetilamino piridina (DMAP) em quantidades catalíticas; b) Manter a mistura reacional obtida na etapa (a) sob agitação magnética à temperatura ambiente por 19 horas, com monitoramento por cromatografia em camada delgada; c) Diluir a solução obtida na etapa (b) com diclorometano (20 mL), transferir a mesma para um funil de separação, lavar sucessivamente com solução saturada de sulfato de cobre (4 x 10 mL) e solução saturada de cloreto de sódio (1 x 10 mL), secar com sulfato de sódio anidro; d) Remover o solvente do meio reacional obtido na etapa (c) em evaporador rotativo; e e) Purificar o produto reacional obtido em (d) por cromatografia em gel de sílica (44,33 g), utilizando-se uma mistura de hexano:acetato de etila (90:10), como eluente.

[2] Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o

13 fisetinidol (1) apresenta dados de RMN C (CD3OD, 75 MHz):  82,96 (C-2); 68,81(C- 3); 33,10 (C-4); 131,28 (C-5); 109,47 (C-6); 157,84(C-7); 103,62 (C-8); 156,13 (C-9); 112,58 (C-10); 132,24 (C-1’); 115,11 (C-2’); 146,22 (C-3’ e C-4’);

1 116,13 (C-5’); 119,87 (C-6’) e de RMN H (CD3OD, 300 MHz):  4,64 (d, J = 7,2 Hz, H-2); 4,00 (dt, J = 7,6 e 5,2 Hz, H-3); 2,68 (dd, J = 15,7 e 8,0 Hz, H-3a); 2,87 (dd, J = 15,7 e 5,0 Hz, H-3b); 6,86 (s, H-5); 6,34 (dd; J = 8,2 e 2,4 Hz, H-6); 6,29 (d, J =2,3 Hz, H-8); 6,83 (d, J = 1,9 Hz, H-2’); 6,76 (d, J = 8,0Hz, H-5’); 6,71 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz, H-6’).

[3] Composto caracterizado por ser obtido de acordo com o processo definido nas reivindicações 1 e 2 e ter a fórmula estrutural C79H134O9 [4] Composto, de acordo com a reivindicação 3 caracterizado

por denominado palmitato de fisetinidol (2).

[5] Composto, de acordo com as reivindicações 3 ou 4 caracterizado apresenta 13 dados espectroscópicos de RMN C)(CDCl3, 75 MHz):  77,66 (C-2); 68,83 (C-3); 130,12 (C- 5); 114,59 (C-6); 153,79 (C-7); 109,89 (C-8); 150,32 (C- 9);116,44 (C-10); 136,60 (C-1’); 121,66 (C-2’); 142,11 (C- 3’); 142,22 (C-4’); 123,62 (C-5’); 124,22 (C- 6’); 173,08 (C=O); 172,23 (C=O); 170,88 (C=O); 170,84 (C=O); 34,42; 34,24; 34,07; 31,95; 29,73; 29,69; 29,63; 29,52; 29,48; 29,39; 29,34; 29,29; 29,24; 29,20; 29,19; 1 29,13; 29,01; 28,29; 24,99; 24,95; 24,92; 24,81; 22,71; 14,12 e de RMN H (CDCl3, 300 MHz):  5,22 (d, J = 5,6 Hz, H-2); 5,34 (dd, J= 10,8 e 5,5, H-3); 3,06 (dd, J = 16,4 e 4,3 Hz, H-4 eq.);2,86 (s, H-5) dd, J = 16,4 e 6,0 Hz, H-4 ax.); 7,31 (s, H-5); 6,70 (dd, J = 8,2 e 1,8 Hz, H-6); 6,74 (sl, H-8); 7,28(d, J = 5,1 Hz, H-2’); 7,20 (d, J = 6,9 Hz, H-5’); 7,06 (d,J = 8,2 Hz, H-6’); 2,59-2,54 (m, 10H), 2,28 (t, J = 7,4 Hz,3H), 1,81-1,73 (m), 1,65-1,30 (m), 0,93 (t, J = 6,7 Hz). [6] Uso do composto conforme definido nas reivindicações 3 a 5 caracterizado por ser para tratar algia. [7] Composto caracterizado por compreender a fórmula estrutural

C79H142O9

[8] Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser para tratar algia.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

64 Salina

0,01 mg/kg e 0,01 mg/kg Palmitato de

Fisetinidol

Figura 5

Figura 6

1/1

RESUMO

PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO PALMITATO DE FISETINIDOL E SEU USO COMO AGENTE ANALGÉSICO E ANTIRREABSORTIVO A presente invenção se insere no campo da química, particularmente aplicada à área de síntese orgânica, e descreve processo de obtenção do palmitato de fisetinidol (2) e seu uso como agente analgésico e antirreabsortivo.

SIAFI2018-DOCUMENTO-CONSULTA-CONGRU (CONSULTA GUIA DE RECOLHIMENTO DA UNIAO 08/11/18 14:27 M17162JO USUARIO : RUTH DATA EMISSAO : 31Out18 TIPO : 1 - PAGAMENTO NUMERO : 2018GR800240 UG/GESTAO EMITENTE : 153045 / 15224 - UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARA UG/GESTAO FAVORECIDA : 183038 / 18801 - INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDU RECOLHEDOR : 153045 GESTAO : 15224 CODIGO RECOLHIMENTO : 72200 - 6 COMPETENCIA: OUT18 VENCIMENTO: 01Nov18 DOC. ORIGEM: 153045 / 15224 / 2018NP002813 PROCESSO : 52753/2018-69 RECURSO : 1 (=)VALOR DOCUMENTO:70,00 DESCONTO/ABATIMENTO: (- )OUTR AS DEDU COES : (+)MORA/MULTA : (+)JUR OS/EN CARG OS : (+)OUTROS ACRESCIMOS : (=)VALOR TOTAL : 70,00 NOSSO NUMERO/NUMERO REFERENCIA : 00029409161811403157 CODIGO DE BARRAS : 89610000000 0 70000001010 3 95523127220 9 00360640000 4 OBSERVACAO Valor ref a patentes ref a nosso numero 29409161811403157 conf processo 52753/ 2018-69. LANCADO POR : 67265740378 - ATILA UG : 153045 31Out2018 14:15 PF1=AJUDA PF3=SAI PF2=DADOS ORC/FIN PF4=ESPELHO PF12=RETORNA

Petição 870180151694, de 14/11/2018, pág. 66/33

7 CAPÍTULO II

The semi-synthetic molecule (-)-fisetinidol palmitate from Bauhinia pulchella reduces inflammatory osteolysis in a ligature-induced periodontits in rats

Artigo será submetido ao periodico INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES (Qualis A2 em Biotecnologia/ Fator de Impacto 3.671)

The semi-synthetic molecule (-)-fisetinidol palmitate from Bauhinia pulchella reduces inflammatory osteolysis in a ligature-induced periodontits in rats

Isabela R. Pinto1, Hellíada V. Chaves2, Jordânia M. O. Freire1, Luzia Herminia T. de Sousa1; Dina A. M. Monteiro3, José Jackson do N. Costa4, Karuza M. A. Pereira5, Gilvandete Maria P. Santiago6, Leôncio M. de Sousa6, Marcos Reinaldo da Silva6, Aurélio de O. Monteiro6, Raquel de C. Montenegro7, Maria Elisabete A. de Moraes7, Vicente de Paulo T. Pinto3, Mirna M. Bezerra3,7*

1 Northeast Biotechnology Network – Ph.D. Program, Federal University of Ceará, Brazil. 2 School of Dentistry, Federal University of Ceará, Sobral, Ceará, Brazil. 3 School of Medicine, Federal University of Ceará, Sobral, Ceará, Brazil.

4 School of Medicine, University Center INTA – UNINTA, Sobral, Ceará, Brazil. 5 Department of Morphology, School of Medicine, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil. 6 Postgraduate Program in Chemistry, Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil. 7 Drug Research and Development Center (NPDM), Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.

*Corresponding author: Mirna Marques Bezerra ([email protected])

ABSTRACT

Periodontitis is an infectious inflammatory disease, which has alveolar bone loss as a hallmark, culminating in tooth loss. A growing body of research suggests that the host immune and inflammatory response to the microbial challenge can lead to the generation of inflammatory mediators (cytokines, nitric oxide, and reactive oxygen species) shifting the homeostatic balance of bone formation and resorption in favour of bone loss. Many species of the Bauhinia genus have been widely used in folk medicine as analgesic, anti-inflammatory and antioxidant. Several classes of compounds have been isolated from Bauhinia species, especially flavonoids. (-)-Fisetinidol palmitate is a semi-syntetic derived of Fisetinidol, a flavonoid of the class of flavan-3-ol, which was obtained from the ethanolic extract of the stem of Bauhinia pulchella. Therefore, this study aimed to evaluate the efficacy of (-)- fisetinidol palmitate on inflammatory osteolysis in the ligature-induced periodontits in Wistar rats. Also, it was evaluated the effects of (-)-fisetinidol palmitate on inflammation, oxidative stress and safety in this animal model. Periodontitis was induced via a nylon thread ligature (3.0) around the second upper left molars. Rats were treated (per os) once a day during 11 days with (-)-fisetinidol palmitate (0.01 or 0.1 mg/kg) or saline vehicle. At the 11th day, rats were terminally anesthetized and the maxillae were excised for morphometric analysis (ImageJ® software). The gingival tissue were collected to quantify IL-1β and IL-8/CINC-1 by ELISA; nitrite/nitrate levels, myeloperoxidase (MPO), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity by spectrophotometric assay; IL1-β, IL-6, RANK/RANK-L, and OPG by qRT-PCR. In addition, at 11th day samples from peripheral blood were collected to evaluate the levels of total alkaline phosphatase (TALP), bone alkaline phosphatase (BALP), transaminases (AST, ALT), and creatinine. Data were analyzed using ANOVA followed by Tukey or Games-Howell or by Kruskall-Wallis test followed by Dunn's test (P <0.05), when appropriate. (-)-Fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) reduced alveolar bone loss. (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) increased BALP, SOD and CAT activity; also, it decreased IL1-β, IL- 8/CINC-1, nitrite/nitrate levels and MPO activity. (-)-Fisetinidol palmitate was also able to reduce the gene expression of IL1-β, IL-6, RANK, and RANK-L, and increased the expression of OPG. No statistical differences (P> 0.05) were observed in the ALT, AST and FAT levels among groups. These data suggest that (-)-fisetinidol palmitate had anti-resorptive effects in a pre-clinical trial of periodontitis in rats. KEY-WORDS: Periodontitis. Bauhinia pulchella. Flavonoids. Bone resorption. Oxidative Stress. Cytokines.

INTRODUCTION

Periodontitis is an infectious inflammatory disease, which has alveolar bone loss as a hallmark, culminating in tooth loss (RODRÍGUEZ-LOZANO et al., 2019). It is qualified as a major public health problem due to its high prevalence and incidence in all regions of the world (ALBANDAR, 1992). Although the pathophysiology of periodontitis is still not completely elucidated, a growing body of research suggests that the host immune and inflammatory response to the microbial challenge can lead to the overprduction of inflammatory mediators (cytokines, nitric oxide, and reactive oxygen species) shifting the homeostatic balance of bone formation and resorption in favour of bone loss (LING et al., 2016; TEIXEIRA et al., 2017; RIBEIRO et al., 2018). Thus, considering the complex etiopathology of periodontitis several approaches have been used for its treatment, which includes mechanical therapy, surgical intervention, and chemotherapeutic agents, such as: antibiotics and host response modulating agents (non- steroidal anti-inflammatory drugs and anti-resorptive agents) which may reduce excessive levels of inflammatory mediators and osteoclast activity (KRAYER et al., 2010; SLOTS, 2017). Although these pharmacological agents may benefit select patient groups, its utility for periodontitis remains unresolved because of the unclear risk-benefit ratio. Thus, in an attempt to overcome these controversies, the investigation for newer and safer therapeutic agents continues. Phytochemicals isolated from plants are considered good alternatives to pharmacology study. Bauhinia pulchella (genus Bauhinia and family Fabaceae- Caesalpinioideae) is widely distributed in Brazil, popularly known as “pata-de-vaca” and it has been used in folk medicine as an anti-inflammatory agent. Several classes of compounds have been isolated from Bauhinia species especially flavonoids (CECHINEL FILHO, 1998). Particularly, our research group synthesized a semi-syntetic derived, (-)-fisetinidol palmitate, from a flavonoid (Fisetinidol) obtained from the ethanolic extract of the stalk of the Bauhinia pulchella. Therefore, this study aimed to evaluate the efficacy of the semi-syntetic (-)- fisetinidol palmitate on bone loss in the ligature-induced periodontits in Wistar rats. Also, it was investigated the putative mechanism of action of (-)-fisetinidol palmitate in this rat model. Further, a systemic evaluation of the sub-chronic toxicity of (-)-fisetinidol palmitate was also performed.

MATERIAL E METHODS

Plant material The stem of the species Bauhinia pulchella Benth. were colleted in May 2013, in the São Benedito city, Ceará state, Brazil. The geographic coordinates are 4º 4’54’’ S, 40º 50’ 21” O. A voucher specimen has been identified by Prof. Edson Pereira Nunes (Federal University of Ceara) and deposited in the Prisco Bezerra Herbarium of Federal University of Ceara, with the number 54266. (CARVALHO, 2014).

Extraction and isolation of (-)-fisetinidol Air-dried and finely powdered stalk (3.6 Kg) was extracted with EtOH (4 x 12 L) at room temperature for 48 h each time. The ethanol solution was concentrated under reduced pressure to yield the EtOH extract (368.3 g). A portion of EtOH extract (100.6 g) was dissolved in a mixture of MeOH:H2O (1:1 v/v) and extracted with EtOAc (4 x 300 mL) to give a dark residue (36.7 g). Part of EtOAc-soluble fraction (34.7 g) was subjected to silica gel column chromatography eluted with n-hexane, n-hexane/EtOAc (9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 1:1, 3:7), EtOAc, EtOAc/MeOH (9:1) and MeOH to yield 43 fractions (100 ml each), which after TLC analysis were combined into 31 fractions (F1-F31). A precipitate (4.0 g) was obtained from the fraction F9 (EtOAc) and characterized as fisetinidol (1).

Acylation of (-)-fisetinidol (-)-Fisetinidol (30.3 mg, 0.11 mmol) was placed in a round-bottomed flask equipped with a magnetic stirrer. Palmitoyl chloride (1 mL, 3.3 mmol), 4-N,N-dimethylamino pyridine (2.68 mg, 0.022 mmol), pyridine (1.5 mL) and chloroform (2 mL) were added to the flask. The mixture was magnetically stirred at room temperature for 19 h. After the completion of the reaction, CH2Cl2 was added, and the mixture was washed with saturated CuSO4 solution and then with saturated NaCl solution. The organic phase was separated, dried over Na2SO4, and concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by silica gel column chromatography eluted with n-hexane/EtOAc (9:1) to give (-)-fisetinidol palmitate (2) (46.0 mg, 0.0374 mmol, 35.4% yield). Animals

Wistar rats (180-240 g), provided by the Animal Care Unit of the Federal University of Ceará (UFC - Fortaleza, Brazil), were randomly housed in appropriate plastic

cages at 23 ± 2 °C with a 12-hours light-dark cycle (light from 06:00 AM to 6:00 PM), and had access to water and food ad libitum. Rats were allocated in groups of six animals and handled with special care to avoid environmental disturbances. The study was conduct in accordance with the guidelines from the Brazilian Society of Laboratory Animal Science (SBCAL). Institutional Animal Care and Use Committee at School of Medicine, Federal University of Ceará, Sobral, Ceará, Brazil, approved all the experiments under the registration number 12/2015.

Induced Periodontits Periodontitis-challenge was performed as previously described (BEZERRA et al., 2002). Briefly, the rats were anesthetized with ketamine:xylazine (90:10 mg/kg; i.p.) and a sterilized nylon suture thread (3.0 Nylpoint, Ceará, Brazil) was placed around the cervix of the second left maxillary molar. Thus, the rats were divided into the following groups: non- ligated (naive - animals not subjected to periodontitis); ligature + vehicle (saline); and ligature + (-)-fisetinidol palmitate (0.01 or 0.1 mg/kg). Groups received (per os) vehicle or (-)- fisetinidol palmitate 1 hour before periodontitis induction and once a day during 11 days.

Measurement of Alveolar Bone Loss

After 11 days of periodontitis-challenge, the maxillae were excised and fixed in 10% buffered formalin for 24 hours. Then, both maxillary halves were defleshed and kept in 8% sodium hypochlorite during 4 hours (PIMENTEL et al., 2012). After that, the specimens were washed in running water and stained with methylene blue (1%) to differentiate bone from teeth, fixed in a piece of wax with their occlusal planes parallel to the ground and long axes perpendicular to the camera and photographed with a 6.1-megapixel digital camera (Canon® 60D). Digital images were processed with ImageJ® software for measurement of ABL as described previously (KUHR et al., 2004). The buccal area (mm2) corresponding to the exposed roots of the molars were calculated and subtracted from the correspondent area (mm2) of the normal group.

Plasma Bone Alkaline Phosphatase (BALP)

Blood samples were collected from the retro-orbital plexus under anesthesia with a mixture of ketamine and xylazine (90:10 mg/kg; i.p.) on the 11th day in order to obtain plasma concentration of alkaline phosphatase using the thermo-activation method, as

previously described (WHITBY; MOSS, 1975). The samples were heated up to 56°C for 10 minutes. Serum levels of BALP (a thermosensitive isoform of the total alkaline phosphatase, TALP) were calculated by subtracting the concentration of the heated alkaline phosphatase in serum from the concentration of TALP in serum. The analysis was performed according to the manufacturer’s instructions (Labest, Lagoa Santa, MG, Brazil).

MPO activity MPO activity was analyzed in gingival tissues collected at 6th hour of periodontitis- challenge, as described by Bradley et al. (1982). The results were expressed as MPO activity/mg tissue.

Cytokines dosage IL-1β and IL-8/CINC-1 levels were evaluated in gingival samples using commercial kits DuoSet ELISA (R&D Systems Inc., MN, USA) using respective standard curves. All kits were used according manufacturer’s instructions. Results were shown as picogram/ml (pg/ml). qRT-PCR Analysis of IL-1β,IL-6, RANK, RANK-L e OPG Total RNA was extracted from gingivae tissues using the TRIzol reagent (Invitrogen, São Paulo, Brazil). The RNA concentration was estimated by reading the absorbance at 260 nm and was checked for purity at 280 nm in a spectrophotometer (Amersham Biosciences, Cambridge, England). For each sample, the RNA concentrations used to synthesize cDNA were adjusted to 1,000 ng/mL. Before the reverse transcription reaction, samples of RNA were incubated for 5 min at 70 ◦C and then cooled in ice. The reverse transcription was performed in a total volume of 20μL composed of 10μL of sample RNA, 4μL reverse transcriptase buffer (Invitrogen), 8 units RNAsin, 150units of reverse transcriptase Superscript III, 0.036U randomprimers, 10 mM DTT and 0.5 mM of each dNTP (Invitrogen). The mixture was incubated at 42◦C for 1 h, subsequently at 80◦C for 5 min and finally stored at −20◦C. The negative control was prepared under the same conditions but without addition of reverse transcriptase. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed in triplicate to determine the gingival levels of mRNA for IL-1β, IL-6, RANK, RANK-L and OPG. Each reaction contained 10μL of SYBR©Green Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 7.3μL of ultra-pure water, 1μL of cDNA and 0.5μM of each primer and was performed in StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems,

Warrington, UK) thermocycler. The thermal cycling profile for the first round of qRT-PCR was initial denaturation and activation of the polymerase for 10 min at 95◦C, followed by 40 cycles of 15s at 95◦C, 30 s at 58◦C, and 30 s at 72◦C. The final extension was for 10 min at 72◦C. The primers were designed by using the PrimerQuestR© Tool ttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index. The primers used in this study are shown in Table 1. The glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as endogenous control for normalization of messenger RNA expression. The specificity of each primer pair was confirmed by melting curve analysis of qRT-PCR products. Relative quantifications of mRNA were carried out using the comparative threshold (CT) cycle method. The delta-delta- Ct method was used to transform the Ct values into normalized relative expression levels (Livak and Schmittgen, 2001).

Table 1. Description of biomarkers, gene, primer sequences and NCBI accession numbers.

Biomarkers Gene Primer sequence (5’-3’) NCBI

IL-1β S-TGCTGTCTGACCCATGTGAG/ A-CCAAGGCCACAGGGATTTTG NM_031512.2

IL-6 S- CATTCTGTCTCGAGCCCACC/ A- GCAACTGGCTGGAAGTCTCT NM_012589.2

Bone makers RANK S-AGGGAAAACGCTGACAGCTAA /A-CCAACACAATGGTCCCCTGA NM_001271235.1

RANK-L S- GCCAACCGAGACTACGGCAA / A- GAACATGAAGCGGGAGGCG NM_057149.1

OPG S- CCTAGAGAGAAATGTCGTAGGA/ A- CATTCCACACTGGAAACCTGA NM_012870.2

Reference gene GAPDH S-GGACCAGGTTGTCTCCTGTG A-CATTGAGAGCAATGCCAGCC NM_017008.4

SOD and CAT assessment Superoxide dismutase (SOD) and Catalase (CAT) were performed to analyzed oxidative stress. SOD activity was assayed as described previously (BEAUCHAMP,

FRIDOVICH, 1971). CAT activity has as principle the measurement of O2 production rate and

H2O in proportion of H2O2 (MAEHLY, CHANCE, 1954). The SOD concentration was expressed as µSOD/µg protein. CAT activity was estimated according methods described previously by Maehly and Chance (1954).

NO production Samples of gingival tissue were collected and stored at -80º C. For total nitrite/nitrate dosage analysis, it was performed by Griess reaction (DING et al., 1988). The

results obtained were compared with those obtained for standard curve and expressed in NOx (μM).

Subchronic Toxicity Evaluation

Body mass, organ weight alteration and biochemical and histopathological parameters were evaluated in animals treated once a day during 11 days with a single dose of (-)-fisetinidol palmitate. Peripheral blood samples were collected in order to obtain biochemical analysis (aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) levels and creatinine (Katal Biotechnology Industry and Trade LTDA, Belo Horizonte, MG, Brazil). Rats were terminally anesthetized and liver, kidney, heart, and stomac were removed for histopathological analysis (H&E).

Statistical analysis All data were normalized using the Shapiro-Wilk normality test. Results were showed as mean±standard error (SEM) or as median, when appropriate. ANOVA followed by the Tukey test or Games-Howell test were used to compare the means and the Kruskal-Wallis and Dunn tests were used to compare the medians. P <0.05 was considered significant. Analyzes were performed using IBM SPSS Statistics for Windows, Version 20.0. Software Armonk, NY or GraphPad Prism 6, San Diego, CA, USA.

RESULTS

Effect of (-)-fisetinidol palmitate on alveolar bone loss

The animals pretreated with 0.1 mg/kg of (-)-fisetinidol palmitate revealed a significant decrease on alveolar bone loss (1.17±0.38), when compared with unchallenged group (3.35±0.18). In addition, periodontitis-challenged group caused a significant decrease in BALP serum concentrations (30.41±1.69 U/L), which was prevented by (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) (115.56±6.89) (Figure 1 A-B).

Effect of (-)-fisetinidol palmitate on MPO activity A subset of rats was euthanized at the 6th hour for analysis of MPO activity, where it was found a significant increase in MPO activity, when compared to naive group. (-)-

Fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) decreased MPO acivity, when compared with to untreated group (Figure 2).

Effects of (-)-fisetinidol palmitate on cytokines on Gingival levels Periodontits-challenge group was associated with a significant (P<0.05) increase in IL- 1 and IL-8/CINC-1 levels (P<0.05), when compared to the naive group (Figure 3 A-B). On the other hand, (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) reduced the levels of both proinflammatory cytokines.

Effects of (-)-fisetinidol palmitate on mRNA expression (-)-Fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) treatment reduced mRNA expression of IL-1β (P<0.036), IL-6 (P<0.036), RANK (P<0.036), RANK-L (P<0.036), and OPG (P<0.036), when compared to periodontitis-challenged group (Figure 4 A-E).

Effect of (-)-fisetinidol palmitate on markers of oxidative stress and NO production Periodontitis-challenged group showed a significant decrease on both SOD and CAT levels, compared with naive group. In addition, it was observed a significant increase in nitrite/nitrate levels. Administration of (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) increased SOD and CAT (1.83±0.21 µSOD/µprotein and 103±6.16 µM/min/mg of protein, respectively) levels, while it reduced nitrite/nitrate levels (50.59±2.27 µM), compared with periodontitis- challenged group (1.06±0.23, 69.73±8.22 and 109.76±14.06; respectively) (Figure 5 A-C).

Evaluation of (-)-fisetinidol palmitate toxicity During the 11 days of treatment with (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) animals did not show any signs of toxicity or mortality. The serum levels of Total Alkaline Phosphatase (FAT), creatinine, as well as serum levels of liver enzymes (AST and ALT) were unchanged, when compared to untreated animals (Table 2). The histopathological analysis of the liver from animals treated with (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) depicted reversible and harmless change, including: discreet congestive vessel, when compared to the vehicle treated group. The heart, kidney and gastric mucosa of the animals did not show any histopathological changes (Figure 6).

DISCUSSION The most important findings of this work can be demonstrated through the anti- inflammatory and anti-resorptive effect of (-)-fisetinidol palmitate in a ligature-induced model of periodontitis in rats. This study indicates that (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) reduced alveolar bone tissue destruction and increased bone-specific alkaline phosphatase (BALP) activity, an isoenzyme measured as biochemical marker of bone formation. Additionally, (-)- fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) reduced MPO activity, IL1-β and IL-8/CINC-1 gingival levels, and transcription of IL-6, RANK, RANKL genes and increased OPG gene. Also, (-)- fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) had higher level of circulating SOD and CAT activity and reduced nitrite/nitrate levels, showning a strong antioxidant effect. The pharmacological activities of Bauhinia species have been investigated in studies and therewere demonstrations of analgesic, diuretic and astringent activities (SHANG 2009); antioxidant and cytotoxic (ADEROGBA et al., 2007); antimutagenic activity (REID et al., 2006); anti-inflammatory (RAO et al., 2008) and modulating the immune response (GHAISAS et al., 2009). Phytochemical and pharmacological studies carried out with Bauhinia pulchella indicate that it is composed of steroid glycosides, triterpenes, lactones and, mainly, flavonoids, thus being potential to new bioactive products (CECHINEL FILHO, 1988). The bone-specific alkaline phosphatase (BALP), isoform of total alkaline phosphatase (TALP), has been associated in bone formation and osteoblastic activity (SOUSA et al., 2016). In the present study, the increase of BALP serum levels was observed after (-)- fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) -treated rats, suggesting that (-)-fisetinidol palmitate prevent bone resorption. The hallmark of periodontitis is the exacerbated inflammatory response, which, in turn, is caused by a synergistic and symbiotic microbial community in periodontal tissue, leading to bone breakdown (SILVA et al., 2015). The inflammatory immune responses, which result in the activation of cytokines, for instance, interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-6, stimulating the osteoclastogenesis induction by influence of the production the Receptor Activator of Nuclear Factor κ B Ligand (RANK-L) (KAYAL, 2013). In this study, (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) decreased IL1-β, and IL-8/CINC-1 gingival levels and transcription of IL-1 β, IL-6 and RANK, RANK-L genes and elevated OPG gene, which suggests that the anti-inflammatory and anti-resorptive effect of (-)-fisetinidol palmitate (0.1 mg/kg) is related with the envolviment of pro-inflammatory cytokines levels.

The oxidative stress plays a key role in the inflammatory process, it seems interesting in physiopathology of periodontitis (CHAPPLE, 2007). The neutrophils busy the periodontal tissue and promoves production of reactive oxygen species (ROS) by proteolytic enzymes (D’ AIUTO, 2010). Antioxidants enzimes are produced by organism of defense to neutralize the excess of ROS (PALWANKAR, 2015). A study by Ellis et al. (1998) showed that SOD and CAT activities were evaluated in human periodontal tissue and these activities were found to be reduced with the progression of periodontal pocket formation. Our group demonstrated the antioxidant effect of natural product from Stemodia maritima L. was associated with boost antioxidant activities (SOD and CAT) (TEXEIRA et al., 2017). All the above studies indicated that there is a relationship between enzymatic antioxidant activities and periodontitis. In the present study, periodontitis-challenged group showed a significant reduction in both SOD and CAT levels, when compared to naive group. Nonetheless, (-)- fisetinidol palmitate exhibited a positive relationship with both enzimes antioxidants, reestablishing SOD and CAT. The two different biological actions of NO has been reported during inflammatory (LEE, 2000; LEITAO et al., 2005). In line with this study, the authors suggested that NO plays an important role in the destruction of periodontal tissues (SUNDAR et al., 2013). In contrast, others studies have demonstraded that NO donors usually limit inflammation and reduced bone loss during the periodontits in rat models (MARTINS et al.,2016). Here we demonstrated that periodontitis-challenged rats showed an increase in nitrite/nitrate levels, and rats treated with (-)-fisetinidol palmitate showed reduced amounts of NO. The interest in natural products research has been expanding, and inclusion of the efficacy and toxicity studies these products is very encouraged (VAL et al., 2014; VARELA- LÓPEZ et al., 2015). In our study, the biochemical and histopathological analysis showed no signs of toxicity. The (-)-fisetinidol palmitate reduces inflammatory response related to periodontitis, such as bone tissue destruction, pro-inflammatory cytokines, and oxidative stress. Our results strongly suggest that this metabolite natural product-based may balances molecules activies involved in inflammatory imune process observed in periodontitis. In this sense, the (-)- fisetinidol palmitate is able to provide resources for indication in periodontal therapy, being promising for the oral health industry.

Acknowledgments The authors thank Nayara Alves de Sousa, Anderson Weiny Barbalho Silva and Alana Nogueira Godinho for excellent technical support. This work was supported by CNPq or FUNCAP, Brazilian Agencies. The other authors declare no potential conflicts of interest with respect to the authorship and/or publication of this article.

REFERENCES

Aderogba M A et al. Antioxidant activity and cytotoxicity study of the flavonol glycosides from Bauhinia galpinii. Natural Product Research 2007;21: 591-599.

Albandar JM, Goldstein H. Multilevel statistical models in studies of periodontal diseases. J Periodontol 1992; 63:690-695.

Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Anal Biochem. 1971; 44:276-287.

Bezerra MM, Brito GAC, Ribeiro RA, Rocha FAC. Low-dose doxycycline prevents inflammatory bone resorption in rats. Brazilian J Med Biol Res. 2002;35: 613–616. doi:10.1590/S0100-879X2002000500015.

Cechinel Filho V;Yunes R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais: conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Quím. Nova 1998; 21:99-105.

Chapple, I.L and MATTHEWS, JB.The role of reactive oxygen and antioxidant species in periodontal tissue destruction. Periodontol. 2000 2007;.43:160-232.

D’ Aiuto F, nibali L, et al. Oxidative stress, systemic inflammation, and severe periodontitis. J. Dent. Res. 2010; 89:1241-1246.

Ding AH, Nathan CF, Stuehr DJ. Release of reactive nitrogen intermediates and reactive oxygen intermediates from mouse peritoneal macrophages. Comparison of activating cytokines and evidence for independent production. J Immunol. 1988; 141:2407–2412.

Ellis S D, Tucci M A, Serio F G., Johnson R. B. Factors for progression of periodontal diseases. J. Oral Pathol. Med. 1998; 27: 101–105.doi: 10.1111/j.1600-0714.1998.tb01923.

Ghaisas M M; Saikh AS; Deshpande AD Evaluation of immunomodulatory activity of methanolic extract of stem bark of Bauhinia variegata Linn. International Journal of Green Pharmacy 2009; 3: 70-74.

Kayal R A. The Role of Osteoimmunology in Periodontal Disease. Biomed Res Int 2013;2013:639368

Krayer JW1, Leite RS, Kirkwood KL. Non-surgical chemotherapeutic treatment strategies for the management of periodontal diseases. Dent Clin North Am. 2010;54(1):13-33.

Kuhr A, Popa-Wagner A, Schmoll H, Schwahn C, Kocher T. Observations on experimental marginal periodontitis in rats. J. Periodontal. 2004; 39: 101–106.

Leitão, R.F.C. et al. Locally applied isosorbid decreases bone resorption in experimental periodontistis in rats. Journal of Periodontology,2005; v.75, n.9, p.1227-32.

Lee C, Miura K, Liu X, Zweier J L. Biphasic regulation of leukocyte superoxide generation by nitric oxide and peroxynitrite. J. BIO. CHEM 2000; 275:38965-38972.

Ling M R., Chapple I L, Matthews J B. Neutrophil superoxide release and plasma C-reactive protein levels pre- and post-periodontal therapy.J. Clin. Periodontol. 2016; 43: 652–658. doi: 10.1111/jcpe.125.

Lozano B. R, González-Febles J , Garnier-Rodríguez J L et al. Association between severity of periodontitis and clinical activity in rheumatoid arthritis patients: a case-control study. Arthritis Res Ther.2019; 1:21-27.

Maehly AC, Chance B. The assay of catalases and peroxidases. Methods Biochem 1954; 1:357–424.

Palwankar P, Rana M, Arora K, and Deepthy, C Evaluation of non-surgical therapy on glutathione levels in chronic periodontitis. Eur j. Dent. 2015;. 9: 415-422.

Pimentel S. P. et al. Protective effect of topical Cordia verbenacea in a rat periodontitis model: immune-inflammatory, antibacterial and morphometric assays. BMC complementary and alternative medicine 2012; v. 12, p. 224,.

Rao YK, Fang SH; Tzeng YM.Anti-inflamatory activities of flavonoids and a triterpene caffeate isolated from Bauhinia variegata. Phytotherapy Research 2008;22: 957-962.

Reid K A et al. Evaluation of the mutagenic and antimutagenic effects of South African plants. Journal of Ethnopharmacology 2006;106: 44-50.

Ribeiro D S F. et al. Tocoyena sellowiana extract decreases bone loss in an experimental model of periodontitis in rats: Putative role for cyclooxygenase-2 and IL-1β inhibition. Biomedicine & Pharmacotherapy 2018; 98: 863-872.

Rodríguez-Lozano, B. et al.Association between severity of periodontitis and clinical activity in rheumatoid arthritis patients: a case-control study. Arthritis Res Ther. 2019 Jan 18;21(1):27.

Shang XY; Liu W; Zhao CW,. Advances in research of chemical constituents and pharmacological activities of Bauhinia. Zhonqquo Zhong Yao Za Zhi 2009;33: 709-717.

Slots J. Periodontitis: facts, fallacies and the future. Periodontol 2000. 2017 Oct;75(1):7-23.

Silva N, Abusleme L, Bravo D, et al. Host response mechanisms in periodontal diseases. J Appl Oral Sci 2015;23:329-55.

Sousa LH, Linhares EV, Alexandre JT, Lisboa MR, et al. Effects of Atorvastatin on Periodontitis of Rats Subjected to Glucocorticoid-Induced Osteoporosis. J Periodontol. 2016 Oct;87(10):1206-16.

Teixeira A.H. et al.Stemodia maritima L. Extract Decreases Inflammation, Oxidative Stress, and Alveolar Bone Loss in an Experimental Periodontitis Rat Model.Front Physiol. 2017; 8: 988.

Val D R, et al. Tephrosia toxicaria Pers. Reduces temporomandibular joint inflammatory hypernociception: the involvement of the HO-1 pathway. Eur. J. Pain 2014,18: 1280–1289.

Varela-López A, et al. Non-nutrient, naturally occurring phenolic compounds with antioxidant activity for the prevention and treatment of periodontal diseases. Antioxidants. 2015; 4:447–481.

Whitby, L. G.; Moss, D. W. Analysis of heat inactivation curves of alkaline phosphatase isoenzymes in serum. Clinica Chimica Acta, 1975, v 59, n. 3, p. 361–367.

FIGURES

A B

200 4 * ** 150 3

100 2 ** BALP (U/L) BALP 50 * 1

0 0 Naive NT 0.1 Salina NT 0.01 0.1

Alveolar Bone Loss Area (mm²) Area Loss Bone Alveolar (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) Periodontitis Periodontitis

Figure 1A. Morphometric analysis in rats proposed to experimental periodontitis and treated with (-)-fisetinidol palmitate. Naive: animals without periodontitis; NT: group submitted to periodontitis and treated with solution saline. (-)-fisetinidol palmitate: rats submitted to periodontitis and treated with (-)-fisetinidol palmitate (0.01 or 0.1 mg/ kg), respectively. Data are shown as mean ± SEM (n=6 for each treatment). *p< 0.00005 versus naive; **p< 0.001versus NT (ANOVA; Games-Howell). 1B. Effect of (-)-fisetinidol palmitate on the dosage of bone alkaline phosphatase in normal rats or submitted to experimental periodontitis. Data represent the mean ± SEM of six animals for each group. *p<0.0005 versus naive; **p<0.0005 versus NT, (ANOVA; Games-Howell).

20 * 15 ** 10

UnMPO/50 5

0 Naive NT 0.1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/ kg) Periodontitis

Figure 2. Effect of (-)-fisetinidol palmitate (0.1mg/kg) on the activity of the enzyme myeloperoxidase (MPO) in gingiva of rats submitted to periodontitis. *p< 0.00005 versus naive; **p< 0.01 versus NT, (ANOVA; Tukey).

A B

1500 1000 *

800 1000 * 600

(pg/mL) **

 400 500

IL-8 (pg/mL) IL-8

IL-1 ** 200

0 0 Naive NT 0.1 Naive NT 0.1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) Periodontitis Periodontitis

Figure 3A. 3B. Effect of (-)-fisetinidol palmitate on the levels of pro-inflammatory cytokines.* p <0.05 versus naïve; ** p <0.05 versus NT. (ANOVA; Bonferroni, respectively).

A B

300 200

150 200

100 100

(Reative Expression) (Reative 50 *  *

IL-6 (Reative Expression) (Reative IL-6

IL-1 0 0 Naive NT 0.1 Naive NT 0,1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg)

PeriodontitisC Periodontitis

C D

50 8

40 6

30 * 4 20 * 2 10

0 0

RANK (Reactive Expression) (Reactive RANK

RANK-L (Reactive Expression) (Reactive RANK-L Naive NT 0.1 Naive NT 0.1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg)

Periodontitis Periodontitis E

8 *

OPG (Reactive Expression) OPG (Reactive 0 Naive NT 0.1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg)

Periodontitis

Figure 4 A-E. Effect of (-)-fisetinidol palmitate (0.1mg/kg) on the gene expression of IL1- β, IL-6, RANK, RANK-L and OPG in the gingival tissues of rats submitted to periodontitis. *p< 0.0036 versus NT (ANOVA; Kruskal-Wallis test).

A B

150 4 **

3 100 ** * 2 * 50 1

SOD uSOD/ug protein uSOD/ug SOD 0 prot.)de CAT(mM/min/Mg 0 Naive NT 0.1 Naive NT 0.1 (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) (-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) Periodontitis Periodontitis C

150 *

100

 **

NOX ( NOX 50

0 Naive NT 0.1

(-)-fisetinidol palmitate (mg/kg) Periodontitis

Figure 5 (A-C). Effect of (-)-fisetinidol palmitate on SOD (A), CAT (B) and Nitrite/Nitrate Concentration (NOx) (C) in the gingival tissue of rats with periodontitis. For SOD * p< 0.00001 versus naive; **p< 0.05 versus NT. For CAT **p< 0.05 versus NT. For NOx *p< 0.001 versus naive; **p< 0.0001 versus NT (ANOVA; Tukey).

Figure 6. Histopathological evaluation of organs of rats submitted to periodontitis and treated with (-)-fisetinidol palmitate (0.1mg/kg). Black circles indicate loss cellular and blue circle edem, arrow congested vessel (discreet).

Table 2: Evaluation of treatment with (-)-fisetinidol palmitate on biochemical parameters in rats submitted to induction of periodontitis.

(-)-fisetinidol

palmitate

Parameters Naive NT 0.1 (mg/kg)

Total Alkaline Phosphatase 232.7± 10.8 188.8± 3.3 218.4 ± 33.4

Creatinine (mg/dL) 0.77 ± 0.04 0.93 ± 0.02 0.68 ± 0.04

AST (U/I) 47.68 ± 11.4 45.36 ± 6.2 65.79 ± 7.5

ALT (U/I) 21.9 ± 3.2 17.7 ± 1.6 19.1 ± 2.3

Data represent the mean ± S.E.M. (ANOVA; Tukey; p >0.05) Data represent the mean ± S.E.M. (ANOVA; Tukey's).

8 CONCLUSÃO

 Fisetinidol (0,0001 e 0,001 mg/kg) e Palmitato de Fisetinidol (0,1 mg/kg) foram capazes de reduzir a perda óssea alveolar no modelo de periodontite em ratas.

 O mecanismo de ação do Palmitato de Fisetinidol ocorre através da redução de mediadores inflamatórios (IL1-β, IL-8) e dos níveis da expressão de RNAm de IL-1β, IL-6, RANK, RANK-L e do aumento de OPG e de FAO sérica. Além disso, Palmitato de Fisetinidol (0,1 mg/kg) reduz a quantidade de radicais de oxigênio ao elevar os níveis das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase;

 A administração de Palmitato de Fisetinidol (0,1 mg/kg) durante 11 dias não afeta parâmetros bioquímicos e análise microscópica dos órgãos, sugerindo que Palmitato de Fisetinidol palmitate pode representar uma ferramenta biotecnológica como opção terapêutica segura em estudos pré-clínicos de periodontite em ratas.

REFERÊNCIAS

ABBASI, A.M. et al. Ethnomedicinal values, phenolic contents and antioxidant properties of wild culinary vegetables. Journal of Ethnopharmacology, Paquistão, v. 162, p.333-345. 2015.

ABE, T.; HAJISHENGALLIS, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of immunological methods, Filadelfia, v. 394, n. 1-2, p. 49-54, 2013.

ADEROGBA, M.A. et al. Antioxidant activity and cytotoxicity study of the flavonol glycosides from Bauhinia galpinii. Natural Product Research, Nigeria, v. 21, p. 591-599, 2007.

AGRA, M. F.; FREITAS, P. F.; BARBOSA-FILHO, J.M.. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Revista Brasileira de Farmacognosia, João Pessoa-PB v. 17, n. 1, p. 114-140, 2007.

AHMED, A.S et al. The antimicrobial, antioxidative, anti-inflammatory activity and cytotoxicity of different fractions of four South African Bauhinia species used traditionally to treat diarrhoea.Journal of ethnopharmacology, João Pessoa, v. 143, p.826-839, 2012.

ALBANDAR, J. M. A 6‐year study on the pattern of periodontal disease progression. Journal of clinical periodontology, Noruega, v. 17, n. 7, p. 467-471, Aug. 1990.

ALBUQUERQUE, U. P., Hanazaki, N. As pesquisas etnodirigidas na descoberta de novos fármacos de interesse médico e farmacêutico: fragilidades e pespectivas. Brazilian Journal of Pharmacognosy, João Pessoa, v.16, p.678-689, 2006.

ALGATE, K. et al. The effects of tumour necrosis factor-alpha on bone cells involved in periodontal alveolar bone loss; osteoclasts, osteoblasts and osteocytes. J Periodontal Res., Australia, v.51, p.549–66, 2016.

ALVIANO, D.S.; ALVIANO, C.S. Plant extracts: search for new alternatives to treat microbial diseases. Curr Pharm Biotechnol, Rio de Janeiro, v. 10, p. 106–121, 2009.

AMALIYA, A. et al. Java project on periodontal diseases: periodontal bone loss in relation to environmental and systemic conditions. Journal of clinical periodontology, Indonesia, v. 42, n. 4, p. 325-332, Feb. 2015.

ANBINDER, A.L., et al. Periodontal disease exacerbates systemic ovariectomy-induced bone loss in mice. Bone, São Paulo, v.83, p.241–247, 2016.

ANDRADE, F.R. et al.Expression of bone resorption regulators (RANK, RANKL, and OPG) in odontogenic tumors. Oral Surg.Oral MedOral Pathol.Oral Radiol Endod.,Goias, v.106, n.4, p.548-555, 2008. . ANTONIO GD, TESSER CD, MORETTI-PIRES RO. Phytotherapy in primary health care, São Paulo, v.48, n.3, p.541-53. 2014.

ARA, T. et al. The Biological Efficacy of Natural Products against Acute and Chronic Inflammatory Diseases in the Oral Region. Medicines (Basel), [s.l.]., v. 5, n.4, p. 122, 2018. ARAÚJO, M. G.; SUKEKAVA, F. Epidemiologia da doença periodontal na América Latina. R. Periodontia, [s.l.]., v.17, n.2, p. 7-13, 2007.

ARAÚJO,A.A. et al. Olmesartan decreases IL-1β and TNF-α levels; downregulates MMP-2, MMP-9, COX-2, and RANKL; and upregulates OPG in experimental periodontitis. Naunyn- Schmiedeberg's Arch Pharmacol., Natal, v.386, p.875-884, 2013.

ARTS, I.C.W.;VAN DE PUTTE, B.;HOLLMAN, P.C.H. Catechin contents of foods commonly consumed in the Netherlands: tea, wine, fruit juice and chocolate milk. Journal of Agricultural and Food Chemistry, [s.l.]., v.48, n.5, p.1752-757, 2000.

BAELUM, V.; LÓPEZ, R. Periodontal disease epidemiology learned and unlearned?. Periodontol 2000, [s.l.]., v.62, p.27-58, 2013.

BARBOSA, C.C.; MORAIS, P.L.S.; MATTOS, F. F. Conhecimentos e práticas sobre as principais doenças bucais da população adulta que demanda centro de saúde. U Revista, Juiz de Fora, v. 35, n. 4, p. 274-280, 2009.

BASCONES-MARTÍNEZ A. et al Host defence mechanisms against bacterial aggression in periodontal disease: Basic mechanisms. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. Madrid, v.14, n.12, p.:e680-5, 2009.

BENAKANAKERE, M.; KINANE, D. F. Innate cellular responses to the periodontal biofilm. In: Periodontal Disease. Karger Publishers, Filadelfia, v.15, n. 1, p. 41-55, 2012.

BEZERRA, M.M.; LIMA, V.; ALENCAR, V.B.M. Selective cyclooxygenase-2 inhibition prevents alveolar bone loss in experimental periodontitis in rats. Journal of Periodontology, Ceará, v.71, p.1009-1014, 2000.

BITTNER, K., RZEPPA, S., HUMPF, H. U. Distribution and quantification of flavan-3-ols and procyanidins with low degree of polymerization in nuts, cereals, and legumes. J. Agric. Food Chem., Alemanha, v.61, p.9148–9154,2013.

BOCH, J. A. et al .Review biological: interleukin 1 signal transduction—current concepts and relevance to periodontitis. Journal of dental research, [s.l.]., v. 80, n. 2, p. 400-407, Feb. 2001.

BOING, A.F. et al. Estratificação socioeconômica em estudos epidemiológicos de cárie dentária e doenças periodontais: características da produção na década de 90. Cad Saúde Pública, São Paulo, v.21, n.3, p.673-678, 2005.

BOONPHONG. S. et al. Bioactive compounds from Bauhinia purpurea possessing antimalarial, antimycobacterial, antifungal, anti-inflammatory, and cytotoxic activities. J Nat Prod., Tailândia, v.70, n.5, p.795-801, 2007.

BOTTURA, P.E. et al. Nonsurgical Periodontal Therapy Combined with Laser and Photodynamic Therapies for Periodontal Disease in Immunosuppressed Rats. Transpl, São Paulo, v.43, p.2009-2016. 2011.

BUCKWALTER, J.A. et al. Bone biology. II: Formation, form, modeling, remodeling, and regulation of cell function. Instr Course Lect, Iowa, v.45, p.387–99, 1996.

BUTTERY, L. D. et al. Nitric oxide stimulates osteoblast replication and development. J. Bone Mineral Res, [s.l.]., v. 14 (suppl), p.1154, 1999.

CASSIDY, A., et al. Habitual intake of flavonoid subclasses and incident hypertension in adults. Am. J.Clin. Nutr., Reino Unido, v. 93, p. 338–347, 2011.

CECHINEL FILHO, VALDIR ;YUNES, R. A. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais: conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade. Quím. Nova, Florianópolis, vol.21, n.1, p.99-105. 1998.

CECHINEL FILHO, V. Chemical composition and biological potential of plants from the genus Bauhinia. Phytother. Res., Itajaí, v. 23, p. 1347-2013,2009.

CHANDRA SHEKAR, B.R. et al. Herbal extracts in oral health care - A review of the current scenario and its future needs. Pharmacogn Rev.; India, v. 9, p. 87–92, 2015.

CHARLES, J. F.; ALIPRANTIS, A. O. Osteoclasts: more than ‘bone eaters’. Trends in molecular medicine, Masachusetes, v. 20, n. 8, p. 449-459, Aug. 2014.

CHAPPLE, I. L. et al. Compromised GCF total antioxidant capacity in periodontitis: cause or effect?J. Clin. Periodonto , Inglaterra, v.34, p.103–110, 2007.

CHENG, Z., et al. Periodontal disease and periodontal bacteria as triggers for rheumatoid arthritis.Best Pract Res Clin Rheumatol., Inglaterra, v.31, n.1, p.19-30, 2017.

COCHRAN, D.L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J.Periodontol, Texas, v. 79, n. 8, p. 1569-76, 2008.

CRONQUIST, A. An Integrated System of Classification of Flowering Plants. Columbia university press, Nova York, 6 ed., p. 1262,1981.

DAMOULIS, P. D.; HAUSCHKA, P. V. Cytokines induce nitric oxide production in mouse osteoblasts. Biochem. Biophys. Res. Comm., Boston, v.201, p.924-931, 1994. DARVEAU, R.P. Periodontitis: a polymicrobial disruption of host homeostasis. Nat. Rev. Microbiol., Washington, v.8, p.481–490, 2010.

DEGUCHI et al. mDia and ROCK Mediate Actin-Dependent Presynaptic Remodeling Regulating Synaptic Efficacy and Anxiety. Cell Reports, Japão, v. 17, p.2405–2417, 2016.

DINARELLO, C. A. Biology of interleukin 1. The FASEB Journal, Boston, v. 2, n. 2, p. 108-115, 1988.

EKE, P.I., et al. Prevalence of periodontitis in adults in the united states: 2009 and 2010. J Dent Res. Periodontal Disease Surveillance Workgroup, Atlanta, v.91, n.10, p.914–920, 2012.

ETHUR, L. Z. et al. Comércio formal e perfil de consumidores de plantas medicinais e fitoterápicos no município de Itaqui - RS. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , Botucatu, v. 13, n. 2, p. 121-128, 2011 .

GARLET GP, et al. The dual role of p55 tumour necrosis factor-αreceptor in Actinobacillus actinomycetemcomitans-induced experimental periodontitis: host protection and tissue destruction. Clin Exp Immunol; [s.l.]., v.147, p.128–38, 2006.

GASPERSIC, R. et al. Unilateral ligature-induced periodontitis influences the expression of neuropeptides in the ipsilateral and contralateral trigeminal ganglion in rats. Archives of oral biology, Eslovânia, v. 53, n. 7, p. 659-665, 2008.

GEMMELL, E.; YAMAZAKI, K.; SEYMOUR, G. J. Destructive periodontitis lesions are determined by the nature of the lymphocytic response. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine, Australia, v. 13, n. 1, p. 17-34, 2002.

GHAISAS, M.M; SAIKH, A.S.; DESHPANDE, A.D. Evaluation of immunomodulatory activity of methanolic extract of stem bark of Bauhinia variegata Linn. International Journal of Green Pharmacy, India, v. 3, p. 70-74, 2009.

GIFT HC & REDFORD M. Oral health and the quality of life. Clinic Geriatric Medicine, Nova York, v.8, n.53, p.673-683, 1992.

GOES, P. et al. Effect of alendronate on bone-specific alkaline phosphatase on periodontal bone loss in rats. Archives of oral biology, Ceará, v. 57, n. 11, p. 1537-1544, Nov. 2012.

GUARIGUATA, L. et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes res clin pract, Belgica, v.103, n. 2, p.137-149, 2014.

GUPTA, M. et al. Anti-inflammatory, analgesic and antipyretic effects of methanol extract from Bauhinia racemosa stem bark in animal models. J Ethnopharmacol., India, v. 98, n.3, p.267-73, 2005.

GRAVES, D. Cytokines that promote periodontal tissue destruction. Journal of periodontology, Boston, v. 79, n. 8S, p. 1585-1591, 2008.

HAJISHENGALLIS, G.; LAMONT, R. J.; GRAVES, D. T. The enduring importance of animal modelsin understanding periodontal disease. Virulence, Filadelfia, v. 6, n. 3, p. 229- 235, Nov. 2015.

HALA BS, Gunjan C, Disha N, Shobha P. Treatment of periodontal disease A herbal approach. Int J Pharm Sci Rev Res, India, v.33, p.126–136, 2015.

HATIPOGLU H, YAYLAK F, GUNGOR Y. A brief review on the periodontal health in metabolic syndrome patients. Diabetes Metab Syndr, Turquia, v.9, p.124–126, 2015.

HENDERSON, B. et al. Molecular pathogenicity of the oral opportunistic Pathogen Actinoba cillus actinomycet emcomitans. Annu Ver Microbiol, Londres, v.57, p.29–55, 2003.

HENNEMAN, S. et al. Local variations in turnover of periodontal collagen fibers in rats. Journal of Periodontal Research, Amsterdan, v. 47, n. 3, p. 383–388, 2012.

HIRANO T, et al. Phosphatidylinositol 3-Phosphate 5-Kinase, FAB1/PIKfyve Kinase Mediates Endosome Maturation to Establish Endosome-Cortical Microtubule Interaction in Arabidopsis. Plant Physiol, Amsterdan, v.169, n.3, p.1961-74,2015.

KARIMBUX, N. Y. et al. Interleukin-1 gene polymorphisms and chronic periodontitis in adult whites: a systematic review and meta-analysis. Journal of Periodontology, Boston, v. 83, n. 11, p. 1407-1419, 2012.

KATCHBURIAN, E.; CERRI, P. S. Cirurgia para implantes. Artes Médicas, São Paulo, p. 437-45, 2002.

KAWAI, T. et al. B and T lymphocytes are the primary sources of RANKL in the bone resorptive lesion of periodontal disease. The American journal of pathology, Boston, v. 169, n. 3, p. 987-998, 2006.

KIRZIOĞLU FY et al. Effects of rosuvastatin on inducible nitric oxide synthase in rats with hyperlipidaemia and periodontitis. J Periodontal Res. Apr; Turquia, v.53, n.2, p.258-266, 2018.

KNESER, U. et al. HorchTissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view. J. Cell. Mol. Med., Alemanha, v. 10, n.1, p. 7-19, 2006.

HUANG, J. et al. Myricetin Prevents Alveolar Bone Loss in an Experimental Ovariectomized Mouse Model of Periodontitis. Int J Mol Sci, China, v.17, n.3, p. 422-425, 2016.

JACOBS, E.; FERREIRA, D.; ROUX, D,G. Atropisomerism ins a new class of condensed tannins based on biphenyl and 0-terphenyl. Tetrahedron lett, Africa do Sul, v. 24, n.42, p.4627-4630, 983. KAJIYA, M. et al. Role of periodontal pathogenic bacteria in RANKL-mediated bone destruction in periodontal disease. J. Oral Microbiol., Boston, v.8, n. 2, p.1-16,2010. KAYAL, R. A. The role of osteoimmunology in periodontal disease. BioMed Research International, Arabia Saudita, v. 2013, p. 1-12, 2013.

KINANE, D. F.; STATHOPOULOU, P. G.; PAPAPANOU, P. N. Periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers, Pensilvania, v. 3, [s.n.], p. 17038, 2017.

KINNEY, J. S.; RAMSEIER, C. A.; GIANNOBILE, W. V. Oral fluid–based biomarkers of alveolar bone loss in periodontitis. Annals of the New York Academy of Sciences, [s.l.]., v. 1098, n. 1, p. 230-251, Apr. 2007.

KUHR, A., et al. Observations on experimental marginal periodontitis in rats. J. Periodontal, Alemanha, v.39, p. 101–106, 2004.

LALLA, E.; PAPAPANOU, P.N. Diabetes mellitus and periodontitis: a tale of two common interrelated diseases. Nat ver endocrinol., Nova York, v.7, n.12, p.738-748, 2011.

LEITÃO, R.F.C. et al. Locally applied isosorbid decreases bone resorption in experimental periodontistis in rats. Journal of Periodontology, Ceará, v.75, n.9, p.1227-32, 2005.

LEWIS, G. P. Legumes of the World. Royal Botanic Gardens Kew, [s.l.]., v. 62, n. 3, p. 195-196, 2005.

LIMA, V.; BEZERRA, M.M.; ALENCAR, V.B.M. Effects of chlorpromazine on alveolar bone loss in experimental periodontal disease in rats. European Journal of Oral Sciences, Ceará, v.108, p.123-129, 2000.

LING, M. R.; CHAPPLE, I. L.; MATTHEWS, J. B. Neutrophil superoxide release and plasma C-reactive protein levels pre- and post-periodontal therapy. J. Clin. Periodontol, Reino Unido, v.43, p.652–658, 2016.

LOPES, S. G. et al. Efect of tanniniferous food from bauhinia pulchella on pasture contamination with gastrointestinal nematodes from goats. Parasites & vectors, Piauí, v.9, n.102, 2016.

MACKENZIE, D. I.; L. L. BAILEY; J. D. NICHOLS. Investigating species co-occurrence patterns when species are detected imperfectly. Journal of Animal Ecology, Nova Zelândia, v.73, p.546–555, 2004.

MAIA NETO, M.; BRAZ FILHO, R.; LIMA, M. A. S.; SILVEIRA, E. R. Flavonoids and alkaloids from leaves of Bauhinia ungulata L.Biochem. Syst. Ecol., [s.l.]., v.36, p.227-229, 2008.

MANCINI, L. et al. The biphasic effects of nitric oxide in primary rat osteoblasts are cGMP dependent. Biochem. Biophys. Res. Comm, Reino Unido, v.274, p.477-481, 2000.

MATSUDA, N.M.; MILLER, S.M. Non-adrenergic non-cholinergic inhibition of gastrointestinal smooth muscle and its intracellular mechanism(s). Fundam Clin Pharmacol., [s.l.]., v.24, n.3, p.261-8, 2010.

McCUAIG, J.M. et al. Evolution of genetic assessment for BRCA-associated gynaecologic malignancies: a Canadian multisociety roadmap. J Med Genet., Canada, v.55, n.9, p.571- 577.

MENA P., et al. Flavan-3-ols, Anthocyanins, and Inflammation. International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Italia, v. 66, n.11, p.745-58, 2014.

MENEZES, A. M. A. et al. Nitrosoglutathione Decreases Inflammation and Bone Resorption in Experimental Periodontitis in Rats. Journal of Periodontology, Ceará, v. 83, [s.n.], p. 514- 521, 2012.

MENEZES, A. MA et al. Effect of sodium alendronate on alveolar bone resorption in experimental periodontitis in rats. Journal of periodontology, Ceará, v. 76, n. 11, p. 1901-

1909, Nov. 2005.

MIDDLETON, E., JR.; KANDASWAMI, C.; THEOHARIDES, T.C. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacology Review, [s.l.]., v.52, p.673, 2000.

MIYASAKI, K T; NEMIROVSKIY, E. Myeloperoxidase isoform activities released by human neutrophils in response to dental and periodontal bacteria. Oral Microbiol Immunol, Estados Unidos, v. 12, p.27-32, 1997.

MISHRA, A. et al. Bauhinia variegata leaf extracts exhibit considerable antibacterial, antioxidant, and anticancer activities. Biomed Res Int.,India, v. 2013, p.1-10, 2013.

MITTAL M. et al. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.Antioxid Redox Signal. , Chigaco, v.20,n.7, p.1126-67,2014.

MOHAMED, M.A.; MAMMOUD, M.R.; HAYEN,H. Evaluation of antinociceptive and anti- inflammatory activities of a new triterpene saponin from Bauhinia variegata leaves. Z Naturforsch C., [s.l.]., v.64,n.11-12, p.798-808, 2009.

MONAGAS, M., et al. Insights into the metabolism and microbial biotransformation of dietary flavan-3-ols and the bioactivity of their metabolites. Food Funct., Madrid, v.1, p. 233–253, 2010.

MOREIRA, P,R. et al. Interleukin-6 expression and gene polymorphism are associated with severity of periodontal disease in a sample of Brazilian individuals. Clin Exp Immunol, Minas Gerais, v.148, n.1, p.119-26, 2007.

NAKASHIMA, T. et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature medicine, Japão, v. 17, n. 10, p. 1231, Sept. 2011.

NAZIR, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. Int J Health Sci (Qassim)., Arabia Saudita, v.11, n.2, p.72-80, 2017

OPPERMANN, R.V. et al. Epidemiology of periodontal diseases in adults from Latin America. Periodontol 2000, [s.l.]., v. 1, p.13-33, 2015.

ORUBA, Z. et al. Periopathogens differ in terms of the susceptibility to toluidine blue O- mediated photodynamic inactivation. Photodiagn Photodyn, Polônia, v.20, p.28-34, 2017.

PANDEY, S.;LO, A.L.; SHRESTHA, R.B. Intestinal parasitic infections among school children of Northern Kathmandu, Nepal. Asian Pac J Trop Dis, Nepal, v.5, p. 89-92, 2015.

PAREKH, J.; CHANDRA, S. Antibacterial and phytochemical studies on twelve species of Indian medicinal plants. African Journal of Biomedical Research, India, v. 10, p. 175-181, 2007.

PARK K. H., et al. Three New Stereoisomers of Condensed Tannins from the Roots of Rosa multiflora. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Coreia, v.58, n. 9, p.1227-1231, 2010.

PETERSEN, P.E., BAEHNI, P.C. Periodontal health and global public health. Periodontol 2000, [s.l.]., v. 60, p.7-14, 2012.

PIETTA, P.G. Flavonoids as antioxidants. J Nat Prod., Italia, Jul; v.63, n.7, p.1035-42, 2000. . PIHLSTROM BL, MICHALOWICZ BS, JOHNSON NW. Periodontal diseases. Lancet. [s.l.]., v. 366, n.9499, p.1809-20, 2005.

PION, F. L. B. et al. Condição periodontal de um subgrupo populacional do município de Guarulhos, SP. Rev Bras Epidemiol, São Paulo, v.9, n.3, p.335-45, 2006.

POLHILL, R.M.; RAVEN, P.H.; STIRTON, CH. Evolution and systematics of the leguminosae. Kew, royal botanic gardens, [s.l.]., p 1-26, 1981

QUEIROZ, L.P. Leguminosas da caatinga. Feira de Santana Universidade, Feira de Santana, p.443, 2009.

RALSTON, S. H. et al. Human osteoblast-like cells produce nitric oxide and express inducible nitric oxide synthase. Endocrinology, Reino Unido, v.135, p.330-336, 1994.

RAMESH, A. et al. Herbs as an antioxidant arsenal for periodontal diseases. J Intercult Ethnopharmacol., [s.l.]., v. 5, p. 92–6, 2016.

RAO, Y.K.; FANG, S.H.; TZENG, Y.M. Anti-inflamatory activities of flavonoids and a triterpene caffeate isolated from Bauhinia variegata. Phytotherapy Research, Taiwan, v.22, p. 957-962, 2008.

REID, K.A. et al.. Evaluation of the mutagenic and antimutagenic effects of South African plants. Journal of Ethnopharmacology, Belgica, v.106, p.44-50, 2006.

ROBINSON, M.; HART, D.; PIGOTT, G. H. The effects of diet on the incidence of periodontitis in rats. Laboratory animals, Reino Unido, v. 25, n. 3, p. 247-253, 1991.

RODINI, C. O. Doença periodontal inflamatória induzida por ligadura: caracterização microscópica e estudo da presença de mastócitos e das enzimas óxido nítrico sintase induzível (inos) e metaloproteinases-2 e-9. 2005. 149f. Dissertação (Mestrado em odontologia) – Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005.

ROMANDINI, M. et al. Periodontitis and Platelet Count: a new potential link with cardiovascular and other systemic inflammatory diseases. Journal of clinical periodontology, Italia, [s.v.: s.n.: s.p], Aug. 2018.

SAMIE, A. et al. Antifungal activities of selected Venda medicinal plants against Candida albicans, Candida krussei and Cryptococcus neoformans isolated from South African AIDS patients. African Journal of Biotechnoloy, Africa do Sul, v. 9, p. 2965-2976, 2010.

SANZ, M.; VAN WINKELHOFF, A.J. Periodontal infections: understanding the complexity– consensus of the Seventh European Workshop on Periodontology. Journal of Clinical Periodontology, Madrid, v.38, n. 11, p.3–6, 2011.

100

SARAIVA, G. L.; LAZARETTI-CASTRO, M. Marcadores bioquímicos da remodelação óssea na prática clínica. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia, São Paulo, v.46, n. 1, p.72-26, Feb. 2002.

SCHUCH, H.S. et al. Can socioeconomic trajectories during the life influence periodontal disease occurrence in adulthood? Hypotheses from a life-course perspective. Medical Hypotheses, Australia, v. 84, p. 596–600, 2015.

SHANG,X.Y; LIU, W.; ZHAO,C.W. Advances in research of chemical constituents and pharmacological activities of Bauhinia. Zhonqquo Zhong Yao Za Zhi, China, v. 33, p. 709- 717, 2009.

SCHETT G;SIEPER, J. Inflammation and repair mechanisms. Clin ExpRheumatol, Alemanha, v.27, p.33–5, 2009.

SILVA, K. L.; CECHINEL FILHO, V. Plantas do gênero Bauhinia: composição química e potencial farmacológico. Quím. Nova, Itajaí, v.25, n.3, p.449-454, 2002.

SILVA, M. I. G. et al. Utilização de fitoterápicos nas unidades básicas de atenção à saúde da família no município de Maracanaú (CE). Revista brasileira de farmacologia, Ceará, v. 16, n. 4, p. 455-62, 2006.

SILVA, T.M., et al. A new cyanoglucoside from Bauhinia pentandra and its antioxidant activity. Chem. Nat. Compd., [s.l.]., v.49, p. 685-690, 2013.

SLOTS, J. Periodontology: past, present, perspectives. Periodontology 2000, [s.l.]., v.62, p. 7–19, 2013.

SOARES, P.K.; SCARMINIO, I.S. Multivariate chromatografic fingerprint preparation and authentication of plant material from the genus Bauhinia. Phytochem. Anal, Paraná, n.19, p.78-85, 2008.

SOCRANSKY, S. S. et al. New concepts of destructive periodontal disease. Journal of clinical periodontology, [s.l.]., v. 11, n. 1, p. 21-32, Jan. 1984.

SODEK, J.; MCKEE, M. D. Molecular and cellular biology of alveolar bone. Periodontology 2000, [s.l.]., v. 24, n. 1, p. 99-126, Jan. 2000.

SOUSA, L.H. et al. Effects of Atorvastatin on Periodontitis of Rats Subjected to Glucocorticoid-Induced Osteoporosis. J Periodontol., Ceará, v.87, n.10, p.1206-16, 2016.

SOUSA, L. M.Chemical Composition, Larvicidal and Cytotoxic Activities of the Essential Oils from two Bauhinia Species. Records of Natural Products, Turquia, v.10, n.3, p.341- 348, 2016.

SOUZA, V.C.; LORENZI, H. Botanica Sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova odessa, Editora Plantarum, 2005.

101

STEFANI, F.A. et al. Expression, polymorphism and methylation pattern of interleukin-6 in periodontal tissues. Immunobiology, Minas Gerais, v.218, n.7, p.1012-7, 2013.

STEVENS, P.F. Angiosperm phylogeny website. 2006. Disponível em link: http:// www.mobot.org/MOBOT/research/APWeb. Acesso em acesso 26 de jan. 2019.

STRUILLOU, X. et al. Experimental animal models in periodontology: a review. The open dentistry journal, França, v. 4, p. 37, 2010.

TABOR, H.K.; RISCH, N.J.; MYERS, R.M. Candidate-gene approaches for studying complex genetic traits: practical considerations. Nat. Rev. Genet., California, v.3, p.391-397, 2002.

TAT, S. K. et al. New perspective in osteoarthritis: the OPG and RANKL system as a potential therapeutic target? The Keio journal of medicine, Canadá, v. 58, n. 1, p. 29-40, 2009.

TEITELBAUM, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science, Washington, v. 289, n. 5484, p. 1504-1508, Sept. 2000. TOKER, H.; GÖRGÜN, E.P.; KORKMAZ, E.M. Analysis of IL-6, IL-10 and NF-κB Gene Polymorphisms in Aggressive and Chronic Periodontitis. Cent Eur J Public Health, Turquia, v.25, n.2, p.157-162, 2017.

TOMINARI, T. et al. Polymethoxy Flavonoids, Nobiletin and Tangeretin, Prevent Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Bone Loss in an Experimental Model for Periodontitis. J Pharmacol Sci, Japão, v.119, p.390-394, 2012.

TOMOFUJI T, et al. Chronic administration of lipopolysaccharide and proteases induces periodontal inflammation and hepatic steatosis in rats. J Periodontol. , Japão, v.78, n.10, p.1999-2006, 2007.

TONETTI, M.S.; JEPSEN, S.; JIN, L.J.; OTOMO-CORGEL, J. Impact of the global burden of periodontal diseases on health, nutrition and wellbeing of mankind: a call for global action. J Clin Periodontol., Italia, v.44, p.456-462, 2017.

TRIVEDI S, LAL N. Antioxidant enzymes in periodontitis. J Oral Biol Craniofac Res. , India, Jan-Apr; v.7, n.1, p.54-57, 2017.

TROJAN-RODRIGUES, M. et al. Plants Used as Antidiabetics in Popular Medicine in Rio Grande do Sul, Southern Brazil. Journal of Ethnopharmacology, Porto Alegre, v. 139, p. 155-163, 2012.

VAN'T HOF, R.J.; RALSTON, S. H. Nitric oxide and bone. Immunology., Reino Unido, v. 103,n.3, p.255-61, 2001.

VAZ, A.M.S.F; TOZZI,A.M.G.A. Bauhinia ser. Cansenia (Leguminosae: Caesalpinioideae) no Brasil. Rodriguesia, Campinas, v.83, p.55-143, 2003.

102

VILMA LIMA et al. Principais mediadores inflamatórios envolvidos na fisiopatologia da periodontite-papel de moduladores farmacológicos. R Periodontitia, Ceará, v. 18, n.3, p. 7-19, 2008.

WANG, T.F. et al. Effects of Periodontal Therapy on Metabolic Control in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus and Periodontal Disease. Medicine (Baltimore).;Taiwan, v.93, p. 292., 2014.

WANG, Y. et al. Periodontitis links to exacerbation of myocardial dysfunction in subjects with type 2 diabetes. J Periodontal Res., China, p. 1-10, 2019.

WINNING, L.; LINDEN, G. J. Periodontitis and systemic disease. BDJ Team, [s.l.]., v. 2, [s.n.], p. 15163, 2015.

YANG, Y. J., et al. Dietary flavan-3-ols intake and metabolic syndrome risk in Korean adults. Nutr. Res. Pract, Coreia, v. 6, p. 68–77, p. 2012.

YOKOYAMA, H. et al. Role of glial cells in neurotoxin-induced animal models of Parkinson's disease. Neurol Sci.,Japão, v. 32, n.1, p.1-7, 2011.

YOSHIDA T., et al.Tannins of Rosaceus Medicinal Plants. V. : Hydrolyzable Tannins with Dehydrodigalloyl Group from Rosa laevigata MICHX. Chemical and Pharmaceutical Bulletin , [s.l.]., v.37 n. 4, p. 920-924,1989.

YOSHIDA T., FENG W.S., OKUDA T.Tannins and Related Polyphenols of Rosaceous Medicinal Plants. XII. Roshenins A-E, Dimeric Hydrolyzable Tannins from Rosa henryi.Chemical and Pharmaceutical Bulletin, [s.l.]., v. 40, n. 8, p.1997-2001, 1992.

ZAKARIA, Z. A. et al. In vivo antiulcer activity of the aqueous extract of Bauhinia purpurea leaf. J Ethnopharmacol, Malasia, v.137, n.2, p.1047-54, 2011.

ZHAO, B. TNF and bone remodeling. Current osteoporosis reports, Nova York, v. 15, n. 3, p. 126-134, June 2017. ZHANG, Q. et al. TNF inhibits production of stromal cell-derived fator 1 by boné stromal cells and increases osteoclast precursor mobilization from boné marrow to peripheral blood. Arthritis research e therapy, Nova York, v.10, p-37,2008.

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ANEXO A– DECLARAÇÃO DE APROVAÇÃO DO PROJETO “EFEITO DO FLAVONOIDE FISETINIDOL OBTIDO DE Bauhinia pulchella (Fabacae) E DE UM DERIVADO SEMI-SINTÉTICO OBTIDO A PARTIR DA BIOTRANSFORMAÇÃO DO FISETINIDOL NO MODELO EXPERIMENTAL DE PERIODONTITE EM RATAS: ANÁLISE DO ENVOLVIMENTO DE CITOCINAS, ÓXIDO NÍTRICO E METALOPROTEINASES DE MATRIZ” PELA CEUA