Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Biológia Doktori Iskola Kísérletes Növénybiológia Doktori Program

TAUBER TAMÁS

SZENNYVÍZISZAP -ROTHASZTÓ MIKROBA- KÖZÖSSÉGEK VIZSGÁLATÁNAK OPTIMALI- ZÁLÁSA

doktori értekezés

Témavezet ı:

DR. TÓTH ERIKA egyetemi adjunktus (ELTE Biológiai Intézet Mikrobiológiai Tanszék)

A Biológia Doktori Iskola vezet ıje: A Kísérletes Növénybiológia doktori prog- ram vezet ıje:

PROF . DR. ERDEI ANNA PROF . DR. SZIGETI ZOLTÁN tanszékvezet ı egyetemi tanár tanszékvezet ı egyetemi tanár (ELTE Immunológiai Tanszék) (ELTE Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék)

Készült az ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszékén Budapest 2013

1 KÖSZÖNETMONDÁS Doktori dolgozatom megírásának végeztével köszönettel tartozom mindenek el ıtt téma- vezetımnek, Dr. Tóth Erikának , akinek az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén eltöltött tíz évem során mindvégig számíthattam id ıt és er ıt nem kímél ı segítségére, olyankor is, ami- kor mindkett ıbıl kevés volt neki. Nem kevésbé tartozom köszönettel szüleimnek , akik mindig feltétel nélkül támogattak, nem csak az utóbbi, doktori munkával eljegyzett éveimben, hanem születésemt ıl kezdve mindig mindenben. Köszönetet mondok továbbá Dr. Márialigeti Károlynak , az ELTE Biológiai Intézet Mikrobiológiai Tanszéke vezet ıjének, hogy lehet ıvé tette doktori munkám elvégzését tan- székén, ahol egy inspiráló tudományos közösség tagja lehettem. Köszönöm Dr. Erdei Annának és Dr. Szigeti Zoltánnak , hogy lehet ıvé tették szá- momra a Kísérletes Növénybiológia doktori programban való részvételt. Hálás vagyok a diplomamunkájukat az én szárnyaim alatt végz ı hallgatóknak a sok pó- tolhatatlan segítségért és élményért. İk Pechál Nikolett , Czigler András és Wirth Balázs . Köszönöm a Mikrobiológiai Tanszék minden egykori és jelenlegi munkatársának , akiket megismertem az évek során, hogy kedves segítıkészségükre mindig számíthattam, és hogy egy jó hangulatú, emberileg is épít ı közösségbe tartozhattam velük. Közülük is ki- emelném a velem egészen vagy közel „egyívású” munkatársaimat, Vajna Balázst , Felföldi Tamást , Palatinszky Mártont , Homonnay Zalánt , Pór Tamást , Táncsics Andrást , Póhner Zsuzsát , Hajdu Kingát (huh), Bohus Veronikát , Kéki Zsuzsit és azokat, akikkel – a tanszéken, vagy csak annak környékén – különösen szoros és értékes munkakapcsolat- ban dolgozhattam együtt: Berta Brigittát és Szabó Zsoltot . Különösen is szívesen gondo- lok azokra az id ıkre, amikor egy tanszéken dolgoztunk Cech Gáborral , Vladár Péterrel , Török Györggyel . Köszönet illeti rajtuk kívül a legkülönfélébb területeken és formában nyújtott fontos se- gítségekért Simka Ágnest , Balogh Lajosné Anikót , Tóth Margitot , Romsics Csabát , Nagymáté Zsuzsát , Sipos Ritát , Révész Sárát , Nikolausz Marcellt , Kovács Józsefet , Barkács Katalint , Kıhler Artúrt , Pestovics Ágit , Oporné Fodor Máriát . Legvégül pedig köszönöm minden valahai nevel ımnek és oktatómnak, akik az évek so- rán nagyban hozzájárultak mindahhoz, ami lettem. Közülük is kiemelend ı Hajdú Judit , dr. Fóti János , Janzsó Márton , Dr. Balázs Istvánné , Dr. Tóth Béláné , Molnár-Fritsch László , Hiszékeny Ildikó , Dr. Rékási József, Pintér Ambrus OSB , Vásárhelyi Anzelm OSB , Varga Mátyás OSB . Köszönet mindnyájuknak!

2

TARTALOM

TARTALOM...... 1 I. BEVEZETÉS ...... 3 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ...... 6 II. 1. A metanogenezis megismerésének rövid története...... 6 II. 2. A biogáztermeltetés rövid története ...... 7 II. 3. Szerves anyagok anaerob lebontásának metanogén útja...... 8 II. 4. A metántermelést végz ı baktériumközösségek tagjai ...... 17 II. 5. A Biogáztermelés a gyakorlatban ...... 23 II. 6. A biogáztermel ı közösségek mikrobiológiai vizsgálómódszerei...... 28 II. 6. 1. A módszercsoportok általános és történeti áttekintése ...... 28 II. 6. 2. Kemotaxonómia a közösségvizsgálatokban...... 33 II. 7. Kis hozamú gázforrások termelésének volumetriás mérése a szakirodalomban 41 II. 8. Módszerfejlesztésünk el ızményei ...... 43 III. CÉLKIT ŐZÉS ...... 45 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER ...... 46 IV. A. Új módszer kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére...... 46 IV. A. 1. A módszer és az eszközök leírása...... 46 IV. A. 2. A "buborékoltató" eszköz ...... 46 IV. A. 3. Buborékszámlálás szoftver segítségével...... 47 IV. A. 4. A módszer validációjának és további tesztelésének eszközei ...... 51 IV. B. Biogáztermel ı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata...... 53 IV. B. 1. A vizsgált reaktorok...... 53 IV. B. 2. Az elvégzett kísérletek és a mintavételezések ...... 55 IV. B. 3. Az alkalmazott módszerek rövid áttekintése ...... 57 IV. B. 4. A lipidek preparálása ...... 57 IV. B. 5. A respiratorikus kinonok analízise...... 59 IV. B. 6. A foszfolipid-zsírsavak származékoltatása és analízise...... 61 IV. B. 7. DNS-izolálás a mintákból...... 62 IV. B. 8. A vizsgált génszakaszok felszaporítása PCR-rel ...... 62 IV. B. 9. Klónkönyvtárak létrehozása...... 63 IV. B. 10. A klónok csoportosítása Amplifikált Riboszomális DNS Restrikciós Analízis (ARDRA) segítségével...... 64 IV. B. 11. T-RFLP analízis...... 64 IV. B. 12. DGGE ...... 65 IV. B. 13. Sávok kivágása a DGGE gélb ıl és újbóli felszaporításuk...... 66 IV. B. 14. Bázissorrend-meghatározás ...... 66 IV. B. 15. Az adatok kiértékelése ...... 67 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ...... 69 V. A. Új metódus kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére...... 69 V. A. 1. A módszertesztelés eredményei...... 69 V. A. 1. 1. Az eszköz kalibrálása ismert standard gázforrás ellenében ...... 69 V. A. 1. 2. Tesztelés bioreaktorokon ...... 69 V. A. 2. A módszertan és a módszertesztelési eredmények értékelése ...... 73 V. A. 2. 1. Módszerünk el ınyei és korlátai ...... 73 V. A. 2. 2. A teszteredmények értékelése...... 75

1

V. A. 2. 3. A módszerfejlesztés lehet ıségei ...... 77 V. B. Biogáztermel ı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata ...... 78 V. B. 1. Mezofil és termofil félüzemi rothasztók mikrobiótájának vizsgálata ...... 78 V. B. 1. 1. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények...... 78 V. B. 1. 2. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények értékelése... 81 V. B. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgálata laboratóriumi modell-rendszerben...... 83 V. B. 2. 1. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának eredményei...... 83 V. B. 2. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának értékelése...... 88 V. B. 3. Mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtés mikrobiológiai hatásának vizsgálata félüzemi reaktorokon, s a markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása ...... 91 V. B. 3. 1. Mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtés eredményei...... 91 V. B. 3. 2. A mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtéses kísérlet értékelése ...... 105 V. B. 3. 3. A markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása 110 VI. ÖSSZEFOGLALÁS ...... 132 VII. SUMMARY ...... 134 VIII. IRODALOMJEGYZÉK...... 136 FÜGGELÉK ...... I-VII

2 I. BEVEZETÉS

I. BEVEZETÉS A metántartalmú biogáz termeltetése az egyik legszerencsésebb találkozása tudomány- nak, technológiának és sürg ıs megoldáskeresésünknek a fogyasztói társadalmak keltette környezeti krízissel kapcsolatban, mely utóbbi vitathatatlanul korunk egyik legéget ıbb problémája. A hulladékból energiát és biztonságos talajjavító adalékot el ıállító folyamat hátterében baktériumok összetett közösségeinek fáradhatatlan munkája áll, így nyilvánvaló, hogy e mikrobiális folyamatok tanulmányozása a biogáztermel ı rendszerek hatásfok- növelésének és javuló kiszámíthatóságának ígéretét hordozza. Az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén folyó mikrobiális ökológiai munkák részeként 2005-ben megkezd ıdött a szennyvíziszap-rothasztás mikrobiológiájának kutatása, melynek kezdetekt ıl részese lehet- tem, s az ebben végzett munkáim alkotják jelen értekezésem tárgyát. A mikrobiális ökológia alapkérdései egyszer őek: mely szervezetek alkotják a vizsgált közösséget, milyen mennyiségben vannak jelen, mi a szerepük az adott ökoszisztémában, illetve milyen kölcsönhatásban állnak egymással és élettelen környezetükkel. A válaszkere- sés gyakorlati síkján azonban már számottev ı bonyodalmakkal kell szembenéznie a kutató- nak. Nem csak gyakorlati szinten nehéz megközelíteni, elkülöníteni, láthatóvá tenni a t ı- lünk oly távoli mérettartományokban létez ı apró szervezeteket, hanem az elvi megközelítés számára is hiányoznak az egyértelm ő és könnyen kezelhet ı határozóbélyegek, csakúgy mint az abundanciát, élettani állapotot, metabolikus kapacitást, kölcsönhatásrendszerbéli pozíciót egyértelm ően tükröz ı karakterek. Külön-külön ugyan mindegyikre vannak kidol- gozott vizsgálati módszereink, így a taxonómiai hovatartozásra a megfelel ı kronométer- gének (leginkább a 16S rRNS-gén) szekvenciái, abundanciaviszonyokra a kemotaxonómiai markermolekulák, élettani karakterek felvételére a legkülönfélébb élettani-biokémiai tesztek vagy aktivitás-vizsgálatra a funkciógének hírviv ı RNS-einek kimutatása. Amikor azonban egy – bakteriális méretek viszonylatában – tengernyi anyagi massza (értsd: mikrobiológiai minta) heterogén és komplex rendszerében kívánunk tájékozódni ezek segítségével, ered- ményeink értelmes összképpé illesztése sokszor igen komoly kihívást jelent. Ennek oka egyrészt a mikrokörnyezetek létéb ıl fakadó kiküszöbölhetetlen mintázási hibákban, a komplexitás különböz ı módszerek nyújtotta vetületeinek eleve nehéz összeilleszthet ıségé- ben, valamint a láthatóvá tételi procedúrák (preparálás, tisztítás, tenyésztés, molekula- amplifikáció, mérés stb.) során adódó százféle hibalehet ıségben sejthet ı. Mindennek elle- nére a környezetmikrobiológus nekigyürk ızik a munkának, és a módszertani korlátok tisz- tességes figyelembevételével igyekszik megválaszolni a felmerül ı kérdéseket. A válaszke- resésben mindenképpen érdemes egyszerre több módszer információira támaszkodnia, még akkor is, ha néha úgy jár, mint az, akinek több óra van a kezén, ezért nem tudhatja ponto-

3 I. BEVEZETÉS san, mennyi az id ı. Mivel minden óra pontatlan valamelyest, hosszú távon így jobban jár, mintha feltétel nélkül ráhagyatkozna valamelyikre. Fontos és elfogadott törekvés tehát a különféle vizsgálati módszerek egyidej ő használata. A mikrobaközösségekr ıl való információszerzés leghatékonyabbnak számító eszközei kétségtelenül a nukleinsav-alapú vizsgálati módszerek, így miként a világban, úgy az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén is ezek a módszerek képezik a tudományos közösségelemzés húzóágát. Régóta és folyamatosan jelen vannak ugyanakkor a klasszikus mikrobiológiai és a közösség-kemotaxonómiai megközelítések is a tanszéki munkában. Kutatócsoportunk tevékenységében ez utóbbiak kapnak hangsúlyt, magam pedig els ısorban a kemotaxonómia alkalmazásával foglalkoztam diplomamunkám során, majd a kés ıbbi kutatásokban, így doktori munkám során is. Doktori munkám jellegét ezzel összefüggésben mindvégig meghatározta egy, a munka indulásakor kényszer ően kötött (de kés ıbb sosem bánt) kompromisszum. Berta Brigitta doktorandusztársammal az ELTE Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpontjának zászlaja alatt kezdtük munkánkat a F ıvárosi Csatornázási M ővekkel kötött együttm őködési szerzıdés keretében, a Dél-pesti Szennyvíztisztító Telep iszaprothasztóinak mikrobiológiai vizsgálatával. Brigitta feladata a biogázreaktorokra rátáplált járulékos szubsztrátok biológiai el ıkezelésének mikrobiális nyomon követése lett volna, míg az enyém az ezt követ ı rot- hasztási folyamaté. A biológiai el ıkezelési munkálatok azonban nem indultak el (nem való- sultak meg azóta sem), így a diplomamunkáink tematikájából adódó irányvonalaknak meg- felel ıen felosztva kezdtük meg az eredetileg egy téma feldolgozását: ı a DNS-munkákat, én pedig a kemotaxonómiai vizsgálatokat végeztem a közösen tervezett kísérletsorokon. Ez a munkamegosztás a kés ıbbiekben is fennmaradt a témában. Ennek köszönhet ı, hogy az itt közölt nukleinsav-alapú vizsgálatok egy részét nem én magam végeztem el, a módszertani sajátságok miatt azonban ezek vázlatos bemutatására is szükség van a dolgozatban. A nuk- leinsav-alapú munkák ismertetésekor az Anyag és módszer fejezetben ennek megfelel ıen feltüntetem az azokat elvégz ı, közös publikációban eddig nem szerepl ı kollégák nevét a leírás végén. A számos elvégzett közösségfeltáró és -elemz ı vizsgálat közül háromnak a bemutatására kerítünk sort e dolgozatban, melyek már megjelent vagy tervezett publikációk témái is egy- ben. Egy mezofil és termofil reaktorból történ ı kezdeti közösségfeltárás az els ı, könnyen bontható szubsztrátok adagolásának közösségösszetételre és biogázhozamra gyakorolt hatá- sát tesztel ı munka a második, s egy mezofil-termofil közösségátrendez ıdés monitorozása a harmadik, melyet egy újfajta adatkezelési koncepció bemutatása egészít ki. Utóbbiról szólva el kell mondanom, hogy a sok korláttal övezett kemotaxonómiai mód- szerkör alkalmazójaként olykor csaknem irigykedve pillantottam üvegedényeim közül a

4 I. BEVEZETÉS kitaposottabb úton haladó, kezük alá tervezett eszközökkel dolgozó, jó felbontást ígér ı nuk- leinsav-alapú módszereket használó kollégáimra, míg a közös munkák során meg nem ta- pasztaltam, hogy másként ugyan, de legalább annyi módszertani korláttal és frusztráló bi- zonytalansággal kell szembenézniük, mint a közösségvizsgáló kemotaxonómia alkalmazó- jának. Ez a perspektíva vezetett ahhoz, hogy mindinkább a módszerek alkalmazhatóságának kérdése kezdett foglalkoztatni azon els ıfajú kérdések helyett, melyek megválaszolásának e módszerek az eszközei volnának. Doktori munkám kés ıbbi id ıszakát ezért annak a kérdés- nek a fényében végeztem, miként volna meghaladható az a polifázikus módszertani status quo, amelyben a mikrobiális ökológia bizonyos értelemben vesztegel, s hogyan volna lehet- séges a rendelkezésre álló ujjlenyomatmódszerek eredményeit egy közös, egyenként mind- egyiken továbbmutató szintézisbe rendezni. Hogy a robbanásszer ően fejl ıdı metagenom- vizsgálatok mennyiben teszik majd meghaladottá és átléphet ıvé ezt a problémát, azt még nehéz megbecsülni. Ett ıl függetlenül izgalmas szellemi kaland volt megkezdeni egy olyan lépést, amelyet a látókörünkbe es ı szakirodalom tanúsága szerint a tudományos közösség mindeddig nem kísérelt megtenni, s bár ez a lépésünk dolgozatom megírásáig sajnálatos módon még nem talált stabil nyugvópontra, a koncepció bemutatására és továbbgondolha- tóvá tételére reményeim szerint alkalmasnak bizonyulnak az itt közölt eredmények is. A közösségvizsgálatokban tett er ıfeszítéseink sorával párhuzamosan haladt egy labora- tóriumi lépték ő iszaprothasztó modellrendszerünk ellen ırzésére alkalmas, újfajta, kishoza- mú gázáramlást mér ı módszer kifejlesztése is. Ez, bár nem szorosan illeszkedik munkám mikrobiológiai problematikájába, annak módszertani hangsúlyaival összerímel, s úgy ala- kult, hogy doktori munkám talán legsikerültebb és bevallom, legélvezetesebb történetévé kerekedett. E módszerfejlesztés bemutatása alkotja a dolgozat negyedik témakörét. A fenti kett ısségnek megfelel ıen a dolgozaton is kett ıs tagolás érvényesül. Az átlátha- tóság kedvéért a számozásukban „A” jel ő alfejezetek a gázhozammér ı módszerfejlesztés- sel, a „B” jel őek pedig a közösségelemzéssel kapcsolatos témaegységeket dolgozzák fel.

5 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS II. 1. A metanogenezis megismerésének rövid története A mocsári lidércfényeket látva ısid ıkt ıl fogva tapasztalhatta az ember a metán biológiai keletkezését, annak tudatos használatba vétele azonban csak jóval kés ıbb, a nagy néps őrő- ség ő civilizációk idején kezd ıdhetett el. Bár anekdota szint ő ismeretek élnek arról, hogy Asszíriában a Kr.e. X. században illetve Perzsiában a XVI. században már biogázt használ- tak fürd ıvíz melegítésére, és hogy Marco Polo két-háromezer évesre tehet ı fedett hulladék- tárolókról számolt be Kínából, az els ı megbízható dokumentumaink az európai újkorból származnak. 1600 táján Van Helmont flamand orvos és kémikus állapította meg el ıször, hogy bomló szerves anyagból gyúlékony gáz szabadul fel, majd 1776-ban Alessandro Volta olasz fizikus ismerte fel a bomló szerves anyag illetve a keletkez ı gáz mennyiségei közti összefüggést (Abbasi és mtsai. 2012). Volta egyszerő kísérletét mocsárgáz gy őjtésével és lángra gyújtásával demonstratív céllal azóta is gyakran megismétlik (II/1. ábra).

II/1. ábra. Volta kísérlete. A fölzavart tavi üledékb ıl felszabaduló buborékokat lefordított szájú edénybe gy őjtve a gáz kés ıbb lángra lobbantható 1.

Az éghet ı gázban a metánt John Dalton és Humphrey Davy egymástól függetlenül azo- nosították 1804–1808 között. 1868-ban a francia Antoine Béchamp ismerte fel a metánter- mel ıdés mikrobiológiai hátterét, majd a század ’90-es éveiben Vaszilij Leonyidovics Omelianskij szentpétervári mikrobiológus izolált hidrogén- illetve ecet- és vajsavtermel ı baktériumokat anaerob módon bontott cellulózból, s ı vetette fel el ıször, hogy a metán szén-dioxidból és hidrogénb ıl keletkezhet mikrobiális katalízis révén. N. L. Söhngen hol- land mikrobiológus az ı kísérleteit ismételve igazolta a sejtést 1910 körül, s a metán másik, acetát dekarboxilezésével történ ı keletkezését is felismerte, bár ez sokáig nem vált elfoga- dottá. Az els ı metanogén izolátumot H. A. Barker állította el ı az általa kidolgozott anaerob

1 http://grants.hhp.coe.uh.edu/ clayne/HistoryofMC/HistoryMC/VoltaII.htm

6 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS tenyésztési eljárás segítségével 1936-ban, mely organizmus Methanobacillus omelianskii néven vált ismertté, bár 1967-ben kiderült, hogy két, szoros szintrófiában él ı baktérium kevert tenyészete volt. Mindmáig azonban a szintrófia egyik iskolapéldájának számít az etanolból ecetsavat és hidrogént el ıállító „S törzs” valamint a hidrogénb ıl és szén- dioxidból metánt el ıállító „M.o.H. törzs” 2 együttélése (Schink 1997; lásd kés ıbb). Barker laboratóriuma a hollandiai Delftben a metanogenezis kutatásának évtizedekig a fellegvára volt. Az els ı valóban tiszta tenyészeteket is itt hozta létre C. G. Schnellen 1947-ben. Ezek a Methanobacterium formicium (mely szubsztrátul hangyasavat használ) és a Barker után elnevezett Methanosarcina barkeri . Az anyagcsereviszonyok tisztázásának és új meg új, a metanogenezisben szerepet játszó baktériumok leírásának évtizedei után az 1970-es években kezdett meredeken emelkedni a témával foglalkozó szakirodalom mennyisége, miután a metanogenezis kulcs-koenzimeit és az ısbaktériumok (Archaea) mibenlétét felfedezték, illetve az anaerob mikroorganizmusok túlnyomásos kamrákban való rutinszer ő tenyésztésének technológiáját kidolgozták (Wolfe 1993). A növekedés azóta sem állt meg.

II. 2. A biogáztermeltetés rövid története A biogén metán gyakorlati felhasználására a világ két távoli pontján, az angliai Exeterben és az indiai Bombayben került el ıször sor az 1890-es évek közepén (Abbasi és mtsai. 2012; bár az internetes források jelent ıs része ezzel szemben a bombayi lepratelep biogázreaktorának létrehozását az 1850-es évekre teszi, s így azt els ıként tartja számon). A szennyvízb ıl illetve emberi ürülékb ıl termeltetett gázt világítás céljára használták fel mind- két helyen. A biogázüzemek telepítésének nagy hulláma a XX. század ’40-es éveiben kez- dıdött, amikor Európán belül els ısorban Franciaországban és Németországban, másutt pedig els ısorban Indiában építettek hol egyszer őbb, hol már igen összetett rothasztókat. Hazánkban az 1950-es években kezdtek hozzá a biogázzal folyó kísérleteknek a F ıvárosi Csatornázási M ővek Soroksári úti szennyvíztisztító telepén (ma FCSM Zrt., Dél-pesti Szennyvíztisztító Telep), az els ı szerves trágya alapú biogáztelep el ıször a Pécsi Állami Gazdaságban létesült (Czupy és Vágvölgyi, 2011). A ’70-es években Észak-Amerikában, a ’80-as években pedig Afrika és Ázsia egyre több országában kezdtek telepítésekbe hulla- dékkezelés és energianyerés céljából, napjainkra pedig már kiemelt fontosságú, támogatott fejlesztésnek számít a biogázüzemek telepítése mindenütt a világon. 2012-ben Németor- szágban mintegy 7000 biogázüzem m őködött, és számuk meredeken emelkedik, lakosság- számra vetítve azonban Spanyolország az európai csúcstartó biogáz-kihozatalban, ezt köve-

2 M.o.H.: „methanogen oxidizing hydrogen”. Kés ıbb Methanobacterium bryantii néven írták le. Az „S törzs” („symbiotic”) sajnos a kés ıbbiekben kihalt.

7 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ti Belgium, Hollandia, Svájc, majd Németország (Abbasi és mtsai. 2012). A népesedés és a gazdasági teljesítmény növekedésének árnyoldalaival, az energiakészletek és a környezet hulladékelnyel ı kapacitásának végességével szembesülve a szerves hulladékból képz ıdı metán energiaforrásként való felhasználása igen gyümölcsöz ı lehet ıségként t őnik fel. Ez a belátás a gazdasági és politikai döntéshozók körében is terjed, így a támogatások révén új és új szerves alapanyagok bevonására, új és új technológiák kidolgozására nyílik lehet ıség napjainkban, ami nem csak az ágazat fent említett növekedésének, hanem a tudományos szakirodalom terebélyesedésének is motorja. Talán érdemes megnézni, hogy a Google Scholar keres ıje szerint 1965 és 2012 között évente hány új publikáció tartalmazza a „biogas” kifejezést (nem megfeledkezve arról, hogy az efféle adatsorokat számos hiba ter- helheti) (II/2. ábra).

16000 14400

14000 13700 12900

12000 11900 10800 10000

8000 8040 6540 6000 5150 4350

4000 3580 új új publikációk száma 2940 2420 2060 1670 1610 1480

2000 1360 1250 1190 1100 1130 1040 1020 964 988 935 987 960 905 925 799 711 759 415 228 113 165 62 0 9 7 3 5 5 5 11 10 11 32 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 II/2. ábra A Google Scholar publikáció-keres ı találatainak száma „biogas” kifejezésre az egyes évekb ıl.

Wolfe fentebbi megállapításával összhangban a ’70-es években ugrik el ıször száz fölé az éves találatok száma. A ’80-as és ’90-es években évente közel ezer új publikáció jelenik meg, hogy aztán a ’90-es évek végét ıl – talán a klímakonferenciák és a biológiában lezajlott molekuláris forradalom együttes hatására – meredek növekedésnek induljon a találatszám. (Nem kizárt persze, hogy a publikált anyagok digitalizálásának ekkori terjedése is hozzájá- rul a találatok növekedéséhez ebben az id ıszakban.) Megtorpanás csak a gyarapodás üte- mében látszik 2008-tól, valószín őleg a gazdasági válság hatására, amely a tudományfinan- szírozásban is érezteti hatását.

II. 3. Szerves anyagok anaerob lebontásának metanogén útja A biogáz szerves anyagok anaerob biológiai bontása során keletkez ı, nagyrészt metánt

(CH 4), kisebb részben szén-dioxidot (CO 2), nyomnyi mennyiségekben pedig vízg ızt, oly- kor kénhidrogént (H 2S), ammóniát (NH 3) és más illékony gázkomponenseket (pl. illékony zsírsavakat) tartalmazó gázelegy, mely metántartalma révén égethet ı, így h ı- és villamos

8 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS energia el ıállítására használható. A gáz minden esetben egy mikrobiális anyagcsere- közösség tevékenysége révén keletkezik, amelyet többé-kevésbé állandó metabolikus sze- reposztásban együttm őköd ı különféle baktériumok alkothatnak. A kiindulási szerves anyag igen sokféle lehet (például konyhai hulladék, gabonaszalma, állati trágya, humán fekália stb.) de általában három klasszikus szervesanyag-csoport tagjait tartalmazza különböz ı arányban: poliszacharidokat, fehérjéket és különbözı zsírokat. Ezek metánná alakítása négy fı lépésben történik. Els ı lépésben hidrolizáló baktériumok bontják a polimereket monome- rekig, vagyis cukrok, aminosavak, zsírsavak és egyéb monomerek keletkeznek. Második lépésben ezeket primer fermentálók alakítják energianyerés céljából kis molekulájú anya- gokká, els ısorban hidrogénné (H 2), CO 2-dá és egyéb C1 vegyületekké, ecetsavvá és egyéb kis molekulasúlyú savakká (tejsav, propionsav, vajsav, borostyánk ısav) valamint alkoho- lokká a megfelel ı erjesztési folyamatokban. A H 2, CO 2 és ecetsav ugyan közvetlenül is hasznosítható már a metanogén közösségalkotók számára, ám egyéb alfolyamatokban más irányba is csatornázódhatnak, miel ıtt eljutnak a metanogénekig. Harmadik lépés a kis mo- lekulájú savak és alkoholok tovább bontása H 2-né, CO 2-dá és ecetsavvá, melyet szekunder fermentálók (köztük a szintróf baktériumok) végeznek. Negyedik lépés a CH 4 kialakítása

H2-bıl és CO 2-ból vagy CH 4 és CO 2 kialakítása ecetsavból, melyet minden esetben az anyagcserefolyamat végén álló metanogén ısbaktériumok (Archaea) végeznek el. Két f ı típusuk anyagcseréjük szerint a hidrogénoxidáló (hidrogenotróf) és az ecetsav diszproporcionálásával CH 4-t és CO 2-t termel ı acetiklasztikus metanogének. Metánképzés e két f ı szubsztrát mellett más – f ıleg C1 – vegyületekb ıl is történhet, de ennek jelent ısége általában alárendeltebb. Az anyagcsere-hálózat vázlatos képét mutatja a II/3. ábra. A metántermelés folyamatában részt vev ı baktériumok szigorúan anaerob környezetben élnek, és többszint ő átalakításban hasznosítják és termelik egymás anyagcsere-végtermékeit illetve kiindulási szubsztrátjait. Kapcsolatuk igen összetett és az el ıbbi okból kifolyólag nagyon szoros. Ellentétben más táplálékhálózatokkal, ahol általában a fogyasztó szervezet van anyagcseréjét tekintve függ ı helyzetben a táplálékláncban el ıtte álló tagtól, itt a terme- lı is érzékeny függésben van végtermékei fogyasztójától. A teljes folyamatban, de még inkább az egyes részfolyamatokban felszabaduló energia ilyen körülmények között ugyanis igen csekély. A folyamat legvégs ı terméke, a metán, még mindig igen nagy energiájú ve- gyület (emiatt érdemes mint energiaforrást termeltetnünk), a baktériumoknak pedig a szer- ves monomerek és a CH 4-CO 2 termékek energiaszintje között felszabadított energiával kell

9 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

szerves polimerek I. 1

monomerek (cukrok, aminosavak, zsírsavak)

2 II.

illékony zsírsavak tejsav borostyánk ısav alkoholok

3 III.

C1 vegyületek (CO 2), H 2 ecetsav 4 IV. 5 6 CH 4, CO 2

1: hidrolizáló baktériumok 4: homoacetogén baktériumok 2: primer fermentáló baktériumok 5: hidrogenotróf metanogének 3: szekunder fermentáló (szintróf) baktériumok 6: acetiklasztikus metanogének

II/3. ábra. Szerves anyagok anaerob lebontásának útja és a baktériumok különböz ı anyagcseretípusú alpopulációinak szerepe a folyamatban. A római számok a hidrolízis, primer fermentáció, szekunder fermentáció és metanogenezis szakaszait jelölik. fedezniük saját életfolyamataik energiaigényét. A részfolyamatokban felszabaduló energia olykor alig haladja meg az egy mol ATP szintéziséhez minimálisan szükséges (h ıveszteséggel is számolva) mintegy -70 kJ/mol energiát, vagy – elektrontranszport- lánccal rendelkez ı baktériumok esetén – az egy proton membrántranszportjához szükséges mintegy -20 kJ/mol energiát (Schink 1997). Bizonyos reakciók, így például vajsav és víz ecetsavvá és H 2-né alakítása standard körülmények között még endergonikusak is, exergonikussá csak igen speciális körülmények között tehet ık, így például az egyik vég- termék (ez esetben a H 2) folyamatos elvonásával, azaz koncentrációjának igen alacsony szinten tartásával. Ez akkor lehetséges, ha a reakciósor következ ı lépését katalizáló baktéri- umok folyamatosan fogyasztják a végterméket. Ha ebben a tevékenységükben zavart szen- vednek, ellehetetlenül a termel ı mikroba anyagcseréje is. A korábban említett

Methanobacillus omelianskii esetében például az „S törzs” katalizálta 2 CH 3CH 2-OH + 2 - + H2O = 2CH 3COO + 2H + 4H 2 reakció is endergonikus standard körülmények között (G°’ = +19 kJ / 2 mol etanol), így a baktérium számára használható energia felszabadítá- sára csak úgy válhat alkalmassá, ha a metanogén „M.o.H. törzs” folyamatosan elvonja a

10 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

termel ıdött H 2-t a saját energiatermel ı reakciója révén (4 H 2 + CO 2 = CH 4 + 2 H 2O ; G°’ = -131 kJ / mol metán), mely már szerencsére exergonikus folyamat, ám legalább annyira rászorul a kiindulási anyagára, mint a partner a végterméke elvonására. Az efféle speciális egymásra utaltságot nevezzük szintrófiának, melynek során két, egymástól metabolikusan eltér ı típusú baktérium jellemz ıen energetikai okokból egymásra szorul egy bizonyos szubsztrát lebontásában (Schink 1997). Ennek egyik legtipikusabb példája a hidrogénoxidá- ló metanogén archaeonok és a szekunder fermentáló baktériumok kapcsolata. A primer fermentálók ugyancsak profitálnak a hidrogénoxidáló közösségalkotók tevé- kenységéb ıl, mivel a H 2 alacsony parciális nyomása (<10 Pa) lehet ıvé teszi a -320 mV redoxpotenciálon a NADH+H +-ból molekuláris hidrogén közvetlen felszabadulását, ami megengedi, hogy a fermentációs terméklista ecetsav-, CO 2- és H 2-termel ıdés irányába to- lódjon vajsav- vagy etanol-termel ıdés helyett, ami több ATP termelését teszi számukra lehet ıvé. Jól kiegyensúlyozott anaerob rendszerben ezért az anyagáramlás f ıként a „küls ı” vonalakon zajlik (II/3. ábra), habár a „középs ı” út anyagforgalma sem lesz soha nulla, mi- vel aminosvak és zsírsavak bontásakor mindig keletkeznek savak és alkoholok. Ezek éppen akkor jutnak különös szerephez, ha a H 2-koncentráció megn ı a közegben pl. a hidrogénfo- gyasztó metanogének m őködési zavara miatt. Ekkor a primer fermentálók anyagcseréje a „középs ı” útra terelıdik (II/3. ábra), a képz ıdı savak lecsökkentik a pH-t, ami pH 6,00 alatt tovább rontja a metanogének helyzetét. A másik oldalon a szekunder fermentáló szintrófok nem tudják elhasználni ıket (éppen a sok H 2 miatt). Ilyenkor tapasztaljuk, hogy a közeg elsavanyodik, a kismolekulájú savak felhalmozódásától b őzössé válik, az anyagcserehálózat pedig végérvényesen sérülhet. Az illósavak felszaporodását a közegben ezért mindig anyagcserezavar jeleként értékelik. A homoacetogén baktériumok szerepét a folyamatokban még kevésbé értjük. Anyagcse- respektrumuk révén olykor bekapcsolódhatnak a primer fermentációs folyamatokba is, egyébként pedig söntöt képeznek a hidrogenotróf és acetiklasztikus irányba haladó anyag- forgalmi utak között: versengve a hidrogenotróf metanogénekkel és szubsztráthoz segítve az acetiklasztikus metanogéneket ezen alpopulációk szabályozásában juthatnak szerephez. Magas h ımérsékleten azonban a folyamat meg is fordulhat, ha az acetiklasztikus metanogének visszaszorulásával felhalmozódik a közegben az ecetsav (Schink 1997). Ez igen fontos lehet a közösség egyensúlyának megtartásában, mivel az ecetsavtermel ı primer fermentálók anyagcseréjét hasonlóképpen gátolhatja anyagcsere-végtermékük felhalmozó- dása a közegben, mint a szintróf baktériumokét a H 2-é (Zinder 1993). Szulfát jelenlétében, pl. tengeri üledékekben, vagy magas szulfáttartalmú szubsztráttal terhelt reaktorokban a kapcsolatrendszer tovább bonyolódik. Az oxidált kénformát terminá- lis elektronakceptorként használó szulfátredukáló baktériumok bizonyos csoportjai a primer

11 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

fermentálók minden szerves termékét képesek közvetlenül CO 2-dá oxidálni, miközben a szulfát H 2S-né redukálódik. H 2 közvetlen oxidálására is képesek lehetnek víz és H2S képzé- se során. Hidrogénkompetitorai lehetnek tehát a hidrogenotróf metanogéneknek, széls ısé- ges esetben pedig akár a teljes metanogén populációt megkerül ı utakra vezethetik a közös- ségi anyagcserét, ami a metanogenezis visszaszorulását eredményezi. A szulfát és a szulfátlégz ık emiatt nem kívánatos tényez ık egy biogáztermel ı rendszerben. Más mester- séges rendszerekben, ahol a szulfát redukciója az üzemeltet ı célja, hasonló kompetíciós okokból éppen a metanogénekt ıl igyekeznek megszabadulni (Esposito és mtsai. 2003). Megtelepedhetnek vasionokat (Fe 3+ ) redukáló baktériumok is az anaerob anyagcserehálózatokban, melyek ugyancsak beszállhatnak a hidrogénért folyó versengésbe (Zinder 1994).

A metanogének kompetíciója H 2-ért és/vagy egyéb szubsztrátokért a szulfátredukáló és homoacetogén (vagy akár Fe 3+ redukáló) baktériumokkal olyan értelemben is bonyolítja az anyagcsererendszert, hogy a szubsztrátok aktuális koncentrációja szerint más-más kiélezett- séggel folyik a verseny a csoportokra jellemz ı más-más hasznosíthatósági küszöbkoncent- rációk miatt. A hidrogén legkisebb parciális nyomásértékeinél, 10 -5 atm körül a szulfátredu- kálók már képesek azt hasznosítani, míg a metanogének csak 10 -4 atm táján lesznek képe- sek belépni a felhasználásba. Az acetogének pedig csak 10 -3 atm parciális nyomásértéknél férnek hozzá ehhez az értékes elektrondonorhoz (Zinder 1994). A verseny így egyáltalán nem kiegyenlített, és mindenkor nagyban függ az egyéb környezeti feltételekt ıl és egyéb közösségalkotóktól is. Az anaerob szervesanyagbontó anyagcsere-hálózatok tehát jól látha- tóan magasan szervezett, többszörös visszacsatolásokkal és kölcsönhatásláncokkal átsz ıtt, ráadásul minden konkrét esetben egyedi vonásokat is mutató rendszerek, így felderítésük izgalmas terepet kínál a kutatás számára. A metanogenezis, mint már említettük, több kiindulási anyagból is megvalósulhat, ahogy a II/1. táblázat is mutatja.

Szubsztrát Reakció G0’ - Hidrogén/CO 2 4 H 2 + HCO 3 → CH 4 + 3 H 2O -135 - + Formiát 4 HCOO + 4 H → CH 4 + 3 CO 2 + 2 H 2O -145 Szénmonoxid 4 CO + 5 H 2O → CH 4 + 3HCO 3- + 3 H+ -196 - - + Etanol 2 CH 3CH 2OH + HCO 3 → 2 CH 3COO + H + CH 4 + H 2O -116 H2/Metanol CH 3OH + H 2 → CH 4 + H 2O -113 - + Metanol 4 CH 3OH → 3 CH 4 + HCO 3 + H 2O + H -105 + - + Trimetilamin 4 CH 3NH + 3 H 2O → 3 CH 4 + HCO 3 + 4 NH 4 + 3H -76 - + Dimetilszulfid 2 (CH3) 2S + 3 H 2O → 3 CH 4 + HCO 3 + 2 H 2S + H -49 - - Acetát CH 3COO + H 2O → CH 4 + HCO 3 -31 Piruvát 4 CH 3COCOOH + 2 H 2O → 5 CH 4 + 7 CO 2 -31 II/1. táblázat. A metanogenezis kiindulási anyagai, a reakciók nettó egyenlete és standard sza- badenergia-változása.

12 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

A metánképz ıdés folyamataiban a C1-csoport valamint a H 2-bıl (vagy szerves közti- anyagokból) származó elektronok és protonok szállítása végig koenzimekhez kapcsoltan történik (II/4. ábra). A koenzimek közül nem egy fémionokat is tartalmaz, s a folyamatokat katalizáló enzimek közül is jónéhány rendelkezik fémtartalmú prosztetikus csoportokkal.

Az anyagcserehálózat gerince a CO 2 redukciójának folyamata H 2-nel, amelyhez többé vagy kevésbé, de az összes egyéb kiindulási anyag metabolizmusa is hozzákapcsolódik. A II/5. ábrán a legfontosabb metanogén szubsztrátok anyagcseréje tekinthet ı át.

* (N-formil-)metanofurán (MFR)

10

5

(formil-)tetrahidroxi-metanopterin (-H4MPT) (metenil-) „ * * * * (metilén-) „ (metil-) „

* (metil-)Koenzim-M (CoM) (merkaptoetán-szulfonsav)

Koenzim F 420 (CoF 420 )

(CoF 420 )H 2

*

Koenzim F 430 (CoF 430 ) Koenzim-B (CoB) (N-7-merkaptoheptanoil-O-foszfo-L-treonin) *

5-hidroxi- benzimidazolil- [ CoM – S – S – CoB ] kobamid

II/4. ábra. A metanogenezis folyamatában részt vev ı koenzimek és a szubsztrátok kapcsolódá- sa. A piros csillag a képz ıdı metánmolekula C-atomját jelöli.

13 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

CO 2 H2 1 2 formiát formil-MFR 3 H2O ferredoxin formil-H4MPT 4 C O citokróm-b (H2) metenil-H4MPT 5 H2 + F 420 F420 H2 6 7 11

metilén-H4MPT H2 + F 420 F420 H2 8 15 metil-aminok acetil-CoA metil-H4MPT ? 9 metanol ATP 14 12 metil-CoM acetil-P metil-szulfidok i

13 H2 + F 420 F420 H2 CoM – SH 10 CoM – S – S – CoB acetát CoB – SH 11 ATP

II/5. ábra. Biológiai metánképz ıdés CO 2-ból, acetátból, formiátból valamint metanolból, me- til-aminokból és metil-szulfidokból. A koenzimeket lásd a II/4. ábrán. A számmal jelölt folya- matok enzimei: 1: egy (NiFe) hidrogenáz, 2: formil-metanofurán-dehidrogenáz, 3: formil- 5 10 metanofurán : H 4MPT–formiltranszferáz, 4: N ,N -metenil-H4MPT-ciklohidroláz, 5: H 2- képz ı metenil-H4MPT dehidrogenáz, 6: CoF 420 -redukáló (NiFe) hidrogenáz, 7: CoF 420 - dependens metenil-H4MPT dehidrogenáz, 8: CoF 420 -dependens metilén-H4MPT reduktáz, 9: kobalt-korrinoid tartalmú metiltranszferáz enzimkomplex, 10: metil-CoM-reduktáz, 11: heterodiszulfid-reduktáz, 12: metiltranszferáz, 13: acetát-kináz, 14: foszfotranszacetiláz, 15: CO-dehidrogenáz (CODH) enzimkomplex. A további magyarázatot lásd a f ıszövegben.

A CO 2 redukciójának folyamata a molekula formil-csoport formájában való megköt ıdé- sével kezd ıdik metanofurán (MFR) koenzim aminocsoportján, amihez a redukálóer ıt egy nikkel-vas (NiFe) hidrogenáz enzim biztosítja elemi hidrogén bontásából. Az elektronok és protonok ferredoxinok közrem őködésével lépnek be a formil-metanofurán-dehidrogenáz enzim által katalizált reakcióba, melynek során formil-MFR, víz és proton keletkezik (Thauer et al. 1994). A folyamat összességében endergonikus, a ferredoxinok redukciójának energiaigényét nátrium-ion-motoros er ı biztosítja (Kaster és mtsai. 2011). [A különbözı metanogén fajokból kimutatott formil-metanofurán-dehidrogenáz enzimek O 2 jelenlétében gyorsan inaktiválódnak. Prosztetikus csoportjaikban molibdént (molibdoprotein-guanin- dinukleotid), nem hem vasat és savlabilis kénatomokat találtak, a Methanothermobacter

14 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS wolfeii -bıl izolált egyik enzimbe pedig volfrám épül, ha a baktérium hozzájut ehhez az elemhez.] Az ily módon fixált C1 csoport a következı lépésben tetrahidro-metanopterin

(H 4MPT) koenzimre kerül, amit a kromofór csoportot nem hordozó formil-metanofurán :

H4MPT–formiltranszferáz enzim katalizál. Ezen a koenzimen történik a formil-csoport re- 5 10 dukálódása a továbbiakban (II/4. ábra). El ıször az N ,N -metenil-H4MPT-ciklohidroláz enzim protonfelvétel majd vízkilépés kíséretében eltávolítja a formilcsoport oxigénjét, a szénatom pedig kett ıs kovalens kötéssel a koenzim 5. nitrogénjéhez, egy egyes kötéssel pedig a 10. nitrogénjéhez kapcsolódik. A továbbiakban ezek a kötések fognak telít ıdni hid- rogénnel. Ennek els ı lépését a CoF 420 -dependens metenil-H4MPT dehidrogenáz vagy az ún.

H2-képz ı metenil-H4MPT dehidrogenáz enzim katalizálhatja – a H 2 közegbeli parciális nyomásának függvényében. Viszonylag magas parciális nyomás esetén az utóbbi enzim révén a H 2 közvetlenül, szubsztrátként léphet a folyamatba, alacsony nyomás esetén azon- ban F 420 koenzim közvetítésére és az els ı enzimre van szükség. Az F 420 koenzim hirdogénnel való redukcióját ugyancsak egy nikkel-vas enzim, a CoF 420 -redukáló (NiFe) hidrogenáz végzi. A következ ı redukciós lépést a CoF 420 -dependens metilén-H4MPT reduktáz segíti, és mindenképpen redukált F 420 koenzim szállítja a hidrogéneket. (A Methanococcus voltae -ból izolált hidrogenázok szelenociszteint tartalmaznak normál cisz- tein helyett.) Bár e redukciós lépések mindegyike exergonikus, energiaraktározás nem tör- ténik, mert ehhez túl kicsinyek a reakcióh ık – nem utolsósorban a kiindulási anyagként szerepl ı H 2 mindig igen alacsony parciális nyomása miatt. A folyamatban képz ıdött metilcsoportot a következ ı lépésben az él ıvilág eddig ismert legkisebb koenzime, a CoM (merkaptoetán-szulfonsav) veszi át. A csoporttranszfert egy metiltranszferáz enzimkomplex végzi, mely a B12 vitaminhoz igen hasonlító szerkezet ő kobalttartalmú korrinoid prosztetikus csoportot (5-hidroxi-benzimidazolil-kobamid) tartalmaz (II/4. ábra). A koordi- nációs kötésbe foglalt kobalt ion feltehet ıleg szerepel a metilcsoport átmeneti megkötésé- ben a transzfer során (Thauer et al. 1994). Na +- és/vagy protontranszferrel megvalósuló kemiozmotikus energiaraktározás is köthet ı a folyamat e mozzanatához, amely az ATP- szintézis, és részben a ferredoxin-redukció energiaigényét fogja fedezni (Kaster és mtsai. 2011). Az utolsó lépés, a voltaképpeni metanogenezis, mely kizárólag metanogén Archaea- sajátság (a többi reakció más organizmusok anyagcserefolyamataiban is el ıfordulhat), há- rom koenzim közrem őködését igényli, és a metil-CoM-reduktáz enzim katalizálja. Ennek az utolsó redukciós lépésnek a voltaképpeni elektrondonora a CoB (vagy N-7- merkaptoheptanoil-O-foszfo-L-treonin; HS-HTP), melynek tiol-hidrogénjével egyenérték ő H+-nal és e --nal a metil-csoport eltávozik a CoM-rıl (metán képz ıdik), a két koenzim pedig diszulfid formában összekapcsolódik (CoM–S–S–CoB). Az elektronátvitelben közvetlen szerepet játszik az enzimhez kapcsolódó F 430 koenzim, amely egy nikkel-porfinoid (II/4.

15 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

ábra). A koenzimek regenerációja a heterodiszulfid-reduktáz enzim révén megy végbe, a folyamat hidrogéndonora F 420 koenzim. E folyamat nagy energia-felszabadulással jár, ez pedig ferredoxin redukciójára fordítódik ( Methanothermobacter marburgensis -ben; Kaster és mtsai 2011). Ezekhez a folyamatokhoz kapcsolódik a többi szubsztráttípus átalakítása is (II/5. ábra).

A szabad hangyasav nem köztiterméke a CO 2-redukciónak, ezért a felhasználására képes metanogénekben el ıször CO 2-dá oxidálódik, majd végighalad a fenti reakciósoron (Thauer et al. 1994). A metanol esete összetettebb, ekkor egy megfelel ı metiltranszferáz enzim a metanol metilcsoportját a metil-CoM-et létrehozó enzimkomplex kobalt-korrinoidjára viszi, majd innen kerül a metilcsoport a CoM-re, és indul tovább a már tárgyalt módon. Metanolból azonban elemi hidrogén felhasználása nélkül is képzıdhet metán. Ilyenkor minden negye- dik metanol metilcsoportja visszafelé teszi meg az utat a reakciósoron, és CO 2-dá oxidáló- dik, miközben három redukált F 420 koenzim képz ıdik fordított folyamatnak megfelel ıen, a II/5. ábrán látható módon, melyek éppen fedezik a másik három metanol metilcsoportjának redukcióját (pontosabban a CoM–S–S–CoB heterodiszulfid bontását) a végs ı, energiater- mel ı lépésben (Keltjens és Vogels 1994). Az acetátból történ ı metántermelés az arra képes baktériumokban az acetát aktiválásával indul, mely ATP-igényes lépés: az acetát-kináz enzim ATP foszfátcsoportjával acetil- foszfáttá alakítja az ecetsavat (II/5. ábra). Az acetil-csoportot a foszfotranszacetiláz enzim ezután CoA molekulával kapcsolja össze Ac-CoA képzıdése és P i felszabadulása közben. Az Ac-CoA-ban ezután a (baktériumok körében egyébként általánosan elterjedt) CO- dehidrogenáz (CODH) enzimkomplex felbontja a szén-szén és a szén-kén kötést is, s a metilcsoport a komplex egy kobalt-vas-kén komponensén keresztül a (H 4MPT-vel analóg, de a Methanosarcina fajokról tetrahidro-sarcinapterinnek keresztelt) H4SPT koenzimre kerül, s mint metil-H4SPT bekapcsolódik a metanogenezis fent ismertetett útjába. A -CO- csoport a komplex egy nikkel-vas-kén komponensén keresztül egy molekula víz oxigénjé- vel végül CO 2-dá oxidálódik, a felszabaduló hidrogének elektronjai pedig ferredoxinhoz kapcsolódva membránkapcsolt elektrontranszport-láncon keresztülhaladva protongradienst generálnak (ezzel megtermelik a kezdeti acetát-aktiváció energiafedezetét), majd a heterodiszulfid (CoM–S–S–CoB) reduktáz valamelyik elektrondonorára kerülnek, így ugyancsak szerepl ıivé válnak a metanogenezisnek (Ferry 1994). Az acetáthasznosításban szerepl ı enzimek, azok változatai vagy azokkal analóg m őkö- dés ő enzimek megtalálhatók a metántermel ı Archaeák többségében, és m őködésük a kul- csa a metanogének minden nagyobb rendszertani egységében megfigyelhet ı szénautotrófiának. Mivel a metanogének nem, vagy csak módjával katabolizálnak hosszabb

16 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS szénláncú szerves molekulákat, saját sejtanyagaik felépítéséhez is C1 vegyületekbıl kell kiindulniuk. Ennek a folyamatnak a tudomány által nagyrészt feltárt mechanizmusa a mó- dosított Jungdahl-Wood út, melynek lényegi megértéséhez elegend ı az imént tárgyalt anyagcserefolyamatokra visszautalnunk. A metanogén autotrófia terméke ugyanis acetil- CoA, illetve az ennek további módosításai révén létrehozott piruvát és α-ketoglutarát (Simpson és Whitman 1994). Az acetil-CoA pedig lényegében az acetáthasznosító anyagcserefolyamat megfordításával keletezik a CO 2 alapú metanogenezis egy szakaszának közbeiktatásával, aminek révén az acetilcsoport mindkét szénatomja CO 2-ból keletkezik.

Az acetil CO-csoportjának szene CO 2 egyik oxigénjének vízzé redukálásával keletkezik a CODH enzimkomplex megfelel ı helyén annak a biokémiai eseménynek a fordítottjaként, amivel az acetát karboxilcsoportjának szene végül CO 2-dá alakul acetiklasztikus metanogénekben (II/5. ábra). A metilcsoport pedig szintén CO 2-ból képz ıdik a metil-

H4MPT-né történ ı redukálódás els ıként tárgyalt folyamatában, s innen átadódik a CODH komplex kobamid prosztetikus csoportjára. A komplex ezután kialakítja a szén-szén illetve a szén-kén kötést CoA molekula részvételével, és létrejön az acetil-CoA, melynek acetáttá és CoA-vá alakulásával még mólonként egy mól ATP is el ıállítható (II/5. ábra). A folyamat tehát logikáját tekintve az acetát-alapú metántermelés folyamatának megfordítása, azzal a különbséggel, hogy a metil csoport szene nem metánból képz ıdik, hanem a CO 2 „irányá- ból” érkezik a H 4MPT-re.

II. 4. A metántermelést végz ı baktériumközösségek tagjai Sokat tud már a tudomány a biogázképz ıdésben szerepet játszó, legkülönfélébb szubsztrátokon és körülmények között végbemen ı anyagcsere-folyamatokról, mégis keve- set tudunk az ezeket katalizáló mikrobákról. Az ilyen közösségekben él ı Bacteria és Archaea csoportok képvisel ıinek is mindmáig csupán néhány százalékát vonhatták tenyész- tésbe, a közösségi dinamikákról és kölcsönhatásokról pedig ugyancsak kevés ismeretünk van (Weiland 2010), ami miatt olykor megmagyarázhatatlan hibákkal és zavarokkal szem- besülünk a biogáztermelés gyakorlatában. Az eddigi ismereteink alapján mindazonáltal kirajzolódik egyfajta összkép e közösségek taxonómiai összetételét illet ıen, részben leírt fajok, nagyobb részben pedig ezekkel 16S rDNS-szekvenciájuk (vagy funkciógénjeik szek- venciáiban mutatott hasonlóságuk) szerint társítható környezeti klónok alapján. A kiindulási polimerek hidrolízisét és a primer fermentációt végz ı baktériumok nagyon különböz ı rendszertani csoportokhoz tartozhatnak, legtöbben azonban a Bacteroidetes diví- zió Bacteroidia és a Firmicutes divízió Clostridia osztályából kerülnek ki (II/2. táblázat). Metabolikus potenciáljuk diverzitásuknak megfelel ıen ugyancsak széles spektrumú, és els ısorban ennek az alpopulációnak az összetétele révén képesek a metántermel ı közössé-

17 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

gek alkalmazkodni a kiindulási szubsztrátok sokféleségéhez. M őködésüket a kiindulási szubsztrát kémiai természetén kívül annak szemcsemérete is nagyban befolyásolja, és álta- lánosan elmondható, hogy a hidrolízis a sebességmeghatározó lépés a biogáz-produkcióban. A monomerek primer bontásának módja alapján, fermentációs végtermékeikkel hatnak a közösségi anyagcserefolyamatok sorában utánuk következ ı közösségalkotókra is. Phylum Classis Ordo Familia Példafajok Irodalom Bateroidetes Kampmann és mtsai. 2012 Bacteroidia Bacteroidales Porphyromonadacea Paludibacter propionicigenes Liu és mtsai. 2009 Petrimonas sulfuriphila Liu és mtsai. 2009 Proteiniphilum acetatigenes Liu és mtsai. 2009 Cytophagaceae Liu és mtsai. 2009 Marinilabiliaceae Alkaliflexus imshenetskii Liu és mtsai. 2009 Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Weiland 2010 Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium quini, C. thermocellum, C. orbiscindens, C. straminisolvens, C. bartlettii Liu és mtsai. 2009 Anaerovorax odorimutans Liu és mtsai. 2009 Gracilibacteraceae Gracilibacter thermotolerans Liu és mtsai. 2009 Eubacteriaceae Garciella nitratireducens Liu és mtsai. 2009 Acetobacterium woodii Weiland 2010 Peptococcaceae Kampmann és mtsai. 2012 Peptococcus niger Klocke és mtsai. 2007 Peptostreptococcaceae Peptostreptococcus anaerobicus Klocke és mtsai. 2007 Ruminococcaceae Acetivibrio cellulolyticus Klocke és mtsai. 2007 Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae Lactobacillus reuteri Liu és mtsai. 2009 Leuconostocaceae Leuconostoc citreum Liu és mtsai. 2009 Streptococcaceae Weiland 2010 Streptococcus alactolyticus Liu és mtsai. 2009 Spirochaetes Spirochaetia Spirochaetales Spirochaetaceae Treponema brennaborense Liu és mtsai. 2009 II/2. táblázat. A hidrolízist és primer fermentációt végz ı baktériumok tipikus példái biogáztermel ı közösségekb ıl.

18 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

A homoacetogén baktériumok eddig leírt csoportjai a Firmicutes divízió Clostridia és Negativicutes osztályaiból kerültek el ı, biogáztermel ı rendszerekben azonban egyel ıre Clostridia osztály képvisel ıi t őnnek fontosabbnak (II/3. táblázat). A Negativicutes osztály homoacetogén tagjai termeszek béltraktusából kerültek el ı (Boga és Brune 2003).

Phylum Classis Ordo Familia Példafajok irodalom Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfotomaculum guttoideum Liu és mtsai. 2009 Desulfotomaculum thermocisternum Liu és mtsai. 2009 Ruminococcaceae Sporobacter termitidis Liu és mtsai. 2009 Clostridiaceae Clostridium aceticum Weiland 2010 Clostridium magnum Schink 1984 Eubacteriaceae Acetobacterium woodii Weiland 2010 Thermoanaerobacterales Thermoanaerobacteraceae Moorella glycerini Liu és mtsai. 2009 Negativicutes Selenomonadales Veillonellaceae Sporomusa termitida Boga és Brune 2003 Acetonema longum Boga és Brune 2003 II/3. táblázat. Acetogén baktériumok tipikus példái biogáztermel ı közösségekb ıl.

A metanogénekkel (és/vagy kompetitoraikkal) szintrófiában él ı baktériumok eddig leírt tagjai a delta-proteobaktériumok közül illetve a Firmicutes divízió Clostridia osztályából kerültek el ı, változatosságuk e csoportokon belül meglehet ıs (II/4. táblázat). Mivel folya- matos kett ıs alkalmazkodásban élnek (hiszen a kiindulási szubsztrátoktól és ezek primer fermentálóitól, valamint anyagcsere-végtermékeik elhasználóitól egyaránt érzékenyen füg- genek) a szintróf baktériumok alpopulációjának összetétele ugyancsak karakteres jellemz ıje a különböz ı metántermel ı él ıhelyeknek és mesterséges rendszereknek. A szulfátredukáló baktériumok nem alkotnak taxonómiailag jól körülhatárolható csopor- tot: tagjaik többségét ugyan a delta-proteobaktériumok és firmicutesek csoportjaiban talál- juk (II/5. táblázat), képvisel ıik jelen vannak a Nitrospirae, Thermodesulfobacteria törzsek- ben is, s ıt az Archaea domén Euryarchaeota és Crenarcheota divízióiban is találunk szulfát- redukálókat (Muyzer és Stams 2008). Ezen túlmen ıen anyagcserevariabilitásuk és H 2- affinitásuk is nagyobb, mint a metanogén baktériumoké, így hatékony – bár nem mindig kedvelt – tagjai lehetnek az anaerob rothasztók közösségeinek.

19 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Firmicutes Clostridia Clostridiales Clostridiaceae Clostridium ultunense Shink 1997 Syntrophomonadaceae Syntrophomonas wolfei, S. sapovorans Shink 1997 Syntrophospora bryantii Shink 1997 Thermoanaerobacterales Thermoanaerobacteraceae Thermoanaerobacter brockii Shink 1997 Peptococcaceae Syntrophobotulus glycolicus Shink 1997 Pelotomaculum spp . Kampmann és mtsai. 2012 Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionales Desulfovibrionaceae Desulfovibrio vulgaris Shink 1997 Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae Syntrophobacter wolinii, S. pfennigii Shink 1997 Syntrophales Syntrophus buswellii, S. gentianae Shink 1997 Desulfomonadales Pelobacteraceae Pelobacter venetianus, P. acetylenicus, P. carbinolicus Shink 1997 II/4. táblázat. Szintróf baktériumok tipikus példái biogáztermel ı közösségekbıl.

A metanogén baktériumok eddig ismert kivétel nélkül az Archaea domén Euryarchaeota divíziójának képvisel ıi, ám e csoporton belül már nem alkotnak egységes taxonómiai cso- portot (II/6. ábra). Konzervatív génszekvenciáik alapján két osztályra osztjuk ıket, az I. osztály tartalmazza a Methanococcales, Methanobacteriales és Methanopyrales rendeket, a II. osztály a Methanosarcinales és Methanomicrobiales rendeket. A szekvencia- összehasonlításokban adódó er ıs bootstrap-értékek alapján feltételezhet ı, hogy a II. osztály tagjai monofiletikus csoportot alkotnak, az I. osztályról azonban ez nem mondható el. Van- nak ugyanakkor más szisztematikai megközelítések is, amelyek szekvenciahasonlóság he- lyett génsorrend-alapú összehasonlítást vesznek alapul. Utóbbi módszer például – bár ugyancsak két osztály létét valószín ősíti – a Methanopyrales és Methanobacteriales rende- ket a Methanosarcinales renddel csoportosítja össze, nem pedig a Methanococcales-szel (Luo és mtsai. 2009).

20 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfuromonadales Desulfuromonadaceae Desulfuromonas spp. Klocke és mtsai. 2007 Desulfovibrionales Desulfovibrionaceae Desulfovibrio vulgaris Shink 1997 Desulfobacterales Desulfobacteraceae Desulfobacter postgatei Isa és mtsai. 1986 Desulfobulbaceae Desulfobulbus spp. Muyzer és Stams 2008 Firmicutes Clostridia Clostridiales Peptococcaceae Desulfotomaculum spp. Klocke és mtsai. 2007 Syntrophomonadaceae Dethiobacter alkaliphilus Kénredukáló! Liu és mtsai. 2009 II/5. táblázat. Szulfátredukáló baktériumok tipikus példái biogáztermel ı közösségekbıl.

II/6. ábra. Az Archaea domén filogenetikai konszenzusfája 31 konzervált fehérje-szekvencia alapján Gao és Gupta (2007) alapján. Kékkel a feltüntetett metanogén fajokat jelöltük. Neighbor joining fa, az elágazási pontoknál a számok a neighbor joining (NJ) / maximum parsimony (MP) / és maximum likelihood (ML) módszerek alapján adódó bootstrap értékek.

21 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Akárhogy is áll azonban a metanogének filogenetikájának kérdése, az anyagcserepotenciálban mutatkozó eltérések és hasonlóságok a gyakorlat számára fonto- sabbak. A metanogének összességében kett ı, jól elhatárolható anyagcseretípust alkotnak. Acetiklasztikus (vagy acetotróf) metanogénekb ıl ismerünk kevesebbet: A Mathanosarcina és Methanosaeta (régebben: Methanothrix ) nemzetségekben találjuk képvisel ıiket, illetve a Methanococcusok között találták még meg a csoport egyéb tagjaitól eltér ıen acetiklasztikus Methanococcus mazei t (Zinder 1994, Touzel és mtsai. 1983; II/6. táblázat). Taxonómiai súlyukat jóval meghaladja fiziológiai jelent ıségük a metántermel ı közösségek életében. Bár az acetiklasztikus metanogenezis nem feltétlenül kizárólagos, így acetotrófiára alkalmas

metanogének képesek lehetnek H 2 és CO 2 vagy más C1 vegyületek felhasználására is a metanogenezisben, in vitro jól mérhet ı preferenciát mutatnak az ecetsav irányába.

Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Euryarchaeota Methanomicrobia Methanosarcinales Methanosarcinaceae Methanosarcina barkeri Weiland 2010 Methanosarcina thermophila Zinder és mtsai. 1985 Methanosarcina mazei Kampmann és mtsai. 2012 Methanosaetaceae Methanosaeta concilii (régebben Methanotrix soehngenii ) Penning és mtsai. 2006; 4 Methanosaeta thermophila (régebben Methanotrix thermophila) 3 Methanococci Methanococcales Methanococcaceae Metanonococcus mazei Touzel és mtsai. 1983 3www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=2224&lvl=3 4 www.uniprot.org/taxonomy/2223 II/6. táblázat. Acetiklasztikus metanogén ısbaktériumok tipikus példái biogáztermel ı közös- ségekb ıl.

Az ecetsavbontásra nem képes metanogéneket a hidrogenotróf kifejezéssel nevezzük

meg általában, mivel mindegyikük képes H 2-bıl és CO 2-ból metán létrehozására, és ez energetikailag is jól megtérül ı, gyakran preferált s a szintrófia miatt közösségileg is igen fontos anyagcsereútjuk. A metanogének minden osztályában megtaláljuk ıket (II/7. táblá- zat). Egyéb szubsztrátjaik a metanogenezisben lehetnek az etanol, illetve hangyasav, meta- nol, metilaminok és metán tiolok (C1 vegyületek) is. Az utóbbi szubsztráttípus felhasználóit szokás metilotróf metanogéneknek is nevezni, nem különítve el élesen a hidrogenotrófoktól. Körülményekt ıl függ ıen ugyanis képesek lehetnek szubsztrátváltásra. A metanogének többsége egy-pár szubsztráttípus közt képes „válogatni”. Bár feltételezések szerint ez a „metilotróf” metanogenezis inkább a Föld ıskorában lehetett igazán fontos táp-

22 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

lálkozási mód, (minthogy akkoriban nagy koncentrációban álltak rendelkezésre alkalmas prekurzorok, pl. metanol), jelent ısége ma is megn ıhet olyan szubsztrátok esetén, melyek lebontásakor metanol (pektinbıl), vagy metil-aminok (pl. kolinból, betainból) képz ıdnek nagy mennyiségben. A metilált szufidok metánná alakításának jelent ısége kicsi, és nem is minden „metilotróf” metanogén képes rá (Zinder 1994).

Phylum Classis Ordo Familia példafajok irodalom Euryarchaeota Methanobacteria Methanobacteriales Methanobacteriaceae Methanobacterium thermoformicicum (régebben Methanobacterium thermoautotrophicum ) Ahring 1995; 1 Methanobrevibacter millerae Kampmann és mtsai. 2012 Methanothermobacter thermophilus 2 Methanococci Methanococcales Methanococcaceae Methanococcus spp. Ince és mtsai. 2003 Methanopyri Methanopyrales Methanopyraceae Methanopyrus kandleri Kampmann és mtsai. 2012 Methanomicrobia Methanomicrobiales Methanospirillaceae Methanospirillum hungatei Kampmann és mtsai. 2012 Methanomicrobiaceae Methanoculleus bourgensis Kampmann és mtsai. 2012 1 www.uniprot.org/taxonomy/145262 2 www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?name=Methanobacterium+thermophilum II/7. táblázat. Hidrogenotróf metanogén ısbaktériumok tipikus példái metántermel ı közössé- gekb ıl. II. 5. A Biogáztermelés a gyakorlatban A fentiek alapján talán már nem meglep ı, hogy a biogáztermel ıdés mennyiségi és mi- nıségi viszonyait igen sok bels ı és küls ı tényez ı befolyásolhatja, amire a mesterséges rendszerek üzemeltet ıinek mindenkor tekintettel kell lennie. Az alábbiakban röviden átte- kintjük a mesterséges biogáztermeltetés néhány lényeges aspektusát. Kiindulási szubsztrát tekintetében minden olyan szerves anyag szóba jöhet, melynek molekuláris strukturájához a hidrolizáló organizmusok enzimei hozzáférnek, illetve amely- nek elemösszetétele kielégíti a baktériumok anabolizmusának szükségleteit. Hozzáférés szempontjából csak az er ısen fásodott anyagokat zárhatjuk ki a sorból, az elemösszetétel igénye pedig csupán további feladatokat és költségeket ró az üzemeltet ıre, hiszen megfelel ı anyagkeverést követ ıen megoldható az önmagukban rossz tápelem-arányú nyersanyagok

23 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS együttbontása (Mata-Alvarez és mtsai. 2000). Tapasztalatok alapján irányadóként C:N:P:S = 600:15:5:1 arányban szokták megállapítani a f ı tápelemösszetételt (Weiland 2010). Ez – a legtöbb figyelmet igényl ı – C:N arány tekintetében 40:1 arányt jelent, bár más források 20-30:1 arányt javasolnak (Yadvika és mtsai. 2004) azzal a megkötéssel, hogy a szén nagy százaléka könnyen bontható frakcióban legyen jelen. Pontos érték már azért sem jelölhet ı meg, mert tapasztalatok szólnak amellett, hogy a szükséges C:N-arány függ pl. a h ımérsék- lett ıl (Yadvika és mtsai. 2004), ráadásul a N-mennyiségnek inkább a szénvázak bontásából nyert energiával kell arányban állnia (hiszen a szén anyaga nagyrészt nem a felépül ı bakte- riális biomassza, hanem a távozó CH 4 és CO 2 részévé válik), az energianyereség értéke pedig függ a különböz ı energetikájú anyagcsereutak mindenkori részvételi arányától, a kilép ı CH 4-CO 2 arányától stb. A túl kevés nitrogén a baktériumok min ıségi éhezéséhez vezet, a túl sok ugyanakkor a felesleg ammónia formájában való feldúsulásához, minthogy pedig ez pH-módosító és a baktériumokra nézvést gátló hatású lehet mind a hidrolizáló, mind a metanogén baktériumok szintjén, igen sok problémához vezet (Mata-Alvarez és mtsai. 2004, Vigneron és mtsai. 2007). A baktériumok számára kisebb mennyiségben egyéb tápelemeket is biztosítani kell. Ilyen például a nikkel, mely a metánképzésben részt vev ı

F430 koenzim (Weiland 2010) vagy a NiFe hidrogenázok (Thauer és mtsai. 1994) prosztetikus csoportjaként fontos, a molibdén a formil-metanofurán-dehidrogenáz kofaktoraként, a kobalt, amely az ugyanott szerepl ı korrinoid faktor (5- hidroxibenzimidazol-kobamid) felépítésében vesz részt (Thauer és mtsai. 1994). A szelén, molibdén és volfrám szerepe nem minden részletében tisztázott még, de egyes metanogén szervezetek igénylik ezeket is mint kofaktorokat. Míg ezek az elemek körülbelül 0,05 mg/l koncentrációban kell csak jelen legyenek, a vas jelenléte 1-10 mg/l koncentrációban szük- séges (Bischoff 2009), többek közt a metanogenezisben szerepl ı vas-kén proteinek nagy száma miatt. Kalcium és magnézium adagolásával ugyancsak sikerült már metánkihozatalt növelni, ráadásul a habzás fékezésében is jótékony hatásúak (Yadvika és mtsai. 2004). Kiindulási nyersanyagként els ısorban olyan hulladékok kerülnek szóba, mint kommuná- lis szennyvíziszap, vágóhídi hulladékok, állattenyésztésb ıl származó s őrő és híg trágya, kommunális hulladék szerves frakciója, gabonaszalma, kukoricaszár és -csutka, halgazda- ságok iszapja, gombahulladék, kávébab-héj, f őkaszálék vagy külön erre a célra termelt energianövények, mint a cukor- és takarmányrépa, tritikálé, cirok, energiafüvek stb. (Mata- Alvarez és mtsai. 2000, Weiland 2010). Bár a legkönnyebben bontható, és legjobb metán- arányú biogázt adó nyersanyag a kommunális szennyvíziszap, amelyet a trágya majd a nö- vényi hulladék követ, a biogázágazatban a legnagyobb hányadot az energianövények adják Európában (Weiland 2010). A f ı kategóriák megoszlását Németországban, mint a legna- gyobb jelenlegi biogáztermel ı államban a II/7. ábra mutatja.

24 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

trágya 24% energianövények 59% szennyvíz/ -iszap 5%

települési hulladék 3%

ipari hulladék 2% tájrendezési szemétlerakók hulladék 2% 2% aratási hulladék 3% II/7. ábra. A biogáztermelés nyersanyagkategóriáinak megoszlása Németországban, mint a legnagyobb jelenlegi biogáztermel ı államban (Weiland 2010).

A tápanyagösszetételt ıl nem választható el az anyagok hozzáférhet ısége az enzimek számára. Az aprítás, bár energiaigényes, a nagy fajlagos hozzáférhet ıségi felület miatt le- csökkenti az optimális metánkihozatalhoz szükséges tartózkodási id ıt, amely – bár szubsztrát, üzemi h ımérséklet és egyéb körülmények alapján 10 naptól több hónapig ter- jedhet – fontos gazdasági tényez ı minden biogázüzem esetében (Weiland 2010). Ebben tehát optimumkeresés javallott. Érdekes, hogy a darabos adalékanyagok akkor is növelhetik a metántermelés hatékonyságát, ha fajlagos felületarányuk nem jelent ıs: ha a felület ad- szorbensként viselkedik, lokálisan olyan magas anyagkoncentrációk kialakulását segíti el ı, mely jótékonyan hathat a baktériumok szaporodására (Yadvika és mtsai. 2004). Mechani- kus aprítás mellett gyakran alkalmazzák a kémiai (alkalikus bontás NH 4OH-dal, NaOH-dal) és/vagy biológiai el ıkezelést, mely utóbbi lehet aerob vagy anaerob természet ő bakteriális el ıemésztés is (Mata-Alvarez és mtsai. 2000), vagy enzimadalékokkal való kezelés (Taherzadeh és Karimi 2008). Az optimális tartózkodási id ı (általában kb.10-100 nap), mint már említettük, alapvet ıen függ a kiindulási szubsztrát anyagi min ıségét ıl, és fizikai frakciómegoszlásától. Könnyen bontható szerves szubsztrátok esetén a lebomlási idı akár néhány órás is lehet, a tartózko- dási id ı azonban mégsem lehet ekkora egy kevert reaktorban, mivel ennyi id ı alatt a lassú szaporodású anaerob baktériumok kimosódnak a rendszerb ıl. Hogy ezt elkerüljük, a tartóz- kodási id ınek a leglassabban szaporodó közösségalkotó generációs idejének kb. tízszerese kell legyen 3. Híg szubszt-rátok esetén ezért megoldást jelentenek a rögzített biofilmes reak- torok, amelyekben egy nagy felület ő inert hordozó felületén, él ıbevonat formájában vannak

3 www.vki.ejf.hu/letoltes/219/szabadon//anaerob_szennyviztisztitas.pdf

25 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS jelen a baktériumok, s a szubsztrát oldata áramlik folyamatosan, nagy felületen érintkezve velük (Peters és Alleman 1983). Általános tapasztalat, hogy a reaktortartalom kevertetése javítja a metánkihozatalt, amit üzemi és félüzemi méretekben általában motorikus meghajtású propellerek, kever ı- vagy kaparólapátok oldanak meg. Híg szubsztrátok (pl. szennyvíz) anyagainak lebontásakor egyéb konstrukciós lehet ıségek is adódnak, mint például a recirkuláltatott gáz buborékai által keverésben tartott (gas-lift) reaktorok (Beeftink és Staugaard 1986, Sáez és mtsai. 1998) vagy a az UASB (Upflow Anaerobic Sludge Bed) reaktorok, ahol az alulról felfelé áramló, a képz ıdı bakteriális flokkulumok ülepedési sebességével egyensúlyt tartó szubsztrát, valamint a képz ıdı biogáz buborékai keverik finoman a biológiailag aktív iszap rétegeit (MacLeod és mtsai. 1990, Lier és mtsai. 1992.). Saját tapasztalatunk szerint ugyan híg szubsztrát (s őrített szennyvíziszap) esetén batch rendszer ő (szakaszosan táplált) reaktor esetén és kis méretléptékben nem befolyásolja negatívan a gázhozamot a kevertetés hiánya, belátható, hogy a diffúziós anyagáramlást nehezít ı viszkózus vagy darabos szubsztrátok esetén, illetve folyamatos táplálású reaktorokban, ahol a heterogén áramlási viszonyok miatt kialakuló pangó folyadékterek ronthatják a hatásfokot, valamilyen szint ő kevertetés elen- gedhetetlen, hogy a baktériumsejtek környezetében ne merüljön ki, t ılük távolabb pedig ne maradjon emésztetlen a szubsztrát. Fontos tényez ı a szubsztrát víztartalma. A metánprodukció mindig nagy víztartalom mellett optimális, 90% alatt általában csökkenés tapasztalható a metántermelésben. A kü- lönféle szubsztrátok azonban jellegzetesen különböznek ebbéli optimumukban is (Mata- Alvarez és mtsai. 2000, Khalid és mtsai. 2011). A magas víztartalom a kirothasztott anyag utóéletében okozhat kezelési nehézségeket. Az üzemi h ımérséklet a biogáztermelés egyik kulcstényez ıje, amennyiben a baktériális közösségek összetételét a szubsztrát tulajdonságaitól függetlenül is meghatározza tagjainak élettani optimuma erre a változóra nézve. Mint az ısbaktériumok között általában, a metanogének között is jellemz ıek a széls ıséges h ımérsékleti optimumok. A 98 °C-on op- timumot mutató, de még 110 °C-on is növekv ı hipertermofil Methanopyrus kandleri tıl (Kurr és mtsai. 1991) a szibériai permafrost üledékek -6 °C-on is aktivitást mutató pszichrofil metanogén izolátumaiig (Wagner és mtsai. 2007) széles a skála. A világon m ő- köd ı mesterséges biogáztermel ı rendszerek többsége 30 és 40 °C közötti mezofil h ımér- sékleten üzemel, és hogy ennek inkább oka vagy következménye az, hogy többet tudunk a mezofil közösségek összetételér ıl, nehéz eldönteni. Az azonban szembeötl ı, hogy a pszichrofil közösségek és reaktorfolyamatok kimondottan elhanyagolt területei a vizsgáló- dásnak, noha üzemelnek reaktorok ilyen h ımérsékleten (30 °C alatt). (Kashyap és mtsainak. 2003-as összefoglaló munkáját a pszichrofil biometanációról az elmúlt tíz évben

26 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

98-an idézték, ami nem mondható soknak annak fényében, hogy ez az egyetlen összefogla- ló munka a sz őkebb témában, míg például Weiland 2010-es általános összefoglalóját 202- en idézték az elmúlt három évben). Az okok közül talán azt lehetne kiemelni, hogy a pszichrofil folyamatok lassabban zajlanak, másfel ıl pedig általános tapasztalat szerint az 55 °C körüli optimumon m őköd ı termofil folyamatok instabilabbak, 50 °C fölött az ammónia toxicitása kifejezettebb, és az üzemi h ımérséklet tartása is plusz energiaráfordítást igényel (Khalid és mtsai. 2011). Bár utóbbival kapcsolatban Weiland (2010) megjegyzi, hogy a kombinált rendszer ő, h ı- és villamos energiát is termel ı telepeken általában h ıtöbblet- termelés van, ami használható volna a reaktorok továbbf őtésére is. İ is elismeri azonban, hogy a lakossági f őtésrendszerek általánosabb rácsatlakozása e telepekre, illetve a biogáz esetleges rávezetése a földgázhálózatra újra visszavetheti a termofil reaktorok energiahaté- konyságát. Fontos el ınye azonban a termofil reaktoroknak a gyors anyaglebontás, valamint a patogén mikroorganizmusok jóval hatékonyabb eliminációja (Sahlström 2003, Weiland 2010), amely a kirothasztott végtermékek elhelyezését teszi biztonságosabbá. További ok lehet, hogy ismereteink szerint a szulfátredukáló baktériumok növekedési optimumh ımérsékletük alapján jellegzetesen két csoportra oszlanak, mezofil (20-40 °C) és termofil (60-70 °C) csoportra (Sonne-Hansen és mtsai. 1999). Minthogy a termofil csoport optimuma fölötte van a termofil metanogének optimumának, 55 °C környékén kevésbé számíthatunk kiélezett hirdogénkompetícióra. Mind a mezofil, még inkább a termofil kö- zösségek igen érzékenyek a h ımérsékletingadozásra ami a metánprodukció stabilitását ille- ti, ezért precíz h ımérsékletszabályozásra van szükség a reaktorokban (Yadvika és mtsai. 2004), szerencsés körülmény azonban, hogy mindkét közösségtípus könnyen regenerálódik akár hosszabb és komolyabb h ımérséklet-eltolódások után is (Ahn és Forster 2002). Végül a pH igen fontos paraméter, mivel a metanogének e tekintetben sz őkt őrés őek. A metanogén rendszerek pH optimuma 7 és 8 közé esik, 6 és 8.5-ös pH alatt illetve felett már drasztikusan csökken a metántermel ıdés. Savanyodás könnyen bontható szubsztrátokkal való túltáplálás következtében állhat be könnyen a feldúsuló illósavak miatt, illetve túlzott nitrogénterhelés esetén a felszaporodó ammónia növelheti a pH-t. Megfelel ı szubsztrátkeverés és -adagolás, továbbá puffer és adalékanyagok (pl. mész) hozzáadása biztosíthatja a kiegyensúlyozott pH-t. Mivel a primer fermentálóknak nem feltétlenül esik egybe az optimuma a szekunder fermentáló szervezetekével és metanogén baktériumokéval se a pH, sem a h ımérséklet tekintetében, gyakran alkalmazzák a kétfázisú biogázszintézist, ahol két egymást követ ı lépcs ıben, elkülönített és más körülményeket biztosító reaktorok- ban zajlik az illósavak szintézise illetve a szinrófiában megvalósuló metanogenezis (Parawira és mtsai. 2005, Weiland 2010).

27 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

II. 6. A biogáztermel ı közösségek mikrobiológiai vizsgálómódszerei

II. 6. 1. A módszercsoportok általános és történeti áttekintése Áttekintésem el ızı fejezetében reményeim szerint sikerült meggy ızıen bemutatnom, hogy a biogén metán el ıállása – akár természetes, akár mesterséges körülmények között is történik – mindig egy-egy igen komplex mikrobiológiai rendszer alrendszereinek magas szinten összehangolt m őködésén alapszik. Nem véletlen tehát, hogy a mikrobiológia tudo- mánya mindig is nagy figyelmet szentelt ezeknek a mikrobiális rendszereknek, és lehet ısé- geinek arányában minden eszközével vizsgálati körébe vonta azokat. A fentiekben beveze- tett történeti szemlélettel tekintem át a mikrobiológiai módszercsoportokat az alábbiakban. Vizsgálhatóság tekintetében a metántermel ı közösségek természetesen kevéssé számítanak speciálisnak az egyéb mikrobiális közösségtípusok között, így vizsgálómódszereik köre és története sem választható el azokétól. Ahol mégis, ott azt külön kiemelem. A mikrobiális kutatások történetén szinte a kezdetekt ıl végighúzódik egy finom törés- vonal a vizsgálódás statikus, egy-egy organizmusra önmagában, és egy dinamikus, az orga- nizmusokat egymás és abiotikus környezetük viszonyrendszerében vizsgáló ökológiai fó- kusz között. A másodikat egy lépéssel általában megel ızi az els ı fajta a kutatás frontvona- lán, hiszen ennek kellett kitermelnie azokat az alapismereteket, melyeket a másik szemlé- letmód aztán rendszerbe foglalhatott, illetve mert ez a szemlélet áll talán közelebb az orvosi mikrobiológiához, amely tudományfinanszírozási okokból mindig is húzóágazat volt a diszciplínán belül. Ez a kett ısség – noha a két irányzat viszonya általában nem verseng ı, hanem megtermékenyít ıen kooperatív – nézetem szerint jól tetten érhet ı a mikrobiológia tudományának mai arculatán is, ahogyan már a kezdetekkor is megmutatkozott. A XIX. század második felében jelent meg a Robert Koch nevével fémjelezhet ı, és a mikrobiológia módszertanát majd egy évszázadra megalapozó módszertan, mely alapvet ıen szilárd tápta- lajon, izoláltan kinövesztett tiszta tenyészetek élettani, mikroszkópos és állatkísérletes vizs- gálatán alapult. A XX. század elején zárkózott fel e mellé a Szergej Vinogradszkij megala- pozta ökológiai szemlélet ő irányzat, mely kevert mikrobiális kultúrák bels ı kölcsönhatás- okban megnyilvánuló törvényszer őségeit kutatta. (Lechevalier és Solotorovsky 1965, Penn és Dworkin 1976). A mikrobiológia fejl ıdését az 1970-es évekig lényegében e meglév ı technikák tökélete- sedése és az ismeretek gyarapodása jelentette. Egyre inkább gátjaivá váltak azonban a to- vábbhaladásnak a bizonytalan határozóbélyegek (pl. a telep- illetve sejtmorfológia és egyéb fenotípusos tulajdonságok) valamint a nem vagy csak igen nehezen kitenyész ı baktériumok mind szembeötl ıbben nagy száma. Az ökológiai szemlélet létjogosultságát (és a módszer- tani újítás általános igényét) egyébként tán nem is jelzi más jobban, mint a Methanobacillus

28 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS omelianskii fed ınéven három évtizeden át inkognitóban él ı szintróf együttélés Barker labo- ratóriumában. A bakterológiai vizsgálatok mennyiségi következtetéseinek kérd ıjeles volta így is csak az 1980-as évekre vált megkerülhetetlenné, amikor is nagyságrendi különbségek mutatkoztak meg a direkt mikroszkópos sejtszámláláson és a hagyományos, tenyésztéses telepszámláláson alapuló módszerek eredményei között. Ez a jelenség Staley és Konopka (1985) kifejezésével „nagy telepszámlálási anomália” ( the great plate count anomaly ) né- ven híresült el. Különféle becslések eredményei alapján kimutatták: talajmintákból él ıhely- tıl függ ıen a baktériumoknak csak mintegy 0,1-1 %-a tenyészthet ı ki (Torsvik és mtsai., 1990), míg egyes vízi él ıhelyekr ıl 4-6 nagyságrendes különbséget is kimutattak (Grimes és mtsai., 1986). Metántermel ı közösségekr ıl ugyancsak születtek a tenyésztéses technikák elfogultságát elemz ı publikációk (Wagner és mtsai. 1993). A hagyományos lemezöntéses telepszámlálás inkubációs ideje alatt akaratlanul guild-szelekciót provokál a kutató, hiszen a mintázott él ıhelyét ıl eltér ı körülményeket teremtve azokat a közösségalkotókat juttatja szaporodási el ınyhöz, amelyeknek az új körülmények felelnek meg. Így tehát az eredeti él ıhelyen passzív, dormans alakban nyugvó mikrobák akár dominánsnak is mutatkozhatnak a tenyésztés végén, míg az eredeti domináns csoport esetleg meg sem mutatkozik. Termé- szetesen minél jobban hasonlítanak a tápközegbeni körülmények az él ıhelyihez, annál gyengébb az eredménytorzulás, így ezen a területen is el ınyt élveztek azon kutatások, me- lyek vizsgálati területeinek baktériumai jól tenyésznek az egészségügyi vizsgálatok számára nagy ráfordítással fejlesztett különféle univerzális, dúsító vagy szelektív táptalajokon. Ezen aerob vagy mikroaerofil organotróf baktériumokéval szemben döcög ısen haladhatott az olyan él ıhelyek benépesít ıinek tenyésztésalapú kutatása, mint a rothasztók szintróf kapcso- latokban gazdag anaerob közege vagy tiszta vizek és az oligotróf területek. Bár semmilyen él ı baktérium mesterséges tenyésztése nem jelent elvi lehetetlenséget, a természetes habitatok lehetséges életkörülményeinek sokféleségét lefed ı táptalajkészlet kidolgozása gyakorlatilag lehetetlen. Ennek ellenére máig folynak módszerfejlesztések új és új mikro- bák tenyésztésbe vonására oligotróf környezetet tükröz ı természetes vagy kis tápanyagtar- talmú táptalajok, növekedési faktorok, mesterséges gradiensek, diffúziós technikák stb. segítségével (Cappuccino és Sherman 2010). Sajnos azonban a tenyésztéses technikák mind id ı-, munka- és költségigényes módszerek, így nagy mintaszámú vizsgálatokban alkalmaz- hatóságuk korlátozott. Ennek ellenére használatuk és fejlesztésük megkerülhetetlen feltétele a mikrobiális ökológia haladásának is, hiszen tiszta tenyészetek alapján juthatunk ahhoz az alapvet ı ismeretkészlethez, melyre minden más módszer kidolgozásában és/vagy eredmé- nyeinek értelmezésében támaszkodnunk kell (Nichols 2007). A XX. század második felében tehát megérett a helyzet a guildszelekció lehet ıségét ki- kerül ı, tenyésztést ıl független vizsgálati módszerek térnyerése el ıtt, s a tudományos és

29 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS technikai fejl ıdés el ıretörése egyaránt szerencsésen találkozott ezzel az igénnyel. A mikro- biológia mindinkább megpróbál a mikrobák által in situ hagyott „nyomok”: kémiai mar- kermolekulák, különösképpen pedig információs „arculattal” rendelkez ı nukleinsav- markerek alapján tájékozódni a mikrobális közösségekr ıl. Els ıként a közösségi DNS egészét kezdték vizsgálni olyan módszerekkel, mint a közös- ségek teljes DNS-készletének kereszthibridizációja ( total genomic cross-DNA hybridization ), a denaturált DNS reasszociációs kinetikájának vizsgálata ( Thermal denaturation and reassociation of whole extracted DNA ), vagy a G+C arányon alapuló sőrőséggradiens alapú összehasonlítás (Ranjard 2000). Hamarosan azonban kiemelt jelent ı- ség ő felismeréssé vált a filogenetikai leszármazás történetér ıl információt ırz ı kronométer- szekvenciák használhatósága mind a baktériumok identifikációjában mind a determináció- ban, ami elvezetett a genomméret alatti vizsgálódás igényéhez. Els ıként a citokróm-c fehér- je aminosavszekvenciájának vizsgálata kezd ıdött el, ám ezt közösségvizsgálatokban sosem alkalmazták. Ezt – els ısorban Carl Woese munkássága nyomán (Woese 1987) – rövidesen felváltotta az (eltér ı sebességgel változó régióik folytán különböz ı mélység ő filogenetikai viszonyokban is használható és univerzálisan el ıforduló) riboszomális RNS-gének bázis- sorrendjének használata (Sipos 2009), ezek közül is els ısorban a 16S rRNS-géné. Woese még a különálló rRNS molekulák kinyerésével jutott vizsgálati anyaghoz, ám ezekben az években indult hódító útjára Kary B. Mullis találmánya (1986), a polimeráz láncreakció (PCR), amivel a DNS célzott szakaszának vizsgálata is rutinszer ővé válhatott, s mind a citokrómok, mind az RNS-ek vizsgálata jórészt génjeik szintjén folytatódhatott. Megnyílt továbbá az út a funkciógének kimutatásához is, felgyorsulhatott a nukleinsav-próbák hibri- dizációján alapuló kimutatási technikák pl. a FISH ( fluoreszcens in situ hibridizáció ) fejl ı- dése (Wagner és mtsai. 1994), és a Sanger-féle DNS-szekvenálási eljárás is új alapokra helyez ıdött. A teljesgenom-vizsgálatoknak ugyan máig megvan az alkalmazási területük, és más amplifikációs technikák is napvilágot láttak a PCR-en kívül (pl. Multiple displacement amplification – MDA ; Dean és mtsai. 2002), mégis a PCR-alapú DNS- amplifikátumok vizsgálati köre indult robbanásszer ő fejl ıdésnek. Egyrészt lehet ıvé vált a génspecifikus közösségi klónkönyvtárak rutinszer ő létrehozása, mely önmagában is felfog- ható elválasztástechnikai és amplifikációs technikának, másrészt a közösségi szint ő DNS- ujjlenyomatmintázatok kinyerése lehet ıvé tette az egyes közösségek gyors összehasonlítá- sát, egyes módszerek esetében pedig taxonómiai információ közvetlen kinyerését is azok- ból. A közösségen belüli filogenetikai diverzitás mellett a funkcionális diverzitás feltárását a különböz ı gének közösségi expressziós mintázatát megmutató RNS-alapú vizsgálati mód- szerek teszik lehet ıvé. A tisztított RNS molekulákról reverz transzkriptáz enzimekkel in vitro DNS-másolat (cDNS) készül, melynek további vizsgálata a DNS-mintákéhoz hason-

30 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS lóan folytatódik. Legelterjedtebben az univerzális primerekkel felszaporított 16S rRNS gé- nek változatosságát elemzik, ezen a példán is vehetık sorra a legelterjedtebb közösségvizs- gálati módszerek. A DNS alapú ujjlenyomat-módszerek között némiképp önkényes felosztással elkülönít- hetünk olyanokat, amelyek az amplifikált DNS-szakaszok (vagy azok származékainak) mérete alapján rendezik ezeket mintázatba általában agaróz vagy poliakrilamid gélelektroforézissel. Az amplifikált szakaszok természetes hosszpolimorfizmusának elektroforetikus elemzésén (Length Heterogeneity PCR) túl méret szerint rendez az ARDRA ( Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ), a T-RFLP ( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism ), a riboszomális gének közötti spacer-régiók er ıs hosszpolimorfizmusát feltáró RISA ( Ribosomal Intergenic Spacer Analysis ), vagy a ma már ritkábban használt RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA ) (Muyzer 1999). Az emésztéses, random, vagy spacer régiókat elemz ı módszerek közös vonása, hogy további filogenetikai elemzést nem vagy csak igen korlátozottan tesznek lehet ıvé, ám pl. az ARDRA és a T-RFLP a klónkönyvtárak és közösségi ujjlenyomat-mintázatok összeegyez- tetését nagyban segíthetik. A felszaporított közösségi génszakaszon belüli szekvenciális eltéréseket tárják fel a DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ) a TGGE ( Thermal Gradient Gel Electrophoresis ) az SSCP ( Single-Stranded Conformational Polymorphism ) vagy a biszbenzimid-polietilénglikol (Bb-PEG) elektroforézis. Hátrányaik között szerepel a mérési körülményekre való nagyfokú érzékenység, a hatékony elválasztást illet ı amplikon- méretkorlát és egyéb hibalehet ıségek (Muyzer 1999, Ranjard 2000). El ınyük viszont, hogy az elektroforézist követıen a sávok jelölt próbákkal azonosíthatók, vagy a gélb ıl kivágva tovább vizsgálhatók, szekvenálhatók stb. Így igen jól lehet becsülni a mintázat egyes elemei termel ıinek taxonómiai helyét. A felsorolás korántsem teljes, egyrészt mivel csak a legelterjedtebb eljárásokra szorítko- zott, másrészt mivel mind a mai napig születnek új és új technikák. A nukleinsav alapú ujj- lenyomat-módszerek és a klónkönyvtárak a mikrobiális közösségelemzés egyik leghatéko- nyabb jelenlegi módszerkörét adják, ugyanakkor hibáik is számosak. Az egyik f ı problémát az okozza, hogy a PCR-t és a mikrobiális ökológiában alkalmazott módszerek jelent ıs há- nyadát eredetileg az orvosi diagnosztika céljaira fejlesztették ki, így specifikus kimutatások- ra és ebb ıl adódóan egyféle rendszerre, egyféle templátra dolgozták ki, például a DGGE módszert egy szervezet egyetlen génjének pontmutáció-detektálására (Sipos 2009). A kö- zösségelemzésre való optimálásra való törekvések folyamatosak, az ökológiai szemlélet ő kutatatás azonban itt is elszenvedi a lépéshátrány következményeit. A másik komoly nehéz- séget a DNS in vitro kezelésében rejl ı olyan csökkenthet ı, de teljes mértékben kikerülhetet-

31 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS len hibalehet ıségek jelentik, mint a preferenciális amplifikáció a PCR (Sipos és mtsai. 2007) vagy a preferenciális ligálás a klónozóvektorok esetében (Palatinszky és mtsai. 2011). A preferenciális amplifikáció legszéls ıségesebb példája, amikor egy mismatch a primer 3’- végi pozíciójában a templát amplifikációjának teljes elmaradásához vezet (Ishii és Fukui 2001), de ha máshol is van, minél közelebb helyezkedik el a 3’ véghez, annál nagyobb mér- tékben jelentkezik a preferenciális amplifikáció. A PCR alapú eredmények mennyiségi tor- zulásához hozzájárulhat pl. a közösségalkotó mikrobák rRNS-operonjainak számában mu- tatott különbség, vagy az operonok közötti heterogenitás egyazon genomon belül (Crosby és Criddle 2003). Igen fontos végül a közösségi génszakaszok felszaporítására használt uni- verzális primerek problematikája, hiszen ezek az univerzálisnak szánt próbákat a már ismert baktériumok célgénjeinek konszenzusszekvenciáihoz tervezik meg, ezek pedig körülbelül azt a bizonyos 1%-át teszik ki az összes becsült taxonnak. A PCR tehát ab ovo el ınyben részesíti a már leírt taxonok képvisel ıit és közeli rokonaikat. (Ez igen határozottan támaszt- ja alá azt, amit a tenyésztésen alapuló fajleírások megkerülhetetlenségér ıl fentebb írtunk.) Ennél fogva az amplifikáción átesett mintákból származó eredmények mennyiségi vonatko- zásban szemikvantitatívnak mondhatók. Az RT-PCR ( Real Time PCR ) technika ugyan jó- val pontosabban adja vissza a kiindulási minta mennyiségi viszonyait, itt azonban pontosan meghatározott célszervezetek mennyiségi arányainak magállapítása lehetséges csak, közös- ségfeltárásra nem nyílik lehet ıség. A tejesség kedvéért érdemes néhány szót ejteni az új generációs, nagy átereszt ı képessé- gő DNS-szekvenálási módszerekr ıl, melyek jelenleg rohamosan terjednek a biológiai kuta- tásokban, s a közösségmikrobiológia is kezdi felvenni eszköztárába ezeket. Jóllehet ezeket a módszereket is genetikailag kis variabilitást mutató szövetminták és tiszta tenyészetek vizs- gálatára tervezik és optimalizálják, a közösségi genomvizsgálatokhoz is nyújtanak ígéretes perspektívát. Az emulziós mikroreaktorokban vagy mikrotiter-lemezeken megvalósuló klonális PCR-ek sokasága kiválthatja a munkaigényes klónkönyvtárkészítést, valamint mi- vel célgének korlátozott hosszúságú szekvenciái helyett egész génkontigokat mutathatunk ki a közösségekb ıl, elvben funkció is rendelhet ı lehet a közösségalkotókról nyert taxonó- miai információkhoz pusztán DNS-alapon is. Az átfedı genomrészletek óriási számítási kapacitással való elillesztésén alapuló módszerkörnek sokáig korlátjaként t őnt föl az egy- szeri leolvasások lehetséges maximális hossza, ami a közösségi genomok kuszaságában való eligazodáshoz kulcsfontosságú kritériumnak látszik. A Roche 454 rendszer jelen dol- gozat írásakor azonban már közelíti az 1000 bázispáros leolvasási hosszok lehet ıségét, amivel a hagyományos PCR reakciók és az ezen alapuló szekvenálási eljárások leolvasási hatékonyságát közelíti jóval nagyobb számú egyszerre kezelt minta és rövidebb futásid ık mellett. Kérdés ugyanakkor, hogy a most még csak feltárulni látszó óriási lehet ıségek me-

32 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS zején milyen problémák, el ıre nem látott bizonytalanságok és módszertani korlátok buk- kannak majd el ı a közösség-mikrobiológiai alkalmazás terén, s önmagában kérdés lehet az is, hogy meddig és milyen széles körben engedhetik meg maguknak az ipari társadalmak az ekkora beruházásokat igényl ı high-tech tudomány finanszírozását… Ezért korai volna még takarodót fújni a közösségvizsgálatok napjainkig használt „hagyományos” ujjlenyomat- módszereinek – még ha ezt egyes nyugati m őhelyekben meg is teszik. A fejleszt ık által is gerjesztett tudományos optimizmus hangjai mellett óvatos, s ıt szkeptikus véleményeket is hallani lehet a tudományos közösségben, a módszerfejl ıdés jelen üteme mellett ugyanakkor senki nem fogalmaz még meg karakán állításokat a jöv ı lehet ıségeit és korlátait illet ıen. Noha a mikrobiológiai háttérkutatás napjainkban hangsúlyosan a nukleinsav alapú mo- lekuláris biológia módszereire támaszkodik, ezek robbanásszer ő fejl ıdése sem oldotta meg a tudományág egyik klasszikus nehézségét, mely szerint nincsen olyan, önmagában jól ki- ragadható egyetlen bélyeg, amely alapján egy baktérium egyértelm ően és megnyugtatóan identifikálható lenne. Ezért célszer ő egyszerre több fenotipikus bélyeget figyelembe venni a fajleírások során. Így terjedt el a több párhuzamos vizsgálati módszerrel egyszerre dolgozó polifázikus taxonómia szemléletmódja az identifikációban és determinációban. Még inkább jelentkezik ez a nehézség a közösség-mikrobiológiában, ahol tiszta tenyészetek helyett egymástól fizikailag izolálhatatlan csoportok keverékével kell dolgoznunk, s ezeket közös mintákból kiindulva kell megkülönböztetnünk egymástól. Éppen a PCR alapú technikák mennyiségi viszonyok feltárásában mutatott bizonytalansága húzza alá a tenyésztést ıl és amplifikációtól egyaránt független módszerek fontosságát, amelyek közül a közösség- mikrobiológiai vizsgálatokban a kemotaxonómia adaptált módszerei a legelterjedtebbek. A kemotaxonómiai módszerek választásának legfontosabb indoka annak felismerése, hogy ez a módszerkör ígéretesen szolgálhatja a nukleinsav-alapú módszerek alapján nyert informá- ció értelmezését, s ıt mennyiségi viszonyok tekintetében azoknál megbízhatóbb információt ad.

II. 6. 2. Kemotaxonómia a közösségvizsgálatokban A kemotaxonómia a változó szekvenciával vagy szerkezettel rendelkez ı biológiai poli- merek illetve molekulák sokféleségét elemz ı, s azt a rendszertan illetve a meghatározás területén felhasználó biológiai segédtudomány. A varlábilis molekulák adta mintázatok termel ıikre specifikus voltát el ıször a növény- rendszertan területén kezdték kihasználni (Wiertelak 1931, Hawksworth 1976, Vaughan és Denford 1968, Harborne és mtsai. 1971, Gibbs 1974), és az új megközelítési mód gyorsan terjedt a botanikán kívül a mikrobiológia területén is (Gorin és Spencer 1970, Lechevalier 1977, Minnikin és Goodfellow 1981, Nahaie és mtsai. 1984). Eleinte ezen a területen is a

33 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS determináció és identifikáció területén használták ki a kémiai markereket mint rendszerezé- si szempontot nyújtó taxonómiai bélyegeket, de a parazitológia területén való felhasználás (Maazoun és mtsai. 1980) útján végül a közösségvizsgálatok eszköztárába is felvételt nyert e módszerkör (Höfle 1988, White 1988). Jóllehet a bakteriális kemotaxonómia számos markermolekulával dolgozik, ha tiszta tenyészeteket vizsgál (lipidek, sejtfal-aminosavak és szénhidrátkomponensek, proteinek), a közösségvizsgálatokban els ısorban a lipidfrakció foszfolipid-zsírsavainak és a respiratorikus kinonjainak használata terjedt el. Kis súllyal bár, de teret nyer az intakt foszfolipidek használata is a közösségfeltárásokban (Gehron és White 1983), és a teljes (nem csak membránalkotó foszfolipideket érint ı) észterlipid-frakció vizs- gálata is (Green és Scow 2000). Az Arcaea domén tagjainak éterlipidjei unikális jellegük miatt megbízható indikátorai az ısbaktériumok biomassza-mennyiségének, ám kis variabi- litásuk folytán finomabb közösségjellemzést nem tesznek lehet ıvé. További hátrányuk pre- parálásuk munka- és mérésük id ıigényes volta a Bacteria-zsírsavakéhoz és a kinonokéhoz viszonyítva (Gattinger és mtsai. 2003). A DNS- vagy fehérjealapú vizsgálómódszereknél kisebb felbontóképességük dacára e módszerek jelentısége növekedett a környezet- mikrobiológiában egyrészt a polifázikus szemlélet terjedése miatt, másrészt amiatt, hogy ezek javára írható kisebb költségvonzatuk, esetenként alacsonyabb id ı- és munkaigényük, továbbá az is, hogy amplifikációs lépés híján eredményeik torzítás nélküli leképz ıdései a mintában található abundanciviszonyoknak. A zsírsav és kinonvizsgálatok alkalmazhatósá- gának alapja a közösség-mikrobiológiában egyrészt viszonylag egyszer ő izolálhatóságuk, másrészt az a szerencsésnek mondható helyzet, hogy az eukarióta él ıvilág (leszámítva a gombákat) mindössze néhány kinont (koenzim-Q [Q10], plasztokinon, fillokinon [MK-4]) és kevés zsírsavat, els ısorban páros, 12-24 C-atomszámú monokarbonsavakat termel. (Bár növényi magvakban felhalmozódhatnak igen nagy koncentrációban „különleges” zsírsavak is [Millar és mtsai. 2000], ezek nem befolyásolják jelent ısen a módszerek környezet- mikrobiológiai alkalmazhatóságát.) A molekulavariánsok túlnyomó többségén ezzel szem- ben els ısorban a baktériumok, másodsorban a gombák osztoznak. Telített ubikinont például mindmáig csak gombákból írtak le, menakinonok pedig kizárólag prokariótákban fordulnak el ı (a fillokinont kivéve, mely azonban a bakteriális eredet ő növényi plasztiszok kinonja). A baktériumok világában azonban igen jelent ıs variabilitással szerepelnek e markermole- kulák (Collins és Jones 1981, Zelles 1999). A taxonómiai diverzitás mellett a funkcionális diverzitás kutatását is lehet ıvé teszik az izotópos technikákkal kombinált kemotaxonómiai módszerek, ahol C 13 tartalmú tápanyagok közösségbe juttatását követ ıen az azokat haszno- sító baktériumok markermolekuláiban lesz jelen az izotóp, ezek pedig tömegspektrometriásan elválaszthatók az anyagcsereaktivitást nem mutató, vagy más szubsztrátokon él ı közösségalkotók hasonló molekuláitól (Green és Scow 2000, Yao és

34 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

mtsai. 2012). Fiziológiai változások nyomon követésére speciális esetekben ugyancsak al- kalmas lehet a módszerkör, egyes közösségalkotók ugyanis körülményeiknek megfelel ıen módosíthatják zsírsav- és kinonprofiljukat is (Kieft és mtsai. 1994).

A zsírsavak a sejteken belül nagyon sok helyen, és változatos formában lehetnek jelen. A kemotaxonómiában markerként használt zsírsavak els ısorban a sejtek plazmamembránját felépít ı foszfolipidek alkotóelemei. Egy membránalkotó foszfolipid egy hidrofil fejb ıl és egy hidrofób láncrészb ıl áll. A fej egy glicerinmolekula, ami két zsírsavval és egy foszfát- csoporttal alkot észterkötést, a láncrész pedig általában a két, hosszú zsírsavláncból áll. A szénlánc általában 14-20 szénatomot tartalmaz, és a leggyakoribbak az egyenes láncúak, az egyszeresen telített (egy kettıs kötést tartalmazó), illetve az egy metil-csoportot tartalmazó változatai. A metil-csoport elhelyezkedése (izo vagy anteizo elágazás), és a kett ıs kötés elhelyezkedése taxonómiai jelent ıséggel bír (II/8. ábra). A baktériumok zsírsav-összetétele nemzetségre jellemz ı tulajdonság, ezen belül a fajok általában a zsírsavak arányában térnek el. Csoportosításukat, melyet a közösségvizsgálatokban alkalmaznak, az II/8. táblázatban láthatjuk.

Jelölés Elnevezés El ıfordulás, indikációs lehet ıség PLFA foszfolipid zsírsavak biomassza SATFA telített, észterkötés ő zsírsavak Bacteria, Eukaria - egyenesláncú Bacteria, Eukaria i, a, Me elágazó láncú Gram-pozitív baktériumok; szulfátredukáló baktériumok, Cytophíga, Flavobacterium, Actinobacteria -cy ciklopropil tartalmú Gram-negatív baktériumok, Clostridium, Bifidobacterium nemzetségek MUFA egyszeresen telítetlen észterkötés ő zsírsavak 16:1 ω6 16-os lánchossz, 1 kett ıs kötés a láncvégtıl a 6. helyen I-es típusú metanotróf szervezetek 18:1 ω6 18-as lánchossz, 1 kett ıs kötés a láncvégt ıl a 6. helyen I-es típusú metanotróf szervezetek 15-ös, 17-es lánchossz Szulfátredukáló baktériumok

PUFA többszörösen telítetlen észeterkötés ő zsírsavak Eukarya. cianobaktérium

PLOH észterkötés ő, hidroxi-szubsztituált zsírsavak α -OH a karboxilcsoport melletti 1. szénatom Gram-negatív baktériumok, Actinobacteria β -OH a karboxilcsoport melletti 2. szénatom Mycobacterium ω -OH a karboxilcsoportot követ ı utolsó szénatomon Gombák myl miklosavak ( β-hidroxi, α-elágazás) Actinobacteria

UNOH nem észterkötés ő, hidroxi-szubsztituált zsírsavak Anaerob baktériumok α -OH a karboxilcsoport melletti 1. szénatom Sphingomonas, Candida β -OH a karboxilcsoport melletti 2. szénatom Bacteroides, Flavobacterium myl miklosavak ( β-hidroxi, α-elágazás) Mycobacterium, Nocardia II/8.táblázat. A leggyakrabban el ıforduló zsírsavtípusok és jellemz ı termel ıik (Zelles, 1999)

Elnevezésük rendszere, bár kissé kaotikus, az alábbi alapvet ı szabályokat követi: az alapláncot mindig a szénatomok számával jelöljük, kett ıspont után pedig a szénlánc telített-

ségi fokát. Pl. C 18:0 – a 18 szénatomból álló, elágazás nélküli zsírsav, más jelöléssel 18:0. 18:2 – 18 szénatomból álló, elágazás nélkül zsírsav, amely két kett ıskötést tartalmaz. A

35 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS kett ıs kötések helyzetét számozhatjuk a láncvégt ıl, ilyenkor kis omegával jelöljük (18:2 ω9,12c – 18 szénatomból álló zsírsav, amiben két kett ıskötés van, a láncvégt ıl szá- mítva a 9. és 12. szénatomnál), de számozhatunk a karboxil-csoporttól is az izomertípus feltüntetésével (ilyenkor ugyanez pl. 18:2 c6 t9, ahol c cisz-, t pedig transz- helyzet ő elren- dez ıdést jelöl a kett ıs kötéseknél). Az izo- vagy anteizo elágazásokat „i” illetve „a” bet ővel jelöljük, a ciklopropil tartalom jele cy. Többek közt Gram-negatív baktériumok, gombák, aktinobaktériumok zsírsavai tartalmazhatnak OH- csoportot vagy csoportokat. Ennek a helyzetét (ha ismert) a görög abc bet őivel jelöljük (II/8. táblázat).A zsírsavak többségének van saját neve is, pl. 15:0 = pentadekánsav. Ez a rendszer azonban a gyakorlatban nehezen kezelhet ı.

II/8. ábra. A zsírsavak általános felépítése.

A kemotaxonómiai markermolekulák az organizmusok faji szint ő besorolására nem használhatók, de a közösséget alkotó csoportok nemzetség vagy magasabb taxonómiai egységek szintjén már gyakran elválnak egymástól a kinon- illetve zsírsavprofil alapján. A respiratorikus kinonok a baktériumok és eukariota sejtszervecskék membránkapcsolt elektrontranszport-folyamataiban részt vev ı proton- és elektronszállító vegyületek. Alapfelépítésük szerint egy egy- vagy többgy őrős kinoidális molekularészb ıl és az ezt szubsztituáló csoportokból állnak. Az utóbb említett csoportok közül az egyik, általában a kinon csoport 2. szénatomját szubsztituáló poliizoprén lánc teszi lehet ıvé a sejtmembránban való oldódásukat. Ez utóbbiak a láncokat felépít ı egységek száma, és telítettségi foka szerint változóak, és ez alapján kromatográfiásan elválaszthatók. Egy-egy mikrobafaj egy, esetleg két-háromféle kinont termel nagy mennyiségben (major kinonok),

36 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

és számos más felépítés ő minor kinont lényegesen kisebb mennyiségben. Jelölésük rendszere a következ ı: MK-val jelöljük a mena-, Q-val az ubikinonokat. (felépítésüket ld. II/9 . ábra) Ezt az izoprénegység száma követi. Telített láncú kinonoknál a telítettség fokát zárójelbe írva jelöljük (pl.: MK5(H2) – 5 izoprénegységb ıl álló oldallánccal rendelkez ı menakinont jelent, melynek oldalláncán egy eredetileg kett ıs kötés telített.) Ha ismert, akkor a hidrogenáltsági fok elé bekerülhet római számmal a telített izoprénegység pozíciója is. Ilyenkor a kinonrészt ıl indulva számozzuk az egységeket: MK5(II, III -H4) - ötös izoprénes menakinon, melynek a kinonrészt ıl számított második és harmadik izoprénegysége telít ıdött. A menakinonok variabilitása, így taxonómiai értéke is nagyobb a diverzitásvizsgálatokban. Míg a Gram-negatív baktériumoknál mind ubi-, mind menakinonok el ıfordulnak (s ıt, némely csoportjaik kinontípust válthatnak környezetük redoxpotenciálja szerint), addig Gram-pozitív csoportok esetében kizárólag menakinonok fordulnak el ı nagy variabilitással.

II/9.ábra. Kinonok általános felépítése

A II/9.a., b. és c. táblázatok összefoglalóan, bár a teljesség igénye nélkül mutatják gyakoribb ubi- és menakinontípusok el ıfordulását különböz ı mikrobanemzetségekben. Talajból lipideket el ıször az egyfázisú Bligh-Dyer módszerrel (Bligh & Dyer, 1959), majd ennek módosításával (White, 1979) vontak ki. A lipidextraktumból a foszfolipidek oszlopkromatográfiás módszerrel kitisztíthatók, majd átészteresítéssel zsírsav-metilészterek képezhet ık, melyek gázkromatográfiás módszerrel pontosan azonosíthatók. Ezt a módszert tökéletesítette Zelles és Bai (1993). Mégis sokan az els ı, egyszer őbb módszert használják kemotaxonómiai markerek extrakciójához. Az els ı zsírsav-alapú közösségi mintázatelemzések mez ıgazdasági talajok vizsgálatában nyertek teret (Zelles és mtsai. 1992; Klug & Tiedje, 1993; Reichardt 1997; Ibekwe és mtsai, 1998;). Bardgett és mtsai. (1997) eredményei szerint zsírsavanalízis alapján megkülönböztethet ık a legeltetett és nem legeltetett területr ıl származó talajok. Frostegård és mtsai 1993-ban eltér ı talajok nehézfémszennyezésének hatását vizsgálták e módszerrel. Mindkét típusú talajban csökkent

37 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS a Gram-pozitív, és n ıtt a Gram-negatív baktériumok zsírsavainak mennyisége a szennyezés hatására. A mikrobiális biomassza mennyisége egyértelm ő csökkenést mutatott mind a PLFA, mind az ATP mind a talajrespiráció alapú vizsgálatok szerint. Trinitro-toluolos talajszennyezés hatását PLFA-alapon vizsgálva Wilke és mtsai. 2004-ben azt találták, hogy a gombák és egysejt őek mennyisége csökkent, majd a szervesanyag-kezeléssel járó talajremediáció hatására lényegesen megnövekedett. kinon Gram-negatív baktérium ubikinon Q-6 Rhodopseudomonas Q-7 Shewanella Q-8 Burkholderia, Comamonas, Thiobacillus, Alcaligenes, Xanthomonas, Pseudomonas, Acinetobacter, Azotobacter, Aeromonas, Proteus, Enterobacter, Escherichia Q-9 Pseudomonas, Hyphomicrobium, Acinetobacter Q-10 Acidiphilium, Agrobacterium, Ochrobactrum, Sphingomonas, Methylobacterium, [egysejt ő-, növényi mitokondrium] Q-11 Legionella, Thiobacillus, Pseudomonas, Protomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Acetobacter, Hyphomonas Q-12 Legionella, Hyphomonas menakinon MK-5 Flavobacterium, Hyphomicrobium, Desulfobulbus MK-5(H2) Desulfobulbus MK-6 Cytophaga MK-6(H2) Desulfovibrio MK-7 Cytophaga, Flavobacterium, Flexibacter MK-8 Aeromonas, Proteus, Enterobacter, Escherichia II/9.a. táblázat. Kinonok, s az ezeket termel ı, talajokban megtalálható Gram-negatív baktériumnemzetségek (Collins, 1981; Fujie és mtsai., 1998a; World Data Center of Microorganisms 1995 alapján)

A respiratorikus kinonokat sokáig csak az anyagcseretípusok vizsgálatában és tiszta tenyészetek kemotaxonómiájában használták. Kinon alapú közösségvizsgálatról el ıször 1986-ban esik szó (Hedrick és White), s ez úttör ınek számít a kinon alapú kemotaxonómiában. Minninkin és mtsai. extrakciós módszertani kutatása (1984) segíti ıket. Hiraishi és mtsai. (1990) statisztikai módszerekkel elemezték az iszapok közösségi összetételét, sikerrel tettek különbséget az eltér ı kezelés ő iszapok között kinon alapon, és a hasonló származású mintákat kinonjaik alapján is hasonlónak találták. Ekkor fogalmazódott meg el ıször a kinonanalízis monitoring vizsgálatok terén való használhatósága. Fujie és mtsai. (1998) összefoglaló táblázatokat tettek közzé a kinonok talajmikróbákban való el ıfordulásáról. Szennyvíztisztító bioreaktorok mikróbaközösségeinek monitoring jelleg ő vizsgálata kapcsán érzékeny statisztikai változókat dolgoztak ki és teszteltek Hu és mtsai (1999a), emellett kisebb id ıigény ő kinontisztítási módszert is kidolgoztak (1999b), melyet kés ıbbi munkáinkban magunk is használtunk.

38 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS menakinon Gram-pozitív baktérium MK-6 Micrococcus MK-7 Bacillus, Thermoactinomyces, Micrococcus

MK-7 (H 2) Brevibacterium MK-8 Lactobacillus, Micrococcus, Rhodococcus

MK-8 (H 2) Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Rhodococcus, Nocardia

MK-8 (H 4) Janibacter, Nocardia, Nocardioides, Terrabacter

MK-8 (H 6) Streptomyces, Nocardiopsis, Actinomadura, Micromonospora MK-9 Arthrobacter, Clavibacter, Curtobacterium, Thermoactinomyces, Brevibacterium

MK 9 (H 2) Arthrobacter, Corynebacterium, Gordona, Mycobacterium, Amycolatopsis, Microtetraspora, Streptosorangium, Brevibacterium, Micrococcus MK 9 (H 4) Actinopla nes, Amycolatopsis, Cellulomonas, Micromanospora, Microtetraspora, Pseudonocardia, Saccharopolyspora, Saccharothrix, Streptosporangium, Actinomyces MK-9 (H 6) Streptomyces, Actionomadura

MK-9 (H 8) Streptomyces, Actionomadura, Catenuloplanes MK-10 Rathayibacter, Aureobacterium

MK-10 (H 2) Glycomyces, Actinomyces

MK-10 (H 4) Actinoplaces, Actinomyces, Glycomyces, Micromonospora, Nocardiopsis

MK-10 (H 6) Nocardiopsis, Thermomonospora

MK-10 (H 8) Thermomonospora, Catenuloplanes MK-11 Agrococcus, Aureobacterium, Microbacterium, Curtobacterium MK-12 Agrococcus, Agromyces, Aureobacterium, Microbacterium II/9.b. táblázat. Kinonok, s az ezeket termel ı, talajokban megtalálható Gram-pozitív baktériumnemzetségek (Collins, 1981; Fujie és mtsai., 1998a; World Data Center of Microorganisms 1995 alapján) ubikinon Mikrogombák Q-6 Saccharomyces Q-7 Candida Q-9 Arthroderma, Ascobolus, Aspergillus, Ctenomyces, Eladia, Microsporon, Mucor, Oidiodendron, Paecilomyces, Penicillopsis, Penicillium Q-10 Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium

Q-10 (H 2) Acremonium, Amauroascus, Arachniotus, Aspergillus, Botryotrichum, Botritis, Chloridium, Crysosporium, Cladorrhinum, Dothichiza, Fusarium, Geomyces, Gliocadium, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium, Phialophora, Phoma, Preusia, Scopulariopsis, Sporothrix, Trichoderma, Verticillium Q-10 (H 4) Botryotrichum, Penicillium

II/9.c. táblázat. Kinonok, s az ezeket termel ı, talajokban megtalálható mikrogombanemzetségek (Fujie és mtsai., 1998a alapján)

A módszereknek természetesen megvannak a maguk korlátai, melyek közül a legfontosabbak (a) az azonos molekulatípust termel ı mikrobák átfed ı reprezentáltsága a profilban, (b) tiszta tenyészetek szükségessége a taxon - marker párok ismeretének gyarapodásához, (c) a markerkészlet környezeti változók szerinti módosulásának lehet ısége egyazon organizmus esetében (Ramsey és mtsai. 2006). Hátrány lehet továbbá, amit eddig mint el ınyt emlegettünk: amplifikációs lépés hiányában nagyobb mennyiség ő mintából kell kiindulni, hogy a lipidfrakció minor komponensei is kimutathatósági határ fölött legyenek jelen (Green és Scow 2000). Hátrányként könyvelhet ı el az átfogó kemotaxonómiai

39 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS adatbázisok hiánya is, ami többek közt annak is köszönhet ı, hogy a fajleírások során sokáig elmulasztották a szerz ık a leírt faj lipid- és/vagy kinonkészletét közölni, s ıt, az egyértelm ő el ıírások ellenére sok esetben mindmáig elmarad ezen adatok közlése (és megkövetelése) a fajleírásokban. A XX. század végét ıl kezd ıdik a polifázikus megközelítés alkalmazása. Ibekwe és mtsai. (1998) az els ık között alkalmaztak párhuzamosan többféle módszert a közösségek megfigyelésére. Zsírsavprofil- és BIOLOG-vizsgálatot alkalmaztak a taxonok szénforrás- hasznosítási mintázatának feltárására. Következtetésük az, hogy a PLFA alkalmasabb módszer a közösségváltozás-detektálásra, ami nem különösebben meglep ı, hiszen a BIOLOG potenciális anyagcsereaktivitást vizsgál, a zsírsav-analízis ellenben közösség- összetételt. 2000-ben Ritchie és mtsai. precedens jelleggel alkalmaznak párhuzamosan kemotaxonómiai és DNS-alapú módszert, s az ekkor a még újnak számító LH-PCR (Length Heterogenity PCR) molekuláris módszer használhatóságát igyekeznek igazolni párhuzamos PLFA-analízissel. Talajminták megkülönböztethet ıségét vizsgálva azt találják, hogy er ıs korreláció van a DNS és a PLFA mintázatok között. A sort Liu és mtsai. (2000) folytatták szennyvízmintákat vizsgálva. Kinon és zsírsav mintázatot DGGE eredményekkel hasonlítottak össze. Az eredményeik feldolgozásából felt őnıen hiányzik a kiérlelt koncepció, értelmezéseik nem többek a kapott eredmények feletti puszta t őnıdésnél. Ez el ıre vetíti a polifázikus szemlélet ő közösség-vizsgálatok kés ıbb állandósuló adatkezelési és értelmezési nehézségeit, melyekr ıl a kés ıbbiekben még szót fogunk ejteni. Ett ıl függetlenül kutatásuk úttör ınek mondható a módszerek polifázikus szemlélet ő közösségi alkalmazásának fejl ıdésében. Fontos összefoglaló elemzés született 2006-ban Ramsey és mtsai. keze alatt, melyben mikrobiális közösségváltozásokkal foglalkozó cikkek sorát tekintették át kiderítend ı, hogy melyik a leghatékonyabb stratégia a közösségváltozások kimutatásában az addig használt ujjlenyomat-módszerek közül. PCR-alapú módszerek (DGGE, T-RFLP, RISA, RAPD) szénforrás-hasznosítási mintázatot elemz ı módszerek és a PLFA-analízis alapján született eredményeket vetnek össze. Nem találtak olyan esetleírást, ahol az eltér ı kezelések hatásait úgy sikerült volna elkülöníteni szénforrás-hasznosítási mintázat vagy PCR-alapú DNS- markermintázat segítségével, hogy PLFA alapon ne váltak volna szét a kezelések. Kiemelik a zsírsavanalízis DGGE-nél érzékenyebb voltát a közösségváltozások detektálásában, amit többek közt azzal magyaráznak, hogy a kimutatható kemotaxonómiai markerek mennyisége legalább egy nagyságrenddel szélesebb skálán mozoghat, mint a DGGE sávok intenzitásából származtatott mennyiségi mutatóké. Konklúziójuk, hogy változások tettenérésében a PLFA-analízis bizonyul a legmegfelel ıbbnek, és amennyiben tényleges taxonómiai információt akarunk e változásokhoz rendelni, akkor támad igény PCR-alapú

40 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS kiegészít ı vizsgálatokra. Ezt kiegészítve Córdova-Kreyols és mtsai. 2006-ban kaliforniai sós mocsarak üledékeiben vizsgálódván megállapították hogy a PLFA-mintázat gyorsabban követi a közösségváltozásokat, mivel a DNS tovább marad a talajban a sejtek pusztulása után, mint a zsírsavak, így a zsírsavanalízis alkalmasabb marker az id ıbeli változások detektálásához. A kezdeti módszerkutatások után id ıvel egyre többen kezdik alkalmazni a kemotaxonómiai analízist. Frey és mtsai. 2006-ban statisztikai elemzéseket végeznek PLFA és T-RFLP eredményeken, melyeket nehézfémszennyezéssel sújtott talajmintákból nyertek ki. A nehézfém-szennyezés mértéke és hatása érdekli ıket, nem a kémiai markerek használhatósága, tehát már tisztán felhasználóként, metodológiai megfontolások nélkül nyúlnak a módszerhez. Ett ıl az id ıszaktól kezd ıdıen csupán a preparációs módszertant finomító cikkek születnek a témában (Wu és mtsai. 2009, Gómez-Brandón és mtsai. 2010, Hanif és mtsai 2012), a többi munka a módszereket alkalmazó kutatási beszámoló számos él ıhelytípusból, els ısorban talajokból (Liao és mtsai. 2007, Djukic és mtsai. 2010, Zhang és mtsai. 2010, Vargas Gil és mtsai. 2011, Elhottová és mtsai. 2012), másodsorban komposztból (Yu és mtsai. 2007, Amir és mtsai. 2008) és biogázreaktorokból (Li és mtsai. 2006, Ahmed és mtsai.2007), illetve rizoszférából (Ravit és mtsai. 2006), vízi üledékekb ıl (Wang és mtsai. 2011), planktonból (Takasu és mtsai. 2012) stb.

II. 7. Kis hozamú gázforrások termelésének volumetriás mérése a szakirodalomban Mind a biogáztermeltetés tanulmányozásában, mind a biotechnológia számos egyéb területén igen hasznos kísérleti eszközök a laboratóriumi lépték ő, azaz mintegy 0,1-10 dm 3 térfogattal üzemel ı bioreaktorok. Laboratóriumi léptékben azonban csupán igen kis gázhozam várható egy reaktorból, kis gázhozamok kielégít ıen pontos mérése pedig sokkal nehezebb feladat, mint amilyennek els ıre gondolhatnánk. Csupán néhány fajta (nem laboratóriumi célra tervezett) készülék kapható kereskedelmi forgalomban, amelyek 1 ml/perc hozam mellett (vagy ez alatt) képesek a feladatra, ezek rendeltetésükb ıl (m őszaki berendezések m őködésének kézi ellen ırzése) adódóan mindössze egycsatornás mérésre alkalmasak, ráadásul mivel általában ultrahangos vagy optikai elven m őködnek (bár így anyagáramot is, nem csak térfogatáramot detektálnak; Nakao 2006), beszerzésük igen költséges. Laborlépték ő bioreaktorok üzemeltet ıi már régóta küzdenek a problémával, így az évtizedek során számos megoldásról beszámolt a szakirodalom a módszerekre jellemz ı el ınyökkel és hátrányokkal együtt. A legegyszer őbb módszerek a folyadékkiszorítás elvén alapulnak (Jawed és Tare 1999; Sterling és mtsai. 2001), amikor folyadékkal telt zárt üvegedény teréb ıl a bevezetett gáz

41 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS kiszorítja a folyadékot egy másik vezetéken keresztül, s a folyadékszint elmozdulása alapján leolvasható a termelt gáz mennyisége. Walker és mtsai. (2009) egy kiváló munkában taglalják az ilyen eszközök hordozta hibalehet ıségeket, s bár jól használható korrekciós és optimalizáló megoldásokat is javasolnak, írásukból nyilvánvaló, hogy sok kényelmetlenséggel kell szembenézniük az ilyen felszerelést alkalmazóknak, ha megbízható eredményeket kívánnak. A legtöbb módszer közleked ıedényekben történ ı folyadékszint-változások optikai vagy elektromos detektálásán alapszik. Ezek m őködésekor általában egy U-alakú cs ıben mozgatja a gáz a folyadékot több egymást követı ciklusban. Amint a folyadékszint a cs ı gázforrástól távolabbi ágában eléri a detektor szintjét, az jelet küld egy vele összekapcsolt számláló készüléknek, egy automatikus szelep kinyílásával ugyanakkor megsz őnik a nyomáskülönbség, a közleked ıedényben helyreáll a folyadékszint, a szelep újra bezárul, a ciklus pedig kezd ıdik el ıröl. A hozam a ciklusok számából (és az edényzet paramétereib ıl) számolható (Angelidaki és mtsai. 1992; Dissing és mtsai. 1984; Liu és mtsai. 2004; Moletta és Albagnac 1982; Nilsson és mtsai. 1988; Van den Berg és mtsai. 1974). Pereda és mtsai. (2010) kombinálták ezt a megoldást a közvetett kiszorítás elvével (Weisenburger és mtsai. 2008), hogy elkerüljék a folyadék-gáz kontaktust: ennek során egy teflonzsák fúvódik fel egy szigetelt edényben, s az ez által az edényb ıl kiszorított gáz mennyiségét mérik. Néhány fejlesztésben közleked ıedényekben detektált folyadékszint-változás helyett nyomásmérésen alapul a szelepek vezérlése (Beaubien és mtsai. 1988). A számolt ciklusok során át adagokban továbbengedett gáz azonban közös vonása e megoldásoknak. Közös hátránya e módszereknek a nagy eszközigény, mivel minden egyes gázforrás saját közleked ıedényt, detektort és szelepet (némelyik egynél többet) kíván megfelel ı vezérléssel, mely utóbbi további eszközöket (vagy megfelel ı számítógépes programot) feltételez. A biogáz begy őjtése kés ıbbi vizsgálatok céljára ugyancsak feladat lehet, a folyadékkiszorításos edényekben azonban a gáz részben elnyel ıdik a folyadékban, részben szennyez ıdik annak g ızeivel. Száraz gázgy őjt ı zacskók használata a térfogatmérést teszi ugyanakkor komplikálttá. Ezekben az esetekben ráadásul elvész az információ a gázfejl ıdés dinamikájáról, különösen rövid id ıskálán. A közleked ıedényes megoldások esetében a csatlakoztatott gázgy őjt ı eszköz nyomásváltoztató hatása révén zavarja a hozammér ı eszköz m őködését downstream helyzetben is. Glauser és mtsai. e probléma egy elmés megoldását mutatták be (1984), de az ı eszközeik kivitelezése és kezelése kifejezetten is komplikáltnak t őnik, miközben a folyadék-gáz kontaktus is állandó ezekben. A szappanos áramlásmér ık egy igen pontos és ısi válfaját képezik a kis volumen ő gázáramlásmér ıknek (Exner 1875), manapság pedig újra alkalmazzák automatizált

42 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS verzióikat (Lashkari és Kruczek 2008). Ezekben egy készülék meghatározott id ıközökben szappanos jelleg ő anyag vizes oldatából hártyát formáz egy nedvesített falú üvegcs ı belsejébe, melyben az áramló gáz gyakorlatilag ellenállás nélkül továbbtolja a hártyát, majd kialakul a következ ı hártya, és így tovább. A cs ıben sorakozó szappanlamellák elhaladását törésmutató- vagy konduktancia-különbség alapján érzékelik a detektorok. A lamellák távolságából és az adagoló órajeléb ıl jó id ıfelbontással regisztrálható a gázhozam dinamikája is. Hátrány azonban a legtöbb hasonló módszert felülmúló eszközigény, amennyiben minden gázforrás külön adagolót, mér ıcsövet, detektorsort igényel. Topolnicki és mtsai. (2009) egy igen egyedi elven mőköd ı áramlásmér ıt fejlesztettek, amelyben egy kapillárison vezetik keresztül a gázt, a mindenkori áramlási sebesség pedig a kapilláris két végén mért nyomásértékek különbségébıl kalkulálható. Ez a módszer (amennyiben automatizált) talán az elképzelhet ı legjobb id ıbeli felbontást szolgáltatja: gyakorlatilag a detektorok és az elektronika jelkezel ı kapacitása szabja határát. A forrásonként két darab érzékeny nyomásszenzor azonban itt is a gázforrások számával egyenes arányban növekv ı költségeket jelent. Az utóbbi id ıben felfutott mérési elv a Milligascounter ® koncepció, ahol folyadék alatt egy billenty ő alatt gy őlı gáz adott mennyisége felemeli a billenty őt, majd kiszabadul, és a billenty ő újabb adag gáz felfogását kezdi meg. A billenések száma illetve ismétl ıdésük sebessége adja az információt a gázfejl ıdésr ıl. A módszer hátránya, hogy a finommechanika igen megdrágítja a berendezéseket, és a mozgó alkatrészek állapotára bizonyára igen érzékeny. Jin és mtsai. (2008) egy fotoelektromos szivárgásdetektort fejlesztettek, mely buborékszámláláson alapul, munkájukban azonban nem számolnak el meggy ızıen a buborékformálás megbízható reprodukálhatóságának igényével, továbbá itt is külön fotoelektromos detektorra van szükség minden egyes gázforráshoz. Eszközüket azonban terepi munkára dolgozták ki, és nem kétséges, hogy ilyen körülmények között igen praktikus lehet. Buborékok lassított áramlási körülmények mellett történ ı mozgásának precíz detektálása alapján azonban el ıttünk senki nem kísérelt meg gázhozamot mérni az általunk áttekintett nemzetközi szakirodalom tanúsága szerint.

II. 8. Módszerfejlesztésünk el ızményei Az üzemi és félüzemi reaktorokban rothasztott szennyvíziszap nem tekinthet ı homogénnek a benne m őköd ı mikrobióta szempontjából. Nem csupán a beltartalom kevertetésének tökéletlenségeib ıl és a pelyhes anyagszerkezetben kialakuló mikrohabitatok létezéséb ıl kifolyólag (térben), hanem a kommunális hulladékként érkez ı szennyvíz

43 II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS változó és az üzemeltet ı által nem kontrollálható összetételéb ıl adódóan is (id ıben). A laboratóriumi lépték ő reaktorok üzembe helyezése – túl a párhuzamosan vizsgálható egységek számának b ıvíthet ıségén – ennek fényében válik praktikussá, mivel az egy alkalommal vett, és kis adagokban sterilizálva raktározott nyersiszap-készletb ıl hosszú id ın keresztül táplálhatók állandó összetétel ő szubsztráttal. 2007-ben egy, a Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepen tervezett f őkaszálék-adagolás kapcsán felkérést kaptunk laboratóriumi el ıvizsgálatok elvégzésére. A termosztát szekrényben, légmentesen zárható üvegedényekb ıl kialakított rothasztók gázteréb ıl kimutatni a biogáz termel ıdését zárt rendszerben is lehetséges (OxiTop rendszerben), ekkor azonban a m őköd ı reaktortartalom igen kicsiny kell legyen, hogy nagy gáztér maradjon az edényekben a felhalmozódó gáz számára. Kés ıbb tapasztaltuk is (kivezet ıcsövek eltöm ıdése esetén), hogy a reaktorok belsejében igen komoly túlnyomás alakulhat ki, amely szétvetve a rektort nem csupán mechanikai úton okozhat kellemetlenségeket. További érv a koncepció ellen, hogy nem tudható, a megnövekv ı gáztenzió nem változtat-e élettanilag releváns fizikokémiai paramétereken, miközben egy normál rektorban, normál üzem esetén ezzel biztosan nem kell számolnunk. Mindezt átgondolva eleve a gázelvezetéses megoldást választottuk, s kézenfekv ı módon adódott a lehet ıség, hogy a rothasztás folyamatát a gázhozam mérésén keresztül kísérjük figyelemmel. A mérési elv megszületéséhez az els ı inspirációt a kezdetkor alkalmazott folyadékkal telt gy őjt ıedényekben felfelé szaladó apró buborékok látványa adta, valamint az a jól látható jelenség, hogy periodikusan fel-felgyorsul majd újra lelassul a képz ıdésük. Ha valahogyan nagyobb buborékok képz ıdnének, ha ezeket kell ıen le lehetne lassítani a folyadékban, s ha a mozgásuk útját is meg tudnánk szabni, akkor számolhatóvá válnának, térfogatuk is becsülhet ı volna, és a gázkivétel id ıbeli dinamikáját is jobban meg tudnánk figyelni. A különböz ı ötletek során át végül egy igen egyszer ő modellhez jutottunk: A vízszinteshez képest enyhén döntött, folyadékkal telt csövekben a buborékok egyenes pályán, egyenletes, és a döntés szögével állítható sebességgel mozognak fölfelé (ld. Mikola- cs ı). Kezdeti megoldásként vízzel telt, és a vízszinteshez képest enyhén megdöntött üvegpipetták alsó végébe vezettük a gázt, amely buborékokat alkotott a pipetták vízterében. Számítógép és hozzá csatlakoztatható kamera segítségével programozott id ıközönként rövid videofelvételeket készítettünk a vízzel telt osztott pipettákban felfelé kúszó buborékokról, majd a felvételeket manuálisan értékeltük ki a buborékok osztáshoz viszonyított hosszának és a buborékérkezések közt eltelt id ık feljegyzésével. Mivel ez igen- igen monoton és id ıigényes munka volt, valamint mivel tanszéki kollégánkon keresztül kapcsolatba kerültünk egy mintázatfelismer ı szoftverek kódolásával foglalkozó fiatal programozóval, Szabó Zsolttal, hamarosan megkezd ıdött módszerünk automatizálása is.

44 III. CÉLKIT ŐZÉS

III. CÉLKIT ŐZÉS Munkánk egyik célja egy könnyen használható, laboratóriumi lépték ő, biogáztermel ı modellrendszer létrehozása volt, valamint e rendszer m őködési folyamatának nyomon kö- vetését lehet ıvé tev ı egyszer ő, könnyen kivitelezhet ı és használható, többcsatornás gázhozammér ı módszer illetve eszköz kifejlesztése. További célunk volt biogáztermel ı közösségek vizsgálata respiratorikus kinon-, memb- ránzsírsav-, és DNS-alapú ujjlenyomatmódszerekkel: (a) egy mezofil és egy termofil, félüzemi szennyvíziszap-rothasztóból származó mikrobaközösség összehasonlítása, (b) könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatásvizsgálata mezofil közösségeken, labora- tóriumi modellrendszer alkalmazásával, valamint (c) egy félüzemi biogázreaktorokon el- végzett, mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtési folyamat hatásának monitorozása. Utóbbi munkáinkhoz kapcsolódóan célunk volt végül egy adatkezelési módszer kidol- gozása is, melynek alkalmazásával kimutathatjuk a különböz ı ujjlenyomat-módszerekkel létrehozott közösségi markermintázatok elemeinek közös termel ı szervezetekt ıl való szár- mazását az eredeti adatsorokban rejtve maradó id ıbeli együttmozgások kimutatása révén.

45 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

IV. ANYAG ÉS MÓDSZER IV. A. Új módszer kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére

IV. A. 1. A módszer és az eszközök leírása Az eszköz három jól elhatárolódó részb ıl áll (IV/1. ábra): • A csövek, melyekben a buborékok haladnak, és az ezeket körülvev ı vizuális markerek (ld. kés ıbb). • Egy számítógéphez csatlakoztatható egyszer ő kamera, és a számítógép. • A számítógépen futó mintazatfelismer ı szoftver. A kamera és a számítógép természetesen kereskedelmi forgalomban kapható eszközök, így a továbbiakban f ıleg a saját munkánk eredményeit képez ı üvegcsöves buborékoltató eszközr ıl és a csövek képéb ıl mérési adatsort generáló programról írunk.

IV. A. 2. A "buborékoltató" eszköz Az eszköz párhuzamosan elhelyezett L-alakú üvegcsövekb ıl, egy ezek rögzítésére, valamint ezek vizuális hátteréül szolgáló fehér tálcából, s az ezen elhelyezett színes jelekb ıl áll, melyek a látvány értelmezését segítik a szoftver számára (IV/1. ábra a). A vastagabb, kb. 40 cm hosszúságú ága az üvegcsöveknek 6 mm belsı átmér ıjő Pyrex üvegb ıl készültek. Ezek a cs ıágak fekszenek fel a tálcára, s a vízszinteshez képes enyhén megdöntve a tálcát a buborékok az ezeket kitölt ı folyadékban lassan elindulnak felfelé, mint a Mikola-cs ıben. A buborék igyekszik a cs ı fels ı részében lenni, és vízszintes helyzetben igyekszik egyrészt a cs ı tetejét egész hosszában kitölteni, a felületi feszültség miatt ugyanakkor gömb alakra is törekszik, így egy elnyújtott forma jön létre (Tüzes és Papp 2007). A 6 mm-es bels ı cs ıátmér ı optimálisnak mutatkozott ahhoz, hogy a buborékok ne képezzenek benne légzárat (vagyis a felületi feszültség nem tudja megakadályozni, hogy a folyadék átfolyhasson a buborék alatt), de még eléggé kitöltsék keresztben a csövet ahhoz, hogy a buborék alatt átáramló folyadékréteg kell ıen vékony legyen. Utóbbi a folyadék és a buborék vizuális elkülöníthet ısége miatt fontos. A mer ıleges vékonyabb cs ıág 2 mm bels ı átmér ıjő, és kb. 15 cm hosszúságú. A vékonyabb ágak a tálca vízszintes helyzetében függ ılegesen állnak, ezekhez csatlakozik a gázforrások fel ıl érkez ı gázvezeték. A gáz nyomása a termel ıdés ütemében lassan nyomja lefelé a folyadékot a vékony ágban, s enyhe megdöntés esetén csak csekély ellennyomást kell leküzdenie. Az L-cs ı könyökrészét elérve a gáz belép a vastagabb, vízszinteshez közeli helyzet ő ágba, majd a felhajtóer ı valamint a felületi feszültség ered ıje szerint jól reprodukálódó módon szakad le a függélyes ág gázterér ıl, és önálló buborékként elindul a

46 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER vastag cs ıágban. Amennyiben a folyadékot megfestjük, fölülnézetben a buborékok (az alattuk átáramló vékony folyadékréteg ellenére) a háttér színét engedik érvényesülni. Így egy egyszer ő képelemz ı szoftver számára is könnyen értelmezhet ı képet kínál a cs ı (IV/1. ábra b): a folyadék színét mutató sávban a háttér színét mutató szakaszok (buborékok) jelennek meg, és mozognak állandó sebességgel egy irányba. A különböz ı reaktorokból táplált csövek párhuzamos elrendezésével több, de külön figyelemmel kísérhet ı sávot helyezhetünk a látótérbe, így minimális eszközb ıvítéssel többcsatornássá b ıvíthetjük eszközünket. A jó képalkotáshoz mindössze állandó, fehér, szórt fényre van még szükség, amely csillogás nélkül megvilágítja a csöveket (Tauber és mtsai. 2011). (a) c

l

s

gáz ki p

t α g

(b) r d e f g a

a

a

IV/1. ábra. A gázhozammér ı rendszer sematikus vázlata. (a) Oldalnézet: p L-alakú üvegcsö- vek festett folyadékkal töltve, bennük buborékok (fehér ellipszisek), g fehér tálca a csövek rögzítéséhez és vizuális hátteréül, c kamera, l fényforrás, s számítógép, r kevertetett reaktor (gázforrás), t termosztátszekrény, α a megdöntés szöge (3-10°). (b) Felülnézet: d vizuális start- vonal a szoftver számára a csövek automatikus kereséséhez, e milliméter-skála a manuális buborékméret-korrekcióhoz, f méretreferencia-marker automatikus buborékméret- meghatározáshoz.

IV. A. 3. Buborékszámlálás szoftver segítségével Hogy számítógéppel végezhessük a buborék-képek automatikus analízisét, három fel- adatot kellett megoldani: pixel-osztályozás, buborékazonosítás és buborékméret- meghatározás.

47 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

Az osztályozás egy egyszer ő színalapú döntés, vajon a vizsgált pixel buborék, cs ı, szí- nes marker vagy a hátér része-e. A döntés a három színkomponens (vörös, zöld, kék) méré- sén alapszik egyszer ő szín-szabályok és egy egyszer ő döntési fa segítségével. A különböz ı kritériumoknak megfelel ı pixelcsoportok helyzetének regisztrálásával megkezd ıdhet a képi információ feldolgozása. A következ ı lépés megállapítani az egy képkockán megjelen ı buborékok számát és méretét. Ehhez el ıször a csövek pontos helyzetét kell bemérni [ehhez szolgál segítségül a csövek színét ıl elüt ı keresési startvonal a látótérben (IV/1 ábra b)]. Ezután minden cs ıben külön történik a buborékok keresése. A cs ı definíció szerint egy kell ıen hosszú, folytonos, egyenes sorozata a beállított színszabály szerint megfelel ı szín ő pixeleknek. A buborék definíció szerint egy kell ıen hosszú, folytonos nem „cs ıszín ő” pi- xelsorozat egy cs ıben. A cs ı színét meghatározó folyadékfesték min ıségét és koncentrá- cióját úgy kell megválasztani, hogy a 6 mm bels ı átmér ıjő cs ıben fehér háttér mellett a háromból két színkomponens tiszta keverékét mutassa. A módszer beállítása és tesztelése során ezért 0,6 mM KMnO 4 oldatot használtunk, mely optimális magenta színt mutat ma- ximális vörös és kék, de minimális zöld fényer ıvel. A csövek automatikusan kereshet ık a háttérben (az ez esetben kék startvonaltól elindulva), mint magenta sávok a fehér háttérben. A buborék pedig ez után úgy detektálható, mint a zöld színkomponenst is tartalmazó pixe- lek sorozata a komplementer színt mutató sávban. A rendszer folyamatosan monitorozza a kamera által beolvasott frame-ek sorozatában az összes csövet, és ha megjelenik egy bubo- rék, követi annak mozgását. Ha felt őnik egy buborék egy frame-ben, mely még nem volt jelen (vagy nem volt a kritikus pozícióban) az el ızıben, akkor regisztrációra kerül a bubo- rék-listában. Ez a lista a program által folyamatosan b ıvített és mentett egyszer ő szövegfájl, mely soronként tartalmazza a buborékok összes adatát (megjelenés id ıpontja, cs ı pozíciója, hossz, kalkulált térfogat stb.). Bár a csövek fent vázolt elrendezése mellett nagyon hasonló buborékok képz ıdnek a cs ıkönyökökben, mégsem lehet garantálni, hogy mindig ugyanakkorák, s tapasztaltuk is, hogy a buborékméret kismértékben függ a gáztermel ıdés sebességét ıl. Ezen kívül a detek- tált buborékhossz értéke mindig függ a csövek és a kamera kölcsönös helyzetét ıl, távolsá- gától is. A pontos méretmeghatározás céljából kerül a pontosan ismert hosszúságú színes méretreferencia-marker a látótérbe (IV/1.b. és IV/2. ábrák). A szoftver minden észlelt bubo- rék méretét összeveti e marker észlelt méretével, amib ıl meghatározható a buborék mm- ben kifejezett hossza az 1. egyenlet alapján:

d p ' i = i 1. egyenlet dm pm

48 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

ahol d i az i-dik (aktuálisan vizsgált) buborék tényleges hossza mm-ben (ez a keresett érték), dm a referenciamarker tényleges (ismert) hossza mm-ben; p i' az i-dik buborék detektált mé- rete (korrigálva a meniszkuszoknál adódó hosszveszteséggel – lásd kés ıbb) pixelszámban kifejezve, p m pedig a referenciamarker detektált hossza pixelszámban kifejezve (IV/2.ábra). A buborék térfogata (jó min ıség ő üvegáru használata esetén) arányos a cs ıbeli hosszával. Manuális cs ıkalibrálás során megállapíthatjuk a buborékhossz-értékeket a buboréktérfogat ellenében ábrázoló kalibrációs egyenes paramétereit, melyeket megadva a szoftvernek, az a buborékhossz (di) alapján kalkulálni tudja a buboréktérfogatot a 2. egyenlet alapján:

d − b V = i 2. egyenlet i a ahol V i az i-dik buborék térfogata ml-ben (keresett érték), a a kalibrációs egyenes meredek- sége, b az y-tengelymetszet értéke, mely utóbbiak a felhasználó által megadott értékek a szoftver számára (b ≠ 0 a cs ı jelent ıs vastagsága miatt). Két korrekciós lehet ıség bevezetése is szükséges azonban, hogy kielégít ı mérési pon- tosságot érhessünk el. Precíz manuális térfogat-hossz kalibráció csak úgy oldható meg, ha a buborékokat határoló meniszkuszok végpontjainak távolságát mérjük meg. A szoftver azonban a meniszkuszok bonyolult fénytörési effektusai miatt fellép ı fényer ı- és színbeli eltérések következtében a meniszkuszok képi környezetét nem a buborék részeként fogja azonosítani, így a buborékok egy közel négyszögletes résként jelennek meg a program számára a cs ıszín ő sávban, amely azonban rövidebb, mint ami a buborék reális hosszából következne, ha a szoftver látná a meniszkuszok végpontjait. Ezért a buborékok detektált hosszértékéhez rendre hozzá kell adnunk egy korrekciós faktort, hogy kiküszöböljük a fen- tiekb ıl adódó komoly szisztematikus hibát. E korrekciós faktor értékét a szoftver készítette pillanatfelvétel segítségével határozhatjuk meg, melyen szerepel egy buborék, illetve szere- pel egy, a látótérben a csövek síkjába helyezett milliméterskála is (IV/1.b. és IV/2.c. ábra).

49 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

(a) pbub ’ (c)

dm

di pbub

c c 1 1

(b)

pm pi

dbub

IV/2. ábra. Az analizált kép és a buborékgeometria. a és b: az aktuális illetve a pixelezett, program által analizálható kép három cs ıvel. d i az i-dik buborék hossza, d m a méretreferen- cia-marker hossza, [d] = mm; p i az i-dik buborék detektált hossza, p m a méretreferencia- marker detektált hossza, [p] = pixelszám. c: a c1 korrekciós faktor megállapításához használt buborék tényleges és detektált hosszának különbsége. d bub a kalibrációt végz ı személy által vizuálisan megállapított hossza a kiválasztott buboréknak, p bub a szoftver által detektált bubo- rékhossz pixelben. p bub ' az X1. egyenlet alapján d bub -ból számolt korrigált buborékhossz. c1 = pbub '-pbub .

A buborék hosszát megállapítva a skála segítségével az 1. egyenlet logikája szerint megha- tározhatjuk az eltérést a buborék szoftver által kalkulált és tényleges hossza között. Mivel a tényleges buborékhossz (d bub ) ezúttal ismert, visszaszámolható bel ıle az a realisztikus pi- xelszám (p bub ') amely megfelelne ennek a tényleges hossznak. Ennek különbsége a (szoftver által a pillanatfelvételen kijelzett) detektált pixelszámtól megadja a c1 korrekciós faktor értékét ([c1] = pixelszám), melyet megadva a programnak automatikusan hozzáadja azt az összes továbbiakban detektált buborék pixelszámához. Ezzel természetesen azt feltételez- zük, hogy a meniszkuszokból adódó hossztévesztés ugyanaz lesz az összes buborék eseté- ben, erre azonban lehet is számítani fix kamerapozíció és állandó megvilágítási körülmé- nyek között. Amennyiben a buborékformálódás kielégít ıen egyformának mondható méré- seink teljes id ıtartamában, vagyis nincs komoly szórása vagy id ıbeli kúszása a buborék- hossz-értékeknek, egy további korrekciós lehet ıségünk is van a pontosság finomítására. Eszközünket egy kalibrációs mérésben egy ismert pontosságú referencia-gázhozammér ıvel vagy standard gázforrással sorba kötve megállapíthatjuk az eszközünkön ténylegesen ke- resztülhaladt gáztérfogat és a saját eszközünk által detektált térfogat különbségét. Ezt a kü-

50 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER lönbséget a kalibrációs mérés alatt detektált buborékok számával elosztva megkapjuk c2 korrekciós faktort ([c2] = ml), melynek értékét (akár csövenként külön) megadva a szoftver azt a továbbiakban minden detektált buborék kalkulált térfogatához hozzáadja. A méretkor- rekciók elhagyása szisztematikus hibához vezet, ezért a párhuzamosan detektált csövekb ıl kiolvasott hozamadatsorok (amennyiben a csövek valóban azonos átmér ıjőek) összehason- líthatók maradnak. A méretreferencia-marker detektált mérete, mivel a marker szegélyei elvágólagosak, természetesen nem szorul korrekcióra. A detektált és a valós méret aránya pontos, illetve a kamera felbontóképességének korlátos volta vezethet szegélyenként egy- egy pixeles zajhoz. E zaj arányának csökkentése a méretreferencia-marker hosszának növe- lésével lehetséges. A gázhozam a buborékok érkezési id ıpontjainak különbségéb ıl (továb- biakban t értékekb ıl) és a buborékok térfogatából egyszer ően számolható. Fontos hangsúlyozni, hogy a mérés nem jár képi információ hosszútávú elektronikus tá- rolásával. Csupán numerikus adatváltozók tárolása történik egy szövegfájlban, így egy 10000 buborék regisztrálásával nyert adatsor (ez kb. 4,5 l gáznak felel meg a mi rendsze- rünkben) mindössze 0,7 Mb memóriát foglal le a számítógépen. A IV/3. ábra összegz ı be- mutatását adja a detektálás és adatgenerálás folyamatának.

észlelt korrigált számolt számolt ben

ı buborékméret buborékméret buborékméret buboréktérfogat pixelben pixelben mm-ben ml-ben gázhozam

(kalkulált adat) 2. egyenlet pi pi‘ − + c di b = 1 (kalkulált Vi (el ızıleg kalkulált adat) a (kalkulált korrekciós faktor) adat) i-dik a cs buborék d p ' 1. egyenlet i = i + c 2 dm pm Méretreferencia-marker ti (el ızıleg kalkulált korrekciós faktor) a b pm (a méretreferencia- (a manuális kalibrációban marker észlelt d szerkesztett kalibráló mérete) m egyenes paraméterei ) (ismert adat) eredmény-result datafile file Kamera & Számítógép

IV/3. ábra. A buborékészlelést ıl a hozamadatsor generálásáig tartó folyamat logikája. d i az i- dik buborék hossza, d m a méretreferencia-marker hossza, [d] = mm; p i és p i' az i-dik buborék detektált illetve korrigált hossza, p m a méretreferencia-marker detektált hossza, [p] = pixel- szám. V i az i-dik buborék térfogata, [V i] = ml. ti az i-1-dik buborék és i-dik buborék észlelési id ıpontjainak különbsége. A szaggatott vonalkeretek a program számára a felhasználó által megadott paramétereket emelik ki.

IV. A. 4. A módszer validációjának és további tesztelésének eszközei Készülékünk pontosságának vizsgálata és korrekciója céljából állandó kis volumen ő hé- liumáramot vezettünk csöveinkbe egy ennek biztosítására képes gázkromatográf- berendezés (HP 5890) kapillárisoszlopából. A héliumáramlás pontos értékét a vezetékhez

51 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER csatlakoztatott vízszintes üvegpipettában mozgó folyadékcsepp vándorlási sebességének precíz mérésével határoztuk meg (több mérés ered ıjeképpen). Az áthaladó gáz mennyiségét a hozam és a mérésid ı alapján számoltuk. A szoftverünk által generált mérési adatokat ösz- szevetettük a kalkulált hozamértékekkel. Az adatokat kiértékeltük. A biogáz-modellrendszeren való tesztelés során fél dm 3-es csiszoltdugós állólombikok- ban rothasztottuk a F ıvárosi Csatornázási M ővek Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepér ıl származó, vételezés után autoklávban sterilizált s őrített nyersiszapot. A kezd ı kultúra ugyancsak a telep mezofil rothasztóiból származott. A reaktorokat termosztátszekrényben,

35°C-on, mágneses kevertetéssel üzemeltettük. A 82,65 mg O 2/ml kémiai oxigénigény ő iszap reaktorokra táplálása batch-rendszerben, 10 napos tartózkodási id ıvel történt oly mó- don, hogy kétnaponta cseréltük a reaktortartalom 20%-át (1 dl) azonos mennyiség ő nyers iszapra. A rátáplálás az oxidatív stressz kerülése érdekében N 2-áram alatt történt. A gázt a csiszolatos dugók csonkjain keresztül szilikoncsöveken át vezettük ki a termosztátszekrényb ıl a buborékszámláló csövekbe. Az illesztési pontokat vákuumzsírral (Dow Corning ®) szigeteltük. A detektáláshoz Vista IM Live! Cam (Creative; 800×600 fel- bontás) kamerát használtunk, a mintázatanalízist pedig az általunk fejlesztett, BuBBer névre keresztelt szoftver végezte a fentebb taglaltak alapján. A szoftvert nyílt forráskóddal hozzá- férhet ıvé tettük 4. A mérési folyamat során a c1 korrekciós faktor értéke 3,25 pixel volt, a méretreferencia-marker hossza 20 mm, az átlagos detektált buborékhossz illetve térfogat 25,8 pixel (azaz 18.7 mm; SD: 2,09) illetve 0,43 ml (SD: 0.04) volt. A buborékképz ıdést a rátáplálások közötti két napos periódusok teljes tartamában regisztráltuk. A reaktortartalom folytonos pH-mérését OP-211/3 Laboratory pH Meter (Radelkis, Budapest) eszközzel vé- geztük. Hogy karakterizálni tudjuk a gázhozamban tapasztalt rövid távú oszcillációt és megállapíthassuk, hogy ennek oka a közösség élettani m őködésében keresend ı, vagy pedig a kísérleti elrendezésb ıl, esetleg a mérési módszer jellegéb ıl adódó m őtermékr ıl van szó, elvégeztük az adatsorok Morell hullámhossz-analízisét (wavelet spectrum analysis) (Shumway és Stoffer 2000). Ez a matematikai adatelemzési módszer akár egymásra rakódó periodikus változások adatsorokból történ ı kimutatására alkalmas, és különösen hidrológiai és klimatológiai munkákban elterjedt a használata (Burns és mtsai. 2002; Whitt és Schu- mann 2005). Erre MATLAB MathWorks programot használtunk. A továbbiakban három egymást követ ı rátáplálási periódusban két párhuzamosan vizs- gált reaktor (A és B) gáztermelése alapján nyert adatsorok eredményeir ıl számolunk be. A három bemutatott periódust megel ızıen számos perióduson keresztül voltak már azonos módon fenntartva a reaktorok. A tárgyalt periódusokra reaktoronként külön mint A1, A2, A3, B1, B2 és B3 periódusokra fogunk hivatkozni.

4 http://mikrobiologia.elte.hu/Miscell.html

52 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

IV. B. Biogáztermel ı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata

IV. B. 1. A vizsgált reaktorok A doktori munkám részét képez ı vizsgálatok a F ıvárosi Csatornázási M ővek Zrt. Dél- pesti Szennyvíztisztító Telepének félüzemi (1,5 és 2,5 m 3-es térfogatú) szennyvíziszap- rothasztóinak mikrobiológiai elemzésével kezdıdtek (IV/4. ábra). A telepen rothasztott szennyvíziszap az els ıdleges és másodlagos ülepít ımedencék iszapjának keverékébıl áll, így tartalmazza a szennyvíz primer szennyez ıdéseit és a biológiai tisztítási fázisban kelet- kezett bakteriális biomassza tömegét is. A félüzemi reaktorokat (a 2000 m 3-es üzemi reak- torokhoz hasonlóan) batch-rendszerben (id ıszakosan), naponta kétszer táplálták víztelenít ı szalagon s őrített, mintegy 5% szárazanyag-tartalmú szennyvíziszappal, 12,5 napos tartóz- kodási id ıt tartva. A reaktorok folyamatosan kevertetve üzemeltek. Els ı vizsgálatunkban egy mezofil és egy termofil félüzemi reaktor mikrobaközösségét hasonlítottuk össze. Második tárgyalt vizsgálatunkat már egy saját laboratóriumi biogáztermel ı modellrend- szer mintáival végeztük. 2007-ben egy, a Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telep biogáztornyaira tervezett f őkaszálék-hozzáadagolás kapcsán ugyanis felkérést kaptunk laboratóriumi el ı- vizsgálatok elvégzésére, melyhez létre kellett hoznunk egy laboratóriumi lépték ő iszaprot- hasztó modellrendszert. Az állandó h ımérsékletet (mezofil rothasztás: 37°C) fenntartására szolgáló termosztátszekrény terében, félliteres, csiszolt dugós állólombikokban végezzük az iszaprothasztást állandó mágneses kevertetés mellett. A termel ıdı biogázt a csiszolatos üvegdugók kivezet ı csövéhez illesztett szilikoncsöveken keresztül vezettük el hozammérés céljából (IV/5. ábra). A gázhozam mérését az alább leírt kísérletek idején már saját fejlesz- tés ő módszerünkkel végeztük, mely rendszerr ıl a dolgozat kés ıbbi fejezeteiben részletesen is írunk, illetve a nemzetközi szakirodalomban is közzétettük (Tauber és mtsai. 2010).

IV/4. ábra. Félüzemi iszaprothasztók az FCSM Zrt. Dél-pesti Szennyvíztisztító Telepén

53 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

A rothasztott iszapban m őköd ı mikrobaközösség fenntartására szolgáló rothasztólombikba a F ıvárosi Csatornázási M ővek Dél-Pesti Szennyvíztisztító Telepér ıl vételeztünk rothasztott iszapot indítókultúrának. A folyamatos fenntartás szubsztrátjául ugyaninnen vételeztünk nagyobb mennyiség ő s őrített nyersiszapot, majd ezt kisebb adagokra osztva autoklávos sterilizálással tartósítot- tuk. A telepen rendszeresített gya- korlatnak megfelel ıen 10 napos tartózkodási id ıvel rothasztottuk az iszapot: két napos periódusokban, a palacktartalom 20 %-ának nyers iszapra cserélésével valósítottuk meg az adagolást. Iszaprothasztó- IV/5. ábra. Szennyvíziszap-rothasztó mo- dellrendszer. ként gömböly ő lombikokat hasz- náltunk, melyekb ıl szilikon- csöveken keresztül elvezettük a keletkez ı biogázt a gázméréshez. A lombikokat 35°C-os termosztátban mágneses kever ıasztalokra helyeztük, és a kísérlet során folyamatosan ke- vertettük az iszapot. A kísérletet három iszaprothasztóval végeztük, az egyik kontrollként szolgált, míg a másik kett ıt párhuzamos kísérlet keretében különbözı szubsztrátokkal táp- láltuk. A kezelés során els ıként fehérjét, majd keményít ıt, végül napraforgóolajat adagol- tunk. A kísérlet során végig mértük és figyeltük a gáztermelés alakulását. Harmadik tárgyalt vizsgálatunkat, a h ımérsékletemelés hatásának, illetve a mezofil kö- zösségb ıl termofil közösségbe való átrendezıdésnek a nyomon követését az FCSM Zrt. Dél-pesti Szennyvíztisztító Telepének már ismertetett félüzemi rothasztóin lefolytatott fel- főtéses kísérlethez csatlakozva végeztük el. Két reaktor (T4 és T6) felf őtését követtük nyo- mon. A reaktorok 2-2 m 3 iszaptartalommal üzemeltek. Hetente kétszer történt rátáplálás reaktoronként 500 l rothasztott iszap s őrített nyersiszapra cserélésével, ami 14 napos tartóz- kodási id ıt jelent. A rátáplált iszap átlagos szárazanyagtartalma 2,87 % volt. A h ımérésklet emelését a két reaktoron különböz ı ütemezésben hajtották végre. A T4-es reaktor felf őtése a mezofil optimumközeli 34,1°C-ról termofil optimumközeli 55°C-ra egy lépésben, hirtelen történt, a T6-os reaktor felf őtése ugyanilyen intervallumban 21 nap alatt, egyenletes h ımér- sékletemeléssel valósult meg. Abiotikus paraméterek (h ımérséklet, illósavtartalom, pH, gázhozam) mérése is kísérte a rátáplálásokat, melyet a szennyvíztelep munkatársai végeztek az el ıírt standard protokollok szerint.

54 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

IV. B. 2. Az elvégzett kísérletek és a mintavételezések Els ı munkánkhoz a T2-es termofil és T4-es mezofil félüzemi biogázreaktorokból vet- tünk mintát egy id ıben kemotaxonómiai- és DNS-munkákhoz 2005. szeptember 20-án. A továbbiakban mint T (termofil) és M (mezofil) mintákra hivatkozunk ezekre. A körülmé- nyeket kísérleti céllal nem változtattuk, célunk csupán a kétféle optimumh ımérséklet ő kö- zösség összehasonlítása volt. Kemotaxonómiai munkához a fermentorok leenged ı csapjá- nak b ı átfolyatását követ ıen zsírtalanított, jól zárható üvegedényben el ızıleg összemért oldószer elegybe (diklór-metán : metanol, 1:2) engedtünk megközelít ıen 20 g tömeg ő rot- hasztott iszapot, majd jégben h őtve a laborba szállítottuk ezeket, s tömegüket pontosan visz- szamértük. Tárolásuk -20 °C-on történt. DNS-munkákhoz steril üvegedényekbe vettünk rothasztott iszapot. Az üvegeket jéggel töltött dobozban szállítottuk a laboratóriumba. Itt minden mintából ötször 1-1 ml-nyi iszapot pipettáztuk 2 ml-es csavaros kupakos csövekbe. A mintákat centrifugáltuk (13000 g, 2 perc), majd a felülúszót leöntöttük, a s őrő iszapot pedig feldolgozásig -20 °C-on tároltuk.

Második munkánkban könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatását vizsgáltuk laboratóriumi lépték ő modellreaktorainkon, illetve ezek mikrobiális közösségein. Az ada- golt szubsztrátok elkészítéséhez az alábbi anyagokat használtuk: 1. autoklávozott, nyers, 5% szárazanyag-tartalom körüli szennyvíziszap

2. fehérje (húskivonat, MM329, KOI: 1185 mg O 2 / g)

3. keményít ı (MN624, KOI: 1126 mg O 2 / g)

4. étkezési napraforgóolaj (KOI: 2867 mg O 2 / g) A kísérlet során kiindulásképpen használt iszaprothasztó közösséget el ızıleg tisztán nyers szennyvíziszap adagolásával tartottuk fenn. A kísérlet kezdetekor az iszap kémiai oxigénigényét megmértük (8700 mg O 2/100 g) és a kezeléshez használt szubsztrátot úgy állítottuk össze, hogy a szennyvíziszap térfogatának 75 százalékát helyettesítettük azonos KOI érték ő alternatív szubsztráttal, majd az elegyet tiszta, kiforralt csapvízzel 100 ml-re egészítettük ki. A kísérlet indításakor és még további két alkalommal fehérjét adagoltunk az iszaprothasztóba, majd két alkalommal tiszta nyersiszapot adagoltunk. Ezután három alka- lommal keményít ıt adagoltunk. Mivel a gázhozamgörbéken a keményít ı hatása hosszab- ban volt látható, ezért ezúttal három alkalommal adagoltunk nyersiszapot. Ezután három alkalommal adagoltunk olajat, majd innent ıl kezdve már csak tiszta nyersiszapot. A kísérlet kezdetén mintát vettünk a nyersiszapból is (IV/1. táblázat). Egy-egy rothasztási szakasz 2 napig tartott, utána újabb adag szubsztrátot adagoltunk, mégpedig úgy, hogy a rothasztott iszapból 100 ml-t eltávolítottunk, ebb ıl mintát vettünk, majd 100 ml friss szubsztrátot ön- töttünk a lombikba. A mintavétel és az adagolás pontos menetét az IV/1. táblázat tartalmaz- za. A leöntött iszapokból mintát vettünk. Zsísavelemzéshez 10 ml mintát adtunk diklór-

55 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

metán és metanol 1:2 arányú elegyének 30 ml-éhez, majd a végleges feldolgozásig -20 °C- on tároltuk a keveréket. A molekuláris módszerekhez 1,5 ml-t Eppendorf-cs ıbe raktunk, 18000 g-n 5 percig centrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük és a szilárd fázist -20 °C-on tárul- tok a minták feldolgozásáig.

Dátum Feldolgozott minták Mintavételt követ ıen adagolt szubsztrát

1. 2009.11.25 A0 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz 2. 2009.11.27 A1, B1, C1 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz 3. 2009.11.29 - 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,51 g fehérje + 70 ml víz 4. 2009.12.01 A3, B3, C3 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 5. 2009.12.03 - 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 6. 2009.12.05 - 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,8 g keményít ı + 69 ml víz 7. 2009.12.07 A5, B5, C5 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,8 g keményít ı + 69 ml víz 8. 2009.12.09 - 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 5,8 g keményít ı + 69 ml víz 9. 2009.12.11 A6, B6, C6 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 10. 2009.12.13 - 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 11. 2009.12.15 A8, B8, C8 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 12. 2009.12.17 - 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz 13. 2009.12.19 A10, B10, C10 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz 14. 2009.12.21 - 25g iszap (2175 mg O 2/ 25g) + 2,28 g olaj + 73 ml víz 15. 2009.12.23 A11, B11, C11 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 16. 2009.12.25 - 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 17. 2009.12.27 - 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) 18. 2009.12.29 - -

19. 2009.12.31 A13, B13, C13 100g iszap (8700 mg O 2 / 100g) NyI* * NyI: az alapvet ı szubsztrátként adagolt nyersiszapból is vettünk mintát kemotaxonómiai célokra. IV/1. táblázat: A mintavétel és a szubsztrátadagolás menete. Az „A” reaktor az egész kísérlet során a kontroll szerepét játszotta, így minden alkalommal normál (100 g iszap) rátáplálást kapott. A 18. periódusban a kezelt reaktorokra nem történt rátáplálás, a kontrollra azonban igen.

Harmadik munkánkban, a szennyvíztelepi félüzemi mezofil rothasztók felf őtésének nyomon követésében mintavételezésünkkel egy közel három hónapos adaptációs id ıszakot monitoroztunk (IV/2. táblázat). Mindkét reaktorból nyolc mintát, ezek közül hatot-hatot heti rendszerességgel vettünk. A két-két utolsó minta a többit ıl id ıben elkülönülve, hosszabb adaptációs periódusokat követ ıen került vételezésre.

Felf őtés egy lépésben T4-es reaktor Felf őtés több lépésben T6-os reaktor mintavétel dátuma T (°C) mintanév T (°C) mintanév 2012. november 7. 34.1* 4/1 34.1 6/1 2012. november 14. 55.0 4/2 41.5 6/2 2012. november 21. 47.3 4/3 45.9 6/3 2012. november 28. 55.7 4/4 52.5 6/4 2012. december 5. 54.9 4/5 55.0 6/5 2012. december 12. 54.8 4/6 54.8 6/6 2012. január 16. 55.3 4/7 54.9 6/7 2012. február 13. 55.4 4/8 55.4 6/8 * A h ımérséklet megemelése az els ı mintavételt követ ıen azonnal megindult. IV/2. táblázat. Minták a felf őtéses kísérletb ıl.

56 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

A kiindulási iszapmintákat a reaktorokból a szennyvíztisztító telep munkatársai vételez- ték csavarkupakos üvegedényekbe, és haladéktalanul laboratóriumunkba küldték azokat. A különböz ı vizsgálatokra szánt alminták kiadagolása, el ıkészítése és megfelel ı eltárolása szintén megtörtént még a mintavételezés napján. A DNS-munkákhoz 1,5 ml-es Eppendorf csöveket töltöttünk meg a rothasztott iszapmintából, majd centrifugálással ülepítettük le a baktériumsejteket is tartalmazó szilárd anyagot (9000 g-n, 10 perc). A felülúszót elöntöttük, míg a sejteket tartalmazó iszapot -20°C-ra leh őtve tettük el a további feldolgozásig. A kemotaxonómiai vizsgálatokhoz 10-10 ml iszapot öntöttünk a zsírtalanított üvegedé- nyekben el ıkészített 30 ml diklór-metán : metanol (1 : 2) extrahálóelegyhez, majd további feldolgozásig -20°C-on tároltuk el a mintákat.

IV. B. 3. Az alkalmazott módszerek rövid áttekintése Mindhárom munkánkban elvégeztük a közösségi zsírsavprofil vizsgálatát, továbbá a mezofil-termofil összehasonlításban illetve a felf őtéses kísérletben a közösségi kinonprofilt is megvizsgáltuk. DNS-alapú vizsgálatok terén mindhárom munkánkban alkalmaztunk T- RFLP (terminális restrikciós fragmenthossz-polimorfizmus) vizsgálatot, ám míg az els ı és harmadik munkánkban ez a közösség egészére kiterjedt és klónkönyvtár-elemzés egészítet- te ki, addig második munkánkban, a könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgála- tában csupán az Archaea közösségalkotókat vizsgáltuk e módszerrel (a metil-koenzim- M-reduktáz enzim α alegységét kódoló mcr A gént vizsgálva és adatbázis segítségével azo- nosítva a terminális restrikciós fragmenteket). A Bacteria közösségalkotókat ebben az eset- ben denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) módszerrel vizsgáltuk. A DGGE el ınye az elméletileg elérhet ı igen jó felbontás. A módszerrel elvben egy bázispárban különböz ı DNS-szekvenciák is elválaszthatók egymástól, ráadásul az így elválasztott sávok kés ıbb tovább elemezhet ık. A T-RFLP vizsgálat során szintén bázissorrendbeli különbségek alap- ján jellemezhet ı a vizsgált minta. A módszer felbontása a használt endonukleázok számával növelhet ı, de még így is elmarad a DGGE-tıl, ezért a zsírsavelemzéssel nem elemezhet ı Archaea közösség vizsgálatához használtuk, amelynek dirverzitása mindig jóval kisebb, mint ez eubakteriális közösségé. Az ujjlenyomatvizsgálatok mellett mindhárom munkánk- ban több 16S rDNS gén szekvenciaanalízisét is elvégeztük (klónokból vagy DGGE- sávokból). Az alábbiakban áttekintjük az alkalmazott módszereket.

IV. B. 4. A lipidek preparálása A lipidfrakció preparálása során Findlay módszerét vettük alapul, amelyet több ponton módosítottunk (Findlay, 1996). A minták kezelésük és tisztításuk során csak zsírtalanított, tiszta (tehát semmiféle kemotaxonómiai markert nem tartalmazó) eszközökkel kerültek

57 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

érintkezésbe. Ahol lehetséges volt h őtöttük, fényt ıl és oxigént ıl távol tartottuk a vizsgált anyagot. Az extrakciót tiszta, 200 °C-on 2 órán át zsírtalanított üvegedényekben végeztük. A min- tákat diklór-metán : metanol 2 : 1 arányú elegyébe helyeztük (20 g rothasztott iszapra: 20 ml diklór-metán illetve 40 ml metanol). A lipidextrakció kezd ı lépéseként foszfátpuffert mértünk az elegyhez (20 ml, 50 mM K 2HPO 4 oldat; pH 7.4), és 6 órán át, 4 °C-on mágne- ses kever ıasztalon kevertettük. 24 óra elteltével további 10 ml diklór-metánt és 10 ml desz- tillált vizet adunk a keverékhez, s a jobb sejtfeltárás érdekében 10 percre ultrahangos ráza- tóba (TESLA UC 405 BJ 1) helyeztük a mintát tartalmazó üvegedényt. Ezt követ ıen 12 órán át állni hagytuk az elegyeket. Az üvegben ilyenkor jól láthatóan elkülönül egy alsó, diklór-metános, és egy fels ı, vizes fázis. A metanol túlnyomó hányada fokozatosan átoldó- dik a diklór-metános fázisból a vizes fázisba. A vizes-metanolos fázis nagy részének eltávolítása után üveg centrifugacsövekbe töltöt- tük az elegyet és centrifugálással (Janetzki T32; 500 g) elválasztottuk az iszap szilárd alko- tóit a folyadékfázistól. A centrifugálás vékony, kocsonyás réteggé préseli ezek nagy részét a szerves és vizes fázis határán. A kloroformos fázist 200°C-on zsírtalanított Pasteur- pipettával vittük át Whatmann-papírral (Whatmann 2Chr) bélelt üvegtölcsérbe, így átsz őrve különítettük el a szerves fázist a benne maradt szilárd részecskékt ıl és a vizes fázis maradé- kaitól. A tisztított szerves fázis vákuumos bepárlását (Büchi Rotavapor R-200)) követ ıen a lipidoldékony anyagokat kloroformban vettük fel. A lipidek tisztítása illetve elválasztása sz ők kicsövezés ő, üveggyapot aprítékkal tömített üvegcsövekbe kézzel töltött szilikagél alapú oktadecil oszlopon (Baker Bond Phase C18, 40 m Prep LC Packing) kezd ıdött (IV/6. ábra). Az oszloptöltetet metanollal átnedvesítettük majd nagy nyomású leveg ıvel kloroformot pré- seltünk keresztül rajta, ezzel tömörítettük. A lipidoldékony talajkomponensek oldatát 1-1 ml kloroformban felvéve a kloroformmal nedvesített oszlopra injektáltuk. További 10 ml kloroform átfolyatásával a kinonok számos egyéb anyag IV/6. ábra. A közösségi lipidfrakció kíséretében lemosódnak az oszlopról (IV/6. áb- tisztítása kézzel töltött szilikagél ala- pú oktadecil oszlopok (Baker Bond ra), míg a glikolipidek és foszfolipidek adszorbe- Phase C18, 40 m Prep LC Packing) álódnak az állófázishoz. Ezeket 10-10 ml aceton-

58 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER nal, illetve metanollal eluáltuk. A kinonok (kloroformos) és a foszfolipidek (metanolos) frakcióját további feldolgozásig -20 °C-on eltároltuk. A foszfolipidek metanolos frakciójába 1 ml diklór-metánt adagoltunk a lipidek oxidációjának elkerülése végett.

IV. B. 5. A respiratorikus kinonok analízise A kloroformos frakció a kinonok mellett a nyers iszapextraktum anyagainak jelent ıs ré- szét (pl. az oldat jellegzetes mélysárga színét adó pigmenteket, viaszokat, egyéb zsíroldékony komponenseket) még tartalmazza, ezért további tisztítást igényel, melyet

Kieselgel 60 F 254 típusú szilikagél vékonyrétegen végeztünk, futtatóelegyként hexán és dietiléter 55:10 arányú elegyét használva. A kinonok a számunkra felesleges anyagoktól retenciós idejük alapján szeparálódnak a vékonyrétegen, ezen túlmen ıen azonban egymás- tól is elválnak az ubikinonok és a menakinonok. A kinonmolekulák átes ı UV fényben tör- tén ı detektálását a rétegben található F 254 indikátor teszi lehet ıvé (IV/7. ábra). Vékonyré- teg-kromatográfia esetén nehézséget jelent, hogy a nagy mennyiségben jelen lev ı szennye- zı anyagok némelyike – az anyagfelvitel helyén a réteg szemcséi közé kötve – befolyásol- hatja a kinonok mobilitását illetve az eluensáramlás körülményeit, akadályozva ezzel a kinonok és a szennyez ıdések szeparálódását.

menakinonok

ubikinonok

IV/7. ábra. Szilikagél vékonyréteg kloroformmal eluált lipidextraktum futtatását követ ıen normális fényviszonyok közt és UV transzilluminátoron szemlélve.

Második és harmadik vizsgálatunkban a vékonyréteg-kromatográfia helyett már a jóval egyszer őbben kezelhet ı el ıre gyártott SepPak ® (Waters) szilika oszlopokon végeztük el a kinonok tisztítását illetve szeparálását. Hexánban feloldva injektáltuk az anyagokat az osz- lopokra, majd Hu és mtsai. (1999b) leírását követve 98 : 2 arányú hexán : dietiléter eleggyel mostuk le a menakinonokat, majd 10 : 90 arányúval az ubikinonokat. Az eluált frakciókat bepároltuk, majd acetonitril-izopropanol elegyben visszaoldva vetettük alá HPLC- analízisnek. A kereskedelmi forgalomban standard kinonoldatok csak korlátozottan hozzáférhetık, ezért a kinonmolekulák pontos analíziséhez a mintákkal egyidej őleg autentikus baktérium- törzsek kinonjainak preparálása szükséges, melyek ismert molekulái alapján történik a ve-

59 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER gyületek meghatározása. A kinonok visszanyerése a vékonyrétegr ıl acetonitril izopropanol 65:35 arányú elegyében történt 12 órás rázatással. Az oldatokat nylonfilteres ependorf-sz őrı segítségével tisztítottuk meg a réteg szemcséit ıl (Alltech Micro-Spin Filter Tubes). A sz őr- letet vákuumos exszikkátorban koncentráltuk, s -20°C-on, üvegedényben tároltuk. A mintákat acetonitril : izopropanol 65:35 eluens használata mellett magas nyomású folyadékkromatográffal vizsgáltuk tovább (Pharmacia LKB 2248 pumpa, oszlop: ODS Spherisorb), a kinonokat 270 nm-en történ ı fényelnyelésük alapján detektáltuk (Uvikord II detektor). Az ubikinonok illetve menakinonok azonosítása retenciós idejük alapján történt. Mivel standard kinonok oldatai nincsenek kereskedelmi forgalomban, ismert kinonösszetétel ő autentikus baktériumtörzsek tiszta tenyészeteinek biomasszájából kinyert kinonokat használtunk standardként (Collins és mtsai. 1977). Az általunk használt autentikus törzsek (f ıkinonjuk aláhúzva): Escherichia coli DSM 1116 [Q-8, Q-7, Q-6, Q-5, Q-4; MK-8, MK-n]; Bacillus sphaericus DSM 28 [MK-7, MK- 6, MK-5]; Arthrobacter variabilis DSM 20132 [MK-9(H2) , MK-8(H2), MK-7(H2), MK- 9]; Brevibacterium linens DSM 20426 [MK-8(H2) ; MK-8, MK-7(H2)]; Pseudomonas fragi DSM 3456 [Q-9, Q-8, Q-7, Q-6]; Nocardioides simplex DSM 10368 [MK-8(H4) , MK- 9(H4), MK-8(H6), MK-8(H2), MK-7(H4)]; Tsukamurella paurometabolum DSM 7482 [MK-9, MK-10, MK-8, MK-7) ; Oerskovia turbata /tanszéki izolátum, 99.8 %-ban meg- egyezik a DSM 20577 törzzsel/ [MK-9(H4) , MK-9(H2), MK-8(H4)], Actinomadura verrucosospora DSM 43358 [MK-9(H6) , MK-11(H4), MK11(H2)]. A standard törzsekb ıl nyert kinonstandardokat a mintáktól külön, de egyazon mintaso- ron belül futtattuk a nagy nyomású folyadékkromatográfon. A molekulák poliizoprén- láncának hossza (az izoprénegységek száma) a normált retenciós id ı logaritmusával áll egyenes arányban. Az izoprénegység-szám és a telítettségi fok illet ıleg a retenciós értékek logaritmusa alapján így kalibrációs táblázat készíthet ı melybe extra-és interpolációval a standard csúcsok között nem szerepl ı molekulavariánsok várható lgRT-értékei is bekerül- hetnek. Mivel a kinonok között túlnyomórészt a lánchossz és a telítettségi fok tesz különb- séget (ellentétben a zsírsavakkal, ahol e kett ı mellett a sokféle szubsztituens is bonyolítja a variációs skálát), ez jó biztonsággal teszi lehet ıvé a legtöbb menakinontípus pontos detektá- lását. Ubikinonok közül sajnos csak telítetlen alaptípusok állnak rendelkezésünkre, így kö- zülük csak ez a típus azonosítható. Telítetlen ubikinonok csak gombákban fordulnak el ı, autentikus gombatörzsek pedig nem álltak rendelkezésünkre. A kromatográfiában használatos HP Chem program környezetében igen nehézkesnek és rugalmatlannak találtuk az elemzés lehet ıségeit különös tekintettel az automatikus integrá- lásra és a kalibrációs táblázat alapján történ ı csúcsazonosításra. Ezért Microsoft Excel kör- nyezetben megírt saját illeszt ıprogramunk segítségével szerkesztettünk kalibrációs tábláza-

60 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER tot a (baktériumokból nyert) standard kinonok futási sebessége alapján. Tisztított közösségi kinonjaink kromatogrammjait HP Chem programban manuálisan integráltuk csúcsonként, s a mintánként kimásolt csúcs-összesít ı táblázatokat .txt szövegfájl formájában tároltuk el. A kalibrációs táblázatot, és a mintacsúcsok adatait tartalmazó szövegfájlokat felhasználva ezután egy saját magunk által írt (Delphi7 programozási környezetben kódolt) illeszt ıprogram segítségével végeztük el a csúcsazonosítást, melynek alapja a minta kinoncsúcsai retenciós idejének ±0,04-es ablakon belüli egybeesése volt a standard kinonok retenciós idejével (a retenciós id ı 10-es alapú logaritmus-skáláján mérve; tapasztalati ér- ték). Ahol a standardok csúcsainak távolságlogaritmusa kevesebb volt, mint 2×0,04, ott különbségük felénél lesz a kategóriahatár, ha pedig egy mintabéli csúcs nem esik standard csúcs ablaknyi környezetébe, ott programunk a legközelebbi standard csúcs nevét adja en- nek a molekulatípusnak egy pozitív vagy negatív index-számmal ellátva aszerint, hogy mi- lyen irányban és hányadik ablak-tartományba esik ett ıl a standard csúcstól. Ily módon adat- sorainkban a nem azonosított csúcsok is egymástól megkülönböztethet ı módon, külön név- vel jelennek meg. Így például MK9(H2)+2 jelentése: nem azonosított menakinon-molekula, melynek retenciósid ı-logaritmusa az MK9(H2) menakinon lgRT értékét ıl pozitív irányba esik (nagyobb annál), és az analízisben beállított ablakméret kétszeresének megfelel ı tar- tományban van t ıle számítva. Természetesen a pontos retenciósid ı-értékével indexelve is azonosítható egy molekulatípus, a kés ıbb generált adatsorokat azonban mégis átláthatóbbá teszi ez a módszer.

IV. B. 6. A foszfolipid-zsírsavak származékoltatása és analízise A foszfolipideket tartalmazó metanolos frakcióval Welch (1991) módszere alapján dol- goztunk tovább. Az oldat vákuum-bepárlását követ ıen a lipideket metanol-toluol 1:1 ará- nyú elegyének 0,5 ml-ében oldottuk vissza, átvittük csavarkupakos, zsírtalanított üvegkém- cs ıbe, majd ugyanennyi metanolos KOH (0,2 N) oldatot adtunk hozzájuk, s 15 percig 37°C-on vízfürd ıben inkubáltuk a csöveket. Ekkor történik a transzészterifikáció: a foszfolipidek zsírsavai metilészterekké alakulnak. Leh őlés után 0,5 ml 0,2 N ecetsavoldatot adtunk az elegyhez, s röviden (5 mp) vortexeltük a csöveket, majd 2 ml kloroformot és 2 ml desztillált vizet adtunk az elegyekhez. 30 másodperces er ıteljes vortexeléssel a kloroformos fázisba rázattuk át a metilésztereket. Az ecetsav hozzáadásakor mintáinkban (általunk nem azonosított, és a receptúrákban sem említett) fehér csapadék képz ıdött, amely emulziót képezve er ısen megnehezítette a fázisszeparációt (centrifuga-használat esetén is) és a kloro- formos fázis tiszta edényzetbe vitelét. Kés ıbbi munkáink során találtunk csak megoldást a problémára: a fagyasztás (-20°C-on) megbontja az emulzió szerkezetét, és kiváltja a fázisszeparációt. A bepárolt, majd hexánban felvett metilésztereket gázkromatográfiával

61 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

(HP 5890 gázkromatográf, HP1 kapilláris-oszlop, hélium viv ıgáz) választottuk szét. A zsír- savszármazékokat retenciós idejük alapján standard metil-észterekhez viszonyítva határoz- tuk meg a kinonokhoz hasonló módon saját programunkkal, 0,08 perces (tapasztalati) range-értéken belül megfeleltetve a zsírsavszármazékok RT értékeit a standard metilészterekéivel. Zsírsavak gázkromatográfiás vizsgálatában a retenciós id ı lineárisan arányos a szénlánc hosszával. Mivel az általunk használt gázkromatográf m őködése id ıközben megbízhatatlanná vált, második és harmadik vizsgálatunk során zsírsav-metilésztereink azonosítását már MIDI rendszer segítségével (MIDI Sherlock version 6.1) végeztettük el. A mérés a DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) kemotaxonómiai laboratóri- umában történt, az adatkorrekciót és kiértékelést mi magunk végeztük. Megjegyzend ı, hogy a tiszta tenyészetek vizsgálatára optimalizált MIDI rendszer a közösségi zsírsavprofi- lok csúcsainak meghatározását sok tévesztéssel végezte el, így az eredményül kapott profi- lok csúcsainak egyenkénti manuális ellen ırzésére és a profilok korrekciójára (sok munka- órában) minden esetben szükség volt.

IV. B. 7. DNS-izolálás a mintákból A két kísérleti fermentor iszapjából a MoBio Laboratories termékével, a Soil DNA kit segítségével izoláltunk DNS-t, a gyártó által megadott módszert követve. Az alkalmazott DNS-izolálási módszer a sejtek fizikai (roncsolás üveggyöngyökkel) és kémiai feltárásán (detergenses kezelés) alapul. A mechanikai roncsolással történ ı sejtfeltárást a kit által java- solt vortexelés helyett sejtmalommal végeztük (30 Hz-es rázatás, 2,5 perc). A DNS tisztítá- sa centrifugálással, a fehérjék kicsapásával és a nukleinsavak szilikát alapú mátrixhoz köté- sével történt. A DNS izolálás eredményességét 1%-os agaróz-gélelektroforézis segítségével ellen ıriztük. A gél elkészítéséhez 1 g agarózt, 100 ml 1x TBE oldatot, valamint DNS- festéket használtunk. Utóbbi az els ı vizsgálatban etidium-bromid, a második és harmadik vizsgálatban GR Safe DNA Stain I festék volt. A DNS termék méretének meghatározása 2.5 l Lambda DnA/EcoRI+HindIII Marker 3 (Fermentas) molekulasúly marker segítségé- vel történt. Az elektroforézist 100 V/cm-en, 20 percig végeztük. A DNS jelenlétét UV transzilluminátor segítségével ellen ıriztük.

IV. B. 8. A vizsgált génszakaszok felszaporítása PCR-rel Az els ı vizsgálatban (mezofil-termofil összehasonlítás) 16S rRNS gén két fajmeghatá- rozásra alkalmas szakaszát PCR segítségével amplifikáltuk a mintáinkból T-RFLP-vizsgálat és klónkönyvtár-készítés céljából. Külön PCR reakciót mértünk össze az Archaea és Bacteria domén tagjainak kimutatására alkalmas primerpárok felhasználásával (27 forward

62 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

és TET-519 reverz Bacteria illetve HEX-A344 forward és A934 rererz primerek Archaea esetén). (A premixek összetételét és a reakció h ıprofilját lásd a Függelékben.) A második vizsgálatban (könnyen bontható szubsztrátok adagolása) „seminested” PCR-t végeztünk: el ıször 27 forward és 1492 reverz primerrel sokszorosítottuk a 16S rDNS gént, majd ezt a PCR terméket templátul használva, GC-kapoccsal ellátott 27 forward és 519 reverz primereket alkalmazva újra amplifikáltuk a gén egy szakaszát egy második PCR során. Az így nyert kett ıs szálú DNS-ek végén guaninban és citozinban gazdag szakasz (GC-kapocs vagy GC-clamp) található. Az Archea közösséget T-RFLP elemzéssel vizsgál- tuk. Ennek els ı lépéseként PCR-rel amplifikáltuk az mcrA gént mlas forward és fluorescensen (FAM) jelölt mcrA-rev reverz primerrel. (Az alkalmazott primerek listáját, a reakcióelegyek összetételét és a reakciók h ıprofilját lásd a Függelékben.) A felf őtéses kísérletben Bacteria közösség 16S rDNS-ének egy szakaszát a 27 forward és 519 reverz univerzális primer pár segítségével szaporítottuk fel T-RFLP-vizsgálat és klónkönyvtár-készítés céljából. Az Archaea közösség 16S rDNS-ének egy szakaszát két lépésben („semi-nested” PCR) az A109f és A1000r, majd a 340f és A1000r univerzális primer párokkal amplifikáltuk. Az alkalmazott primereket, a reakcióelegyek összetételét és hıprofilját lásd a Függelékben.) A PCR termékeket Wizard SV PCR Clean-Up Systemet (Promega) használva megtisztí- tottuk. A tisztított PCR termékeket agaróz gélektroforézissel megfuttattuk, a géleket etídium-bromiddal megfestettük, majd a GeneTools (Syngene) programmal meghatároztuk a DNS mennyiségét.

IV. B. 9. Klónkönyvtárak létrehozása A 16S rDNS PCR termékekeit a Viogene PCR-M→Clean Up System (Proteogenix) szilika alapú kitjének segítségével megtisztítottuk, 30 l DEPC kezelt vízzel eluáltuk, majd a templát DNS-t Promega pGEM-T Easy (Promega) vektorokba ligáltuk (37 °C-on egy éjszakán át), az E. coli JM109 kompetens sejteket pedig h ısokkal transzformáltuk a cég által leírt protokoll szerint. A kin ıtt telepeket steril fogpiszkáló segítségével 35 l DEPC kezelt vizet tartalmazó 600 l-es Eppendorf csövekbe mostuk, majd a szuszpenziókat 98°C- on 5 percig denaturáltuk PCR készülékben, ezután 12 000 g-n 3 percig centrifugáltuk. A 98°C-os 5 perces denaturáció során a sejtekb ıl kiszabaduló DNS centrifugálás után a felülúszóba kerül. Innen mértük be a templátokat M13 PCR elegybe. (Az alaklamazott pri- mereket, a premix összetételét és a reakció h ıprofilját lásd a Függelékben.) Az így létrejöv ı termékekb ıl 1 l-t ezután az el ızınek megfelel ı, 21 ciklusos PCR-nek vetettük alá 344f- HEX/934r ( Archaea ) és 27f-TET/519r (Eubacteria) primer párokkal. Ezután a klónokat a közösségi DNS-amplikonokkal megegyez ı módon készítettük el ı T-RFLP analízisre.

63 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER

A felf őtéses kísérletben a PCR amplifikációt követ ıen a DNS terméket EZ-10 Spin Column PCR tisztító kit (Bio Basic Inc., Kanada) segítségével tisztítottuk meg a primer dimerekt ıl és a további alkalmazásokat zavaró sószennyez ıdésekt ıl a gyártó utasításait követve. Ett ıl kezdve a klónkönyvtár készítése az ismertetett módon történt a 6/1, a 6/6 és egy, az itt vizsgált mintasornál kés ıbbi, 2011. március 12-én vett mintából. Jelen dolgozat írásakor a klónok T-RF-eredményei nem álltak rendelkezésre még, így az eredmények érté- kelésében a reprezentáns klónok szekvenciáinak in silico hasításából adódó T-RF hosszakat vetettük össze a közösségi minta T-RF-hosszaival, s [a T-RF-driftb ıl adódó hibalehet ısé- gek figyelembe vételével (Kaplan és Kitts 2003)] ilyen módon feleltettük meg egymásnak a közösség domináns csúcsait és a klónokat.

IV. B. 10. A klónok csoportosítása Amplifikált Riboszomális DNS Restrikciós Analízis (ARDRA) segítségével A felf őtéses kísérletben szekvenálandó klónjaink sz őrésére ARDRA-csoportokat hoz- tunk létre. Az inszert DNS amplifikációját követ ıen a termékeket restrikciós emésztésnek vettettük alá, amely a Bacteria esetén AluI és BsuRI (HaeIII), az Archaea közösség vizsgá- latakor AluI és MspI (HpaII) enzimekkel történt (összetételt, hasítóhelyet ld. a Függelék vonatkozó pontjában). Az emésztmény detektálása 2%-os agaróz gélben történt. A felhasz- nált agaróz mennyisége 2 g volt. További eltérés, hogy ARDRA elemzés esetén 20 l-nyi mintát vittünk fel a gél zsebeibe 8 l tölt ı pufferrel való összekeverés után. A futás 80 V/cm-en, 90 percen keresztül zajlott. A kapott mintázatok alapján a klónokat csoportosítot- tuk, a két enzimmel hasított DNS termékek gélben kapott mintázatának egyezése esetén egy ARDRA csoportba kerültek. Minden csoportból kiválasztottunk egy-egy reprezentánst, amelyet bázissorrend meghatározásnak vettetünk alá.

IV. B. 11. T-RFLP analízis A terminális restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (T-RFLP) szemikvantitatív mo- lekuláris ujjlenyomat módszer, amely során a kialakuló terminális fragmensek (T-RF-ek) mintázata alapján következtetni lehet az egyes közösségalkotók (fajok) jelenlétére, valamint azok relatív abundanciájára. A T-RFLP során az emésztett PCR termék fluoreszcensen je- lölt terminális fragmensei a kapott kromatogramban egy-egy csúcsként jelennek meg, a közösség egy-egy tagját képviselve. A csúcs alatti terület pedig a DNS relatív mennyiségé- rıl, ezáltal a közösségbeli dominanciaviszonyokról ad információt. A különböz ı közössé- gek így specifikus mintázattal jellemezhet ıek, amelyek alapján az egyes közösségek össze- tétele összehasonlítható. A mezofil és termofil közösségek mintáiból és a klónkönyvtár mintegy száz tagjából származó PCR-termékeket vetettük alá T-RFLP-analízisnek. A fluoreszcensen jelölt prime-

64 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER rekkel készült PCR termékekb ıl restrikciós endonukleázt tartalmazó reakcióelegyeket állí- tottunk össze. (Az elegyek és pufferek összetételét lásd a Függelékben.) Az emésztett min- tákat ezután etanolos precipitációnak vetettük alá. (Menete a Függelékben.) Az így megtisz- tított közösségi 16S rDNS-hez 30 µl dH 2O-t adtunk, majd az elektroforézisig -20°C-on tá- roltuk. Futtatás el ıtt a mintákból er ısségüknek megfelel ıen 1-4 µl-t mértünk 12 µl formamid és 0,5 µl TAMRA 500 (Applied Biosystems) elegyébe, majd 98°C-on 5 percig denaturáltuk. A terminális fragmentek elválasztását ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) kapilláris gélelektroforézis készülékkel végeztük. Ennek során a min- tákkal együtt eltér ı fluoreszcens jelöléssel ellátott molekulasúly standardot is futtatunk, esetünkben ez a TAMRA 500 (Applied Biosystems) volt, melynek segítségével kés ıbb meg tudjuk állapítani a fragmentumok pontos hosszát GeneScan (Applied Biosystems, 3.1.2. verzió) programcsomag segítségével. A jel intenzitása arányos a kópiaszámmal, ezért a görbe alatti terület nagyságából következtethetünk a közösség relatív abundancia viszo- nyaira is, a PCR technika torzítását figyelembe véve (Polz és Cavanaugh 1998, Lueders és Friedrich 2003). Az adatok értékeléséhez a T-Align, interneten elérhet ı programcsomagot használtuk (Smith 2005). A könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában a PCR termékeket HaeIII, MspI (New England Biolabs) restrikciós endonukleázzal emésztettük. A 10 l végtérfogatban mintegy 10 ng DNS tartalmú PCR termékhez 10 egység (U) enzimet adtunk és 30 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk a reakcióelegyet (Tauber és mtsai. 2013). (A reakcióelegyek összetételét lásd a Függelékben.) A csúcsokat a németországi kollégák mcrA adatbázisa segítségével azonosítottuk „ in silico” emésztések során (Nikolausz és mtsai 2012). Az adatbázis különféle mintákból izolált szekvenciákat tartalmaz teoretikusan, és a gyakorlat- ban is meghatározott T-RF-méretekkel. A felf őtéses kísérlet feldolgozásában Bacteria esetében AluI (Fermentas) és BsuRI (Fermentas) enzimek hasítottak, míg Archaea-vizsgálathoz AluI (Fermentas) és MspI (Fermentas) restrikciós endonukleázokat használtuk. (A reakcióelegyek összetételét lásd a Függelékben.)

IV. B. 12. DGGE Mivel a G-C kötés stabilabb, mint az A-T, denaturálódásnál a láncvégekre épült GC- gazdag DNS szakaszok kevésbé hajlamosak szétválni, ezáltal egy úgynevezett GC-kapcsot (GC-clamp) alkotnak. Így a denaturálódás során a kett ıs szálú DNS az egyik végénél nem fog szétválni, ennek következtében a teljesen denaturálódott DNS adott denaturálóanyag- koncentrációnál megáll a gélben, nem vándorol tovább. A gélben optimális esetben egy-egy

65 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER csík egy-egy taxonnak felel meg, a csíkok intenzitása pedig arányban áll a taxon abundanciájával a közösségen belül. Az elektroforézishez 7 %-os poliakrilamid tartalmú gélt használtunk. A grádiens el ıállí- tásához 40 százalékos és 60 százalékos denaturáló gél törzsoldatokat készítettünk, ahol de- finíció szerint a 100 százalékos denaturáló koncentrációjú gél 7 M ureát és 40 százalék formamidot tartalmaz. A 40 százalékos törzsoldat elkészítéséhez 4,8 ml 40 százalékos akrilamid oldatot, 480 l 50-szeres töménység ő Tris-acetát-EDTA (TAE) puffert, 4 g ureát és 3,84 ml formamidot 24 ml-re egészítünk ki desztillált vízzel. A 60 %-os törzsoldathoz 4,8 ml 40 %-os akrilamid oldatot, 480 l 50-szeres töménység ő TAE puffert, 5 g ureát és 4,8 ml formamidot egészítünk ki 24 ml-re desztillált vízzel. Az oldatokat ultrahangos ráza- tással buborékmentesítettük, majd közvetlenül a gélöntés el ıtt 50 l 20 %-os ammónium perszulfát oldatot és 50 l tetrametil-etilén-diamin (TEMED) oldatot adtunk, ami beindítja a polimerizációt. A denaturáló grádiens gélt perisztaltikus pumpa és grádienskever ı segítsé- gével öntöttük, amelyre denaturálószert nem tartalmazó tölt ı gélt rétegeztünk. A végs ı PCR termék teljes térfogatát (45 l) Hamilton-fecskend ıvel juttattuk a gél zsebeibe. Az elektroforézist 1 %-os TAE pufferben, 60 °C-on, 80 V feszültséggel 15 órán át INGENY PhorU készülékben végeztük. Ezután a gélt etídium-bromidban 30 percig festettük, majd kétszer 15 percen keresztül mostuk 1 %-os TAE pufferben. A kialakult futási mintázatot átes ı UV fény mellett digitális kamerával rögzítettük. A sávmintázatot TotalLab (TL120, Nonlinear Dynamics) képelemz ı programmal kiértékeltük és ez alapján elvégeztük a min- ták klaszteranalízisét.

IV. B. 13. Sávok kivágása a DGGE gélb ıl és újbóli felszaporításuk A poliakrilamid gélb ıl UV átvilágítás mellett, steril szikével kivágtuk a diszkrét csíko- kat, s ezeket steril Eppendorf-csövekbe tettünk. A csíkokra mintánként 20 l steril DEPC- kezelt desztillált vizet pipettáztunk és 12 órán keresztül 4°C-on inkubáltuk. Másnap a felül- úszót átmértük új tesztcsövekbe és felhasználásig -20°C-on tároltuk. A gélcsíkokból eluált DNS-t szekvencia meghatározás céljából ismételt PCR amplifikációnak vettettük alá a ko- rábbi PCR-DGGE analízisnél használt primerpárokkal, azonban a forward primer ezekben az esetekben jelöletlen volt. A PCR termékeket Viogene PCR-M® Clean Up System rend- szerrel (Viogene-Biotek Corp Sunnyvale, CA, USA) tisztítottuk a gyártó utasításainak meg- felel ıen.

IV. B. 14. Bázissorrend-meghatározás A mezofil-termofil összehasonlításban a közösségek és a klónok két enzimmel kapott T- RFLP mintázatait összevetve választottuk ki klónkönyvtárunk azon tagjait, melyek átfed ı csúcsokat adtak a közösségi minták T-RFLP eredményeivel. Ezeken aztán

66 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER szekvenciavizsgálatot végeztünk. A transzformált sejtek telepeib ıl izolált DNS-t el ıször M13 primerekkel amplifikáltuk, majd az így kapott fragmentekre doménspecifikus prime- rekkel mértünk össze PCR-t, ennek termékét Viogene kittel megtisztítottuk. Az ekképpen tisztított DNS-re állítottunk össze szekvenáló PCR-t, mely a Sanger-féle stop-nukleotidos módszeren alapul annyi kiegészítéssel, hogy az egyes dideoxi-nukleotidok más-más hul- lámhosszon fluoreszkáló festékkel jelöltek. Ehhez az ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit-jét (Applied Biosystems) használtuk. A reakcióhoz hasz- nált primerek a már említett 519r és 934r oligok voltak. (A szekvenáló reakció összetételét és a reakció h ıprofilját lásd a Függelékben.) A szekvenáló reakció termékét etanol precipi- tációval tisztítottuk, ezután ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) automa- ta szekvenátorral elemeztük. A szekvenciákat Chromas programcsomaggal ellen ıriztük és a kapott adatokat BLAST internetes adatbázis segítségével illesztettük és analizáltuk. A könnyen bontható szubsztrátok vizsgálatában a DGGE-sávokból felszaporított termé- kek szekvenálása hasonlóan történt. A reakciójához használt primerek 27f és 519r oligok voltak. A szekvenciameghatározás a LGC Genomics GmbH berlini laboratóriumában tör- tént. Kiméra szekvenciákra Mallard szoftverrel sz őrtünk (Ashelford és mtsai. 2006), a ki- mérákat kizártuk a további vizsgálódásból. A felf őtéses kísérlet esetében a klónozott gének bázissorrend meghatározását ugyancsak a LGC Genomics GmbH berlini laboratóriumában végezték el. Az alkalmazott primerek 27f és 519r oligok voltak. A bázissorrend-adatok kiértékelését MEGA5 program segítségé- vel végeztük. A kapott szekvenciákkal legközelebbi rokon szervezeteket nyilvános adatbá- zisban (GenBank) kerestük meg a BLAST program segítségével (Altschul és mtsai. 1997), valamint a legközelebbi tenyészthet ı rokon fajokat (típustörzseket) az interneten elérhet ı EzTaxon adatbázis alkalmazásával azonosítottuk (Kim és mtsai. 2012).

IV. B. 15. Az adatok kiértékelése Adataink kiértékeléséhez és eredményeink szemléltetéséhez Microsoft Excel ® progra- mot illetve PAST statisztikai programot (Hammer és mtsai. 2001) használtunk, valamint saját fejlesztés ő szoftvereinket alkalmaztuk. A házi programok és a többféle mérési rend- szer használatából kifolyólag sokszor további feladat volt a különböz ı minták táblázatainak egybeszerkesztése közös adatmátrixszá. Ez nagyszámú változó esetén manuálisan már rendkívül vesz ıdséges munka, így ezt is a számítógépre bíztuk: a minták adatsorait egysé- ges táblázatba rendez ı program megírására Szabó Zsoltot kértük fel, aki a buborékszámlá- lásos gázhozammér ı módszer kifejlesztésekor is a szoftverkódolás kivitelez ıje volt. Az általunk kidolgozott, származtatott változókat is elemzésbe vonó adatkezelési eljárás kivitelezése érdekében illetve ennek tesztelésére alkalmas szimulált adatsorok generálásá-

67 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER hoz szintén saját szoftverre volt szükségünk. A szimulációkból valamint a valós mintákból származó adatmátrixok értékeib ıl adatkezel ı programunk adatcsoportokon belül meghatá- rozott tagszámú összeadásokat végez, megfelel ı adatsz őrést hajt végre, majd a képzett ösz- szegeket mint származtatott változókat a kiindulási adatokkal együtt klaszteranalízisnek veti alá. Ennek eredménye alapján nagyítható (így részleteiben is tanulmányozható) és nyomtat- ható hasonlósági fát szerkeszt. Az adatkezelési koncepció részletes kifejtésére a V. B. 3. 3. fejezetben kerítünk sort. Az újszer ő adatkezelési módszer tesztelésére mikrobaközösségek molekulamarkereinek id ıbeli szintváltozásait szimulálni képes szoftvert is kódoltunk. Ez egy megadott tagszámú virtuális mikrobaközösség populációdinamikáját modellezi egy általánosított Lotka-Volterra modell alapján. A virtuális közösségalkotókhoz (el ıre beállít- ható szorzó szerint) hozzárendelt virtuális markermolekulák szintjét minden generációs lépésben feljegyzi. Így egy, a valóságosakhoz hasonló adatmátrixot generál különböz ı típu- sú markerekkel (ahogy a valóságban is dolgozunk pl. zsírsav-, kinon- és DNS- markerekkel), melyek hordozzák az információt a közösség id ıbeli változásairól. Ám a valós helyzett ıl eltér ıen itt eleve pontosan ismerjük a markereket „termelı” szervezetek kilétét (hisz mi magunk rendeltünk markereket a közösségalkotókhoz). Így ezen adatsorok segítségével tesztelhet ıvé válik bármely adatkezelési eljárás a tekintetben, hogy az adatso- rok alapján képes-e az eredeti közösségszerkezetre utaló, használható információt nyújtani. A programok kódolását az ELTE Informatikai Karával közösen végzett szakdolgozati ko- operációs program keretében Czigler András végezte, aki az adatrendezés tökéletesítésében is segítségünkre volt (Czigler 2010). A felf őtéses kísérlet T-RFLP-eredményeit – szintén az V. B. 3. 3. fejezetben tárgyalt okokból – visszakorrigáltuk az eredeti biomasszamennyiségnek megfelel ı mennyiségi ará- nyokra, ahol a biomasszamennyiség becslését a közösségi zsírsavak mennyiségi összegzé- sével végeztük. Az összefüggéskeresést zavaró hatások csökkentése érdekében a statisztikai elemzésekb ıl kizártuk azokat a markerváltozókat, amelyek a) csak egyetlen mintában vol- tak jelen, és fajlagos mennyiségük a markercsoportban nem érte el az 5%-ot, b) amelyek kevesebb, mint a minták felében voltak jelen és egyikben sem érték el az 1%-ot csoportju- kon belül, c) azon nem azonosított kemotaxonómiai markerek, amelyek kevesebb, mint 10 mintában voltak jelen, s egyikben sem érték el az 5%-ot kategóriájukban. (Utóbbi kritérium hatálya alá csupán 6 db, az ubikinon-adatsorban szerepl ı nem azonosított változó esett, mindegyik 2%-os el ıfordulás alatt).

68 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK V. A. Új metódus kidolgozása kis produkciójú gázforrások hozamának volumetriás mérésére

V. A. 1. A módszertesztelés eredményei

V. A. 1. 1. Az eszköz kalibrálása ismert standard gázforrás ellenében Az általunk használt rendszerparaméterek (800×600 felbontású kamera, 6 mm bels ı cs ıátmér ı, 28 cm-es távolság a csövek síkja és a kamera frontlencséje között) mellett a következı eredményeket kaptuk. Els ı körben 11 értékelhet ı mérést végeztünk. Minden mérés 100 buborék áthaladásáig tartott 0,87 ml/perces állandó hozam mellett. Csupán a kézi kalibrálásra hagyatkozva (vagyis csak c1 korrekciós faktort használva; 3,25 px) a detektált gázmennyiség (átlagosan 59,81 ml) 5.82±0,18%-kal volt kisebb, mint a standard hozam alapján kalkulált mennyiség (átlagosan 62,6 ml). Bevezetve ebb ıl a különbségb ıl c2 kor- rekciós faktort (0,0279 ml) a következ ı 11 mérésben a detektált gázmennyiség sokkal job- ban közelítette a várt értéket: a különbség mindössze ±0,17% volt. A szisztematikus hiba tehát elt őnt.

V. A. 1. 2. Tesztelés bioreaktorokon Két reaktor három, egyenként kett ı napos rátáplálási periódusának gázhozammérését végeztük el, minden rátáplálási id ıpontban újra indítva a buborékszámlálást. Kis id ıfelbon- tással szemlélve a hozamgörbéket (V/1. ábra) karakterisztikus mintázatot látunk kezdeti magas, de gyorsan csökken ı hozammal, stabil gáztermelési periódussal, majd hosszan el- nyúló leszálló ággal. Az V/1. ábrán az is megfigyelhet ı (az els ı mérési periódus görbéin bemutatva), hogy az adatpontokba átlagolt mérési alapértékek (vagyis buboréktérfogat-t adatpárokból számolt hozamértékek) szórása nagyobb, mint a szomszédos (két óránkénti) átlagértékek különbsége. Ha összevetjük a buborékméret-adatok és a t id ıadatok relatív szórását (V/1. táblázat), láthatjuk, hogy az utóbbi felel a hozamszórás nagy részéért, mint- egy tízszeresen meghaladva a méretek relatív szórását. Ez az ingadozás a buborékok érke- zési ütemében ráadásul nem volt kaotikus, hanem egy határozottan szabályosnak t őnı, in- tenzív oszcilláció képét mutatta, melyet a két órás átlagadatok természetesen elfedtek. Nagy (buboréknyi) id ıfelbontással ábrázolva a hozamgörbét (V/2. ábra) mind az ingadozás inten- zitása, mind szabályossága nyilvánvalóan látszik. A buborékok érkezési ütemének id ıbeli fluktuációját parallel videofelvételekkel is igazoltuk. A gázkilépés periodikusan vissza- visszaesett akár 80%-kal, majd újra maximumáig n ıtt.

69 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2

Gázhozam [ml/perc] Gázhozam 0.1 0 0 10 20 30 40 Mérési id ı [óra] A1 A2 A3

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Gázhozam [ml/perc] Gázhozam 0.1 0 0 10 20 30 40 Mérési id ı [óra] B1 B2 B3 V/1. ábra. Biogázhozamok 2 órás bontásban. a: A reaktor eredményei. b: B reaktor eredmé- nyei. A hibasávok az adatpontok szórását mutatják A1 és B1 mérések esetében.

a buborékméretek relatív szórása a t értékek relatív szórása A1 0,064 0,623 A2 0,056 0,520 A3 0,062 0,708 B1 0,076 0,459 B2 0,069 0,638 B3 0,073 0,670 V/1. táblázat. A buborékméretek és t id ıintervallumok relatív szórása.

70 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

0.8 0.7

. 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Gázhozam[ml/perc] 0.1 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44

0.8 Mérési id ı [óra] 0.7 . 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2

Gázhozam [ml/perc] [ml/perc] Gázhozam 0.1 max. 0 7:12:00 9:12:00 11:12:00 13:12:00 15:12:00 Mérési id ı [óó:pp:mm] V/2. ábra. A1 periódus hozama maximális (mindenkori t-nyi) felbontással, melyen minden buborék adatpontja szerepel. A jelölt id ıszakban a hozamingadozás frekvenciája maximális volt.

Hogy egzakt módon tudjuk karakterizálni az észlelt oszcillációt, az adatsorokból Morell hullámhossz-spektrumot generáltunk (V/3.a. ábra). (Az angol wavelet spectrum kifejezés- nek eddig nem ismertük meg elfogadott magyar változatát. Talán a hollámhossz-spektrum kifejezés t őnik alkalmasnak, holott az általunk használt ábrázolásban inkább a periódusid ı- spektrum volna szabatos.) Egy efféle spektrumon a vizsgált adatsor ingadozásainak perió- dusid ıi vannak feltüntetve a mérési id ı ellenében, mégpedig matematikailag generált ideá- lis hullámokhoz való illeszkedésük szignifikanciaszintjei szerint, színkódolt tartományok formájában feltüntetve. Ez az ábrázolásmód akkor is jól elkülönülten mutatja az adatsori ingadozások karakterisztikáit, ha egyszerre több háttértényez ı ingadozása rakódott az ada- tokra. Ilyenkor függ ıleges irányban (azaz más periódusid ıvel) elkülönül ı szignifikanciamaximumok mutatják a spektrumon az adatgrafikonokon sokszor kivehetet- lenül egymásra íródó szabályos ingadozások jelenlétét. A spektrum által kirajzolt szignifikanciamaximum-zónák y irányú középpontjaiból megszerkesztettük a gázhozamgörbéink oszcillációinak frekvenciaprofiljait (V/3.b. és c. ábra). Ezeken jól látha- tó, hogy közvetlenül rátáplálások után hosszabb periódusú ingadozás kezd ıdött (az y ten- gely fordított!), ezt követ ıen gyorsul az ingadozás, míg az id ıszak 20. órája táján eléri ma-

71 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ximumát. Ez után enyhén csökken ı tendencia következett minden esetben. A lassú kezdeti ingadozás különösen B reaktor esetében volt igen kifejezett. 5 10 (a) 15 20 25 30 35 40 5 10 (b) [perc] [perc] 15 ı 20 25 30 35 A1 A2 A3 Periódusid 40 0 10 20 30 40 5 10 15 (c) 20 25 30 35 40 B1 B2 B3 45 0 10 20 30 40

Mérési id ı [óra] V/3. ábra. Morell-féle hullámhossz-spektrum és frekvenciaprofilok. a: A1 periódus hullám- hossz-spektruma. b és c: A illetve B reaktor hozamainak frekvenciaprofiljai az 1., 2., és 3. pe- riódusban. A folytonos vonalak egyazon maximálszignifikancia-mezık pontjait kötik össze, a szaggatott vonalak a szomszédos mez ık közeli pontjait. További magyarázat az V. A. 2. feje- zetben.

Az észlelt ingadozás legnagyobb id ıbeli következetességgel és szignifikanciával az A1 mérési periódusban jelentkezett (ezt mutattuk be az V/2. és az V/3.a. ábrákon). Ebben az esetben a frekvenciamaximum a mérés kezdetét ıl számolt 11:12:00 - 12:02:00 id ıinterval- lumra esett, ahol a periódusid ık átlaga 12 perc 39 másodperc volt. Négy periódus esett ebbe szakaszba, mindegyik alatt 7 buborék érkezett 0,44 ml-es átlagtérfogattal. Vagyis egy ilyen periódus alatt a gázhozam 3,08 ml volt. On-line pH-mérést is végeztünk, hogy fényt derítsünk a gázkilépés ingadozó voltának esetleges fizikokémiai hátterére. A pH a mérési id ıszak folyamán 6,8 - 7 értékek között változott, de semmiféle kimutatható ingadozását nem tapasztaltuk.

72 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V. A. 2. A módszertan és a módszertesztelési eredmények értékelése

V. A. 2. 1. Módszerünk el ınyei és korlátai A digitális képalkotási technikák és a mintázatfelismer ı szoftverek mai fejlettségi szint- jén kézenfekv ı alkalmazni ezeket az eszközöket egyszer ő mérési feladatok elvégzésére. Az áramló gáz buborékok formájában folyadékban láthatóvá tehet ı, és geometriailag alkalmas módon felépített eszközzel a gázbuborékok kis hidrosztatikai nyomás ellenében, reprodu- kálható méretben és alakban, pontos nyomvonalon, kicsi és állandó sebességgel képesek mozogni, aminek következtében megbízhatóan észlelhet ık, számolhatók és mérhet ık mint egy alkalmasan kialakított vizuális mintázat részletei. Nincs szükség sem komplex vagy precíz technikával kialakított mozgó alkatrészekre, sem szelepekre vagy speciális detekto- rokra. Egy egyszer ő, olcsó webkamera üvegcsövek fölé rögzítve, valamint egy alkalmas szoftver elvégzi a mérés egészét anélkül, hogy bármilyen számottev ı módon befolyásolná a mért rendszert. Mindössze a csövekben (melyek speciális kotyogóként is felfoghatók) talál- kozik a gáz csekély hidrosztatikai ellennyomással, melyet a termel ı gázforrás légkörit meg- haladó enyhe túlnyomása is leküzd már. Nincs szükség hardvervezérlésre a kamera m őköd- tetésén túl. A csövek végére csatlakoztatható esetleges gázgy őjt ı zsákok sem befolyásolják a mérés eredményét, ha pedig mégis, csak ideiglenesen, a nyomásarányok állandósulásáig. Nem utolsósorban pedig eszközünk minimális ráfordítással b ıvíthet ı több csatornás készü- lékké: gázforrásonként csupán egy további üvegcsövet kell a látótérbe helyezni. A látótér mérete illetve a kamera felbontása természetesen korlátját jelenti ennek is, de jelenlegi szoftver-verziónk 8 csatorna (cs ı) mérésére eleve alkalmas, így nyolc gázforrás mérése mindössze hét L-cs ıvel jelent nagyobb ráfordítást, mint egyetlen forrás mérése. Ez az esz- közszint ő egyszer őség meglehet ısen praktikussá teszi módszerünket. A látótér nagyságának és a kamera csövekt ıl mért távolságának változtathatósága a mindenkori igények szerinti optimum keresésének lehet ıségét kínálja. A kamera látóterébe annál több párhuzamosan mérhet ı cs ı fér (kis szoftvermódosítással a mérhet ı csövek szá- ma 8 fölé emelhet ı, erre azonban nekünk sosem volt szükségünk idáig), minél távolabb van a kamera a csövekt ıl. Ekkor azonban a buborékok kisebb szög alatt látszanak, ami a méretmeghatározás pontosságát és a jel-zaj arányt kedvez ıtlenül befolyásolja. (Ez a kamera felbontásának növelésével természetesen visszakorrigálható). Fordítva is igaz ugyanakkor, hogy a mérhet ı csövek számának rovására a mérési pontosság jelentısen javítható a kamera és a csövek közelítésével. A csövek megdöntési szögének váltakozásával sz ők határok kö- zött kereshetünk optimumot a buborékok sebessége és az id ımérés pontossága, illetve a buborékok mérete és száma között. A buborékok sebességének növelése nagyobb gázho- zam esetén indokolt, amikor a buborékok gyorsan is képz ıdnek, és fél ı, hogy túl nagyra nınek, vagy nem ideális áramlási viszonyok esetén beérik egymást, és egyesülnek a cs ıben.

73 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

A nagy buborékméret el ınye viszont, hogy er ısen javítja a térfogatmérés pontosságát a jel- zaj arány javítása és az esetleg fennmaradó szisztematikus hibák arányának csökkenése miatt. A kis buborékméret el ınye ugyanakkor, hogy adott mennyiség ő gáz több buborék formájában fog megjelenni, ami a mérés id ıbeli felbontását növeli. Zajon a fentiekben az abból ered ı hibákat értjük, hogy a kamera felbontása véges, az észlelhet ı buborékhatár képe ráadásul a folyadék- és gázfázis között a meniszkuszok miatt eleve bizonytalan. Így a folyadékáramlás ingadozásából, az eszköz és/vagy az épület mikromozgásaiból vagy a megvilágítás esetleges ingadozásaiból fakadóan változó optikai mikrotényez ıkön múlik, hogy egy határpixelt a program a buborék vagy környezete része- ként azonosít majd. Ez azonban aligha jelenthet egy pixelnél nagyobb bizonytalanságot buborékhatáronként, azaz két pixelnyit buborékonként. Nem mindegy azonban, hogy ez a két pixelnyi esetleges hiba például egy hét pixelesnek detektált buborékon alapuló térfogat- számítást terhel, vagy egy harminc pixelesen alapuló mérést. Módszerünk hátrányaként tartható számon, hogy a gáz, ha kevés folyadékkal is, de kon- taktusba lép, amire tekintettel kell lenni a folyadék és a festék megválasztásánál, illetve el- kerülhetetlen a gázkomponensek részleges beoldódása a folyadékba. Ezen a téren ugyanak- kor további optimalizálási lehet ıségek is nyílnak. Walker és mtsai. (2009) úgy találták, hogy 75%-osan telített sóoldat használatával a folyadékkiszorításos gy őjt ıedényekben megel ızhet ı a gázkomponensek beoldódása. Sóoldat minden további nélkül alkalmazható a buborékszámoló csövek esetében is, amennyiben a festékanyag színén és/vagy id ıtállósá- gán ez nem változtat.

Festékanyagként munkánk során 0,06 mM-os KMnO 4 oldatot használtunk optimálishoz közeli magenta (R: 255 G: 0 B: 255) színe miatt, a permanganát ionok azonban lassan Mn- oxiddá redukálódva mintegy két hét alatt elbarnították a csöveket, így azok rendszeres tisz- títást igényeltek. Kés ıbbi munkáink során alternatív fest ıanyagokat keresve megállapítot- tuk a 0.5 M-os (telítettség-közeli) CuSO 4 oldat alkalmasságát optimálishoz közeli ciánkék (R: 0 G:255 B: 255) színe miatt. A töménység az oldat kezelését megnehezítheti, ugyanak- kor a gázbeoldódás problémájára önmaga megoldást jelenthet. Egyéb, inertebb rézsók ugyanúgy szóba jöhetnek (pl. CuCl 2). Optimálishoz közeli sárga (R: 255 G: 255 B:0) színe miatt jól tudtuk alkalmazni a 0,0015%-os Na-fluoreszcein oldatot, amelyet azonban – más rendszereken szerzett tapasztalataink alapján – a gáz ammóniatartalma színtelenít el rövid id ın belül, így magas nitrogéntartalmú anyagok rothasztásánál meggondolandó a használa- ta. A környez ı h ımérséklet hirtelen változásai befolyásolhatják a mérés eredményét, amennyiben a buborékok összehúzódnak vagy kitágulnak a csövek belsejében. Amennyi- ben a pontosság megkívánja, és lehet számítani a küls ı h ımérséklet hirtelen ingadozásaira,

74 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

érdemes a készüléket a reaktorokkal együtt termosztálni. A gáz természetesen összehúzód- hat vagy kitágulhat a csöveket megel ızı gázvezetékben is. Kétségtelen, hogy egy hideg gázbuborék több anyagot foglal magában, mint egy ugyanakkora meleg. Ne felejtsük el azonban, hogy térfogatáramot mérünk, eszközünk valóban nem alkalmas anyagáram méré- sére. Természetesen szimultán h ımérséklet- és nyomásmérés lehet ıvé teszi az adatok ilyen célú korrekcióját is, az együtt termosztálás azonban egyszer őbb megoldásnak t őnik. A habzás minden bioreaktorokkal foglalkozó kísérlet egyik f ı buktatója. Eszközünk el ı- nyére válik e téren is az egyszer őség. Nem kerülnek érintkezésbe érzékeny alkatrészek az esetleg túlfutó habbal. Csupán a gázvezetékeket és a mér ıcsöveket kell kitisztítanunk. Ter- mészetesen a hab belépése az eszközbe ellehetetleníti a további mérést, ez azonban valószí- nőleg minden egyéb módszerre ugyanígy igaz. Habzásgátló anyagok adagolása javallott ilyen esetekben, Mathiasen (1989) Mg 2+ és Ca 2+ adagolását javasolja ilyen esetekre, de id ı- szakos habzás esetén számunkra az is megoldást jelentett, ha csökkentve az iszapmennyisé- get egyszer ően nagyobbra hagytuk a reaktorok gázterét.

V. A. 2. 2. A teszteredmények értékelése A tesztel ı és egyben kalibráló mérés standard gázforrással szemben azt mutatta, hogy a használt paraméterek esetén a manuális kalibráció és vizuális korrekció (c1) önmagában is alig 6%-os szisztematikus hibával terhelt mérést tesz lehet ıvé. Bevezetve c2 korrekciós faktort (amely voltaképpen nem más, mint a kalibráló mérés szisztematikus hibája elosztva a buborékszámmal) a kés ıbbi mérésekben a szisztematikus hiba a mérési értékek szórásá- nak értéke alá csökkent, tehát 0,17% alá. A c2-es faktor bevezetése ennél fogva ajánlatos. Ez a pontosság azonban csak állandó buborékméretek esetén érhet ı el, ez pedig állandó gázfejl ıdési sebesség mellett lehetséges. Mivel utóbbi valódi mérési szituációban természe- tesen nem várható hosszú távon, ennél valamivel nagyobb pontatlanságra kell számítani. A pontatlanságok f ı forrásai minden bizonnyal a kalibrációkor és a méretmeghatározásoknál fellép ı, szabad szemmel nem korrigálható alá- és fölébecslések (amennyiben a számítógép id ımérése kielégít ıen pontosnak tekinthet ı). Számítani lehet arra, hogy a meniszkuszi alá- vagy fölébecslések az eltér ı látószög miatt kissé eltérnek különböz ı méret ő buborékok esetén, ezen eltérések pedig nem korrigálódnak sem c1, sem c2 faktorokkal. Ez valószín ő- leg igen csekély mérv ő hibát ad a méréshez, ugyanakkor felveti esetleges dinamikus kor- rekciós változók bevezetésének lehet ıségét kés ıbbi módszerfejlesztés keretében. A bioreaktorokon végzett méréseink eredményeit tekintve a kis id ıfelbontású gázhozamprofilok (V/1. ábra) alakja könnyen értelmezhet ı. A kezdeti gyors gázfejl ıdés a nyersiszap könnyen továbbalakítható kis molekulájú szerves anyagainak, például illó zsír- savak gyors bontásának köszönhet ı (mely utóbbiak jelenlétér ıl a nyersiszapban érzékszervi

75 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

úton is könnyen meggy ızıdhetünk). Ezt az el ızı periódus végén felhalmozódott metabolikus enzimek illetve a rátápláláskor bekeveredett oxigén jelenléte is segíti. Utóbbi szerepét alátámasztják kés ıbbi gázösszetétel-méréseink, melyek szerint CO 2 a rátáplálást követ ı kezdeti id ıszakban a metánnál jól láthatóan nagyobb arányban termel ıdik. A CO 2 id ıszakos többlete a fakultatív anaerob közösségalkotók légzési végtermékeként magyaráz- ható. Ezzel párhuzamosan megindul a biopolimerek bontása, ami következ ı id ıszakban folyamatos tápanyag-utánpótlást és stabil gázhozamot biztosít. A biopolimerek fogyásával feltételezésünk szerint megindul a közösség önlebontása, ami a fokozatos, elnyúló hozam- csökkenéshez vezet a periódusok végén. Az efféle hozamprofilok tanulmányozásából in- formációt nyerhetünk a mikrobaközösségek állapotáról, szubsztráthasznosítási hatékonysá- gáról, éhezést őrésér ıl stb. Célunk a Morell hullámhossz-spektrumok elkészítésével annak megállapítása volt, hogy az észlelt, rövid periódusú hozamingadozás kísérleti vagy mérési m őtermék-e, avagy a kö- zösség élettanában és/vagy a rothasztott iszap fizikokémiai sajátságaiban rejl ı bels ı oka van. Amennyiben a fluktuációt ébreszt ı hatás forrása küls ı (pl. a termosztát visszacsatolá- sok közötti h ıingadozása, szabályosan jelentkez ı zavarok a mágneses kevertetésben, nem várt hibák a buborékészlelésben és számításban stb.) az volna várható, hogy a jelenség szinkronizáltan jelentkezik a párhuzamosan m őköd ı reaktorokban, még inkább pedig, hogy az ingadozás természete nem mutat összefüggést a rátáplálási periódusok id ıszakaszaival. A hullámhossz-spektrumok (V/3. ábra) azonban világosan mutatják, hogy minden rátáplá- lási periódusnak id ıben jellegzetesen formált, ugyanakkor egyedi hullámhosszprofilja van, amib ıl számunkra az a következtetés adódik, hogy az ingadozásnak a szubsztrátbontási folyamat történetébe ágyazott bels ı oka van. Ezt az A1 periódusnak az V/3. ábrán is megfi- gyelhet ı egyidej ő hozam- és frekvenciaanomáliái is meger ısítik a mérési id ı közepe táján. Kés ıbbi megfigyelésünk, miszerint kevertetés hiányában az ingadozás elmarad – bár a ho- zam teljes, és alakulása hasonló –, ugyancsak ezt a sejtést támasztja alá, hiszen amíg a gömbölyded állólombikban hatékony kevertetés folyik, a rektortartalmat ez kell ıen homo- génen tarthatja ahhoz, hogy esetleges periodikus biokémiai folyamatok szinkronizálódhas- sanak. Ennek hiányában azonban eltér ıen szinkronizált mikrohabitatok alakulhatnak ki a reaktorban, melyek parciális hozamingadozásai kioltják egymást. Megjegyezzük, hogy rö- vid id ıszakokra és igen alacsony amplitúdóval ugyan, de olykor kevertetés nélkül is tapasz- talunk gyanúsan szabályos hozamingadozásokat. A termosztátciklusok és a kevertetési zavarok szerepét egyidej ő hangfelvételek segítsé- gével is sikerült kizárnunk (ekkor a termosztát f őtési id ıszakaiban hallható pattogó hangot és a mágneses kever ık „kotyogását” rögzítettük), bár az, hogy a párhuzamos reaktorok ho- zamingadozása közel sem szinkronizált, önmagában is kellıen igazolja e lehet ıségek kizá-

76 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK rását. Ellen ıriztük a habképz ıdés lehetséges szerepét is: nem m őködik-e egy, a termelt gáz által föl-fölemelt majd átszakadva visszaereszked ı szilárd habkéreg egyfajta fújtatóként a gázt adagolva, megfigyelésünk szerint azonban tiszta folyadékfelszín esetén is tapasztalható az oszcilláció. Mivel a pH értéke konstansnak bizonyult ingadozó hozamú id ıszakok fo- lyamán, ugyancsak kizárható a lehetséges háttértényez ık közül. Összehangolt sejtciklusok szerepe anaerob közegben ilyen rövid ciklusid ıvel aligha elképzelhet ı. Sajnos egy ilyen rövid periódusú ingadozás okának mélyebb felderítése igen nehéz feladatnak t őnik (különö- sen további munkahipotézisek hiányában), amelyre a jelen munka keretei között nem nyílt lehet ıség.

V. A. 2. 3. A módszerfejlesztés lehet ıségei A legmagasabb szignifikanciával észlelt legrövidebb periódusidej ő hozamingadozás A1 periódus 11:12 - 12:02 id ıszakában jelentkezett (V/2. és V/3. ábrák) 12 perc 39 másodper- ces átlagos periódusid ıvel, periódusonként átlag 3 ml gázhozammal, melyen 7-7 buborék osztozott. Egy ilyen ingadozás kimutatásához olyan mér ıeszközre van szükség, melyben a jeladó gázmennyiség legfeljebb fele akkora, mint a periódusonkénti hozam. Az átlagos bu- boréktérfogat (0,44 ml) esetünkben ezt b ıven megengedi. Ebben a konstrukcióban 0,88 ml- nél kisebb periódusonkénti hozamú ingadozások nem mutathatók ki megbízhatóan. A csö- vezet geometriájának módosításával, a cs ıátmér ı csökkentésével azonban módszerünk adaptálható nagyobb felbontású mérésekhez is. Mivel a vékonyabb csövekben a buborékok már légzárat képeznek vizes oldatokban, egy határig a felületi feszültség csökkentésével dolgozhatunk (pl. detergensek használatával), azután szükségessé válik a folyadék vissza- vezetése a buborékok "mögé" egy járulékos vezetéken keresztül, melynek révén egy, a fel- felé mozgó buborékok által hajtott köráramlás lehetıvé teszi a buborékok haladását a mér ı- cs ıben. Ilyen elven akár kapillárisokban mozgó apró buborékok is számolhatók és mérhe- tık, amivel mind a térfogati, mind az id ıbeli felbontás növelhet ı. Végkövetkeztetésként elmondható, hogy (a) sikerrel megalkottunk egy mérési elvet és eszközt, mellyel párhuzamosan több kis hozamú gázforrás kibocsátása mérhet ı anélkül, hogy a gázforrások számának növelésével szorzatosan növekedne az eszközigény. Sikerrel kalibráltuk (b) standard gázforrás ellenében, és kielégít ı mérési pontosságot értünk el. A módszer kiválóan m őködött bioreaktorok m őködésének nyomon követésében (c), amennyi- ben jól használható gázhozamprofilok generálásán túl a hozamok nem várt, rövid periódus- idej ő ingadozását is feltárta, és jól analizálható adatsorokat generált annak elemzéséhez. Lehet ıségeink arányában igazoltuk, hogy a tapasztalt ingadozás oka a mérés tárgyának mőködésében (a gáztermel ı közösség m őködésében) inherens módon rejlik, nem pedig kísérleti vagy mérési m őtermékr ıl van szó.

77 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V. B. Biogáztermel ı szennyvíziszap-rothasztók mikrobiológiai vizsgálata

V. B. 1. Mezofil és termofil félüzemi rothasztók mikrobiótájának vizsgálata

V. B. 1. 1. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények Mind T-RF-csúcsok, mind klón-szekvenciák és azok „in silico emésztése” alapján sike- rült mintáinkban taxonokat azonosítani a Bacteria és Archaea doménekb ıl. Jelentıs eltérés volt tapasztalható a T-RF mintázatban a termofil és mezofil közösség között mindkét domén esetében. Viszonylag kevés észlelt csoport fordult el ı egyszerre mindkét h ımérsékleten, amint az megfigyelhet ı az V/4. és V/5. ábrákon.

M

T

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 79,4 97,22 107,39 152,04 154,19 155,38 193,08 sim. Methanoculleus sp. 228,63 sim. Methanosaeta sp. 380,04 sim. Methanosarcina sp. 550,00 V/4. ábra. Az Archaea közösség összetétele a T-RFLP-vizsgálat alapján a vizsgált termofil (T) és mezofil (M) reaktorokban. A jelmagyarázatban a számok a fragmenthosszakat jelölik. „sim. Methanoculleus sp .” értsd: similis Methanocullei speciei, azaz (klónszekvencia alapján) Methanoculleus fajhoz hasonlító.

A mezofil Archaea közösség domináns tagja a Methanosaeta fajt képviselte, emellett Methanoculleus és Methanosarcina fajokat azonosítottunk, valamint még tenyésztésbe nem vont Archaea-csoportok képvisel ıit. Ezzel szemben a termofil Archaea-közösséget majdnem teljes egészében egy Methanosarcina faj alkotta, mely T-RF-mérete alapján ugyanannak mutatkozott, mint a mezofil közösségben talált faj (V/4. ábra). E mellett igen kis mennyiség- ben egyéb csoportok jelenléte is megmutatkozott. Két klón Methanosaeta concilii nek illetve Methanoculleus bourgensis nek bizonyult 16S-rDNS szekvenciája alapján.

78 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

M

T

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 72,5 sim. uc. klón anaerob iszaprothasztóból 74,16 sim. Nostocoida sp. 81,29 82,72 sim. Coprothermobacter sp. 102,75 123,47 145,86 147,08 150,6 158,47 198,7 201,66 sim. uc. klón anaerob iszaprothasztóból 217,33 sim. Smithella sp. 224,59 232,99 sim. Dokdonella sp. 233,57 sim. uc. aktivált iszapból 236,97 239,51 247,76 sim. CFB sp. 249,16 271,05 sim. Acidovorax sp. 273,21 519,69 520,47 sim. uc. anaerob iszaprothasztóból

V/5. ábra. A Bacteria közösség összetétele a T-RFLP-vizsgálat alapján a vizsgált termofil és mezofil reaktorokban. A jelmagyarázatban a számok a fragmenthosszakat jelölik. „sim. Nostocoida sp .” értsd: similis Nostocoidae speciei, azaz (klónszekvencia alapján) Nostocoida fajhoz hasonlító.

A Bacteria közösségek között is szembet őnı különbség a mezofil közösség termofilnál nagyobb diverzitása (V/5. ábra). A domináns csoportok nagy része mindkét mintában eddig le nem írt, de környezeti klónként már kimutatott taxonok közeli rokonának bizonyult. Mindkét közösségb ıl kimutattuk a Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides taxoncsoport tagjai- nak jelenlétét. Néhány esetben sikerült nemzetség-szint ő meghatározást végeznünk klónok szekvenciaanalízisével, ahol a klónok a mintabeli csúcsokkal átfed ı csúcsokat adtak T- RFLP-alapon. Ezek a klónok a Nostocoida , Acidovorax és Smithella nemzetségek tagjainak mutatkoztak a mezofil, és Coprothermobacter- illetve Docdonella -tagoknak a termofil kö- zösségben. Kemotaxonómiai markereink alapján el ıször diverzitási és ekvitabilitási (mennyiségi ki- egyenlítettséget mutató) indexeket számoltunk Hu és mtsai. (1999a) alapján (V/6. ábra). Látható, hogy zsírsavak alapján nem találunk komoly diverzitásbeli különbséget a kétféle reaktor között (bár a termofil reaktor diverzitása valamivel nagyobb volt; V/6.b. ábra). Szembet őnı ugyanakkor, hogy az azonos mennyiség ő mintából származó zsírsavmennyiség mezofil közösségb ıl több mint háromszor akkora volt, mint a termofilból kinyerhet ı (V/6.a. ábra).

79 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

a) 0.4 b) 30 c) 0.7 0.35 25 0.6 0.3 0.5 20 0.25 D 0.4 0.2 15 E 0.3 0.15 10 mol/g szárazanyag 0.2 0.1 5 0.05 0.1

0 0 0 MT MT MT

V/6. ábra. a) A zsírsavak összesített mennyisége mintánként. b) „D” diverzitásindex zsírsvak 0,5 2 alapján. D=[ Σ(f x )] ; ahol f x az x-dik marker fajlagos mennyisége és x=1


n. (D a markerek számára és mennyiségeik kiegyensúlyozottságára egyaránt érzékeny). c) „E” ekvitabilitási index zsírsvak alapján (E csak a markerek mennyiségeinek kiegyensúlyozottságára érzékany). E = D/n ahol n a markerek száma.

Az egyes zsírsavtípusok megoszlásában néhány jellegzetes különbség látható (V/7. áb- ra). Így például jól látható ciklopropil tartalmú (cy) és a többszörösen telítetlen (PUFA) zsírsavak kisebb arányú jelenléte a termofil reaktorban. A szulfátredukálók indikátorának tekintett C 15:1 és C 17:1 zsírsavak jelenléte mindkét reaktorban kis arányú. Egy vagy több azonosítatlan zsírsav aránya nagyobb volt a termofil mintában.

M

T

SATFA MUFA PUFA elágazó C15:1, C17:1 cy azonosítatlan

V/7. ábra. Zsírsavtípusok arányai a mintákban. SATFA: telített zsírsavak (Saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (Polyunsaturated fatty acids), 15:1 - 17:1 : C 15:1 és C 17:1 zsírsavak, jellemz ıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsavak, azonosítatlan: azonosítatlan zsír- savak.

80 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Kinonok tekintetében az egyetlen informatív jellegzetesség az MK5(H2) egyszeresen te- lített rövid láncú menakinon igen nagy (valamivel 50 % feletti) arányú dominanciája volt mindkét reaktorban, amely a szulfátredukáló Desulfobulbus nemzetség markere.

V. B. 1. 2. A mezofil és termofil rothasztókból nyert eredmények értékelése A közösségekb ıl DNS-alapon azonosított baktériumcsoportok egyikénél sem váratlan szennyvíziszaprothasztókban való el ıfordulásuk. A mezofil közösség Archaea-csúcsai közt dominanciát élvez ı, Methanosaeta-ként azonosított T-RF-et jó eséllyel a klónja alapján Methanosaeta concilii-ként azonosított baktérium adja, melyet több ízben is izoláltak már iszaprothasztókból mint mezofil acetiklasztikus szervezetet (Chouari és mtsai. 2005a). Az ugyaninnen kimutatott Methanoculleus bourgensis -t el ıször egy cserzıüzem szennyvizéb ıl izolálták (Wright és Pimm 2003). Ez a törzs H 2-t és CO 2-t hasznosító mezofil, kokkusz ala- kú baktérium, mely ecetsavat is igényel növekedéséhez. Az acetáthozzáférés a mi mintánk- ból kimutatott szervezet számára sem jelenthet gondot Methanosaeta -dominált közössé- günkben. A termofil mintában gyakorlatilag egyeduralkodó Methanosarcina rokont ugyan nem sikerült átfed ı csúcsot adó klón segítségével pontosan meghatározni, tudható azonban e nemzetségr ıl, hogy tagjai ecetsav mellett H 2-t, CO 2-t, metanolt és metilamint is hasznosí- tanak metántermelésük során. Nem kell tehát feltételeznünk a széls ıséges Methanosarcina - dominancia ellenére sem, hogy a lebontási anyagcsereutak széls ıségesen eltolódnának az ecetsavtermel ıdés irányába (ld. II/3. ábra, 10. old.) termofil h ımérsékleten. A Bacteria domén tagjairól elmondható, hogy a meghatározható T-RF-csúcsok termel ıi többségükben eddig tenyésztésbe nem vont szervezetekkel mutatnak rokonságot, ezek azonban éppen iszaprothasztókból kerültek el ı korábban (Chouari és mtsai. 2005a). Szul- fátredukáló baktériumok, melyek jelenlétére kemotaxonómiai eredményeink alapján is számítunk, ezek közt lehetnek (Chouari és mtsai. 2005b). A közelebbr ıl is azonosított cso- portok leírt rokonai közül a Nostocoida nemzetség némely tagjáról tudható, hogy szenny- víziszap-flokkulumokból leírt fonalas baktériumokról van szó (Schade és mtsai. 2002), s könnyen meglehet, hogy jellegzetesen pelyhes iszapjaink e tulajdonságát éppen ez a szerve- zet biztosítja fonalaival. Ugyancsak kerültek el ı iszaprothasztókból Acidovorax (Schulze és mtsai. 1999) és Dokdonella (Li és mtsai. 2012) fajok is, melyek jelenlétét mi is kimutattuk. A Smithella és Coprothermobacter fajokat szintén több ízben izoláltak már szennyvíziszap- rothasztókból. A Smithella fajok szintrofikus szervezetek, filogenetikailag pedig szulfátre- dukáló csoportokhoz is közel állnak (Schink és Stams 2001). Coprothermobacter fajokat mint mezofil proteolitikus szervezeteket Etchebehere és mtsai. (1998) izoláltak mezofil iszaprothasztóból. Esetünkben a termofil reaktorból került el ı rokon szervezetre utaló DNS- marker.

81 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Mivel a mintáinkból azonosított nemzetségek fajainak leírásaiban sajnálatosan nem ke- rült közlésre a fajra jellemz ı zsírsavprofil – kivéve a Dokdonella kunshanensis (Li és mtsai.

2012) leírását, mely szervezetb ıl kizárólag elágazó szénláncú zsírsavakat izoláltak [izo-C17 :

1ω9c (31.6 %), izo-C15 : 0 (12.6 %), izo-C16 : 0 (21.3 %), izo-C17 : 0 (13.1 %) és izoC 11:0 3-OH (6.5 %)] –, a nukleinsav-alapú és zsírsavalapú eredményeink megfeleltet ı összevetésére nem nyílik lehet ıségünk. A zsírsavak és azon belül a különböz ı zsírsavtípusok mennyiségi kü- lönbségei alapján azonban levonhatunk bizonyos következtetéseket. A zsírsavak összmennyiségének er ıs különbsége a két üzemh ımérséklet között kétféleképpen is értel- mezhet ı: vagy eleve kisebb biomassza él egy termofil rothasztó iszapjának egységnyi tér- fogatában, vagy a termofil közösség észterlipidekkel rendelkez ı Bacteria tagjai arányukban visszaszorulnak az éterlipid-membránnal rendelkez ı (a zsírsavprofilhoz tehát hozzá nem járuló) Archaea közösségalkotókkal szemben. El ıbbi értelmezés a hasonló volumen ő gáz- termel ıdés fényében kérdéses, a másodikhoz pedig azt kell feltételeznünk, hogy a hidrolí- zis, acetogenezis, szintróf hidrogéntermelés stb. folyamatait katalizáló Bacteria közösségal- kotók termofil körülmények között annyival hatékonyabban végzik dolgukat, hogy majd negyedakkora mennyiség ő biomassza elégséges a folyamatok elvégzéséhez. Bármelyiket is fogadjuk el, a zsírsavalapon vizsgálható Bacteria részközösségre nézve ugyanazt jelenti mindkett ı: kisebb összes biomasszát. Nem zárható ki természetesen a preparálási m őtermék lehet ısége sem, kés ıbbi eredményeink azonban (mint látni fogjuk) alátámasztják, hogy észlelésünk helytálló, a termofil közösségben csakugyan kevesebb zsírsav található. Az enterális baktériumok markereiként számon tartott ciklopropil-tartalmú zsírsavláncok csökkent mennyisége a termofil reaktorban egybecseng a patogén csíraszámok redukcióját illet ı korábban említett eredményekkel (Sahlström 2003, Weiland 2010). A szulfátredukáló baktériumok zsírsavmarkerei (C 15:1 és C 17:1 ) alárendelt szerepet mutatnak a zsírsavprofilok alapján, nem úgy, mint az MK5(H2) kinonmarkerük, amely er ısen dominálta a kinonprofilokat. Ez arra enged következtetni, hogy bár a légz ı (membránkapcsolt elektron- transzport-lánccal rendelkez ı) szervezetek között nagy arányban találunk szulfátredukáló- kat, a Bacteria-populációban mégis alárendelt a szerepük, a csoport nagy része tehát respiratorikus kinonokat nem termel ı, fermentáló szervezet. Mivel MK5(H2) kinon eddig jellemzıen csak Desulfobulbus fajokból került el ı (Sorokin és mtsai. 2012), gyaníthatjuk e genus jelenlétét mindkét közösségben. A fent említett nemzetség-szint ő egyeztetés lehetetlensége a kétféle eredmény között, il- letve az er ıs taxonómiai információt hordozó kemotaxonómiai markerek mennyiségeinek kicsinysége (és közel egyformasága a két közösségben) meggátol minket a mélyebb követ- keztetések levonásában, ezzel együtt is elmondható azonban, hogy kezdeti közösségfeltárá- sunk eredményes volt.

82 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V. B. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának vizsgálata laboratóriumi modell-rendszerben

V. B. 2. 1. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának eredményei A könnyen bontható szubsztrátok adagolása jól látható, karakterisztikus változásokhoz vezetett a gázhozamban, amint azt a V/8. ábra szemlélteti.

V/8. ábra. A három reaktor gázhozamai kétórás bontásban a kísérletsor teljes ideje alatt. A: kontroll, B-C: adagolt szubsztráttal kezelt párhuzamos reaktorok. A föls ı számok a rátáplálá- si periódusokat jelölik (ld. IV/1.táblázat). A kategóriatengely alatti számok a minták számozá- sát jelölik. Az adatsorok a rátáplálási id ıpontokban megszakadnak. A 2. rátáplálási periódus második felében és a 17. periódusban C reaktor hozamának mérése túlhabzás miatt meghiú- sult.

A kontrollreaktor gázhozamprofilja alkalomról alkalomra hasonló, míg a kezelt reakto- rok egymáshoz hasonló változásokat mutatnak különböz ı szubsztrátok rátáplálását követ ı- en. A fehérje adagolása azonnali, markáns gázhozamnövekedést eredményezett, amely gyorsan, még a rátáplálási periódusok végére visszaesett a kontroll-szinte, s a fehérjeadago- lás végeztével a hozamok id ıbeli karakterisztikája is gyorsan normalizálódott. Ezzel szem- ben a keményít ı adagolása kezdetben határozott hozamcsökkenéssel járt a kontrollreakto- rokhoz képest. Ezt követ ıen azonban er ıs hozamnövekedés indult meg jelent ıs id ıbeli eltolódással a két kezelt reaktor esetében. A C jelő reaktor jóval kés ıbb reagált a keményí- tıadagolásra, akkor azonban magasabb maximumot és er ısebb meredekséget ért el a ho- zam. A hozammaximumok különbsége 90 óra volt, a keményít ı adagolásának hatása há- rom normál (csak nyersiszappal történ ı) rátáplálási periódus után múlt el, az összesített gázhozam az érintett periódusok (6.-11.) alatt reaktoronként 6341 ml (A), 7260 ml (B) és 7523 ml (C) volt. Étolaj-adagolás esetén a kezelt reaktorok alacsonyabb, de állandóbb gáz- produkciót mutattak, mint a kontroll. Az olajadagolás végeztével a normál periódusokban hozamuk egy ideig meghaladta a kontrollreaktorét. A 18. rátáplálási periódusban a kezelt reaktorok nem kaptak semmilyen rátáplált anyagot, csak a kontroll-reaktor. A többletet eredményez ı hatás lecsengését kívántuk megfigyelhetıvé tenni így.

83 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

A zsírsavanalízis eredményeként 48-féle zsírsavat mutattunk ki a reaktorokból, ami gaz- dag eubakteriális közösségre utal. Az adagolt nyersiszap jelent ısen különbözött a mintáktól mind a zsírsavtípusok számában, mind arányukban. A minták egymástól inkább a zsírsavtí- pusok mennyiségi arányaiban különböztek, mintsem a zsírsavak el ıfordulásában. A leg- gyakoribb zsírsavak az él ıvilágban általánosan elterjedt (így kevés taxonómiai információt hordozó) C16:0 , C 16:1 , C 18:0 , C 18:1 zsírsavak valamint az elágazó láncú anteizo C 15:0 és izo

C15:0 zsírsavak voltak minden mintában (V/9. ábra) C19:0+1 * 100% C18:3 w6c(6,9,12) PUFA C18:2 w6,9c/18:0ante C18:1 w5c C15:1 w6c 90% C17:1 w8c C15:1 w5c C17:1 w6c C16:1 w6c / 16:1w7c C16:1w5c 80% C13:1at12-13 C20:1w9c MUFA C15:1 w8c C18:1w6c C18:1 w9c 70% C18:1 w7c C16:1 w7c/16:1w6c C18:1 w7c11-methyl C17:1 w9c ISO / 16:010-methyl C17:1 ISOI/ANTEISOB 60% C15:1 G ISO C19:0 ANTEISO C18:0 10-methyl C17:0 ISO C17:0 ANTEISO 50% C16:0 ISO C16:0 ANTEISO C15:0 ISO elágazó C15:0 ANTEISO C14:0 ISO 40% C14:0 ANTEISO SATFA C13:0 ISO C13:0 ANTEISO C12:0 ISO C16:0Nalcohol 30% C17:0 ISO 3OH C15:0 ISO 3OH C11:0 ISO 3OH C13:0 3OH/15:1iH -OH C11:0 2OH 20% C10:0 3OH C10:0 2OH C9:0 3OH ciklikus C19:0 w8c cyclo C20:0 10% C19:0 C18:0 C17:0 C16:0 C14:0 0% C13:0 C10:0 B1 B3 B5 B6 B8 C1 C3 C5 C6 C8 A0 A1 A3 A5 A6 A8 NyI B10 B11 B13 C10 C11 C13 A10 A11 A13 C9:0 V/9. ábra Zsírsavak a mintákban átlagolt összesített részarányuk szerinti elrendezésben. A zsírsavelnevezések értelmezését ld. a II. 6. 2. fejezetben. A: kontroll, B-C: adagolt szubsztráttal kezelt párhuzamos reaktorok, NyI: nyersiszap. SATFA: telített zsírsavak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (polyunsaturated fatty acids), MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, *: azonosítatlan zsírsavak.

84 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V/10. ábra. Zsírsav-mintázat alapján szerkesztett hasonlósági fa (euklideszi távolság) és a maior valamint minor zsírsav-típuskörök megoszlása a mintákban. MUFA: egyszeresen telí- tetlen zsírsavak (Monounsaturated Fatty Acids), SATFA: telített zsírsavak (Saturated fatty acids), „branched”: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (Polyunsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, 15:1 - 17:1 : C 15:1 és C 17:1 zsírsavak, jellemz ıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsa- vak. A római számok a szövegben tárgyalt klasztereket jelölik. A mennyiségi eloszlások esetén a kategóriaátfedések miatt az értéktengely valójában dimenzió nélküli, a százalékértékek csak a viszonyítás megkönnyítésére szolgálnak.

A minták zsírsav-alapú klaszteranalízise (V/10. ábra) azt mutatja, hogy kontroll-minták mutatják egymással a legnagyobb hasonlóságot (I. klaszter), az olajkezelt minták ezekhez közel kerültek (II. klaszter), illetve további kontroll mintákkal keveredtek, míg a keményít ı- és fehérjekezelt minták külön csoportosultak (III. klaszter). A f ı zsírsavtípusok összesített mennyiségei (V/10. ábra) nem mutatnak jelent ıs változást kezelések hatására. Egyedül a szulfátredukáló baktériumokra általánosan jellemz ınek tekin- tett C 15:1 és C 17:1 zsírsavak vannak a kezelt reaktorokban jellemz ıen kisebb mennyiségben, mint a kontrollban. Különbségek inkább akkor tárulnak elénk, ha betekintünk e zsírsavcso- portok bels ı struktúrájába. A legnagyobb mennyiségben jelen lévı telített zsírsavak meny- nyisége nem mutatott jellegzetes változást a kísérlet folyamán, a kisebb telített zsírsavkom- ponensek mennyiségi ingadozása pedig véletlenszer őnek t őnik. Az egyszeresen telített

(MUFA) zsírsavak között ezzel szemben jellegzetes változást mutatott a már említett C 15:1

és C 17:1 zsírsavak mellett a C18:1 ω6c zsírsav is (V/9. és V/11. ábra). Mennyisége jól láthatóan a keményít ı- és protein-táplált id ıszakokban volt magas, míg a olaj-táplálás esetén és a kontroll-mintákban alacsony volt. A V/10. ábra III. klaszterének az egyik „csoportképz ı” jellegzetességét valószín őleg ez adja. C 13:1 at 12-13 és C 16:1 ω5c épp ellenkez ı alakulást mutat-

85 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK tak. További zsírsavak esetén is felismerhet ı az adagolt szubsztrát min ısége szerint muta- tott változás, így a C18:1 ω1c fehérjerátáplálás hatására növekedett meg mennyiségében, míg anteizo C 15:0 (V/9. ábra) és C 16:1 ω7c / 16:1 ω6c zsírsavak keményít ıadagolásra mutattak növe- kedést.

V/11. ábra. Egyszeresen telített zsírsavak mennyiségi arányváltozásai. A minták a kezelési típusok szerinti elrendezésben láthatók (K: kontroll reaktorok normál nyersiszapos táplálással, P: protein, S: keményít ı, O: olaj, n: normál nyersiszapos táplálás). A csillagok és a háromszög jelzés a szövegben is említett zsírsavak azonosítását könnyítik.

Jóllehet a C 15:1 és C 17:1 zsírsavak (szulfátredukáló baktériumok markerei) aránya csök- kent fehérje- és keményít ıadagolás hatására (V/10. ábra), a zsírsavcsoport bels ı diverzitása megn ıtt (V/11. ábra). Például C 15:1 ω8c zsírsav teljesen hiányzik a kontrollmintákból, és az olajadagolást követ ıen a kezelt reaktorokból is elt őnt. [A8 minta elkülönülése a hasonlósági fán a C 18:0 zsírsav kiugróan magas arányának köszönhet ı benne, az A3 minta elkülönülése az I. klasztert ıl a C 18:1 ω7c különösen kicsiny arányának tulajdonítható e mintában (V/10.

ábra), az A13 minta esetén ugyanez a C 18:0 zsírsavnak köszönhet ı (C 18:0 2,26%-ot adott, míg átlaga a kontroll mintákban 10.80% volt)]. A DGGE-mintázat alapján készített klaszteranalízis a zsírsavakéhoz hasonló módon egy csoportba rendezte a kontrollmintákat (V/11. ábra, VI. klaszter). A B reaktor esetében jól elkülönülnek a keményít ıbontás megindulása el ıtti és az azt követ ıen vett minták (VI. és V. klaszter), s a keményít ıbontásra lassabban reagáló C reaktorból a kritikus periódusban vett C5 és C6-os minták is egy közös ágon kerültek távol szomszédaiktól.

86 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V/11. ábra. DGGE sávmintázat alapján szerkesztett hasonlósági fa (euklideszi távolság) és a gélkép a fa topológiájának megfelel ı elrendezésben. A mintaneveket ld. a IV/1. táblázatban és az V/8. ábrán. A római számok a szövegben tárgyalt klasztereket jelölik. Az ovális keretek a sikeresen szekvenált sávokat jelölik. Az azonosított baktériumcsoportokat megneveztük.

A fa topológiájáért felel ıs sávok nagy része kevert szekvenciákból állónak bizonyult, a kivágott sávok 22%-ának (14 sáv) esetében azonban sikerrel járt a szekvenciavizsgálat. Ez minden mintában Bacteroidetes-dominanciát mutat, de a Clostridiales és Thermotogales csoportok tagjai is kimutathatók voltak. A szekvenciák mindegyike nem tenyészthet ı bakté- riumokhoz tartozó környezeti klónokhoz esett közel a szekvencia-adatbázis alapján. A T-RFLP-profilok tanúsága szerint az Archaea csoport kisebb diverzitással képviselteti magát a közösségben (V/12. ábra). Csak a Methanoculleus csoportot sikerült nemzetség-szinten azonosítani. Egy T-RF a Methanosaetaceae család tagjaként került azonosításra, míg két másik csúcsot nem sikerült azonosítani az adatbázis segítségével. Habár a csúcsok el ıfordulásában nem mutatkozik különbség, viszonylagos méretik megváltoztak a kezelések hatására, amint az a kezeléseket reprezentáló minták T-RF-profiljain megfigyelhet ı (V/12. ábra). A Methanosaetaceae csa- ládhoz tartozó T-RF-csúcs nagysága a fehérjeadagolás idején mutatott relatív növekedést.

87 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

V/12. ábra. Az Archaea T-RFLP elektroforetogramja (mcr A gén; Msp I enzim). A mintaneve- ket ld. a IV/1. táblázatban és az V/8. ábrán. bp: bázispár, E.c.: környezeti klón, Mc: Methanoculleus , Ms: Methanosaetaceae, U.p.: meghatározatlan csúcs. A csúcsokat a németor- szági kollégák mcrA adatbázisa segítségével azonosítottuk (ld. IV. B. 11. fejezet).

V. B. 2. 2. Könnyen bontható szubsztrátok adagolásának értékelése A gázhozammérés eredménye jól mutatja a mikrobiális közösség élettani válaszát a szubsztrátváltoztatásra. A fehérjeadagolás azonnali gázhozamnöveléséb ıl arra következtet- hetünk, hogy a baktériumok alkalmazkodási id ıigény nélkül képesek a fehérjék bontására. A közösség alkalmasint eleve fel van készülve fehérjebontásra, hiszen a kommunális szennyvíziszap nagy része bakteriális biomassza, így sok fehérjét tartalmaz. A fehérjék megnövekedett mennyisége extra nitrogénforrást jelentett a mikrobák számára s ennek lehet köszönhet ı a heves anyagcserenövekedés. A keményít ı késedelmes hozamnövel ı hatása látványosan szemlélteti a baktériumok alkalmazkodását a megváltozott életkörülményekhez (jelen esetben a táplálékhoz), valamint hogy ez az alkalmazkodás id ıt igényel. Véletlensze- rő tényez ık is hatással lehetnek rá, hisz másként nehéz magyarázni a két azonosan kezelt reaktor eltér ı idej ő reakcióját a keményít ıadagolásra. A felhalmozódott keményít ı kés ıbbi er ıs hozamnövel ı hatása nyilvánvaló. A lassú, de kiegyensúlyozott gáztermelés az étolaj adagolása során azt mutatja, hogy a közösségben folyamatosan jelen van a trigliceridek bontásának képessége, ám ez az el ıbbiekhez képest lassú folyamat. Érthet ı ez, amennyiben figyelembe vesszük, hogy a települési szennyvizekkel folyamatosan érkeznek emulgeált zsiradékok a szennyvíztisztító telepekre, ugyanakkor a kísérleti rátáplálást követ ıen az olaj- cseppecskék (a melléadagolt iszappal való er ıs összerázás dacára) részben „zsírkarikákká” egyesültek a reaktortartalom felszínén, ami nehezebb hozzáférést engedhetett csak a hidrolizáló szervezetek számára. Ennek köszönhet ıen az el nem bontott zsiradék az olaj-

88 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK adagolás befejeztével egy ideig még tovább emelhette a hozamot a normál periódusban kapott 100 g nyersiszap biztosította (kontrollnak megfelel ı) hozamon felül. Általánosságban elmondható, hogy a minták els ısorban a zsírsavak arányában külön- böztek, nem els ısorban a zsírsavak el ıfordulásában vagy számában. A nyersiszap különböz ısége a mintáktól jól látható a zsírsavak számában és arányában, ami mutatja, hogy a mikrobióta – legenyhébben fogalmazva – módosítja a bevitt anyag markerkészletét, amit sejthetünk a lipidbontás (gázhozamban megmutatkozó) perzisztens képességéb ıl is. De abból a megfontolásból kiindulva is, hogy a nagyarányú bakteriális biomasszát tartalmazó kommunális szennyvíziszap bontására adaptálódott bakteriális kö- zösségnek értelemszer ően maguk a küls ı eredet ő bakteriális markermolekulák is alapvet ı szubsztrátját jelentik. Az elhalt sejtek foszfolipidtartalmának rövid életidejét a közegben továbbá egyöntet ően állítja a vonatkozó szakirodalom (Córdova-Kreyols és mtsai. 2006). Mivel amúgy sem volna lehetséges egy bizonyos marker mennyiségének felbontása arra a zavaró hányadra, amely a szubsztráttal jutva a rendszerbe eddig elkerülte a lebontást, illetve arra a kemotaxonómiailag releváns hányadra, amelyet a közösség maga épített fel, a szubsztrát kemotaxonómiai vizsgálata legfeljebb akkor szolgálhat információval, ha egy- azon szubsztrátdózis elbontásának folyamatát monitorozzuk. A miénkhez hasonló kísérleti elrendezés esetén legjobb, ha ráhagyatkozva az irodalmi tapasztalatokra nem növeljük fe- leslegesen mintáink számát. Ugyanakkor természetesen érdemes a közösség mintázását úgy id ızíteni, hogy id ıben minél távolabb essék a megel ızı rátáplálástól (ahogyan mi is tettük). Közvetlenül a soron következ ı rátáplálás el ıtt véve a mintát lesz legkisebb az esélye annak, hogy számottev ı mennyiség ő küls ı eredet ő markermolekula szennyezze mintánkat. A kis taxonómiai érték ő zsírsavak nagy mennyisége mellett az elemzés kimutatta jelleg- zetes, bizonyos taxonómiaicsoportokra jellemz ı zsírsavak jelenlétét is. A nem hidroxiszubsztituált, elágazó láncú zsírsavak (különösen a 15 és 17 C-atomos telített mole- kulák) a Bacteroidetes csoport legáltalánosabb markerei (Mayberry és mtsai. 1982). A Bacteroidetes csoport számos munkában bizonyult biogáztermel ı rendszerek legabundánsabb közösségalkotójának (Ariesyady és mtsai. 2007, Kampmann és mtsai. 2012, Lee és mtsai. 2012). Mintáinkban az elágazó láncú zsírsavak nem mutatnak számot- tev ı mennyiségi ingadozásokat. Mindez összhangban áll Lechevalier és Lechevalier közlé- sével (1988), miszerint a Bacteroidetes-dominálta közösségek elég stabilak szubsztrátváltozások hatásaival szemben. Jóllehet a f ı zsírsavak összességükben nem mu- tatnak látványos ingadozást, a statisztikai elemzés képes volt kimutatni összefüggéseket. Eredményeink szerint a kontroll és az olajkezelt közösségek együtt csoportosultak a hason- lósági fán, ami arra utal, hogy az étolaj jelenléte nem állítja váratlan kihívás elé a rezidens közösséget (és ezt a gázhozameredmények is alátámasztják). Ez meger ısíti feltevésünket,

89 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK mely szerint a trigliceridek általános összetev ıi a kommunális szennyvíziszapnak, így a közösség hozzájuk szokhatott, ha nem is feltétlenül bomlanak könnyen. Az egyszeresen telített zsírsavak (MUFA) arányaiban mutatkozó eltolódások közösségösszetétel-változásra utalnak, de ezen molekulák alacsony információs értéke miatt csak annyit mondhatunk, hogy a változások valószín őleg a közösség Gram-negatív tagjait érintették, mivel a MUFA molekulákat általános Gram-negatív markerekként tartják számon, míg az elágazó láncú zsírsavak Gram-pozitív baktériumokat jeleznek. A C 15:1 és C 17:1 zsírsavak arányváltozásai megengedik a következtetést, hogy a szubsztrátváltások zavaró hatása jelent ısen befolyá- solja a szulfátredukáló baktériumok m őködését, mivel e markerek összmennyisége csök- kent, ellenben új altípus (C 15:1 ω8c) is megjelent közöttük. Ahogy a zsírsavak, úgy a DGGE vizsgálat eredményei is inkább enyhe abundanciaingadozásokra utalnak mintsem radikális átrendez ıdést jeleznének. Míg a kont- rollminták a hasonlósági fán együvé csoportosulnak, addig a kezelt reaktorokból származók elválnak egymástól, és f ıként a keményít ıbontás megindulása tekinthet ı vízválasztónak. A keményít ı okozta, gázhozamgörbék által is megmutatott adaptációs kényszer fényében nem meglep ı, hogy éppen ekkor produkáltak a közösségek kimutatható összetétel-ingadozást. Számos munka eredménye szerint a Clostridia (Wirth és mtsai. 2012), a Bacteroidetes (Kampmann és mtsai. 2012, Lee és mtsai. 2012) csoportok vagy mindkettı együtt (Schlüter és mtsai. 2008, Shigematsu és mtsai. 2009) gyakorta adják biogáztermel ı közösségek do- mináns hidrolizáló tagjait. Kampmann és mtsai. (2012) szerint továbbá a Bacteroidetes és Firmicutes közösségek gyakran meglep ı stabilitásról tesznek tanúságot ilyen rendszerek- ben. Mások (Fernandez és mtsai. 2000) ugyanakkor pusztán glükózadagolással provokáltak közösségösszetétel-változást biogázreaktorokban (de nem a Bacteroidetes-dominálta közös- ségekben). Az irodalmi tapasztalatokkal összhangban sikerült kimutatnunk ezeket a bakté- riumcsoportokat saját mintáinkból is. Kilenc sáv bizonyult tenyésztésbe nem vont Bacteroidetes klónhoz igen hasonlatosnak, egy bizonyult tenyésztésbe nem vont Clostridia klón közeli rokonának, egy a Thermofragaceae család tagjának mutatkozott hasonló alapon, míg három a Bacteria divízió eddig le nem írt tagjával mutat rokonságot. A Clostridia- sávval egy magasságban f ıleg az olajkezelt mintákban (B10-11, C10-11; V/11. ábra, 87. old.) találunk sávokat, de ez a tény szemlátomást nem befolyásolja a fa topológiáját olyan mértékben, hogy ezek a minták együvé csoportosuljanak. Az Archaea csoportból mindössze a Methanoculleus T-RF-et sikerült nemzetség szinten azonosítani a használt adatbázis alapján. Az acetiklasztikus Methanosaetaceae család tagja minden bizonnyal alárendeltebb szerepet játszanak a közösségben, de kétségtelenül jelen vannak két másik, nem azonosított Archaeonnal együtt (V/12. ábra, 88. old.). Látható, hogy az Archaea közösségalkotókat csak kevéssé befolyásolta a szubsztrát természete, ami érthe-

90 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK tı, hiszen mint metanogének els ısorban az eubakteriális lebontási folyamatok végtermékei- tıl (CO 2, H 2, acetát) függenek. Ezek megoszlása azonban természetesen befolyásolhatja a különböz ı anyagcseréj ő metanogének abundanciaarányait (Lee és mtsai. 2009), ahogy itt is elképzelhet ı, hogy a szubsztrát fehérjearányának növekedése a megszokottnál jobban az acetogenezis irányába terelte az anyagcsereutakat, így az acetiklasztikus csoport felszapo- rodhatott. Mindent egybevetve szennyvíziszaprothasztó laboratóriumi modellrendszerünk mezofil közösségét széles szubsztráthasznosítási spektrummal rendelkez ı, robosztus, Bakteroidetes dominanciájú közösségként írhatjuk le, mely kényelmes alanya lehet számos szubsztrátadagolási kísérletnek, amelyek kiváló és gyors nyomon követését teszi lehet ıvé a gázhozammérés. A közösségösszetétel mélyebb feltárását a DGGE nem teljes felbontása hiúsította meg egyfel ıl, másrészt – mint kés ıbb látni fogjuk – éppen a közösség robosztus volta az, amely megfoszt bennünket a további információnyerés lehet ıségét ıl, hiszen mar- káns id ıbeli változások híján alig mutatkozik összefüggés a különböz ı markercsoportok tagjainak id ıbeli viselkedése között.

V. B. 3. Mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtés mikrobiológiai hatásának vizsgálata félüzemi reaktorokon, s a markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása

V. B. 3. 1. Mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtés eredményei

6 60 m3/m3 4/2 4/4 4/6 4/7 4/8 6/5 6/7 6/8 °C 4/3 6/6 5 4/5 6/4 50 mg/l hımérséklet [°C] 6/3 4 6/2 40

3 3 3 4/1 gázhozam [m /m ] 6/1 30

2 20 illósav [mg/l] 1 10

0 0 10 11. 11 12. 1. 6. 1. 26. 2. 15. 3. 7. 1 1 11. 12. 1 2. . . 0 1. 1. . 3. 7. 18 7. 27 17. . 18. 6 26. 1 . . 7. 27. 17 . 5. .

V/13. ábra. A h ımérséklet, az illósav-tartalom és a gázhozam alakulása a kísérlet során a min- tavételeink id ıpontjában. A számok a görbék mentén a mintázott reaktorra és az minták sor- számára utalnak.

A szennyvíztelepen mért abiotikus tényez ık tükrében végigkövethet ı a két párhuzamos kísérlet (hirtelen és fokozatos felf őtés) története. A V/13. ábra) részén láthatók a h ımérsék-

91 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK let-értékek a mintavételi id ıpontokban. A h ımérséklet volt a mesterségesen változtatott független hatótényez ı, melynek az üzemi és mikrobiológiai paraméterekre gyakorolt hatá- sát vizsgáltuk. A 4-es számú reaktor esetében a h ımérsékletemelés hirtelen, egy lépésben történt mezofilról termofil értékre (37 °C-os átlagh ımérsékletr ıl 55 °C-os átlagra; az V/13. ábrán is látható kis h ımérséklet-ingadozások a telepi f őtırendszer kis m őködésbeli bizonytalan- ságainak tulajdoníthatók). A 6-os számú reaktor esetében a felf őtés egy három hetes inter- vallumban, egyenletes h ımérsékletnöveléssel történt. A V/13. ábrán az illósavtartalmat és a gázhozamot is feltüntettük. Jól látható a h ıstressz id ıszakára es ı növekvı illósavtartalom és csökkent gázhozam. A kísérlet végére mindkét reaktor jelent ıs hozamot produkált. A pH az illósavtartalommal ellentétesen, kis kitérésekkel mutatott csak változást 6,4 és 7,7-es szélsıértékek között (ezért nem tüntettük fel az ábrán), ám míg a 4-es reaktorban a kísérlet id ıszakában 6,8 volt az átlag-pH, addig a 6-osban 7,4 a tapasztalt illósavtartalommal össz- hangban.

25 a) 20 15 10 5 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 D MK D Q b) 40 30 20 10 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 D Zsírsav 30 c) 25 20 15 10 5 0 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

D Bsu D Alu V/14. ábra. A markerek mintánkénti diverzitása. a) „D” diverzitásindex mena- (MK) és ubikinonok (Q) alapján. b) „D” diverzitásindex foszfolipid-zsírsavak alapján. c) „D” diverzi- 0,5 2 tásindex T-RF-ek alapján hasítóenzimek szerint bontva. D=[ Σ(f x )] ; ahol f x az x-dik marker fajlagos mennyisége a markercsoportban és x=1


n. n a markerek száma a markercsoport- ban.

A mikrobiális közösséget jellemz ı markerek összetételváltozását az azt egyetlen válto- zóba s őrít ı markerdiverzitásindex (Hu és mtsai. 1999a) segítségével tekintettük át el ıször (V/14. ábra). A DNS-markerek mindkét reaktorban diverzitásingadozást mutatnak a h ımér-

92 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK sékletváltást követ ı illetve a h ımérsékletemelés alatti id ıszakban, majd a termofil közösség stabilizálódásával a markerdiverzitás lecsökken. Ugyanez a tendencia mutatkozik meg eny- hén a kinondiverzitásban fokozatos felf őtés esetén, míg a hirtelen h ımérsékletváltásnál ez nem észlelhet ı. A zsírsavakból számolt diverzitásértékek nem mutatnak tendenciózus vál- tozást a h ımérskletemeléssel. A domináns DNS-markerek (T-RF-ek) Bacteria termel ıihez a 16S rDNS klónkönyvtár szkevenciavizsgálata és a klónok in silico emésztése alapján több esetben sikerült taxonó- miai információt rendelnünk. A V/2. táblázat foglalja össze a klónokat a szekvenciájuk alapján legközelebbi rokonnak mutatkozó fajokkal valamint a T-RFLP vizsgálatban hasz- nált Alu és Bsu enzimek hasítóhelyei szerint adódó in silico T-RF-méreteikkel. A klónok a Chloroflexi, Betaproteobacteria, Clostridia, Synergistetes, Thermotogae és Bacteriodetes phylumokba sorolhatók. A klónszekvenciákhoz a táblázatban bemutatott leírt fajokon kívül számos igen hasonló szekvencia adódódott az adatbázis alapján: eddig nem tenyésztett kör- nyezeti klónok szekvenciái. Többségük anaerob iszapokból, biofilmekb ıl vagy biogáz- reaktorokból került el ı.

Azono- In silico hasítási Legközelebbi típustörzs sított hely klónok száma Alu I Bsu Hasonlóság Név és Phylum (db) (bp) (bp) % Defluviitoga tunisiensis FR850164 11* 75 305 99 (Thermotogae) Coprothermobacter proteolyticus 4** 83 238 98 CP001145 (Clostridia) Flavobacterium filum DQ372981 1 71 - 94 (Bacteroidetes) Levilinea saccharolytica AB109439 4 235 220 91 (Chloroflexi) Aminobacterium colombiense CP001997 1 75 279 90 (Synergistetes) Longilinea arvoryzae AB243673 13 245 264 88 (Chloroflexi) Ethanoligenens harbinense 1 - 273 85 ADJQ01000048 (Clostridia) Paludibacter propionicigenes CP002345 1 239 - 83 (Bacteroidetes) Amoebophilus asiaticus CP001102 1 249 234 79 (Bacteroidetes) * 9 klón 99%-os, egy 95%-os, további egy pedig 100%-os hasonlósággal ** 2 klón 98%-os, egy 89%-os, további egy pedig 94%-os hasonlósággal V/2. táblázat. A közösségek 16S rDNS klónkönyvtárának klónjaihoz a szekvenciájuk alapján legközelebbi rokonnak mutatkozó fajok valamint a T-RFLP vizsgálatban is használt Alu és Bsu enzimek hasítóhelyei szerint adódó in silico T-RF-méreteik.

93 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

A T-RF-markerek mennyiségi megoszlását mutató V/15. és V/16. ábrán ugyancsak je- leztük a legközelebbi hasonlóságot mutató fajt a talált klónoknak megfeleltethet ı T-RF- eknél. Az V/2. táblázatban felt őntetett in silico T-RF méretek egy vagy két bázispár eltérést mutathatnak a nekik megfeleltetett közösségi T-RF-ek méretét ıl a T-RF-drift jelensége miatt (Kaplan és Kitts 2003), amely abból ered, hogy a kapilláris-gélelektroforézis során az azonos hosszúságú DNS-fragmentek eltér ı purin- és pirimidinbázis-arányaik szerint eltér ı sebességgel haladhatnak, így valós hosszuktól néhány bázispárnyival eltér ı fragmenthosszal mutatkoznak meg. [Az ebb ıl adódó bizonytalanság egyértelm ően tisztáz- ható lenne a klónozott gének tényleges (nem in silico ) T-RFLP elemzésével, erre azonban a dolgozat megírásáig nem volt lehet ıség.] További bizonytalansági tényez ıként el ıfordul, hogy egyazon T-RF különböz ı mintákból kimutatva egy-két bázispárnyi eltéréssel érkezik a kapilláris végén a detektorhoz, így el ıfordul, hogy észlelt méretük miatt adattáblázataink- ban szomszédos markerkategóriába „csúsznak át” (pl. a mintasor egy szakaszán Alu75 T- RF helyett rendre Alu76-ot találunk), miközben – különösen domináns csúcsok esetén – alig valószín ő, hogy hirtelen közösségátrendez ıdés eredményét látjuk. Ilyen esetekben, ahol ezt legjobb szakmai belátásunk szerint megtehettünk, összevontuk a kategóriákat, így kerül- tek tehát a markereink közé olyanok, mint az Alu75-76 T-RF. Az ábrákon jól látható a mar- kermennyiségek ingadozása, és hogy az érett termofil közösség jellegzetesen más összeté- telt mutat, mint a mezofil illetve átmeneti közösségek. Több T-RF esetében jól megfigyel- het ı a fokozatos kiszorulás a közösségi mintázatból, bizonyos esetekben pedig fokozatos feldúsulást látunk. Így például feldúsultak a Defluviitoga tunisiensis, Coprothermobacter proteolyticus, Flavobacterium filum és Amoebophilus asiaticus fajokkal rokonítható T-RF- ek, míg kiszorultak a Levilinea saccharolytica, Longilinea arvoryzae, Paludibacter propionicigenes és Ethanoligenens harbinense fajokkal rokoníthatók.

94 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

100%

90%

80% Alu248 sim. A.a. sim. Alu248

70%

60%

50% C.p. sim. Alu083 Alu243 sim. L.a. sim. Alu243 Alu243 sim. L.a. sim. Alu243 40% Alu236-37 sim. L.s. sim. Alu236-37

30%

20% Alu075-76 sim. D.t. / A.c. / D.t. sim. Alu075-76 Alu240 sim. P.p. sim. Alu240 10%

0% F.f. sim. Alu072-73 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

Alu049 Alu053 Alu062 Alu066 Alu072-73 sim. F.f. Alu075-76 sim. D.t. / A.c. Alu083 sim. C.p. Alu090 Alu10102 Alu10405 Alu132 Alu138 Alu147 Alu149 Alu150 Alu159 Alu175 Alu193 Alu197 Alu202 Alu205 Alu209 Alu210 Alu215 Alu222 Alu225 Alu233 Alu234 Alu236-37 sim. L.s. Alu240 sim. P.p. Alu242 Alu243 sim. L.a. Alu248 sim. A.a. Alu252-53 Alu255 Alu257 Alu271 Alu494-95 Alu497 Alu504 Alu519-21 Alu523 Alu526 Alu536 Alu578-81 V/15. ábra. A Bacteria közösség markerösszetétele Alu enzimes emésztéssel végzett T-RFLP- vizsgálat alapján a vizsgált mintákban. „sim. A.a. ” értsd: similis Amoebophili asiatici, azaz (klónszekvencia alapján) Amoebophilus asiaticushoz hasonlító. További rövidítések: F.f.: Flavobacterium filum, L.s.: Levilinea saccharolytica, A.c.: Aminobacterium colombiense, P.p.: Paludibacter propionicigenes, D.t.: Defluviitogae tunisiensis, C.p.: Coprothermobacter proteolyticus, L.a.: Longilinea arvoryzae. A sávok kitöltési mintázata a mindkét enzimmel meg- jelen ı T-RF-ek esetében azonos a V/16. ábrán látható megfelel ı sávokéval.

95 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

100%

90%

80%

70%

60%

50% Bsu304-05 sim. D.t.

40% Bsu238 sim. C.p. Bsu280 sim. A.c. Bsu263 sim. L.a.

30% Bsu263 sim. L.a. Bsu272-73 sim. E.h.

20% Bsu238 sim. C.p.

10% Bsu235 sim. A.a.

0% Bsu219-20 sim. L.s. 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

Bsu052-54 Bsu061 Bsu075 Bsu076 Bsu172 Bsu175 Bsu182 Bsu185 Bsu195 Bsu197-99 Bsu201 Bsu202 Bsu203 Bsu214 Bsu219-20 sim. L.s. Bsu226 Bsu228 Bsu230 Bsu231 Bsu234 Bsu235 sim. A.a. Bsu236 Bsu238 sim. C.p. Bsu251 Bsu252 Bsu255 Bsu259 Bsu263 sim. L.a. Bsu270 Bsu272-73 sim. E.h. Bsu280 sim. A.c. Bsu282 Bsu285 Bsu287 Bsu294 Bsu297 Bsu304-05 sim. D.t. Bsu316 Bsu318 Bsu319 Bsu325 Bsu332 Bsu339-40 Bsu375 Bsu406-08 Bsu411 Bsu421 Bsu442 Bsu494 Bsu504-05 Bsu519-22 Bsu578-81 V/16. ábra. A Bacteria közösség markerösszetétele Bsu enzimes emésztéssel végzett T-RFLP- vizsgálat alapján a vizsgált mintákban. „sim. A.a. ” értsd: similis Amoebophili asiatici, azaz (klónszekvencia alapján) Amoebophilus asiaticushoz hasonlító. További rövidítések: L.s.: Levilinea saccharolytica, D.t.: Defluviitogae tunisiensis, A.c.: Aminobacterium colombiense, E.h.: Ethanoligenens harbinense, C.p.: Coprothermobacter proteolyticus, L.a.: Longilinea arvoryzae. A sávok kitöltési mintázata a mindkét enzimmel megjelen ı T-RF-ek esetében azonos a V/15. ábrán látható megfelel ı sávokéval.

A szukcessziós folyamat kimutatására f ıkomponens-analízist (PCA) alkalmaztunk (V/17. ábra). Mindkét reaktor esetében jól látható a szukcessziós folyamat végbemenetele, ahogy a két h ımérsékletemelési stratégia szerint adódó jellegzetes különbség is. Kiemelen- dı a 4/4-es minta távolsága az összes többit ıl.

96 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

4/5 4/6

6/8 4/7 4/2 4/4 6/7 4/8

4/3

6/5 6/6

Component 19,559% 2 6/3 6/4 6/2

6/1 4/1

Component 1 59,752% V/17. ábra. A T-RFLP-vizsgálat eredménye alapján készült f ıkomponens-analízis (Alu és Bsu enzimes emésztés együtt, biomasszamennyiséggel korrigált adatokból, kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

A közösségi zsírsavmintázat típuskategóriák szerinti eloszlása (V/18. ábra) markáns át- rendez ıdést nem mutat felfőtés hatására, ám a többszörösen telített zsírsavak (PUFA) kö- vetkezetes és gyors együttnövekedése a h ımérséklettel, és a szulfátredukálók (SRB) zsírsa- vainak id ıleges feldúsulása a 4-es közösség termofil átrendezıdése során trendszer őnek látszik, ahogy az érett termofil közösségekben a ciklopropil-gy őrős oldalláncú zsírsavak nagyobb aránya is. A MIDI-rendszer által nem azonosított zsírsavak gyakoribb el ıfordulása figyelhet ı meg továbbá termofil körülmények között.

97 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 SATFA MUFA PUFA -OH Cy elágazó C15:1, C17:1 azonosítatlan

V/18. ábra. A közösségi zsírsavmintázat típuskategóriák szerinti eloszlása a mintákban. SATFA: telített zsírsavak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), PUFA: többszörösen telítetlen zsírsavak (poliunsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak. 15:1 - 17:1 : C 15:1 és C 17:1 zsírsavak, jellemz ıen szulfátredukáló baktériumok zsírsavai, Cy: ciklopropil-tartalmú zsírsavak, azonosítatlan: azonosítatlan zsírsavak. Az értéktengely a mar- kerkategória-átfedések miatt dimenziónélküli.

11:20 unid* 9:00 unid* 100% 14:959 unid* 7:90 *unid azonosítatlan 13:565 *unid 5:20 *unid 90% 4:00 unid* 3:40 unid* C18:2 ? 6,9c PUFA C18:3 ? 6c(6,9,12) 80% C16:1? 7c C13:1 AT 12-13 C20:1 ? 9c C18:1? 7c 70% C18:1? 9c C17:1? 6c C17:1? 8c MUFA C15:1 ? 6c 60% C16:1? 5c ISO C17:1? 9c / 16:0 10 methyl C15:1 ISO G 11methyl C18:1? 7c 50% C15:1 ISO I C17:0 ANTEISO C17:0 ISO 40% C16:0 ISO elágazó C15:0 ANTEISO C15:0 ISO C14:0 ISO 30% C13:0 ANTEISO C13:0 ISO SATFA C12:0 ISO -OH C17:0 ISO 3OH 20% C11:0 ISO 3OH C15:0 3OH ciklikus C19:0 CYCLO ? 8c C20:0 10% C18:0 C17:0 C16:0 C15:0 0% C14:0 C13:0 C12:0 /1 3 /5 7 2 /6 4 4/ 4 4/ 6/ 6/4 6 6/8

V19. ábra. A foszfolipid-zsírsavak mennyiségi eloszlása a mintákban. SATFA: telített zsírsa- vak (saturated fatty acids), elágazó: elágazó szénláncú zsírsavak, PUFA: többszörösen telítet- len zsírsavak (polyunsaturated fatty acids), MUFA: egyszeresen telítetlen zsírsavak (monounsaturated fatty acids), -OH: hidroxiszubsztituált zsírsavak, *: azonosítatlan zsírsavak.

Egyenként tekintve a zsírsavak mennyiségi alakulását (V/19. ábra) ugyancsak szolidnak tőnik az átrendez ıdés a T-RF-ek mennyiségi átrendez ıdéséhez viszonyítva. Ennek ellenére,

98 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ha f ıkomponens-analízist végzünk a zsírsavmennyiségek alapján, (V/20. ábra), láthatóan igen hasonló szukcessziós történetet kapunk vissza, mint a DNS-markerek hasonló elemzé- sekor. A két reaktor kiindulási és végállapotának közelsége és a 4/4-es közösség többit ıl való eltávolodása itt is megfigyelhet ı.

4/1

6/1

6/2 Component 11.666% 2 6/3 6/4

.6/7 .6/6. 4/6 6/5 4/7 4/4 6/8 . 4/8 4/5

4/3

4/2

Component 1 85,656%

V/20. ábra. Zsírsavösszetétel alapján készült f ıkomponens-analízis eredménye (kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

Trendszer ő változás a kisebb részarányú zsírsavak némelyike esetén figyelhet ı meg in- kább (V/21. ábra), ezek közt azonban olykor következetes együttmozgás is el ıfordul, így például az izo C 13:0 és anteizo C 13:0 , az izo C 17:0 és anteizo C 17:0 párok között.

99 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

C13:0 ISO C13:0 ANTEISO

C19:0 CYCLO ω8c C17:0 ISO 3OH

0,08 C17:0 ISO

0,07 mennyiségfajlagos C17:0 ANTEISO 0,06 C11:0 ISO 3OH 0,05 C12:0 0,04 C20:1 ω9c 4/1 0,03 4/2 4/3 C18:3 ω6c(6,9,12) 4/4 0,02 4/5 4/6 0,01 4/7 4/8 0 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8

V/21. ábra. Trendszer ő mennyiségi változást mutató zsírsavak a felf őtéses kísérlet során.

Hasonló, ám a mintasorok szabad szemmel való áttekintése során nehezen szembeötl ı zsírsav-együttmozgások feltárására elvégeztük a zsírsav-markerek korrelációs klaszteranalí- zisét (V/22. ábra), amely további együttmozgásokra derített fényt. A fán az er ıs korrelációs hasonlóság id ısori elemzésben er ıs id ıbeli együttmozgásra utal. 0,9-nél nagyobb korrelá- ciós hasonlóságot mutatnak nem csak a fentebb említett zsírsavak, hanem más párok és hármasok is. Megfigyelhet ı az is, hogy a zsírsavak tágabb együttmozgásaik alapján is cso- portosulnak.

100 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

* *

*

*

*

V/22. ábra. A Zsírsavmarkerek id ıbeli Pearson-féle korrelációja alapján (paired group mód- szerrel, abszulút mennyiségi adatok alapján) szerkesztett hasonlósági fa. Piros keretek emelik ki az er ıs együttmozgást (hasonlóság > 0,9) mutató zsírsavmarker-párokat illetve – hármasokat. *: azonosítatlan zsírsavak.

A respiratórikus menakinonok relatív mennyiségi viszonyait tekintve (V/23. ábra) szem- bet őnı a Desulfobulbus fajokból leírt MK5(H2) kinon dominanciája, valamint a viszonylag csekély mérv ő átrendez ıdés a közösségi mintázatban. Ezzel ellentétben az ubikinonokra tekintve (V/24. ábra) határozott változás látható, amely leginkább a Q4-es kinon termofil irányú feldúsulásában és a Q8, Q9 és Q10 kinonok párhuzamos visszaszorulásában érhet ı tetten. Az ubikinon-diagramon szembeötl ı nagyszámú azonosítatlan marker egy része való- szín őleg részlegesen telített izoprénláncú ubikinonoknak felel meg, melyek kimutatatására azonban nem rendelkeztünk standardekkel vagy autentikus mikroba-törzsekkel.

101 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

100% MK11(H4) MK10(H6) 90% MK11(H2) MK9(H6)+1 * MK10(H2)-1 * 80% MK9(H4) MK8(H6)-1 * 70% MK9(H2) MK8(H4)-1 * MK9 60% MK6(H8)-1 * MK7(H4) MK8+1 * 50% MK6(H6)-1 * MK5(H8) MK6(H4) 40% MK5(H6) MK6(H2) MK4(H8) 30% MK6 MK4(H6) 20% MK5(H2) MK4(H4) MK5 10% MK4(H2) MK2(H8) * MK3(H4) 0% MK4 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 V/23. ábra. A menakinonok mennyiségi eloszlása a mintákban. *: azonosítatlan marker (a retenciós idejében legközelebb es ı markerr ıl és attól számított el ıfordulási sorszámával elne- vezve).

102 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

100% Q12+4 * Q11+1 * 90% Q11-4 * Q10+2 * Q10 80% Q10-2 * Q9+3 * 70% Q9+2 * Q9+1 * Q9 60% Q9-1 * Q9-2 * Q8+2 * 50% Q8 Q8-1 * Q7+2 * 40% Q7+1 * Q7 30% Q7-1 * Q6+2 * Q6+1 * 20% Q6 Q6-1 * Q5+1 * 10% Q5 Q5-1 * Q4 0% 4/1 4/2 4/3 4/4 4/5 4/6 4/7 4/8 6/1 6/2 6/3 6/4 6/5 6/6 6/7 6/8 V/24. ábra. Az ubikinonok mennyiségi eloszlása a mintákban. *: azonosítatlan marker (a retenciós idejében legközelebb es ı markerr ıl és attól számított el ıfordulási sorszá- mával elnevezve).

A kinonok együttes mennyiségi mozgásai alapján végzett f ıkomponens-analízis ered- ménye a V/25. ábrán látható. A szukcessziós mozgás és a 4/4-es minta kiugrása a másik két marker esetéhez hasonlóan felt őnı, jóllehet a 6-os közösség mintasorának két végpontja kinonok tekintetében legalább annyira távol es ı a többitıl.

103 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

6/1 6/8

4/5 4/8

Component 16.85% 2 4/2 4/6 6/2 6/6 6/7 4/1 6/4 4/7 6/3 6/5 4/3

4/4

Component 1 64.505% V/25. ábra. Mena- és ubikinonok mennyiségei alapján készült f ıkomponens-analízis eredmé- nye (kovariancia szerint). A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik.

Fıkomponens-analízist végeztünk a három f ı markertípus egyesített adatsorai alapján is (V/26. ábra). Ez vizsgálatunk eredményeinek minden adatát figyelembe veszi. Hogy eny- hítsük a mérési adatok természetének különbségéb ıl adódó abszolútérték-eltérések torzító hatását, az adatok természetes alapú logaritmusát vettük, s ennek alapján készült a f ıkom- ponens-elemzés. A két f ı komponens kovariancia-képvisel ı erejének csökkenése (a külön végzett elemzésekhez viszonyítva) ennek az adathomogenizálásnak tulajdonítható. A szuk- cessziós folyamat egyértelm ően kirajzolódik, a 4/4-es minta különállása azonban enyhül a konszenzusos PCA-eredményekben.

104 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

4/4 4/5

4/7 4/6

4/3

4/2 Component 16.965% 2

6/5 6/7

4/8 6/6

6/8 4/1 6/4 6/1

6/3 6/2

Component 1 37.888%

V/26. ábra. A három markertípus (TR-F, foszfolipid-zsírsav és respiratórikus kinon) alapján végzett f ıkomponens-analízis konszenzus-eredménye. A kék kör a mezofil kiindulási állapotot, a piros a kísérlet végi termofil állapotot jelöli. A barna nyilak a 4-es reaktor, a zöldek a 6-os reaktor közösségének szukcessziós útját követik. Az elemzés az abszolút mennyiségi adatok természetes alapú logaritmusának felhasználásával készült.

V. B. 3. 2. A mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtéses kísérlet értékelése Már a két bemutatott abiotikus paraméter, az illósavtartalom és a gázhozam alakulása is jól tükrözi azt a közösségszint ő mikrobiológiai eseményt, amely várakozásainknak megfe- lelıen végbement mezofil h ımérsékletr ıl termofilra való felf őtés során. A radikális változ- tatásnak kitett közösség gázhozama azonnal visszaesik a felf őtést követ ıen, illósavtartalma pedig jelent ıs növekedésnek indul, ami – mint korábban említettük – a metanogén közös- ségben stresszhatás és m őködési zavar jele. Hirtelen felf őtés esetén érthet ı módon elpusz- tulnak vagy inaktiválódnak azok a közösségalkotók, amelyeknek növekedési optimumától távol esik az új üzemi h ımérséklet, miközben a termofil csírabevitel a nyersiszap – vélhet ı- en dormans – alkotóival még nem kapott elég id ıt, hogy aktiválódjék, abundanciáját meg- növelje, anyagcsere-kapcsolatait kiépítse. (Modellrendszeri kísérleteinkb ıl tudjuk, hogy az itt bemutatotthoz hasonló h ımérsékletkövet ı közösségváltás sterilizált iszappal való táplá- lás esetén nem lehetséges: m őköd ı termofil metanogén közösség nem épül ki, és a gázter- melés végleg leáll. A közösségek tehát igénylik rugalmasságukhoz a folyamatos küls ı csí- rabevitelt, önmaguktól nem tartanak fenn olyan belsı tartalékdiverzitást, amely az új közös- ség megalapozója lehetne.) Fokozatos felf őtés esetén – bár a gáztermelés visszaesik, és az illósavtartalom némileg megn ı az átmeneti h ımérsékleteken – a közösség id ıt kap a régi

105 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK közösségalkotók kimosódásával és újabbak megtelepedésével történ ı alkalmazkodásra, az anyagcsere-hálózat igény szerinti lassú, anaerob sejtciklusokkal követhet ı átrendez ıdésére. Ugyanakkor a hirtelen h ımérsékletváltás után is normális szintre emelkedik a gázhozam a kísérlet végére, és eredeti szintjére esik vissza az illósavtartalom. Visszaigazolódik tehát a szakirodalomban is emlegetett tapasztalat (Ahn és Forster 2002), miszerint mindkét közös- ségtípus képes felépülni illetve spontán regenerálódni akár hosszú és radikális h ımérséklet- váltások után is. Tulajdonképpen ezen jelenségek határesetét érhetjük tetten abban a tény- ben is, hogy a biogázreaktorokat a legtöbbször nem kell mesterségesen fenntartott indító- kultúrákkal oltani, a metánprodukció ugyanis magától elindul a környezetb ıl és a szubsztrátokból összeverbuválódott organizmusok közösséggé szervez ıdésével is, ameny- nyiben a h ımérséklet és a redoxpotenciál megfelel ı. A DNS-alapú módszerek határozottan és taxonómiailag is informatív módon tükrözik a közösségváltozást. A termofil közösség csökkent diverzitása a mezofilhoz képest itt is megmutatkozik, csakúgy, mint a mezofil-termofil közösségösszhasonlítás esetében (V. B. 1. 1. fejezet). Jól látható, hogy a mezofil-termofil átmenet fokozatos felf őtés esetén sima, trendszer ő, fokozatos közösségátrendez ıdéssel valósul meg, míg radikális, hirtelen h ımér- sékletváltás esetén rendetlenebbül, véletlenszer őnek látszó ingadozásoktól zavartan valósul meg az új közösségi egyensúly kialakulása. Ez többé-kevésbé a többi markertípus közössé- gi változásaiban is megmutatkozik, és kiválóan összecseng az abiotikus paraméterek válto- zásmódjával, valamint a f ıkomponensanalízisek nyomán látható jellegzetes „kerül ıúttal”, amelyet a 4-es reaktor közössége bejár az új egyensúly kialakulásáig. A közösségátrende- zıdés azonban ett ıl függetlenül hasonló eredménnyel zárul: fokozatosan kiszorultak a Levilinea saccharolytica, Longilinea arvoryzae, Paludibacter propionicigenes és Ethanoligenens harbinense fajokkal rokonítható T-RF-ek, és több más, közelebbr ıl nem azonosított T-RF is, míg egyebek között a Defluviitoga tunisiensis, Coprothermobacter proteolyticus, Flavobacterium filum és Amoebophilus asiaticus fajokkal rokonítható T-RF- ek dominánssá válnak. Az Aminobacterium colombiense Alu enzimes emésztéssel ugyanazt a T-RF-et adja, mint a Defluviitoga tunisiensis , Bsu enzimmel azonban elkülönülnek, ez alapján pedig úgy t őnik, hogy az A. colombiense alárendelt szerepet játszik a mezofil, majd az átmeneti közösségekben is, id ıvel pedig kiszorul a termofil közösségb ıl. Az Alu75-76 T-RF-et pedig zömmel a D. tunisiensis faj adja. A klónkönyvtár segítségével jó hasonló- sággal meghatározott T-RF-ek különösen két faj er ıteljes feldúsulását mutatják termofil körülmények között: a Defluviitoga tunisiensis eszerint – bár jelen van a mezofil közösség- ben is – termofil körülmények között kap csak komolyabb teret, a Coprothermobacter proteolyticus pedig kimondottan csak termofil közösségben jelenik meg, válik rezidenssé, sıt, akár dominánssá. Az el ıbbi fajról tudjuk, hogy termofil növekedési optimuma ellenére

106 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK egy sajtkészítésb ıl származó savót feldolgozó mezoterm reaktorból izolálták Tunéziában (Hania és mtsai. 2011), a másodikat pedig – nevének megfelel ıen – termofil körülmények közül izolálták [el ıször Thermobacteroides proteolyticus néven (Ollivier és mtsai. 1985), majd átnevezésre került a Coprothermobacter nemzetség típusfajaként (Rainey és Stackebrandt 1993)], majd megtalálták például termofil komposztban is (Kersters és mtsai. 1994). Ezen eredményünk tehát kiválóan egyezik a szakirodalmi adatokkal, azonosított fajaink metanogén közösségek jellegzetes alkotói. A többi fajokkal rokonított klónunk ese- tében a szekvenciahasonlóság a faji megfeleltetéshez túl kicsiny, és csupán annyi mondható el, hogy a máig kitenyésztett baktériumfajok közül a V/2. táblázatbéli (93. old.) áll legköze- lebbi rokonságban a talált klónokkal. A Flavobacterium filum -hoz 94%-ban hasonló klón esetében még nem zárható ki teljesen az azonos nemzetségbe tartozás, a többiek esetében azonban már igen. Ennek ellenére sem érdektelen talán végigtekinteni klónjaink legköze- lebbi leírt rokonainak során. A Flavobacterium filum egy koreai szennyvíztisztító telepr ıl került el ı (Ryu és mtsai. 2007) és bár mezofil szervezet, nem kizárható, hogy egy közeli termofil rokonának klónjára bukkantunk reaktorainkban, hiszen az ennek megfelel ı T-RF feldúsulása a termofil közösségszervez ıdés során trendszer ő. Levilinea saccharolytica né- ven egy mezofil anaerob törzset írtak le (Yamada és mtsai. 2006), és a vele rokonítható klón nálunk is kiszorul a termofil közösségekb ıl, ami mezofil növekedési optimumh ımérsékletet valószín ősít. Az Aminobacterium colonbiense hígtrágyarothasztóból el ıkerült mezofil aminosavfermentáló szervezet (Baena és mtsai. 1998), melynek mi egy termofil rokonát azonosíthattuk, ha csupán 90%-os szekvenciahasonlósággal is. A Longilinea arvoryzae egy rizsföld metanogén közösségéb ıl el ıkerült mezofil szervezet (Yamada és mtsai. 2007). Észlelt rokona nálunk is kiszorul termofil körülmények között, bár mintha az átmeneti zavaros id ıszak növelné az abundanciáját. Melaszos szennyvízb ıl izolált mezofil szervezet az Ethanoligenens harbinense (Xing és mtsai. 2006). A vele ro- konságot mutató T-RF nálunk is kiszorul a termofil közösségb ıl, bár sokáig állja a sarat felf őtés után. Rizsföld anoxikus, növényi maradványokkal teli talajából írták le (Ueki és mtsai. 2006) a Paludibacter propionicigenes propionsavtermel ı, 30°C növekedési optimu- mú szervezetet, akinek távoli rokona nálunk is hasonló h ımérsékleti optimumnak megfele- lıen szorult ki a két közösség T-RF-mintázatából (hirtelen felf őtés esetén gyorsabban). A legtávolabbról rokonított klón az am ıba-endoszimbionta Amoebophilus asiaticus kandidá- tus-fajjal mutat 79%-os szekvenciahasonlóságot. A távolabbi rokonfajok számbavétele alapján is egy jellegzetes metántermel ı közösség körvonalazódik tehát. A legalább genus-szinten azonosított klónjainkhoz érdemes megnéznünk a leírt fajok zsírsavkészletét. Defluviitoga tunisiensis C 16:0 (42.7%), C18:1 ω9c (30.7%), C16:1 ω9c (10.7 %),

C18:0 (9.9%) és C 18:1 ω7c (6.0 %) zsírsavakkal rendelkezik (Hania és mtsai. 2011), melyek

107 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK mind jelen vannak a közösségi zsírsavkészletben, a Coprothermobacter proteolyticus erede- ti fajleírásában elmulasztják közölni a zsírsavkészletet, ám egy ugyanabba a nemzetségbe tartozó faj ( Thermobacteroides leptospartum , Toda és mtsai. 1988) leírásában a C 16:0

(27.7%), iso-C17:0 (18.5%) és iso-C15:0 (16.4%) zsírsavakat találjuk, melyeket ugyancsak kimutattunk a közösségb ıl, nemzetségen belül pedig a zsírsavkészlet azonosnak tekinthet ı, ha a termelési arányok nem is feltétlenül. A Flavobacterium filum -hoz 94 %-ban hasonló klónunk esetében még elképzelhet ı a genus-szint ő összetartozás és így várhatóan a zsírsav- készlet azonossága is. Ebb ıl a fajból izo-C15:0 (19.7%), C 15:0 (17.2%), izo-C15:1 G (16.8%), izo-C16:0 3-OH (9.7%), izo-C15:0 3-OH (9.2%), izo-C16:0 (5.8%), anteizo-C15:0 (3.7%), izo-

C14:0 (3.5%), izo-C17:0 3-OH (3.5%), C 15:0 3-OH (1.9%), C 15:1 ω6c (1.8%), izo-C16:1 H

(1.5%), izo-C14:0 3-OH (1.5%), C 16:0 (1.5%), C16:0 3-OH (1.2%), C 14:0 (1.0%) és iso-

C13:0 (0.7%) zsírsavakat izolálták (Ryu és mtsai. 2007). Az aláhúzott négy zsírsav kivételé- vel kimutattuk a közösségb ıl ezeket a molekulákat is. A leírt fajokkal 90% körüli vagy az alatti hasonlóságot mutató klónok esetében a genus-szint ő együvé tartozás kizárható, így a zsírsavkészlet hasonlóságát sincs értelme firtatni. Sajnos a zsírsavmintázat moderált válto- zásai nem követik árulkodó módon a T-RF-ek változásait, így ránézésre nem mondható több e megfelelésekr ıl. A zsírsavtípusok változásában megemlítend ı a ciklopropil-tartalmú zsírsavak feldúsulása a termofil közösségi egyensúly felé törekedve. Minthogy ezt a zsírsa- vat enterális baktériumok markereként szokták számon tartani, eredményünk itt ellentmond a termofil körülmények általánosan tapasztalt, enterális patogéneket elimináló hatásának. E zsírsavmarker enterális mikrobakörhöz rendeltsége ugyanakkor (bár jellemz ı) nem kizáró- lagos, jelen esetben valószín őbb, hogy rezidens közösségalkotótól származik. A szulfátre- dukáló baktériumok markereként számon tartott C 15:1 és C 17:1 zsírsavak kicsiny aránya a többi zsírsav között összevetve a Desulfobulbus szignatúrakinon MK5(H2) dominanciájá- val újra csak arra enged következtetni, hogy a feltételezett Desulfobulbus fajok az anaerob légz ı szervezetek között mutatnak csak dominanciát, akik arányaikkal amúgy együttesen is eltörpülnek a fermentáló szervezetek sokaságában. A mennyiségi arányok id ıbeli alakulása ugyanakkor nem mutat összhangot a két marker között, ami egy további bizonytalansági tényez ıre hívja fel a figyelmünket. A Desulfobulbus fajok zsírsavkészletér ıl szóló szakiro- dalom ugyanis beszámol arról a jelenségr ıl, hogy ezek a baktériumok a rendelkezésükre álló szubsztrátnak megfelel ıen más-más zsírsavarányt produkálnak foszfolipidjeikben, így a propionsavon vagy tejsavon mint szénforráson való növekedéskor mért C 17:1 dominancia helyett CO 2 és H 2 jelenlétében tenyésztve C 16:0 és C 18:1 válik dominánssá a zsírsavkészle- tükben (Taylor és Parkes 1983). Elképzelhet ı tehát, hogy metanogén közösségekben a Defulfobulbus fajok beolvadnak zsírsavaikkal a többi szervezet tömegébe (utóbbi zsírsava- kat megtaláltuk a klónok alapján azonosított, termofil közösségben fajoknál is, s amúgy is

108 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

gyakoriak). Elképzelhet ı az is, hogy a C 16:0 és C 18:1 zsírsavak jelent ıs hányada éppen ezek- tıl a szulfátredukálóktól származik, akik eszerint talán mégsincsenek olyan kisebbségben a fermentálók mellett, mint az imént következtettünk rá. Azonosított DNS- ujjlenyomat nem áll rendelkezésünkre, hogy támpontot adjon a kérdés megválaszolásához. Vizsgált DNS- marker híján ugyancsak keveset mondhatunk a PUFA zsírsavak termofil feldúsulásáról, ami eukarióta szervezetek feldúsulását jelentené, ugyanakkor az eukarióta mitokondriumokra jellemz ı Q10 ubikinon visszaszorulása termofil egyensúly felé haladva óvatosságra int e következtetést illet ıen. Mivel általános tapasztalat, hogy tömegesen találni ismert fajhoz nem sorolható klónokat anaerob rothasztókban és más metanogén közösségekben, az sem kizárható, hogy mégis prokarióták termelik ezeket a zsírsavakat. A zsírsavak korrelációs hasonlósági fáján sem csak hasonló zsírsavtípusba tartozó markerek együttmozgását láthat- juk meg – ami nyilvánvalóan egyazon termel ı szervezett ıl való származásukat valószín ősí- ti – de figyelemre méltó például a viszonylag ritka C 15:0 3OH zsírsav igen er ıs együttmozgása egy azonosítatlan zsírsavval (4:00 unid) is, amely a 6-os reaktor termofil közösségeiben jelent meg, és ha valóban egy máig nem ismert zsírsavtípus képvisel ıje, valószín ő, hogy termel ıjét sem ismerjük még. Ugyanígy gondolatébreszt ı, hogy a termofil közösségekben általánosan megn ıtt a MIDI adatbázisok számára azonosíthatatlan zsírsavak aránya, ami ugyancsak azt sugallja, hogy sok fehér folt van még a tudásunkban a metanogén közössé- gek összetételével és tagjaik kilétével kapcsolatban. Felvet ıdik a kérdés, miért tapasztalható eltér ı változékonyság a markerek között, és pél- dául a faji szinten is megnyugtatóan azonosított Defluviitoga tunisiensis irodalomból ismert fı zsírsavainak (C 16:0 , C18:1 ω9c ) id ıbeli változása miért nem mutat hasonló karaktert, mint az ugyanezen fajhoz rendelhet ı T-RF-marker változása? Nos, a faj két f ı zsírsava (és a többi is) elég általánosnak mondható a baktériumok körében, más szóval a D. tunisiensis nem egy különleges szervezet a zsírsavait tekintve. Joggal valószín ősítjük tehát, hogy a közösség más tagjai is jelent ıs mennyiséget „dobtak közösbe” ugyanezekb ıl a markermolekulákból, maszkírozva ezzel egymás abundanciaváltozásait. Nyilvánvaló, hogy itt a DNS- és zsír- savmarkerek taxonómiai felbontási képességére jellemz ı különbséggel szembesülünk (a DNS-marker javára), ugyanakkor joggal mondanánk-e, hogy a zsírsavanalízist feleslegessé teszi a közösségi vizsgálatban a DNS-markerek vizsgálhatósága? Mint az Irodalmi áttekin- tés fejezetben említettük, a PCR-amplifikáción alapuló markersokszorozás alaposan torzít- hatja a mennyiségi viszonyokat, míg a zsírsavpreparációban és -mérésben nem ismerünk komoly elfogultságot eredményez ı tényez ıt. Ez nem vezet ellentmondáshoz a fenti tapasz- talatainkkal, mivel az, hogy a DNS-markerek – jó taxonómiai felbontóképességük miatt – megmutatják a minták-béli abundanciaváltozásokat, nem jelenti, hogy például a markerter- mel ı szervezetek eredeti arányait is megbízhatóan tükrözik vissza a bel ılük származó mar-

109 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK kerek arányai. Másfel ıl a kisebb taxonómiai felbontás ellenére a zsírsav- (és kinon-) mintá- zat ha másképp is, de ugyancsak információt hordoz a közösségi eseményekr ıl. A marke- rekkel külön, majd együttesen is elvégzett f ıkomponens-analízissel a szukcessziós folyamat bemutatása mellett éppen az volt a célunk, hogy megmutassuk: az olykor nehezen értel- mezhet ı összkép, a látszólagos ellentmondások és bizonytalanságok ellenére egyik marker- csoport sem bizonyul alkalmatlannak a közösségi változások nyomon követésére, s ıt észre kell vegyük, hogy mindhárom markertípus hitelesen képezi le a közösségváltozást. Hiszen figyelemre méltóan hasonló karakter ő szukcessziós utakat rajzolnak ki, így egymás alkal- mazhatóságát kölcsönösen igazolják. A történet tehát mindegyik adatsorban ott bujkál, csak a megfelel ı kapaszkodók hiányoznak számunkra, hogy jobban megfejtsük a rejtvényt, és a fentebb leírtaknál mélyebben értsük meg a közösségek bels ı változásainak természetét.

V. B. 3. 3. A markerek korrelációs megfeleltetési stratégiájának kidolgozása A fentiekben lényegét tekintve végighaladtunk azon a gondolatmeneten, amellyel a polifázikus szemlélet ő közösségelemzések rekonstruálni igyekeznek egy közösségösszetételt és közösségváltozást a különbözı molekuláris ujjlenyomatok alapján. Az általunk áttekintett szakirodalomból úgy t őnik, a hasonló módszereket alkalmazó szer- zık nem is lépnek tovább az efféle következtetéseknél, és a megjelen ı publikációk nagy része is a fentiekhez hasonló t őnıdés az adatok nyújtotta képlékeny összkép fölött (Liu és mtsai. 2000). A mindenkori olvasónak (és gyaníthatóan maguknak a szerz ıknek is) köny- nyen támadhat az az érzése, hogy a sok ismeretlen faktor – mint amilyen a nem ismert (csak észlelt) fajok nagy száma egy ilyen mikrobaközösségben, az átfed ı markertermelés okozta információvesztés, vagy az alkalmazott módszerek tökéletlenségeib ıl (például preferenciá- lis DNS-amlifikációból) adódó várható információtorzulások – miatt az egész eredményér- tékelés tulajdonképpen csupán ügyesen átgondolt, és szakszer ően tálalt nem-tudás, illetve valószín ő forgatókönyveken való kreatív ötletelés, nem pedig tényleges közösségfeltárás vagy nyomon követés. Az pedig a mindenkori olvasó el ıismereteit ıl, beállítottságától vagy éppen jóindulatától függ, hogy rábólint az adatértelmezés szerz ı által felkínált forgatóköny- vére, vagy nekiáll érveket keresni (és találni), hogy jelent ıs részben miért megalapozatla- nok vagy legalábbis tetsz ılegesek a leírt következtetések. Ez a bizonytalanság természete- sen a rendelkezésünkre álló módszerek és a vizsgált tárgy természetéb ıl fakadó, szükség- szer ően adódó helyzet, ugyanakkor különös, hogy e helyzet meghaladására mintha kevés er ıfeszítés irányulna a szakterület m ővel ıi részér ıl. A másik sajátosság, ami felt őnhet, hogy a tarka diagramokon megjelen ı számtalan színes sáv közül csak kevéssel kapcsolat- ban adódik értelmez ı gondolat, a többségnek kényszer ő figyelmen kívül maradás lesz a sorsa, vagy egy sokváltozós adatelemz ı módszer alkotta összképben oldódik fel az általa

110 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK hordozott információ. Pedig érezhet ı, hogy az ismereteink és módszereink alapján kirajzo- lódó értelmezési horizonton túl rengeteg információ lapul még kitermeletlenül az adatsorok mélyén. Miként lehetne – legalább részben – hozzáférni ezekhez? Az efféle gondolatok még nem is fogalmazódtak meg bennem élesen, amikor doktori munkám legelején, az ELTE KKKK egyik m őhelymegbeszélésén egy leveg ıkémiával fog- lalkozó doktorandusztársam, Muránszky Gábor témaismertetését hallgattam, melyben arról került szó, miként lehet városi légszennyez ı komponensek forrását azonosítani illetve kö- zös forrásból való származásukat kimutatni mennyiségük együttes id ıbeli változásai alap- ján. (Például ha egy üzem leáll, az általa kibocsátott légszennyez ı komponensek szintje egyszerre mutat csökkenést egy id ıbeli monitoringvizsgálat adatsoraiban.) Az efféle elem- zéshez arra van szükség, hogy magukat a mért változókat tegyük statisztikai összehasonlítás tárgyává, értékeik id ıbeli változása a monitoring során ugyanis olyan karakterisztikát rajzol ki, melyek alapján összehasonlíthatóak, azaz megmutatkozhatnak a hasonló „történettel” bíró változók csoportjai. Az id ıben hasonlóan változó anyagok mögött ugyanis valószín ő- leg hasonló történet áll (pl. azonos kibocsátó forrás, és annak m őködési ingadozásai). Ekkor ébredt bennem a gondolat, hogy hasonló logikával a közösségmikrobiológiában használt ujjlenyomatmódszerek markerei eredetének is nyomába lehetne eredni: egy közösségbeli légz ı baktérium, amely a közösségi markermintázathoz hozzájárul valamilyen kinonnal, különféle zsírsavakkal, és egy T-RF-markerrel, abundanciájának id ıbeli (vagy térbeli) vál- tozásai során értelemszer ően változtatni fogja markereinek mennyiségi arányait is a közös- ségi ujjlenyomatmintázatban. Ha például egy baktérium dominánssá válik egy közösség- ben, vélhet ıleg zsírsavai és T-RF markerei is dominánssá válnak a markerkészletben. Az adatsorok megfelel ı statisztikai elemzésével kimutathatnánk az id ıbeli együttmozgásokat, és ezzel azonosíthatnánk különböz ı típusú markerek közös termel ıit. Így akár soha ki nem tenyésztett környezeti klónokhoz is hozzárendelhetnénk olyan fenotipikai bélyegeket, mint bizonyos zsírsavak megléte, vagy légzés képessége (kinonmarkerek alapján). Igaz, soha nem bizonyossággal, de a mintaszámmal és a változások amplitúdójával növekv ı hihet ı- séggel tehetnénk meg e hozzárendeléseket. Közbevetjük: az alapgondolat még csak véletlenül sem újdonság: amikor valaki közös- ségi ujjlenyomat-mintázatokat vet össze, tulajdonképpen nem tesz mást, mint a vizsgált markereknek egy id ı-, tér- vagy állapotsor mentén való viselkedését veszi szemügyre, és ebb ıl igyekszik információt nyerni a közösség történetér ıl. Er ıs markeregyüttmozgás ese- tén ilyenkor is közös termel ıre kezd gyanakodni az elemz ı. Ennek egyszer ő példáját mutat- tuk be az el ızı fejezet V/22. ábrájával (101. old.), ahol hasonló karakter ő zsírsavak id ısori korrelációit kimutatva közös termel ı szervezet létét valószín ősítettük. Arra azonban, hogy ne bakteriális markercsoporton belül, hanem különböz ı markercsoportok között végezzünk

111 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK célirányos statisztikai felderítést termelıszint ő összetartozások kimutatására (vagyis hogy id ıbeli együttmozgásokból kikövetkeztessük, hogy pl. mely kinon és T-RF származik a mintában ugyanattól a baktériumtól), tudomásunk szerint még nem volt példa a közösségmikrobiológiában. Ehhez a markerváltozók összevont csoportjában kell korreláci- ós összehasonlításokat végeznünk valamilyen alkalmas, sokváltozós adatelemzési módszer segítségével. Ha egy marker egy másik típusú markerrel mennyiségileg következetesen korrelál id ı-vagy térsorokban, az közös termel ı szervezet létét valószín ősíti (ha nem is bi- zonyítja). Az els ıre talán nem is komplikáltnak t őnı feladat megfelel ı kivitelezéséhez azonban kü- lönböz ı problémákkal kell szembenéznünk. Rögtön szembesülnünk kell a taxonómiai rele- vanciájukat tekintve átfed ı markerek fentebb látott problémájával. Két baktérium, amelyek T-RF-eik alapján elkülöníthet ık, könnyen lehet, hogy ugyanazt a zsírsavat termelik nagy mennyiségben ami (az V/27. ábrán látható módon) ahhoz vezet, hogy a zsírsavmarker kü- lön-külön egyik termelıjének T-RF-markerével sem korrelál különösebben jól, hanem azok mindenkori (mintákon belüli) összegével fog korrelálni. Az V/27. ábrán mutatott esetben nem fogunk szemmel látható markeregyüttmozgást észrevenni egyszer ő diagramokon (kü- lönösen ha sok egyéb marker adatai uralják az összképet), holott az információ mégis ott rejlik az adatokban! Kár volna lemondani róla, ha kinyerhet ı. . markermennyiség

id ı- vagy térsor

T-RF1 T-RF2 T-RF3 Zsírsav1 Σ T-RF1-3

V/27. ábra. Egy egyszer ő, elképzelt mikrobaközösség markereinek változása id ı vagy térso- ron. A közösséget alkotó három faj elkülönül T-RF markerei alapján (T-RF1, T-RF2, T-RF3), miközben mindhárman ugyanazt a zsírsavat (Zsírsav1) termelik. A termelt zsírsav (hibátlan kimutatásokat feltételezve) egyik T-RF-fel sem korrelál jól külön-külön, ugyanakkor látható- an nagyon jól korrelál a három T-RF mindenkori mennyiség-összegével (szaggatott vonal).

A valóságban persze nem tudjuk, mely változókat kell összeadnunk az egyik markercso- portban, hogy aztán ez az összeg korreláljon a másik csoport valamely változójával. Ho- gyan lehetne ezeket az összetartozó markereket mégis megtalálni? A matematikai statisztika mélyebb ismeretének híján felkerestük az ELTE TTK sokváltozós statisztikai módszereket

112 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK sőrőn alkalmazó szaktekintélyeit, ám ilyesfajta rejtett összefüggések kimutatására alkalmas módszer nem volt ismert az ı körükben sem. Maradt tehát a modern számítástechnika szá- mítási kapacitását kihasználó „nyers er ı” módszere: kombinatorikusan adjuk össze a válto- zóink mennyiségeit mintánként, majd az így nyert származtatott összegváltozók között ke- ressük azokat, amelyek kiugróan jó korrelációt mutatnak más változókkal. Az erre a m őveletre alkalmas célszoftver kifejlesztését az ELTE IK Numerikus Analízis Tanszéke és a Mikrobiológiai Tanszék közötti együttm őködés keretében diplomamunkát készít ı Czigler András programtervez ı informatikus hallgatóval közösen végeztük el (Czigler 2010). A szoftver a megfelel ı rendezésben betáplált adatokból kombinatorikusan összegváltozókat képez, s ezeket a származtatott változókat bevezetve a változók közé ki- számolja az adatok közötti Pearson-féle korreláció értékét (bár más hasonlósági indexek számolására is alkalmas), ezeket rendezhet ı alakban kilistázza, illetve megfelel ıen kezelhe- tı hasonlósági fa alakjában ábrázolja. Természetesen a nyers er ı alkalmazásában azért jó néhány ésszer ő optimalizációra is le- het ıség nyílt. Így például a különböz ı változótípusokat továbbra is külön kezeljük, és az összegképzést csak a csoportokon belül végzi el a szoftver, hiszen nincs belátható értelme annak, hogy mondjuk egy zsírsav és egy T-RF mennyiségi összegének korrelációját vizs- gáljuk egy másik zsírsavval. Azzal, hogy csoporton belül maradunk, az összegképzés kom- binatorikus lehet ıségeinek száma er ısen redukálódik. A felhasználó markercsoportonként megadhatja továbbá, hogy hány tagú összegekig menjen el a program az összegváltozók generálásában, és ehhez járul egy, a programba épített várható számítási id ıt becsl ı alkal- mazás is, amely alapján eldönthet ı, megéri-e nekikezdeni az aktuálisan beállított paraméte- rekkel az analízisbe. Nem nehéz ugyanis belátni, hogy nagyszámú változót tartalmazó adatmátrixok és soktagú összegekig való elszámolás esetén a kombinációk száma olyan óriásira rúghat, hogy az egy általánosan használt asztali számítógép kapacitását igen hosszú id ıre lefoglalhatja. További problémaként merült fel a csoporton belüli változók nagyságrendileg eltér ı mennyiségi aránya egymástól. Tételezzük fel ugyanis, hogy ha a képzeletbeli közösségünk példájánál maradva a három feltüntetett T-RF mellett még számos egyéb T-RF is szerepel az adatsorban (mondjuk T-RF4, T-RF5, T-RF6, T-RF7), akkor amennyiben ez utóbbi T- RF-ek arányaikban eltörpülnek a „fontos” T-RF-ek mellett és/vagy id ıben egyenletes mennyiséget produkálnak, akkor úgy adódhatnak hozzá sorban az értékes T-RF- összegünkhöz, hogy a zsírsavval továbbra is magas korrelációt adnak az összegek, mégis salakinformációval tölt ıdött fel az eredménytáblázatunk és a hasonlósági fánk. Erre muta- tunk példát a V/28. ábrán. A fa informatív ágán az értékes összegváltozót is tartalmazó új összegváltozók jelennek meg, melyek azonban értéktelen többletinformációt képviselnek,

113 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK nagy változószám esetén áttekinthetetlenné teszik az amúgy sem egyszer ő adatsruktúrát. Ennek megoldására beépítettünk egy sz őrési metódust, amely a túlságosan er ıs korrelációt mutató markercsoportok felhalmozódását meggátolja azok (beállítható hasonlósági küszöb alapján való) sz őrésével, valamint el ıre beállítható egy nagyságrend-különbségi korlát, amely fölött nem végzi el a program az összeadásokat. Utóbbi korlátozás az elvégzend ı számítások mennyiségét is csökkenti.

d/T-RF2 d/T-RF7 d/T-RF2 d/T-RF2+T-RF3 d/T-RF6 d/T-RF2+T-RF3 d/T-RF1+T-RF2 d/T-RF5 d/T-RF3 d/T-RF3 d/T-RF1+T-RF3 d/T-RF1+T-RF3 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3+T-RF4+T-RF5 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3+T-RF4 a) z/Zsírsav1 z/Zsírsav1 b) d/T-RF1+T-RF2+T-RF3 d/T-RF1+T-RF2+T-RF3 d/T-RF4 d/T-RF1+T-RF2 d/T-RF1 d/T-RF1 V/28. ábra. a) A szövegben említett példaváltozók és összegváltozóik közötti korrelációs hason- lóság. A bekeretezett összefüggést kerestük. b) Az alacsony nagyságrend ő és/vagy közel kons- tans mennyiség ő változók értéktelen információval tölthetik fel az eredményeket (szürke ka- pocsjel). A fák a saját fejlesztés ő szoftverünkkel készültek (Pearson korreláció, átlagos lánc- módszer). A változók neve el ıtt a változócsoport neve szerepel (d: DNS-markerek, z: zsírsa- vak). Az eredeti változók neve er ıs, az összegváltozóké halványabb színnel jelenik meg.

A faszerkesztésre szoftverünk els ı verziójában háromféle módszer közül választhatunk, ezek az egyszer ő, a teljes és az átlagos láncmódszer. (Általában az Átlagos láncmódszert preferálják a másik kett ıvel szemben, ám a mi koncepciónkban idáig a faszerkesztési mód- szer megválasztásának alárendelt szerepe van, mi ugyanis a fát csupán a leger ısebben kor- reláló párok gyors megmutatására használjuk, a fa közepes topológiájából nem nyerünk információt. A leger ısebb korrelációk pedig minden módszerrel megmutatkoznak.) A nagy adatmennyiséget tartalmazó adatmátrixok alapján készül ı hasonlósági fák már a változók egyenkénti összehasonlításakor is áttekinthetetlenül nagyok lehetnek, nemhogy a bevezetett összegváltozókkal együtt. Ezért a szoftver egy részleteiben nagyítható, pásztázható formá- ban rajzolja ki a hasonlósági fát, hogy az kényelmesebben tanulmányozható lehessen. Mivel ahogyan már említettük, a statisztika matematikájában való felkészültségünk cse- kélyebb annál, mintsem hogy el ıre fel mertük volna mérni az adatkezelési koncepciónkban leselked ı egyéb rejtett buktatókat, a továbblépésnek azt a módját választottuk, hogy virtuá- lisan összeállított mesterséges modellközösségek markermintázatán teszteltük a módsze- rünket, ahol el ıre ismerhetjük a várt eredményt, mellyel az adatkezelési módszernek vissza kell térnie. Ezért még a programtervezéssel párhozamosan készítettünk egy közösségdina- mikát modellez ı szimulációs szoftvert is, melyben meghatározott markertípusokkal jelle- mezhet ı, el ıre megadott számú „fajt” indítottunk útjára egy virtuális közösségben, melyben a közösségi szukcesszió folyamatát egy általános Lotka-Volterra modell segítségével szi-

114 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK muláltuk. A program fajonként minden futás elején kisorsolja az összes többi fajjal vett kölcsönhatási rátákat, melyek alapján a fajok (aktuális létszámuknak megfelel ı arányban) minden generációs lépésben módosítják a többi faj létszámát. A markerek természetesen minden generációs lépésben „gazdájuk” abundanciaváltozásának megfelel ıen kapnak új mennyiségi értékeket. Bár a modell determinisztikus, a program megadott indítóközössé- gekkel több szukcessziós folyamatot is szimulál (melyek között a véletlenszer ően sorsolt kölcsönhatási ráták adják a különbséget) a végén pedig egy olyan lefutott közösségi szuk- cessziós folyamatot választ eredménynek, amely kellıen hosszan tartott kihalások nélkül ahhoz, hogy módszerteszteléshez elegend ı adathoz jussunk általa. (Természetesen ilyen program nélkül is tudtunk volna modell-adatsorokat készíteni, ahogy azt például az V/27. ábra szerkesztéséhez is megtettük, de egyszer őbben használhatónak és elegánsabbnak tet- szett közösségszimulációval generálni az adatsorokat). Az alábbiakban egy egyszer ő virtuális modellközösség id ıbeli „monitorozásának” pél- dáján keresztül mutatjuk be, miként teszteltük adatelemzési koncepciónkat. Kérdésünk volt, hogy kimutathatóak-e a korrelációk és összegkorrelációk (abszolút mennyiségek adatsorán kívül) markercsoportokon belül fajlagosított mennyiségekkel is, illetve ha nem, segít-e raj- tunk Aitchison (2003) tanácsa, mely szerint logaritmizálva a fajlagos mennyiségek adatait újra normálhatjuk azokat korrelációs elemzések számára. Miként módosul a korreláció, ha a többforrású markereket termel ıik más nagyságrendben produkálják, illetve lehet-e tenni valami további lépést ennek a jelenségnek a kezelésére? Nem utolsósorban pedig kérdés volt, hogy újonnan fejlesztett szoftverünk visszaadja-e a várakozásainknak megfelel ı korre- lációs mintázatot. A bemutatott modellközösség négy fajból állt, ezek pedig az alábbiak szerint hozzájuk rendelt két markertípusból termeltek négy-négyféle fajuknak megfelel ı min ıség őt és meny- nyiségőt (V/3. táblázat).

markerek és termelési mennyiségük baktérium DNS1 DNS2 DNS3 DNS4 zsírsav1 zsírsav2 zsírsav3 zsírsav4

1. faj 100 0 0 0 0 1000 1000 0 2. faj 0 100 0 0 1000 0 0 1000 3. faj 0 0 100 0 0 0 10 1000 4. faj 0 0 0 100 100 0 0 1000 V/3. táblázat. A bemutatott modellközösség négy fajának DNS- és zsírsavmarkerei. A táblá- zatban foglalt számok azt mutatják, hogy melyik baktérium melyik markert termeli és milyen nagyságrendben termeli azt. A szám a szimuláció során egy egyszer ő szorzótényez ı, amely az illet ı faj mindenkori egyedszámával megszorozva megadja a marker fajra jutó mennyiségét az adott generációs lépésben.

115 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Modellközösségünk négy faja tehát elkülöníthet ı DNS-markere alapján, és mindegyik csak egyféle DNS-markert termel ugyanolyan mennyiségben, pontosabban – hogy valóságh őbben értelmezzük az összefüggést – a képzeletbeli PCR-t követ ıen minden sejt 100 amplikonnal képviselteti magát a közösségi ujjlenyomatmintázatban. (A valódi bioló- giai mintákban persze jóval nagyobb a fajok és a markerek mennyisége.) A zsírsav4 mar- kert három faj is termeli ugyanolyan arányban, zsírsav2-t csak az 1. faj, sejtenként mind 1000-1000 zsírsavmolekulát adva a képzeletbeli extraktumhoz. Zsírsav1-et a 2. és 4. faj is termeli, ám utóbbi csak tizedannyit termel bel ıle, mint az el ıbbi, zsírsav3-at pedig ugyan- csak két faj termeli, de a 3. faj csak századannyi mennyiségben, mint az 1. faj. Az eltér ı mértékben való markertermeltetéssel abbéli er ıs gyanúnkat kívántuk tesztelni, mely szerint ha két termel ı eltér ı mértékben járul hozzá egy marker mennyiségéhez, miközben másik vizsgált (megkülönböztethet ı) markerük ett ıl függetlenül azonos mennyiségben (vagy más eltérés szerint) termel ıdik, sérülni fog a közös marker várt korrelációja ezek összegével. A szukcessziós folyamat 10 generációs id ıszakon keresztül zajlott, minden generációból történt mintavétel. A szukcesszió folyamatában a markermennyiségek a V/29. ábrán látható módon változtak. (Maguknak a baktériumoknak az abundancia-arányai a peremfeltételek miatt egyértelm ően megfelelnek a DNS-markerarányoknak, így az abundanciát nem ábrá- zoltuk külön.)

116 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

70 60 50 40 30

mennyiség 20 10 a) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 "Mintavétel" ideje

DNS1 DNS2 DNS3 DNS4

1200 160 140 1000 120 800 100 600 80

mennyiség 60 400 40 200 20 b) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 "Mintavétel" ideje zsírsav1 zsírsav2 zsírsav3 zsírsav4 (zsírsav2) (zsírsav3)

V/29. ábra. a) A DNS-markermennyiségek alakulása a szimulált közösségben. b) A zsírsavak mennyiségének alakulása a szimulált közösségben. Mivel zsírsav2 és zsírsav3 görbéi nagyon közeliek az ábrán, szürkítve és szaggatott vonallal másodlagos tengelyen is feltüntettük ıket, megmutatva az enyhe eltérést közöttük. A termel ı szervezetek abundancia-arányai egyértel- mően megfelelnek a DNS-markerarányoknak, így az abundanciát nem ábrázoltuk külön.

Látható a DNS-markerek alakulásából (V/29. ábra, V/3. táblázat), hogy a 3. faj domi- náns közösségalkotóból alárendelt szerepbe szorult a szukcesszió során, miközben a 2. faj harmadrangú közösségalkotóból domináns szerepbe került. Eközben a 4. faj másodrangú közösségalkotó szerepb ıl szinte teljesen kiszorul a közösségb ıl, míg az 1. faj közel kons- tans abundanciával egzisztál végig. A zsírsavmarkerek közül ennek megfelel ıen zsírsav2 mennyiségi alakulása pontosan leképezi az ıt egyedül termel ı 1. faj (és DNS1 marker) mennyiségi változását, zsírsav3 pedig ugyancsak az ıt els ısorban termel ı 1. faj mennyiségi

117 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ingadózásai szerint változik, a másodlagos tengelyen ábrázolva azonban megfigyelhet ı, hogy mennyisége eltér zsírsav2-ét ıl, és a különbség az ıt másodlagosan termel ı 3. faj (DNS3) mennyiségi arányai szerint változik (azaz csökken). A két termel ı által is produkált zsírsav1 a 2. faj változási trendjét követi inkább, ami érthet ı abból is, hogy ez fajlagosan tízszer annyit termel bel ıle, mint a másodlagos termel ı 4. faj, de abból is, hogy 2. faj válto- zása markánsabb, mint 4. fajé. A zsírsav4 marker pedig három egyenrangú termel ıje meg- lehet ısen különböz ı változási karakterisztikájának ered ıjét mutatja. Mi tehát a várakozásunk az együttmozgásokkal kapcsolatban? Az egyetlen szervezetet jelz ı DNS1 és zsírsav2 markerek pontos mennyiségi korrelációjára számítunk, ugyanígy számítunk továbbá a zsírsav4 és az ezt termel ı három faj DNS-markerei összegének (DNS2 + DNS3 + DNS4) tökéletes korrelációjára (legalábbis abszolút mennyiségi adatok betáplá- lása esetén). Kíváncsiak vagyunk, miként módosul az DNS-markerek összegének korrelá- ciója a közös zsírsavval eltér ı volumen ő zsírsavtermelés esetén. Ha megnézzük DNS1 és zsírsav2 korrelációját abszolút adatokon, természetesen vissza- kapjuk a tökéletes korrelációt, hiszen a szimulációs program nem szimulált véletlen hibákat, DNS1 és zsírsav2 markerek mennyiségeit pedig egyszer ő szorzással származtatta 1. faj létszámából minden lépésben. Ha azonban a markermennyiségeket csoportjukon belül fajlagosítjuk (úgy, hogy összegük csoporton belül mintánként 1-et vagy 100%-ot adjon ki), a korreláció „elromlik”. A közösségi ujjlenyomat-módszerek alkalmazása során sokféle el ınye miatt gyakran használjuk a fajlagosítást. Egyrészt tompítja a mintavételi és preparálási hibák következmé- nyeit összehasonlíthatóvá téve az eltér ı összmennyiség ő markert tartalmazó mintákat, más- kor méréstechnikailag könnyíti meg a kutató dolgát a fajlagosítás lehet ısége, így például T- RFLP-vizsgálatokban a fragmentek elválasztásakor olyan mennyiséget injektál a kapilláris- ra, hogy a kicsiny és nagy csúcsok egyaránt jól látszódjanak, az ebbıl az önkényességb ıl adódó abszolút mennyiségi torzulások azonban a mennyiségfajlagosítás révén elt őnnek a mintaközi összehasonlításokban. Ennek ellenére az adatok statisztikai értékelésekor figye- lemmel kell lenni arra, hogy az adott módszer alkalmazható-e fajlagosított adatokkal. A fajlagosítással ugyanis megsz őnik a változók függetlensége: bármelyik változó értékének megváltozása hatással lesz az összes többi változó fajlagos mennyiségére a mintában. Aitchison (2003) felhívja a figyelmet arra, hogy épp emiatt hiteles korrelációs vizsgálatok nem is végezhet ık fajlagos adatsorokon annak ellenére, hogy sok tudományos munkaha- gyomány mindennapjaiban ez bevett gyakorlat. Mint látjuk, még inkább jelent ıssé válik a fajlagosítás okozta probléma, amikor különböz ı módszerekb ıl nyert, már fajlagosított adat- sorokat vonunk be közös statisztikai vizsgálatba. Nem nehéz megérteni, hogy esetünkben miért szüntette meg a fajlagosítás az abszolút adatok esetén tökéletesnek mutatkozó korre-

118 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK lációt. DNS1 mennyisége kiegyensúlyozott az egész szukcessziós folyamatban, fajlagos mennyiségi grafikonja ugyanakkor elején és végén kissé „lekonyul” a DNS2 és DNS3 mar- kerek mintasor végi illetve eleji nagy mennyiségei miatt. Zsírsav2 marker id ıbeli fajlagos mennyiségi változására ugyanakkor e két DNS-marker mennyiségi változása semmiféle hatással nincs (hiszen a fajlagosítás markercsoportokon belül történt), ellenben hatással vannak rá a többi zsírsavak mennyiségi változásai. Hiába keressük tehát kiszemelt változó- ink kiváló korrelációját fajlagos adatokban, egyikét is, másikét is elváltoztatták a csoportju- kon belüli egyéb változások. Amennyiben abszolút mennyiségi adatok nyerése nem lehet- séges, Atchison a fajlagos adatok újranormálásának egyik módszeréül azok logaritmizálását javasolja, ami nagyrészt feloldja a fajlagosítás okozta, korrelációszámításokat meghamisító adattorzulást. Bár az abszolút mennyiségek természetes alapú logatitmusaival ugyanúgy megkapjuk a várt korrelációt, mint az alapadatokkal, a fajlagos adatok logaritmizálása nem hozta vissza azt, a korreláció továbbra is gyenge.. A továbbiakban ezért az abszolút meny- nyiségi adatokat kell vizsgálatainkban felhasználnunk.

a) (DNS2+DNS3+DNS4) ∟ zsírsav4 b) (DNS2+DNS4) ∟ zsírsav1

1200 600 1000 y = 20.457x - 578.06 500 2 800 R = 0.6011 400 600 y = 10x + 2E-07 300 400 2 R = 1 200 200 0 100 -50-200 0 50 100 150 0 -400 0 20 40 60

c) (DNS1+DNS3) ∟ zsírsav3

160 V/30 . ábra. Összegváltozók korrelá- 140 y = 1.1034x + 27.27 ciója a tagváltozók termel ıinek elté- 2 120 R = 0.4872 rı típusú közös markerváltozójával 100 a) azonos volumen ő markertermelés esetén valamint b) és c) eltér ı volu- 80 men ő markertermelés esetén. 60 40 20 0 0 20 40 60 80

119 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

A közös marker eltér ı nagyságrend ő termelése esetén mérhet ı korrelációkat a V/30. áb- ra mutatja. A zsírsav4 markert azonos mennyiségben termel ı 2. 3. és 4. fajok DNS- markereinek összegével (DNS2 + DNS3 + DNS4) várakozásainknak megfelel ıen tökéletes korrelációt kapunk (V/30.a. ábra). Abban az esetben azonban amikor a DNS-markereket azonos, a közös zsírsavmarkert ellenben különböz ı mennyiségben termelték a fajok, nem látunk jó korrelációt (V/30.b. és c. ábra). Ha megnézzük, mit mutat a szoftverünk által szerkesztett hasonlósági fa (V/31. ábra), láthatjuk, hogy a fenti tapasztalatokkal összhangban megtalálja a jó korrelációkat, de nem talált korrelációt azon változók között, ahol a fentiekben sem találtunk. Teljes korrelációt mutat (DNS2 + DNS3 + DS4) és zsírsav4 változók valamint DNS1 és zsírsav2 változók között (sötétkék keretek). Utóbbiakkal igen jó korrelációval csatlakozik az (ugyancsak az 1. faj által nagy mennyiségben termelt) zsírsav3 (világoskék keret), amelynek teljes korreláci- óját ezekkel csak a nagy abundanciaértékeket produkáló 3. faj kis mérv ő termelése zavarta meg. Szemmel a tökéletest ıl megkülönböztethetetlenül jó korrelációt mutat zsírsav1 a f ı termel ıjének DNS2-markerét ıl (szaggatott keret; a korrelációs együttható értéke ez esetben r = 0.999696). Termel ıinek DNS-összegváltozójától (DNS2 + DNS4) azonban csak gyenge korrelációt mutat.

D/1+2+4 D/2+4 Zs/1 D/2 D/1+2 D/2+3 D/1+2+3 D/4 D/1+4 D/3+4 D/1+3+4 D/3 D/1+3 Zs/4 D/2+3+4 D/1+2+3+4 Zs/3 Zs/2 D/1

V/31. ábra. Szoftverünk által készített hasonlósági fa eredeti és származtatott összegváltozók- kal (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer). A keretek a kiemelten magas korrelációjú vál- tozópárokat emelik ki (lásd még a f ıszövegben). D/ és a piros szín a DNS-markereket mutatja, a számok a markerazonosítók markercsoporton belül. Zs/ és a zöld szín a zsírsavváltozókat jelöli hasonló módon. Az összegváltozók eredeti markercsoportjuk halványított színét öröklik. A tengelyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

120 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Utólag annak okát sem volt nehéz megérteni, miért nincs jó korreláció eltér ı mérv ő markerprodukciók esetén, illetve, hogy miért mutat zsírsav1 DNS2-vel sokkal jobb korrelá- ciót, mint (DNS2+DNS4)-gyel. Ha megnézzük a DNS2 és DNS4 markerek, származtatott összegváltozójuk és a zsírsav1 marker id ıbeli változását (V/32. ábra), láthatjuk, hogy zsír- sav1 érthet ı módon annak a termel ıjének DNS-markerével mozog együtt, amely a másik- hoz képest tízszeres arányban termeli, nem pedig a két DNS-marker összegével. Jól kivehe- tı ugyanakkor, hogy együttmozgásuk eltérése (szürkített terület az ábrán) továbbra is ará- nyos a kis termelés ő 4. faj DNS-markerének (DNS4) mennyiségével az id ıben, s nem ne- héz kitalálni, hogy az eltérés nagysága épp tizede DNS4 mindenkori mennyiségének, meg- felelıen a termelésbeli volumenkülönbség mértékének! Ha (DNS2 + DNS4) származtatott összegváltozó helyett [DNS2 + (DNS4)/10]-et ábrázoltuk volna – vagy [10*(DNS2) + DNS4]-et –, megkaptuk volna a tökéletes (r = 1) korrelációt zsírsav1-gyel. A közös terme- lésr ıl árulkodó információ tehát továbbra is megtalálható az adatokban, csak éppen egysze- rő összeadással való változószármazékoltatással könnyen kicsúszik a kezünkb ıl eltér ı vo- lumen ő termel ıdések esetén, s ıt, két-háromszoros termelési különbség esetén még a f ı termel ıvel mutatott jó korreláció felismerése is ellehetetlenülhet.

V/32. ábra. DNS-markerváltozók, származtatott összegváltozójuk és termel ıik közös zsírsav- markerének id ıbeli változása a szimulált szukcesszióban. A zsírsavváltozó mennyiségét az azonos szín ő másodlagos tengelyhez igazítottuk. Az ábrán másodlagos tengelyen ábrázoltuk a zsírsavmarker mennyiségének alakulását, hogy jól összevethet ı legyen a kisebb mennyiség ő DNS-markerek mennyiségeivel. A két tengely skálaosztásának aránya épp tízszeres, hiszen tízszeres mennyiségi szorzóval termelte a nagyobb termelés ő 2. faj a zsírsavat a DNS- markerhez képest.

Sajnos be kellett látnunk, hogy az eltér ı volumen ő markertermel ıdés a baktériumokban várhatóan nem könyvelhet ı el esetlegesen jelentkez ı, tolerálható hibaforrásként. Tudjuk

121 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ugyanis, hogy a baktériumok nem csupán egyféle zsírsavat vagy kinont termelnek, hanem egyszerre többfélét, amelyek közül egyesek dominánsan, míg mások csupán minor kompo- nensekként fordulnak el ı bennük. Amelyik marker az egyik fajban f ı komponens, a másik- ban könnyen lehet minor, és ekkor máris az eltér ı markerprodukciós ráta esetével állunk szemben. Továbbá könny ő belátni azt is, hogy egy 1 m átmér ıjő kokkusz geometriai okokból közel feleannyi membránzsírsavat termel csupán, mint egy 1 m átmér ıjő, 2 m hosszúságú bacillusz, miközben DNS-markereik mennyisége között ett ıl nem lesz hasonló mennyiségi különbség. Az is tudható továbbá, hogy a baktériumok abban is eltérhetnek, hány riboszomális RNS-operon található a genomjukban (egyt ıl akár 15-ig is terjedhet az operonszám; Case és mtsai. 2007), ami akkor is befolyásolni fogja a 16S rDNS-markerek megjelen ı mennyiségét, ha a preferenciális amplifikáció okozta hibákat nem is vesszük számításba. (Az operonszámbeli eltérések nyilván minden más genetikai markert ugyanígy érinthetnek.) Annak megoldásához, hogy a termelési ráta eltérései ellenére felismerhessük a markerek termel ı szerinti összetartozását, ismernünk kellene a két ráta hányadosát [ahogyan a fenteb- bi példában is megállapítottuk a 10-es (vagy 1/10-es) szorzót], amellyel az eltér ı zsírsav- termelés ő fajok azonos ráta szerint termelt DNS-markereinek egyikét korrigálva visszakap- tuk a várt korrelációt. Valós adatsorok esetében természetesen nem ismerjük a termelési ráták különbségeit. Ugyanakkor feltételezhetjük, hogy ha szorzók alkalmazásával változtat- ni tudtuk a két megfigyelt változó közötti korrelációs együttható értékét, akkor minden ösz- szehasonlított markerpár esetében létezik egy olyan arányosító faktor, amely mellett a kor- reláció közöttük maximális. Ha a példánkban kiválasztott változók esetében ábrázoljuk a Pearson-féle korrelációs együttható értékét (y-tengely) egy szorzó ellenében (ez lesz az x- tengelyen ábrázolt futóparaméter), mellyel a DNS markerpár egyik tagjának mennyiségi értékeit összeszorozzuk, akkor egy olyan görbére számítunk, amelynek 0,1-nél vagy 10-nél maximuma van (attól függ ıen, hogy DNS2-t vagy DNS4-et szoroztuk a futóparaméterrel). Várakozásainknak megfelel ıen valóban ilyen görbéket kaptunk (V/33. ábra).

122 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

(DNS2*x+DNS4 ∟ zsírsav1) 1 1,5 r a) 1 0,9998

0,5 0,9996 r r 0 0,9994 0 10 20 30 40 50 -0,5 0,9992 -1

-1,5 0,999 0 10 20 30 x szorzótényez ı [0,001 - 50]

r(DNS4*x+DNS2 ∟ zsírsav1) 1 b) 1,5 1 0,9998

0,5 0,9996 r r 0 0,9994 0 10 20 30 40 50 -0,5 0,9992 -1

-1,5 0,999 0 0,1 0,2 0,3 x szorzótényez ı [0,001 - 50]

V/33. ábra. A Pearson-féle r korrelációs együttható értéke x szorzótényez ı ellenében zsírsav1 marker és a: (DNS2*x + DNS4), b: (DNS4*x + DNS2) származtatott változóérték korrelációját vizsgálva. Az ábrák jobb oldalán kinagyítva a maximumhelyek láthatók. ∟ jellel a korrelációs összefüggést jelöltük.

A többi összefüggés ilyetén vizsgálata esetén is hasonló lefutású, egymaximumú görbé- ket kapunk (ezek bemutatásától terjedelmi okokból eltekintünk). Monoton növekv ı, majd a következ ı szakaszon monoton csökken ı, egymaximumú összefüggések maximumhelyének optimális számú lépésben való kell ıen pontos meghatározása könnyen algoritmizálható feladat egy számítógépes programozó számára. Ha szoftverünket továbbfejlesztve képessé tesszük arra, hogy az összegváltozók más változókkal való összehasonlításakor keresse meg azt az arányosító tényez ıt is a tagokhoz, mellyel a vizsgált eset korrelációja maximális, leküzdhetjük a kemotaxonómiai markerek eltér ı termelési rátáiból fakadó problémát, s ıt megoldódik a DNS-markerek termel ıjüket alul- vagy felülreprezentáló különbségeiben rejl ı hibalehet ıségek problémája is. Elvégeztük a szoftverfejlesztésnek ezt a következ ı lépését is. Jelen dolgozat írásáig csupán kéttagú összegekben képes korrelációt maximalizá- ló arányosító tényez ıt keresni a programunk, az adatkezelés tesztel ı bemutatására azonban ez is elegend ı. A V/34.a. ábrán látható az új hasonlósági fa, ahol a DNS-markerek összeg-

123 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK változói már optimális aránytorzítással jelennek meg aszerint, hogy mely szorzótényez ıvel mutatják a legnagyobb korrelációt egy-egy zsírsavmarkerrel. a)

b)

c)

V/34. ábra. Szoftverünk által készített hasonlósági fa eredeti és aránytorzított származtatott összegváltozókkal (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer). A színes jelek az ábra a) részén a b) és c) részekben kinagyított részfákat jelölik. D/ és a piros szín a DNS-markereket mutatja, a számok a markerazonosítók markercsoporton belül. Zs/ és a zöld szín a zsírsavváltozókat jelö- li hasonló módon. A származtatott változók eredeti markercsoportjuk halványított színét öröklik, a második tag neve el ıtt olvasható a szorzótényez ı, mely mellett maximális korreláci- ót talált egy zsírsavval a program. A tengelyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

A zsírsavakat tartalmazó kinagyított részfákon (V/34.b. és c. ábra) látható, hogy zsírsav1 ezúttal már megtalálja a maximális korrelációját DNS2 és DNS4 összegével, minthogy a program megállapította és hozzárendelte a 0,1-es szorzót DNS4-hez, s ugyanígy tökéletes korrelációt mutat zsírsav3 is a (DNS1+0,01*DNS3) markerrel. A zsírsav2 marker esetében értelemszer ően tökéletes a korreláció (1*DNS1) markerrel. A zsírsav4 marker (1*DNS2+1*DNS3+1*DNS4) összeggel mutatna tökéletes korrelációt, mivel azonban szoftverünk egyel ıre nem képes kett ınél több tagú összegekkel elvégezni a szorzótényez ıs optimalizálást, ez a zsírsav a három DNS-marker kéttagú származékaival csoportosul ugyan egy ágra, mindegyikt ıl er ıs eltérést mutat azonban. Nem várt származtatott változók is fel- tőnnek a fán, a legnagyobb korrelációkat azonban a keresett kombinációk mutatják. A fa alsó szélén megjelenik egyszer ő változóként a DNS2 marker 0,0002-szerese, ami nyilván-

124 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK valóan nem hordoz értelmes információt. Ez az adatsz őrés további optimalizálásának igé- nyére hívja fel figyelmünket. A három- és többtényez ıs összegek korrelációsoptimum-keresésében már nem egy gör- bén, hanem egy tulajdonképpeni adatsíkon kell megtalálnunk a maximumpontot. Az összeg három tagjából egy továbbra is fix maradhat, és a második tag futóparaméteres szorzataival megkeressük a korreláció maximumát, ez után azonban a harmadik tagnak is változnia kell egy másik futóparaméterrel szorozva, s ennek következ ı értékénél újra meg kell vizsgál- nunk az els ı két tag korrelációját a küls ı markerrel. A kapott maximumhelyek egy másik tengely mentén új görbét jelölnek ki, ennek maximumát keressük. Természetesen ez id ı- igényes számítások sorát jelenti még a számítógépnek is, optimalizálás azonban itt is lehet- séges. Négy tényez ı esetén már csak négy dimenziós ábrán volna szemléltethet ı egy adat- tér maximumpontjának keresése, a keresési metódus azonban nem különbözik lényegileg a háromtényez ıs esett ıl, csak a számításigény ugrik ismét többszörösére. Okkal vet ıdhet fel a kérdés, hogy ha megváltoztatjuk a kiindulási változóinkat, s ıt aktí- van korrelációs maximumokat keresünk e megváltoztatott változók között, ráadásul oly módon tesszük ezt, hogy éppen az így kapott er ıs korrelációkat tekintjük találatnak, azaz kinyert információnak, nem jár-e ez azzal a veszéllyel, hogy mi magunk állítunk el ı hamis összefüggéseket, és adatkezelési m őtermékeket ismerünk majd fel a minták valóságáról üzen ı információként. A fentebb bemutatott szimulált közösségtörténet adatain és más szi- mulált adatsorokon is ellen ıriztük a nem összetartozó markerek és származtatott változók korrelációinak szorzóparamétert ıl való függését (mint ahogyan az V/33. ábrán bemutatott módon néztük meg ugyanezt ismerten összetartozó változókra), és azt találtuk, hogy nem összetartozó markerek esetében vagy végig monoton változó, maximum nélküli görbéket kapunk x futóparaméter függvényében, vagy van a görbének maximuma, ám annak értéke távol esik 1-tıl, vagyis az arányeltolással elérhet ı legjobb korreláció is elég rossz. Abban az esetben, amikor a markerek összetartozása „félig igaz”, azaz a származtatott összegváltozó egyik tagja a szimulációban valóban egyazon termel ıtıl származik a küls ı csoport változó- jával, míg a másikra ez nem áll, a korreláció egyes ritka esetekben mutatott 1-hez közeli maximumot, ami így hibás találat lehet ıségét jelenti. Belátható módon azonban az ilyen esetekre is igaz az, hogy volt egy rejtett összegegyüttmozgás az adatsorban, és mi azt mutat- tuk ki. (Ne felejtsük, hogy az adatsor mentén sosem módosítottuk egy marker értékeit egy- máshoz képest , csupán a teljes markeradatsoron lejátszódott mennyiségi változás más mar- kerekéhez mért együttes arányán változtattunk, így kerestük az „arányfüggetlen” együtt- mozgásokat.) Mint tudjuk, korreláció adódhat ok-okozati összefüggés nélkül is, és ezt egy- szer ő korrelációs vizsgálatok értelmezésénél is figyelembe kell venni. A miénkhez hasonló adatkezelési fogásokat nélkülöz ı korrelációvizsgálatokban is megtréfálhatnak bennünket

125 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK véletlenül adódó jó korrelációk. Nem kell tehát szembenéznünk új típusú problémával itt sem. A véletlenül adódó er ıs korrelációs kapcsolatok várhatóan nem jelentkeznek majd újra a kísérletek ismétléseiben, s az is várható, hogy a mintaszám esetleges b ıvítésével illetve a monitorozási sor folytatásával fellazulnak. Érdemes megtekintenünk, milyen eredményre vezet, ha valós adatsorokon próbáljuk ki vázolt adatkezelési módszerünket, még ha jelenlegi programverziónk kettesével képes is csupán származtatott változókká alakítani a kijelölt változócsoport tagjait. A felf őtéses kí- sérleti minták kemotaxonómiai feldolgozásának egyik célja éppen az volt, hogy ezt megte- hessük egy kell ıen er ıs változásokat mutató adatsorral, így hát az alábbiakban ezen a min- ta- illetve adatsoron mutatjuk be módszerünk alkalmazhatóságát. Ehhez azonban el ıször megfelel ı alakba kellett hoznunk az adatokat, hiszen a módszereket egymástól függetlenül alkalmazó kutatásokban általában fajlagos mennyiségek adatsoraival dolgoznak, s ıt a T- RFLP-vizsgálatokban már a mérési módszer optimalizálásakor kihasználják a fajlagosítás lehet ıségét, így ilyen vizsgálatokban általában nem is jutunk teljes abszolút mennyiségi adatmátrixokhoz. A fajlagos mennyiségek azonban esetünkben – mint azt fentebb bizonyí- tottuk – nem alkalmazhatók, így valahogyan vissza kellett formálnunk az adatokat az erede- ti mennyiségeket reprezentáló alakra. A kinonok esetében ez nem okozott nehézséget, mivel a HPLC-kromatogram görbe alatti területei egyértelmően arányosíthatók az egyes kinonok mintabeli mennyiségeivel. A zsírsavak esetében nehézség, hogy a gázkromatográfiás mé- réskor alkalmazott lángionizációs detektor alapvet ıen az áthaladó szénmennyiség alapján ad jelet, így a csúcsok nagysága nem csak a mért zsírsav-metilészter mennyiségét ıl, de a molekula méretétıl is függ. A mintabeli zsírsavmolekulák anyagmennyiségét ezért úgy becsültük vissza, hogy a mennyiségi nyersadatokat (görbe alatti területeket) minden zsírsav esetén elosztottuk annak szénatomszámával (a ligandumok illetve telítetlen kötések hatását elhanyagoltuk). Bár az így kapott adatok nem mennyiséget jelentenek, a mennyiségekkel mégis arányosak, s így az adatmátrixban egymástól független, abszolút adatokat biztosíta- nak. A legnehezebb a T-RFLP eredmények visszaalakítása volt, mivel már a méréskor olyan hígításban kerültek injektálásra a preparátumok, hogy a kis és nagy csúcsok egyaránt láthatóak legyenek (tekintet nélkül az eredetei amplikonmennyiségek visszakövethet ıségé- re, mivel az általában nem szükséges). Ráadásul a külön reakcióban felszaporodó PCR- termékmennyiségek az egymás közötti mennyiségi összevetések céljára megbízhatatlanok. Ezért szükség esetén általában külön e célból alkalmazott kvantitatív PCR (Q-PCR) mód- szerrel végzik a felszaporítást, melyb ıl a kiindulási mennyiségek visszaszámolhatók. Ese- tünkben Q-PCR alkalmazására nem került sor. Megoldásként ezért azt választottuk, hogy mivel a foszfolipidek mennyiségét úgyis régóta alkalmazzák biomasszabecslésre (Tunlid és mtsai. 1985), mi is kihasználjuk ebbéli alkalmasságukat. A foszfolipid-zsírsavak abszolút

126 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK mennyiségeinek összegzésével a kiindulási mintabiomasszák mennyiségét reprezentáló adatokhoz jutottunk, amelyekkel mintánként visszaarányosítottuk a T-RF-csúcsok fajlagos értékeit (mintákon belül aránytartó módon). Ez a szükségmegoldás elvileg helyes ugyan, mégis annyi gyakorlati hiba lehet ıségét rejti, hogy a jöv ıbeli hasonló vizsgálatok esetére mindenképpen javasolt Q-PCR vagy egyéb módszerek bevezetése az abszolutizált mennyi- ségi adatok visszanyerhet ısége érdekében. Az itt tárgyalt elemzések erejéig azonban a fenti lehet ıséggel kellett beérnünk, s az adatkezelésnek az így visszaalakított mennyiségeket vetettük alá. Mivel ahogy a szimulált adatsorok példáján is látható, a származtatott változókat is tar- talmazó fán az eredeti markerek számát többszörösen meghaladó számú változó kerül fel- tüntetésre, a sokkal több adatot tartalmazó valódi adatsorok eredményfái temérdek adatot tartalmaznak. Programunk képes ugyan a fák részleteinek kinagyítására és pásztázására, a fák egészének ábrázolása nyomtatásban azonban igen nehezen volna kivitelezhet ı. Renge- teg változó kap helyet a fán akkor is, ha csak a leger ısebb 500 hasonlóság változói kerültek rá, és csupán a zsírsavakat, a kétféle DNS markertípust (Alu és Bsu T-RF-ek) és ezek kétta- gú összegváltozóit tartalmazta az analízis (egy ilyen fát szemléltet ı jelleggel bemutatunk a Függelékben: F/1 ábra). A nagyméret ő, egyszín ő, markertípusra nézve homogén részfák sok helyet foglalnak el a fán, miközben ezek érdemi információt nem hordoznak számunk- ra. Ez az esetsz őrés további fejlesztésének igényére mutat rá. Ha azonban megnézzük a markertípusokra nézve heterogén farészleteket, megtalálhatjuk a keresett markercsoportosu- lásokat. Az V/35. ábrán legfölül látható zsírsavmarker a C 18:0 , amely jó korrelációt mutat az (Alu236-37+0.3644*Alu243) összegváltozóval (r=0.9464), amelyben a két T-RF-marker épp a Levilinea saccharolitica illetve a Longilinea arvorisae rokonfajok azonosított mark- erei (V/2. táblázat, 93. old.). Az összegváltozó mellé csoportosul egy másik is, melyben ugyancsak az Alu243 marker szerepel az Alu159-cel együtt. A C 18:0 zsírsav mintáink egyik állandó, jelent ıs arányban el ıforduló markermolekulája (V/19. ábra), ugyanakkor pedig az él ıvilág egyik legáltalánosabb membránlipid-alkotója. Így nagyon is feltételezhet ı, hogy a felf őtéshez adaptálódott közösségeink két igen jellemz ı tagja hordozza ezt a molekulát, és mennyiségi arányváltozásaik eléggé megszabták az ugyancsak nagyarányú zsírsavmarker mennyiségének id ıbeli lefutását ahhoz, hogy a korrelációs fán egymás mellé rendel ıdjön a két DNSmarker és a zsírsav. (Ne feledjük, hogy a korrelációs hasonlóság érzéketlen az ada- tok abszolút értékére, így nem a mennyiségi dominancia ténye jelenik meg a hasonlóság- ban, csupán az id ıbeli együttmozgások.) A közös ágon megjelen ı harmadik T-RF (Alu159) vélhet ıleg a zsírsav egy harmadik termel ıjének markere, amely azért nem kapott helyet az el ıbbi összegváltozóban, mert a programunk eddig csak két tényez ı arányoptimáló összeg- zésére képes. Mint azt láttuk a szimulált közösségünk elemzésében (V/34. ábrán a zsírsav4

127 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK marker termel ıinek esete), az összefüggésben szerepl ı egyéb markerek ilyen esetben is közeli ágra kerülhetnek egy másik összegváltozó részeként.

V/35. ábra. A felf őtéses kísérlet zsírsavai és összegzett T-RF adatai alapján készült hasonlósági fa kiemelt részlete.

Amennyiben elemzésünk a valóságot tükrözi, máris hozzárendelt egy fenotipikai bélye- get az egyébként tenyésztésbe még nem vont L. saccharolitica- és L. arvorisae -rokon fa- jokhoz, s a szorzótényez ı értékéb ıl az is sejthet ı, hogy el ıbbi körülbelül háromszorosát termeli a C 18:0 zsírsavnak, mint az utóbbi (legalábbis azonos mérvő T-RF-reprezentáltságuk esetén). Az eredmény emellett feloldani látszik a felf őtéses kísérletben tapasztalt ellent- mondást a DNS-markerek er ıs id ıbeli változása és a zsírsavmarkerek viszonylagos állan- dósága között. Az átfed ı termel ıdések miatt az általánosabb markerek körében kikompen- zálódhatnak a termelık mennyiségi ingadozásai. Eközben azonban az általuk hordozott információ nem vész el feltétlenül.

További két zsírsav (izo C 16:0 és anteizo C 13:0 ) egyérteml ően párba rendez ıdik a fán egy- egy összegváltozóval [(Bsu197-99+0,0535*Bsu263) illetve (Bsu255+0,6842*Bsu318), r =

0,9483 illetve 0,9600], egy zsírsav pedig (F/1. ábra, piros nyíl), az izo C 14:0 , amely párban áll az (Alu194+0,4704*A193) összegváltozóval (r = 0,9533). Ezek a zsírsavak ez alapján tehát egészében vagy f ıként két termel ıtıl származhatnak, melyeket a két T-RF-marker jelez. A farészleten látható többi zsírsavak (és az F/1. ábra néhány másik zsírsava) néhány T-RF markert variáló változócsoportokkal kerültek szomszédságba. Ezek valószín őleg ket- tınél több termel ı szervezett ıl származnak, s T-RF-értékeiket egy több tényez ıs összege- ket alkotó szoftver-verzió remélhet ıleg egységes összegváltozóba lesz képes s őríteni.

128 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Eddig csupán azt az adatpárosítási lehet ıséget tanulmányoztuk, amikor zsírsavakat ren- delünk valószín ő termel ıik DNS-markereinek összegéhez. Más adatpárosítási lehetıségek is adottak azonban, melyek közül több is értelmes felhasználás lehet ıségét vetíti el ıre: • Zsírsavak párosítása T-RF -marker-összegekkel: ezt tanulmányoztuk eddig. Átfe- dı zsírsavtermelés ő közösségalkotókat párosít a közös zsírsavmarkerrel. • Kinonok párosítása T-RF-marker-összegekkel: átfed ı kinontermelés ő közösség- alkotókat párosít a közös kinonmarkerrel. • Kinonok párosítása zsírsavösszegekkel vagy fordítva: Természetesen lehetséges, hogy két faj ugyanazt a kinont termelje, miközben más zsírsavakat termelnek (vagy fordít- va). Az ilyen összefüggések azonosítására alkalmas ez a párosítás. • T-RF-markerek párosítása zsírsav- vagy kinonösszegekkel: az el ıbbi logika meg- fordítása. Akkor lehet értelme, ha például kis fajszámú közösség némely tagjában környeze- ti változások hatására markáns zsírsav- vagy kinontípusváltás történik. Ilyenkor a T-RF- marker mennyisége fog korrelálni a váltásban érintett kemotaxonómiai markerek összegé- vel. • T-RF-markerek párosítása másik típusú T-RF markerek összegeivel: amikor két közösségalkotó az egyik hasítóenzimmel ugyanazt a T-RF markert adja, a másik hasítóenzimmel azonban elkülönülnek egymástól (ld. például a Defluviitoga tunisiensis és Aminobacterium colombiense esetét az V/2. táblázatban, 93. old.), akkor ez a viszony feltá- ródhat az elemzésben.

Ezekkel a kombinációkkal is elvégeztük az elemzést és a legegyértelm őbb találatokat ki- gy őjtöttük (V/4. táblázat). Így mind a menakinonokhoz, mind az ubikinonokhoz találtunk néhány hozzárendelhet ı T-RF-et. Különös módon a kinonok párosítása a zsírsavak összeg- változóival nem hoztak eredményt, jóllehet minden kinontermel ı baktériumnak kell legye- nek membránzsírsavai. Valószín őleg a respiratórikus kinonokat nem termel ı fermentáló baktériumok dominanciája folytán az adatsorokra rakódó „kinonfüggetlen” zsírsavtömegek takarják el a keresett összefüggéseket. A hasonlósági fán az látható, hogy a kinon- és zsír- savváltozók gyakorlatilag nem keverednek, hanem homogén, távol álló ágakba tömörülnek a fán (ld. a Függelékben az F/2. ábrát). Ez az eredmény azonban kifejezetten megnyugtató abból a szempontból, hogy láthatóan nem jelennek meg tömegesen adatkezelési m őtermék- ként véletlenül adódó er ıs korrelációk a fákon. Hasonló eredményre jutottunk, amikor T- RF markereket rendeltünk zsírsavösszegekhez. A markertípusok külön csoportosultak a fán (ld. a Függelékben az F/3. ábrát). E szerint tehát nem történt módszerünkkel azonosítható zsírsav-váltás a közösségalkotó szervezetek egyikében sem.

129 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

önállóan a származtatott ösz- szorzó- a származtatott összegvál- a korrelációs együtt- vizsgált szegváltozó els ı tagja tényez ı tozó második (szorzott) ható (r) értéke változó tagja

izo C 16:0 Bsu197-99 + 0,0535* Bsu263 0,9483 anteizo C 13:0 Bsu255 + 0,6842* Bru318 0,9600

C16:0 ω7c Bsu280 + 0,5401* Bsu504-05 0,9802 izo C 14:0 Alu149 + 0,7404* Alu197 0,9533 anteizo C 17:0 Alu159 + 0,0064* Alu243 0,9874

C18:0 Alu236-37 + 0,3644* Alu243 0,9463 Alu159 + 0,0239* Alu243 0,9741 izo C 13:0 Bsu255 + 0,1245* Bsu519-22 0,9773 Bsu325 + 1,0235* Bsu519-22 0,9669 Bsu297 + 0,7547* Bsu519-22 0,9783 izo C 15:0 Alu159 + 0,8626* Alu193 0,9550 Alu159 + 0,1579* Alu504-05 0,9531 Alu159 + 0,1139* Alu504-05 0,9619

C20:0 Bsu219-20 + 7,6987* Bsu282 0,9675 Bsu201 + 0,1277* Bsu219-20 0,9670 Alu233 + 4,0771* Alu197 0,8825

C20:1 ω9c Bsu228 + 0,6910* Bsu255 0,9650 Bsu228 + 0,1437* Bsu297 0,9808 Bsu228 + 0,1021* Bsu325 0,9873 Bsu228 + 1,1219* Bsu22 0,8852

MK5(H2) Alu066 + 0,1029* Alu526 0,8501

MK10(H6) Alu066 + 0,0565* Alu083simC.p. 0,9503

MK6(H4) Bsu076 + 0,0271* Bsu304-05simD.t. 0,8730

MK5 Bsu185 + 0,0900* Bsu236 0,8568

Q9+2 unid Alu094 + 0,1223* Alu147 0,9972

Q7 Bsu203 + 0,1032* Bsu294 0,9719

Q8 Bsu228 + 1,6193* Bsu282 0,9248

Alu225 Bsu185 + 2,0929* Bsu203 0,9980

Bsu230 Alu236-37 L.s. + 0,1777* Alu519-21 0,9857 V/4. táblázat. Kiemelten er ıs csoportosulások eredeti és származtatott változók között. A zsír- savakhoz öt ízben több származtatott T-RF-összegváltozó is járul egy közös ágon. A származ- tatott összegváltozók tagjai tetsz ılegesen felcserélhet ık, ebben az esetben a szorzótényez ı reciproka érvényes.

A kinonok T-RF markerekkel keresett összefüggéseiben is találtunk közeli korrelációkat (V/4. táblázat). Az esetek többségében taxonómiailag nem rokonított T-RF-markerekkel adódtak összefüggések, két esetben azonban az Alu083 ( C. proteoliticus ) és a Bsu304-05 (D. tunisiensis ) markerei korreláló összegváltozóbba kerültek kis szorzóval. A C. proteoliticus esetében a MK10(H6) kinon termelése nem várható, mivel ez a faj obligát fermentáló (Ollivier és mtsai. 1985), nem zárható ki teljességgel ugyanakkor, hogy anaerob légzésre is képes közeli rokona él közösségeinkben. A D. tunisiensis esetében azonban egyenesen várjuk kinonmarker megjelenését, mivel kénlégz ı szervezetr ıl van szó (Hania és mtsai. 2011), így a MK6(H4) megléte elfogadható. (A fajleírás sajnos nem számol be

130 V. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK kinonvizsgálatról). Ha így is van, a kinont mindenképpen jóval kisebb arányban termeli (0,0271 szorzóval került a változóba), mint a Bsu076 marker gazdája, akir ıl jelenléte té- nyén kívül sajnos nem tudunk semmit. A T-RF-markerek másik T-RF-markercsoporttal keresett összefüggéseiben szintén talál- tunk néhány markáns összefüggést. Az egyetlen olyan összefüggés, amelyre el ıre számít- hattunk a klónok vizsgálata alapján, az a Defluviitoga tunisiensis és Aminobacterium colombiense -rokon fajok által egyaránt termelt Alu75-ös marker várható csoportosulása lenne a két szervezet külön Bsu-T-RF-ének arányoptimált összegével (Alu305+x*Alu279). Valószín ő, hogy az A. colombiense kis mennyiségi aránya miatt nem találtuk meg ezt az összefüggést, ehelyett az Alu75 marker a (Bsu304-05+6,3555*Bsu504-05) származékvál- tozóval áll párban. A Defluviitoga tunisiensis esetében fennálló összefüggés tehát kiderül, hisz a származtatott változó els ı tagja ennek a szervezetnek a markere, ugyanakkor felhívja a figyelmünket az eredmény, hogy az Alu75-ös markernek lehetett egy igen jelent ıs har- madik termel ıje is a közösségben, melyet klónból nem sikerült azonosítani, Bsu enzimmel ugyanakkor ez adhatja a Bsu504-05-ös T-RF-et. Ez arra figyelmeztet, hogy az Alu75-ös fragment mennyiségei alapján akkor se vonjunk le bátor következtetést a D. tunisiensis faj abundanciaváltozásait illet ıen, ha a másik enzimmel adott T-RF-ek alapján az A. colombiense -rokon szervezet miatt ezt akár meg is tehetnénk. Hogy megbízhatóbb és finomabban kirajzolódó eredményeket kapjunk, illetve hogy az értelmezés esetlegességeit ıl minél jobban megszabadulhassunk, többféle optimalizációs lehet ıségünk kínálkozik a jöv ıre nézve. A mintakezelés és preparálás szintjén fokozottan kell ügyelni a pontosságra a megkívánt abszolút mennyiségi adatok megbízhatósága érde- kében. A DNS-amplifikáció mennyiségi követhet ıségét minél inkább biztosítani kell (pl. kvantitatív PCR alkalmazásával). A szoftverfejlesztés szintjén megoldandó a három- és többtagú összegváltozók arányoptimáló el ıállítása, valamint a feleslegesen generált válto- zók hatékonyabb sz őrése. Mesterségesen szimulált, nagy faj- és markerszámú közösségek id ısori adatainak elemzésével valamint mesterségesen el ıállított, ismert fajkészlet ő és abundanciaarányú baktériumkeverékek gyakorlati analízisével tesztelni lehetne az adatkeze- lési illetve egyéb (pl. preparációs) módszertani korlátokat, jel-zaj arányokat, meg lehetne állapítani szükséges korrekciós faktorokat és a következtetésekben alkalmazandó hihet ıségi küszöböket is.

131 VI. ÖSSZEFOGLALÁS

VI. ÖSSZEFOGLALÁS A metántartalmú biogáz termel ıdésének mikrobiológiai háttere elméleti és gyakorlati szempontból egyaránt fontos kérdéseket vet fel a tudomány számára. Mivel a biogáz terme- lését mindig egy komplex mikrobaközösség végzi, melynek tagjai bonyolult kölcsönhatás- rendszerben m őködnek együtt, érdemes a közösséget magát vizsgálnunk, mintsem izolált tagjait külön-külön. Erre kínálnak lehet ıséget a régóta alkalmazott ujjlenyomat-módszerek, melyek a közösség taxonómiai összetételére és/vagy metabolikus állapotára jellemz ı min- tázatokat adnak. Ezen mintázatok azután összevethetık, és – a módszer jellegének megfele- lıen – értelmezhet ık. Alkalmazásukat nagyban megkönnyítik az ellen ırizhet ı körülmé- nyeket és több párhuzamos vizsgálat lehet ıségét biztosító laboratóriumi lépték ő kísérleti modellrendszerek (kis térfogatú biogázreaktorok). Utóbbiak m őködési állapotáról gázter- melésük mérése alapján nyerhetünk legegyszer őbben információt. Ezen szempontoknak megfelel ıen egyik célunk egy modellreaktorok gázhozamának mérésére alkalmas, egyszer ő mérési módszer kidolgozása volt. További célunk biogáztermel ı közösségek vizsgálata volt ujjlenyomatmódszerekkel: (a) egy mezofil és egy termofil biogázterml ı mikrobaközösség összehasonlítása, (b) könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatásvizsgálata mezofil közösségeken, és (c) egy mezofilról termofil h ımérsékletre való felf őtési folyamat hatásának monitorozása. Utóbbi munkáink- hoz kapcsolódóan célunk volt végül egy adatkezelési módszer kidolgozása is, melynek al- kalmazásával kimutathatjuk a különböz ı módszerekkel létrehozott közösségi mintázatok elemeinek közös termel ı szervezetekt ıl való származását. Munkánk során sikerrel kifejlesztettünk, kalibráltunk és teszteltünk egy buborékszámlá- láson és -mérésen, valamint mintázatfelismer ı számítógépes program használatán alapuló volumetriás gázhozammérési módszert. Sikeresen feltártuk egy mezofil és egy termofil hımérsékletoptimumú biogáztartermel ı mikrobaközösség szerkezetét, s összetételükben, valamint marker-készletükben is jellegzetes különbségeket állapítottunk meg. A gázhozam és a mikrobiológiai markerkészlet alakulásában is tetten értük a könnyen bontható szubsztrátok adagolásának hatását modellrendszerünkben. Bacteroidetes dominanciájú kö- zösségünk ugyanakkor igen stabilnak bizonyult, így a szubsztrátváltások csak csekély vál- tozásokat okoztak a közösség összetételében. A korábban említett markermolekulák vizsgá- latával követtük nyomon két félüzemi reaktor felf őtésének folyamatát, s az ezzel járó kö- zösségátrendez ıdést. Mindhárom markertípus (kinonok, zsírsavak és DNS-markerek) kohe- rensen leképezte a közösségváltozást. Végül kidolgoztunk és szimulált adatsorokon tesztel- tünk egy sokváltozós adatkezelési módszert, mely több, párhuzamosan alkalmazott ujjle- nyomatmódszer eredményének közös elemzésére alkalmas. Lényege, hogy eredeti mar-

132 VI. ÖSSZEFOGLALÁS kermennyiségek és eltér ı markertípusok elemeib ıl származtatott összegváltozók mintasori mennyiségeinek aránytorzító összevetésekor korrelációs optimumokat keres, így kimutatja azokat az id ıbeli együttmozgásokat, melyek az átfed ı markertermelések miatt rejtve ma- radtak az eredeti adatsorokban, s közös termel ı szervezet létére utalnak. Ilyen analízisnek alávetve felf őtéses vizsgálatunk nyersadatait, az elvi megfontolások és a szakirodalmi ada- tok tükrében is jól értelmezhet ı, ígéretes eredményeket kaptunk.

133 VII. SUMMARY

VII. SUMMARY The microbial background of the production of methane containing biogas raises a series of important scientific questions of both theoretical and practical nature. As biogas is always produced by a complex microbial consortium ruled by complicated interactions, it is worth to investigate the community itself rather than the individual members separately. The well-established fingerprint-methods provide an opportunity to do this. These methods produce specific patterns according to the taxonomic composition and/or the methabolic state of the microbial community. These patterns can be compared to each other and interpreted depending on the nature of the method used. Laboratory-scale biogas producing model systems offer highly controllable circumstances and the opportunity of several paral- lel experiments, thereby facilitating the application of fingerprint methods. Information on the operating status of these small volume reactors can be easily obtained by measuring their gas production. Based on the above considerations the first aim of our work was to develop a simple, easy-to-use method for measuring the gas yield of small scale bioreactors. The second aim was to investigate biogas producing microbial communities using fingerprinting methods: (a) comparing a mesophilic and a thermophilic community of a biogas reactor, (b) studying the effect of easily degradable substrate feeding on mesophilic communities, and (c) moni- toring the effect of a heating up process from mesophilic to thermophilic temperature. Connected to the latter work, a final objective was to develop a data management method which enables us to demontsrate the existence of common producers of individual elements making up the different fingerprint patterns. As a result we successfully developed, calibrated and tested a volumetric gas yield measurement system based on counting and measuring bubbles, utilizing a pattern recognition software. The structure of a mesophilic and a thermophilic biogas producing microbial community was successfully explored and characteristic differences were established both in the taxonomic composition and the marker set of the samples. The effect of easily degradable substrate feeding was observable in the changes of gas yield and mar- ker set as well. The investigated communities were dominated mainly by Bacteroidetes, they proved to be highly stable, so that substrate shifts led only to slight changes in the composition. The heating up process and the following community structure change was monitored using three molecular marker types. All three marker types (quinones, fatty acids and DNA-biomarkers) coherently reflected the community change. Finally, a multivariate data analysis method was developed and tested with simulated data rows. The essence of the method is to search for correlation optima in a comparison process, during which

134 VII. SUMMARY original data variables and derived sum-variables from several marker types are compared in a ratio distorting way. With the help of this method several co-movements over the time can be pointed out in the marker population, which remain hidden in the original data structure, but suggest the existence of common producing organisms. The raw data from the heating up experiment were analyzed in this manner and the results were well interpretable in the light of theoretical considerations and the literature.

135 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

VIII. IRODALOMJEGYZÉK Abbasi T., Tauseef S. M., Abbasi S. A. (2012) A brief history of anaerobic digestion and “biogas”. In: Biogas and Biogas Energy, SpringerBriefs in Environmental Science, 11-23 Ahmed Z., Cho J., Lim B. R., Song K. G., Ahn K. H. (2007) Effects of sludge retention time on membrane fouling and microbial community structure in a membrane bioreactor. J. Membr. Sci. 287(2): 211-218 Ahn J. H., Mathiesen N. L. (2002) The effect of temperature variations on the performance of mesophilic and thermophilic anaerobic filters treating a simulated papermill wastewater. Process Biochem. 37(6): 589-594 Aitchison J. (2003) A concise guide to compositional data analysis. CDA Workshop, Girona Altschul S. F., Madden T. L., Schäffer A. A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 Amir S., Merlina G., Pinelli E., Winterton P., Revel J. C., Hafidi M. (2008) Microbial community dynamics during composting of sewage sludge and straw studied through phospholipid and neutral lipid analysis. J. Hazard. Mater. 159(2): 593-601 Angelidaki I., Ellegaard L., Ahring B. K. (1992) Compact automated displacement gas metering system for measurement of low gas rates from laboratory fermentors. Biotechnol. Bioeng. 39(3): 351-353 Ariesyady H. D., Ito T., Okabe S. (2007) Functional bacterial and archaeal community structures of major trophic groups in a full-scale anaerobic sludge digester. Water Res. 41(7): 1554-1568 Ashelford K. E., Chuzhanova N. A., Fry J. C., Jones A. J., Weightman A. J. (2006) New screening software shows that most recent large 16S rRNA gene clone libraries contain chimeras. Appl. Environ. Microbiol. 2(9): 5734-5741 Baena S., Fardeau M. L., Labat M., Ollivier B., Thomas P., Garcia J. L., Patel B. K. C. (1998) Aminobacterium colombiense gen. nov. sp. nov., an amino acid-degrading anaerobe isolated from anaerobic sludge. Anaerobe 4(5): 241-250 Bardgett R. D., Leemans D. K., Cook R., Hobbs P. J. (1997) Seasonality of the soil biota of grazed and ungrazed hill grasslands. Soil Biol. Biochem. 29(8): 1285-1294 Beaubien A., Jolicoeur C., Alary J. F. (1988) Automated high sensitivity gas metering system for biological processes. Biotechnol. Bioeng. 32(1): 105-109 Beeftink H. H., Staugaard P. (1986) Structure and dynamics of anaerobic bacterial aggregates in a gas-lift reactor. Appl. Environ. Microbiol. 52(5): 1139-1146 Bischoff M. (2009) Erkenntnisse beim Einsatz von Zusatz- und Hilfsstoffen sowie von Spurenelementen in Biogasanlagen. VDI-Ber 2057:111-123 Bligh E.G., Dyer W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. . J. of Biochem. 37(8): 911-917 Boadi D., Benchaar C., Chiquette J., Massé D. (2004) Mitigation strategies to reduce enteric methane emissions from dairy cows: Update review. Can. J. Anim. Sci. 84(3): 319-335 Boga H. I., Brune A. (2003) Hydrogen-dependent oxygen reduction by homoacetogenic bacteria isolated from termite guts. Appl. Environ. Microbiol. 69(2): 779-786 Burns S.J., Fleitmann D., Mudelsee M., Neff U., Matter A., Mangini A. (2002) A 780-year annually resolved record of Indian Ocean monsoon precipitation from a speleothem from south Oman. J. Geophys. Res. 107(D20): 4434 Case R. J., Boucher Y., Dahllöf I., Holmström C., Doolittle W. F., Kjelleberg S. (2007) Use of 16S rRNA and rpoB genes as molecular markers for microbial ecology studies. Appl. Environ. Microbiol. 73(1): 278-288

136 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Chouari R., Le Paslier D., Daegelen P., Ginestet P., Weissenbach J., Sghir A. (2005a) Novel predominant archaeal and bacterial groups revealed by molecular analysis of an anaerobic sludge digester. Environ. Microbiol. 7(8): 1104-1115 Chouari R., Le Paslier D., Dauga C., Daegelen P., Weissenbach J., Sghir A. (2005b) Novel major bacterial candidate division within a municipal anaerobic sludge digester. Appl. Environ. Microbiol. 71(4): 2145-2153 Collins M. D., Jones D. (1981) Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implication. Microbiol. Rev. 45(2): 316-354 Córdova-Kreylos A. L., Cao Y., Green P. G., Hwang H. M., Kuivila K. M., LaMontagne M. G., Van De Werfhorst L. C. Holden, P. A., Scow, K. M. (2006) Diversity, composition, and geographical distribution of microbial communities in California salt marsh sediments. Appl. Environ. Microbiol. 72(5): 3357-3366 Crosby L. D., Criddle C. S. (2003) Understanding bias in microbial community analysis techniques due to rrn operon copy number heterogeneity. Biotechniques 34(4): 790-803 Czigler A. (2010) Mikrobiális ujjlenyomatmódszerek változóinak összefüggés-vizsgálata. Szakdolgozat. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Numerikus Analízis Tanszék, Buda- pest Czupy I., Vágvölgyi A. (2011) Mez ıgazdasági (növénytermesztés, állattartás, erdészeti) hulladékok kezelése és hasznosítása. Pannon Egyetem, Környezetmérnöki Intézet. http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/ tamop425/0021_Mezogazdasag_hulladekai/adatok.html Dean F. B., Hosono S., Fang L., Wu X., Faruqi A. F., Bray-Ward P., Lasken R. S. (2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. 99(8): 5261-5266 Dissing U., Ling T. G. I., Mattiasson B. (1984) Monitoring of methanogenic processes with an immobilized mixed culture in combination with a gas-flow meter. Anal. Chim. Acta 163:127-133 Djukic I., Zehetner F., Mentler A., Gerzabek M. H. (2010) Microbial community composition and activity in different Alpine vegetation zones. Soil Biol. Biochem. 42(2): 155-161 Elhottová D., Koubová A., Šimek M., Cajthaml T., Jirout J., Esperschuetz J., Schloter M., Gattinger, A. (2012) Changes in soil microbial communities as affected by intensive cattle husbandry. Appl. Soil Ecol. 58: 56-65 Esposito G., Weijma J., Pirozzi F., Lens P. N. L. (2003) Effect of the sludge retention time on H2 utilization in a sulphate reducing gas-lift reactor. Process. Biochemistry. 30(4): 491- 498 Etchebehere C., Pavan M. E., Zorzopulos J., Soubes M., Muxi L. (1998) Coprothermobacter platensis sp. nov. a new anaerobic proteolytic thermophilic bacterium isolated from an anaerobic mesophilic sludge. Int. J. Syst. Bacteriol. 48(4): 1297-1304 Exner F. (1875) Über den Durchgang der Gase durch Flüssigkeitslamellen. Pogg. Ann. 155:321-336 Fernandez A. S., Hashsham S. A., Dollhopf S. L., Raskin L., Glagoleva O., Dazzo F. B., Tiedje J. M. (2000) Flexible community structure correlates with stable community function in methanogenic bioreactor communities perturbed by glucose. Appl. Environ. Microbiol. 66(9): 4058-4067 Ferry J. G. (1994) Fermentation of acetate. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Findlay R. H. (1996) The use of phospholipid fatty acids to determine microbial community structure. Molecular Microbial Ecology Manual 4(4): 1-17

137 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Frey B., Stemmer M., Widmer F., Luster J., Sperisen C. (2006) Microbial activity and community structure of a soil after heavy metal contamination in a model forest ecosystem. Soil Biol. Biochem. 38(7): 1745-1756 Frostegård Å., Tunlid A., Bååth E. (1993) Phospholipid fatty acid composition, biomass, and activity of microbial communities from two soil types experimentally exposed to different heavy metals. Appl. Environ. Microbiol. 59(11): 3605-3617 Fujie K., Hu H. Y., Tanaka H., Urano K., Saitou K., Katayama A. (1998) Analysis of respiratory quinones in soil for characterization of microbiota. Soil Sci. Plant Nutr. 44(3): 393-404 Gao B., Gupta R. S. (2007) Phylogenomic analysis of proteins that are distinctive of Archaea and its main subgroups and the origin of methanogenesis. BMC genomics 8(1): 86 Gattinger A., Günthner A., Schloter M., Munch J. C. (2003) Characterisation of Archaea in soils by polar lipid analysis. Acta Biotechnol. 23(1): 21-28 Gehron M. J., David C W. (1983) Sensitive assay of phospholipid glycerol in environmental samples. J. Microbiol. Methods 1(1): 23-32 Gibbs R. D. (1974) Chemotaxonomy of flowering plants. I-IV. McGill-Queen's univ Press. Montreal London, 1-680 Glauser M., Jenni B., Aragno M. (1984) An inexpensive, automatic gas meter for laboratory- scale methane digesters and other gas-evolving systems. J. Microbiol. Meth. 2(3): 159- 164 Gómez-Brandón M., Lores M., Domínguez J. (2010) A new combination of extraction and derivatization methods that reduces the complexity and preparation time in determining phospholipid fatty acids in solid environmental samples. Biores. Tech. 101(4): 1348-1354 Gorin P. A. J., Spencer J. F. T. (1970) Proton magnetic resonance spectroscopy–an aid in identification and chemotaxonomy of yeasts. Adv. Appl. Microbiol. 13:25-89 Green C. T., Scow K. M. (2000) Analysis of phospholipid fatty acids (PLFA) to characterize microbial communities in aquifers. Hydrogeol. J. 8(1): 126-141 Grimes D. J., Atwell R. W., Brayton P. R., Palmer L. M., Rollins D. M., Roszak D. B., Colwell R. R. (1986) The fate of enteric pathogenic bacteria in estuarine and marine environments. Microbiol. Sci. 3(11): 324 Hammer Ř., Harper D. A. T., Ryan P. D. (2001) PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. . Paleontol. Elecrtonica 4(1): 1-9 Hania W. B., Godbane R., Postec A., Hamdi M., Ollivier B., Fardeau M. L. (2011) Isolation and characterization of Defluviitoga tunisiensis gen. nov, sp. nov., a novel thermophilic bacterium pertaining to the order Thermotogales, isolated from a mesothermic anaerobic reactor treating cheese whey in Tunisia. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. doi: 10.1099/ijs.0.033720-0 Hanif M., Atsuta Y., Fujie K., Daimon H. (2012) Supercritical Fluid Extraction and Ultra Performance Liquid Chromatography of Respiratory Quinones for Microbial Community Analysis in Environmental and Biological Samples. Molecules 17(3): 2628-2642 Harborne J. B., Boulter D. Turner, B. L. (1971) Chemotaxonomy of the Leguminosae. Academic Press, London and New York Hawksworth D. L. (1976) Lichen chemotaxonomy. In: Lichenology: progress and problems, ed. Brown D. H., Hawksworth D. L., Bailey R. H., Academic Press, London, 139-184 Hedrick D. B., White D. C. (1986) Microbial respiratory quinones in the environment: I. A sensitive liquid chromatographic method. J. Microbiol. Methods 5(5): 243-254 Hiraishi A., Morishima Y., Takeuchi J. I. (1991) Numerical analysis of lipoquinone patterns in monitoring bacterial community dynamics in wastewater treatment systems. J. Gen. Appl. Microbiol. 37(1): 57-70

138 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Höfle M. G. (1988) Taxonomic structure of bacterial communities in mixed cultures as measured by low molecular weight RNA profiles. Arch. Hydrobiol. Beih. Ergebn. Limnol 31:71-77 Hu H. Y., Fujie K., Nakagome H., Urano K., Katayama A. (1999a) Quantitative analyses of the change in microbial diversity in a bioreactor for wastewater treatment based on respiratory quinones. Water Res. 33(15): 3263-3270 Hu H. Y., Fujie K., Urano K. (1999b) Development of a novel solid phase extraction method for the analysis of bacterial quinones in activated sludge with a higher reliability. J. Biosci. Bioeng. 87(3): 378-382 Ibekwe A., Kennedy A. C. (1998) Phospholipid fatty acid profiles and carbon utilization patterns for analysis of microbial community structure under field and greenhouse conditions. FEMS Microbiol. Ecol. 26(2): 151-163 Inatomi K., Kamagata K. Y., Nakamura K. (1993) Membrane ATPase from the aceticlastic methanogen Methanothrix thermophila .. J. Bacteriol. 175(1): 80-84 Ince B. K., Ince O., Oz N. A. (2003) Changes in acetoclastic methanogenic activity and microbial composition in an upflow anaerobic filter. Water Air Soil Poll. 144(1): 301-315 Isa Z., Grusenmeyer S., Verstraete W. (1986) Sulfate reduction relative to methane production in high-rate anaerobic digestion: Technical aspects. Appl. Environ. Microbiol. 51(3): 572-579 Ishii K., Fukui M. (2001) Optimization of annealing temperature to reduce bias caused by a primer mismatch in multitemplate PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67(8): 3753-3755 Jawed M., Tare V. (1999) Microbial composition assessment of anaerobic biomass through methanogenic activity tests. Water SA 25(3): 345-350 Jin T., Xu B., Tang K., Hong J. P. (2008) Bubble counter based on photoelectric technique for leakage detection of cryogenic valves. J. Zhejiang Univ-Sc. A. 9 (1): 88-92 Kampmann K., Ratering S., Kramer I., Schmidt M., Zerr W., Schnell S. (2012) Unexpected stability of Bacteroidetes and Firmicutes communities in laboratory biogas reactors fed with different defined substrates. Appl. Environ. Microbiol. 78(7): 2106-2119 Kaplan C. W., Kitts C. L. (2003) Variation between observed and true terminal restriction fragment length is dependent on true TRF length and purine content. J. Microbiol. Methods 54(1): 121-125 Kashyap D. R., Dadhich K. S., Sharma S. K. (2003) Biomethanation under psychrophilic conditions: a review. Biores. Tech. 87(2): 147-153 Kaster A. K., Moll J., Parey K., Thauer R. K. (2011) Coupling of ferredoxin and heterodisulfide reduction via electron bifurcation in hydrogenotrophic methanogenic archaea. P. Natl. Acad. Sci. USA 08(7):2981-2986 Keltjens J. T., Vogels G. D. (1994) Conversion of methanol and methanolamines. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Kersters I., Maestrojuan G. M., Torck U., Vancanneyt M., Kersters K., Verstreate W. (1994) Isolation of Coprothermobacter proteolyticus from an anaerobic digest and further characterization of the species. Syst. Appl. Microbiol. 17(2): 289-295 Khalid A., Arshad M., Anjum M., Mahmood T., Dawson L. (2011) The anaerobic digestion of solid organic waste. Waste Manage. 31(8): 1737-1744 Kieft T. L., Ringelberg D. B., White D. C. (1994) Changes in ester-linked phospholipid fatty acid profiles of subsurface bacteria during starvation and desiccation in a porous medium. Appl. Environ. Microbiol. 60(9): 3292-3299 Kim O. S., Cho Y. J., Lee K., Yoon S. H., Kim M., Na H., Chun J. (2012) Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62(Pt 3): 716-721

139 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Kiss B. (2007) Biogáz termel ı mikrobióta h ımérsékletfüggésének vizsgálata molekuláris módszerekkel. Szakdolgozat.. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tan- szék, Budapest Klug M. J., Tiedje J. M. (1993) Response of microbial communities to changing environmental conditions: chemical and physiological approaches. In: Trends in Microbiology and Ecology, ed. Guerrero R., Pedrós-Alió C., Spanish Society for Microbiology, Barcelona, 371–378 Kurr, M., Huber, R., König H., Jannasch, H. W., Fricke, H., Trincone, A. (1991) Methanopyrus kandleri , gen. and sp. nov. represents a novel group of hyperthermophilic methanogens, growing at 110°C. Arch. Microbiol. 156(4): 239-247 Lashkari S., Kruczek B. (2008) Development of a fully automated soap flowmeter for micro flow measurements. Flow. Meas. Instrum. 19 (6): 397-403 Lechevalier H. A., Solotorovsky M. (1965) Three centuries of microbiology. McGraw-Hill, New York Lechevalier M. P., De Bievre C., Lechevalier H. (1977) Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition. Biochem. Syst. Ecol. 5(4): 249-260 Lechevalier H., Lechevalier M. P. (1988) Chemotaxonomic use of lipids—an overview. Microbial lipids 1(1): 869-902 Lee C., Kim J., Hwang K., O'Flaherty V., Hwang S. (2009) Quantitative analysis of methanogenic community dynamics in three anaerobic batch digesters treating different wastewaters. Water Res. 43(1): 157-165 Lee S. H., Kang H. J., Lee Y. H., Lee T. J., Han K., Choi Y., Park H. D. (2012) Monitoring bacterial community structure and variability in time scale in full-scale anaerobic digesters. J. Environ. Monitor. 14(7): 1893-1905 Li H., Yang M., Zhang Y., Yu T., Kamagata Y. (2006) Nitrification performance and microbial community dynamics in a submerged membrane bioreactor with complete sludge retention. J. Biotechnol. 123(1): 60-70 Li Y., Zhang J., Chen Q., Yang G., Cai S., He J., Li S. P. (2012) Dokdonella kunshanensis sp. nov., isolated from activated sludge and emended description of the genus Dokdonella . Int. J. Syst. Evol. Microbiol. in press. Liao M., Chen C. L., Zeng L. S., Huang C. Y. (2007) Influence of lead acetate on soil microbial biomass and community structure in two different soils with the growth of Chinese cabbage ( Brassica chinensis ). Chemosphere 66(7): 1197-1205 Lier J. B., Grolle K. C., Stams A. J., Macario E. C., Lettinga G. (1992) Start-up of a thermophilic upflow anaerobic sludge bed (UASB) reactor with mesophilic granular sludge. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37(1): 130-135 Liu W. T., Linning K. D., Nakamura K., Mino T., Matsuo T., Forney L. J. (2000) Microbial community changes in biological phosphate-removal systems on altering sludge phosphorus content. Microbiology 146(5): 1099-1107 Liu J., Olsson G., Matthiasson B. (2004) A volumetric meter for monitoring of low gas flow rate from laboratory-scale biogas reactors. Sensor. Actuat. B-Chem. 97(2): 369-372 Liu F. H., Wang S. B., Zhang J. S., Zhang J., Yan X., Zhou H. K., Zhao, G. P., Zhou, Z. H. (2009) The structure of the bacterial and archaeal community in a biogas digester as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis and 16S rDNA sequencing analysis. J. Appl. Microbiol. 106(3): 952-966 Lueders T., Friedrich M. W. (2003) Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl. Environ. Microbiol. 9(1): 320-326

140 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Luo H., Sun Z., Arndt W., Shi J., Friedman R., Tang J. (2009) Gene order phylogeny and the evolution of methanogens. PLoS One 4(6): 6069 Maazoun R., Lanotte G., Pasteur N., Rioux J. A., Kennou M. F., Pratlong F. (1981) Ecology of leishmaniasis in southern France. 16. Ann. Parasit. Hum. Comp. 56(2): 131 MacLeod F. A., Guiot S. R., Costerton J. W. (1990) Layered structure of bacterial aggregates produced in an upflow anaerobic sludge bed and filter reactor. Appl. Environ. Microbiol. 56(6): 1598-1607 Márialigeti K., Gorál R., Pohner Zs., Székely A., Tauber T., Tóth E. (2006) Use of molecular fingerprint techniques in the optimisation of sewage treatment biotechnologies. In: Proceedings of the Annual General Meeting of the European Culture Collections’ Organisation, Budapest, 81-92 Mata-Alvarez J., Macé S., Llabrés P. (2000) Anaerobic digestion of organic solid wastes. An overview of research achievements and perspectives. Biores. Tech. 74(1): 3-16 Mathiesen N. L. (1989) Ca and/or Mg soap solution in biogas production. WO Patent 8900548 Mayberry W. R., Lambe D. W., Ferguson K. P. (1982) Identification of Bacteroides species by cellular fatty acid profiles. Int. J. Syst. Bacteriol. 32(1): 21-27 Millar A. A., Smith M. A., Kunst L. (2000) All fatty acids are not equal: discrimination in plant membrane lipids. Trends Plant Sci. 5(3): 95-101 Minnikin D. E., Goodfellow M. (1981) Lipids in the classification of Bacillus and related taxa. In: The Aerobic Endospore-Forming Bacteria, ed. Berkeley R. C. W., Goodfellow M., Special Publication of the Society for General Microbiology, Academic Press, Lon- don, 4: 59–90 Minnikin D. E., O'donnell A. G., Goodfellow M., Alderson G., Athalye M., Schaal A., Parlett J. H. (1984) An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoid quinones and polar lipids. J. Microbiol. Methods 2(5): 233-241 Moletta R., Albagnac G. (1982) A gas meter for low rates of gas flow: application to methane fermentation. Biotechnol. Lett. 4(5): 319-322 Mullis K. B., Faloona F. A., Scharf S. J., Saiki R. K., Horn G. T., Erlich H. (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 Muyzer G. (1999) Genetic fingerprinting of microbial communities–present status and future perspectives. In: Microbial biosystems: new frontiers. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial Ecology. Atlantic Canada Society for Microbial Ecology, Hali- fax Muyzer G., Stams A. J. M. (2008) The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 6(6): 441-454 Nahaie M. R., Goodfellow M., Minnikin D. E., Hajek V. (1984) Polar lipid and isoprenoid quinone composition in the classification of Staphylococcus. J. Gen. Microbiol. 130(9): 2427-2437 Nakao S. (2006) Development of the P V T t system for very low gas flow rates. Flow. Meas. Instrum. 17 (3): 193-200 Nichols D. (2007) Cultivation gives context to the microbial ecologist. FEMS Microbiol. Ecol. 60(3): 351-357 Nikolausz M., Walter R. F. H., Sträuber H., Liebetrau J., Schmidt T., Kleinsteuber S., Bratfisch, F., Günther, U., Richnow, H. H. (2012) Evaluation of stable isotope fingerprinting techniques for the assessment of the predominant methanogenic pathways in anaerobic digesters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97(5): 2251-2262 Nilsson B. K., Bjerle I., Karlsson H. T. (1988) A simple meter with zero pressure drop for gas flows. Ind. Eng. Chem. Res. 27(8): 1553-1555

141 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Ollivier B. M., Mah R. A., Ferguson T. J., Boone D. R., Garcia J. L., Robinson R. (1985) Emendation of the genus Thermobacteroides : Thermobacteroides proteolyticus sp. nov., a proteolytic acetogen from a methanogenic enrichment. Int. J. Syst. Bacteriol. 5(4): 425- 428 Palatinszky M., Nikolausz M., Sváb D., Márialigeti K. (2011) Preferential ligation during TA-cloning of multitemplate PCR products—A factor causing bias in microbial community structure analysis. J. Microbiol. Methods 85(2): 131-136 Parawira W., Murto M., Read J. S., Mattiasson B. (2005) Profile of hydrolases and biogas production during two-stage mesophilic anaerobic digestion of solid potato waste. Process Biochem. 40(9): 2945-2952 Penn M., Dworkin M. (1976) Robert Koch and two visions of microbiology. Bacteriol Rev. 40(2): 276-283 Penning H., Claus P., Casper P., Conrad R. (2006) Carbon isotope fractionation during acetoclastic methanogenesis by Methanosaeta concilii in culture and a lake sediment. Appl. Environ. Microbiol. 72(8): 5648-5652 Pereda R. O. C., Munoz E. M. R., Ruiz G. H. (2010) Automatic volumetric gas flow meter for monitoring biogas production from laboratory-scale anaerobic digester. Sensor. Actuat. B-Chem. 147(1): 10-14 Peters R. W., Alleman J. E. (1983) The history of fixed-film wastewater treatment systems. In: Fixed-film Biological Processes for Wastewater Treatment, ed. Wu Y. C., Smith E. D., Park Ridge, Noyes (NJ), 60-88 Polz M. F., Cavanaugh C. M. (1998) Bias in template-to-product ratios in multitemplate PCR. Appl. Environ. Microbiol. 64(10): 3724-3730 Rainey F. A., Stackebrandt E. (1993) Transfer of the type species of the genus Thermobacteroides to the genus Thermoanaerobacter as Thermoanaerobacter acetoethylicus (Ben-Bassat and Zeikus 1981) comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 43(4): 857-859 Ramsey P. W., Rillig M. C., Feris K. P., Holben W. E., Gannon J. E. (2006) Choice of methods for soil microbial community analysis: PLFA maximizes power compared to CLPP and PCR-based approaches. Edobiologia 50(3): 275-280 Ranjard L., Poly F., Nazaret S. (2000) Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques: application to soil environment. Res. Microbiol. 151(3): 167-177 Ravit B., Ehenfeld J. G., Häggblom M. M. (2006) Effects of vegetation on root-associated microbial communities: A comparison of disturbed versus undisturbed estuarine sediments. Soil Biol. Biochem. 38(8): 2359-2371 Reichardt W., Mascarina G., Padre B., Doll J. (1997) Microbial communities of continuously cropped, irrigated rice fields. Appl. Environ. Microbiol. 63(1): 233-238 Ritchie N. J., Schutter M. E., Dick R. P., Myrold D. D. (2000) Use of length heterogeneity PCR and fatty acid methyl ester profiles to characterize microbial communities in soil. Appl. Environ. Microbiol. 66(4): 1668-1675 Ryu S. H., Park M., Jeon Y., Lee J. R., Park W., Jeon C. O. (2007) Flavobacterium filum sp. nov., isolated from a wastewater treatment plant in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57(9): 2026-2030 Sáez A. E., Marquez M. A., Roberts G. W., Carbonell R. G. (1998) Hydrodynamic model for gas-lift reactors. AIChE journal 44(6): 1413-1423 Sahlström L. (2003) A review of survival of pathogenic bacteria in organic waste used in biogas plants. Biores. Tech. 87(2): 161-166

142 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Schade M., Beimfohr C., Lemmer H. (2002) Phylogenetic and physiological characterization of a " Nostocoida limicola "-like organism isolated from activated sludge. Water Sci. Technol. 46(1-2): 91-97 Schimpf U., Valbuena R. (2009) Increase in efficiency of biomethanation by enzyme application. Bornimer Agrartechnische Berichte 68: 44-56 Schink B. (1984) Clostridium magnum sp. nov., a non-autotrophic homoacetogenic bacterium. Arch. Microbiol. 137(3): 250-255 Schink B. (1997) Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61(2): 262-280 Schink B, Stams A. J. M. (2001) Obligately syntrophic bacteria: cultivation and biochemical studies. In: The prokariotes: an evolving electronic resource for the microbiological community, ed. Dworkin M., Springer-Verlag, New York Schlüter A., Bekel T., Diaz N. N., Dondrup M., Eichenlaub R., Gartemann K. H., Krahn, I., Krause, L., Krömeke, H., Kruse, O., Mussgnug, J. H., Neuweger, H., Niehaus, K., Pühler, A., Runte, K. J., Szczepanowski, R., Tauch, A., Tilker, A., Viehöver, P., Goesmann, A. (2008) The metagenome of a biogas-producing microbial community of a production- scale biogas plant fermenter analysed by the 454-pyrosequencing technology. J. Biotechnol. 136: 77-90 Schmitz-Esser S., Tischler P., Arnold R., Montanaro J., Wagner M., Rattei T., Horn M. (2010) The genome of the amoeba symbiont “ Candidatus Amoebophilus asiaticus ” reveals common mechanisms for host cell interaction among amoeba-associated bacteria. J. Bacteriol. 192(4): 1045-1057 Schulze R., Spring S., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K. H., Kämpfer P. (1999) Genotypic diversity of Acidovorax strains isolated from activated sludge and description of Acidovorax defluvii sp. Nov.. Syst. Appl. Microbiol. 22(2): 205-214 Shigematsu T., YueQin T., Kida K. (2009) Microbial communities related to methane fermentation processes-monograph. Seibutsu-kogaku Kaishi 7(12): 570-596 Shumway R. H., Stoffer D. S. (2000) Time Series Analysis and its Applications. Springer- Verlag, New York Simpson P. G., Whitman W. B. (1994) Anabolic pathways in methanogens. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Sipos R., Székely A. J., Palatinszky M., Révész S., Márialigeti K., Nikolausz M. (2007) Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene targetting bacterial community analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 60(2): 341-350 Sipos R. (2009) Mikroba közösségek fajösszetétel-vizsgálata: A multitemplát PCR és a DGGE elemzése. Doktori értekezés. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, Budapest, 3-18 Smith C. J., Danilowicz B. S., Clear A. K., Costello F. J., Wilson B., Meijer W. G. (2006) T- Align, a web based tool for comparison of multiple terminal restriction fragment length polymorphism profiles. FEMS Microbiol. Ecol. 54(3): 375-380 Sonne-Hansen J., Westermann P., Ahring B. K. (1999) Kinetics of sulfate and hydrogen uptake by the thermophilic sulfate-reducing bacteria Thermodesulfobacterium sp. Strain JSP and Thermodesulfovibrio sp. Strain R1Ha3. Appl. Environ. Microbiol. 65(3): 1304- 1307 Sorokin D. Y., Tourova T. P., Panteleeva A. N., Muyzer G. (2012) Desulfonatronobacter acidivorans gen. nov., sp. nov. and Desulfobulbus alkaliphilus sp. nov., haloalkaliphilic heterotrophic sulfate-reducing bacteria from soda lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2(9): 2107-2113

143 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Staley J. T., Konopka A. (1985) Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39(1): 321-346 Sterling Jr. M. C., Lacey R. E., Engler C. R., Ricke S. C. (2001) Effects of ammonia nitrogen on H 2 and CH 4 production during anaerobic digestion of dairy cattle manure. Biores. Technol. 77(1): 9-18 Taherzadeh M. J., Karimi K. (2008) Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: a review. Int. J. Mol. Sci. 9(9): 1621-1651 Takasu H., Kunihiro T., Nakano S. L. (2012) Vertical community structure of bacteria and phytoplankton in Lake Biwa using respiratory quinone and pigment analysis. In: Studies on Environmental Chemistry—Environmental Pollution and Ecotoxicology, ed. Kawaguchi M., Misaki K., Sato H., Yokokawa T., Itai T., Nguyen T. M., Ono J., Tanabe S., 6: 377–385 Tauber T., Berta B., Székely A. J., Gyarmati I., Kékesi K., Márialigeti K., Tóth E. (2006) Characterisation of community structure of bacteria in parallel mesophilic and thermophilic pilot scale anaerobe sludge digesters. Acta. Microbiol. Immun. Hung. 54 (1): 47-55 Tauber T., Berta B., Szabó Z., Kovács J., Márialigeti K., Tóth E. M. (2011) A simple and novel volumetric method to metre low gas flows from laboratory-scale bioreactors and its application on laboratory sludge digesters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90(4): 1453-1461 Tauber T., Wirth B., Nikolausz M., Palatinszky M., Schumann P., Márialigeti K., Tóth M. E. (2013) The effect of easily degradable substrate feeding on the community structure of laboratory-scale wastewater sludge digesters. Acta Microbiol. Imm. H. 60(3): in press. Taylor J., Parkes R. J. (1983) The cellular fatty acids of the sulphate-reducing bacteria, Desulfobacter sp ., Desulfobulbus sp . and Desulfovibrio desulfuricans . J. Gen. Microbiol. 129(11): 3303-3309 Thauer R. K., Hedderich R., Fischer R. (1994) Methanogenesis from CO 2 and H 2. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Toda Y., Saiki T., Uozumi T., Beppu T. (1988) Isolation and characterization of a protease- producing, thermophilic, anaerobic bacterium, Thermobacteroides leptospartum sp. nov. (Microbiology Fermentation Industry). Agr. Biol. Chem. 52(6): 1339-1344 Topolnicki J., Kudasik M., Skoczylas N., Sobczyk J. (2009) Low cost capillary flow meter. Sensor. Actuat. A-Phys. 152 (2): 146-150 Torsvik V., Goksøyr J., Daae F. L. (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 56(3): 782-787 Touzel J. P., Albagnac G. (1983) Isolation and characterization of Methanococcus mazei strain MC3. FEMS Microbiol. Lett. 16(2-3): 241-245 Tunlid A., Baird B. H., Trexler M. B., Olsson S., Findlay R. H., Odham G., White D. C. (1985) Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly β-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31(12): 1113-1119 Tüzes D, Papp L. (2007) Buborék mozgásának vizsgálata Mikola cs ıben. http://www.linkgroup.hu /tuzes/alaplab/mikola.pdf Ueki A., Akasaka H., Suzuki D., Ueki K. (2006) Paludibacter propionicigenes gen. nov., sp. nov., a novel strictly anaerobic, Gram-negative, propionate-producing bacterium isolated from plant residue in irrigated rice-field soil in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 6(1): 39-44 Van den Berg L., Lentz C. P., Athey R. J., Rooke E. A. (1974) Assessment of methanogenic activity in anaerobic digestion. Apparatus and method. Biotechnol Bioeng 16(11): 1459- 1469

144 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Vargas Gil S., Meriles J., Conforto C., Basanta M., Radl V., Hagn A., Schloter M., March, G. J. (2011) Response of soil microbial communities to different management practices in surface soils of a soybean agroecosystem in Argentina. Eur. J. Soil Biol. 47(1): 55-60 Vaughan J. G., Denford K. E. (1968) An acrylamide gel electrophoretic study of the seed proteins of Brassica and Sinapis species, with special reference to their taxonomic value. J. Exp. Bot. 19(4): 724-732 Wagner M., Amann R., Lemmer H., Schleifer K. H. (1993) Probing activated sludge with oligonucleotides specific for proteobacteria: inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure. Appl. Environ. Microbiol. 59(5): 1520-1525 Wagner D., Gattinger A., Embacher A., Pfeiffer E. M., Scholter M., Lipski A. (2007) Methanogenic activity and biomass in Holocene permafrost deposits of the Lena Delta, Siberian Arctic and its implication for the global methane budget. Glob. Change Biol. 13(5): 1089-1099 Wagner M., Assmus B., Hartmann A., Hutzler P., Amann R. (2011) In situ analysis of microbial consortia in activated sludge using fluorescently labelled, rRNA-targeted oligonucleotide probes and confocal scanning laser microscopy. J. Microsc. 176(3): 181- 187 Walker M., Zhang Y., Heaven S., Banks C. (2009) Potential errors in the quantitative evaluation of biogas production in anaerobic digestion processes. Biores. Technol. 100(24): 6339-6346 Wang H., Wang F. Y., Wei Z. Q., Hu H. Y. (2011) Quinone profiles of microbial communities in sediments of Haihe River–Bohai Bay as influenced by heavy metals and environmental factors. Environ. Monit. Assess. 176(1): 157-167 Weisenburger G. A., Barnhart R. W., Steeno G. S. (2008) Measurement of gas flow rates from small-scale reactions. Org. Process. Res. Dev. 12 (6): 1299-1304 Welch D. F. (1991) Applications of cellular fatty acid analysis. Clin. Microbiol. Rev. 4(4): 422-438 White D. C., Davis W. M., Nickels J. S., King J. D., Bobbie R. J. (1979) Determination of the sedimentary microbial biomass by extractable lipid phosphate. Oecologia 40(1): 51-62 White D. C. (1988) Validation of quantitative analysis for microbial biomass, community structure, and metabolic activity. Adv. Limnol. 31(1): 1-18 Wiertelak J. (1931) Chemical composition. The chemical composition of wood of Trochodendron araloides . Trop. Woods, 25: 29 Wilke B. M., Gattinger A., Fröhlich E., Zelles L., Gong P. (2004) Phospholipid fatty acid composition of a 2, 4, 6-trinitrotolune contaminated soil and an uncontaminated soil as affected by a humification remediation process. Soil Biol. Biochem- 36(4): 725-729 Wirth R., Kovács E., Maróti G., Bagi Z., Rákhely G., Kovács K. L. (2012) Characterization of a biogas-producing microbial community by short-read next generation DNA sequencing. Biotechnol. Biofuels 5(1): 1-16 Witt A., Schumann Y. (2005) Holocene climate variability on millennial scales recorded in Greenland ice cores. Nonlinear Proc. Geoph. 12(3): 345-352 Woese C. R. (1987) Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51(2): 221-271 Wolfe R. S. (1993) A historical owerview of methanogenesis. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York Wright A. D. G., Pimm C. (2003) Improved strategy for presumptive identification of methanogens using 16S riboprinting. J. Microbiol. Methods 55(2): 337-349 Wu Y., Ding N., Wang G., Xu J., Wu J., Brookes P. C. (2009) Effects of different soil weights, storage times and extraction methods on soil phospholipid fatty acid analyses. Geoderma 150(1): 171-178

145 VIII. IRODALOMJEGYZÉK

Xing D., Ren N., Li Q., Lin M., Wang A., Zhao L. (2006) Ethanoligenens harbinense gen. nov., sp. nov., isolated from molasses wastewater. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56(4): 755-760 Yadvika S., Sreekrishnan R. S., Kohli S., Rana V. (2004) Enhancement of biogas production from solid substrates using different techniques – A review. Biores. Tech. 95(1): 1-10 Yamada T., Sekiguchi Y., Hanada S., Imachi H., Ohashi A., Harada H., Kamagata Y. (2006) Anaerolinea thermolimosa sp. nov., Levilinea saccharolytica gen. nov., sp. nov. and Leptolinea tardivitalis gen. nov., sp. nov., novel filamentous anaerobes, and description of the new classes Anaerolineae classis nov. and Caldilineae classis nov. in the bacterial phylum Chloroflexi. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56(6): 1331-1340 Yamada T., Imachi H., Ohashi A., Harada H., Hanada S., Kamagata Y., Sekiguchi Y. (2007) Bellilinea caldifistulae gen. nov., sp. nov., an amino acid-degrading anaerobe isolated from anaerobic sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57(10): 2299-2306 Yao H., Thornton B., Paterson E. (2012) Incorporation of 13 C-labelled rice rhizodeposition carbon into soil microbial communities under different water status. Soil Biol. Biochem. 53: 72-77 Yu H., Zeng G., Huang H., Xi X., Wang R., Huang D., Huang G., Li, J. (2007) Microbial community succession and lignocellulose degradation during agricultural waste composting. Biodegradation 18(6): 793-802 Zelles L., Bai Q. Y., Beck T., Beese F. (1992) Signature fatty acids in phospholipids and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24(4): 317-323 Zelles L., Bai Q. Y. (1993) Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25(4): 495-507 Zelles L. (1999) Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fertil. Soils 29(2): 111- 129 Zhang C., Xu J., Liu X., Dong F., Kong Z., Sheng Y., Zheng Y. (2010) Impact of imazethapyr on the microbial community structure in agricultural soils. Chemosphere 81(6): 800-806 Zinder S. H., Sowers K. R., Ferry J. G. (1985) NOTES: Methanosarcina thermophila sp. nov., a Thermophilic, Acetotrophic, Methane-Producing Bacterium. Int. J. Syst. Evol. Micr. 35(4): 522-523 Zinder S. H. (1994) Physiological ecology of methanogens. In: Methanogenesis: Ecology, Physiology, Biochemistry, Genetics, ed. Ferry, J. G., Chapman and Hall, New York http://mikrobiologia.elte.hu/Miscell.html

146 FÜGGELÉK

FÜGGELÉK (A f ı részek számozása „Ad” prepozícióval a f ıszöveg vonatkozó alfejezeteire utal vissza.)

Ad III. B. 8. A 16S rDNS PCR és h ıprofilja a mezofil-termofil közösség-összehasonlításban:

Reagensek: (Bacteria) mintánként: Reagensek: (Archaea) mintánként: 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl p 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl p MgCl 2 (Fermentas) 4µl r MgCl 2 (Fermentas) 4µl r dNTP (Fermentas) 10µl e dNTP (Fermentas) 10µl e H2O (DEPC kezelt) 27µl m H2O (DEPC kezelt) 27µl m 27f (0,2 µg/µl) 0,5µl i HEX-A344f (0,2 µg/µl) 0,5µl i TET-519r (0,2 µg/µl) 0,5µl x A934r (0,2 µg/µl) 0,5µl x Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl DNS templát 2µl DNS templát 2µl Össztérfogat 50µl Össztérfogat 50µl

A PCR reakció h ıprofilja: kezdeti denaturáció 98°C 5 min Taq bemérés 94°C 10 sec anelláció 52°C 30 sec extenzió 72°C 30 sec 30 ciklus denaturáció 94°C 30 sec végs ı extenzó 72°C 10 min hőtés 4°C ∞

A 16S rDNS PCR pimerei, premixei és h ıprofilja a könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában.

Használt primerek: 27f: 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1492r: 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’ mlas: 5’-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3’ mcrA-rev: 5’-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT-3’ Bet őkódok: M: A/C; W: A/T; K: G/T; S: G/C; Y: C/T; R: A/G

Reagensek: (Archaea) mintánként: Reagensek: (Bacteria) mintánként: 10X PCR puffer (CoralLoad) 2,5µl p 10X PCR puffer (Fermentas) 5µl p dNTP (CoralLoad) 0,5µl r dNTP (Fermentas) 10µl r H2O (DEPC kezelt) 16,875µl e H2O (DEPC kezelt) 27µl e mlas (0,2 µg/µl) 2 µl m 27f (0,2 µg/µl) 0,5µl m mcrA-rev (0,2 µg/µl) 2 µl i 1492r (0,2 µg/µl) 0,5µl i Taq polimeráz (1U/µl; CoralLoad) 0,125 µl x Taq polimeráz (1U/µl; Fermentas) 1µl x DNS templát 1 µl DNS templát 2µl Össztérfogat 25 µl Össztérfogat 50µl

A PCR reakció h ıprofilja: kezdeti denaturáció 98°C 5 min Taq bemérés 94°C 10 sec anelláció 52°C 30 sec extenzió 72°C 30 sec 30 ciklus denaturáció 94°C 30 sec végs ı extenzó 72°C 10 min hőtés 4°C ∞

I FÜGGELÉK

A 16S rDNS PCR pimerei, premixei és h ıprofilja a felf őtéses kísérletben

Használt primerek bázissorrendje 27f: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' HEX-27f: (HEX)-5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' 519r: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3' A109f: 5’-ACKGCTCAGTAACACGT-3’ A340f: 5’-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3’ HEX-A340f: (HEX)-5’- CCCTAYGGGGYGCASCAG-3’ A1000r: 5’-GGCCATGCACYWCYTCTC-3’ Bet őkódok: M: A/C; W: A/T; K: G/T; S: G/C; Y: C/T; R: A/G

PCR reakciók összetétele és h ıprofilja: Bacteria és Archaea 16S rDNS PCR összetétele Dream Taq polimeráz (Fermentas) 1,00 l 10x puffer (Fermentas) 2,50 l MgCl 2 (Fermentas) 2,00 l reverz primer 0,25 l premix forward primer 0,25 l dNTP 5,00 l végtérfogat: 25,00 l DEPC víz 13,00 l templát 1,00 l

Bacteria 16S rDNS PCR h ıprofilja: kezdeti denaturáció 98 oC 5perc denaturáció 94 oC 0:30 perc anneláció 52 oC 0:30 perc 32 ciklus extenzió 72 oC 0:30 perc végs ı extenzió 72 oC 10 perc hőtés 4 °C ∞

Archaea 16S rDNS PCR-ek h ıprofilja: kezdeti denaturáció 98 oC 5perc denaturáció 94 oC 0:30 perc anneláció 60 oC 0:30 perc ciklusonként 0,5 °C-kal csökkentve 20 ciklus extenzió 72 oC 1:00 perc denaturáció 94 oC 0:30 perc anneláció 50 oC 0:30 perc 15 ciklus extenzió 72 oC 1:00 perc végs ı extenzió 72 oC 10 perc hőtés 4 °C ∞

A PCR-ek ciklusszámának csökkentésének oka a „Taq dadogás” (Miller és Yuan 1997) hatásának minimalizálása volt, melynek eredménye lehet az eredetileg egyazon szek- venciából keletkez ı, 1-2 bázis hosszbeli különbséggel rendelkez ı T-RF-ek (terminális restrikciós fragment) megléte.

II FÜGGELÉK

A klónozott génszakaszok felszaporítása PCR-rel mezofil-termofil közösség- összehasonlításban

primerek: M13/pUCf: 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ és M13/pUCr: 5’- CAGGAAACAGCTATGAC-3’

ı A PCR összetétele: A PCR h profilja: reagensek: mintánként: kezdeti denat. 95°C 3 min 10x puffer 2,5 µl anelláció 58°C 30 sec MgCl2 2 µl elongáció 72°C 30 sec 10 ciklus dNTP 5 µl denaturáció 94°C 30 sec dH2O 13,5 µl premix végs ı extenzió 72°C 10 min

344f(-HEX) 0,25 µl hőtés 4°C ∞ 934r 0,25 µl Taq polimeráz 0,5 µl DNS templát 1 µl 25 µl

Ad III. B. 11.

Az etanolos precipitáció menete: 1. Minden emésztett mintához 62,5 µl 95%-os etanolt, 14,5 µl dH 2O-t és 3 µl 3M Na- acetát oldatot (pH=4,6) mértünk. Ezután 20 perces inkubáció következett szobah ımér- sékleten. Ennek során kicsapódik a DNS és a fehérjék is. 2. A csöveket ezután 14000 g-n és 4°C-on, 20 percig centrifugáltuk. 3. A felülúszót leöntöttük, és a pelletekhez 250 µl 70%-os alkoholt adtunk, majd alaposan vortexeltük. 4. A mintákat 14000 g-n 4°C-on 10 percig centrifugáltuk. 5. A 70%-os alkoholban csak a DNS precipitálódik, így a felülúszót leöntve megkapjuk a tisztított mintánkat. 6. Az etanol eltávolításához Jouan RC 10.09. centrifugát használtunk Edwards Modulyo fagyasztva-szárító berendezéssel és vákuumpumpával kiegészítve.

A restrikciós emésztés enzimei és elegyei mezofil-termofil közösség-összehasonlításban

reagens: mintánként: Hasítási Optimális Enzim hely hıfok enzim 0,3 µl Alu I 5' AG ↓CT 37°C premixbe puffer 2 µl Hin 6I 5' G ↓CGC 37°C összemérve dH 2O 9,7 µl Msp I 5' C ↓CCG 37°C fluoreszcensen jelölt templát 8 µl 20 µl A puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/mL BSA

III FÜGGELÉK

A restrikciós emésztés enzimei és elegyei a könnyen bontható szubsztrátok adagolásvizsgálatában.

reagens: mintánként: Hasítási Optimális Enzim hely hıfok enzim 1 µl Hae III 5' GG ↓CC 37°C premixbe össze- puffer 1 µl Msp I 5' C ↓CCG 37°C mérve dH2O 7 µl fluoreszcensen jelölt templát 1 µl 10 µl

MspI puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/ml BSA HaeIII puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA

A restrikciós emésztés enzimei és elegyei a felf őtéses kísérletben

Az elegyek és pufferek összetétele: reagens: mintánként: Hasítási Optimális Enzim hely hıfok enzim 0,3 µl Alu I 5' AG ↓CT 37°C premixbe puffer 2 µl BsuR I 5' GG ↓CC 37°C összemérve dH2O 9,7 µl Msp I 5' C ↓CCG 37°C fluoreszcensen jelölt templát 8 µl 20 µl

AluI puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9), 10 mM Mg-acetát, 66 mM Na-acetát, 0,1 mg/ml BSA MspI (HpaII) puffer: 33 mM Tris-acetát (pH 7,9) 10 mM Mg-acetát, 66 mM K-acetát, 0,1 mg/mL BSA TaqI puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8), 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1 mg/ml BSA

Ad III. B. 14 . A szekvenáló reakció összetétele és h ıprofilja három vizsgálatban

A szekvenáló reakció összetétele: A reakció h ıprofilja: reagensek: mintánként: denaturáció 96°C 10 sec Big DyeTM Terminator 2 µl anelláció 50°C 5 sec 30 ciklus Big Dye puffer 3 µl premixbe extenzió 60°C 4 min dH2O 7 µl összemérve hőtés 4°C ∞ primer 1 µl templát 7 µl 20 µl

A Big Dye TM Terminator oldat (Applied Biosystems) tartalmazza a dezoxi és fluoresz- censen jelölt dideoxi nukleotidokat, a MgCl 2-ot és a módosított Taq polimerázt. A pri- mereket a f ıszövegben ismertetjük.

IV FÜGGELÉK

Ad V. B. 3. 3. Nagy méret ő fák eredeti és származtatott összegváltozókkal:

0.4100 0.6676 0.7060 0.8525 1.000

F/1. ábra. A felf őtéses kísérlet zsírsav és T-RF adatai alapján készült hasonlósági fa a DNS- markerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos láncmód- szer; az 500 leger ısebb kapcsolat változóival). Kék színnel a zsírsavak, pirossal az Alu-, zölddel a Bsu-T-RF-ek neve látható (ha nem is olvasható). A piros keret egy, a f ıszövegben kiemelten tárgyalt farészletet emel ki, a piros nyíl az egyértelm ően párban álló, szintén tár- gyalt izo C 14:0 zsírsav és (Alu149 + 0,4704*Alu194) összegváltozó pozícióját jelöli. A tenge- lyen a korrelációs együttható értékei láthatók.

V FÜGGELÉK

F/2. ábra. A felf őtéses kísérlet menakinon- és zsírsav-adatai alapján készült hasonlósági fa a zsírsav-markerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos láncmódszer; az 500 leger ısebb kapcsolat változóival). Piros színnel a menakinonok, zöld- del a zsírsavak neve látható.

VI FÜGGELÉK

F/3. ábra. A felf őtéses kísérlet T-RF és zsírsav-adatai alapján készült hasonlósági fa a zsír- sav-markerek kéttagú, aránytorzított összegváltozóival (Pearson korreláció, átlagos lánc- módszer; az 500 leger ısebb kapcsolat változóival). Piros színnel az Alu, zölddel a Bsu T- RF-ek neve látható, kékkel a zsírsavak nevei.

VII