UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Triagem e seleção de antígenos salivares do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de estratégias genômica e proteômica para desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos
DANIELA DANTAS MORÉ
Ribeirão Preto
2010
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DANIELA DANTAS MORÉ
Triagem e seleção de antígenos salivares do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de estratégias genômica e proteômica para desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada
Orientadora: Profa. Dra. Beatriz Rossetti Ferreira
Ribeirão Preto
2010
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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto / USP
Moré, Daniela Dantas
Triagem e seleção de antígenos salivares do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de estratégias genômica e proteômica para desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos. Ribeirão Preto, 2010. 151 f.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / USP – Área: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientadora: Ferreira, Beatriz Rossetti
1.Vacina 2. Bovinos 3. Carrapatos 4. Genômica 5. Proteômica
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DANIELA DANTAS MORÉ
Título: Triagem e seleção de antígenos salivares do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus por meio de estratégias genômica e proteômica para desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Aprovada em: ___ / ___ / ____
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Beatriz Rossetti Ferreira Instituição: FMRP - USP
Julgamento: ______Assinatura: ______
Profa. Dra. Arlete Ap. M. Coelho Castelo Instituição: FMRP - USP
Julgamento: ______Assinatura: ______
Dr. Sandro Gomes Soares Instituição: FMRP - USP
Julgamento: ______Assinatura: ______
Profa. Dra. Ana Lúcia T. O. do Nascimento Instituição: IBU
Julgamento: ______Assinatura: ______
Prof. Dr. Marcos Horácio Pereira Instituição: ICB - MG
Julgamento: ______Assinatura: ______
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Aos animais, razão maior para realização desse trabalho. 5
Agradecimentos
Obrigada mãe Natureza pela força que me instiga a prosseguir.
À Minha família. Meu pai Carlos por seu apoio, confiança e entusiasmo. Minha mãe Cida por sua força. Minha irmã Fernanda por seu exemplo. Meu cunhado Luiz, sua alegria.
Dê, obrigada por chegar em minha vida e transformá-la com seu amor.
À minha nova família. Lu, minha sogra, obrigada pelo seu incentivo. Meu sogro Nino, sua perseverança. Vô Tiado e Vó Bili, pelos ensinamentos e toda jovialidade. Obrigada por me aceitarem tão bem. A todos os demais membros da família, muito obrigada por acreditarem em mim.
À professora Dra. Beatriz, meu muito obrigada. Obrigada pelos ensinamentos, discussões, sugestões e confiança que vieram durante esses anos de trabalho. Hoje me sinto melhor para o mundo e reconheço sua fundamental contribuição. Minha eterna gratidão.
À professora Dra. Isabel, por contribuir de maneira tão elegante em minha formação profissional e também pessoal. Obrigada pela amizade, confiança e as sempre boas sugestões. Você inspira e orgulha novos cientistas.
Ao professor Dr. João, por colaborar com o trabalho, mas mais do que isso, obrigada por auxiliar no alcance da solidez que hoje sentimos no “grupo dos carrapatos”.
Obrigada ao professor Dr. Marcos Rossi e às técnicas Lígia e Mônica, responsáveis pelo processamento das amostras no laboratório de Patologia dessa instituição, pelos conselhos e o apoio técnico, essenciais às análises histopatológicas desse trabalho.
Aos demais professores da pós graduação em imunologia básica e aplicada pela contribuição direta ou indireta na minha formação profissional. Obrigada à secretária do departamento Ana Cristine por nos orientar em meio a tantos papéis da pós graduação. Obrigada aos técnicos Wander e Lúcia pelos cuidados com nosso material.
Obrigada às professoras Dra. Gabriela e Dra. Milena pela consideração e respeito.
Dra. Consuelo pela oportunidade de estar em seu laboratório para treinamento em interferência por RNA e a chance de conhecer um pouquinho do México.
Dra. Wendy Brown e Dr. PK pela experiência vivida durante os meses nos Estados Unidos. Obrigada pela paciência e dedicação. Dr. Josh pelos incontáveis “helps”. Dr. Nori pela música que alegrava o laboratório e Ms. Katlyn pelas palavras em espanhol...
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Aos membros da banca, pelo aceite ao convite e pelas discussões que sem dúvida contribuirão para o futuro desse trabalho.
Obrigada aos colegas do “Grupo dos carrapatos”, Alessandra, Sandra, Carlo, Elen e Gustavo pela colaboração, convívio e troca de experiências. Acho que hoje mais que nunca sentimo- nos um grupo.
Francine pelo auxílio nos experimentos de interferência por RNA.
Obrigada aos colegas de laboratório que me ensinaram muito sobre o significado do trabalho em equipe...vocês são mais de 30, sintam-se todos agradecidos!
Aos colegas dos demais laboratórios, especialmente à Ana Paula e Iza, pela troca de experiências nas indas e vindas no corredor. Pelos materiais emprestados, pelas boas risadas, pelas barganhas...
Às alunas da enfermagem pelos momentos de descontração na nossa salinha...
Obrigada Alessandra pela amizade que cresceu e se fortaleceu ao longo dos anos de execução desse trabalho. Obrigada pela ajuda em tantos experimentos e discussões, mas obrigada também pela confiança, pelo suporte em momentos difíceis, pelas conversas “na sacada”, por me “albergar” em sua casa, por me ensinar a respeitar as diferenças entre as pessoas... valeu mesmo Cabeça, sua amizade está incluída entre os privilégios que recebi durante a pós graduação.
Jonilson, pela amizade serena de um típico soteropolitano, pelo seu bom humor e os acarajés...
Cristina, Reginaldo e Lucas pelo carinho, atenção e companhia; dos conselhos quase maternos às idas ao supermercado, por trazer um pouquinho de calor nos momentos mais gelados... Sinto saudades de vocês.
À amiga Ana e o recém chegado amigo Pedro. Obrigada pela alegria e exemplo que trouxeram à minha vida.
Beraba, assessor para assuntos de informática... obrigada por sua paciência e simpatia.
Jairo, minha gratidão pelo apoio incondicional.
À Universidade de São Paulo, pelo apoio recebido durante todos esses anos da minha formação profissional.
À FAPESP pelo apoio financeiro que possibilitou a execução desse e de outros trabalhos fundamentais para meu aprimoramento profissional.
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A descoberta consiste em ver o que todos viram e em pensar no que ninguém pensou.
Albert Szent-Györgyi, Prêmio Nobel de Fisiologia/Medicina 1937 8
Resumo
Moré, D.D. Triagem e seleção de antígenos salivares para uma vacina anticarrapatos Rhipicephalus (B.) microplus através de estratégias genômica e proteômica. 2010. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
Carrapatos são ectoparasitas hematófagos que coevoluiram simbioticamente com hospedeiros terrestres e adquiriam diversos mecanismos de evasão das respostas montadas por seus hospedeiros durante os longos períodos de infestação. Essa modulação se faz essencialmente através da inoculação de saliva no sítio de alimentação que contém uma série de moléculas com funções biológicas relevantes. Em contrapartida, a resposta imune dos hospedeiros também é capaz de interferir com a expressão gênica em seus eventuais parasitas. Bovinos desenvolvem uma resposta imunológica contra moléculas inoculadas durante a infestação por carrapatos, embora algumas raças apresentem diferentes padrões genéticos de suscetibilidade a novas infestações. A indução natural de resposta imune protetora contra infestações subsequentes em raças zebuínas sugere a possibilidade do controle através da vacinação dos hospedeiros. A redução no grau das infestações traria uma diminuição significativa dos prejuízos sanitários e financeiros causados por carrapatos. As tecnologias genômicas e proteômicas tem desempenhado um importante papel na busca por antígenos candidatos para o desenvolvimento de várias vacinas, como o fez nesse estudo. Genes de interesse (GIs) clonados foram selecionados através da análise de bibliotecas de cDNA de glândulas salivares de carrapatos, produzidos para inoculação sob a forma de DNA nu na pele de bovinos resistentes às infestações (raça nelore) e avaliação de resposta cutânea tardia. Posteriormente, carrapatos foram inoculados com moléculas fita dupla de RNA (dsRNA) para o silenciamento gênico de alguns dos GIs através de interferência por RNA e tiveram seus parâmetros de desempenho biológicos e reprodutivos avaliados após a alimentação em bovinos. Em seguida, as proteínas recombinantes foram produzidas em sistema de transcrição e tradução in vitro (IVTT). Os resultados mostraram que dos 23 GIs avaliados quanto à indução de resposta cutânea tardia com a inoculação de DNA nu, apenas dois não foram capazes de induzir resposta como eritema ou enduração; com relação às células presentes no sítio de inoculação dos GIs não foram observadas diferenças significativas. Em seguida, 15 GIs foram selecionados para avaliação do efeito de interferência por RNA. O silenciamento gênico de cinco GIs foi capaz de interferir consistentemente com o desempenho dos carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, prejudicando principalmente o peso das fêmeas alimentadas e da massa de ovos, a eficiência reprodutiva e a taxa de eclosão. O silenciamento do GI SIGP G05 merece destaque, pois levou a um maior comprometimento no desempenho dos carrapatos, provocando a redução de 47, 67, 53 e 76% nos parâmetros citados. Em seguida, com exceção do GI CEM G04, todas as proteínas recombinantes foram sintetizadas com sucesso, com obtenção de aproximadamente 20 µg de cada proteína (55,8 a 111,6 ng/ µL) que poderão ser agora testadas como imunógenos para auxiliar o desenvolvimento de uma vacina anticarrapato.
Palavras-chave: 1. Vacina; 2. Bovinos; 3. Carrapatos; 4. Genômica; 5. Proteômica
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Abstract
Moré, D.D. Genomic and proteomic approaches for screening of candidates antigens for development of an anti-tick Rhipicephalus (B.) microplus vaccine. 2010. Thesis – School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo.
Ticks are haematophagus arthropods were able to establish a symbiotic relationship with hosts developing many different mechanisms of immune evasion during their long feeding period (more than 20 days). This modulation is due essentially to the saliva inoculation, which contains a cocktail of molecules pharmacologically active in the skin bite site. On the other hand, the host immune response has been proved be able to interfere with parasite gene expression profile. Bovines develop an immune response against molecules inoculated during the tick infestation, although some breeds present different degrees of susceptibly to infestations. The induction of protective immune response against tick infestations in bovine zebuine breeds suggest the possibility of a vaccine-based control that could reduce the health and financial harms caused by ticks. Genomic and proteomic approaches have recently improved the selection of candidate antigens to develop new vaccines, as in this work. Genes of interest (GI) were selected by bioinformatics treatment of cDNA libraries from tick salivary glands and then produced to be inoculated as naked DNA in the skin of tick resistant bovines (Nelore breed) for evaluation of a delayed cutaneous response induction. After this, ticks were inoculated with iRNA molecules for gene silencing of the GIs and their biological and reproductive parameters were analyzed after their feeding on bovines. The loss of function showed some important proteins involved in tick feeding and breeding that could be expressed by in vitro transcription and translation assay (IVTT). The data showed that out of 23 groups evaluated only two were not able to induce any alteration like erithema and enduration. However, the cellular infiltrate induced by nu DNA inoculation was not different among groups. Next, we selected 15 genes for evaluation by RNA interference. The silencing of five genes was harmful to tick development, especially for engorged female and egg mass weight, hatchability and the reproductive efficiency index. The SIGP G05 silencing was the most detrimental for the ticks showing a reduction of 47, 67, 76 and 53%, respectively in the parameters cited. As this work is based in large scale screening, we proceeded to the protein expression for the 15 proteins using in vitro transcription and translation system (IVTT). Except CEM G04, all proteins could be successfully expressed and approximately 20 µg of each protein could be obtained (55.8 to 111.6 ng / µL). These proteins can be used in immune assays to help the selection of good antigens for an anti-tick vaccine.
Keywords: 1. Vaccine 2. Bovine 3. Ticks 4. Genomic 5. Proteomic
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Lista de figuras
Figura 1 - Representação esquemática da cascata de coagulação...... 24
Figura 2 - Representação esquemática do ciclo de vida do carrapato Rhipicephalus (B.) microplus...... 26
Figura 3 - Representação esquemática das sequências clonadas nos vetores pENTR-D-TOPO e pEXP1-DEST1 Gateway®...... 57
Figura 4 - Contagem global e diferencial de células presentes na pele após 48 h da inoculação dos GIs...... 69
Figura 5 - Contagem global e diferencial de células presentes na pele após 72 h da inoculação dos GIs...... 70
Figura 6 - Fotomicrografias de secções histológicas para análise do infiltrado celular induzido pelos GIs...... 72
Figura 7 - Eletroforese das moléculas de fita dupla de RNA (dsRNA) sintetizadas a partir da sequência clonada dos GIs...... 76
Figura 8 - Efeito do silenciamento gênico na taxa de mortalidade e porcentagem dos carrapatos fêmeas ingurgitadas...... 77
Figura 9 - Efeito do silenciamento gênico na taxa de mortalidade e porcentagem dos carrapatos fêmeas ingurgitadas...... 78
Figura 10 - O silenciamento de alguns GIs reduziu o peso médio das fêmeas e das massas de ovos...... 82
Figura 11 - O silenciamento dos GIs não afetou o peso médio das fêmeas, das massas de ovos e o índice de eficiência reprodutiva (IER)...... 84/85
Figura 12 - O silenciamento de alguns GIs, apesar de não reduzir o número de carrapatos fêmeas capazes de produzir larvas viáveis, reduziu o índice de eficiência reprodutiva (IER)...... 86
Figura 13 - O silenciamento de alguns GIs aumentou o período para eclosão das larvas e reduziu a taxa de eclosão das larvas...... 88
Figura 14 - O silenciamento gênico após o completo ingurgitamento das fêmeas de carrapatos não alterou o peso das massas de ovos...... 89
Figura 15 - Fotomicrografias de secções de carrapatos inoculados com água (controles)..92/93
Figura 16 - Fotomicrografias de tecidos de carrapatos inoculados com dsRNA para o silenciamento do gene da subolesina (controle positivo)...... 95
11
Figura 17 - Fotomicrografias de tecidos de carrapatos inoculados com dsRNA para o silenciamento dos diferentes GIs testados...... 96/97
Figura 18 - Confirmação do silenciamento gênico por qRT-PCR...... 99
Figura 19 - Triagem das colônias transformadas após clonagem em vetor TOPO-pENTR...103
Figura 20 - Triagem de colônias transformadas após clonagem em vetor pEXP1-D...... 104
Figura 21 - Dot blot para quantificação relativa das proteínas recombinantes produzidas....105
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Lista de tabelas
Tabela 1 - Detecção de reação cutânea tardia em resposta a 12 diferentes GIs após 48 h da inoculação...... 66
Tabela 2 - Detecção de reação cutânea tardia em resposta a 12 diferentes GIs após 72 h da inoculação...... 67
Tabela 3 - Incidência de respostas positivas após 24, 48 e 72 h da inoculação de todos os genes de interesse testados como DNA nu...... 73
Tabela 4 - Escolha dos genes de interesse para os ensaios de interferência por RNA...... 74
Tabela 5 - Efeito do silenciamento gênico na sobrevivência, alimentação e fecundidade de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus...... 80
Tabela 6 - Efeito do silenciamento gênico na sobrevivência, alimentação e fecundidade de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus...... 81
Tabela 7 - Porcentagem de redução do desempenho biológico e reprodutivo dos silenciamentos mais expressivos...... 91
Tabela 8 - Seleção dos genes de interesse de carrapatos R. (B.) microplus para expressão protéica...... 100
Tabela 9 - Relação das proteínas expressas com seu tamanho em nucleotídeos, aminoácidos, predição de peso molecular e concentração obtida...... 102
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Lista de siglas e abreviaturas
ADP: adenosina trifosfato
BPTI: inibidor de tripsina pancreática bovina
CD: cluster of differentiation cDNA: DNA complementar
ConA: concanavalina A
COX: cicloxigenase
DC: células dendríticas dsRNA: RNA de dupla fita
DTH: hipersensibilidade do tipo tardia
EPM: erro padrão da média
ESTs: expressed sequence tags
ExPASy: expert protein analysis system
Fbg: fibrinogênio
GI: gene de interesse
GO: gene ontology
GP: glicoproteína
IER: índice de eficiência reprodutiva
IFN-γ: interferon do tipo gamma
Ig: imunoglobulina
IL: interleucina iRNA: interferência por RNA
IVTT: in vitro transcription and translation
KD: constante de dissociação
KOG: clusters of orthologous groups para genomas eucarióticos completos
LPS: lipopolissacarídeo
NK: natural killer 14
NR: non redundant nucleotide database
OE/OD: orelha esquerda e direita, respectivamente
ORFs: open reading frames
PAF: fator ativador de plaquetas
PAR: ativação plaquetária através de receptor
PBS: solução salina tamponada com fosfato
PDG2: prostaglandina G2
P-fam: protein families database
PGE2: prostaglandina E2
PGF2: prostaglandina F2
PLA2: fosfolipase A2
PRG: proteína rica em glicina qRT-PCR: reação de transcriptase reversa seguida por reação de polimerase em cadeia quantitativa
RGD: arginina (R), glicina (G) e ácido aspártico (D)
RISC: RNA-induced silencing complex rRNA: RNA ribossomal
SGE: extrato de glândula salivar
SMART: simple modular architecture research tool ssRNA: RNA de simples fita
TF: fator tecidual
Th: T helper
TLR: receptor do tipo Toll
TNF: fator de necrose tumoral
TXA2: tromboxano A2 vWF: fator de von Willebrand
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SUMÁRIO
1 Introdução...... 19
1.1 Co-evolução e Interação parasito-hospedeiro...... 20
1.2 A Saliva...... 27
1.2.1 Papel no metabolismo hídrico e iônico...... 27
1.2.2 Papel na hematofagia...... 27
1.2.3 Mecanismos moleculares de modulação...... 28
1.2.3.1 Quinase-bradicinina...... 29
1.2.3.2 Prostaglandinas...... 29
1.2.3.3 Inibidores da hemostasia...... 30
1.2.3.4 anticoagulantes...... 31
1.2.3.5 Ligantes...... 32
1.2.3.6 Imunomodulação – efeitos celulares, na produção de citocinas e anticorpos...... 33
1.3 Descoberta de antígenos e desenvolvimento de vacina anticarrapato...... 37
1.3.1 Estratégias vacinais anticarrapatos...... 37
1.3.2 Uso de estratégias genômicas e proteômicas na descoberta de antígenos...... 38
2 Objetivos...... 42
2.1 Gerais...... 43
2.2 Específicos...... 43
3 Materiais e Métodos...... 44
3.1 Animais experimentais...... 45
3.2 Escolha dos genes de interesse...... 45
3.3 Triagem por DNA nu...... 45 16
3.3.1 Obtenção dos DNAs plasmidiais - Cultura bacteriana...... 45
3.3.2 Purificação de DNA plasmidial (GigaPrep)...... 46
3.3.3 Inoculação de DNA plasmidial (genes de interesse ou nu DNA) em bovinos previamente infestados para verificar indução de hipersensibilidade cutânea...... 47
3.3.4 Análise histológica das biópsias do local de inoculação dos GIs...... 47
3.4 Triagem por RNA de interferência...... 48
3.4.1 Seleção de genes de interesse...... 48
3.4.2 Obtenção das moléculas de dsRNA para o ensaio de silenciamento gênico...... 48
3.4.3 Digestão com nuclease...... 49
3.4.4 Purificação das dsRNA...... 49
3.4.5 Purificação de produto de PCR...... 49
3.4.6 Reação de transcrição in vitro...... 50
3.4.7 Quantificação de dsRNA e preparo das amostras...... 50
3.4.8 Inoculação dos dsRNA nos carrapatos...... 51
3.4.9 Inoculação do dsRNA (RNAi) em carrapatos R. (B) microplus e infestação...... 51
3.4.10 Infestação de bovinos com carrapatos inoculados com dsRNA...... 52
3.5 Avaliação dos carrapatos após alimentação...... 52
3.5.1 Dissecção de glândulas salivares de carrapatos parcialmente alimentados...... 52
3.5.2 Extração de RNA de material dos carrapatos...... 53
3.5.3 Síntese de cDNA e confirmação da expressão gênica...... 54
3.5.4 Microscopia de luz comum...... 54
3.5.5 Bioinformática...... 55
3.6 Obtenção de proteínas recombinantes dos genes selecionados...... 55
17
3.6.1 Obtenção dos produtos para clonagem em sistema TOPO® (Invitrogen)...... 55
3.6.2 Clonagem em vetor de entrada pENTR-D-TOPO® (Invitrogen)...... 58
3.6.3 Seleção das colônias recombinantes...... 58
3.6.4 Extração de DNA plasmidial em pequena escala (Miniprep)...... 59
3.6.5 Clonagem em sistema Gateway® (pEXP1-DEST Gateway® Vector Kit)...... 61
3.6.6 Ensaio de expressão de proteína em sistema livre de células (Cell Free)...... 61
3.6.7 Dot blot...... 61
3.7 Análise estatística...... 61
4. Resultados...... 63
4.1 Seleção de genes de interesse por análise in silico de bibliotecas de cDNA de tecidos/estágios de carrapatos R. (B.) microplus...... 64
4.2 Produção e purificação dos DNAs plasmidiais (DNA nu)...... 64
4.3 Inoculação intradérmica dos genes de interesse sob a forma de DNA nu em bovinos da raça Nelore para avaliação da resposta cutânea tardia...... 64
4.4 Avaliação do efeito do silenciamento gênico através de interferência por RNA nos parâmetros biológicos e reprodutivos dos carrapatos...... 75
4.5 Avaliação do efeito do silenciamento gênico nos tecidos dos carrapatos...... 90
4.6 Confirmação do silenciamento gênico nas glândulas salivares de carrapatos parcialmente alimentados...... 94
4.7 Análise in silico mais detalhada dos genes de interesse selecionados...... 98
4.8 Expressão de proteínas recombinantes...... 101
5 Discussão...... 106
6 Conclusões...... 128
7 Referências Bibliográficas...... 130
18
Introdução
19
1 Introdução
1.1 Co-evolução e Interação parasito-hospedeiro
A interação entre as espécies desempenha um importante papel na evolução bem como na co-evolução das mesmas (Thrall et al., 2007). As relações simbióticas mutualistas ou parasitárias estabelecidas entre as espécies geralmente conduzem à co-evolução, uma vez que ao se adaptar uma espécie pode selecionar outra entre as com que se relaciona as quais também sofreram adaptações, num sistema sujeito ainda às influências das outras espécies daquela comunidade (complexidade da biota) bem como do ambiente que habitam (Thrall et al., 2007).
Diversos fatores podem interferir na relação entre as espécies e favorecer o estabelecimento de um determinado tipo de relação em detrimento de outros. É sabido, por exemplo, que a expansão populacional ou o aumento da densidade de indivíduos favorece o estabelecimento de relações parasitárias enquanto que o decréscimo favorece o mutualismo; também parece estar provado que o aumento da disponibilidade de nutrientes favorece o estabelecimento das relações parasitárias (Thrall et al., 2007). Embora entre as relações simbióticas o mutualismo seja aceito como o de maior grau de co-evolução, as relações parasitárias são especialmente marcantes no que diz respeito a mútuas adaptações: a cada novo mecanismo de defesa do hospedeiro, uma nova estratégia de ataque do parasito; o inverso também é esperado. O surgimento de espécies parasitas hematófagas vetores e a estreita relação com seus hospedeiros vertebrados são um interessante exemplo a ser estudado e tem servido como uma excelente fonte de observações que contribuem para a descrição dos mecanismos envolvidos nessas relações.
A hematofagia, que por definição é o comportamento de ingerir sangue para se alimentar, surgiu entre os artrópodes durante as Eras Jurássica e Cretácea, ou entre 145 a 65 milhões de anos atrás (Ribeiro, 1995a, b). Essa estratégia de alimentação teve de lidar com uma defesa do hospedeiro vertebrado já vigente no momento: a cascata de coagulação sanguínea que surgira aproximadamente 255 milhões de anos antes (ou 400 milhões de anos atrás), e que ao menos 200 milhões de anos se encontra na forma que conhecemos hoje. Ou seja, a adaptação de artrópodes hematófagos a esse novo ambiente exigiu uma adaptação específica a um eficiente sistema hemostático existente (Doolittle e Feng 1987 apud1 Mans et
1 Doolittle R.F. e Feng D.F. Reconstructing the evolution of vertebrate blood coagulation from a consideration of the amino acid sequences of clotting proteins. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987; 52:869-74. 20 al., 2002b). A capacidade de interferir com a hemostasia do hospedeiro é uma das adaptações evolutivas mais estudadas entre os artrópodes hematófagos e, associada a um possível surgimento de novos nichos, pode ter sido a resposta a pressão seletiva sofrida pela aquisição do controle da homeostasia (Mans et al., 2002b). Essa adaptação estreitou a relação entre as espécies e certamente contribuiu para a co-evolução desses artrópodes parasitas e seus hospedeiros vertebrados, uma vez que adaptações posteriores já foram estudadas e confirmadas. Assim, a complexa interação que se dá entre essas espécies pode ser vista como o balanço entre as defesas do hospedeiro contra os parasitos e as estratégias de evasão desenvolvidas por esses, que além de facilitarem a alimentação também contribuem para a transmissão de patógenos.
De fato, diversos autores têm estudado o papel que a aquisição da hematofagia desempenhou na evolução de espécies de carrapatos, possivelmente por serem eles os primeiros a adquirir essa adaptação (Mans e Neitz, 2004a). Carrapatos são ectoparasitos hematófagos obrigatórios, amplamente distribuídos nos continentes e atualmente adaptados a se alimentarem do sangue de mamíferos, aves, répteis e anfíbios (Gonzalez-Acuna et al., 2005a; Gonzalez-Acuna et al., 2005b). Esses ácaros estão classificados na ordem Ixodida, subordem Acari que compreende aproximadamente 879 espécies divididas em três famílias: a Argasidae ou carrapatos de corpo mole, a Ixodidae ou carrapatos de corpo duro e a Nuttalliellidae (Horak et al., 2002). A família Argasidae é dividida em duas subfamílias, Argasinae e Ornithodorinae; a família Ixodidae é dividida em Prostriata (subfamília Ixodinae) e Metastriata (subfamílias Amblyomminae, Haemaphysalinae, Hyalomminae e Rhipicephalinae) (Guglielmone et al., 2009; Nava et al., 2008a; Nava et al., 2008b; Nava et al., 2009). A origem mais aceita atualmente foi no final do período Cretáceo aproximadamente a 120 milhões de anos atrás, concomitante ao desmembramento do continente único e a separação da Austrália, e o surgimento dos primeiros animais tetrápodes (anfíbios) (Dobson e Barker, 1999). Essa hipótese é apoiada pela presença de um mecanismo rudimentar de controle da hemostasia incluindo trombina, fator Xa da coagulação (fXa) e plaquetas nesses animais e que esse mecanismo representaria a pressão seletiva exercida sobre os ácaros para a aquisição da estratégia de adaptação a seus hospedeiros (Lewis, 1996). A adaptação do ponto de vista bioquímico, através da aquisição da capacidade de produção de proteínas com novas funções, e funcional, que ofereça uma vantagem adaptativa à espécie (Mans e Neitz, 2004a), será mantida na população podendo ser adquirida através de diferentes mecanismos. 21
Uma adaptação possível seria a modificação de algum mecanismo já existente através de alterações moleculares como, por exemplo, a secreção de uma enzima antes apenas com função intracelular, por meio da adição de peptídeo sinalizador (SigP) à sequência original (Mans e Neitz, 2004a). Um exemplo importante foi a aquisição de proteínas com função secretora como as da família nSec1 (Karim et al., 2004). Além disso, uma mutação pontual poderia adicionar uma nova função a uma proteína existente sem que essa perdesse a função inicial, o que é conhecido como compartilhamento gênico e ocorre em outros organismos como Pseudomonas aeruginosa (Goldflam e Rowe, 1983). Por serem moléculas de função conservada, o compartilhamento gênico costuma adicionar novas funções sem perder as anteriores. O fenômeno de seleção negativa retiraria da população mutações deletérias. A descrição de mecanismos genéticos como duplicação gênica e a presença de famílias de proteínas multigênicas com diversas funções tem validado essa visão nos últimos anos. A duplicação gênica é um mecanismo que pode ocorrer em diversas fases de vida da célula e sua participação na radiação das espécies tem sido aceita nas últimas décadas. Além disso, baseando-se na taxa de ocorrência estima-se que a cada 35-350 milhões de ano metade de um genoma pode ser duplicado, aumentando a frequência dos genes (GRAUER e LI, 1996 apud Mans e Neitz, 2004a). Isso significa dizer que no genoma de um carrapato, que estima-se ter entre 30 e 60 mil genes, poderia ter ocorrido a duplicação gênica que conferisse a adaptação. Além disso, também é possível estimar que ocorreram adaptações independentes entre carrapatos das famílias Ixodidae e Argasidae (OHNO, 1970 apud2 Mans e Neitz, 2004a). O ganho de funções com moléculas antihemostáticas como proteínas semelhantes à família de inibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI, do inglês bovine pancreatic tripsin inhibitor) e lipocalinas tem sido associado à ocorrência da duplicação gênica (Mans e Neitz, 2004a).
O registro fóssil de carrapato mais antigo data de 90-94 milhões de anos atrás e se trata de um exemplar da família Argasidae (Carios jerseyi) encontrado em New Jersey, EUA. Esse registro também oferece indícios que as famílias de carrapatos tenham se separado a aproximadamente 92 milhões de anos atrás (Mans et al., 2002b). Entretanto perguntas tais como qual a natureza do ancestral comum desses ectoparasitas antes da adaptação a um ambiente hematófago, ou seja, quais as estratégias antihemostáticas estavam presentes ou se desenvolveram a seguir, ou se a adaptação ocorreu antes ou depois da divergência das famílias e quais os mecanismos evolucionários que permitiram carrapatos se adaptarem ao
2 GRAUER, D. e LI, W.H. Fundamentals of Molecular Evolution, second ed. Sinauer Associates, Inc, Sunderland, MA, 2000. 3 OHNO, S. Evolution by gene duplication. Springer, New York, 1970 22 ambiente hematófago, permanecem não completamente respondidas. Mans e colegas, 2002 demonstraram que carrapatos pertencentes às diferentes famílias, apresentam moléculas antihemostáticas que embora tenham a mesma função, apresentam mecanismos de ação diferentes, sugerindo uma adaptação independente entre carrapatos moles e duros. Outros fatores apóiam essa hipótese, incluindo diferenças na morfologia das glândulas salivares, no comportamento alimentar e nas estratégias reprodutivas (Sonenshine e Gregson, 1970). Entretanto, a presença de moléculas inibidoras da agregação plaquetária, presentes em ambas as famílias, e algumas observadas em todos os artrópodes hematófagos estudados até o momento (Ribeiro, 1995a), ainda sugere a presença de um ancestral comum não hematófago (Mans et al., 2002b), que poderia ser representado por ácaros parasitiformes de vida livre da ordem Holothyrida, que se alimentam de fluídos de ácaros mortos (Walter e Proctor, 1998) supostamente em ambientes nidícolas, após o surgimento dos animais com esses hábitos.
A ruptura das paredes dos vasos sanguíneos, que ocorre por exemplo com a introdução das peças bucais dos carrapatos na pele de seus hospedeiros, imediatamente desencadeia três dos principais mecanismos que suportam a hemostasia. A contração das células musculares da parede dos vasos (vasoconstrição) é o primeiro a ocorrer e rapidamente minimiza a perda de sangue. Em seguida, plaquetas (trombócitos) aderem à matriz de colágeno exposta com o dano vascular, progressivamente diminuindo seu movimento no fluxo sanguíneo ligando-se à superfície subendotelial através de interações com colágeno, laminina e fator de Von Willebrand (vWF). Eventualmente, as plaquetas se encontram ativadas o que leva a importantes mudanças morfológicas e a liberação do conteúdo de seus grânulos. Seus grânulos contem proteínas de adesão como o fibrinogênio (Fbg) e trombospondina e proteínas como a serotonina que retém as proteínas procoagulantes (como fatores ativadores de plaquetas e ADP) na superfície das plaquetas (Dale et al., 2002). Outra alteração conformacional desencadeada pela ativação plaquetária é a perda de simetria nas camadas de fosfolipídios da membrana celular com a exposição do procoagulante fosfatidilserina. Como terceiro evento, a cascata de coagulação é ativada após a ligação do fator tecidual subendotelial (TF), que alcança a circulação sanguínea com o dano vascular, ao fator VIIa da cascata de coagulação. A coagulação sanguínea se dá com a subsequente ativação dos fatores IX, X e II (protrombina) na superfície das plaquetas ativadas que culmina com a geração do complexo FVa-FXa (protrombinase) liberado na corrente sanguínea. Trombina exerce uma série de funções procoagulantes, incluindo a conversão de Fbg em fibrina insolúvel, ativação
23 plaquetária através de receptor (PAR), ativação do fator XIII (transglutaminase) e dos co- fatores V e VII, como mostra a figura 1, adaptado de Francischetti, 2009.
VIA INTRÍNSECA
Pre-calicreína Calicreína Cininogênio Fator XII Fator XIIa VIA EXTRÍNSECA trauma Fator XI Fator XIa Fator VIIa Fator VII 2+ Ca Fator tecidual Fator IX Fator IXa
VIIIa, Ca2+ trauma Fator X Fator Xa Fator X
Protrombina Trombina
Fibrinogênio Fibrina Fator XIIIa
Coágulo de fibrina
Figura 1. Representação esquemática da cascata de coagulação sanguínea.
É através da interação entre integrinas que o processo desencadeado pelas plaquetas se inicia. Plaquetas se ligam a matriz de colágeno através da interação entre integrinas do tipo
α1β1, α2β1, α10β1 e α11β1 presentes em sua superfície (Barczyk et al., 2010). A ativação das plaquetas através da ligação a mediadores como ADP e colágeno, leva a expressão de integrinas αIIbβ3 (sinalização de dentro para fora), um receptor de Fbg que funciona como ponte entre plaquetas ativadas; é a ponte de Fbg que cria o tampão de plaquetas. A interação do Fbg com essa integrina também induz sinais para dentro da célula que culminarão com a liberação de serotonina e ADP e exposição de fosfatidilserina levando a mais agregação plaquetária. Serotonina também contribui para a vasoconstrição. A ativação de enzimas como a fosfolipase A2 (PLA2) leva a liberação de ácido araquidônico o qual é metabolizado por plaquetas e originam tromboxano A2 (TXA2), outro potente vasoconstritor e indutor de agregação plaquetária. As células endoteliais por outro lado produzem prostaciclina I2 (PGI2) que é um inibidor potente da agregação plaquetária de forma a prevenir a formação de agregados celulares na luz dos vasos em sítios distantes da lesão vascular (Francischetti, 2010). Plaquetas ativadas secretam diversos fatores pro-inflamatórios como as citocinas TGF- β, que apresenta propriedades pró-apoptóticas, e IL-1 que é capaz de ativar leucócitos 24 sanguíneos, induzir a expressão de fatores teciduais como o TF e promover a aderência de neutrófilos e monócitos (Gawaz et al., 2005; Weyrich e Zimmerman, 2004). Plaquetas também são fonte de PAI-1 (inibidor de ativador de plasminogênio), um importante inibidor da fibrinólise; também expressam P-selectina e promovem interações celulares entre neutrófilos, plaquetas e células endoteliais; ainda são uma das principais fontes do ligante de CD40 solúvel (CD40L), que por pertencer a superfamília de moléculas do fator de necrose tumoral (TNF), tem múltiplas ações que podem ser significantes no processo de microcoagulação (Slupsky et al., 1998). Essas ações incluem a regulação positiva na expressão de citocinas na musculatura lisa vascular e nas células endoteliais, o aumento na expressão de moléculas de adesão expressa na superfície dessas últimas e o aumento de fator tecidual (TF) em macrófagos (Levi et al., 2004; Opal, 2003; Slofstra et al., 2003; Taylor et al., 2000).
Carrapatos apresentam o ciclo de vida dividido em duas fases distintas: a de vida livre e a de vida parasitária. Na primeira as condições do meio ambiente podem afetar sobremaneira a continuação das espécies; nessa fase carrapatos não se alimentam, realizam a ecdise (ou “muda) entre os estágios de desenvolvimento e estão sujeitos às condições de umidade, temperatura e do encontro com um hospedeiro. Essas exigências apóiam a ideia da relação entre o surgimento de animais tetrápodes oferecendo a oportunidade de um novo nicho (Balashov Yu, 1984). De forma geral, o ciclo de vida de carrapatos inicia-se após a eclosão dos ovos e surgimento das larvas não alimentadas no solo; essas encontrarão um hospedeiro vertebrado onde se alimentarão por aproximadamente sete dias. Larvas alimentadas voltam ao solo para realizar a ecdise para o estágio seguinte de desenvolvimento desses ácaros, as ninfas. As ninfas não alimentadas repetem o passo realizado pelas larvas e então ocorre a muda para adultos, com diferenciação sexual, e fêmeas e machos não alimentados se fixam a um hospedeiro onde se alimentam e copulam; fêmeas completamente alimentadas (teleóginas) se desprendem e completam o ciclo com a postura dos ovos. Nesse sentido, é possível inferir a interferência das condições ambientais no estabelecimento das espécies e na sua perpetuação (Mans e Neitz, 2004a). Entretanto, vale ressaltar que algumas espécies apresentam variações no ciclo descrito acima, entre elas a espécie objeto de estudo desse trabalho, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, classificado como um carrapato monoxeno (ou de um único hospedeiro), o qual está esquematizado a seguir (Fig. 2). Resumidamente, esses carrapatos permanecem fixos ou sobre o mesmo hospedeiro durante os três diferentes estádios de vida parasitária descritos anteriormente, como pode ser observado 25 nos pontos 1, 2 e 3 da figura 2. A postura dos ovos e a eclosão das larvas ocorrem no ambiente como descrito anteriormente para carrapatos heteróxenos (ou de 3 hospedeiros) e são representados respectivamente pelos passos 4, 5 e 6. É certo que esses dois diferentes tipos de ciclos de vida recebem pressões evolutivas distintas, uma vez que apresentam dependência do ambiente e interação com o hospedeiro em diferentes níveis.
Adaptado de Andreolli & Malavazi, 2001
Figura 2. Representação esquemática do ciclo de vida de carrapatos Rhipicephalus (B.) microplus
Além disso, a relação estabelecida entre carrapatos e seus hospedeiros vertebrados ainda pode ter contribuído para o estabelecimento de novas relações decorrentes, através da transmissão de patógenos. De fato, alguns patógenos são ativamente transmitidos apenas por insetos, carrapatos e ácaros durante a hematofagia; várias espécies já foram descritas como vetores de vírus, rickettsias, bactérias, protozoários, fungos e filarias (Balashov Yu, 1984; Sauer et al., 1995). Os patógenos transmitidos por carrapatos causam doenças nos homens e nos animais de criação e companhia. Na clínica veterinária, entre os bovinos, destaca-se a transmissão de doenças hemoparasitárias como a babesiose e anaplasmose, que podem ocorrer isolada mas quando ocorrem concomitantemente levam o animal a um quadro de anemia e prostação, conhecido popularmente como “Tristeza Parasitária Bovina”, em referência às manifestações clínicas da doença. Os agentes causadores da babesiose e anaplasmose, Babesia sp (revisado por Sawczuk, 2007) e Anaplasma sp (revisado por Kocan et al., 2010) respectivamente, são transmitidos durante o repasto alimentar dos carrapatos. Outras espécies de Babesia e Anaplasma também são transmitidas para outras espécies de hospedeiros, como cães (Schoeman, 2009) e homens. Além disso, essas doenças causam enormes prejuízos a pecuária brasileira e mundial, somados aos bilhões de dólares, especialmente associados a queda da produção e ao uso de estratégias não sustentáveis de controle dos ácaros e tratamento dos hospedeiros. Entre os cães, destaca-se a importância das infecções por Erlichia canis (Berrada e Telford, 2009), conhecida popularmente como 26
“Doença do carrapato” que leva frequentemente os cães a óbito, se não tratada precocemente. Como era esperado, carrapatos também causam problemas de saúde pública em diversos países. No Brasil, os casos mais graves são causados pelo agente da Febre Maculosa (Rickettsia rickettsie) transmitido mais comumente pelo carrapato Amblyomma cajennense. Nos Estados Unidos, carrapatos do gênero Ixodes recebem bastante destaque por ser o ácaro vetor da Doença de Lyme, a doença transmitida por vetor mais comum desse país. Bastante grave e causada pela espiroqueta Borrelia burgdorferi, leva a manifestações clínicas que dependem do estágio da doença, mas incluem eritemas, cardites, comprometimento do sistema nervoso central e artrite (Murray e Shapiro, 2010). Além da Doença de Lyme, Erlichiose, Anaplasmose, Bartonelose e encefalites transmitidas por carrapatos, entre outras, já foram descritas em humanos (Angelakis et al., 2010a; Angelakis et al., 2010b; Elston, 2010; Lasala e Holbrook, 2010).
1.2 A Saliva
1.2.1 Papel no metabolismo hídrico e iônico
Durante a fase não parasitária, as glândulas salivares de carrapatos são fundamentais para mantê-los hidratados até o encontro com o hospedeiro, o que teoricamente pode levar anos na natureza (Sauer et al., 1995). A eliminação de água passa a ser controlada e uma saliva com maior concentração de sais, capaz de absorver água do ambiente, é produzida. A saliva então retorna ao corpo do carrapato (Francischetti et al., 2009)
Durante a fase parasitária, a produção de saliva está envolvida em um processo inverso, o de excreção de água. Carrapatos precisam eliminar a água de seus intestinos, concentrando apenas o sangue do hospedeiro que será absorvido. A água passa a ser bombeada dos intestinos em direção a hemocele e então para as glândulas salivares. Estima-se que carrapatos alternem entre os períodos de alimentação e salivação em ciclos de 5 – 20 minutos para a hemoconcentração (Balashov Iu, 1972).
27
1.2.2 Papel na hematofagia
Em vista dos fatos acima descritos, estudar a interface entre carrapatos e seus hospedeiros vertebrados, em especial a família Ixodidae e os mamíferos, assume especial interesse. Atualmente, a saliva de carrapatos tem sido considerada a responsável pelo estabelecimento das interações até o momento descritas entre carrapatos e seus hospedeiros, por ser estrategicamente inoculada pelos carrapatos no local de fixação ao hospedeiro. Durante a infestação, estima-se que carrapatos inoculem em seus hospedeiros aproximadamente 500 µL de saliva a cada 96 h de infestação (Balashov Iu, 1972), promovendo a modulação e o desvio das respostas imunes (Brossard e Wikel, 2004) o que garante o sucesso na hematofagia. Sabendo que algumas espécies permanecem fixas aos seus hospedeiros por longos períodos de tempo, especialmente as pertencentes a família Ixodidae como as espécies monóxenas descritas anteriormente, a quantidade e a variedade de moléculas que podem ser inoculadas no sitio de fixação e que de alguma forma estão envolvidas no estabelecimento da relação parasita-hospedeiro merecem destaque.
A complexidade dessa interface pode ser observada através da composição da saliva desses ácaros. De fato, diversas moléculas presentes na saliva de artrópodes hematófagos como insetos e carrapatos já foram identificadas e são atualmente associadas ao entendimento dos mecanismos de adaptação. Além disso, o interesse na descoberta de novos fármacos é eminente.
1.2.3 Mecanismos moleculares de modulação
A saliva secretada por artrópodes hematófagos pode ser considerada um coquetel farmacologicamente ativo de moléculas com funções diversas. Essas moléculas lidam com a defesa hemostática, sensação de dor e prurido e respostas imunes dos tipos inata e adquirida dos hospedeiros (Alarcon-Chaidez e Bender, 2001; Wikel e Alarcon-Chaidez, 2001) e têm sido descritas na saliva de carrapatos ao longo das últimas duas décadas (Champagne, 1994; Francischetti et al., 2009; Gillespie et al., 2000; Ribeiro e Mather, 1998; Wikel, 1999; Wikel e Alarcon-Chaidez, 2001; Wikel e Bergman, 1997). Atualmente as funções já descritas na saliva de carrapatos de corpo duro são classificadas em inibidores da cascata de coagulação, inibidores da agregação plaquetária, vasodilatadores, proteínas ligantes, proteases, quinases, entre outras, e que serão discutidas a seguir. Entretanto vale ressaltar que, do ponto de vista 28 sistêmico, o resultado da ação dessas proteínas é o controle da resposta imune dos hospedeiros. Uma resposta imune eficiente do hospedeiro poderia bloquear os mecanismos desenvolvidos pelos ácaros (Alarcon-Chaidez e Bender, 2001; Wikel e Alarcon-Chaidez, 2001).
1.2.3.1 Quinase-bradicinina Um dos primeiros mecanismos de controle da resposta inflamatória de seus hospedeiros descritos em carrapatos foi a ação da saliva sobre as cininas (Ribeiro et al., 1985), atividade essa que pode ser responsável pela ausência de dor consequente a fixação e alimentação do carrapato em seu hospedeiro (Ribeiro e Mather, 1998). Dentre os diversos agentes envolvidos na inflamação, a bradicinina desempenha ao menos dois importantes papéis: é mediadora da dor e aumenta a permeabilidade vascular, que leva ao edema (Proud e Kaplan, 1988; Regoli e Barabe, 1980), ambos associados a rejeição dos carrapatos por seus hospedeiros. Bradicinina é formada nos tecidos dos vertebrados após a ativação do fator de coagulação XII, responsável pelo início da via intrínseca de formação do coágulo (discutido a seguir). Cininase I, uma carboxipeptidase, e Cininase II, uma metaloenzima similar a enzima conversora de angiotensina (ACE), são as duas principais enzimas responsáveis pela degradação da bradicinina nos vertebrados, embora outras já tenham sido descritas. Ribeiro e Mather (1998) demonstraram a presença de uma enzima semelhante a cininase II em carrapatos Ixodes scapularis (Ribeiro e Mather, 1998).
1.2.3.2 Prostaglandinas Prostaglandinas (PGs) são sintetizadas a partir do ácido araquidônico (AA) que metabolizado pelas enzimas cicloxigenase 1 e 2 (COX-1 e COX-2) origina PGH2, que por sua vez é convertido a PGD2, PGE2 e PGF2 pelas respectivas sintases. A importância dessas moléculas no metabolismo de mamíferos vem sendo largamente estudado, entretanto a participação durante o desenrolar da relação parasita-hospedeiro tem sido sugerida em estudos atuais (Kubata et al., 2007), inclusive entre carrapatos e seus hospedeiros (Sa-Nunes et al., 2007; Oliveira et al., em preparação). Supostamente, PGs apresentam diversas atividades que contribuiriam para o sucesso da hematofagia realizada por carrapatos. As primeiras evidências de sua presença na saliva desses artrópodes foram descritas a aproximadamente 40 anos atrás
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(TATCHELL, 1971 apud3 Bowman et al., 1996) e desde então acredita-se que haja uma importante relação com a competência desses ácaros como vetores de agentes infecciosos. PGs e outros eicosanoides já foram descritos em diversos parasitas, tais como protozoários, trematoides, cestoides e nematoides (Belley e Chadee, 1995). Os níveis de atividade semelhante a PGE e as concentrações em saliva de diferentes espécies de carrapatos também foram determinados em algumas condições. Seu papel sobre a função de células dendríticas do hospedeiro vem sendo demonstrado (Cavassani et al., 2005; Oliveira et al., 2008a; Sa- Nunes et al., 2007) somando-se às evidências da participação ativa da saliva na modulação da imunidade desenvolvida pelos hospedeiros. Além disso, as PGs desempenham diferentes funções nos próprios parasitos, tais como osmorregulação e evasão da resposta imune (Kubata et al., 2007).
1.2.3.3 Inibidores da hemostasia
Diversos mecanismos são responsáveis pela manutenção da hemostasia nos hospedeiros, com os quais carrapatos precisam lidar durante todo o processo de aquisição de sangue. Os processos de formação de trombos e coágulos são finamente regulados e orquestrados por uma complexa rede de moléculas capazes de ativar-se sequencialmente. A inibição desse quadro se faz necessária desde os primeiros contatos das peças bucais dos carrapatos com seus hospedeiros.
Plaquetas são inicialmente ativadas por colágeno e adenosina difosfato (ADP). Dentro de aproximadamente 4 segundos após a lesão vascular, um plug (ou tampão) de plaquetas já pode ser visualizado. Plaquetas ativadas liberam mais ADP que, junto com serotonina, produz tromboxano A2 (TXA2) levando à formação de trombina, que em última análise, retroalimentam a agregação plaquetária; liberam também outros mediadores inflamatórios como as prostaciclinas que previnem a desintegração do tampão homeostático nos danos vasculares (Francischetti, 2009). Interessantemente, extratos salivares de carrapatos são capazes de inibir a agregação plaquetária in vitro. Por se tratar de um fenômeno redundante, não é surpreendente que essa modulação se dê através da regulação de diferentes moléculas agonistas da agregação plaquetária bem como da liberação de inibidores dessa células, como os inibidores RGD descritos a seguir. Agentes anticoagulantes encontrados na saliva de
3 TATCHELL, 1971. An active constituent of the saliva of the cattle tick Boophilus microplus. Proceedings of 3rd international Congress of Acarology, 1973. 30 carrapatos previnem a formação de trombina e por sua vez também são capazes de ativar plaquetas, e serão posteriormente discutidos.
É importante ressaltar que os inibidores da agregação plaquetária agem em diferentes mecanismos. Essas moléculas podem atuar como inibidoras da ativação plaquetária, inibidoras de plaquetas após a ativação e inibidores após a agregação dessas células (Mans e Neitz, 2004a, b). Dentre as moléculas descritas em carrapatos destacam-se as que apresentam o domínio RGD, formado pela sequência de 3 aminoácidos (arginina, glicina e ácido aspártico) que previnem a ligação do fibrinogênio às plaquetas. Disagregina e savignigrina inibem a agregação plaquetária no plasma estimulada pelos mais importantes agonistas fisiológicos tais como o ADP, trombina, fator ativador de plaqueta (PAF) e colágeno. Além disso, savignigrina é capaz de desagregar plaquetas já ativadas com ADP (Karczewski et al., 1994; Mans et al., 2002a; Mans e Neitz, 2004b). Essas moléculas agem através da ligação aos trombócitos em repouso ou ativados com cinética e afinidades similares (KD: 50–70 nM). O receptor alvo é a principal integrina presente nas plaquetas, aIIbb3 (também conhecida como glicoproteína (GP) IIb-IIIa), que impede a ligação de fibrinogênio com seu receptor pivô nesse tipo celular. Além disso, a savignigrina apresenta seu domínio RGD em domínio Kunitz (Mans et al., 2002a), que será discutido a seguir.
1.2.3.4 Anticoagulantes
Além de mecanismos antihemostáticos, carrapatos desenvolveram mecanismos inibidores da coagulação sanguínea. Geralmente essas moléculas apresentam domínios proteicos do tipo Kunitz e inibem serina proteases envolvidas na coagulação, como o fator Xa e VIIa. O exemplo típico dessa molécula é o inibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) endógeno, um potente agente anticoagulante (Corral-Rodriguez et al., 2009). Interessantemente, os inibidores do tipo Kunitz descritos em carrapatos são capazes de inibir também e simultaneamente a trombina, e por isso são descritos como potentes ou multifuncionais inibidores do tipo Kunitz (Macedo-Ribeiro et al., 2008). Esses inibidores já foram descritos em diversas espécies de carrapatos, inclusive pertencentes a diferentes famílias, como a ornithodorina de O. moubata, a boophilina de R.(B.) microplus, a amblina de Amblyomma hebraeum (Lai et al., 2004) e a hemalina de Haemaphysalis longicornis. Além disso, essas moléculas foram encontradas em órgãos como glândula salivar e intestino e na
31 hemocele. Entretanto, não surpreendentemente, carrapatos apresentam as serina proteases, conhecidas como serpinas (do inglês, serine protease inhibitors) que não parecem apresentar domínio Kunitz, embora apresentem entre si uma certa similaridade de estrutura primária. Essas moléculas serviriam como mais uma estratégia para o controle da coagulação sanguínea e possível alvo para a intervenção profilática (Imamura et al., 2005; Mulenga et al., 2001). Algum sucesso já foi observado com o uso dessas moléculas como antígenos candidatos (Prevot et al., 2009; Prevot et al., 2007). Essas moléculas parecem ter baixo peso molecular e serem potentes inibidores naturais (Ciprandi et al., 2006).
1.2.3.5 Ligantes
Uma possível estratégia usada por carrapatos para se evadir da resposta imune dos hospedeiros é produzir proteínas que ligam-se seletivamente e neutralizam as quimiocinas que normalmente recrutam células dos sistemas imunes inato e adquirido e protegem o hospedeiro dos parasitos. De fato, a atividade neutralizadora de quimiocinas vem sendo descrita por alguns pesquisadores. Déruaz e colaboradores (2008) demonstraram três proteínas ligantes de quimiocinas presentes na saliva de carrapatos, chamadas de evasinas, que apresentam atividade altamente seletiva sobre as quimiocinas. Por exemplo, a Evasina-1, proteína monomérica de 94 aminoácidos, tem especificidade para quimiocinas do subgrupo das quimiocinas CC, semelhantes entre si (CCL3, CCL4 e CCL18). Essa proteína se liga às quimiocinas com relativa alta afinidade e por seu caráter anti-inflamatório, tem recentemente sido indicada como um agente terapêutico. Além disso, já foi demonstrada que a saliva de carrapatos inibe a função quimiotática de MIP-1α frente a células dendríticas diferenciadas de medula óssea (Oliveira et al., 2008a). Adicionalmente, ensaios in vitro mostraram a função ligante de quimiocina da saliva de carrapatos. Oliveira e colaboradores demonstraram esse efeito na migração de células dendríticas murinas para a pele dos animais inoculados com a saliva de carrapatos R. sanguineus.
Outra categoria de ligantes que merece destaque é a família das lipocalinas. As lipocalinas foram inicialmente descritas como proteínas que possuem a capacidade de se ligar a pequenas moléculas hidrofóbicas (Flower, 1996; Flower et al., 1993). Essas moléculas podem apresentar adicionalmente um sítio de ligação com moléculas hidrofílicas, como a histamina, e se classificam numa categoria especial de lipocalinas por terem perdido
32 características fundamentais na sua classificação (Paesen et al., 2000). No ambiente inflamatório que pode estar sendo desencadeado pelo carrapato no sítio de alimentação, essas moléculas teriam a capacidade de se ligar e inibir as funções de histamina, serotonina, LTB4 (Beaufays et al., 2008a; Sangamnatdej et al., 2002) e outros fatores, auxiliando o sucesso no repasto sanguíneo (Kemp e Bourne, 1980; Ribeiro et al., 1985). Essas moléculas já foram descritas em carrapatos dos gêneros de corpo duro (Ixodidae) e de corpo mole (Argasidae), conforme discutido posteriormente.
Finalmente, moléculas ligantes de imunoglobulinas foram descritas na saliva de carrapatos, especialmente Ixodes scapularis e R. appendiculatus. Essas moléculas parecem ter um papel favorável na hematofagia e interessantemente na relação entre machos e fêmeas: essas moléculas são abundantemente expressas na glândula salivar de machos e não nas de fêmeas (Packila e Guilfoile, 2002; Wang e Nuttall, 1994). O efeito que essas moléculas podem ter sobre a resposta imune é evidente e será abordado a seguir.
1.2.3.6 Imunomodulação – efeitos celulares, na produção de citocinas e anticorpos
Diversos efeitos sobre os diferentes subtipos celulares já foram descritos para a saliva de artrópodes hematófagos, especialmente entre os carrapatos.
Sobre as células T, de forma geral, a saliva de carrapatos deprime a função celular imune através da inibição da ativação e proliferação celular. A infestação por Dermacentor andersoni reduz significativamente a proliferação in vitro de linfócitos T ativados por Concanavalina A (ConA) (Ramachandra e Wikel, 1992). A saliva de Ixodes scapularis inibe a resposta proliferativa de linfócitos frente a ConA e a fitohemaglutinina (PHA) (Mejri et al., 2002; Urioste et al., 1994). Linfócitos do linfonodo de camundongos C3H/HeJ repetidamente infestados por Rhipicephalus sanguineus apresentam redução da proliferação induzida por ConA (Ferreira e Silva, 1999). Entretanto, a infestação por carrapatos não altera a proliferação in vitro frente à LPS (Ramachandra e Wikel, 1992). Adicionalmente, a resposta de esplenócitos de camundongos BALB/c repetidamente infestados por carrapatos Ixodes ricinus não sofre alteração após uma ou duas infestações e aumenta após a terceira e quarta exposição (Dusbabek et al., 1995). Interessantemente, a supressão da resposta a ConA foi detectada após nove dias de infestação (Borsky et al., 1994). Como era de se esperar, carrapatos
33 desenvolveram maneiras de suprimir ou desviar a resposta de linfócitos T e a produção de citocinas (Gillespie et al., 2000; Wikel, 1999; Wikel e Bergman, 1997).
Turni e colaboradores (Turni et al., 2002, 2007) demonstraram que extrato de glândula salivar de R.(B.) microplus inibe a proliferação policlonal de linfócitos de bovinos das raças Brahma e Hereford em respectivamente 89% e 41%. Outro estudo baseado nos carrapatos Haemaphysalis bispinosa e Hyalomma anatolicum anatolicum, espécies que naturalmente infestam ovinos, mostrou que durante certos períodos (6-9 dias), a infestação reduz significativamente o número de linfócitos T, especialmente os linfócitos γδ e CD8 desses animais (Boppana et al., 2004). Esse trabalho também destaca que a infestação leva a um aumento das células T CD4 bem como das células B, interferindo com as relações CD4/CD8 e T/B; além disso, descreve a inibição da proliferação celular induzida por ConA. Entretanto resultados exclusivos para cada espécie de carrapato ou de acordo com o número de infestações são observados e dificultam o entendimento da relação entre os padrões de resposta apresentado pelos diferentes hospedeiros e o desenvolvimento de imunidade protetora efetivamente.
Sobre as células dendríticas (DC), já foram descritas alguns efeitos induzidos pela saliva de carrapatos. Entre eles, destacam-se a inibição da diferenciação de células derivadas da medula óssea e a indução da expressão de moléculas de MHC classe II nessas células. Além disso, a maturação de células dendríticas frente a LPS na presença de saliva de carrapatos R. sanguineus é prejudicada, com diminuição da expressão de moléculas coestimuladoras e da síntese de IL-12, mostrando-se células menos eficazes na ativação de células T (Cavassani et al., 2005). Em estudo posterior, Oliveira e colaboradores demonstraram ainda que o efeito inibidor da ativação celular frente ao LPS esta associado à produção de IL-10 em níveis aumentados enquanto a produção de citocinas inflamatórias como IL-12p70 e TNF-α em níveis diminuídos (Oliveira et al., 2010). Além disso, a ativação da via de receptores do tipo Toll (TLR) também está alterada nesse subtipo celular ativado na presença de ligantes do receptor e saliva de carrapatos R. sanguineus. Adicionalmente, Sá- Nunes e colaboradores (2007) demonstraram o efeito imunossupressor de PGs presentes na saliva de carrapatos I. scapularis sobre DCs.
Respostas variáveis têm sido encontradas a respeito da modulação exercida por carrapatos sobre a produção de citocinas por macrófagos. Extrato de glândula salivar de D. andersoni regula negativamente a produção de IL-1 e TNF-α (Ramachandra e Wikel, 1992). 34
Entretanto, a infestação por I. scapularis ou I. pacificus não produz alterações consistentes na produção de citocinas por macrófagos (Schoeler et al., 1999). Por outro lado, Ferreira e Silva demonstraram que a saliva de carrapatos R. sanguineus além de prejudicar a proliferação de linfócitos T, é capaz de inibir a atividade microbicida de macrófagos infectados com Trypanossoma cruzi através da diminuição da síntese de NO (Ferreira e Silva, 1998).
Já foi demonstrado o efeito de diferentes espécies de carrapatos sobre linfócitos Natural Killer (NK) humanos. Espécies como I. ricinus e R. appendiculatus não interferem com a atividade desse subtipo celular, entretanto o extrato de glândula salivar (EGS) de carrapatos D. reticulatus é um potente inibidor da função de NK durante o estágio de alimentação. Vale ressaltar que extratos de glândulas salivares provenientes de carrapatos não alimentados não mostraram as mesmas propriedades.
Recentemente, foram identificadas duas proteínas com capacidade de inibição da ação de neutrófilos tratados com saliva de carrapatos Ixodes scapularis. Através da redução da expressão de integrinas do tipo β, ocorre prejuízo da aderência e da capacidade de matar bactérias em neutrófilos humanos (Guo et al., 2009). Anteriormente outros trabalhos já haviam demonstrado o efeito da saliva de carrapatos sobre os neutrófilos (Beaufays et al., 2008b; Montgomery et al., 2004), sugerindo que embora esse subtipo celular seja amplamente encontrado no sítio de inflamação induzido pela infestação (observação pessoal), seu grau de ativação pode variar de modo a contribuir pouco para o controle do ectoparasita e dos patógenos transmitidos por ele. Turni e colaboradores (Turni et al., 2002, 2007) também observaram que os neutrófilos e monócitos de bovinos de raça taurina apresentam menor capacidade de fagocitar bactérias e sofrer consequente ativação.
Os granulócitos por sua vez tem recebido bastante destaque na interação carrapatos hospedeiros. Atualmente, a participação dessas células em resposta às infestações tem sido associada ao desenvolvimento de resistência entre os hospedeiros. Diversos trabalhos tem mostrado uma correlação positiva entre o número de basófilos na lesão de alimentação dos carrapatos a uma resposta imune adquirida contra os ácaros (Brossard e Fivaz, 1982; Brown et al., 1984; Gill, 1986; Mbow et al., 1994; Walker et al., 1985; Franzin et al., em preparação). Resumidamente, esse trabalhos mostram que diferentes hospedeiros apresentam distintos graus de suscetibilidade a carrapatos de diversas espécies, mas que uma vez detectada algum grau de prejuízo no desenvolvimento dos ácaros após a infestação e portanto, resistência dos hospedeiros, ocorre o envolvimento dos granulócitos, com especial atenção para os basófilos, 35 embora o envolvimento de eosinófilos e mastócitos também vem sendo sugerido. Esses trabalhos também sugerem o desenvolvimento de uma resposta cutânea do tipo tardia não clássica, uma vez que conta com a participação desses subtipos celulares. Mais recentemente, o papel de basófilos na aquisição de imunidade a carrapatos foi elegantemente demonstrado por meio de modelo murino (Wada et al., 2010).
A infestação por carrapatos reduz a habilidade do hospedeiro em desenvolver resposta humoral primária a um imunógeno administrado no decorrer e após vários dias da infestação (Walker et al., 1985). Fivaz (1989) demonstrou que a infestação de coelhos por R. appendiculatus reduz a habilidade de montar uma resposta humoral a albumina sérica bovina administrada durante o pico de alimentação dos carrapatos (Fivaz, 1989). Recentemente ficou demonstrado que hospedeiros bovinos com diferentes fenótipos de suscetibilidade às infestações apresentam resposta humoral diferenciada; os níveis de IgG1 e IgG2 estão diminuídos em animais suscetíveis sugerindo um papel da imunidade protetora mediada por anticorpos (Kashino et al., 2005). A descrição de proteínas ligantes de imunoglobulinas corrobora essa hipótese. Entretanto, os mecanismos responsáveis por essa modulação ainda são desconhecidos. O efeito pode ser devido a modulação exercida sobre outras células do sistema imune como células T e/ou apresentadoras de antígenos (Cavassani et al., 2005; Oliveira et al., 2010; Oliveira et al., 2008a; Franzin et al., em preparação).
Extrato de glândula salivar de D. andersoni suprime a produção das citocinas IL-1 e IFN-γ por linfócitos de camundongos não infestados (Ramachandra e Wikel, 1992). Por outro lado, a saliva de Ixodes scapularis inibe a produção de IL-2 por esplenócitos murinos (Urioste et al., 1994). A infestação por carrapatos causa a regulação negativa de citocinas do padrão Th1 e polariza a resposta para o padrão Th2 da resposta imune. A infestação de camundongos C3H/HeJ com carrapatos ninfas de Ixodes scapularis resulta na diminuição de IL-2 e IFN-γ, começando aos quatro dias após a infestação e retornando ao normal apenas no dia 12 (Zeidner et al., 1997). No mesmo estudo, os níveis de IL-4 permanecem elevados 12 dias após a exposição e a quantidade de IL-10 atinge seu máximo ao décimo dia após a alimentação, multiplicando-se por aproximadamente 4,5 vezes as quantidades encontradas nos controles (Zeidner et al., 1997). Camundongos BALB/c e C3H/HeN tem significantemente menos citocinas IL-2 e IFN-γ e um aumento de IL-4 e IL-10 ao final de cada uma de quatro infestações com carrapatos ninfas de I. scapularis (Schoeler et al., 1999). Além disso, nenhuma linhagem de camundongo desenvolve resistência adquirida a I. scapularis. Uma
36 polarização bastante pronunciada para o padrão Th2 de resposta é observada quando camundongos C3H/HeN são infestados com I. pacificus (Schoeler et al., 1999). Extrato de glândula salivar de I. ricinus suprime a produção de IFN-γ e aumenta a de IL-10 por linfócitos de camundongos de BALB/c (Kopecky et al., 1999). Citocinas de camundongos C3H/HeJ infestados com adultos do carrapato R. sanguineus são moduladas para o padrão Th2 (Ferreira e Silva, 1999). Também já foram estudados os efeitos moduladores de SGE sobre a síntese de citocinas por células humanas, e demonstraram a indução do padrão Th2 de resposta imune (Kovar et al., 2002).
1.3 Descoberta de antígenos e desenvolvimento de vacina anticarrapato
1.3.1 Estratégias vacinais anticarrapatos
Outro fator que demonstra a estreita relação desenvolvida entre carrapatos e seus hospedeiros foi o desenvolvimento ou a seleção de mecanismos que levaram a especificidade ao hospedeiro. Carrapatos coevoluiram com seus hospedeiros e parecem ter desenvolvido estratégias comuns com mecanismos específicos entre as diferentes combinações de espécies de carrapatos e hospedeiros. Evidentemente, essa relação se estabeleceu de acordo com os mecanismos já abordados mas ocorreu de forma ligeiramente diferente entre as espécies e para bovinos, diferentemente entre raças. Não é demais ressaltar o papel da imunidade do hospedeiro no estabelecimento dessa relação, e as diferenças que podemos observar entre as raças taurinas e zebuínas em resposta às infestações e aos antígenos de carrapatos (Abatepaulo et al., 2008; Carvalho et al., 2008; Turni et al., 2002; Wambura et al., 1998; Franzin et al., em preparação; Moré et al., em preparação). Está bem estabelecido que, no caso de bovinos, o gado zebuíno (Bos indicus) é menos acometido por carrapatos que o gado europeu (Bos taurus) (Frisch, 1999; Wambura et al., 1998). Contudo, os mecanismos que conduzem a resistência aos ectoparasitas ainda não foram efetivamente elucidados, mas os dados acumulados na literatura atual sugerem o envolvimento de linfócitos Th1 e reação cutânea tardia com participação de basófilos, conhecida como “do tipo Jones-Mote” (Allen, 1973; Bechara et al., 2000; Brown e Askenase, 1985; Brown et al., 1982; Ferreira et al., 2003; Latif et al., 1991a; Latif et al., 1991b). Além disso, pelo menos em cobaias, foi demonstrada que essa resistência poderia ser transmitida parcialmente pelo soro de animais infestados,
37 indicando a importância dos anticorpos na proteção (Trager, 1939). Possivelmente esses dados contribuirão para a identificação e seleção de antígenos protetores.
Nas últimas décadas muito esforço tem sido empregado no intuito de se desenvolver uma vacina anticarrapato eficaz. Atualmente estão disponíveis no mercado de produtos veterinários duas vacinas: Gavac™ (Rodriguez et al., 1995a; Rodriguez et al., 1995b) de fabricação cubana (Heber Biotec), e TickGard Plus™ (Willadsen et al., 1995) de fabricação australiana (Intervet). Ambas foram desenvolvidas contra o antígeno Bm86, que é uma glicoproteína de superfície de 86 kDa de células intestinais de carrapatos. Infelizmente, a eficiência dessas vacinas não tem sido satisfatória, e mesmo com seu uso, ainda se faz necessário utilizar formas químicas de controle, além dos sucessivos reforços que devem ser administrados, dificultando o manejo da vacina. O antígeno Bm86 é um antígeno oculto (concealed antigen), ou seja, não ocorre sua exposição ao hospedeiro durante uma infestação natural. Isso pode comprometer a eficiência da vacina, uma vez que sem exposição frequente ao antígeno não ocorre preservação de imunidade. Esse certamente é um aspecto negativo desse tipo de vacina, que poderia ser contornado com estratégias que utilizem antígenos expostos, como os antígenos salivares.
Outro fator que deve ser considerado é a complexidade do carrapato, que muito provavelmente exigirá uma vacina multicomponente. Atualmente, existem outros antígenos candidatos potenciais sob avaliação para controlar diferentes espécies de carrapatos, porém, dentre os já testados, nenhum apresenta eficácia compatível com as exigências da produção animal. Além disso, é desejável que vacinas anticarrapatos modernas controlem mais de uma espécie de carrapato, bem como interfiram na transmissão de patógenos (de la Fuente e Kocan, 2003). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), juntamente com órgãos associados como a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA), divulga boletins e comunicados técnicos atualizados com o objetivo de auxiliar produtores rurais brasileiros no controle dos carrapatos (Catto et al., 2010; Koller et al., 2009). Entretanto essas publicações enfocam especialmente o aprimoramento de estratégias convencionais de controle e não sugerem novas estratégias eficientes e sustentáveis para solução do problema, como pretende o presente trabalho. Assim, a atual situação exige que novos antígenos sejam descobertos. As abordagens genômicas/proteômicas e leituras imunobiológicas de alta processividade permitem que essa demanda seja atendida de forma otimizada.
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1.3.2 Uso de estratégias genômicas e proteômicas na descoberta de antígenos
O advento das tecnologias em genômica e perfilamento de genes em larga escala, de fato, têm tornado possível estabelecer um conjunto mais abrangente daqueles expressos em situações fisiológicas distintas de parasitas, e vêm mostrando diferenças na expressão gênica em órgãos e tecidos durante as múltiplas fases do desenvolvimento parasitário. Essa abordagem tem se mostrado bastante interessante para os artrópodes, visto que ao se comparar glândulas salivares de ninfas e adultos de carrapatos I. scapularis observou-se que vários genes são expressos diferencialmente, dependendo da forma parasitária (Nazareth et al., 2006; Ribeiro et al., 2006). Esse tipo de informação pode orientar a escolha de antígenos no sentido de identificar aqueles cuja expressão estende-se a todas as fases parasitárias, ou ainda outros que desempenham papel crucial em determinada fase. Vale lembrar que a resposta imune do hospedeiro afeta profundamente a expressão gênica dos parasitas, inclusive carrapatos, fenômeno atestado pelos inúmeros mecanismos de escape já descritos. Tecnologias recentes, como a construção de transcriptomas, tem se mostrado promissoras para a triagem rápida, sistemática e global de antígenos e podem representar um interessante método para a seleção de candidatos vacinais (de la Fuente e Kocan, 2003).
As tecnologias disponíveis para estudos de transcriptomas possibilitaram a clonagem em larga escala dos genes de interesse (GIs) e a realização de testes de imunogenicidade, como por exemplo, com antígenos entregues sob a forma de DNA nu para avaliação da resposta cutânea induzida (Ciprandi et al., 2006). Os ensaios realizados por Valenzuela e colaboradores mostraram que 25-30% dos GIs testados induziram reações de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH), tanto para flebotomíneos quanto para carrapatos I. scapularis e, entre os GIs dos primeiros, apenas 50% dos positivos para DTH mostraram capacidade para induzir resposta humoral, o que sugere que nem todo GI induz necessariamente os dois tipos de resposta (Oliveira et al., 2006; Valenzuela, comunicação pessoal). Esses resultados reforçam a necessidade de triar os GIs quanto à sua capacidade de induzir respostas celulares. Mais recentemente o grupo do Valenzuela mostrou que nem sempre GIs indutores de resposta cutânea tardia são protetores, contudo se induzirem a produção de citocinas relacionadas ao perfil Th1, como IFN-γ, o são (Oliveira et al., 2008b). Além disso, o caráter multicomponente da DTH tem auxiliado a determinação do status da resposta imune a diferentes antígenos (Dietert et al., 2010; Hernandez et al., 2005), entretanto seu papel na proteção contra patógenos ainda é controverso (Belkaid et al., 2000; Gomes et
39 al., 2002; Valenzuela et al., 2001). Na medicina veterinária, associada à detecção de resposta imune humoral, a avaliação da DTH tem se mostrado útil para detecção de resistência a doenças (Heriazon et al., 2009; Hernandez et al., 2003).
Por outro lado, interferência por RNA (RNAi) é uma abordagem de genética reversa baseada no uso de ácidos nucléicos para o controle da expressão gênica, em nível pós transcricional. O processo se inicia com a síntese de uma molécula de RNA de dupla-fita (dsRNA) específica para o gene de interesse que em seguida, é clivada por uma enzima chamada Dicer, presente no citoplasma. Essa clivagem origina diversas moléculas de RNA “curtas” (short interference RNAs, siRNA). Esses siRNAs associados ao complexo enzimático RISC (RNA-induced silencing complex), se ligam ao mRNA do gene de interesse, levando à degradação do mRNA de forma a guiar a regulação gênica (Mello e Conte, 2004). Mecanismos de silenciamento pós-transcricionais de genes por moléculas de RNA foram descritos para todos eucariotos estudados até o momento, e a interferência por RNA se mostrou uma excelente ferramenta para estudar a genômica funcional de uma variedade de organismos, além de outras aplicações (Araujo et al., 2007; Mitchell et al., 2007; Zhou et al., 2006a). Trabalhos recentes têm sugerido que a tecnologia de interferência por RNA pode auxiliar na descoberta de antígenos contra diversos patógenos/parasitas (Hannon, 2002), dentre eles os carrapatos (de la Fuente et al., 2006a), através da análise da ausência da função da proteína estudada. Com isso, é possível prever o papel que a imunidade protetora teria sobre o desenvolvimento do carrapato caso fosse anulada a atividade dessas proteínas (antígenos). Trata-se, portanto, de mais uma técnica baseada numa estratégia genômica, nesse caso, acompanhada de uma triagem in vivo, uma vez que os GIs são silenciados diretamente nos carrapatos. Diversos trabalhos têm mostrado o papel dessa estratégia na descoberta de antígenos para controle e terapêutica do câncer e de uma ampla gama de agentes, entre eles vírus, bactérias e parasitos (Hirsch, 2010; Katakowski e Palliser, 2010; Yoshino et al., 2010). Alguns trabalhos demonstram a utilização de interferência por RNA na triagem de antígenos de carrapatos (de la Fuente et al., 2005; de la Fuente et al., 2006b; Narasimhan et al., 2004; Nijhof et al., 2007; Ramakrishnan et al., 2005). Seu uso otimiza o rastreamento de um número grande de genes de uma só vez em busca de potenciais candidatos a uma vacina, uma vez que despende um período curto de tempo e exige um número pequeno de animais. Esses estudos têm auxiliado a confirmar a função predita de genes, avaliar seu papel na biologia dos ácaros e propor a seleção de antígenos candidatos para o desenvolvimento de vacinas.
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Associada às outras técnicas para avaliação de moléculas candidatas, a produção das proteínas recombinantes correspondentes aos GIs estudados tem sido largamente empregada. Com isso, tem sido possível realizar a caracterização, avaliação da imunogenicidade e potencial vacinal dessas moléculas para uma ampla gama de enfermidades (Barnard, 2010) e estudos recentes demonstraram o uso de estratégias proteômicas na identificação de antígenos candidatos de vetores artrópodes (Souza et al., 2010; Teixeira et al., 2010).
À luz do conhecimento atual da biologia dos carrapatos em posse das modernas estratégias “ômicas”, a pesquisa por antígenos protetores tem se focado em moléculas não ocultas (Ribeiro e Francischetti, 2003), ou seja, proteínas que estejam em contato com o hospedeiro durante a infestação, já que são consideradas como as responsáveis pelo sucesso da hemostasia, embora a associação de moléculas com essas funções ainda pode ser empregada (Habeck, 2002; Trimnell et al., 2002). Além disso, tem sido possível identificar moléculas imunogênicas através do estudo das glândulas salivares ou de moléculas presentes na saliva dos ácaros que podem ser utilizadas como antígenos vacinais, protegendo os hospedeiros das infestações e possivelmente da transmissão de patógenos. O contato dos hospedeiros com essas moléculas em condições naturais contribuiria para a manutenção da memória imunológica. Em vista do exposto, a intrigante questão se o bloqueio da imunossupressão induzida pelos carrapatos contribuiria para a aquisição de resistência a esses ácaros permanece em discussão e recentes avanços vem sendo adquiridos na identificação de moléculas essenciais ao estabelecimento da relação parasita-hospedeiro. A participação das estratégias genômicas e proteômicas na busca e identificação dessas moléculas candidatas vacinais, especialmente para carrapatos (Anatriello et al., 2010; de la Fuente et al., 2010; Maruyama et al., 2010), merece destaque.
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Objetivos
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2 Objetivos
2.1 Gerais
2.1.1 Selecionar antígenos candidatos para uma vacina anticarrapatos utilizando estratégias genômica e proteômica.
2.2 Específicos
2.2.1 Avaliar o potencial de genes de interesse (antígenos candidatos), sob a forma de DNA nu, induzirem resposta cutânea tardia em bovinos da raça nelore (resistentes a infestações com carrapatos).
2.2.2 Analisar o efeito do silenciamento gênico dos antígenos candidatos (genes de interesse) com uso de RNA interferência em carrapatos R.(B.) microplus.
2.2.3 Produzir as proteínas recombinantes correspondentes a alguns genes de interesse selecionados.
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Materiais e Métodos
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3 Materiais e Métodos
3.1 Animais experimentais
Bovinos das raças Holandês Preto e Branco (HPB, n=3) e da raça Nelore (NEL, n=9), não irmãos entre si, de aproximadamente 18 meses de idade, previamente infestados com carrapatos R. microplus foram mantidos na Faculdade de Zootecnia e Engenharia Alimentar (FZEA-USP), Campus de Pirassununga, SP, ou em propriedade particular no município de Sertãozinho, SP. Os animais foram alimentados por pastagem com suplementação no cocho, sob cuidados veterinários, de acordo com as exigências de saúde e sanidade.
3.2 Escolha dos genes de interesse
Os genes testados foram selecionados entre aqueles presentes na biblioteca de cDNA de glândula salivar proveniente de carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis, concluída em 2007 pelo grupo; esses foram selecionados por se tratarem de moléculas que apresentam características de prováveis antígenos protetores, e portanto, desejáveis numa formulação vacinal. Foram consideradas características relevantes a abundância relativa, que pode ser traduzida pela expressão em distintas fases parasitárias, bem como a quantidade de transcritos presentes nas amostras, a presença da seqüência de peptídeo sinal, e portanto, se tratarem de proteínas secretadas e ainda, mas não menos importante, por possuírem função putativa relevante na interação parasito-hospedeiro. A biblioteca utilizada para o presente estudo pertence ao banco de bibliotecas do grupo da FMRP-USP, que contempla o transcriptoma de órgãos de carrapatos em diferentes estágios de vida e alimentados em hospedeiros geneticamente diferentes quanto a resistência às infestações.
3.3 Triagem por DNA nu
3.3.1 Obtenção dos DNAs plasmidiais - Cultura bacteriana
E.coli (linhagem TOP-10) recombinantes (transformadas com os genes selecionados) foram cultivadas em meio LB ágar com canamicina a 30 µg/ml por no mínimo 12 h a 37ºC. Em seguida, colônias isoladas foram transferidas individualmente para 5 mL de meio LB líquido contendo a mesma concentração de canamicina (pré-inóculo) em tubo de ensaio
45 plástico de 50 mL (Costar) o qual foi incubado em agitador Orbital Shaker (ThermoForma) a 37° C a 300 rpm por 8 h. Em seguida, 2,5 mL dessa cultura foram transferidos para 1,25 L de meio LB líquido, também contendo 30 µg/ml de canamicina, e incubados por aproximadamente 14 h a 250 rpm em agitador Incubator Shaker Series Innova® 44 (New Brunswick Scientific). Imediatamente antes da purificação, as culturas (2,5 L por gene clonado) foram divididas em garrafas de 400 mL e centrifugadas (Legend Mach 1.6R, Sorvall) a 5000 rpm por 20 minutos. Cada cultura rendeu aproximadamente uma biomassa de 5 g.
3.3.2 Purificação de DNA plasmidial (GigaPrep)
Essa etapa foi realizada com a utilização do kit EndoFree® Plasmid Purification Kit (Qiagen®), seguindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, à biomassa recuperada adicionou-se 125 mL de tampão P1 e em seguida, o mesmo volume do tampão P2. Essa suspensão foi mantida a temperatura ambiente por 5 minutos e homogeneizada por inversão do recipiente. Nesse período, os filtros foram acoplados a garrafas plásticas novas, livres de LPS. Foram então adicionadas de 125 mL do tampão P3 e homogeneizadas vigorosamente. Essa etapa consiste na lise da parede bacteriana para obtenção do material plasmidial. O material obtido foi então transferido para o filtro já acoplado a garrafa, incubado por 10 minutos e então filtrado utilizando-se uma bomba de vácuo (Quimis). Após a passagem pelo filtro de todo o volume, adicionou-se 50 mL do tampão FWB2, misturando-se o material retido e submetendo-o novamente à filtração, até esgotar o material líquido. Adicionou-se 30 mL do tampão ER ao material filtrado, homogeneizando por inversão, e incubou-se por 30 minutos no gelo. Enquanto isso, as colunas foram equilibradas com 75 mL do tampão QBT, por gravidade. Em seguida, o volume filtrado foi transferido para o topo das colunas (uma coluna por clone purificado) de resina para que o material passasse por gravidade e o DNA fosse retido à coluna, por afinidade; essa etapa ocorre em aproximadamente 45 minutos. A coluna foi lavada com 600 mL do tampão QC, para que na seqüência, o DNA fosse eluído da coluna com 100 mL do tampão QN. Imediatamente após a purificação, adicionou-se 70 mL de isopropanol ao DNA eluído e este foi precipitado por ultra centrifugação (15000 x g por 45 minutos a 4° C) em centrífuga J2-HS (Beckman). O pellet obtido foi então ressuspenso em 1 mL de PBS livre de LPS e congelado até o momento do uso. 46
3.3.3 Inoculação de DNA plasmidial (genes de interesse ou DNA nu) em bovinos previamente infestados para verificar indução de reação cutânea tardia
Bovinos da raça nelore infestados naturalmente com carrapatos, sensibilizados aos antígenos salivares, foram inoculados na orelha com os genes clonados e vetor plasmidial vazio descritos acima. Para o preparo dos inóculos, as alíquotas de DNA purificado foram quantificadas em Gene Quant (GE Amersham) e diluídas de forma a fornecer as quatro concentrações diferentes que já foram avaliadas nesse estudo. Foram testadas as concentrações de 50, 100, 200 (dados não mostrados) e 500 µg de DNA purificado, todos diluídos em 100 µL de PBS livre de LPS. Além disso, os animais foram inoculados com 100 µL de PBS livre de LPS como controle negativo. A inoculação foi por via intradérmica com uso de seringas de 1 mL e agulha 12,7 x 0,33 mm (Becton-Dickinson, NJ) hipodérmica estéreis. Cada animal recebeu uma dose de cada GI, sendo 5 a 6 GIs por orelha, além dos controles PBS e vetor.
3.3.4 Análise histológica das biópsias do local de inoculação dos GIs
Transcorridas 1, 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação dos genes de interesse, as reações cutâneas de enduração foram mensuradas com a utilização de paquímetro digital Mitutoyo®. Foram realizadas duas medições perpendiculares em cada área medida; dessas um único valor médio foi obtido, e expresso em milímetros. Além disso, biópsias do local de inoculação foram realizadas e avaliadas como descrito. Os locais de inoculação dos GIs foram submetidos à biópsia com punch de 4-8 mm de diâmetro (Richter) e processadas para análise histológica. Resumidamente, as amostras foram mantidas em PBS-Formol 10% por 12 horas, e então transferidas para uma bateria de desidratação, formada por 3 etapas de 30 min e 1 de 1 h em álcool absoluto. Em seguida, as amostras foram submetidas a duas etapas de 30 min e uma de 1h em xilol absoluto. Finalmente foram transferidas para a parafina líquida, em duas etapas de 1 h cada, e então incluídas em parafina. Os cortes de 5 µm foram realizados em micrótomo Leica, as lâminas coradas com May-Grüenwald Giemsa e observadas em microscópio óptico Olympus com objetiva reticulada. Para as contagens celulares, a região da inoculação era localizada na lâmina, e um valor médio oriundo da contagem de dois campos (0,0625mm2 cada) era obtido para as contagens totais (aumento de 400 vezes) e de três
47 campos para as contagens diferenciais (aumento de 1000 vezes), delimitados por uma lente ocular reticulada.
3.4 Triagem por RNA de interferência
3.4.1 Seleção dos genes de interesse
As bibliotecas de cDNA de larvas e glândulas salivares de ninfas, machos e fêmeas de carrapatos R. microplus alimentadas em bovinos das raças HPB e NEL foram construídas com uso do kit SMARTTM cDNA Library Construction (Clontech). Mais de 20.000 seqüências foram analisadas com auxílio de programas domésticos de bioinformática desenvolvidos pelo colaborador Dr. José Marcos Ribeiro do Section of Vector Biology, do NIIAID do NIH, disponibilizados para o grupo (Valenzuela, 2002). Os cDNAs dos clones correspondentes aos GIs selecionados estavam inseridos no vetor plasmidial TOPO VR2001 (Oliveira et al., 2006). Os critérios de seleção dos genes foram: possuírem função putativa relevante na interação parasita-hospedeiro; exibirem expressão concomitante por distintas fases parasitárias e/ou diferentes espécies de carrapatos; serem proteínas secretadas (presença de seqüência de peptídeo sinal) e mostrarem freqüência de expressão diferencial entre as bibliotecas. Mais um critério adicionado à lista foi apresentar ou não resposta cutânea tardia induzida pela inoculação de DNA plasmidial dos GIs. Além disso, as sequências foram exaustivamente analisadas por meio de ferramentas bioinformáticas disponíveis na internet, conforme descrito posteriormente.
3.4.2 Obtenção das moléculas de dsRNA para o ensaio de silenciamento gênico
As moléculas de RNAi foram produzidas através da utilização do kit comercial MEGAscript® RNAi Kit (Ambion). Esse é um sistema para preparo de dsRNA utilizado para silenciamento (RNAi), livre de proteínas e outros contaminantes. Resumidamente, o procedimento começa com uma reação de transcrição das seqüências de interesse (DNA template), onde é inserida a seqüência promotora T7 (sítio de ligação da RNA polimerase) à seqüência de interesse. Essa etapa é obtida através da inserção da seqüência T7 (5'- TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') nos primers utilizados na reação de transcrição do DNA template. A adição dessa seqüência foi realizada utilizando ambos os primers contendo 48 a seqüência T7 nas regiões 5’ opostas, originando moléculas de RNA de fitas simples (ssRNA) que apresentam os promotores T7. Na mesma reação, ocorre a hibridação das ssRNA recém sintetizadas, de modo à formarem as moléculas de dupla fita (dsRNA). As sequências de interesse clonadas em vetor plasmidial (TOPO VR2001) foram utilizadas como DNA molde para a reação que ocorreu de acordo com as recomendações do fabricante, com temperatura de anelamento de 61ºC. Os produtos obtidos tiveram seu tamanho confirmado em gel de agarose 1%.
3.4.3 Digestão com nuclease
Após a reação de transcrição in vitro, realizou-se a digestão do material com nuclease do kit, a fim de se remover DNA e/ou ssRNA que não foram consumidos durante a reação de síntese das fitas duplas de RNA (dsRNA). Para isso, adicionou-se aos 20 µL finais da reação, 21 µL de água livre de nuclease, 5 µL de tampão 10x de digestão, 2 µL da enzima DNAse I e outros 2 µL da enzima RNAse, totalizando 50 µL de reação. Incubou-se por 1 h a 37°C.
3.4.4 Purificação das dsRNA
Aos 50 µL totais da reação de digestão, adicionou-se 50 µL de tampão de ligação, 150 µL de água livre de nuclease e 250 µL de etanol 100%, misturando gentilmente com o auxílio de uma pipeta. Em seguida, transferiram-se os 500 µL do material para o filtro que acompanha o kit e centrifugou-se por 2 minutos à máxima rotação. O material foi lavado duas vezes com 500 µL do tampão de lavagem, descartando o fluido após a centrifugação. Trocou- se o filtro de tubo e realizou-se a eluição das dsRNA purificadas com 100 µL de tampão de eluição, centrifugando por 2 minutos à máxima velocidade. O material foi em seguida armazenado a -20°C até o momento da quantificação.
3.4.5 Purificação de produto de PCR
Para purificação do produto de PCR utilizou-se o kit PureLink® (Invitrogen), que é baseado em coluna de afinidade. Resumidamente, adicionou-se 4 volumes do produto de PCR de solução ligadora de DNA (Tampão B3, por se tratar da purificação de moléculas grandes)
49 para 1 volume do produto, misturando-se perfeitamente. Em seguida, a amostra foi transferida para a coluna de afinidade e centrifugou-se a coluna a 10000 x g por 1 minuto, descartando-se o fluido. Lavou-se a coluna com 650 µL de solução de lavagem do kit (W1), centrifugando-se por mais 1000 x g por 1 minuto, e descartou-se o fluído novamente. A coluna foi novamente centrifugada à velocidade máxima por 3 minutos para eliminar resíduos do tampão de lavagem. Em seguida a coluna foi transferida para um novo tubo para eluição do material. Para isso, adicionou-se 50 µL de tampão de eluição do kit (E1) no centro da coluna e após incubar por 1 minuto à temperatura ambiente, centrifugou-se à máxima velocidade por 2 minutos a fim de se obter o material eluído, o qual foi finalmente armazenado a -20°C. Após a purificação do produto, outra corrida de eletroforese foi realizada para confirmação da presença do produto puro.
3.4.6 Reação de transcrição in vitro
A reação de transcrição in vitro foi realizada utilizando-se o kit MEGAScript RNAi® (Ambion), seguindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, adicionados a 8µL do produto de PCR purificado (DNA template), 2 µL do tampão de reação 10x T7, 2 µL de cada uma das bases ATP, CTP, GTP e UTP, e finalmente, 2 µL do mix da enzima T7, misturando perfeitamente, totalizando 20 µL de reação. A reação foi incubada por uma noite a 37°C.
3.4.7 Quantificação de dsRNA e preparo das amostras
As amostras foram quantificadas em espectrofotômetro, com absorbância de 260nm, com o material numa diluição de 100 vezes. Em seguida, com o valor da concentração, a quantidade total de dsRNA pôde ser calculada e em seguida o número de moléculas presentes nas amostras. Assim, o total de dsRNA foi calculado utilizando-se a fórmula abaixo e o resultado expresso em µg/µL (Almazán, comunicação pessoal):
Total = Abs 260 x fator de diluição x 40 (valor de leitura para RNA) / volume total
Em seguida, para o cálculo do número de moléculas, utilizou-se a fórmula seguinte, e os resultados expressos em número de moléculas por µL.
50
N° moléculas = (concentração da amostra (g/ µL) / número de pares de bases x 640) x 6 x 1023, onde 640 é a massa molecular média de 1par de base.
Assim, as amostras puderam ser diluídas de forma a conter na ordem de 1011 moléculas em aproximadamente 0,3 µL, volume que foi inoculado em cada carrapato.
3.4.8 Inoculação dos dsRNA nos carrapatos
Aproximadamente 24 h antes da inoculação, carrapatos machos e fêmeas foram coletados de hospedeiro saudável, sexados e separados para a realização do ensaio. Para a inoculação das dsRNA, carrapatos machos foram fixados em fita adesiva, apoiada em uma folha de cera de dentista, divididos em grupos de 5. A inoculação foi realizada com a utilização de seringa Hamilton 80308 (701/SN, 33/.375”/45DGR). Cada carrapato foi inoculado com aproximadamente 0,3 µL da suspensão de dsRNA, contendo na ordem de 6 x 1011 moléculas. Cada grupo de genes testados continha 35 machos inoculados, acompanhados de 5 fêmeas não inoculadas, a fim de se manter as características do ciclo biológico/reprodutivo dos ácaros. Esses carrapatos foram mantidos em estufa por aproximadamente 2 h até serem liberados sobre o dorso de bovinos.
3.4.9 Inoculação do dsRNA (RNAi) em carrapatos R. (B) microplus e infestação
Larvas de carrapatos foram liberadas no interior de câmara de infestação colada ao dorso dos bovinos e a infestação acompanhada durante aproximadamente 14 dias, onde os carrapatos acabaram de sofrer muda para o estágio de adulto. No décimo quinto dia de infestação (adultos de 1 dia) os carrapatos (n=50 para cada gene testado) foram destacados do hospedeiro e inoculados com aproximadamente 0,3 μL da suspensão de dsRNA (Microseringa Hamilton), contendo aproximadamente 3×1010–1×1011 moléculas / μL. Os dsRNA foram inoculados no quadrante posterior direito da face ventral do exoesqueleto dos ácaros. Os carrapatos inoculados foram mantidos em estufa BOD (Tecnal TE-401) a 28°C por 2 h até serem liberados em câmaras de alimentação fixas sobre o dorso de outros bovinos HPB, suscetíveis a carrapatos. Como grupos controles, carrapatos receberam apenas a inoculação de água milliq livre de nucleases no qual as moléculas dsRNA foram diluídas ou foram inoculados com dsRNAs para silenciamento de subolesina, uma proteína que 51 sabidamente é essencial para o desenvolvimento dos ácaros - grupo controle positivo (de la Fuente et al., 2006a). Dos 50 carrapatos (20 machos e 30 fêmeas) inoculados para cada grupo, 5 machos foram utilizados para a confirmação do silenciamento por PCR; 3 machos foram utilizados para as avaliações estruturais dos tecidos; e, 9-20 fêmeas foram utilizadas para a avaliação dos parâmetros biológicos e reprodutivos. O número de carrapatos para completar os 50 inoculados está incluído numa parcela perdida, ou seja carrapatos que não se fixaram nos hospedeiros ou que morreram. Paralelamente, fêmeas completamente alimentadas, que já haviam se desprendido de seu hospedeiro, foram inoculadas com 1 µL da mesma solução de dsRNA usada anteriormente. O peso das fêmeas foi anotado anteriormente à inoculação. Em seguida, as fêmeas foram mantidas em estufa B.O.D para serem avaliadas apenas quanto aos parâmetros reprodutivos, descritos a seguir.
3.4.10 Infestação de bovinos com carrapatos inoculados com dsRNA
Os carrapatos foram liberados em câmaras de alimentação fixadas ao dorso de bovinos da raça HPB previamente infestados. Os carrapatos foram acompanhados durante todo o período de alimentação, que durou aproximadamente oito dias, sendo recuperados ao final desse período para as análises posteriores.
3.5 Avaliação dos carrapatos após alimentação
3.5.1 Dissecção de glândulas salivares de carrapatos parcialmente alimentados
Uma vez que os antígenos candidatos são antígenos salivares, glândulas salivares de carrapatos injetados com dsRNA e alimentados por 2-3 dias nos bovinos suscetíveis foram dissecadas para obtenção de RNA para quantificação da transcrição dos genes alvos após o silenciamento gênico por qRT-PCR. A dissecção das glândulas salivares, que se deu com o auxílio de um microscópio estereoscópico (Leica), com aumento de aproximadamente 20 vezes. O material cirúrgico utilizado para a dissecção foi previamente tratado para estar livre de RNAses. As glândulas obtidas foram imediatamente transferidas para um tubo contendo solução de preservação do RNA (RNA Later – Qiagen), mantidas a 4°C por 24 h e, só então, transferidas para -80°C. Para a extração do RNA total das glândulas salivares foi utilizado o
52 kit Illustra RNAspin Mini Kit (GE Healthcare), indicado para obtenção de RNA a partir de poucas células ou pequenas porções de tecidos.
3.5.2 Extração de RNA de glândula salivar de carrapatos
Embora seja possível realizar a reação de amplificação (PCR) utilizando o DNA plasmidial que temos purificado como molde, durante o estágio foi utilizado RNA total dos tecidos de carrapato. O RNA extraído teve de ser submetido a uma RT-PCR para obtenção do DNA molde para em seguida, realizar-se a transcrição in vitro na reação que originará as moléculas de dsRNA que serão inoculadas na hemocele dos carrapatos. Assim, sobre uma folha de cera de dentista, uma gota de PBS foi colocada e com a utilização de uma lâmina cortante, o carrapato foi dividido ao meio. Com o auxílio de pinças, as glândulas salivares do ácaro foram extraídas, num pool de 10 pares, e após passar por uma nova gota de PBS para lavagem do material, o pool foi transferido para um tubo com RNA later (aproximadamente 600 µL). Esse material foi mantido a 4°C por 24 horas e em seguida transferido para freezer a -80°C até o momento da extração.
Para a extração do RNA, as amostras foram transferidas para o gelo e mantidas até o completo descongelamento do tampão (RNA later). Com o auxílio de uma agulha 18G as glândulas salivares foram recuperadas do tampão, uma vez que permanecem na superfície, e transferidas para um novo tubo contendo o tampão de lise do kit a 1% de β-mercaptoetanol. Em seguida, com o auxílio de uma agulha 26G, realizou-se a lise das glândulas salivares através da aspiração e injeção das amostras por aproximadamente seis vezes, ou até que não fossem visualizadas glândulas íntegras. Em seguida, o lisado foi transferido para um filtro devidamente acoplado a um tubo coletor, ambos provenientes do kit, e levou-se a centrifugação de 11000 x g por um minuto. O filtrado foi então transferido para um novo tubo e adicionou-se etanol, homogeneizando em vórtex, por duas vezes de cinco segundos cada. Transferiu-se a solução para uma coluna proveniente do kit e centrifugou-se por 30 segundos a 8000 x g. Descartou-se o fluído e transferiu-se a coluna para um novo tubo coletor a fim de se realizar a dessalinização da amostra; para isso, adicionou-se o tampão adequado e centrifugou-se por um minuto a 11000 x g. Descartou-se o fluído e reposicionou-se a coluna no mesmo tubo coletor para proceder com a digestão da amostra com DNAse tipo I, a qual foi preparada separadamente adicionando-se 10 µL da enzima em 90 µL do tampão proveniente do kit. A cada amostra, adicionou-se 95 µL da solução de DNAse I e incubou-se por 15 53 minutos a temperatura ambiente. Adicionou-se então 200 µL do tampão de lavagem I também proveniente do kit a fim de parar a reação de digestão e centrifugou-se por um minuto a 11000 x g e transferiu-se a coluna para um novo tubo coletor. Adicionou-se então 600 µL do tampão de lavagem II e centrifugou-se às mesmas condições. Essa etapa de lavagem foi repetida por mais uma vez, descartando-se o fluído a cada centrifugação. Finalmente, mais uma centrifugação de dois minutos foi realizada a fim de secar a membrana completamente e proceder com a eluição do RNA, que se deu com a adição de 40 µL de água livre de RNAse e uma última centrifugação de 11000 x g por um minuto. As amostras foram quantificadas em espectrofotômetro NanoDrop e mantidas a -80°C até o momento do uso.
3.5.3 Síntese de cDNA e confirmação da expressão gênica
Para a obtenção do cDNA, utilizou-se o kit comercial Improm II (Promega) com algumas modificações, a seguir. Aproximadamente 1 µg de RNA foi utilizada em cada reação de síntese de cDNA, as quais se adicionou 1 µL de iniciador Oligo-[dT]15 e quando necessário água até o volume de 15 µL. Em seguida, foram adicionados o tampão de reação fornecido pelo fabricante, MgCl2 e dNTP, totalizando 25 µL. A reação de anelamento ocorreu a 25ºC por 5 minutos, seguida de extensão por 1 h a 42°C. O material foi submetido a reação de RT-PCR quantitativo. Para tal, 5 µL de cDNA sintetizados foram adicionados a 0,5 µL de cada oligo, 1,5 µL de água ultrapura e 12,5 µL de Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG com ROX (Invitrogen). O programa utilizado para amplificação das amostras foi de 50ºC por 2 minutos, 95ºC por 2 minutos, 40 ciclos de 95ºC por 15 segundos, 59ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos em termociclador ABI Prism 7000 (Applied Biosystems).
3.5.4 Microscopia de luz comum
Três carrapatos machos inoculados com dsRNAs correspondente a um GI (3 carrapatos por GI) e alimentados em hospedeiros suscetíveis foram coletados para avaliação da integridade dos ácinos salivares e células intestinais por microscopia de luz comum. Os carrapatos coletados foram fixados em solução tamponada de formaldeído 2% por 48-72 h e em seguida submetidos a uma bateria de desidratação e emblocados em resina metacrilato. Secções de 3 µm foram então obtidas e coradas pela técnica de Mallory para observação em 54 microscópio, técnica modificada a partir de (Kocan et al., 1980). As lâminas foram comparadas com o auxílio de imagens digitais obtidas. A integridade dos tecidos foi arbitrariamente definida e comparada entre os grupos experimentais e controles.
3.5.6 Bioinformática
Além da ferramenta disponibilizada pelo Dr. José Marcos Ribeiro, esse trabalho contou com o auxílio de várias ferramentas de bioinformática disponíveis gratuitamente na internet. Ferramentas que auxiliaram no desenho das moléculas de dsRNA quanto ao tamanho, localização dentro da ORF completa, predição dos primers, efeitos indesejáveis, entre outros fatores foram utilizadas. Entre elas destaca-se a ferramenta do German Cancer Research Center, onde as probes de RNA são desenhadas apoiando-se em informações da espécie alvo. Em seguida as sequências foram submetidas às ferramentas de predição de domínios protéicos como SMART, do inglês simple modular architecture research tool. Outro endereço bastante visitado foi o servidor de dados Expert Protein Analysis System ou ExPASy. Essas ferramentas eletrônicas auxiliaram na predição de estruturas moleculares durante o desenho das probes de RNA para inserção dos domínios protéicos quanto para as proteínas estudadas.
3.6 Obtenção de proteínas recombinantes dos genes selecionados
3.6.1 Obtenção dos produtos para clonagem em sistema TOPO® (Invitrogen)
Para a obtenção dos produtos para clonagem, iniciadores foram desenhados individualmente para cada gene tendo como referência a sequência de nucleotídeos do clone selecionado (gene de interesse) para ser o DNA molde na reação de amplificação. Entretanto, sequências auxiliares foram inseridas aos iniciadores e serão descritas a seguir. Para os iniciadores foward destacam-se a inclusão da sequência CACC na posição 3’ que serve de entrada no vetor escolhido. Isso é possível uma vez que, ao adicionar a sequência supracitada ao iniciador foward, os produtos de PCR obtidos também a apresentarão em sua posição 3’. Durante a reação de clonagem, a ligação entre o produto de PCR obtido e o vetor ocorre já que o vetor apresenta uma cauda complementar (GTGG) livre, disponível para alinhar-se com a sequência CACC (sítio de clonagem). Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos GGA foi incluída imediatamente após CACC; essa sequência faz parte de um grupo de nucleotídeos conhecidos como sequência de Kozak, e que são fortemente indicados a estarem presentes nas 55 sequências as quais se deseja submeter à expressão protéica, pois auxiliam no acoplamento da maquinaria ribossomal para o início da tradução (Kozak, 1987). Assim, como mostra a Figura 3A, todos os iniciadores foward foram confeccionados com a sequência CACCGGAATG inicial, onde ATG é o códon inicial do gene de interesse. Para o desenho dos iniciadores reverse, também na posição 5’, adicionou-se a sequência TCATTT GTCGTCGTCGTCTTTATAGTC, responsável pela codificação de uma sequência alvo, conhecida como FLAG; essa sequência alvo é amplamente utilizada para auxiliar a detecção e/ou a purificação das proteínas que a apresentam. Vale ressaltar ainda que o stop códon presente na sequência de interesse foi substituído pelo presente na sequência FLAG. Para a amplificação dos produtos, utilizou-se GoTaq® Hot Start Colorless Master Mix (Promega) com programa 95°C por 2 minutos, 30 repetições de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto, período adicional de extensão de 7 minutos a 72°C, mantendo em seguida as amostras a 4°C até o momento da confirmação do produto em gel de agarose 1%. Após a confirmação do tamanho correto dos produtos em gel de agarose, esses foram purificados utilizando-se o kit comercial QIAEXII Agarose Extraction (Qiagen). Resumidamente, as bandas apropriadas a cada gene foram recortadas do gel e em seguida pesadas em balança digital. Adicionou-se três volumes do tampão QX1 e 20 µL do tampão QIAEX II e incubou-se por 10 minutos a 50°C a fim de se solubilizar a agarose e ligar o DNA às partículas de sílica presentes no tampão QIAEX II; a suspensão foi agitada a cada 2 minutos no decorrer da incubação. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a alta rotação por 30 segundos e o sobrenadante foi cuidadosamente removido com o auxílio de uma pipeta. A centrifugação foi repetida com 500 µL do tampão QX1 e em seguida com 500 µL do tampão PE por duas vezes para a lavagem do pellet obtido. Estes permaneceram por aproximadamente 30 minutos sobre a bancada para secagem e então eluídos adicionando-se 20 µL do tampão EB sob agitação. Incubou-se por 5 minutos e centrifugou-se por 30 segundos para remoção da sílica presente na reação e então cuidadosamente o sobrenadante contendo o DNA purificado foi recuperado com o auxilio de uma pipeta. Os produtos para clonagem purificados foram mantidos por 10 minutos a 37°C após a purificação e imediatamente submetidos à reação de clonagem.
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5’ 3’ A CACC ATG GGA Gene FLAG-Tag Stop Codon
5’ 3’ B ATG GGA Gene FLAG-Tag Stop Codon
Figura 3. Representação esquemática das sequências clonadas respectivamente, nos vetores pENTR-D-TOPO (A) e pEXP1-DEST1 Gateway® (B). Os GIs foram clonados em vetor de entrada no sistema Gateway através da inserção do sítio de clonagem CACC na posição 3’ da sequência original do GI. A sequência GGA foi adicionada após o ATG inicial da ORF do GI e a sequência codificadora do epítopo FLAG na porção C-terminal, imediatamente antes ao stop codon da ORF, que serviu para identificar as proteínas produzidas.
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3.6.2 Clonagem em vetor de entrada pENTR-D-TOPO® (Invitrogen)
A reação de clonagem em vetor TOPO® foi realizada segundo as instruções do fabricante e foram utilizados 4 µL dos produtos de PCR purificados, 1 µL de solução salina que acompanha o kit e 1 µL do vetor TOPO®, totalizando 6 µL de reação que foi mantida a temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, as reações foram transferidas para o gelo e procedeu-se a transformação de E.coli competentes com os produtos de clonagem. Para isso, 2 µL de cada reação de clonagem foram transferidos para 1 tubo de E.coli quimicamente competentes provenientes do mesmo fabricante e gentilmente homogeneizados e mantidos em gelo por 30 minutos. Em seguida, os tubos foram imediatamente transferidos para banho- úmido a 42°C a fim de se realizar um choque térmico nas células bacterianas e imediatamente recolocados no gelo. Adicionou-se 250 µL de meio S.O.C em cada tubo e manteve a 37°C por 1 hora sob agitação de 220 rpm. Em seguida, metade do volume (125 µL) de células transformadas foi transferido para uma placa contendo meio LB e canamicina a uma concentração final de 50 µg/mL e incubados por 16 horas para crescimento e seleção das colônias isoladas.
3.6.3 Seleção das colônias recombinantes
Após as reações de transformação, 4-6 colônias isoladas foram selecionadas para confirmação da presença de cada um dos genes de interesse por PCR. Assim, as colônias foram individualmente recuperadas da placa com o auxilio de uma pipeta e transferidas para um tubo de 200 µL contendo 5 µL de água que foram em seguida cuidadosamente agitados sobre a bancada. Após a recuperação de todas as colônias, realizou-se o replaqueamento (backup) das colônias testadas em uma nova placa contendo meio LB na presença de 50 µg/mL de canamicina (ou carbenicilina, após a segunda clonagem), de maneira que pudessem ser novamente recuperadas após a confirmação da clonagem; essas foram novamente mantidas a 37°C por 16 horas. Para a amplificação dos produtos, utilizou-se GoTaq® Hot Start Green Master Mix (Promega) com programa 95°C por 4 minutos, 30 repetições de 94°C por 30 segundos, 50°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto, período adicional de extensão de 7 minutos a 72°C, mantendo em seguida as amostras a 4°C até o momento da confirmação do produto em gel de agarose 1%. Após a confirmação das colônias recombinantes em gel de agarose, essas foram repicadas da placa de backup para tubos contendo 5 mL de meio LB
58 líquido com 50 µg/mL de canamicina e mantidas a 37°C por 14-16h para extração do DNA plasmidial.
3.6.4 Extração de DNA plasmidial em pequena escala (Miniprep)
A extração do DNA plasmidial se deu seguindo as recomendações do fabricante e resumidamente inclui etapas semelhantes às anteriormente descritas para extrações em larga escala. Inicia-se com a centrifugação do volume da cultura (5 mL) e obtenção de pellet de células bacterianas; descartou-se o meio de cultura e ressuspendeu-se o pellet em 250 µL de tampão de ressuspensão proveniente do kit comercial utilizado (PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit - Invitrogen). Essa solução foi transferida para um tubo de 1,5 mL e então adicionou-se 250 µL do tampão de lise e gentilmente inverteu-se o tubo 4-6 vezes para homogeneização. A lise transcorreu por 5 minutos e então adicionou-se 350 µL do tampão de precipitação, invertendo o tubo novamente por 6-10 vezes imediatamente após a adição do tampão até obter uma mistura homogênea. As amostras foram centrifugadas por 12000 x g por 10 minutos a temperatura ambiente e o sobrenadante transferido para uma coluna de purificação já acoplada a um novo tudo de 1,5 mL. Realizou-se mais uma centrifugação a 12000 x g, entretanto agora por apenas 1 minuto para ligação do DNA a coluna de purificação. Descartou-se o fluído retido no tubo e em seguida, adicionou-se à coluna 700 µL de tampão de lavagem e repetiu-se o passo de centrifugação por 1 minuto. Descartou-se o tampão de lavagem retido no tubo e submeteu-se a mais uma centrifugação para eliminação de traços do tampão na coluna (já que esse contém etanol). A coluna foi transferida para um tubo coletor proveniente do kit e adicionou-se 40 µL de água no centro da coluna, incubou-se por 1 minuto e centrifugou-se por 2 minutos para obtenção do DNA plasmidial purificado. As amostras obtidas foram mandadas para uma empresa para realização de seqüenciamento. As sequências foram analisadas de acordo com os cromatogramas recebidos utilizando-se o programa BioEdit (disponível gratuitamente na internet) e selecionadas para a etapa seguinte. Vale ressaltar que as amostras foram submetidas a esses passos após as duas clonagens realizadas.
59
3.6.5 Clonagem em sistema Gateway® (pEXP1-DEST Gateway® Vector Kit – Invitrogen)
A subclonagem dos genes de interesse em sistema Gateway® foi realizada com a utilização da enzima Gateway® LR Clonase (Invitrogen); essa enzima é responsável pela recombinação sítio-específica entre os vetores presentes na reação e permite a inserção da sequência gênica mostrada na Figura 3B. Para tal, 10 µL do DNA plasmidial purificado obtido (descrito no passo anterior) foram transferidos para um novo tubo e adicionou-se 2 µL do vetor de destino (pEXP1-DEST Gateway® Vector) e 4 µL do tampão da enzima a temperatura ambiente; só então a enzima foi retirada do freezer (-80°C) e 4 µL adicionados à reação e incubadas por 1 h a temperatura ambiente. Adicionou-se 2 µL de Proteinase K à cada reação e incubou-se por mais 10 minutos. Em seguida, procedeu-se a transformação de E.coli quimicamente competentes, como já descrito anteriormente. Da mesma forma, as colônias recombinantes foram analisadas e selecionadas para os ensaios de expressão. Os DNA plasmidiais foram obtidos da mesma forma como já exposto (Miniprep) e servirão de molde para a reação de transcrição e tradução in vitro (do inglês, in vitro transcription and translation – IVTT).
3.6.6 Ensaio de expressão de proteína em sistema livre de células (cell free)
O ensaio para expressão das proteínas recombinantes foi realizado utilizando-se o kit comercial Roche®, seguindo as recomendações do fabricante. Para cada reação, foram adicionados 12 µL de lisado de E. coli (contendo a maquinaria enzimática para expressão protéica), 10 µL de reaction mix (fornecido pelo fabricante), 12 µL de aminoácidos, 1 µL de metionina, 5 µL de tampão, 7 µL de água e 3 µL de DNA molde (obtido após clonagem no vetor pEXP1-DEST; sessão anterior). As reações dos genes de interesse foram realizadas em paralelo aos controles positivo (GFP: do inglês, green fluoresecent protein) e negativo (sem a adição do DNA molde). As amostras seguiram por um período de incubação de 8 h a 30°C em agitação de 600 rpm, em placa de 96 poços. Cinco reações para cada GI foram realizadas separadamente e após o período de incubação, essas foram transferidas para um único tubo e mantidas a -20°C; uma alíquota foi obtida antes do congelamento para a realização da quantificação relativa por dot blot (descrito a seguir).
60
3.6.7 Dot blot
Inicialmente a membrana de nitrocelulose (BioRad) foi umedecida com tampão PBS e fixada em suporte especifico (BioRad) para a realização da reação (molde de placa de 96 poços). Em seguida, o suporte foi acoplado a uma fonte de vácuo e a colocação da membrana conferida pipetando-se alguns microlitros de tampão em cada poço do molde atentando para detectar a possível difusão das amostras para poços vizinhos, de maneira a não permitir que as amostras a serem quantificadas se sobrepusessem. A curva foi primeiramente preparada de forma a conter 6 pontos de uma diluição seriada a partir de uma solução a 111,6 ng / µL; foram utilizados 50 µL de cada diluição. As amostras foram diluídas na proporção de 1:50, ou seja, para cada 49 µL de tampão, adicionou-se 1 µL da reação de expressão descrita anteriormente. Adicionalmente, as amostras diluídas 1:50 foram diluídas mais 5 e 10 vezes, de forma a auxiliar a quantificação. As membranas foram bloqueadas por 1 h com tampão de bloqueio I-Block (Applied). Em seguida, foram incubadas por 30 minutos, sob agitação, com três diferentes anticorpos primários, anti-FLAG, anti-His e anti-Xpress, todos na concentração de 5 mg/mL diluídos 1:1000; os resultados combinados auxiliam na quantificação e confirmação da expressão da proteína em sua sequência completa. Todos os anticorpos primários eram conjugados a HRP (do inglês, horseradish peroxidase). Em seguida, as membranas foram lavadas por 15 minutos com o mesmo tampão de bloqueio e então incubadas com o anticorpo secundário, também marcado com HRP, por mais 1 h. Novamente as membranas foram lavadas com tampão I-Block antes de serem reveladas. Para a revelação, as membranas foram mantidas por aproximadamente 5 minutos em 4 mL de solução de Luminol e 4 mL de reagente de detecção PIERCE (ThermoScientific). Foram então transferidas para filme fotográfico com a utilização de um imã e reveladas em processador Kodak X-OMAT 2000A.
3.7 Análise estatística
Os dados foram comparados utilizando-se Teste t estudante (Student t test) para a comparação entre dois grupos estudados, previamente submetidos ao teste de normalidade. Os dados de comparação entre proporções observados nos ensaios de inoculação de DNA nu e de interferência por RNA foram comparados utilizando-se teste qui-quadradro. Foram considerados dois níveis de significância estatística, p ≤ 0,05 e p ≤ 0.01, indicados
61 respectivamente por um ou dois sinais nos gráficos apresentados. Os gráficos e análises foram realizadas com o auxílio dos programas SigmaPlot e SigmaStat, versão 11.2.
62
Resultados
63
4 Resultados
4.1 Seleção de genes de interesse por análise in silico de bibliotecas de cDNA de tecidos/estágios de carrapatos R. (B.) microplus
Os genes de interesse estudados no atual trabalho foram selecionados com a análise de bibliotecas de cDNA de vários tecidos e estágios de carrapatos R. (B.) microplus ingurgitados em bovinos suscetíveis às infestações, ou seja, carrapatos bem sucedidos em sua alimentação. A função putativa das proteínas relacionadas e a intensidade de expressão dos genes nas bibliotecas foram alguns dos critérios de seleção utilizados. O sucesso da clonagem prévia de alguns desses genes garantiu sua disponibilidade para pronta utilização nesse trabalho.
4.2 Produção e purificação dos DNAs plasmidiais (DNA nu)
Os GIs foram produzidos e purificados de culturas em larga escala de bactérias E.coli conforme descrito na sessão de materiais e métodos. A purificação dos GIs apresentou diferente rendimento de acordo com o GI, e variou de aproximadamente 4 a 10 mg de DNA por coluna de afinidade utilizada (dados não mostrados); vale ressaltar que não foi possível obter quantidades suficientes de alguns GIs e esses foram excluídos da triagem. Além disso, a purificação do DNA foi realizada em condições livres de LPS e sua quantificação em todas as amostras ficou abaixo de 0,01 unidades de endotoxina (EU)/mL (dados não mostrados).
4.3 Inoculação intradérmica dos genes de interesse sob a forma de DNA nu em bovinos da raça nelore para avaliação da resposta cutânea tardia
A resposta cutânea tardia a antígenos de carrapato R. (B.) microplus clonados em vetor plasmidial (GIs) e inoculados sob a forma de DNA nu foi inicialmente avaliada através da mensuração da área de eritema e/ou enduração após a inoculação em bovinos nelores (NEL) previamente infestados com carrapatos. Ensaios preliminares determinaram as orelhas como o melhor local para observar os sinais macroscópicos analisados, assim como indicaram a dose a ser empregada nas inoculações.
64
Assim, foi realizada a inoculação 500 μg de DNA nu/bovino de 23 GIs ou apenas o vetor (controle negativo) por via intradérmica na face interna da orelha de 12 bovinos, sendo as medições de eritema e/ou enduração feitas após 24, 48 e 72 h. A realização da coleta de biópsia ocorreu apenas para as inoculações de GIs que apresentaram algum sinal macroscópico visível. Em todos os momentos que biópsias da inoculação dos GIs foram coletadas as biópsias das inoculações controles também o foram (PBS e vetor plasmidial), mesmo que as últimas não apresentassem alterações macroscópicas visíveis.
As tabelas 1 e 2 mostram as observações das alterações macroscópicas realizadas após a inoculação de 12 GIs em 9 animais, coletadas após 48 h (Tab. 1) e 72 h (Tab. 2). Embora a indução de eritema e/ou enduração pela inoculação dos GIs tenha sido bastante variada, de forma geral, ambos os sinais foram observados para os GIs positivos (Tab.1 e 2). Entretanto, na maioria das inoculações, os GIs não induziram resposta macroscópica detectável. A tabela 3 relaciona os 23 GIs testados, a proteína que apresentou maior similaridade quando comparada nos diferentes bancos de dados utilizados durante a análise do transcriptoma, a função putativa e o número de animais que apresentaram resposta positiva à inoculação de 500 µg de DNA nu, contemplando todo o período (24, 48 e 72 h) analisado. As inoculações controles (vetor vazio e PBS) induziram resposta positiva num número bem pequeno de inoculações (4 e 1, respectivamente), se mostrando aquém de todos os GIs testados, exceto para SIGP B02 e SIGP B06 que não induziram resposta em nenhuma inoculação realizada, embora tenham sido realizadas apenas duas por GI. A incidência de respostas positivas induzidas pela inoculação dos GIs variou de 16 a 100% dos animais, dependendo do GI analisado. Sendo possível detectar que os GIs que induziram resposta positiva em um maior número de bovinos (resposta mais consistente) foram os pertencentes ao grupo de genes que codificam proteínas relacionadas ao cemento (provável atividade de fixação), bem como proteínas ricas em glicina, segundo análise mais detalhada do gene presente na biblioteca de cDNA. Entretanto, a incidência de resposta positiva aos GIs não se mostrou estatisticamente diferente do grupo controle (PBS) para nenhum dos grupos testado, ou seja, nenhum GI induziu significantemente resposta cutânea tardia em hospedeiros sensibilizados previamente por infestação quando inoculados sob a forma de DNA nu. Com o intuito de ainda se observar diferenças entre as respostas cutâneas aos GIs quanto a cinética do recrutamento e a participação de diferentes populações celulares no sítio de inoculação, foram realizadas biópsias para análise microscópica apenas das reações cutâneas macroscópicas positivas.
65
Tabela 1. Detecção de reação cutânea tardia em resposta a 12 diferentes GIs após 48 h da inoculação.
Gene de Animal 1 Animal 2 Animal 3 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração VETOR ------B ------SIGP_A07 ------OE: + SIGP_A12 - - - - - OD: + OE: + SIGP_C06 - - - - - OD: + SIGP_D05 ------
Gene de Animal 4 Animal 5 Animal 6 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração VETOR ------B ------SIGP_D08 ------OE: + OE: + OE: + SIGP_F11 - - - OD: - OD: + OD: + SIGP_G05 ------SIGP_H02 ------
Gene de Animal 7 Animal 8 Animal 9 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração VETOR ------B ------CEM_A11 ------OE: + CEM_C10 - - - - - OD: - OE: + CEM_F09 - - - - - OD: + OE: + CEM_F12 - - - - - OD: + Vetor: construção sem inserto (GI) B: inoculação de PBS OE: orelha esquerda; OD: orelha direita Os sinais indicam presença (+) ou ausência (-) de resposta
66
Tabela 2. Detecção de reação cutânea tardia em resposta a 12 diferentes GIs após 72 h da inoculação.
Gene de Animal 1 Animal 2 Animal 3 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração VETOR ------B ------SIGP_A07 ------OE: - SIGP_A12 - - - - - OD: + OE: - SIGP_C06 - - - - - OD: + OE: - SIGP_D05 - - - - - OD: +
Gene de Animal 4 Animal 5 Animal 6 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração OE: - VETOR - - - - - OD: + B ------SIGP_D08 ------SIGP_F11 ------OE: - SIGP_G05 - OD: + - - - OD: + SIGP_H02 ------
Gene de Animal 7 Animal 8 Animal 9 interesse Eritema Enduração Eritema Enduração Eritema Enduração VETOR ------B ------CEM_A11 ------CEM_C10 ------CEM_F09 - - - - - OD: + CEM_F12 - - - - - OD: +
Vetor: construção sem inserto (GI) B: inoculação de PBS OE: orelha esquerda; OD: orelha direita Os sinais indicam presença (+) ou ausência (-) de resposta
67
Tabela 3. Incidência de respostas positivas após 24, 48 e 72 h da inoculação dos genes de interesse testados como DNA nu
Nº % de Gene de respostas Similaridade Função putativa reações interesse positivas / positivas total PBS - Controle Negativo 4 / 23 17,39 VETOR - Controle Negativo 1 / 21 4,76 SIGP A07 Endopeptidase Desconhecida 1 / 6 16,66 Inibidor de sinalização de SIGP A12 Ligante de MD 2 / 6 33,33 TLR SIGP B01 Proteína salivar secretada Desconhecida 1 / 2 50,00 Peptídeo salivar secretado de SIGP B08 Desconhecida 0 / 2 0,00 Ixodes pacificus SIGP C06 Desintegrina Inibidor de adesão celular 2 / 6 33,33
SIGP C10 Serina protease Inibidor de trombina 2 / 2 100,00
SIGP D05 Ligante de histamina Anti-inflamatório 2 / 9 22,22
SIGP D08 Serina protease Inibidor de trombina 2 / 8 25,00
SIGP E05 Ligante de RNA Fator de splicing 1 / 2 50,00
SIGP F11 Ligante de histamina Anti-inflamatório 2 / 6 33,33
SIGP G05 Microplusina Peptídeo antimicrobiano 4 / 8 50,00
SIGP H02 Ligante de IgG Inibidor de anticorpo 2 / 9 22,22 Protéina hipotética de SIGP H06 Anticoagulante 0 / 2 0,00 Haemaphysalis longicornis Proteína flagiliforme (similar CEM A11 Fixação 2 / 8 25,00 a RIM36) CEM C02 Loricrina Reparo tecidual 2 / 3 66,66
CEM C10 RIM 36 Fixação 2 / 8 25,00 Anticoagulante / Anti- CEM D06 Aglutinina 2 / 2 100,00 inflamatório Espidroina – PRG semelhante CEM E04 Fixação 1 / 3 33,33 64P) CEM F01 Proteína rica em prolina Fixação 1 / 2 50,00 Proteína salivar CEM F09 Desconhecida 5 / 9 55,55 imunodominante CEM F11 Flagiliforme Semelhante a seda de aranha 1 / 3 33,33
CEM F12 Cemento - similar a RIM36 Fixação 5 / 8 62,50
CEM G04 Proteína estrutural (PRG) Fixação 2 / 2 100,00
68
Assim, foram coletadas biópsias apenas das reações macroscopicamente positivas 48 ou 72 h após a inoculação, sendo em seguida realizada a análise histopatológica das mesmas, com contagem total e diferencial do infiltrado celular induzido pelos GIs. Como é possível observar na Figura 4A, com exceção do GI CEM F12, 48 h após a inoculação, todos os GIs foram capazes de recrutar um infiltrado inflamatório celular significativo para o sítio de inoculação na pele. Embora sem relevância estatística, o número absoluto de células presentes no infiltrado celular em resposta à inoculação foi maior para vários dos GIs testados em relação aos grupos controles, principalmente para SIGP D08, CEM C10 e CEM G04 (Fig. 4A). Após 48 h da inoculação dos GIs, o infiltrado celular era composto principalmente de células mononucleares e neutrófilos (Fig. 4B); os mastócitos estavam proporcionalmente mais presentes nos grupos controles. Apenas dois GIs (SIG C06 e SGP F11) não foram capazes de alterar a proporção celular do infiltrado quando comparados ao controle; os demais GIs induziram um aumento consistente na proporção de neutrófilos, indicando o desenvolvimento de resposta inflamatória nesse tempo.
Um grupo que apresentou aumento do infiltrado celular local em resposta aos GIs após 48 h da inoculação, também o fez após 72 h (Fig. 5A). Em adição a estes, outros quatro GIs induziram aumento global do número de células nesse tempo, como mostra a figura 5A. O número de células observadas nas biópsias analisadas também foi superior aos grupos controles, entretanto o infiltrado já se encontrava reduzido em relação à observação anterior (48 h), com exceção do GI SIGP C06. Além disso, nas biópsias das reações positivas mais tardias (72 h) os infiltrados não puderam ser observados nas biópsias da inoculação dos GIs SIGP A12, SIGP D05 e CEM F09, o que indica que, embora ainda se observasse reação macroscópica, as células já não mais estavam no local da inoculação. Por outro lado, o contrário ocorreu com o GI CEM F12, que apesar de não ter induzido infiltrado celular inflamatório no tempo de 48 h, o induziu com 72 h (Fig. 5A), contudo essa diferença não foi significativa com relação aos controles. Esses resultados sugerem que os GIs estudados possivelmente apresentam diferentes cinéticas de expressão na pele, de forma que induzem tempos de recrutamento de infiltrado celular diferentes na pele dos animais.
Quanto à composição do infiltrado celular inflamatório recrutado, após 72 h foi possível observar que a presença de neutrófilos foi bastante reduzida, sendo as células mononucleares as principais encontradas no sítio de inoculação dos GIs, exceto para o GI
69
SIGP H02 e o vetor, onde os neutrófilos permaneceram como as principais células (Fig. 5B). A resposta ao GI CEM D06 se mostrou bastante diferente da observada às 48 h e basófilos
250 A
200
150
100
Número de células 50
nd 0 B V
SIGP A07SIGP A12SIGP C06SIGP D08SIGP F11CEM C10CEM D06CEM E04CEM F09CEM F12CEM G04
B 105
90
75
Mononucleares 60 Mastócitos
% de células % Neutrófilos Basófilos 45
B V
SIGP A07SIGP C06SIGP D08SIGP F11CEM C10CEM D06CEM E04CEM F09CEM G04
Figura 4: Contagem global e diferencial de células presentes na pele após 48 h da inoculação dos GIs. Animais da raça Nelore foram inoculados intradermicamente com 500 µg dos diferentes GIs, PBS (B) e vetor vazio (V). Após 48 h da inoculação, foi coletada uma biópsia dos sítios de inoculação para contagem do infiltrado celular. Em A, as barras representam o número de células observadas ± EPM (erro padrão da média) em resposta a inoculação dos diferentes GIs testados sob a forma de DNA nu; Em B, as barras representam a porcentagem dos diferentes tipos celulares encontrados em resposta a cada um dos grupos mostrados em A. nd: não determinado.
70
250 A 200
150
100
Número de células 50
0 B V
SIGP A12SIGP C06SIGP D05SIGP G05SIGP H02CEM D06CEM F09CEM F12
105 B
90
Mononucleares 75 Mastócitos Neutrófilos Basófilos
% de células % 60 Eosinófilos
45 B V
SIGP C06 SIGP G05 SIGP H02 CEM D06 CEM F12
Figura 5: Contagem global e diferencial de células presentes na pele após 72 h da inoculação dos GIs. Animais da raça Nelore foram inoculados intradermicamente com 500 µg dos diferentes GIs, PBS (B) e vetor vazio (V). Após 72 h da inoculação, foi coletada uma biópsia dos sítios de inoculação para contagem do infiltrado celular. Em A, as barras representam o número de células observadas ± EPM em resposta a inoculação dos diferentes GIs testados sob a forma de DNA nu; Em B, as barras representam a porcentagem dos diferentes tipos celulares encontrados em resposta a cada um dos grupos mostrados em A.
71 foram evidenciados. No tempo de 72 h após a inoculação não houve diferença relevante com relação à resposta apresentada pela inoculação de PBS (B) e os GIs SIGP C06, SIGP G05, CEM D06 e CEM F12, entretanto é possível observar que houve uma tendência dos GIs induzirem respostas diferentes entre si no que concerne às proporções das diferentes populações celulares recrutadas. A presença de granulócitos não neutrófilos também foi mais acentuada após 72 h da inoculação (Fig. 5B).
A figura 6 mostra cortes histológicos de algumas amostras processadas para realização das contagens celulares globais e diferenciais, coradas com HE e May-Grünwald Giemsa. Os painéis A, C e E mostram os infiltrados celulares inflamatórios recrutados pela inoculação de PBS, vetor e GI SIGP G05 utilizados para as contagens globais. É possível observar a presença de células inflamatórias dispersas na derme (Fig. 6 A, C, E, aumento de 400 X) e infiltrado celular composto principalmente por neutrófilos e mononucleares e alguns eosinófilos e mastócitos. A contagem diferencial foi realizada utilizando aumento de 1000 X (Fig. 6 B, D, F).
Tomados em conjunto, os resultados obtidos dos ensaios de triagem in vivo por inoculação de DNA nu e análise macro e microscópica do sítio de inoculação não se mostraram conclusivos para a seleção dos genes candidatos (Tab. 3). Infelizmente, alguns dados analisados variaram entre as duplicatas, não garantindo a consistência esperada dos resultados. Apesar desse entrave, é importante ressaltar que as inoculações controles (PBS e vetor vazio) não induziram respostas cutâneas relevantes, sugerindo que os GIs testados foram transfectados nas células locais e as proteínas, responsáveis pela indução das reações cutâneas, foram sintetizadas. Assim, os resultados obtidos até esse momento nos indicaram a necessidade de empregar outras estratégias de triagem de antígenos.
Visto que o sucesso na primeira triagem foi parcial e o número de GIs a serem estudados ainda era elevado, a freqüência de expressão dos genes estudados (GIs) entre as bibliotecas de cDNA de larvas e de glândulas salivares de ninfas, fêmeas e machos (Tabela 4) foi analisada e levou à seleção daqueles cuja frequência de expressão fosse mais expressiva e comum a diferentes estágios de desenvolvimento dos carrapatos. Nessa tabela a freqüência de expressão representa o número de cópias expressas para determinado transcrito naquela biblioteca específica. Assim, a tabela 4 mostra os 15 GIs selecionados.
72
A B
PBS
C D VETOR
SIGP G05 E F
Figura 6. Fotomicrografias de secções histológicas de peles de bovinos para análise do infiltrado celular induzido pelos GIs. A pele de bovinos da raça Nelore foi inoculada com 500 µg de DNA nu dos GIs selecionados. Após 72 h as biópsias das reações cutâneas positivas foram coletadas e processadas para análise histopatológica do infiltrado inflamatório celular. Coloração HE para as contagens globais (coluna da esquerda) e May- Grüenwald Giemsa para as contagens diferenciais (coluna da direita), aumento de 400 X. Setas azuis indicam mastócitos, enquanto as pretas, eosinófilos.
73
Tabela 4. Características dos genes de interesse selecionados para os ensaios de interferência por RNA
Nº % de Respostas Frequência de expressão na ID Similaridade Função putativa reações Grupo positivas / biblioteca positivas total PBS NA Controle Negativo 4 / 23 17,39 NA G1 Média em RmHM, alta em SIGP A07 Endopeptidase Desconhecida 1 / 6 16,66 G2 RmHN, baixa em RmHL Inibidor de sinalização SIGP A12 Ligante de MD 2 / 6 33,33 Baixa em RmHF G3 de TLR SIGP D08 Serina Protease Inibidor de trombina 2 / 8 25,00 Baixa RmHN G4 NÃO NA Controle Negativo NA NA NA G5 INOCULADOS SIGP H02 Ligante de IgG Inibidor de Ab 2 / 9 22,22 Alta em RmHM G6 Alta em RmHM, média em CEM G04 Proteína estrutural (PRG) Fixação 2 / 2 100,00 G7 RmHN, baixa em RmHL SUBOLESINA Desconhecida Controle Positivo NT NT NA G8 Modulação de matriz SIGP A03 Metaloprotease NT NT Alta em RmHM G9 extracelular SIGP C03 Ligante de IgG Inibidor de anticorpo NT NT Alta em RmHM G10 Anti-inflamatório/ Anti- SIGP F11 Ligante de histamina 2 / 6 33,33 Média em RmHF G11 hemostático Peptídeo SIGP G05 Microplusina 4 / 8 50,00 Baixa em RmHM e RmHN G12 antimicrobiano Alta em RmHM e RmHN, CEM C02 Loricrina Reparo tecidual 2 / 3 66,66 G13 baixa em RmHF Proteína salivar Baixa em RmHF e RmHL, CEM F09 Desconhecida 5 / 9 55,55 G14 imunodominante média em RmHM e RmHN Inibidor de adesão SIGP C06 Desintegrina 2 / 6 33,33 Baixa RmHN G15 celular CEM B09 Cemento (64P) Fixação NT NT Média em RmHN G16
CEM C09 Cemento (RIM36) Fixação NT NT Alta em RmHM e RmHN G17 Baixa em RmHF, alta em CEM F12 Cemento (RIM36) Fixação 5 / 8 62,50 G18 RmHN
NA: Não aplicável; NT: Não testado;
RmHL: biblioteca de cDNA proveniente de carrapatos no estágio larva alimentados em hospedeiro Holandes Preto e Branco (HPB); RmHN: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio ninfa alimentados em hospedeiro HPB; RmHM: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto macho alimentados em hospedeiro HPB; RmHF: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto fêmea alimentados em hospedeiro HPB.
74
4.4 Avaliação do efeito do silenciamento gênico através de interferência por RNA nos parâmetros biológicos e reprodutivos dos carrapatos
A figura 7 mostra os 15 GIs que foram produzidos como fita dupla de RNA (dsRNA) para a inoculação nos carrapatos adultos. Esses GIs foram testados em três experimentos independentes, individualmente ou em combinação, totalizando 19 grupos experimentais. Além disso, três grupos controles foram incluídos: carrapatos não inoculados (controle negativo, G5), carrapatos inoculados com água (diluente das moléculas de RNA recém- sintetizadas, controle negativo, G1) e carrapatos inoculados com RNA de interferência para a subolesina (controle positivo, G8) (de la Fuente et al., 2006a). dsRNA para o silenciamento da metaloprotease 1 (MP1) também foi produzido, de acordo com a sequência disponível na base de dados de R. (B.) microplus. Para avaliar o efeito do silenciamento gênico foram realizadas infestações em bovinos suscetíveis às infestações.
O primeiro parâmetro biológico analisado entre os carrapatos liberados sobre o hospedeiro foi a taxa de mortalidade das fêmeas após dois dias da inoculação das moléculas dsRNA (ou dois dias após a liberação sobre o hospedeiro suscetível, uma vez que os carrapatos foram liberados ao final das inoculações). Não foram observadas diferenças significativas na taxa de mortalidade de fêmeas inoculadas com RNA de nenhum dos GIs estudados comparada à de fêmeas não inoculadas (controle negativo, G5) (Figs. 8 e 9 e Tabs. 5 e 6). À primeira vista, a taxa de mortalidade dos carrapatos pareceu elevada (variando de 10 a 48 %), no entanto está coerente com resultados apresentados por outros pesquisadores (Kumar et al., 2009). No terceiro dia de infestação, três carrapatos foram coletados por grupo para a análise histológica dos órgãos internos e dissecção das glândulas salivares para confirmação do silenciamento gênico por PCR. Esse prazo foi estabelecido em virtude do tempo que dura a infestação com carrapatos R. (B.) microplus no estágio adulto (aproximadamente sete dias), visto que a atividade das glândulas salivares diminui significativamente nos períodos finais de alimentação (Nunes et al., 2006).
Em seguida, as fêmeas foram acompanhadas até o sétimo dia de ingurgitamento. Nos três experimentos realizados, as fêmeas do grupo controle G5 (não inoculadas) aos sete dias da infestação já estavam completamente alimentadas e se soltaram para ovipostura. Nesse momento, as fêmeas dos demais grupos foram também coletadas, mesmo se ainda estivessem fixadas ao hospedeiro. Vale ressaltar que nesse dia já havia fêmeas destacadas do hospedeiro
75
PM G2 G3 G4 G6 G7
400 bp
PM G9 G10 G11 G12 G13
300 bp
PM G14 G15 G16 G17 G18
300 bp
Figura 7. Eletroforese das moléculas de fita dupla de RNA (dsRNA) sintetizadas a partir da sequência clonada dos GIs. As dsRNA foram sintetizadas adicionando-se o sítio T7 3’ e 5’ às sequências de cDNA originais dos GIs e a transcrição foi realizada in vitro. Após a purificação dos produtos obtidos, o tamanho dos transcritos, correspondentes a cada GI testado e representados pelos grupos G2 a G18 foi confirmado por eletroforese em gel de agarose 1%, marcados com GelRed®. É possível observar que os transcritos sintetizados variaram entre 300 e 400 bp. A coluna da esquerda (PM) representa o marcador de peso molecular de 1Kb.
76
A 60
50
40
30
20
10
Mortalidade das fêmeas (%) das Mortalidade 0
G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 80 B
60
40
20
% de fêmeas de ingurgitadas %
0
G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14
Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina)
Grupos experimentais
Figura 8. Efeito do silenciamento gênico na taxa de mortalidade e porcentagem dos carrapatos fêmeas ingurgitadas. Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Após 2 dias, os carrapatos mortos foram recuperados e a taxa de mortalidade calculada para cada grupo. Os carrapatos restantes foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e após seu desprendimento para ovipostura o número de fêmeas alimentadas foi calculado para cada grupo. As barras representam a relação entre o número de fêmeas mortas sobre o número total de fêmeas liberadas (A) e a relação entre o número de fêmeas alimentadas e o número de fêmeas liberadas (B). Os resultados obtidos foram comparados com o grupo controle (representado pela barra branca; G1: carrapatos inoculados com água). Dados dos experimentos 1 e 2 compilados. Nenhuma diferença estatística foi observada.
77
A 50
40
30
20
10
Mortalidade fêmeasdas (%) 0
G5 G1 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23 B 70
60
50
40
30
20
10
% de fêmeas de ingurgitadas %
0
G5 G1 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23
Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina)
Grupos experimentais
Figura 9. Efeito do silenciamento gênico na taxa de mortalidade e porcentagem dos carrapatos fêmeas ingurgitadas. Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Após 2 dias, os carrapatos mortos foram recuperados e a taxa de mortalidade calculada para cada grupo. Os carrapatos restantes foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e após seu desprendimento para ovipostura o número de fêmeas alimentadas foi calculado para cada grupo. As barras representam a relação entre o número de fêmeas mortas sobre o número total de fêmeas liberadas (A) e a relação entre o número de fêmeas alimentadas e o número de fêmeas liberadas (B). Os resultados obtidos foram comparados com o grupo controle (representado pela barra branca; G1: carrapatos inoculados com água). Dados dos experimentos 1 e 2 compilados. Nenhuma diferença estatística foi observada.
78 em todos os grupos estudados, embora no grupo controle todas as fêmeas se encontravam nessa situação. Além disso, em alguns grupos foi possível observar mortalidade de fêmeas no decorrer da infestação (após os dois primeiros dias). Sendo assim, algumas fêmeas não estão contempladas nos resultados referentes à taxa de mortalidade, nem tampouco entre as recuperadas ingurgitadas (segunda e terceira colunas das Tabs. 5 e 6). O número de fêmeas ingurgitadas recuperadas foi diferente entre os grupos estudados, entretanto nenhuma relevância estatística foi observada (Figs. 8 e 9 e Tabs. 5 e 6). Em seguida, as fêmeas foram mantidas em laboratório e avaliadas com relação aos seus parâmetros reprodutivos. Inicialmente realizou-se a comparação dos grupos testes com os dois controles G5 e G1 separadamente. Dado que não havia diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos controles, optou-se por se comparar os resultados obtidos com os grupos testes somente com o grupo G1, por julgar o grupo controle mais indicado para as comparações, uma vez que sofreram o stress da inoculação. Vale ressaltar que em nenhum dos parâmetros avaliados, diferenças vistas como estatisticamente significativas ocorreram apenas para um dos controles, não o sendo para o outro. Por fim, os resultados obtidos com os grupos controles dos dois experimentos realizados independentemente foram compilados e considerados no todo, uma vez que também não diferiram entre si. Entretanto o mesmo não foi observado para o terceiro experimento, onde ocorreu diferença estatística entre seus grupos controles e os dos dois primeiros experimentos. Assim, os resultados obtidos com os últimos grupos testados (G15 a G23) serão apresentados separadamente nas tabelas e nas figuras. Vale ressaltar que os resultados obtidos com a inoculação desses grupos experimentais também foram comparados ao respectivo grupo controle G1, conforme descrito para os experimentos anteriores. Acredita-se que a diferença observada entre os grupos controles pode estar associada a um pior desempenho dos carrapatos devido a fatores ambientais como a época do ano. Além disso, como já dito anteriormente, o G8 foi repetido no terceiro experimento, entretanto com um pequeno número de carrapatos inoculados (10 fêmeas), utilizando-se todo o dsRNA disponível.
Como é possível observar na Figura 10, o peso das fêmeas ao final do ingurgitamento realmente não diferiu entre os grupos controles negativos, ficando em torno de 194,52 mg ± 23,99 para o G5 e 180,80 mg ± 22,88 para o G1. Entretanto, foi possível observar uma redução significativa do peso das fêmeas alimentadas com o silenciamento de cinco dos GIs testados (G9, G11, G12, G13 e G14), onde os valores observados foram respectivamente 26,71 mg ± 10,32, 87,57 mg ± 23,19, 102,00 mg ± 25,19, 78,93 mg ± 24,55 e 92,58 mg ± 79
Tabela 5. Efeito do silenciamento gênico na sobrevivência, alimentação e fecundidade de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Nº Fêmeas Nº de produtoras Tempo médio Nº de Peso médio das Tempo médio fêmeas Peso médio da larvas de fêmeas fêmeas IER médio (%) para eclosão Taxa de Grupo mortas / massa de ovos viáveis / sobrevivência ingurgitadas alimentadas ± ± EPM das larvas (d) eclosão (%) total ± EPM (mg) total fêmeas das larvas (d) / total (%) EPM (mg) ± EPM (%) ingurgitadas ± EPM (%) Controle 20/60 30/60 18/30 Negativo 194,52 ± 23,99 90,83 ± 13,71 33,76 ± 4,52 18,39 ± 0,26 40,96 ± 8,23 46,71 ± 0,68 (33,33) (50) (60) (G5) 14/60 30/60 16/30 B (G1) 180,80 ± 22,88 87,16 ± 12,94 34,16 ± 4,26 18,25 ± 0,25 42,68 ± 7,61 46,33 ± 0,47 (23,33) (50) (53,33) Controle 9/60 30/60 0/30 6,69 ± 1,14** 0,00 ± 0,00** 0,00 ± 0,00** NA NA NA Positivo (G8) (15) (50) (0)** 14/30 11/30 7/11 SIGP_A07 199,00 ± 37,01 70,54 ± 16,41 29,39 ± 4,43 17,28 ± 0,42 50,57 ± 14,40 48,14 ± 0,67* (46,66) (36,66) (63,63) 6/30 14/30 5/14 SIGP_A12 125,00 ± 34,86 53,42 ± 17,63 26,02 ± 5,77 18,60 ± 0,40 29,11 ±14,55 45,6 ± 0,68 (20) (46,66) (35,71) 16/30 10/30 6/10 SIGP_D08 176,20 ± 41,97 66,0 ± 20,13 27,79 ± 6,12 17,66 ± 0,76 14,65 ±7,03* 46,17 ± 0,91 (53,33) (33,33) (60) 3/30 16/30 8/16 SIGP_H02 177,25 ± 31,03 66,75 ± 14,38 29,73 ± 4,94 18,31 ± 0,35 14,67 ± 7,87* 47,67 ± 1,43 (10) (53,33) (50) 4/30 21/30 11/21 CEM_G04 195,00 ± 27,01 69,40 ± 14,10 29,91 ± 4,23 18,08 ± 0,43 23,63 ±7,96 45,91 ± 1,59 (13,33) (70) (52,38) 13/30 7/30 1/7 SIGP_A03 26,71 ± 10,32** 6,14 ± 6,14** 7,06 ± 7,06** 19 ± 0 89 ± 0 ND (43,33) (23,33) (14,28) 5/30 18/30 7/18 SIGP_C03 119,39 ± 26,21 50,17 ± 14,32 25,45 ± 5,93 19,86 ±0,14** 47,1 ± 12,65 ND (16,66) (60) (38,88) 3/30 21/30 4/21 SIGP_F11 87,57 ± 23,19** 33,00 ± 12,55** 15,18 ± 5,15** 19,5 ± 0,29* 39,35 ± 16,14 ND (10) (70) (19,05) 7/30 13/30 2/13 SIGP_G05 102,00 ± 25,19* 29,08 ± 12,42** 16,63 ± 5,99* 19 ± 0 10,40 ± 9,91** ND (23,33) (43,33) (15,38) 12/30 14/30 2/14 CEM_C02 78,93 ± 24,55** 24,00 ± 10,37** 12,97 ± 4,59** 19 ± 0 42,97 ± 16,24 ND (40) (46,66) (14,28) 11/30 17/30 3/17 CEM_F09 92,58 ± 29,19* 30,77 ± 15,21* 14,83 ± 4,83** 19 ± 0 13,40 ± 8,85* ND (36,66) (56,66) (17,65)
Os símbolos representam os níveis de significância em relação aos respectivos controles: * 0,01 < p < 0,05, e ** p ≤ 0,01 em relação a G1;
B: Branco; NA: não aplicável; ND: não determinado
IER (Índice de Eficiência Reprodutiva) = Peso da massa de ovos (g) X 100 Peso da fêmea ingurgitada (g)
80
Tabela 6. Efeito do silenciamento gênico na sobrevivência, alimentação e fecundidade de carrapatos Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Nº fêmeas Nº de produtoras Nº de Peso médio Peso médio fêmeas de larvas Gene de fêmeas das fêmeas da massa de IER médio mortas / viáveis / interesse ingurgitadas alimentadas ± ovos ± EPM (%) ± EPM total total fêmeas / total (%) EPM (mg) (mg) (%) ingurgitadas (%) Controle 13/30 17/30 0/30 Negativo 101,94 ± 24,44 49,14 ± 19,16 25,99 ± 6,25 (43,33) (56,66) (0) (G5) 7/30 11/30 0/30 B (G1) 110,00 ± 26,51 51,40 ± 20,42 29,28 ± 8,07 (23,33) (36,66) (0) 9/30 8/30 0/30 SIGP_C06 78,37 ± 23,62 23,00 ± 10,67 21,30 ± 6,54 (30) (26,66) (0) 9/30 14/30 0/30 CEM_B09 91,21 ± 22,21 39,22 ± 15,50 26,60 ± 6,83 (30) (46,66) (0) 5/30 15/30 0/30 CEM_C09 100,07 ± 22,53 52,00 ± 21,35 36,84 ± 9,09 (16,66) (50) (0) 2/30 20/30 0/30 CEM_F12 81,05 ± 17,53 17,33 ± 9,33 20,69 ± 10,39 (6,66) (66,66) (0) SIGP_A12 + 10/30 19/30 0/30 69,74 ± 17,51 44,00 ± 23,02 29,64 ± 9,95 SIGP_G05 (33,33) (63,33) (0) SIGP_D08 + 13/30 14/30 0/30 56,07 ± 15,65 8,40 ± 5,48 10,32 ± 6,47 SIGP_H02 (43,33) (46,66) (0) SIGP_G05 + 1/30 16/30 0/30 44,94 ± 14,05 17,25 ± 15,27 16,59 ± 11,71 CEM_F09 (3,33) (53,33) (0) SIGP_F11 + 6/30 11/30 0/30 129,73 ± 28,26 40,67 ± 19,89 21,72 ± 7,92 CEM_C02 (20) (36,66) (0)
IER (Índice de Eficiência Reprodutiva) = Peso da massa de ovos (g) X 100 Peso da fêmea ingurgitada (g)
81
A 300
250
200
150 * * ** ** 100
50 ** **
Peso das fêmeas ingurgitadas (mg) fêmeas ingurgitadas Peso das 0
G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 B 120
100
80
60 ** * ** 40 **
20 **
Peso da massa de ovos (mg) de massa Peso da ** 0
G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14
Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina)
Grupos experimentais
Figura 10: O silenciamento de alguns GIs reduziu o peso médio das fêmeas e das massas de ovos. Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e as fêmeas alimentadas foram recuperadas para avaliação dos parâmetros reprodutivos após seu desprendimento para ovipostura. Imediatamente após seu desprendimento, o peso das fêmeas alimentadas foi determinado e após 10 dias de ovipostura, o peso da massa de ovos proveniente das fêmeas alimentadas foi obtido. As barras representam o peso médio das fêmeas alimentadas (mg) EPM (A) e o peso médio das massas de ovos obtidas das fêmeas alimentadas (mg) EPM (B). Dados dos experimentos 1 e 2 compilados. Os símbolos representam diferenças estatísticas em relação ao grupo controle G1; *:0,01 82 29,19 (com p<0,01 para G9, G11 e G13; 0,01 O parâmetro biológico seguinte avaliado foi o peso da massa de ovos (Figs. 10 e 11; Tabs. 5 e 6). Os mesmos grupos que apresentaram redução do peso das fêmeas também mostraram redução do peso da massa de ovos de maneira significativa em relação aos grupos controles. Vale ressaltar que os valores médios observados nesse parâmetro reprodutivo para os grupos teste demonstraram uma redução bastante acentuada (variação de 2,5 até 13 vezes). Novamente não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos do terceiro experimento. Em seguida, o índice de eficiência reprodutiva (IER) das fêmeas foi calculado, pela razão entre o peso da massa de ovos e o peso das fêmeas alimentadas. Esse índice pode ser interpretado como a taxa de conversão de peso de sangue (ingerido pela fêmea) em massa de ovos. Como é possível observar nas Figuras 11 e 12 e nas Tabelas 5 e 6, o silenciamento gênico reduziu significativamente o IER em cinco dos GIs testados (os mesmos onde ocorreram reduções dos pesos das fêmeas e das massas de ovos). Os valores médios ± EPM observados em cada grupo estão apresentados nas Tabelas 5 e 6 . Esse resultado confirma que o silenciamento teve um efeito mais acentuado sobre a ovipostura das fêmeas do que sobre o peso de ingurgitamento, uma vez que os IERs mostraram-se consistentemente diminuídos. Além disso, pode-se concluir que o silenciamento desses genes prejudicou o sucesso alimentar e reprodutivo dos carrapatos, e que eles podem ser alvos interessantes numa nova estratégia de controle. Assim como não foram observadas diferenças estatísticas em relação ao número de fêmeas mortas e de fêmeas alimentadas, não houve diferença significante em relação ao número de fêmeas produtoras de massas de ovos/larvas viáveis entre os primeiros 14 GIs estudados. A exceção ficou apenas para o grupo G8 (controle positivo, subolesina) em que essa diferença foi relevante (Fig. 12 e Tab. 5). Nenhuma fêmea produziu massa de ovos viáveis entre os grupos testados no terceiro experimento (dados não mostrados). 83 Figura 11: O silenciamento dos GIs não afetou o peso médio das fêmeas, das massas de ovos e o índice de eficiência reprodutiva (IER). Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e as fêmeas alimentadas foram recuperadas para avaliação dos parâmetros reprodutivos após seu desprendimento para ovipostura. Imediatamente após seu desprendimento, o peso das fêmeas alimentadas foi determinado e após 10 dias de ovipostura, o peso da massa de ovos proveniente das fêmeas alimentadas foi obtido. Em seguida, o IER foi calculado através da razão entre o peso da massa de ovos (g) e o peso da respectiva fêmea ingurgitada (g) multiplicado por 100. As barras representam o peso médio das fêmeas ingurgitadas (mg) EPM (A), o peso médio das massas de ovos obtidas das fêmeas alimentadas (mg) EPM (B) e o IER EPM (C). Dados do experimento 3. Nenhuma diferença estatística foi observada em relação ao grupo controle G1. 84 200 A 150 100 50 Peso das fêmeas ingurgitadas (mg) fêmeas ingurgitadas Peso das 0 G5 G1 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23 B 120 100 80 60 40 20 Peso das massas de ovos (mg) 0 G5 G1 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23 C 60 50 40 30 IER (%) IER 20 10 0 G5 G1 G15 G16 G17 G18 G19 G20 G21 G22 G23 Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina) Grupos experimentais 85 A 50 40 30 * ** 20 ** IER (%) ** ** 10 ** 0 G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 B 70 60 50 40 30 20 de larvas viáveisde % de fêmeas produtoras fêmeas de produtoras % 10 ** 0 G5 G1 G8 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina) Grupos experimentais Figura 12. O silenciamento de alguns GIs, apesar de não reduzir o número de carrapatos fêmeas capazes de produzir larvas viáveis, reduziu o índice de eficiência reprodutiva (IER). Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e as fêmeas alimentadas foram recuperadas para avaliação dos parâmetros reprodutivos após seu desprendimento para ovipostura. As barras representam o IER EPM (A), calculado através da razão entre o peso da massa de ovos (g) e o peso da respectiva fêmea ingurgitada (g) multiplicado por 100 e a porcentagem de fêmeas produtoras de larvas viáveis EPM (B), calculada através da razão entre o número de fêmeas que produziram larvas viáveis sobre o número total de fêmeas liberadas para alimentação. Dados dos experimentos 1 e 2 compilados. Os símbolos representam diferenças estatísticas em relação ao grupo controle G1; *: 0,01 Dois grupos (G10 e G11) mostraram impacto significativo (p<0,01 e 0,01 Adicionalmente, foi possível observar uma redução significativa da taxa de eclosão das larvas com o silenciamento de quatro GIs estudados (G4, G6, G12 e G14), os quais apresentaram valores até 75% menores aos observados nos controles (Fig. 13 e Tab. 5). Mais uma vez, dois grupos (G4 e G6) mostraram um único parâmetro alterado em relação ao grupo controle, enquanto os outros dois, essa alteração foi adicional às anteriormente observadas. Finalmente, o tempo de sobrevivência das larvas não foi negativamente afetado pelo silenciamento de nenhum dos GIs estudados. Vale ressaltar que nem todos os 23 grupos tiveram esse parâmetro avaliado. Merecem destaque os resultados obtidos no terceiro experimento, onde surpreendentemente nenhuma massa de ovos viáveis foi recuperada, nem tampouco entre as fêmeas do grupo controle, o que não permitiu a avaliação de diversos parâmetros outrora analisados e prejudicou a análise dos últimos genes testados. Entre esses, estão incluídos o grupo 19, formado por carrapatos silenciados de metaloprotease tipo 1 (de acordo com a sequência disponível em base de dados) e os grupos 20, 21, 22 e 23 formados pela combinação de oito genes testados anteriormente. Infelizmente, o efeito sinérgico que seria avaliado pelo silenciamento de ambos os genes simultaneamente não pode ser realizado, nem tampouco a comparação com os resultados obtidos com o silenciamento da sequência de metaloprotease proveniente da biblioteca de cDNA estudada. A fim de avaliar o efeito do silenciamento gênico apenas em parâmetros reprodutivos, isto é, independentes da alimentação, fêmeas de carrapatos completamente alimentadas em bovinos suscetíveis foram inoculadas com os dsRNA como descrito anteriormente. Foram testados 20 grupos mostrados na figura 12. Com os resultados obtidos é possível dizer que o silenciamento gênico não exerceu efeito significativo apenas sobre os parâmetros reprodutivos analisados, incluindo peso da massa de ovos (Fig. 14), tempo para eclosão das larvas e taxa de eclosão das mesmas (dados não mostrados). Esses resultados nos apontam que há maior prejuízo no desenvolvimento dos carrapatos se o silenciamento gênico for 87 A 25 ** 20 * 15 10 5 0 Período para larvasPeríodoeclosão para (d) das G5 G1 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 B 100 80 60 40 * * Taxa de eclosãoTaxa de (%) 20 * ** 0 G5 G1 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupo controle positivo (subolesina) Grupos experimentais Figura 13: O silenciamento de alguns GIs aumentou o período para eclosão das larvas e reduziu a taxa de eclosão das mesmas. Fêmeas de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante todo o período de alimentação (7 dias) e as fêmeas alimentadas foram recuperadas para avaliação dos parâmetros reprodutivos após seu desprendimento para ovipostura. As massas de ovos foram observadas diariamente e o período (em dias) para eclosão das larvas (d) EPM foi determinado (A). Após a completa eclosão das larvas, as massas foram avaliadas quanto a taxa de eclosão (%) EPM (B). Dados dos experimentos 1 e 2 compilados. Os símbolos representam diferenças estatísticas em relação ao grupo controle G1; *: 0,01 88 240 200 160 120 80 40 Peso das massas de ovos (mg) de massas Peso das 0 G5 G1 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13 G14 G15 G16 G17 G18 G19 G22 G23 Grupo controle não inoculado Grupo controle inoculado com água Grupos experimentais Figura 14: O silenciamento gênico após o completo ingurgitamento das fêmeas de carrapatos não alterou o peso das massas de ovos. Fêmeas de carraptos R. (B.) microplus foram recuperadas e pesadas após completa alimentação em hospedeiro suscetível à infestação. Em seguida foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água). As fêmeas foram mantidas em oviposição durante 10 dias e então, o peso da massa de ovos foi determinado. As barras representam o peso médio das massas de ovos (mg) EPM. Nenhuma diferença estatística foi observada entre os grupos. 89 realizado nas etapas iniciais do período de alimentação dos carrapatos, o que, de fato, ocorreria após a imunização dos hospedeiros, enquanto o silenciamento gênico realizado no final do período de alimentação poderia afetar mais diretamente a função do GI escolhido na progênie da fêmea inoculada (Nijhof et al., 2007), embora não tenham sido avaliados. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o silenciamento gênico afetou sobremaneira os parâmetros reprodutivos e biológicos dos carrapatos, principalmente com relação à quantidade de sangue ingerida durante a alimentação, uma vez que quase todos os momentos em que se observa uma redução do peso das fêmeas alimentadas, uma redução significativa do peso da massa de ovos também ocorre (Tab. 5). Além disso, é possível concluir que não há uma correlação direta entre os efeitos do silenciamento gênico e a abundância de expressão dos GIs em nossas bibliotecas de cDNA de tecidos/estágios de carrapatos. Ou seja, foi possível observar um efeito significativo nas fêmeas alimentadas com silenciamento de genes preferencialmente expressos em larvas, ninfas e machos e não daqueles expressos abundantemente apenas em fêmeas. Por outro lado, os resultados parecem confirmar que genes abundantemente expressos podem ser bons candidatos a antígenos vacinais. A tabela 7 mostra a porcentagem de redução dos principais parâmetros afetados para os genes nos quais a interferência por RNA causou maior efeito. É possível observar uma acentuada redução no desempenho dos parâmetros afetados e perceber que dois GIs (G12 e G14, respectivamente SIGP G05 e CEM F09) foram os responsáveis pelo maior prejuízo observado nos carrapatos, considerando o número de parâmetros e o nível que os afetaram, se mostrando os principais genes selecionados pela avaliação do desenvolvimento dos carrapatos após interferência por RNA. 4.5 Avaliação do efeito do silenciamento gênico nos tecidos dos carrapatos Secções dos tecidos dos carrapatos inoculados com dsRNA e alimentados em bovinos foram comparados aos de carrapatos controles para observar o efeito do silenciamento gênico. Como mostra a figura 15, no grupo controle não foi possível observar alterações microscópicas nas estruturas ou células dos diversos órgãos avaliados. Foi possível observar as glândulas salivares com sua estrutura preservada e a presença dos três a quatro diferentes tipos de ácinos que as compõem (Walker et al., 1985); o intestino também não apresentou 90 Tabela 7. Porcentagem de redução de parâmetros dos desempenhos biológico e reprodutivo de carrapatos inoculados com RNA de interferência cujos silenciamentos foram mais expressivos. Peso médio Peso médio Gene de IER Taxa de das fêmeas da massa de interesse médio eclosão alimentadas ovos SIGP D08 SE SE SE 67 SIGP H02 SE SE SE 67 SIGP A03 85 93 81 SE SIGP F11 52 62 56 SE SIGP G05 43 67 53 76 CEM C02 56 72 65 SE CEM F09 49 65 59 69 IER: Índice de Eficiência Reprodutiva SE: Sem Efeito 91 Figura 15. Fotomicrografias de secções de carrapatos inoculados com água (controles). Fêmeas e machos de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculados com 0,3 µL de água no abdômen e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante 3 dias de alimentação e então foram coletados e processados para análise histológica após coloração pela técnica de Mallory. Aumento de 1000x. A) Glândulas salivares; B) Hemócitos; C - F) Intestinos; G) Espermatogônias; H) Ovos em desenvolvimento. 92 A B C D E F G H 93 nenhuma alteração celular ou de seu conteúdo, representado por inclusões intracelulares resultantes da digestão de hemoglobina do hospedeiro (Caperucci et al., 2010) (Fig. 15); o aparelho reprodutor e os hemócitos também não aparecem afetados (Fig. 15 G-H e 15 B). Por outro lado, os carrapatos inoculados com dsRNA do controle positivo apresentaram alterações significativas nos diversos órgãos observados que corroboram os efeitos observados nos parâmetros biológicos e reprodutivos avaliados após a inoculação (Fig. 16). As glândulas salivares se mostraram parcialmente degeneradas, impossibilitando a distinção entre os tipos de ácinos (Fig. 16 A-B), vacuolização e retração citoplasmática e diferentes graus de degeneração nuclear sugestivos de apoptose puderam ser observados; o intestino mostrou sua organização celular alterada, caracterizada pela presença de células bastante vacuolizadas (Fig. 16 C-D) e conteúdo menos denso (Fig. 16 D) e reduzido em quantidade; foi possível observar diversos túbulos de Malpighi sem nenhum conteúdo (Fig. 16 E). Ainda observou-se a presença de hemócitos nas secções do controle positivo (Fig. 16 F). Entre os grupos experimentais, de forma geral foram observadas alterações teciduais em diferentes graus, de acordo com o gene ou o tecido avaliado. Foi possível observar uma acentuada degeneração das glândulas salivares (Figs. 17 A-C) e da arquitetura do intestino (Fig. 17 D) com alteração das inclusões citoplasmáticas intestinais (Fig. 17 E-F); os ovos também apresentaram alterações da morfologia e organização (Fig. 17 G). Aparentemente, o sistema nervoso central, representado pelo singlânglio nos carrapatos, não parece ter sido afetado pelo silenciamento (Fig. 17 H). 4.6 Confirmação do silenciamento gênico nas glândulas salivares de carrapatos parcialmente alimentados Glândulas salivares de carrapatos machos e fêmeas inoculados com dsRNAs parcialmente alimentados foram coletadas para confirmação do silenciamento gênico por RT- PCR quantitativo (qRT-PCR) e infelizmente nem todos os grupos puderam ser avaliados devido ao rendimento de RNA obtido. A expressão de mensagem foi determinada para os GIs silenciados paralelamente ao gene constitutivo actina. De acordo com Bustin e colaboradores (2009), todos os resultados foram normalizados pela expressão do gene constitutivo na mesma amostra e em seguida pela expressão do mesmo GI no grupo controle G5 (carrapatos não inoculados) e portanto a condição mais próxima do natural (ΔΔCt). 94 A B C D E F Figura 16. Fotomicrografias de tecidos de carrapatos inoculados com dsRNA para o silenciamento do gene da subolesina (controle positivo). Fêmeas e machos de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante 3 dias de alimentação e então foram coletados e processados para análise histológica após coloração pela técnica de Mallory. Aumento de 1000x. Observar que há uma vacuolização evidente dos tecidos. A) Glândulas salivares; B - F) Intestinos 95 Figura 17. Fotomicrografias de tecidos de carrapatos inoculados com dsRNA para o silenciamento dos diferentes GIs testados. Fêmeas e machos de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante 3 dias de alimentação e então foram coletados e processados para análise histológica após coloração pela técnica de Mallory. Aumento de 1000x. A – C) Glândulas salivares (observar a presença de diversos vacúolos); D – F) Intestinos; G) Ovos em desenvolvimento; H) Singânglio. 96 A B C D E F G H 97 Assim, a figura 18 mostra a expressão relativa de mensagem dos GIs estudados nos grupos experimentais e G1, ambos normalizados pela expressão dos mesmos transcritos no grupo G5. Como é possível observar, houve uma expressiva diminuição da expressão de mensagem para todos os GIs analisados, o que confirma a eficiência do silenciamento gênico realizado e valida as observações discutidas adiante. Surpreendentemente, alguns GIs tiveram seu nível de expressão alterados no grupo G1 em relação ao grupo G5, quando o esperado era que se mantivessem iguais (Fig. 18). Entretanto vale ressaltar que embora os níveis de mensagem dos GIs tenham sofrido variação entre os grupos controle, ela não foi suficiente para induzir um efeito detectável nos parâmetros avaliados nos carrapatos. De certa forma, os níveis de diminuição de mensagem transcrita entre os grupos experimentais avaliados, comparados aos níveis entre os grupos controle, corroboram os efeitos observados nos parâmetros anteriormente descritos. 4.7 Análise in silico mais detalhada dos genes de interesse selecionados A comparação entre bibliotecas de cDNA de glândulas salivares de carrapatos R. (B.) microplus alimentados em bovinos genotipicamente distintos quanto à resistência (raça NEL) e suscetibilidade (raça HPB) a carrapatos forneceu mais um atributo aos genes estudados como antígenos candidatos e finaliza a análise dos candidatos selecionados através de estratégias genômicas. Ao se comparar as bibliotecas RmH e RmN (produzidas com glândulas salivares de carrapatos fêmeas semi-alimentadas em bovinos da raça HPB ou NEL, respectivamente) foi possível observar que há interferência do sistema imunológico do hospedeiro sobre a expressão gênica, pois o número de transcritos detectados para dada função entre elas foi diferente para alguns genes. Essa abordagem mostrou que alguns genes têm sua expressão reprimida, enquanto outros têm sua expressão induzida durante a hematofagia e que a modulação ocorre distintamente entre os genótipos de resistência dos hospedeiros. Na tabela 8 é possível notar que alguns GIs têm sua expressão modulada pela resposta imunológica dos hospedeiros, enquanto outros não. Interessantemente, nem sempre há correlação entre a modulação da expressão gênica pela reposta imunológica dos hospedeiros e os resultados observados com a inoculação de DNA nu e interferência por RNA. De qualquer 98 maneira, essa informação foi incorporada a análise dos GIs anteriormente estudados. Os dados obtidos por todas as triagens descritas até o momento foram compilados na tabela 8. A 2 3 1 0 0 -3 -1 -6 de mensagemde -2 -9 Expressãorelativa -3 -12 G1 G10 G1 G11 2 2 0 1 -2 0 -4 de mensagem de -1 -6 Expressão relativa Expressão -8 -2 G1 G12 G1 G17 1 1 0 0 -1 -1 -2 -2 -3 -3 de mensagem de -4 -4 Expressão relativa Expressão -5 -5 G1 G19 G1 G23 Grupo controle inoculado com água Grupos experimentais Figura 18. Confirmação do silenciamento gênico por qRT-PCR. Fêmeas e machos de carrapatos R. (B.) microplus alimentadas por 1 dia foram inoculadas com dsRNA no abdômen (aproximadamente 1011 moléculas em 0,3 µL de água) e 2 h após foram liberadas sobre o dorso de um bovino suscetível à infestação. Os carrapatos foram acompanhados durante 3 dias de alimentação e coletados para dissecção das glândulas salivares para confirmação do silenciamento gênico. As glândulas salivares de cinco carrapatos de cada grupo foram agrupadas e tiveram seu RNA total isolado para confecção das moléculas de cDNA correspondentes, que foram submetidas à reação de amplificação com quantificação em tempo real (qRT-PCR). Os dados do grupo controle G1 (que recebeu inoculação de água) e dos grupos experimentais mostrados foram previamente normalizados em relação ao gene constitutivo actina, e em seguida, ao grupo controle G5 (que não recebeu nenhuma inoculação). 99 Tabela 8. Características dos genes de interesse de carrapatos R. (B.) microplus selecionados para expressão protéica. Resposta Efeito do Gene de Freqüência de expressão / Modulação Similaridade Função putativa cutânea silenciamento interesse Biblioteca analisada da RI tardia gênico Média em RmHM, alta em SIGP_A07 Endopeptidase Desconhecida + + SE RmHN, baixa em RmHL Reconhecimento de Inibidor de SIGP_A12 Baixa em RmHF + SE SE lípídios sinalização de TLR SIGP_D08 Serina Protease Inibidor de trombina Baixa RmHN + + SE Alta em RmHM e média SIGP_H02 Ligante de IgG Inibidor de anticorpo + + SE RmNM Alta em RmHM, Média em Proteína estrutural CEM_G04 Fixação RmHN, baixa em RmNN, NT SE ++ (PRG) RmHL, RmNl e RmNF Modulação de matriz SIGP_A03 Metaloprotease Alta em RmHM + ++ ++ extracelular SIGP_C03 Ligante de IgG Inibidor de anticorpo Alta em RmHM e RmNM NT + SE Anti-inflamatório, Média em RmHF e baixa SIGP_F11 Ligante de histamina + +++ SE Anti-hemostático RmNF Peptídeo Baixa em RmHM e RmHN e SIGP_G05 Microplusina + +++ SE antimicrobiano baixa em RmNM Alta em RmHM e RmHN, CEM_C02 Loricrina Reparo tecidual baixa em RmHF; alta em + ++ ++ RmNM Baixa em RmHF e RmHL, Proteína salivar média em RmHM e RmHN; CEM_F09 Desconhecida + +++ -- imunodominante baixa em RmNF e RmNN e alta em RmNM Inibidor de adesão SIGP_C06 Desintegrina Baixa RmHN + +++ SE celular CEM_B09 Cemento (64P) Fixação Média em RmHN NT SE + Alta em RmHM e RmHN; CEM_C09 Cemento (RIM36) Fixação NT SE + baixa em RmNM Baixa em RmHF, alta em CEM_F12 Cemento (RIM36) Fixação + SE + RmHN NT: Não Testado; RI: Resposta Imune; SE: Sem Efeito; Os sinais + representam um score atribuído a cada GI de acordo com o impacto exercido sobre os parâmetros avaliados em cada triagem. RmHL: biblioteca de cDNA proveniente de carrapatos no estágio larva alimentados em hospedeiro Holandes Preto e Branco (HPB); RmHN: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio ninfa alimentados em hospedeiro HPB; RmHM: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto macho alimentados em hospedeiro HPB; RmHF: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto fêmea alimentados em hospedeiro HPB; RmNL: biblioteca de cDNA proveniente de carrapatos no estágio larva alimentados em hospedeiro Nelore (N); RmNN: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio ninfa alimentados em hospedeiro Nelore; RmNM: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto macho alimentados em hospedeiro Nelore; RmNF: biblioteca de cDNA proveniente de glândula salivar de carrapatos no estágio adulto fêmea alimentados em hospedeiro Nelore. 100 intensidade do efeito ocorrido pela a inoculação de DNA nu, pelo silenciamento gênico ou pela presença de alteração da expressão gênica entre as bibliotecas foi classificada por escores, onde um, dois ou três sinais positivos representam um efeito crescente sobre o parâmetro avaliado; sinais negativos representam a diminuição do parâmetro avaliado 4.8 Expressão de proteínas recombinantes A partir dos resultados obtidos com as estratégias genômicas sumarizados na tabela 8, 15 genes foram pré-selecionados para os ensaios de expressão protéica. Uma vez que a expressão em sistemas livres de células não gera bons resultados para a expressão de proteínas de alto peso molecular, após a avaliação das sequências, houve necessidade de dividir a sequência correspondente ao GI CEM C02 em dois fragmentos com aproximadamente metade do peso molecular da proteína completa. Vale ressaltar, que o fragmento que corresponde à sequência inicial da ORF é que contém o domínio responsável pela função/atividade descrita na tabela 8. Os produtos para clonagem obtidos através de reação de PCR foram primeiramente clonados em vetor de entrada para sistema Gateway® (TOPO-pENTR) e utilizados para transformação de E. coli quimicamente competentes, que foram selecionadas em culturas apropriadas. O sucesso das clonagens foi confirmado por PCR entre as oito colônias selecionadas para cada GI, como mostra a Figura 19. Duas colônias de cada grupo foram expandidas para a obtenção de DNA plasmidial, submetidos à reação de seqüenciamento para confirmação da sequência completa inserida, como mostra esquematicamente a figura 3A. As amostras confirmadas foram submetidas à reação de subclonagem e o mesmo procedimento se repetiu para todos os grupos, como mostra a figura 20, dessa vez com duas amostras para cada grupo. Ambas as amostras foram confirmadas (Fig. 3B) por seqüenciamento, embora apenas uma tenha sido utilizada para os ensaios de expressão. O tamanho em nucleotídeos (bp) e em aminoácidos, assim como os pesos moleculares correspondentes a cada proteína sintetizada estão apresentados na tabela 9. As proteínas obtidas foram, em seguida, submetidas à avaliação por dot plot, onde a expressão dos epítopos etiquetas presentes no vetor de expressão utilizado (X-press e 6His) e a inserida na sequência dos GIs (FLAG) puderam ser confirmadas para todas as 16 proteínas sintetizadas. Além disso, as proteínas foram quantificadas baseando-se na expressão do 101 3,5 55,8 55,8 27,9 27,9 55,8 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 111,6 Conc Conc obtida obtida (ng/µL) > > > > > > > > > > >> >> 28 21 29 25 16 25 24 30 20 29 30 25 21 22 26 27 (kDa) de pesode Predição Predição molecular molecular de peso molecular e pesode molecular 243 193 253 219 145 221 211 261 166 286 238 192 219 264 277 (aa) Nº de de Nº aminoácidos aminoácidos 732 582 762 660 438 666 636 786 501 861 717 579 660 795 831 (bp) Nº de de Nº nucleotídeos nucleotídeos aminoácidos,predição - RIM36 /Fixação - RIM36 /Fixação H. longicornis 61 a 741 da ORF; da 741 a 61 64P/Fixação 64P - PRG/Fixação RIM36 RIM36 - PRG/fixação Loricrina/Reparo tecidual Loricrina/Reparo Ligante de IgG/Inibição de IgG de IgG/Inibição Ligante de IgG de IgG/Inibição Ligante Similaridade/Função Putativa Similaridade/Função Microplusina/Peptídeo antimicrobiano Microplusina/Peptídeo nucleotideos Imunodominante (20/24 kDa)/Desconhecida Imunodominante Metaloprotease/Remodelamento da matriz EC da matriz Metaloprotease/Remodelamento Serina protease (domínio Kunitz)/Anticoagulante protease (domínio Serina Proteína salivar secretada (domínio SCP)/Desconhecida secretada Proteína(domínio salivar Ligante de histamina/Anti-inflamatória e Anti-hemostática de histamina/Anti-inflamatória Ligante Proteína extracelular de Proteína extracelular Ligante de lipídios (domínio ML)/Inibição da sinalização via TLR via da sinalização ML)/Inibição (domínio de lipídios Ligante (conc.) obtida (conc.) Inibição da adesão plaquetária (domínio RGD-Ixodegrina)/Antihemostática (domínio da adesão plaquetária Inibição CEM C02.1: representado pelos pelos representado C02.1: CEM CEM C02.2: representado pelos nucleotídeos 693 a 1374 da ORF. da 1374 a 693 nucleotídeos pelos representado C02.2: CEM Gene de interesse CEM_F09 CEM_F12 SIGP_A07 SIGP_A12 SIGP_D08 SIGP_A03 SIGP_C03 SIGP_F11 SIGP_C06 CEM_B09 CEM_C09 Tabela 9. Relação das proteínas expressas com seu tamanho em nucleotídeos,tamanho com emexpressas seu 9. Relação das proteínas Tabela concentração SIGP_H02 CEM_G04 SIGP_G05 CEM C02.2 CEM CEM_C02.1 102 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 G2 G12 G3 G13.1 G4 G13.2 G6 G14 G7 G15 G9 G16 G10 G17 G11 G18 Figura 19. Triagem das colônias transformadas após clonagem em vetor TOPO-pENTR. Após a clonagem dos GIs em vetor de entrada (TOPO-pENTR), bactérias E. coli TOP10 foram transformadas por choque térmico com as construções plasmidiais, plaqueadas e mantidas a 37 C por aproximadamente 16 h. Em seguida, oito colônias foram selecionadas para cada GI, e o sucesso das clonagens foi confirmado por PCR, conforme mostrado para os grupos G2 a G18. A presença de bandas únicas de maior intensidade e de tamanho esperado (não mostrado) permitiu a seleção de duas colônias positivas em cada grupo que foram expandidas para a obtenção de DNA plasmidial. Posteriormente os DNAs purificados foram submetidas à reação de seqüenciamento. 103 1 2 3 4 5 6 G2 G3 G4 G6 G7 G9 G10 G11 G12 G13.1 G13.2 G14 G15 G16 G17 G18 Figura 20. Triagem de colônias transformadas após clonagem em vetor pEXP1-D. Após o sequenciamento das amostras, os DNAs plasmidiais purificados foram submetidos a reação de subclonagem com a enzima ligase e as ORFs dos GIs foram transferidas do vetor de entrada para o vetor de expressão em sistema Gateway® pEXP1-D. Em seguida, bactérias E. coli TOP10 foram transformadas por choque térmico com as construções plasmidiais, plaqueadas e mantidas a 37 C por aproximadamente 16 h. Em seguida, duas colônias foram selecionadas para cada GI, e o sucesso das clonagens foi confirmado por PCR, conforme mostrado para os grupos G2 a G16; para o G17 e G18 foram selecionadas três colônias. A presença de bandas únicas de maior intensidade e de tamanho esperado (não mostrado) permitiu a seleção de duas colônias positivas em cada grupo que foram expandidas para a obtenção de DNA plasmidial. Posteriormente os DNAs purificados foram submetidas à reação de seqüenciamento. 104 epítopo FLAG, comparativamente a uma curva de concentração conhecida (Fig. 21). Como é possível observar, todas as proteínas foram expressas com sucesso, embora para os GIs G7 e G13.2 o rendimento tenha sido bem inferior aos demais, e apresentaram as tags (epítopos etiquetas) Xpress e 6His adequadamente (dados não mostrados), garantindo a expressão da proteína na sua sequência completa. O reconhecimento do epítopo FLAG foi também utilizado para a quantificação das amostras, sendo que a maioria das proteínas foi sintetizada em concentração superior a 111,6 ng/µL (Tab. 9). 1 2 3 4 5 6 A G2 G4 G6 G7 G9 B G10 G12 G13.1 G13.2 G14 G15 G17 G18 GFP B Figura 21. Dot blot para quantificação relativa das proteínas recombinantes produzidas. Após a diluição de 1:50, 50 µL dos pontos da curva ou das reações de expressão foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose e incubadas por 1 h com tampão de bloqueio. Em seguida, as amostras foram incubadas com anticorpo primário anti-FLAG por 1 h e então com anticorpo secundário conjugado a peroxidase por mais 1 h. A curva para quantificação está representada pelos pontos 1 a 6, e correspondem, respectivamente, a 111,6, 55,8, 27,9, 13,95, 6,97 e 3,48 ng/µL de proteína (A). Os círculos representam o sinal de detecção das proteínas amplificado por quimioluminescência e transferidos para filme fotográfico (B). A quantificação das proteínas foi realizada pela comparação dos sinais obtidos pelas amostras aos pontos da curva. 105 Discussão 106 5 Discussão Embora a ideia de selecionar antígenos para o desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos venha de mais de uma década atrás, o desafio de estabelecer um controle eficaz das infestações por carrapatos Rhipicephalus (B.) microplus em bovinos através de métodos sustentáveis ainda não foi vencido. A busca por antígenos ganhou força nos últimos anos com o advento de tecnologias que auxiliam o estudo de moléculas envolvidas na interação dos carrapatos com seus hospedeiros. Estratégias genômicas e proteômicas merecem destaque atualmente nesse campo, e como tal, auxiliaram na seleção de antígenos candidatos no presente estudo. De fato, a primeira estratégia genômica adotada na seleção dos antígenos estudados foi a análise in silico do transcriptoma de glândula salivar de R. (B.) microplus, com a construção de uma biblioteca de cDNA de carrapatos alimentados em hospedeiros suscetíveis; bibliotecas de outros órgão também foram confeccionadas, entretanto os dados não serão contemplados nesse estudo. A análise do transcriptoma de glândula salivar foi ferramenta imprescindível para iniciar a seleção dos antígenos que seriam estudados, uma vez que mostrou o perfil de expressão gênica de um dos principais, se não o principal, órgãos de atividade intensamente relacionada à hematofagia. Expressed sequence tags (ESTs) de 3 bibliotecas de cDNA de glândulas salivares (fêmeas com 3-4 dias de alimentação, ninfas e machos em alimentação) do carrapato R. (B.) microplus foram analisadas. As ESTs foram automaticamente cortadas de iniciadores e seqüências do vetor, agrupadas e comparadas com banco de dados. A presença de peptídeo sinal, indicativo de secreção, foi determinada através de Signal P 3.0 Server. As buscas foram feitas nos bancos de dados NR – proteína (NCBI), GO, KOG, P-fam, SMART, rRNA (NCBI), e ACARI. As 3487 ESTs produziram 1644 contigs e vários dele foram diferencialmente expressos nos diferentes estágios do carrapato. Com esse perfilamento gênico, foi possível detectar a expressão nas glândulas salivares de diversas moléculas com funções metabólicas e outras supostamente envolvidas na alimentação e modulação da resposta imune do hospedeiro; genes que codificam proteínas com funções envolvidas na fixação e de função desconhecida também foram detectados. Três critérios analisados no transcriptoma de glândulas salivares fundamentaram a seleção de 46 Open Reading Frames (ORFs) para clonagem em vetor plasmidial e serviram de base para o estudo: o órgão alvo, a função putativa e a secreção da proteína codificada. Todas as moléculas desse estudo foram selecionadas na biblioteca de glândulas salivares de 107 fêmeas, machos e/ou ninfas parcialmente alimentadas; a função putativa dos genes foi determinada pelo alinhamento da sequência descrita na biblioteca às sequências de diversas bases de dados disponíveis e a presença de peptídeo sinal, que indica a secreção da proteína através da maquinaria celular vesicular e garante a exposição do antígeno ao hospedeiro através de sua inoculação juntamente com a saliva durante a hematofagia, foi confirmada. Esse última característica é particularmente importante no contexto de vacinas, uma vez que a exposição ao antígeno é condição necessária para o desenvolvimento de resposta imune protetora de memória (Surh e Sprent, 2008) e as vacinas anticarrapatos atualmente disponíveis no mercado são compostas por antígenos ocultos que não apresentam níveis de proteção satisfatórios. Das 46 ORFs clonadas em vetor plasmidial após a análise in silico do transcriptoma, 24 (incluindo o vetor vazio) foram selecionadas de acordo com a análise bioinformática, e em seguida produzidas e purificadas em larga escala para a etapa seguinte da seleção, que se deu com a inoculação na pele de bovinos para avaliação da capacidade de induzir reação cutânea de hipersensibilidade tardia, que é uma leitura imunológica correlacionada com a resistência a carrapatos. Os GIs foram inoculados sob a forma de DNA nu, ou seja, não ligado a nenhuma molécula facilitadora ou carreadora, na pele de bovinos previamente infestados por carrapatos R. (B.) microplus. A inoculação do DNA nu foi escolhida como a primeira estratégia para avaliar os antígenos em ensaios in vivo, devido às vantagens dessa metodologia, especialmente na vacinologia veterinária, entre as quais se destacam a simplicidade de manufatura, estabilidade, baixo custo, segurança e a facilidade no transporte (pode ser liofilizada) (Dhama et al., 2008). A possibilidade de se desenvolver uma vacina de DNA para grandes animais vem sendo largamente estudada e já foi demonstrado ser possível induzir resposta imune protetora a vírus através da inoculação de DNA vacinal em bovinos (Babiuk et al., 2003a; Babiuk et al., 2003b). O fato dos animais já terem sido expostos a carrapatos garante o contato prévio com os antígenos que posteriormente serão entregues sob a forma de DNA nu e pode revelar uma resposta protetora, de forma a auxiliar na triagem dos antígenos, ou seja, uma estratégia de imunologia reversa (Vivona et al., 2008). Essa estratégia evita a necessidade de imunizar os animais com os GIs, além do fato de ser o hospedeiro imune (e no caso desse estudo, geneticamente resistente ao carrapato) quem indica quais os antígenos estimularam as respostas observadas. Essa estratégia tem se mostrado útil em alguns estudos de seleção de antígenos alvos de Ixodes scapularis, o carrapato vetor da doença de Lyme (Valenzuela, comunicação pessoal). 108 De forma geral, a inoculação de DNA nu na pele dos bovinos teve efeito de indução de inflamação, causando recrutamento de células para o local da inoculação, que permaneceram presentes após 72 h. A presença de sinais macroscópicos e o recrutamento maior de neutrófilos e mononucleares, além de alguns granulócitos como basófilos e eosinófilos, confirmam esse achado. A relativa diminuição do número de mastócitos corrobora a ideia de um ambiente inflamatório. Entretanto, o desenvolvimento de resposta macroscópica e as populações celulares variaram de acordo com o tempo e os grupos observados e não se repetiram entre as duplicatas experimentais. Assim, as observações descritas em resposta às inoculações de DNA nu foram bastante pontuais e contribuíram apenas parcialmente na seleção dos antígenos para a etapa posterior da triagem. De forma geral, a indução de resposta cutânea é apenas um dos parâmetros avaliados dentre vários na identificação de antígenos candidatos. Atualmente, diversos trabalhos têm destacado a importância de melhorias nas estratégias de vacinação com DNA nu (Abdulhaqq e Weiner, 2008; Dhama et al., 2008). A transfecção das células locais é uma etapa imprescindível no mecanismo de ação das vacinas de DNA, com a qual as células passam a sintetizar a proteína codificada pelo gene inoculado como DNA plasmidial, que por sua vez será processada por células do sistema imune e apresentadas nos diferentes contextos de apresentação de antígenos (moléculas de MHC do tipo I e do tipo II, moléculas de MHC-não convencionais, proteínas solúveis, entre outros) aos braços celulares e humorais da resposta imune. O sucesso nessa etapa após as imunizações com DNA determina se haverá estimulação da resposta imune, que por sua vez poderá ser avaliada quanto a sua eficiência de proteção; nos ensaios de triagem realizados, culminaria no desenvolvimento da resposta cutânea tardia. Diversos fatores estão envolvidos no desempenho das transfecções e da tradução proteica, em especial ao que se referem às vias, locais e doses de inoculação utilizadas, bem como à cinética de expressão das diferentes proteínas. O uso de sistemas de entrega de DNA, como as nanopartículas, formulações, adjuvantes, entre outros, vêm sendo empregados para o aprimoramento dessa estratégia (Wack e Rappuoli, 2005). Esses resultados sugerem fortemente a necessidade da obtenção das proteínas recombinantes codificadas pelos GIs estudados para avaliação da capacidade de induzir resposta protetora. Assim, com os resultados obtidos no ensaio de inoculação de DNA nu, 15 genes foram selecionados, formando 23 grupos, e inoculados com dsRNA para avaliação através de interferência por RNA. Vale ressaltar que diferentemente ao que ocorre em mamíferos, onde as moléculas RNA entregues possuem aproximadamente 21 bp (short interference RNA, 109 siRNA) (Boutros e Ahringer, 2008), a interferência por RNA em carrapatos se dá com a entrega de fitas duplas de RNA de aproximadamente 400 bp. Entretanto, não está descartado que a clivagem dessas moléculas grandes gerem moléculas sRNA responsáveis pelo silenciamento adicional de genes não relacionados. Com o intuito de minimizar os efeitos indesejados com a inoculação das dsRNA, as moléculas desenhadas tiveram seu tamanho reduzido para aproximadamente 300 bp. Além disso, os GIs selecionados para o silenciamento gênico nesse estudo tiveram suas sequências analisadas na biblioteca de cDNA da qual se originaram, e não mostraram nenhuma similaridade importante com outras sequências descritas. Vale ressaltar que a maioria dos GIs testados foram agrupados na biblioteca com outros de função ou sequência semelhantes, o que em última análise pode significar que o efeito observado ocorra pela perda de função, mesmo que através do silenciamento de mais de uma molécula. A análise das bibliotecas mostrou uma baixa probabilidade dessa ocorrência (dados não mostrados). Além disso, procurando diminuir os efeitos indesejáveis, ferramentas interativas disponíveis em rede auxiliaram o desenho das moléculas para inoculação. Os resultados observados com a avaliação dos parâmetros biológicos e reprodutivos dos carrapatos após a interferência por RNA mostraram um prejuízo das funções avaliadas de maneira GI específica, ou seja, o silenciamento de alguns GIs não foi capaz de induzir nenhum prejuízo enquanto que outros prejudicaram consistentemente o desempenho dos ácaros; esses resultados, associados aos observados com a análise histopatológica dos carrapatos inoculados e da quantificação de transcritos de RNA para os genes estudados, corroboraram a função gene específica do silenciamento. Além disso, a inoculação das dsRNA não se mostrou letal para nenhum GIs estudados uma vez que não foi observada alteração na mortalidade dos carrapatos. Entretanto, não se pode descartar a possibilidade de o silenciamento dos GIs ter ocorrido em outros órgãos que não apenas nas glândulas salivares, uma vez que inoculados na hemocele dos carrapatos, as dsRNA podem alcançar os demais órgãos e estes não foram avaliados. Sabendo que os GIs estudados são expressos nas glândulas salivares de carrapatos adultos parcialmente alimentados (aproximadamente três a quatro dias de alimentação), é possível supor que seu silenciamento nas etapas iniciais da alimentação gere um efeito negativo no sucesso da hematofagia. Entretanto, em se tratando de um processo fundamental para estabelecimento da espécie, e apoiado pela descrição de diversas moléculas presentes na saliva de carrapatos com funções relativas à hematofagia, a idéia de que seu sucesso não está sob o controle de uma única molécula parece a mais coerente. Assim, o silenciamento de 110 genes relativos à aquisição de sangue poderiam não induzir isoladamente nenhum prejuízo detectável no desempenho dos carrapatos; por outro lado, o silenciamento simultâneo de dois ou mais GIs poderia demonstrar um efeito sinérgico entre eles durante a alimentação. Resumidamente, entre os 15 GIs diferentes testados, o silenciamento de cinco afetou significativamente a alimentação das fêmeas. Todos os grupos que tiveram o peso das fêmeas alimentadas diminuído também apresentaram diminuição no peso da massa de ovos, enquanto nenhum grupo apresentou diminuição no peso da massa de ovos sem ter apresentado diminuição no peso das fêmeas, o que poderia indicar uma correlação entre os dois parâmetros. É esperada como conseqüência da diminuição da ingestão de sangue pela fêmea uma redução da massa de ovos que produz, como de fato ocorreu nesse estudo: carrapatos que tiveram prejuízo na ingestão de sangue (com diminuição do peso ao final da alimentação) apresentaram, sem exceção, diminuição do peso da massa de ovos, sem necessariamente sofrerem prejuízos em outros parâmetros analisados. Entretanto, essa observação não é sistematicamente repetida na literatura (Almazan et al., 2010) e nenhuma menção de sua confirmação foi realizada até o momento. Se confirmada, diminuir o peso da fêmea, e por conseqüência direta ou indireta, diminuir a massa de ovos, pode indicar um método desejável de controle da população de carrapatos. Uma vez que o IER é obtido através da relação entre a massa da fêmea ao final do ingurgitamento e o peso da massa de ovos, esse estudo indicou um efeito bastante pronunciado do silenciamento gênico durante a alimentação das fêmeas nos hospedeiros suscetíveis, já que o IER se apresentou consistentemente diminuído. Segundo os resultados obtidos, se a diminuição desses parâmetros fosse proporcional, não seria esperado que ocorresse a diminuição do IER; assim, sua diminuição indica que o efeito sobre o peso das fêmeas foi maior. Além disso, o silenciamento gênico não causou redução do número de fêmeas produtoras de larvas viáveis, entretanto aumentou o tempo para eclosão das larvas e reduziu a taxa de eclosão das mesmas. O aumento do tempo para eclosão das larvas assume grande importância uma vez que expõe os ovos às condições ambientais por mais tempo, o que se observado na natureza, poderia significar uma diminuição das chances de sucesso da progênie devido à desidratação (Kurup et al., 2008) e contribuir para a diminuição a população de carrapatos. Por outro lado, embora não tenha sido observada uma correspondência direta entre os efeitos sobre os parâmetros biológicos e reprodutivos e as alterações microscópicas nos órgãos dos carrapatos parcialmente alimentados, a degeneração precoce das glândulas 111 salivares, o desarranjo da arquitetura intestinal, a deficiência na excreção de metabólitos e a má formação dos ovos podem, conjuntamente, levar ao insucesso nas infestações. A combinação de antígenos capazes de induzirem essas alterações observadas individualmente podem possivelmente produzir esse efeito. Assim, entre os parâmetros afetados pelo silenciamento dos GIs destacam-se o peso das fêmeas alimentadas, o peso das massas de ovos, a eficiência reprodutiva e a taxa de eclosão das larvas e os principais GIs responsáveis por essas alterações foram os GIs SIGP A03, SIGP F11, SIGP G05, CEM C02 e CEM F09 (Tab. 7). Entretanto, é interessante notar que em alguns casos ocorreu prejuízo dos parâmetros biológicos (como peso das fêmeas alimentadas) sem alteração dos parâmetros reprodutivos (como taxa de eclosão das larvas) e que o inverso também é verdadeiro, ou seja, parâmetros reprodutivos foram afetados pelo silenciamento mesmo na ausência de alterações nos parâmetros biológicos, indicando uma possível função dos GIs estudados também no desenvolvimento dos ovos e/ou das larvas provenientes das fêmeas inoculadas; representam essas situações o silenciamento dos GIs SIGP A03 e SIGP D08 respectivamente. Reforçam essa assertiva os resultados observados entre as fêmeas inoculadas ao final da infestação (dados não mostrados): uma vez que as fêmeas se desprenderam naturalmente do hospedeiro, o desenvolvimento dos ovos já se encontrava em estágio avançado. Entretanto, embora não estudado, o efeito do silenciamento tardio dos GIs pode ter sido transferido à progênie das fêmeas inoculadas e comprometer o desenvolvimento das larvas da próxima geração, contribuindo ainda assim para o controle da população de carrapatos. O efeito do silenciamento gênico em ovos e larvas não eclodidas pode se tornar mais uma alternativa. Embora machos inoculados com dsRNA tenham sido utilizados nesse estudo, os efeitos do silenciamento gênico exercido diretamente sobre o desempenho deles não foram alvos de investigação. Tomados em conjunto, os efeitos exercidos sobre o desempenho dos carrapatos com o silenciamento dos GIs realizado nos estágios iniciais da alimentação de adultos podem indicar a participação dessas proteínas em processos vitais dos carrapatos e, portanto, representar um antígeno mais robusto para composição da vacina. A combinação dos efeitos prejudiciais dos diferentes GIs sugere uma interessante estratégia de controle dos carrapatos, e reforça a ideia de uma vacina multicomponente. Interessantemente, conforme mostrado nesse estudo, as funções perdidas com interferência por RNA que mais afetaram o desenvolvimento das fêmeas foram de GIs 112 anteriormente descritos como mais representativos nas bibliotecas de cDNA de glândulas salivares provenientes de carrapatos machos e ninfas, e não nas de fêmeas, como seria o esperado. Entretanto, a análise realizada nesse estudo considerou o efeito do silenciamento em adultos (machos e fêmeas), uma vez que ambos foram inoculados. Isso pode indicar uma possível participação da proteína em diferentes estágios de desenvolvimento dos carrapatos e seu grau de envolvimento no estabelecimento do sucesso na hematofagia; ou ainda que os diferentes estágios de desenvolvimento apresentam moléculas semelhantes tal que o silenciamento gênico ocorra cruzado entre elas. Além disso, leva a crer que o critério de abundância de expressão em determinada(s) biblioteca(s) não deve(m) ser considerado(s) de forma decisiva sobre a seleção dos GIs a serem estudados, como já discutido anteriormente. É o conjunto de resultados provenientes de diferentes triagens que deve indicar um bom antígeno. Finalmente, vale ressaltar os efeitos observados com a inoculação do controle positivo (subolesina). Corroborando os dados disponíveis na literatura, o silenciamento desse gene afetou amplamente o desenvolvimento dos carrapatos, reduzindo todos os parâmetros analisados, inclusive o número de fêmeas produtoras de larvas viáveis. Entretanto, ainda não foram demonstrados estudos conclusivos de seu uso vacinal, embora alguns ensaios de proteção já estejam sendo realizados (Almazan et al., 2010; de la Fuente et al., 2010). As observações desses trabalhos reforçam a necessidade de ampliar os resultados da seleção de antígenos através de ensaios de genômica e genômica funcional, a fim de identificar moléculas capazes de induzir resposta imune nos hospedeiros, ou seja, avaliar a função de antígenos candidatos em ensaios in vitro e in vivo (Wack e Rappuoli, 2005). As estratégias proteômicas têm oferecido o suporte necessário para avançar na seleção de antígenos através da vacinologia reversa (Movahedi e Hampson, 2008). Paralelamente, a análise comparativa do transcriptoma de glândulas salivares de carrapatos alimentados em hospedeiros resistentes e suscetíveis mostrou que poucos GIs são diferencialmente expressos entre essas duas situações. Se modulação indicar a importância desses GIs no reconhecimento do carrapato pelo hospedeiro, pode também indicar a possibilidade desses GIs serem reconhecidos pelo sistema imune dos hospedeiros e adequados como antígenos vacinais imunologicamente ativos. Entretanto, esses dados ainda não foram confirmados e por isso não são conclusivos para a seleção dos antígenos candidatos. O 113 mesmo racional a respeito da necessidade de se estudar a imunogenicidade dos GIs selecionados através de silenciamento gênico se aplica. O uso das proteínas selecionadas em ensaios imunológicos assume importante passo na escolha dos candidatos vacinais. Para tal, a escolha de uma estratégia de síntese e purificação das proteínas dentre as diversas atualmente disponíveis é um desafio (Graslund et al., 2008). As vantagens e desvantagens de cada uma devem ser consideradas de acordo com a proteína a ser expressa, a disponibilidade de equipamentos, a semelhança com a proteína nativa exigida, a quantidade de proteína recombinante necessária, entre outros fatores. Entre elas podemos destacar os sistemas in vivo, onde são empregadas células de diferentes organismos ou sistemas in vitro (ou livre de células), os quais vêm assumindo maior importância nos últimos anos devido às dificuldades encontradas com outros sistemas de produção. Dentre os sistemas in vivo, os mais utilizados têm sido aqueles baseados em E. coli, embora o uso sistemas baseados em levedura (Pichia pastoris) e/ou células de mamíferos tem crescido nos últimos anos. Dentre os sistemas de expressão in vitro, destacam-se aqueles baseados em E. coli e em gérmen de trigo onde, ao contrário do anteriores, não são os organismos vivos/células que são utilizado(a)s mas apenas as enzimas envolvidas na tradução proteica desses organismos em condições in vitro. Por se tratar de um estudo que aborda estratégias de larga escala, o número de proteínas a serem produzidas (15) e a quantidade necessária de cada uma delas para a realização de mais uma etapa de triagem in vitro foram fatores determinantes na escolha da metodologia utilizada para a síntese das proteínas selecionadas. Assim, o método escolhido foi o sistema livre de células, conhecido como IVTT (do inglês, transcrição e tradução in vitro) que garante a produção simultânea de um grande número de proteínas em relativo curto prazo de tempo e em quantidades satisfatórias para a realização de triagens in vitro. Trabalhos anteriores mostram o sucesso dessa metodologia na seleção de antígenos candidatos (Lopez et al., 2008; Tsuboi et al., 2010a; Tsuboi et al., 2010b; Lawrence, comunicação pessoal). Como demonstrado anteriormente, apenas uma proteína (CEM G04) foi expressa em quantidades bem pequenas, o que deve impossibilitar a realização da próxima etapa de triagem com esse GI. Entretanto, como é possível observar na tabela 9, se trata de uma proteína de função similar a CEM B09, produzida com sucesso. É interessante ressaltar que a produção de proteínas de sequências diferentes, mas de funções semelhantes, foi repetida para outras situações (SIGP C03 e SIGP H02; CEM C09 e CEM F12), a fim de se garantir a obtenção das proteínas com essas funções, mas também possibilitar a comparação entre elas e confirmar os resultados obtidos com dada função. Vale 114 observar que embora o alinhamento da proteína CEM F09 mostre maior similaridade com uma proteína imunodominante de Rhipicephalus appendiculatus, essa apresenta também similaridade com as proteínas CEM C09 e CEM F12, conhecidas como RIM36. A ideia de procurar antígenos protetores que atuem conjuntamente em uma formulação vacinal vem se mostrando cada vez mais indicada para o controle da complexa relação parasito-hospedeiro estabelecida nas infestações por carrapatos. Esses antígenos podem ser provenientes de moléculas envolvidas em importantes funções durante a hematofagia, tais quais as das moléculas selecionadas para os ensaios de expressão protéica, discutidas e sumarizadas no esquema a seguir. Evidentemente, ensaios que avaliem as funções biológicas dessas proteínas e experimentos de vacinação e desafio são essenciais para caracterizar as proteínas selecionadas como imunógenos úteis para as estratégias vacinais anticarrapatos. Liberação Ativação Inibição Lipocalina (PLH) Cemento-PRGs Vasoconstrição Alérgenos Defensina Transmissão de patógenos Outras proteínas ligantes IgG Inibidor de Metaloprotease Desintegrina Sinalização IC trombina Fibrina Fbg Reparo e ? PLH: Proteína Ligante de Histamina arquitetura PRG: Proteína Rica em Glicina Trombina tecidual Fbg: Fibrinogênio IgG: imunoglobulina G IC: intracelular Adesão leucocitária Plaquetas Formação do coágulo Agregação plaquetária 115 SIGP A07 (G2) Sequência putativa de proteína salivar secretada de Ixodes scapularis (3E-030 e 3E- 034, respectivamente nas bases Pfam e ACARI), e portadora de domínio SCP (2E-020), de função ainda desconhecida. Segundo a análise da base de dados SMART pode se tratar de um potente alérgeno de veneno de vespas responsável pelo desencadeamento de resposta alérgica a picada desses insetos (King et al., 1996) ou ainda a uma proteína relacionada ao stress celular, observada em plantas em resposta a infecção por patógenos (Dixon et al., 1991). Alérgeno é o termo utilizado para descrever moléculas que possuem ao menos duas das três propriedades a seguir: 1) capacidade de sensibilizar, ou seja, induzir a produção de anticorpos de alta afinidade, especialmente da classe IgE; 2) capacidade de induzir resposta alérgica em indivíduos sensibilizados; e 3) a capacidade de se ligar a IgE, embora algumas moléculas sejam capazes de induzir resposta alérgica sem entretanto induzir sensibilização (Aalberse, 2000). Vale ressaltar a importância da estrutura terciária dessas moléculas e de alterações pós- traducionais na capacidade de indução de alergia (alergenicidade), o que foi comprovado por reatividade cruzada com antígenos de outros insetos conforme revisado por (Aalberse, 2000). Além disso, o tamanho médio predito para alérgenos de vespas é de aproximadamente 23 kDa (King et al., 1996), o que condiz com tamanho da proteína sintetizada (não confirmado). Portanto, a expressão protéica através da metodologia utilizada garantirá o estudo da capacidade de indução de resposta e do reconhecimento imune dessas moléculas essencialmente a epítopos lineares e, portanto, não com a função de alérgeno. É evidente, entretanto, que não se pode descartar o reconhecimento por moléculas de anticorpo, inclusive da classe IgE, durante a resposta imune frente a imunização, embora o reconhecimento no contexto de alergia ocorra a epítopos conformacionais. Além disso, poucas ou nenhuma característica molecular em comum é atualmente reconhecida para os alérgenos. Uma molécula com potente função de alérgeno inoculada durante as infestações naturais, pode ser reconhecida por algum braço da imunidade em animais imunizados, poderia anular o efeito do alérgeno. A imunidade contra essas moléculas poderia envolver a ativação de células da imunidade inata, da imunidade adquirida, reconhecimento humoral, entre outros. 116 SIGP A12 (G3) Embora em menor grau, essa proteína também apresenta certa similaridade com proteína salivar de Ixodes scapularis (2E-005) e também pode se tratar de um alérgeno (Horackova et al., 2010), conforme descrito anteriormente para o GI SIGP A07 e portanto, se tratar de igual interesse. Entretanto, segundo a análise do banco de dados SMART, essa proteína apresenta adicionalmente um domínio que pode representar um interessante mecanismo de modulação da resposta imune diante das infestações, o domínio ML (3E-006). Esse domínio é descrito como um domínio de ligação a lipídios (ML: do inglês, reconhecimento lipídico relativo à MD-2). Esse domínio já foi identificado em moléculas como MD-1, MD-2, GM2A, Npc2 e diversas proteínas com funções desconhecidas em plantas, animais e fungos. A formação de estruturas ricas em fitas β que exercem as diversas funções biológicas através da interação com lipídios é predita para essas moléculas. Interessantemente, esse domínio está particularmente envolvido no reconhecimento de produtos relativos a patógenos (Ishihara et al., 2004), especialmente no reconhecimento de LPS associado a TLR4. Vale lembrar que a molécula MD2 está acoplada ao receptor TLR4 e participa ativamente do reconhecimento de LPS de bactérias Gram negativas (Bjorkbacka et al., 2004). Esses resultados são reforçados pelos achados de Mollnes e colaboradores (Mollnes et al., 2008), uma vez que a inibição de moléculas do complemento associada ao bloqueio de CD14, induziram a inibição da resposta inflamatória frente à LPS. Uma molécula ligante de lipídios na lesão de alimentação pode prejudicar a ativação da resposta inflamatória local contra o carrapato. Patógenos que por ventura se encontrem nesse ambiente poderão ser favorecidos a infectarem os hospedeiros; o papel da saliva nesse contexto já foi abordado anteriormente. Mecanismos efetores da resposta imune contra o carrapato poderiam reverter a inibição da função de proteínas como essas. Além disso, de acordo com o domínio ML, essas proteínas ainda poderiam se ligar a algum tipo de receptor de reconhecimento padrão, como os TLR, e promover a modulação da sua ativação. SIGP F11 (G11) Diversas classes de moléculas já foram descritas como alérgenos, e esse GI se trata de mais um possível de ser encontrado na saliva de carrapatos. Entretanto, se trata de uma proteína ligante de histamina e por isso pode ser classificada como uma lipocalina. De forma 117 geral, membros da família das lipocalinas possuem capacidade de se ligar a moléculas hidrofóbicas pequenas, a receptores específicos expressos na membrana das células e formarem complexos com macromoléculas solúveis. A variedade de função biológica das lipocalinas seria mediada por uma ou mais dessas propriedades. Atualmente, são reconhecidas na síntese e transporte de moléculas bem como na modulação da resposta imune como proteínas carreadoras (Flower, 1996). Proteínas ligantes de histamina de carrapatos são lipocalinas diversificadas (Paesen et al., 1999). A histamina, que é um produto da descarboxilação da histidina, tem um papel importante na inflamação e alergia. É principalmente produzida por mastócitos e basófilos, e secretada em resposta especifica ou não a um antígeno ou dano tecidual. Age ligando-se especificamente em um receptor na membrana celular e medeia importante inflamação cutânea em resposta a carrapatos (Kemp e Bourne, 1980; Paesen et al., 2000). Em contrapartida, carrapatos desenvolveram moléculas com a função desse GI para sequestrarem a histamina liberada localmente no sitio de alimentação, e impedir que atinja seu alvo nas células. Outras proteínas ligantes de histamina já foram descritas em algumas espécies de carrapatos como as proteínas RaHBP1, 2 e 3 de Rhipicephalus appendiculatus, Salp25C e Salp25E de Ixodes scapularis e outras em D. reticulatus (Sangamnatdej et al., 2002) e em Amblyomma americanum (Aljamali et al., 2003), além das não tão estruturalmente relacionadas lipocalinas encontradas em carrapatos moles do gênero Ornithodoros (Cheng et al., 2010). É fácil perceber o importante papel que essas moléculas devem desempenhar durante a infestação, impedindo o desenvolvimento de uma resposta inflamatória exacerbada, prejudicial aos carrapatos. O reconhecimento dessas moléculas e a estimulação da resposta imune poderiam neutralizar essa função e prejudicar o desempenho dos ácaros. SIGP H02 (G6) e SIGP C03 (G10) Proteínas C e B ligantes de Imunoglobulina G, respectivamente. Essas proteínas foram descritas especialmente na saliva de carrapatos R. appendiculatus machos (Wang e Nuttall, 1994) e vêm sendo associadas ao auxilio exercido pelo macho na alimentação das fêmeas, uma vez que o bloqueio dessa função, seja através de imunização ou por administração de anticorpos anti-proteína ligante de imunoglobulina, leva a um prejuízo no desenvolvimento das fêmeas. A ingestão de anticorpos do hospedeiro ocorre durante a ingestão de sangue, onde inevitavelmente carrapatos ingerem imunoglobulinas presentes no soro. Mais ainda, a 118 infestação pode induzir a produção de anticorpos específicos contra proteínas dos carrapatos e esses anticorpos reconhecem moléculas de diversos tecidos dos carrapatos, tais como intestinos e glândulas salivares, ligando-se especificamente a elas após a alimentação (Alarcon-Chaidez et al., 2006; Wang e Nuttall, 1994). Isso nos indica a importância de neutralizar a resposta humoral do hospedeiro, impedindo que essas moléculas alcancem seus alvos teciduais e prejudiquem o desenvolvimento dos carrapatos. Evolutivamente, a síntese e liberação de moléculas capazes de se ligar e impedir a função das imunoglobulinas presentes no soro dos hospedeiros pode ter se tornado essencial para o sucesso da relação dessas espécies. De fato, o número de transcritos encontrados nas bibliotecas de cDNA de glândulas salivares de carrapatos R. (B.) microplus que codificam proteínas ligantes de imunoglobulinas, especialmente do tipo G, reforça essa ideia. Já há indícios de que impedir a aplicação desse mecanismo de escape no microambiente cutâneo em resposta a infestação prejudica o desenvolvimento dos carrapatos, especialmente de fêmeas. É interessante notar que os efeitos observados pelo silenciamento gênico dessa função causou pequeno efeito significativo no desenvolvimento das fêmeas, o que apoia a ideia da relação simbiótica entre machos e fêmeas durante a infestação. SIGP D08 (G4) Proteína cuja função putativa de serina protease com a presença de domínio Kunitz com alto grau de confiança (4E-020) que em carrapatos esta relacionada à inibição de trombina (1E-031), e portanto com possível função inibidora da via extrínseca da coagulação. De fato, diversas moléculas com propriedades inibidoras de trombina já foram descritas para diversas espécies de carrapatos, entre elas BmGTI de intestinos, BmAP (Horn et al., 2000), microfilina (Ciprandi et al., 2006) e boofilina (Macedo-Ribeiro et al., 2008) salivares de carrapatos R. (B.) microplus, variegina de Amblyomma variegatum (Koh et al., 2007), hemalina (Liao et al., 2009) e HLS2 (Imamura et al., 2005) de Haemaphisalys longicornis, amblina de Amblyomma hebraeum (Lai et al., 2004) e Ixolaris, Iris e Pentalaris de Ixodes scapularis (Francischetti et al., 2004; Francischetti et al., 2002; Nazareth et al., 2006) carrapatos do gênero Ornithodoros também apresentam moléculas de função semelhante. Além disso, o efeito dessas moléculas, conhecidas como serpinas (do inglês, serine protease inhibitors) vêm sendo largamente estudadas (Francischetti, 2010; Prevot et al., 2006; Prevot et al., 2009) e seu uso no controle de carrapatos sugerido por alguns autores (Corral- 119 Rodriguez et al., 2009; Mulenga et al., 2001). Dada a importância da aquisição de sangue na biologia dos carrapatos fica fácil sugerir o motivo pelo qual essas moléculas estariam envolvidas na modulação da resposta homeostática do hospedeiro. É válido lembrar que carrapatos não canulam pequenos vasos na pele para realizar a ingestão de sangue; eles promovem a formação de uma cavidade alimentar após o rompimento das estruturas da derme de onde o sangue será adquirido (Ribeiro, 1995b). Claro que a inibição da coagulação do sangue nessa etapa e durante o processo de digestão pelas células intestinais se faz de suma importância. Assim, a utilização da molécula (SIGP D08) isolada da biblioteca de cDNA em ensaios de imunização se mostra bastante interessante mesmo com os resultados observados com os ensaios de interferência por RNA. A vasta lista de moléculas com essa função que já foram identificadas em carrapatos sugere o envolvimento de diversas moléculas com funções redundantes no sítio de infestação e a perda da função de apenas uma delas não necessariamente acarretaria em prejuízos no desempenho dos carrapatos. Adicionalmente, o tamanho predito para a proteína expressa pelo sistema utilizado nesse estudo condiz com proteínas descritas com essa atividade (<30kDa), entretanto ensaios funcionais precisam ser realizados para confirmação de sua atividade. Mais recentemente, essas moléculas têm sido consideradas agentes anti-inflamatórios e mediadores da resposta imune dos hospedeiros (Francischetti, 2010; Prevot et al., 2006), paralelo ao seu efeito anti-hemostático, o que suporta a investigação das mesmas como antígenos candidatos. SIGP C06 (G15) Molécula com domínio RGD (sequência dos três aminoácidos Arginina – Glicina – Asparagina) que confere a habilidade de se ligar seletivamente a integrinas, semelhante a ixodegrina de I. scapaularis. Conforme descrito anteriormente, integrinas são particularmente importantes na interação entre plaquetas durante a agregação em reposta a uma lesão vascular e na interação célula matriz durante os estágios de migração leucocitária nos sítios inflamatórios. Adicionalmente, a adesão celular mediada por integrinas leva a ativação de vias de sinalização envolvidas em importantes funções celulares tais como, crescimento, diferenciação, progressão, expressão gênica, motilidade e apoptose (Barja-Fidalgo et al., 2005). Atualmente, dois tipos de sinalização a partir das integrinas são aceitos: a transmissão de sinais intracelulares após a ligação de um ligante no receptor de integrinas (sinal de fora para dentro da célula) e a regulação da avidez através da conformação das integrinas gerada 120 por sinais provenientes do interior das células (sinais de dentro para fora das células). Com isso, é possível imaginar a quantidade de mecanismos de modulação que ligantes de integrinas podem se envolver no ambiente de alimentação dos carrapatos: uma vez que células são guiadas para o sítio de inflamação e há a apresentação de antígeno com ativação da resposta imune, integrinas seriam capazes de participar das fases de iniciação, manutenção ou terminação das respostas imunes inata e adquirida. Anular esse efeito pode transformar o sítio de alimentação favorecendo a formação do trombo pela agregação plaquetária e a ativação leucocitária com indução de resposta inflamatória prejudicial ao desenvolvimento dos carrapatos. Segundo (Barja-Fidalgo et al., 2005) as desintegrinas pertencem a uma família de proteínas de baixo peso molecular, comumente rica em glicina, que apresentam o domínio RGD, presente em muitas proteínas adesivas da matriz extracelular e de proteínas de superfície celular. Tem a habilidade de inibir as funções das integrinas em diferentes sistemas celulares e sua estrutura terciária parece estar envolvida em seu mecanismo de ação. A maioria das desintegrinas identificadas até o momento são potentes inibidores da agregação plaquetária, atuando como inibidor competitivo na interação entre o fibrinogênio e a integrina αIIbβ3 após a ativação de plaquetas induzida por ADP (Niewiarowski et al., 1994); adicionalmente, podem estar envolvidas na inibição da adesão celular tumoral durante a metástase (Trikha et al., 1994). Ligantes de integrinas α5β1 e αVβ3 têm se mostrado inibidores da adesão celular à matriz extracelular (Juliano et al., 1996), da angiogênese (Sheu et al., 1997) e indutores de apoptose de células endoteliais (Yeh et al., 1998a; Yeh et al., 1998b). Mais recentemente foi demonstrado que desintegrinas podem induzir a ativação de vias de sinalização que participam da proliferação de células endoteliais (Cominetti et al., 2004). Entretanto, vale ressaltar que a ativação induzida por integrinas depende do tipo celular e do microambiente envolvido. O rendimento da reação de expressão protéica desse GI apresentou-se bem abaixo do obtido com as demais. Seu uso dependerá de outras estratégias de expressão protéica, bem como o escalonamento dessas técnicas para obtenção de maiores quantidades da proteína, o que de certo modo, facilitará também o estudo dos demais GIs. 121 SIGP A03 (G9) Metaloproteases são responsáveis pela degradação e turn over de proteínas de tecido conectivo. Na verdade, essas moléculas foram inicialmente identificadas através de suas funções sobre as proteínas desse tecido e desde então todas as proteínas que foram descritas com função de metaloprotease são capazes de degradar componentes da matriz extracelular (Parks et al., 2004). Consequentemente, as metaloproteases são referidas como uma família de enzimas responsáveis pelo turn over, degradação, catabolismo e destruição de matriz extracelular, embora a maioria dos achados tenham sido observados in vitro. Estudos mais recentes utilizando modelos in vivo têm indicado que as metaloproteases exercem esse mesmo efeito nos tecidos. O conceito de que diferentes sub-populações celulares estão envolvidas nas diversas respostas promovendo a angiogênese, remodelamento e fagocitose nos tecidos, sugere um possível espectro de ação dessas moléculas. Provavelmente elas dependerão dos tipos e localização celulares e portanto apresentar mais de uma função ativa, uma vez que interagem com mais de um substrato. Os potenciais substratos incluem todas as proteínas de membrana, secretadas e do espaço extracelular que atualmente também estão sendo identificadas por estratégias proteômicas e modelos de manipulação gênica. Conforme revisado por (Parks et al., 2004), evidências de sua ação sobre proteínas não pertencentes à matriz extracelular já foram encontradas. Os aspectos discutidos já poderiam indicar essa molécula como um interessante alvo de estudo no controle de carrapatos. De fato, algumas metaloproteases vem sendo identificadas, clonadas, produzidas e algumas até testadas em ensaios de vacinação contra carrapatos (Decrem et al., 2008a; Decrem et al., 2008b; Francischetti et al., 2004; Imamura et al., 2009) de diferentes espécies, entre elas, I. ricinus, I. scapularis, Haemaphisalis longicornis e R. (B.) microplus. Adicionalmente, sob o ponto de vista dos resultados desse estudo, esse GI foi capaz de induzir resposta em todas as triagens realizadas, se mostrando uma molécula de destaque entre as estudadas, embora tenha sido mais abundantemente identificada no transcriptoma de glândulas salivares de carrapatos machos. SIGP G05 / G12 Considerando o importante papel dos artrópodes hematófagos como vetores de diversas doenças para animais domésticos e o homem, e da relação co-evolutiva que se 122 desenvolveu entre eles e os patógenos que transmitem, peptídeos antimicrobianos assumem grande destaque no estabelecimento do sucesso nas relações entre carrapatos, hospedeiros e alguns microorganismos. Defensinas são geralmente moléculas pequenas, carregadas positivamente que interagem com as cargas negativas presentes nos envelopes celulares e nos fosfolipídios de membrana de micro-organismos. Carrapatos são capazes de reconhecer patógenos através de moléculas como LPS, peptidoglicanas ou glicanas presentes na superfície de patógenos. O reconhecimento e a reação frente a esses estímulos são exercidos por vias celulares e humorais da imunidade. A via celular é representada pelos hemócitos que retiram os produtos de patógenos na hemolinfa através de fagocitose, nodulação e encapsulamento (Ceraul et al., 2007). Hemócitos são bastante eficientes na síntese de muitos peptídeos antimicrobianos que são liberados nos fluidos e tecidos de carrapatos. A resposta humoral trabalha em conjunto, promovendo o encapsulamento, aglutinação e a própria síntese de potentes moléculas com ação antimicrobiana durante ou após a alimentação. Entretanto é importante lembrar que estão incluídas entre as menores moléculas estudadas e que podem oferecer outros tipos de desafios na indução da resposta imune. De fato, diversas moléculas com função de defensinas já foram descritas para diferentes espécies de carrapatos. Lisozimas são moléculas antimicrobianas importantes para a lise de bactérias (Qasba e Kumar, 1997) e já foram descritas em Ornithodoros moubata durante a ingestão de sangue (Grunclova et al., 2003) e D. variabilis após a inoculação de Borrelia burgdorferi na hemocele (Johns et al., 2000). Cistatinas são outro grande grupo de proteínas antimicrobianas presentes em várias espécies vegetais e animais que têm sido demonstrada durante a resposta imune inata de carrapatos através de sua função de cisteína- proteases. Genes que codificam cistatinas estão expressos em O. moubata, H. longicornis e R.(B.) microplus (Grunclova et al., 2006; Lima et al., 2006; Zhou et al., 2006b). A ingestão de sangue e a inoculação de LPS também induzem um aumento na expressão de cistatinas em H. longicornis. Adicionalmente, foi demonstrado o papel das cistatinas na inibição do crescimento de Babesia bovis in vitro (Zhou et al., 2006b). A caracterização de outras defensinas identificadas entre várias espécies de carrapatos também, incluindo I. scapularis, A. americanum, D. variabilis, R. microplus e H. longicornis (Ceraul et al., 2007; Fogaça et al., 2006; Fogaça et al., 2004; Hynes et al., 2005; Pichu et al., 2009; Todd et al., 2007), entre outros. Mais de uma isoforma de defensina foi encontrada em carrapatos O. moubata, I. ricinus, A. hebraeum e H. longicornis (Lai et al., 2004; Nakajima et 123 al., 2003; Rudenko et al., 2005; Rudenko et al., 2007; Zhou et al., 2007). Interessantemente, essas moléculas podem estar envolvidas em outras funções importantes durante e após o período de alimentação nos hospedeiros, de acordo com os prejuízos observados nos ensaios de perda de função. Associar o controle das infestações por carrapatos ao controle de patógenos transmitidos por eles é uma estratégia bastante inovadora do ponto de vista biotecnológico e interessante para o uso em criação animal. É razoável considerar a ocorrência de um efeito sinérgico especialmente entre as três últimas proteínas discutidas no sítio de alimentação de carrapatos; se conjuntamente anulados pela resposta imune do hospedeiro induzida por imunização podem resultar em um importante prejuízo para os parasitas. Ensaios que confirmem essa hipótese são igualmente necessários. CEM C02/ G13 Loricrina são proteínas ricas em glicina (PRG), identificadas em humanos em 1990 por Mehrel e colaboradores, e desde então vêm sendo relacionada como uma proteína de envelope, envolvida na cornificação do epitélio cutâneo. Já foi demonstrado que ocorre a deposição gradativa de loricrina ao redor das membranas celulares à medida que se aproxima das camadas mais externas da pele e contribui como barreira protetora sobre a epiderme (Candi et al., 2005). Em carrapatos, essa proteína ainda não foi descrita, embora encontrada no transcriptoma utilizado nesse estudo (2E-028). Nesses ácaros, esse GI pode estar relacionado com a síntese de moléculas elásticas envolvidas na fixação ao hospedeiro. CEM F09 (G14) Proteína similar a proteína imunodominante de 20 a 24 kDa de R. appendiculatus (7E- 061), rica em glicina, encontrada abundantemente no transcriptoma de glândulas salivares de machos e ninfas. Embora de função desconhecida, essa molécula também foi capaz de induzir resposta em todas as triagens realizadas e foi satisfatoriamente produzida in vitro. Isso a coloca entre os GIs mais importantes identificados nesse trabalho, conforme mostrado na Tabela 7. Adicionalmente, essa proteína também se assemelha com a proteína RIM36 descrita como proteína do cemento de carrapatos, que serão abordadas a seguir. 124 CEM C09 (G17) e CEM F12 (G18) Esse GI codifica uma proteína semelhante a RIM 36, de aproximadamente 36 kDa, descrita em R. appendiculatus (Bishop et al., 2002). Uma das categorias de proteínas secretadas na saliva de carrapatos são as proteínas de cemento que permitem carrapatos permanecerem fixos em seus hospedeiros durante o prolongado período de ingestão de sangue além de prevenirem o contato das peças bucais dos carrapatos com moléculas da resposta imune do hospedeiro (revisado por Binnington e Kemp, 1980). O cone de cemento de carrapatos é formado por camadas de dois tipos principais de proteínas: as primeiras são produzidas logo após a fixação dos mesmos e rapidamente formam uma estrutura central rígida e o segundo tipo, produzidas por volta de 24 h de fixação, formam estruturas relativamente flexíveis ao redor da estrutura primária. A produção de cemento tipicamente ocorre entre o terceiro e quarto dias de infestação, é primariamente constituído de proteínas embora contenha alguns carboidratos e lipídios (Bishop et al., 2002). Proteínas do cone de cemento representam candidatos vacinais uma vez que são essenciais para a fixação e alimentação dos carrapatos. Certo grau de resistência foi induzido em animais experimentais com a imunização com proteínas dessa categoria (Brown e Askenase, 1986; Shapiro et al., 1989); a forma recombinante de uma proteína de cemento de H. longicornis, foi capaz de induzir a síntese de anticorpos por coelhos, com mortalidade dos carrapatos ninfas e larvas alimentados nesses hospedeiros (Mulenga et al., 1999). Essas proteínas apresentam repetições de resíduos de glicina e lisina (repetições GL), segundo Harnnoi e colaboradores (Harnnoi et al., 2006a; Harnnoi et al., 2006b). CEM B09 (G16) e CEM G04 (G7) Da mesma forma que descrito para os dois GIs similares a proteína RIM36, esses GIs codificam uma proteína do cone cemento, a proteína 64P, entretanto não apresentam similaridade importante de sequência quando comparadas às RIM36 (alinhamento não mostrado). Alguns estudos vem sendo conduzidos na tentativa de utilizar essas proteínas como antígenos vacinais, embora nenhum resultado conclusivo sobre proteção e seu uso em formulações vacinais tenha sido indicado até o momento (de la Fuente et al., 2007; Havlikova et al., 2009). Devido ao alto grau de similaridade interessantemente esses antígenos poderiam 125 representar antígenos de reconhecimento cruzado entre diferentes espécies de carrapatos e ser antígeno comum nas formulações vacinais. Embora as funções descritas para as proteínas similares se concentram na fixação dos carrapatos em seus hospedeiros, os efeitos observados com o silenciamento gênico podem indicar a participação dessas moléculas em processos ainda não demonstrados. Além disso, os ensaios imunológicos que avaliem a ativação e proliferação celular e o reconhecimento humoral frente aos antígenos avançarão na seleção de moléculas efetivamente imunogênicas, alvos da resposta imune durante as infestações. Em conclusão, a julgar pela importância das funções de algumas proteínas em garantir o ambiente imunomodulador que a saliva promove no sítio de alimentação, as proteínas descritas foram selecionadas para serem avaliadas em ensaios imunológicos, de ativação celular, indução de proliferação e produção de citocinas, bem como o reconhecimento por anticorpos de animais previamente infestados. Esses ensaios serão de fundamental importância para indicar a imunogenicidade das proteínas selecionadas, ou seja, indicá-las como um antígeno eficiente (um imunógeno) e contribuir para o desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos. Associado à descoberta de antígenos úteis, formulações adequadas e testes de proteção frente a desafio realizados a campo devem ser considerados no desenvolvimento de uma vacina. Atualmente, a administração de um coquetel de antígenos, ou uma vacina multicomponente, vem sendo cada vez mais aceita como a indicada para o controle da interação entre carrapatos e seus hospedeiros, o que torna a identificação de novos antígenos candidatos extremamente importante. Adicionalmente, as vacinas podem contemplar antígenos envolvidos na transmissão de patógenos e bloquear mecanismos essenciais para a transmissão. Finalmente, é importante ressaltar que diversas moléculas com propriedades farmacológicas presentes na saliva de carrapatos e descritas no transcriptoma de R. (B.) microplus que deu origem a esse estudo não foram incluídas na seleção descrita, o que não significa não se tratarem de interessantes GIs a serem estudados no futuro. Essas moléculas sem dúvida podem ser incluídas no desenvolvimento de imunobiológicos para o controle de carrapatos, patógenos transmitidos por eles e ainda para outros parasitas, além de contribuir para a descrição de novos fármacos possivelmente utilizados na medicina e farmacologia. Evidentemente, que outras estratégias proteômicas atualmente disponíveis para o estudo molecular de proteínas identificadas na saliva de artrópodes parasitas hematófagos que ainda 126 não foram incorporadas ao estudo das proteínas selecionadas nesse trabalho também serão de grande utilidade no avanço da identificação dos antígenos vacinais. 127 Conclusões 128 6 Conclusões 6.1 A inoculação de DNA nu na pele de bovinos não induziu de forma consistente reações cutâneas tardias e por isso auxiliou apenas parcialmente a seleção de genes de interesse; 6.2 Parâmetros como a freqüência da expressão nas bibliotecas de cDNA de glândulas salivares de diferentes estágios de desenvolvimento bem como alimentados em diferentes hospedeiros serviram para auxiliar a seleção de genes de interesse que seriam estudados em etapas posteriores; 6.3 O silenciamento por meio de interferência por RNA de 10 entre 15 dos genes selecionados mostrou que os critérios bioinformáticos empregados na seleção foram corretos. Os 5 genes de interesse que não foram silenciados por meio de iRNA podem ser específicos de estágios iniciais do desenvolvimento, uma vez que foram expressos apenas em transcriptomas de GSs de ninfas; 6.4 O silenciamento gênico através mostrou ser eficiente na seleção de genes que desempenham funções importantes durante o desenvolvimento de carrapatos adultos e mostrou 5 GIs especialmente capazes de interferir negativamente no desempenho das fêmeas silenciadas ou das larvas provenientes delas (SIGP_A03, SIGP_F11, SIGP_G05, CEM_C02 E CEM_F09); 6.5 A expressão de proteínas recombinantes foi realizada com sucesso e permitiu que 14 GIs selecionados como candidatos vacinais fossem sintetizados para utilização em ensaios imunológicos de avaliação do reconhecimento e indução da resposta imune in vitro e in vivo. 6.6 O emprego de estratégias genômica e proteômica na seleção de antígenos candidatos se mostrou eficiente e pode, dessa forma, contribuir para o desenvolvimento de uma vacina anticarrapatos. 129 Referências Bibliográficas 130 7 Referências Bibliográficas4 7 Referências Bibliográficas5 Aalberse, R.C. 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