UNIVERSITE DE NANTES FACULTE DE PHARMACIE

ANNEE 2013 N° 078

MEMOIRE DU DIPLOME D’ETUDES SPECIALISEES DE PHARMACIE SPECIALISEE

Soutenu devant le Jury interrégional Le 13 novembre 2013 Par Tifenn BOUTARD

Conformément aux dispositions de l’arrêté du 06 Mai 1987 tient lieu de :

THESE POUR LE DIPLOME D’ETAT DE DOCTEUR EN PHARMACIE

EVALUATION DE LA SECURITE D'EMPLOI ET DE

L'EFFICACITE DE L'OXYDE DE ZINC DANS LE DOMAINE DE LA PHOTOPROTECTION TOPIQUE

Président du Jury : Mme Liliane ACAR, Professeur UFR Pharmacie de Rennes

Directeur de thèse : Mme Laurence COIFFARD, Professeur UFR Pharmacie de Nantes

Membres du Jury : Mme Gaëlle QUEREUX, Professeur - Praticien Hospitalier CHU de Nantes M. Nicolas MARIE, Praticien Hospitalier CH Guillaume Régnier de Rennes

Remerciements

REMERCIEMENTS

A Madame Liliane ACAR, Professeur à l'Université de Rennes I, Faculté de Pharmacie, Laboratoire de Pharmacie Galénique et Biopharmacie, Vous me faîtes l’honneur de présider ce jury de thèse. Recevez ici l'expression de mon respect et de ma reconnaissance.

A Madame Laurence COIFFARD, Professeur à l'Université de Nantes, Faculté de Pharmacie, Laboratoire de Pharmacie Industrielle et de Cosmétologie, Je vous remercie d'avoir accepté de diriger ce travail et de m'avoir ouvert les portes de la Cosmétologie. Soyez assurée de ma profonde gratitude.

A Madame Gaëlle QUEREUX, Professeur à l'Université de Nantes, Praticien Hospitalier, Service d'Oncologie-Dermatologie, CHU de Nantes Je tiens à vous adresser mes plus vifs remerciements pour avoir accepté de juger ce travail et pour l'intérêt que vous lui portez. Trouvez ici l'expression de ma respectueuse considération.

A Monsieur Nicolas MARIE, Praticien Hospitalier, CH Guillaume Régnier de Rennes, Je tiens à t'exprimer ma reconnaissance pour avoir accepté de participer à ce jury de thèse avec autant d'enthousiasme. Reçois ici le témoignage de toute mon estime.

Je tiens également à remercier les personnes qui m'ont accueillie au sein de leur équipe de recherche,

Monsieur Christos ROUSSAKIS, Professeur à l'Université de Nantes, Faculté de Pharmacie, Laboratoire Cibles et Médicaments des Infections et du Cancer, Je te remercie pour tes encouragements perpétuels, ta disponibilité et pour la confiance que tu m'as accordée.

Monsieur Thierry DEVERS, Maître de Conférences (HDR) à l'Université d'Orléans, Centre de recherche sur la Matière Divisée - site de Chartres, Je te remercie pour ton aide et ton soutien.

Madame Céline COUTEAU, Maître de Conférences (HDR) à l'Université de Nantes, Faculté de Pharmacie, Laboratoire de Pharmacie Industrielle et de Cosmétologie, Je vous remercie pour vos précieux conseils et pour votre disponibilité.

Remerciements

J'adresse également mes remerciements les plus sincères à l'ensemble du personnel et doctorants des différents laboratoires qu'une partie de ce travail m'a amenée à rencontrer, et plus particulièrement Christophe TOMASONI, Bénédicte ROUSSEAU et Dominique JALABERT. Merci à tous d'avoir consacré du temps à la réalisation de ce travail.

Je remercie chaleureusement Madame le Professeur Brigitte DRENO, Directeur de l'Unité de Thérapie Cellulaire et Génique du CHU de Nantes, pour la chance qu'elle m'a offerte de découvrir et d'évoluer dans le milieu de la Thérapie Cellulaire. Un grand merci à toute l'équipe de cette unité, où je me suis sentie comme en famille durant ces 3 années.

A mes amis,

A ma famille, Véritable pilier de mon bien être. Pour votre présence et votre soutien ; vous avez su à chaque fois m'encourager et me motiver pour que je puisse redoubler d'efforts aux moments opportuns.

A Sosso…

A tous, merci.

Table des matières

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES ...... 4

LISTE DES ABREVIATIONS ...... 8

INTRODUCTION ...... 10

I. Les effets du soleil sur la peau ...... 11 I.1 Rappels de physiologie cutanée ...... 11 I.1.1 L’épiderme ...... 11 I.1.1.1 Les kératinocytes ...... 12 I.1.1.1.1 Le processus de kératinisation ...... 12 I.1.1.1.2 L'organisation stratifiée de l'épiderme...... 13 I.1.1.1.3 La structure de la couche cornée ...... 14 I.1.1.2 Les mélanocytes ...... 14 I.1.1.2.1 Description et rôle des mélanocytes ...... 14 I.1.1.2.2 La synthèse des mélanines ...... 15 I.1.1.2.3 Les différents phototypes ...... 16 I.1.1.3 Les cellules de Langerhans ...... 16 I.1.1.4 Les cellules de Merkel ...... 16 I.1.2 La jonction dermo-épidermique ...... 16 I.1.3 Le derme ...... 17 I.1.4 L’hypoderme ...... 17 I.2 Le rayonnement solaire ...... 18 I.3 Réactions photochimiques au niveau cutané : effets cellulaires des UV ...... 19 I.3.1 Facteurs influençant les réactions photochimiques au niveau cutané ...... 19 I.3.2 Réactions photochimiques et chromophores naturels de la peau ...... 20 I.4 Conséquences biologiques des UV : les effets du soleil sur la peau ...... 21 I.4.1.1 Les effets bénéfiques ...... 21 I.4.1.1.1 La synthèse de la vitamine D ...... 21 I.4.1.1.2 Activité sur l'humeur ...... 23 I.4.1.1.3 Les effets thérapeutiques ...... 23 I.4.1.1.3.1 Principales méthodes : PUVA thérapie et photothérapie UVB ...... 23 I.4.1.1.3.2 Effets et indications des photothérapies ...... 24 I.4.1.1.3.3 Effets indésirables des photothérapies ...... 24 I.4.1.1.4 La pigmentation ...... 25 I.4.1 Les effets néfastes ...... 25 I.4.1.1 L'érythème actinique ...... 25 I.4.1.2 La photo-immunosuppression ...... 26 I.4.1.3 La photocarcinogenèse ...... 27 I.4.1.3.1 Mécanismes de cancérisation médiée par les UV ...... 27

4 Table des matières

I.4.1.3.1.1 Première étape : induction de lésions et de mutations de l'ADN ..... 27 I.4.1.3.1.2 Deuxième étape : initiation et promotion tumorales ...... 28 I.4.1.3.2 Les différents types de cancers cutanés ...... 29 I.4.1.3.2.1 Les carcinomes ...... 29 I.4.1.3.2.2 Les mélanomes ...... 31 I.4.1.4 La photosensibilisation ...... 32 I.4.1.4.1 La réaction phototoxique ...... 32 I.4.1.4.2 La réaction photoallergique ...... 33 I.4.1.5 Le photovieillissement ...... 35

II. La photoprotection topique ...... 36 II.1 Les actifs photoprotecteurs : les filtres solaires ...... 36 II.1.1 La réglementation des filtres solaires ...... 36 II.1.2 Les qualités du filtre solaire idéal ...... 38 II.1.3 Les filtres organiques ...... 39 II.1.3.1 Mécanisme d'action ...... 39 II.1.3.2 Les principales familles de filtres organiques ...... 40 II.1.3.2.1 Les filtres UVB ...... 40 II.1.3.2.1.1 Les dérivés de l'acide para-amino benzoïque ...... 41 II.1.3.2.1.2 Les dérivés de l'acide salicylique ...... 41 II.1.3.2.1.3 Les cinnamates ...... 41 II.1.3.2.1.4 Les dérivés du benzylidène camphre ...... 42 II.1.3.2.1.5 L'octocrylène ...... 42 II.1.3.2.1.6 L'acide phenylbenzimidazole sulfonique ...... 42 II.1.3.2.1.7 Les triazines ...... 42 II.1.3.2.1.8 Le diméthico-diéthylbenzalmalonate ...... 42 II.1.3.2.2 Les filtres UVA ...... 43 II.1.3.2.2.1 Les dérivés du dibenzoylméthane ...... 43 II.1.3.2.2.2 Le diéthylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate ...... 43 II.1.3.2.3 Les filtres à large spectre ...... 43 II.1.3.2.3.1 Les benzophénones ...... 44 II.1.3.2.3.2 Les Mexoryl® ...... 44 II.1.3.2.3.3 Les Tinosorb® ...... 44 II.1.4 Les filtres inorganiques ...... 44 II.2 Efficacité des filtres et produits de protection solaire ...... 46 II.2.1 Evaluation globale de l'efficacité des produits de protection solaire ...... 46 II.2.1.1 Les indices de protection ...... 46 II.2.1.1.1 L'indice de protection dans le domaine UVB ...... 46 II.2.1.1.2 L'indice de protection dans le domaine UVA ...... 47 II.2.1.2 Les méthodes in vivo de détermination des indices de protection ...... 47 II.2.1.2.1 Détermination du SPF ...... 47 II.2.1.2.2 Détermination du FP-UVA ...... 47 II.2.1.3 Les méthodes in vitro de détermination des indices de protection ...... 48 II.2.1.4 Les critères réglementaires d'efficacité des produits de protection solaire . 49

5 Table des matières

II.2.2 Efficacité dans la prévention du photovieillissement ...... 50 II.2.3 Efficacité dans la prévention de la photo-immunosuppression ...... 50 II.2.4 Efficacité dans la prévention des photodermatoses ...... 51 II.2.5 Efficacité dans la prévention des cancers cutanés ...... 51 II.2.5.1 Produits de protection solaire et carcinomes...... 51 II.2.5.2 Produits de protection solaire et mélanomes...... 52 II.2.6 Recommandations de bon usage des produits de protection solaire ...... 53

III. Problématique liée à l'utilisation des nanoparticules de TiO2 et de ZnO dans les produits de protection solaire ...... 54

III.1 Propriétés physicochimiques des nanoparticules de TiO2 et de ZnO ...... 55 III.2 Le problème de la pénétration cutanée ...... 56 III.3 Etudes de cytotoxicité et de génotoxicité ...... 57 III.3.1 Méthodes d'évaluation du potentiel cytotoxique et génotoxique ...... 57 III.3.2 Etudes de cytotoxicité et génotoxicité appliquées aux nanoparticules...... 59

IV. Etude de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans les produits de protection solaire ...... 62 IV.1 Objectifs de l'étude ...... 62 IV.2 Matériels et méthodes ...... 63 IV.2.1 Produits de protection solaire et formes commerciales évalués ...... 63 IV.2.1.1 Produits de protection solaire minéraux...... 63 IV.2.1.2 Formes commerciales d'oxyde de zinc ...... 65 IV.2.2 Caractérisation des formes commerciales d'oxyde de zinc ...... 65 IV.2.2.1 Diffraction des rayons X ...... 65 IV.2.2.1.1 Principe de la méthode ...... 65 IV.2.2.1.2 Conditions expérimentales ...... 66 IV.2.2.2 Microscopie électronique à transmission ...... 67 IV.2.2.2.1 Principe de la méthode ...... 67 IV.2.2.2.2 Conditions expérimentales ...... 68 IV.2.3 Evaluation de la sécurité d'emploi de l'oxyde de zinc ...... 68 IV.2.3.1 Modèle cellulaire...... 68 IV.2.3.1.1 Caractéristiques de la lignée cellulaire ...... 68 IV.2.3.1.2 Entretien des cellules ...... 68 IV.2.3.1.3 Synchronisation des cellules ...... 68 IV.2.3.2 Détermination des concentrations inhibitrices 50 %...... 69 IV.2.3.2.1 Principe de la méthode ...... 69 IV.2.3.2.2 Protocole ...... 69 IV.2.3.3 Cinétiques de croissance continue et discontinue ...... 71 IV.2.3.3.1 Protocole ...... 71 IV.2.3.3.1.1 Cinétiques de croissance continue ...... 71 IV.2.3.3.1.2 Cinétiques de croissance discontinue ...... 73 IV.2.3.4 Observation des changements morphologiques des cellules ...... 73

6 Table des matières

IV.2.3.5 Recherche des cibles moléculaires impliquées dans le phénomène de génotoxicité ...... 73 IV.2.3.5.1 Les cibles moléculaires explorées ...... 73 IV.2.3.5.2 Principe de la méthode ...... 74 IV.2.3.5.3 Protocole ...... 75 IV.2.4 Evaluation de l’efficacité photoprotectrice ...... 76 IV.3 Résultats ...... 77 IV.3.1 Caractérisation des formes commerciales d'oxyde de zinc ...... 77 IV.3.2 Evaluation de la sécurité d'emploi de l'oxyde de zinc ...... 79

IV.3.2.1 Détermination des CI50 ...... 79 IV.3.2.2 Réalisation des cinétiques de croissance cellulaire ...... 79 IV.3.2.3 Observations microscopiques ...... 81 IV.3.2.4 Activité génotoxique ...... 82 IV.3.3 Evaluation de l'efficacité photoprotectrice des produits de protection solaire minéraux ...... 85 IV.4 Discussion ...... 85

CONCLUSION GENERALE ...... 89

LISTE DES FIGURES ...... 90

LISTE DES TABLEAUX ...... 91

REFERENCES ...... 92

ANNEXES ...... 106

7 Liste des abréviations

LISTE DES ABREVIATIONS

3-BC 3-benzylidène camphre 4-MBC 4-méthylbenzylidène camphre 5-MOP 5-méthoxypsoralène 8-MOP 8-méthoxypsoralène 8-Oxo-dG 8-oxo-7,8-dihydroxyguanine ADN Acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire A Absorbance AFSSAPS Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé ARN Acide ribonucléique ARNm ARN messager ARNt ARN total C Cytosine

CI50 Concentration inhibitrice 50 % CBC Carcinome basocellulaire CPD Dimère cyclobutanique de pyrimidine CSC Carcinome spinocellulaire Ct Cycle treshold DEM Dose minimale érythématogène DMSO Diméthylsulfoxyde DRX Diffraction des rayons X ERO Espèces réactives de l'oxygène FDA Food and drug administration FP-UVA Facteur de Protection UVA FP-UVAcnm FP-UVA cancer non mélanocytaire G Guanine IPD Immediate persistent darkening JCPDS Joint Commitee on Powder Diffraction standards INCI International Nomenclature of Cosmetic Ingredients IR Infrarouge LDH Lactate déshydrogénase LPIC Laboratoire de Pharmacie Industrielle et de Cosmétologie MET Microscopie électronique à transmission MMP Métalloprotéinases matricielles MTT Bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium OMC Octylméthoxycinnanmate PABA Acide para-amino benzoïque PBS Phosphate Buffered Saline PCR Réaction de polymérase en chaîne PMMA Polyméthylméthacrylate PPD Persistent pigment darkening

8 Liste des abréviations

PPS Produit de protection solaire PUVA Psoralène ultraviolet A RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR RPMI Rosewell Park Memorial Institute SPF Sun Protection factor SPFcnm SPF cancer non mélanocytaire SVF Sérum de veau fœtal T Thymine TAS Trouble affectif saisonnier

TiO2 Dioxyde de titane UV Ultraviolet ZnO Oxyde de zinc

9 Introduction

INTRODUCTION

La photoprotection topique occupe une place centrale dans la lutte contre les effets néfastes du soleil. Si l’efficacité des filtres et des produits de protection solaire dans la prévention de l’érythème actinique n’est aujourd’hui plus à démontrer, leur rôle vis-à-vis des méfaits à long terme du soleil est également de plus en plus étudié.

Pourtant, l’utilisation de ces produits est régulièrement critiquée en raison d’effets indésirables remettant en cause leur innocuité générale. Depuis 2005, les filtres inorganiques tels que le dioxyde de titane et l’oxyde de zinc sont particulièrement incriminés. Utilisés historiquement sous forme pigmentaire, ils étaient peu appréciés du fait de la coloration blanche inesthétique qu'ils laissaient sur la peau après application et de la sensation granuleuse qu’ils procuraient. Actuellement, les filtres inorganiques sont utilisés sous forme nanoparticulaire, signifiant que les particules qui les composent possèdent au moins une des trois dimensions inférieure à 100 nm. Dans le domaine cosmétique, l’intérêt des nanoparticules repose essentiellement sur les propriétés optiques inédites que les particules peuvent acquérir lorsqu'elles sont de dimensions nanométriques, conduisant à une amélioration de l'efficacité en termes de niveau de photoprotection atteint et de transparence des produits formulés. Néanmoins, le passage à la forme nanométrique soulève de nombreuses interrogations quant à leur profil toxicologique, notamment liées à leur activité photocatalytique qui générerait la formation d’espèces réactives de l’oxygène. L'entrée en vigueur en juillet 2013 du Règlement (CE) N°1223/2009 témoigne de l'évolution réglementaire du statut des nanoparticules dans les produits cosmétiques. En effet, les industriels ont désormais l'obligation de notifier auprès des autorités et d'indiquer la présence de nanoparticules dans les produits cosmétiques.

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au cas de l’oxyde de zinc, oxyde fréquemment rencontré dans les produits de protection solaire bien qu’il ne soit pas inscrit sur la liste des filtres autorisés par le Règlement. Dans une première partie, après des rappels sur les effets du soleil sur la peau et sur l’efficacité des produits de protection solaire, nous aborderons spécifiquement la problématique soulevée par l’utilisation des nanoparticules dans les produits de protection solaire. Dans une seconde partie, nous présenterons les tests in vitro réalisés et les résultats relatifs à l'évaluation de la sécurité d’emploi de différentes formes commerciales d’oxyde de zinc et à l’efficacité photoprotectrice de plusieurs produits de protection solaire dits minéraux.

10 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I. Les effets du soleil sur la peau

I.1 Rappels de physiologie cutanée

La peau représente l'organe le plus important de l'organisme en termes de surface et de poids. Chez un adulte de taille moyenne, sa superficie varie entre 1,5 et 2,0 m2 et elle représente en moyenne 10 % de la masse corporelle totale. Bien plus qu'un organe de revêtement, la peau est le siège de multiples fonctions : fonction de protection, fonction de thermorégulation, fonction sensorielle, fonction d'échange et fonction métabolique.

Il s'agit d'une structure hétérogène, constituée de trois couches tissulaires superposées et communicantes : l'épiderme et le derme séparés par la jonction dermo-épidermique, et l'hypoderme (Figure 1). La peau comprend également plusieurs annexes : les phanères, représentés par les follicules pileux et les ongles, et les glandes sudoripares et sébacées, qui sécrètent respectivement la sueur et le sébum1.

Figure 1 : Représentation 3D de la peau et ses annexes2

I.1.1 L’épiderme

L'épiderme est un épithélium de revêtement pavimenteux, stratifié et kératinisé, en perpétuel renouvellement. Il présente une épaisseur moyenne d'environ 100 µm qui varie en fonction des zones anatomiques. Il est dépourvu de vaisseaux lymphatiques ou sanguins, mais renferme de très nombreuses terminaisons nerveuses libres.

11 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

L'épiderme est constitué de quatre types cellulaires : les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel1.

I.1.1.1 Les kératinocytes

Les kératinocytes représentent 90 % des cellules épidermiques. Ils ont la particularité de se différencier en fabriquant de la kératine, protéine fibreuse qui confère à l'épiderme sa fonction de protection3.

I.1.1.1.1 Le processus de kératinisation

Le processus de kératinisation comprend deux phénomènes simultanés : une migration verticale des cellules et un phénomène de différenciation (Figure 2). Il prend naissance au niveau de la couche basale où existent des cellules souches, ou germinatives, à activité proliférative très élevée. Les cellules filles issues de la multiplication des cellules souches peuvent suivre trois voies différentes : rester quiescentes, être éliminées par un processus de mort cellulaire programmée, l'apoptose, ou s'engager dans un processus de différenciation afin de reconstituer les couches supra-basales de l'épiderme.

Figure 2 : Représentation schématique des principales étapes de la différenciation épidermique4

Au cours de la migration, les kératinocytes se différencient, perdent leur capacité de division et subissent une évolution morphologique qui témoigne de leur kératinisation progressive. Chaque kératinocyte produit dans la couche basale migre vers la surface en 30 jours environ.

12 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.1.1.1.2 L'organisation stratifiée de l'épiderme

Les transformations progressives des kératinocytes ont pour conséquence la formation de différentes couches au sein de l’épiderme (Figure 3).

Figure 3 : Structure des sous-couches de l’épiderme observées en microscopie5

La couche basale ou germinative (Stratum germinativum) est la couche la plus profonde. Elle entre en contact avec la jonction dermo-épidermique. Elle est constituée par une monocouche de cellules prolifératives cubiques, responsables du renouvellement constant des cellules épithéliales de l'épiderme.

La couche épineuse (Stratum spinosum) ou couche du corps muqueux de Malpighi est constituée de 5 à 10 couches de cellules volumineuses et polyédriques. Celles-ci sont solidement attachées les unes aux autres par les desmosomes, qui présentent un aspect en "épines" en microscopie optique. Dès qu’une cellule migre au niveau de la couche épineuse, elle cesse tout cycle de division et commence à se différencier.

La couche granuleuse (Stratum granulosum) est formée de 3 à 4 couches de kératinocytes aplatis. A son niveau sont élaborés les grains de kératohyaline et les corps d’Odland qui sont à l’origine de la formation du ciment lipidique intercellulaire lors de la phase terminale de la kératinisation.

La couche claire (Stratum lucidum) ne s'observe que dans la peau épaisse. Elle est constituée de plusieurs assises de cellules plates et claires.

La couche cornée (Stratum corneum), enfin, est la couche la plus superficielle de l’épiderme. Elle est composée de 25 à 30 couches de cellules aplaties et dépourvues de noyau, les cornéocytes, qui représentent le stade ultime de la kératinisation. La partie la plus profonde, le Stratum compactum ou couche cornée à proprement dite, est constituée de cellules cohésives tandis que la partie la plus superficielle, le Stratum disjonctum, est composée de cellules discohésives. L’ultime étape de la différenciation épidermique correspond à l’élimination des cornéocytes les plus superficiels par le processus de

13 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique desquamation6. Ces dernières cellules, continuellement éliminées, sont alors remplacées par les cellules provenant des couches inférieures.

I.1.1.1.3 La structure de la couche cornée

Le rôle de barrière de la couche cornée résulte non seulement de sa composition mais aussi de son organisation structurale. L’arrangement des cornéocytes au sein de la couche cornée est schématiquement comparé à un mur de briques (Figure 4). Les briques représentent les cornéocytes, qui sont de nature hydrophile du fait de leur richesse en kératine. Les cornéocytes sont entourés par un "ciment" lipophile, essentiellement constitué de céramides (45-50 %), de cholestérol (25 %) et d’acides gras libres (15 %)7, organisé en bicouches alternant des zones hydrophiles et des zones hydrophobes. La cohésion des cornéocytes est de plus assurée par des liens protéiques représentés par les cornéodesmosomes.

Figure 4 : Structure de la couche cornée8

Un film cutané de surface est formé à partir des cornéocytes qui desquament. Il est qualifié de film hydrolipidique car il s'agit d'une émulsion.

I.1.1.2 Les mélanocytes

I.1.1.2.1 Description et rôle des mélanocytes

Les mélanocytes représentent environ 5 à 7 % des cellules épidermiques. Ce sont des cellules étoilées, localisées dans la couche basale de l'épiderme ou dans les follicules pileux. Ils sont présents sur l’ensemble du corps, à l’exception de la paume des mains et de la plante des pieds. Les mélanocytes contiennent des organites spécifiques, les mélanosomes, au sein desquels se produit la synthèse de la mélanine qui est responsable de la pigmentation de la peau. Les mélanosomes migrent le long des prolongements du mélanocyte et sont transférés aux kératinocytes adjacents par exocytose et endocytose. Une "Unité Epidermique de Mélanisation", ou UEM, est constituée d'un mélanocyte et de 36 kératinocytes, auxquels le mélanocyte transfère les mélanosomes9. La mélanine est absorbée par les kératinocytes et va se concentrer autour du noyau afin de protéger leur acide désoxyribonucléique (ADN) vis-à-vis des effets néfastes des UV.

14 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.1.1.2.2 La synthèse des mélanines

Deux types de mélanine, retrouvés en proportions différentes chez l'homme, sont synthétisés au niveau des mélanosomes : les eumélanines et les phaeomélanines (Figure 5).

a) eumélanine, b) phaeomélanine Figure 5 : Structures chimiques des deux types de mélanine

Les mélanines sont produites à partir de la tyrosine qui est convertie en dihydroxyphénylalanine (dopa), puis en dopaquinone sous l'action enzymatique de la tyrosinase (Figure 6).

Dopa : dihydroxyphénylalanine ; DHI : 5,6-dihydroxyindole ; DHICA : 5,6-dihydroxyindole-2 carboxylique ; TRP : tyrosinase-related protein Figure 6 : Les voies de synthèse des mélanines10

A partir de la dopaquinone, les voies de synthèse diffèrent pour les eumélanines et les phaeomélanines. La transformation de la dopaquinone, par une série de réactions successives comprenant, une oxydation, une cyclisation et une polymérisation catalysées par les tyrosinase-related protein TRP-1 et TRP-2, conduit aux eumélanines. Les phaeomélanines, quant à elles, résultent de l'incorporation de composés soufrés (cystéine) dans la dopaquinone et d'une polymérisation10.

15 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Les eumélanines sont des pigments de couleur brune ou noire tandis que les phaeomélanines sont jaunes orangées.

I.1.1.2.3 Les différents phototypes

La population est répartie en six phototypes différents, en fonction de l'intensité de la pigmentation (Tableau 1).

Phototype Couleur de la Couleur des Susceptibilité aux Capacité à peau cheveux coups de soleil bronzer I Très claire Roux Toujours 0 II Très claire Blond Toujours ± III Claire Blond-châtain Souvent + IV Mate Châtain-brun Rarement ++ V Foncée Brun Exceptionnellement +++ VI Noire Brun Jamais +++ Tableau 1 : Les différents phototypes11

Ces phototypes ne sont pas corrélés au nombre de mélanocytes, mais à la quantité et au type de mélanine qu'ils produisent.

I.1.1.3 Les cellules de Langerhans

Les cellules de Langerhans représentent 3 à 5 % des cellules épidermiques3. Ce sont des cellules dendritiques mobiles, principalement localisées au niveau de la couche du corps muqueux de Malpighi. Elles ont pour rôle d'assurer la défense immunologique de la peau : elles captent les antigènes exogènes pour les présenter aux lymphocytes T, après migration jusqu’aux ganglions lymphatiques1.

I.1.1.4 Les cellules de Merkel

Les cellules de Merkel correspondent à la population cellulaire minoritaire de l'épiderme, ne représentant que 1 % des cellules épidermiques. Ce sont des cellules neuroendocrines9, situées dans la couche basale de l'épiderme et inégalement réparties sur le corps. Elles produisent des neuromédiateurs et jouent le rôle de récepteur sensoriel du toucher.

I.1.2 La jonction dermo-épidermique

L'adhérence entre le derme et l'épiderme est assurée par la jonction dermo-épidermique. Elle est élaborée à la fois par les kératinocytes épidermiques basaux et par les fibroblastes dermiques. Elle contrôle les échanges des produits issus du métabolisme entre ces deux couches.

16 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

D'une épaisseur de 1 à 2 µm, la jonction dermo-épidermique apparaît divisée en trois zones distinctes en microscopie électronique, parmi lesquelles se distinguent : - la lamina lucida, située immédiatement sous la membrane plasmique des kératinocytes basaux et dans laquelle on peut distinguer les filaments d’ancrage des hémidesmosomes, composés de collagène de type XVII ; - la lamina densa, plus profonde, constituée de filaments de collagène de type IV ; - la sub-lamina densa, correspondant à la partie la plus superficielle du derme dans laquelle sont situées les fibrilles d’ancrage, principalement constituées de collagène de type VII3. Elle assure la liaison mécanique entre le derme et la lame basale.

I.1.3 Le derme

Le derme est un tissu conjonctif de soutien, à la fois résistant et flexible, dont l'épaisseur varie de 500 µm à 2 mm en fonction de la zone anatomique considérée. Il est pourvu d’une riche vascularisation lymphatique et sanguine et d’un important réseau de terminaisons nerveuses.

Le derme est principalement composé de fibroblastes, entourés d'une matrice extracellulaire qu'ils synthétisent. La matrice extracellulaire est constituée de glycosaminoglycanes qui forment un gel souple très hydraté, auxquels sont associées des fibres protéiques, majoritairement représentées par le collagène et l'élastine. Le collagène, essentiellement de types I et III1, est organisé sous forme de faisceaux assurant la résistance mécanique de la peau12. Les fibres d’élastine, moins nombreuses et plus fines, sont organisées en un maillage souple, conférant élasticité à la peau.

Le derme est subdivisé en deux couches : le derme papillaire, superficiel, en contact avec l'épiderme via la jonction dermo-épidermique et le derme réticulaire, représentant 80 % du derme9, directement en rapport avec l'hypoderme. Ce dernier renferme les annexes pilo- sébacées.

Le derme joue un rôle majeur dans la nutrition et la protection de l'épiderme mais il est également impliqué dans la thermorégulation et la cicatrisation. La présence de leucocytes, de mastocytes et de macrophages lui confère un rôle de défense contre les agents pathogènes.

I.1.4 L’hypoderme

L’hypoderme est la couche la plus profonde de la peau et représente 15 à 20 % du poids corporel1. C'est un tissu conjonctif lâche, constitué par un réseau de cellules graisseuses, les adipocytes, qui sont regroupées sous forme de lobules et attachées au derme par des fibres de collagène et d’élastine. L'hypoderme constitue le plus grand réservoir énergétique de l'organisme. Il joue également un rôle de protection vis-à-vis des chocs et agit comme isolant thermique.

17 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.2 Le rayonnement solaire

Le rayonnement solaire est composé de rayons cosmiques, de rayons gamma, de rayons X, de rayons ultraviolets (200-400 nm), de la lumière visible (400-800 nm), des infrarouges (800-5000 nm) et des ondes radio. Le rayonnement ultraviolet (UV) est divisé en trois zones : les UVC (200-290 nm), les UVB (290-320 nm) et les UVA (320-400 nm), eux- mêmes subdivisés en UVA1 (340-400 nm) et UVA2 (320-340 nm).

Une faible partie du rayonnement solaire parvient jusqu'à la terre. En effet, l'atmosphère terrestre en filtre environ le tiers par absorption, diffusion et réflexion. L'ozone arrête les rayonnements de longueurs d'onde inférieures à 290 nm : rayons cosmiques, rayons gamma, rayons X ainsi que les UVC et les UVB les plus courts (Figure 7). Le spectre solaire au sol se compose ainsi de 56 % d'infrarouges (IR), de 39 % de lumière visible et de 5 % de rayonnement UV (5 % d'UVB et 95 % d'UVA)13.

Figure 7 : Spectre solaire et filtration atmosphérique14

L'ensoleillement reçu par un individu est la résultante du rayonnement solaire direct, du rayonnement diffusé par le ciel et du rayonnement réfléchi par le sol. Il varie en fonction de nombreux facteurs photoclimatologiques tels que l'heure, la saison, la latitude, l'altitude, la couverture nuageuse et atmosphérique ainsi que la nature du substrat (Tableau 2).

Facteur Influence sur l'ensoleillement reçu Heure 30 % de l'énergie UV délivrée entre 13h et 15h Taux maximal d'UVB en juillet dans l'hémisphère nord Saison Intensité supérieure en automne par rapport au printemps Latitude Ensoleillement maximal sous les tropiques Altitude Quantité d'UV augmente de 4 % tous les 300 mètres Couverture nuageuse et Filtration de 2/3 des UV par une couche nuageuse dense pollution atmosphérique Poussières et fumées soulevées par le vent atténuent le visible et les UVA Réflexion par la neige entre 75 % et 95 % > sable 15-45 % > herbe 10-30 % > Nature du substrat eau 5-10 % Tableau 2 : Influence des facteurs photoclimatologiques sur l'ensoleillement reçu par les individus13

18 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.3 Réactions photochimiques au niveau cutané : effets cellulaires des UV

I.3.1 Facteurs influençant les réactions photochimiques au niveau cutané

Les effets cellulaires du rayonnement UV dépendent de la profondeur de la pénétration dans la peau et de son niveau énergétique9.

La pénétration cutanée est proportionnelle à la longueur d'onde du rayonnement incident, et est influencée par les propriétés optiques de la peau. Le trajet intracutané du rayonnement est ainsi modulé par quatre processus principaux15 : - la réflexion : elle est due aux variations des indices de réfraction des milieux rencontrés. Au niveau de la couche cornée, elle s’exerce de façon importante pour les UVA et la lumière visible ; - la diffusion : elle s'effectue par diverses structures telles que molécules, filaments, organites cellulaires, membranes, et essentiellement par la couche cornée et la mélanine qui diffusent les courtes longueurs d'onde ; - l’absorption : elle s'exerce à tous les niveaux de la peau. La couche cornée absorbe essentiellement les UVB par le biais des acides aminés polaires constitutifs de la kératine et la mélanine absorbe principalement le rayonnement visible1 ; - la transmission : elle correspond à la partie du rayonnement pénétrant dans la peau.

Il résulte de ces différents processus que 70 % des UVB sont arrêtés par la couche cornée, 20 % atteignent le corps muqueux de Malpighi et un peu moins de 10 % le derme (Figure 8)3. La majorité du rayonnement UVA et du visible traverse l'épiderme mais, seuls 20 à 30 % atteignent le derme. Les infrarouges, quant à eux, parviennent jusqu'à l'hypoderme.

Figure 8 : Pénétration du rayonnement solaire dans la peau3

L'énergie d'un rayonnement est inversement proportionnelle à sa longueur d'onde. Les radiations ayant les longueurs d'onde les plus courtes sont donc les plus énergétiques et possèdent la plus grande activité biologique. Les UV sont moins pénétrants que le visible

19 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique ou l'IR mais représentent la portion du spectre solaire la plus active sur le plan biologique13.

I.3.2 Réactions photochimiques et chromophores naturels de la peau

Les effets cellulaires des UV sont dus à l'absorption des photons par des molécules cibles, appelées chromophores (Figure 9). En absorbant de l'énergie, ces molécules passent dans un état excité instable (réaction photochimique primaire). La désactivation des états excités (réaction photochimique secondaire) se fait par différentes voies. Elle peut produire des modifications de la structure moléculaire des chromophores eux-mêmes (transformation en photoproduits) ou d'autres molécules ayant accepté l'énergie libérée par les chromophores, notamment l'oxygène moléculaire. Ces modifications se traduisent par des réponses biologiques à plus ou moins long terme.

Figure 9 : Conséquences de l'absorption des rayons UV par un chromophore16

La peau comporte un certain nombre de chromophores, qui peuvent participer à des réactions photochimiques directes ou constituer des photosensibilisants endogènes15.

Les principaux chromophores "directs" sont l'ADN, l'acide urocanique, les protéines, les eumélanines et les kératines. Au niveau de l'ADN, les dommages portent essentiellement sur les bases pyrimidiques.

Les photosensibilisants endogènes tels que les riboflavines, les flavines, les bilirubines, les phaeomélanines et les porphyrines sont issus du métabolisme cellulaire. Ils sont à l'origine de réactions photochimiques secondaires dont les plus importantes sont représentées par le transfert de leur énergie à l'oxygène, aboutissant à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) : oxygène singulet, anion superoxyde, peroxyde d'hydrogène et radical hydroxyle. Ces ERO sont des espèces à haute réactivité biologique qui produisent un stress oxydant capable de modifier le métabolisme cellulaire.

20 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Elles ont trois grandes cibles biologiques17 : - les membranes cellulaires : sous l'effet des ERO, les acides gras polyinsaturés, constituants principaux des membranes cellulaires, subissent des réactions en chaîne (lipopéroxydation) qui dénaturent leur structure. Les membranes cellulaires sont alors altérées voire détruites ; - les protéines et enzymes : les ERO provoquent des modifications structurelle et fonctionnelle des protéines et enzymes ; - les acides nucléiques : les ERO induisent des cassures de chaînes, des pontages nucléobases ou l'oxydation de bases qui sont à l'origine de mutations ou de perturbation de la synthèse des protéines.

Les UVB ont une action délétère directe sur l'ADN, l'acide urocanique et les protéines. Ils peuvent également générer des ERO. Les UVA sont essentiellement à l'origine de réactions de photosensibilisation via les photosensibilisants endogènes avec production d'ERO. Cependant, il a été démontré que les principaux dommages exercés par les UVA au niveau de l'ADN ne sont pas liés à une oxydation. Comme pour les UVB, ils consistent en la formation de dimères de pyrimidine18.

I.4 Conséquences biologiques des UV : les effets du soleil sur la peau

Les actions UV-induites sur les différents types cellulaires conduisent à des effets biologiques variés à l'échelle de la peau, parfois bénéfiques mais le plus souvent néfastes, et qui s’exercent à court et à long terme (Tableau 3).

Effets bénéfiques Effets néfastes Synthèse de vitamine D Précoces : érythème Activité sur l'humeur Retardés : érythème actinique, photo- immunosuppression Effets thérapeutiques Long terme : vieillissement cutané photo-induit, photocarcinogenèse Tableau 3 : Effets bénéfiques et néfastes du soleil sur la peau

I.4.1.1 Les effets bénéfiques

I.4.1.1.1 La synthèse de la vitamine D

La vitamine D existe sous deux formes : la vitamine D2 ou ergocalciférol, produite par les végétaux, et la vitamine D3 ou cholécalciférol, produite par les animaux. Chez l'homme, toutes deux exercent les mêmes activités biologiques puisqu'elles sont converties en métabolite actif, la 1,25-dihydroxy-vitamine D. La vitamine D peut être apportée par l'alimentation, mais elle provient essentiellement de la synthèse cutanée sous l'action des UVB. L'effet bénéfique de l'ensoleillement résulte donc de l'action des UVB sur le métabolisme de la vitamine D3 endogène.

Lors de l'exposition solaire, les UVB agissent sur les membranes des kératinocytes en provoquant la photolyse du 7-déhydrocholestérol (provitamine D3) en prévitamine D3

21 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

(Figure 10). Sous l'effet de la chaleur, la prévitamine D3, thermodynamiquement instable, s'isomérise rapidement en vitamine D3. Néanmoins, une exposition prolongée au soleil n’entraîne pas d’hypervitaminose. En effet, la prévitamine D3 étant très thermolabile, elle est rapidement convertie par photolyse en dérivés biologiquement inactifs, lumistérol et tacalcitol. Une exposition de 15 minutes des mains et du visage à la lumière solaire est suffisante pour assurer les besoins quotidiens en vitamine D19.

20 Figure 10 : Formation de la vitamine D3 dans la peau

Plusieurs facteurs individuels et environnementaux influencent la production cutanée de vitamine D. Le vieillissement s'accompagne d'une diminution de la concentration en 7- déhydrocholestérol dans les kératinocytes. Après une même exposition solaire, l'augmentation de la concentration en vitamine D3 circulante est quatre fois moins importante chez des sujets âgés de 62 à 80 ans que chez des adultes jeunes21. Par ailleurs, le phototype joue un rôle important dans l'adaptation de la durée d'exposition solaire aux besoins. Pour une même dose d'UVB, la quantité de vitamine D formée est d'autant plus faible que la densité en mélanine est élevée. Les sujets à peaux noires ou mates sont donc plus susceptibles de développer des carences en vitamine D22 que les personnes à peaux claires. Les facteurs influençant l'intensité des UVB tels que la latitude, la saison, la pollution et l'heure de la journée affectent également la production de vitamine D.

La vitamine D, d’origine endogène ou exogène, est une pro-hormone. Afin d'acquérir son activité biologique, elle subit deux hydroxylations, la première au niveau du foie, la seconde au niveau des reins. Le rôle majeur de la vitamine D active est le maintien de l’homéostasie phosphocalcique, mais elle est également impliquée dans des processus de prolifération et de différenciation cellulaires. Elle entraîne une diminution de la prolifération des kératinocytes souches indifférenciés, une inhibition de la prolifération des fibroblastes, et stimule la mélanogenèse. Enfin, des arguments épidémiologiques et expérimentaux suggèrent le rôle antitumoral de la vitamine D dans différentes formes de cancer23, 24, 25, 26. La vitamine D et ses analogues entraîneraient une inhibition de la prolifération des cellules tumorales humaines en culture et une inhibition de la carcinogenèse expérimentale chez l'animal.

22 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.4.1.1.2 Activité sur l'humeur

Le trouble affectif saisonnier (TAS), également appelé dépression saisonnière, correspond à une très forte sensibilité au changement de saison pendant l'automne et l'hiver et ce jusqu'au printemps. Il touche principalement les femmes, entre 25 et 50 ans. Dans les formes les plus sévères, les manifestations sont caractéristiques d’une dépression (réduction des possibilités intellectuelles, troubles de l’humeur, somnolence diurne, anxiété, prise de poids) mais la TAS s’en distingue par une hypersomnie et une hyperphagie élective pour les glucides27. Des formes cliniques monosymptomatiques ou mineures, le winter blues, sont également possibles.

Les mécanismes de ce trouble ne sont pas encore totalement élucidés. Une première hypothèse avançait que la mélatonine était à l'origine des TAS. Il s'agit d'une hormone sécrétée par l’hypophyse, qui renseigne l'organisme sur l'alternance jour/nuit. Il est actuellement question d'un dysfonctionnement des transporteurs intracellulaires de la sérotonine28. Cette dernière est un neuromédiateur formé dans l’épiphyse à partir du tryptophane, et dont le déficit est à l’origine de nombreuses dépressions.

Un des traitements consiste à exposer le patient de façon quotidienne à une source artificielle de lumière, en utilisant une lampe à spectre et intensité définis. La luminothérapie s'avère efficace contre les TAS dans environ 80 % des cas29. La stimulation lumineuse des yeux inhibe la voie de dégradation de la sérotonine et tend donc à en augmenter le taux.

I.4.1.1.3 Les effets thérapeutiques

De nombreuses dermatoses sont aujourd'hui traitées grâce à l'action thérapeutique de la lumière, la photothérapie. Elle utilise les effets UV-induits qui conduisent à des effets bénéfiques pour une peau pathologique. Il existe plusieurs méthodes, toutes régies par des recommandations et des bonnes pratiques.

I.4.1.1.3.1 Principales méthodes : PUVA thérapie et photothérapie UVB

La PUVA thérapie est une technique de photochimiothérapie reposant sur une irradiation UVA large spectre après administration d'une molécule photosensibilisante, à savoir un psoralène. Le terme "PUVA thérapie" est l'acronyme formé à partir des initiales Psoralène Ultraviolet A.

Les psoralènes sont des isomères de la famille des furocoumarines, molécules synthétiques, pour certaines présentes à l'état naturel dans de très nombreuses plantes dont elles peuvent être extraites. En France, les psoralènes actuellement utilisés sont le 5- méthoxypsoralène (5-MOP) et le 8-méthoxypsoralène (8-MOP) (Figure 11).

23 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

a) 5-MOP, b) 8-MOP Figure 11 : Structures chimiques des psoralènes

Les psoralènes provoquent deux types de réactions lorsqu'ils sont soumis à une irradiation UV30. La première est une réaction de photosensibilisation directe et indépendante de l'oxygène, qui consiste en la formation de photoproduits avec l'ADN, responsables d'une inhibition de la synthèse de l'ADN. Elle est à l'origine de l'utilisation thérapeutique des psoralènes. La seconde est responsable d'effets indésirables. Il s'agit d'une réaction indirecte, dépendante de l'oxygène, qui aboutit à la formation d'ERO. En fonction du mode d'administration des psoralènes se distinguent la PUVA orale, la PUVA locale et la balnéo PUVA31.

La photothérapie UVB a été la première photothérapie utilisée. Il s'agit d'une exposition directe de la peau au rayonnement sans photosensibilisant. En fonction du spectre de la source lumineuse se différencient la photothérapie UVB à large spectre et celle à spectre étroit. Il existe également des photothérapies UVA et UVAB.

I.4.1.1.3.2 Effets et indications des photothérapies

L'effet antiprolifératif des UV résultant des lésions directes ou indirectes de l'ADN et de l'altération des membranes est mis à profit dans le traitement du psoriasis, dermatose caractérisée par une accélération de la cinétique kératinocytaire. L'effet apoptotique concerne les différentes cellules cutanées (kératinocytes, lymphocytes, cellules de Langerhans). L'apoptose des lymphocytes est bénéfique dans le traitement des lymphomes cutanés31. L'effet immunosuppresseur des UV est utilisé pour le traitement des dermatoses associées à des désordres immunologiques. L'effet immunosuppresseur local au niveau des kératinocytes interfère avec la production de cytokines, autre composante expliquant le mécanisme des photothérapies dans le traitement du psoriasis30. L'inactivation des cellules de Langerhans peut expliquer le mode d'action pour le traitement des dermatites de contact32.

I.4.1.1.3.3 Effets indésirables des photothérapies

Les photothérapies sont responsables d'effets indésirables précoces et tardifs. Les effets indésirables précoces sont nombreux. Il s'agit notamment de sécheresse cutanée, de prurit et de réactions phototoxiques33. La PUVA thérapie est fortement déconseillée pendant la

24 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique grossesse, bien qu'aucune malformation congénitale n'ait été observée. Les effets indésirables tardifs se traduisent par un vieillissement cutané précoce, commun aux deux méthodes et un risque de cataracte, de troubles de la pigmentation et une diminution des fonctions immunitaires spécifiques de la PUVA thérapie34. La survenue de cancers cutanés représente le risque le plus préoccupant. Les risques de développer un carcinome spinocellulaire suite à la PUVA thérapie ont été établis35. Ils sont dose-dépendants et fonction du phototype et de l'âge du patient à l'initiation de la PUVA thérapie. L'augmentation du risque de développer un carcinome basocellulaire est significative, mais modérée. Le risque à long terme des photothérapies UVB n'a pas fait l'objet d'évaluation clinique globale et reste non clairement défini.

I.4.1.1.4 La pigmentation

Le rayonnement UV provoque deux types de pigmentation.

La pigmentation immédiate ou phénomène de Meirowski, d'une part, est induite par les UVA. Elle est la conséquence de la photo-oxydation des précurseurs de la mélanine13. Il s'agit d'une pigmentation fugace, quasiment invisible chez les sujets à peaux claires. Elle disparaît en quelques heures après arrêt de l'exposition, de manière très rapide initialement puis elle se stabilise après la première heure36.

La pigmentation retardée ou bronzage, d'autre part, est induite par les UVB, et à moindre mesure par les UVA. Elle apparaît deux ou trois jours après exposition. Elle est provoquée par un ensemble d'événements tels que l'augmentation du nombre de mélanocytes et de mélanosomes et l'accélération du transfert des mélanines aux kératinocytes. Ces événements sont activés après réparation des lésions UV-induites directes de l'ADN et après stimulation indirecte de la production de deux hormones par les kératinocytes, l'α- melanocyte stimulating hormone (αMSH) et l'adrénocorticotrophine (ACTH), qui sont de puissants activateurs de la mélanogenèse13. Si le bronzage peut être considéré comme un plaisir, il résulte bien d'une agression par les UV et peut donc à ce titre être classé comme un effet néfaste du soleil.

I.4.1 Les effets néfastes

I.4.1.1 L'érythème actinique

L'érythème actinique, communément appelé coup de soleil, survient quelques heures après l'exposition solaire, pour atteindre son intensité maximale à la 24ème heure. Il est essentiellement provoqué par les UVB. Les UVA induisent également un érythème mais à des doses 1000 fois supérieures37, et peuvent avoir un rôle photo-aggravant sur l’érythème UV-induit. Les longueurs d’onde les plus susceptibles d’induire des érythèmes sont comprises entre 306 et 310 nm38.

25 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Cliniquement, il existe quatre degrés d'intensité de l'érythème : - 1er degré : érythème rose pâle apparaissant entre la 6ème et la 24ème heure et qui s’efface en 48 heures sans desquamation ni pigmentation ; - 2ème degré : érythème rouge vif, légèrement douloureux, apparaissant entre la 2ème et 12ème heure et qui disparaît en 72 heures en laissant une légère desquamation et une pigmentation transitoire ; - 3ème degré : érythème cyanique avec œdème apparaissant entre la 2ème et la 6ème heure et qui entraîne une desquamation importante suivie d’une pigmentation durable ; - 4ème degré : décollements bulleux, correspondant à une brûlure du second degré, s’accompagnant de douleur et de signes généraux, et qui entraînent une desquamation intense pouvant laisser place à une pigmentation séquellaire.

L'érythème induit par les UVB est un phénomène biphasique. La phase immédiate, transitoire, se caractérise par une vasodilatation des vaisseaux dermiques, suite au relargage de substances vaso-actives. Lors de la phase retardée apparaissent les sunburn cells, ou cellules photodyskératosiques, qui correspondent à des kératinocytes en apoptose39. Les UVA induisent un érythème immédiat très fugace, suivi d’un érythème plus tardif, sans apparition de sunburn cells.

I.4.1.2 La photo-immunosuppression

Les UV exercent leur effet immunosuppresseur à différents niveaux de la réponse immunitaire. Les cellules de Langerhans, principales cellules de l'immunité cutanée, activent la voie lymphocytaire effectrice par présentation d'un antigène après migration jusqu'aux ganglions lymphatiques. Sous l'effet des UVA ou des UVB, elles subissent des altérations morphologiques et fonctionnelles40, conduisant à des anomalies de migration vers les ganglions lymphatiques et à l'induction préférentielle de la prolifération de lymphocytes Th2 producteurs des cytokines immunorégulatrices IL-4 et IL-10. Sous l'action des UV, les kératinocytes sécrètent de multiples médiateurs solubles ayant des activités inflammatoires (TNFα et IL-6) et immunomodulatrices (IL-10). Les UV provoquent la migration de macrophages et de mastocytes du derme vers l'épiderme41. L'histamine libérée par les mastocytes exerce un effet inhibiteur systémique sur les réactions d'hypersensibilité de contact.

Ces effets sont la conséquence des actions directe et indirecte des UV sur certains chromophores de la peau, l'ADN et l'acide urocanique42. La formation de dimères de pyrimidine dans l'ADN des kératinocytes et des cellules de Langerhans serait à l'origine respectivement de la synthèse anormale des médiateurs et de la modification de l'activité de gènes impliqués dans le processus de présentation antigénique. L'acide urocanique est synthétisé dans la couche cornée sous forme trans. Après absorption des UV, il subit une photo-isomérisation en acide cis-urocanique, responsable notamment de la libération d'histamine par les mastocytes et de la modification des capacités de présentation antigénique des cellules de Langerhans.

26 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

La photo-immunosuppression est responsable de l'aggravation de certaines manifestations d'origine infectieuse et d'un effet promoteur sur le développement des cancers cutanés. Cependant, en provoquant une tolérance aux antigènes de contact et en modulant les réactions inflammatoires, elle présente un effet bénéfique sur le plan thérapeutique dans le cadre des photothérapies.

I.4.1.3 La photocarcinogenèse

La photocarcinogenèse se définit comme l'ensemble des phénomènes provoqués par le soleil ou par des sources lumineuses artificielles, aboutissant à la survenue de tumeurs cutanées. Les cancers cutanés sont parmi les plus fréquents des cancers humains. Il en existe deux grands types : les carcinomes (basocellulaires et spinocellulaires) développés aux dépens des cellules épidermiques et les mélanomes, développés aux dépens des mélanocytes.

I.4.1.3.1 Mécanismes de cancérisation médiée par les UV

I.4.1.3.1.1 Première étape : induction de lésions et de mutations de l'ADN

Les UVB sont capables d'entraîner des lésions directes de l'ADN. Ces lésions sont majoritairement représentées par les dimères cyclobutaniques de pyrimidine (CPD), et les photoproduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PP) (Figure 12a, b). L’énergie absorbée au niveau de deux pyrimidines (cytosine (C) ou thymine (T)) adjacentes conduit à la formation d’une liaison covalente entre ces deux bases, au détriment des liaisons hydrogène établies entre deux bases complémentaires. Ces lésions, si elles ne sont pas correctement réparées, sont à l'origine de mutations. La majorité des mutations observées sont des transitions C → T43. La présence simultanée de transitions en tandem CC → TT constitue la véritable "signature" de la mutagenèse UVB, car ce type de mutation est une caractéristique quasiment exclusive de l’effet de ce rayonnement44.

a) CPD, b) 6-4 PP c) 8 oxo-dG, T = Thymine, C = Cytosine Figure 12 : Lésions de l'ADN UV-induites45

27 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

L'irradiation UVA induit des dommages à l'ADN de type indirect. Les bases de l'ADN sont particulièrement sensibles à l'oxydation. La 8-oxo-7,8-dihydroxyguanine (8-Oxo-dG, Figure 12c) est ainsi formée par oxydation de la guanine (G) par une réaction de photosensibilisation. Cette lésion est responsable de mutations qui sont des transversions G→ T46. Des études récentes ont prouvé que les UVA peuvent être également responsables de la formation de CPD18.

I.4.1.3.1.2 Deuxième étape : initiation et promotion tumorales

Les mutations causées par les UV sont responsables à la fois d'un dysfonctionnement des mécanismes protégeant le génome (inhibition de gènes suppresseurs de tumeurs) et d'une autonomisation de la prolifération cellulaire (activation de proto-oncogènes)47.

Le gène P53, qualifié de "gardien du génome", joue un rôle déterminant dans la défense contre les UV48 en favorisant la réparation de l'ADN lésé et en éliminant les cellules altérées. Le cycle cellulaire est classiquement divisé en quatre phases : G1, S, G2 et M. Elles correspondent respectivement à la synthèse des protéines, la synthèse ou réplication de l'ADN, la vérification de la réplication de l'ADN et à la division cellulaire ou mitose. D'une manière générale, après un stress génotoxique, la protéine p53 provoque à court terme un arrêt du cycle cellulaire en phase G1. Ce blocage permet la réparation des lésions de l'ADN avant la phase S de synthèse de l'ADN. A long terme, la protéine p53 stimule des gènes qui interviennent dans l'apoptose afin de provoquer la mort des cellules dont l'ADN a été mal réparé et qui sont capables d'évoluer vers une transformation cancéreuse.

Les mécanismes génétiques et moléculaires impliqués dans les carcinomes et les mélanomes sont distincts. Les mutations du gène P53 interviennent dans les carcinomes spinocellulaires et basocellulaires, et sont retrouvées dans respectivement 90 % et 50 % des cas49. Elles apparaissent comme un événement précoce puisqu'elles s'observent déjà dans les lésions précancéreuses, en particulier les kératoses actiniques50. L'inactivation fonctionnelle de la protéine p53 accroît donc la probabilité de mutations d'autres gènes et interfère avec l'élimination des cellules lésées par apoptose. Après chaque exposition au soleil, les cellules normales dont l'ADN porte des lésions irréparables sont éliminées par apoptose, tandis que les cellules lésées appartenant à un clone dont la protéine p53 fonctionne mal se multiplient et prennent les places laissées vacantes par la disparition des premières51. Une irradiation UV chronique stimule la prolifération des cellules initiées. En son absence, les clones et les lésions précancéreuses régressent. D'autres gènes, notamment les gènes de la famille Ras, peuvent être mutés.

28 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Le rôle central de la protéine p53 est résumé dans la figure 13.

Figure 13 : Rôle de la protéine p53 dans la photocarcinogénèse47

Dans les mélanomes familiaux, les anomalies génétiques les plus fréquentes sont les mutations du gène cyclin-dependent kinase inhibitor 2 (aCDKN2A), retentissant sur deux voies de contrôle du cycle cellulaire. Les mutations des oncogènes BRAF et NRAS sont retrouvées dans 25 à 70 % des mélanomes13.

L'action immunosuppressive des UV joue également un rôle important dans la promotion tumorale. En réduisant les mécanismes d'immunosurveillance des cancers, elle permet la croissance du clone tumoral en formation52.

I.4.1.3.2 Les différents types de cancers cutanés

I.4.1.3.2.1 Les carcinomes

Les carcinomes, parmi lesquels se distinguent les carcinomes basocellulaires et les carcinomes spinocellulaires, représentent 90 % des cancers cutanés. L'exposition solaire est le facteur étiologique majeur des carcinomes.

Le carcinome basocellulaire (CBC) est le cancer cutané le plus fréquent. Il représente environ 30 % des cancers de l'adulte53. Il survient dans la grande majorité des cas après l'âge de 50 ans. Le CBC est principalement localisé sur les zones photo-exposées et se développe le plus souvent de novo. Parmi les facteurs de risque se distinguent les expositions solaires intermittentes, les phototypes I et II, et l'immunodépression54.

29 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Il existe plusieurs formes cliniques et histologiques de CBC qui conditionnent leur gravité. Le carcinome basocellulaire nodulaire est la forme clinique la plus fréquente. Il apparaît sous la forme d'une papule lisse et translucide, recouverte de télangiectasies (dilatation anormale des vaisseaux sanguins situés près de la surface cutanée) (Figure 14).

Figure 14 : Carcinome basocellulaire nodulaire54

Le carcinome basocellulaire superficiel, quant à lui, apparaît le plus souvent sur le tronc ou les membres sous la forme d'une plaque érythémateuse plane et bien limitée. Le carcinome basocellulaire sclérodiforme, enfin, est une forme plus rare, localisée principalement sur le visage. Il présente l'aspect d'une cicatrice sous la forme d'une plaque blanchâtre dure aux limites imprécises.

Le CBC ne métastase que très rarement mais le risque de récidive est important. Sur 5 ans, il a été évalué à 48,9 %55. La prise en charge thérapeutique doit tenir compte de facteurs pronostiques tels que la localisation, la taille, les types histologiques et l'évolutivité. La chirurgie par exérèse est le traitement de première intention des CBC tandis que la chimiothérapie s'adresse aux formes métastatiques, extrêmement rares.

Le carcinome spinocellulaire (CSC) représente le deuxième cancer cutané en fréquence, mais il est responsable de la majorité des décès imputables aux cancers cutanés hors mélanomes56. Il apparaît généralement après l'âge de 60 ans, sur les zones photo-exposées. Le facteur étiologique le plus fréquemment retrouvé est l'exposition solaire chronique. Les sujets de phototypes I et II sont les plus sensibles. Le deuxième agent carcinogène du CSC est l'infection à papillomavirus dont les gènes viraux sont capables d'inactiver le gène P5357. La plupart des CSC apparaissent sur des lésions précancéreuses, les kératoses actiniques. Ils se présentent sous la forme d'une lésion infiltrée pouvant s'ulcérer et former une plaie irrégulière à bordure surélevée (Figure 15).

Figure 15 : Carcinome spinocellulaire58

30 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Sur le plan évolutif, le CSC possède un potentiel métastatique estimé à 2,3 % à 5 ans56. Les facteurs pronostiques sont la taille, la localisation, l'épaisseur et la profondeur de l'invasion de la tumeur, la récidive locale et l'immunodépression. La chirurgie par exérèse est le traitement de choix des CSC59. La radiothérapie est réservée aux tumeurs de grande taille chez des patients inopérables. La chimiothérapie n'a qu'une place limitée dans le traitement des CSC, puisqu'ils sont peu chimiosensibles.

I.4.1.3.2.2 Les mélanomes

Les mélanomes, qui ne représentent que 5 % des cancers cutanés, sont les plus agressifs en raison d'un potentiel métastatique important. Leur incidence est en constante augmentation dans tous les pays développés, expliquant la diffusion de campagnes de sensibilisation contre les effets néfastes du soleil. En effet, elle double tous les dix ans environ. L'âge moyen d'apparition est de 56 ans chez la femme contre 58 chez l'homme.

L'exposition solaire représente le risque majeur de survenue du mélanome, bien qu'il ne soit pas exclusif puisque des formes de mélanomes apparaissent sur des zones non photo- exposées. Les expositions intermittentes et la survenue de coups de soleil pendant l'enfance semblent être des facteurs de risque supérieurs à des expositions chroniques60. Des facteurs génétiques peuvent expliquer la survenue des mélanomes. La fréquence des formes familiales est estimée à 10 %61. Les individus de phototypes I et II ou présentant des naevi atypiques sont également des sujets à risques60, 62.

Cliniquement, le mélanome apparaît au stade précoce comme une tache colorée avec des nuances de noir et brun de quelques millimètres, souvent asymétrique et aux bords irréguliers. Des modifications évolutives se traduisant en termes de taille, de forme, de contour et de coloration constituent un élément diagnostic (Figure 16).

a) grain de beauté normal, mélanomes b) au stade intermédiaire et c) au stade avancé Figure 16 : Grain de beauté versus mélanome63

Ces aspects cliniques sont à l'origine des cinq critères de diagnostic clinique précoce du mélanome, résumés dans le tableau 4. Néanmoins, seule l'analyse histologique de la lésion cliniquement suspecte permet de confirmer le diagnostic de mélanome cutané.

31 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Critères Définition Asymétrie Une lésion bénigne sera habituellement symétrique alors qu’un mélanome est plus souvent asymétrique par rapport à ses deux axes Bords irréguliers Une lésion bénigne a des bords bien nettement tracés et des contours harmonieux. Un mélanome aura des limites plus floues et des contours plus déchiquetés Couleur Une lésion bénigne est généralement d’une seule couleur alors que dans un mélanome inhomogène coexistent des plages brun foncé, brun clair, noires, rougeâtres ou chamois et parfois blanches Diamètre Supérieur à 6 mm Extensivité Alors que la taille d’une liaison bénigne est habituellement stable, le mélanome se caractérise par une augmentation progressive de sa surface Tableau 4 : L'abécédaire du mélanome64

Le risque évolutif est celui de la survenue de métastases plus ou moins tardives. Le pronostic du mélanome varie en fonction du stade de la maladie. Au stade de tumeur primitive, le taux de survie à 5 ans est d'environ 72 %, taux qui chute à 10-15 % au stade métastatique65. La poursuite des campagnes d'information du grand public motivant les consultations de dépistage précoce est donc de première importance.

Un diagnostic au stade métastatique impose un traitement de type chimiothérapie, principalement par la dacarbazine, tandis que la radiothérapie est peu intéressante. Depuis une quinzaine d'années, l'immunothérapie spécifique est une thérapeutique en plein essor66.

I.4.1.4 La photosensibilisation

La photosensibilisation se définit comme l’ensemble des phénomènes pathologiques liés à l’interaction d’une substance photosensibilisante contenue dans la peau (chromophore) et d’une longueur d’onde efficace. La substance photosensibilisante peut provenir d’un trouble métabolique provoquant une photosensibilisation endogène, ou d’une substance introduite dans l’organisme, par voie systémique ou par contact, entraînant une photosensibilisation exogène. La photosensibilisation se traduit par deux types de réactions : les réactions phototoxiques et les réactions photoallergiques. Les UVA en pénétrant plus profondément que les UVB dans la peau, sont les radiations qui activent la plupart des agents photosensibilisants.

I.4.1.4.1 La réaction phototoxique

La réaction phototoxique est une réaction pouvant survenir chez tous les individus, dès la première exposition. Elle nécessite la présence d'une substance phototoxique en concentration élevée dans la peau et un temps d’exposition à la lumière suffisant. La plupart de ces réactions sont des réactions photodynamiques dépendantes de l'oxygène résultant de la production d'ERO lors de la désexcitation de la molécule photosensibilisante. Certaines réactions phototoxiques, dans le cas des psoralènes par exemple, peuvent être indépendantes de l'oxygène.

32 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

La réaction phototoxique se manifeste principalement par un érythème intense et/ou un œdème évoquant un coup de soleil, strictement localisé aux zones exposées et imprégnées de la substance photosensibilisante. L'apparition peut être immédiate ou retardée. La disparition de l’érythème s’accompagne d'une desquamation et éventuellement d’une hyperpigmentation durable67.

Plusieurs autres formes cliniques existent, en fonction de la substance photosensibilisante incriminée (Figure 17).

a) dermite des prés, b) dermite pigmentaire en breloque, c) photo-onycholyse, d) pseudoporphyrie Figure 17 : Différentes formes cliniques de la réaction phototoxique15

La dermite des prés est une photodermatose liée à un contact avec des végétaux riches en fucocoumarines. Après quelques heures, une éruption érythémateuse bulleuse apparaît (Figure 17a). La dermite pigmentaire en breloque est une réaction phototoxique secondaire à l’application de certaines huiles essentielles, incorporées dans les parfums et dans certains produits cosmétiques. Elle se caractérise par une pigmentation en coulée, pouvant persister pendant des mois68 (Figure 17b). La photo-onycholyse induite par certains médicaments tels que les tétracyclines, les contraceptifs oraux ou encore la quinine provoque le décollement plus ou moins complet du bord distal de l’ongle (Figure 17c). Enfin, la pseudo-porphyrie est la forme de phototoxicité la plus sévère. Elle a été décrite avec des médicaments tels que les tétracyclines, les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les diurétiques, l’amiodarone, la pyridoxine et la dapsone69. Elle se manifeste préférentiellement au niveau du dos des mains par des bulles, des érosions cutanées et des cicatrices pouvant persister plusieurs mois après l'arrêt du traitement (Figure 17d).

I.4.1.4.2 La réaction photoallergique

La réaction photoallergique, ou photo-immunologique, est plus rare. Il s'agit d'une réaction d'hypersensibilité à médiation cellulaire. Elle nécessite une sensibilisation préalable et ne survient que chez des sujets prédisposés. Elle est indépendante de la dose de substance photosensibilisante.

33 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

La réaction photoallergique est la conséquence de la production d'un photoantigène qui peut se former par deux mécanismes68. Dans le premier cas, l'absorption des UV par l'agent photosensibilisant conduit à la formation de photoproduits stables pouvant se coupler avec une protéine tissulaire. Dans le second cas, la substance photosensibilisante excitée par absorption des UV va libérer de l'énergie à son retour à l'état fondamental, facilitant son couplage avec la protéine porteuse. Le photoantigène ainsi formé est pris en charge par les cellules de Langerhans qui le présentent aux lymphocytes thymo-dépendants sécréteurs de cytokines70.

L'aspect clinique caractéristique est un ezcéma érythémateux, parfois vésiculeux et prurigineux. Il siège au niveau des zones photo-exposées mais peut s'étendre aux zones couvertes lors d'agressions répétées. Lorsque le photoallergène responsable n'est plus en contact, l'évolution est prolongée avec une régression progressive des lésions.

Les substances susceptibles d'induire des réactions photoallergiques sont variées. Les filtres solaires contenus dans les produits cosmétiques sont régulièrement incriminés71. Parmi les médicaments, les cas de photoallergie de contact aux anti-inflammatoires non stéroïdiens comme le kétoprofène sont nombreux72, 73. Ce dernier est à l'origine de réactions croisées avec l'acide tiaprofénique, le fénofibrate et l'oxybenzone, en raison d'une analogie structurale. Des cas de photoallergies sont essentiellement rapportés avec le fénofibrate, les anti-ulcéreux, les diurétiques thiazidiques et la simvastatine administrés par voie systémique69.

Le tableau 5 résume les principales différences entre réaction phototoxique et réaction photoallergique.

Critère Phototoxicité Photoallergie Fréquence Elevée (collective) Faible (individuelle) Survenue Possible dès la première exposition Après une phase de sensibilisation Quantité de photosensibilisant Grande Petite Début après exposition au Minutes à heures 24 heures ou plus photosensibilisant et lumière Aspect clinique usuel "Coup de soleil" Eczéma Exclusivement sur les zones photo- Zones photo-exposées pouvant Topographie exposées déborder aux zones couvertes Troubles pigmentaires Fréquents Inhabituels Infiltrat lymphoplasmocytaire Lésions épidermiques sunburn cells Aspect histologique dermique à prédominance Œdème du derme périvasculaire Evolution à l'arrêt du Guérison rapide en 8 à 10 jours, Guérison lente en plusieurs photosensibilisant pigmentation résiduelle semaines, parfois rémanence Tableau 5 : Phototoxicité et photoallergie69, 74

34 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

I.4.1.5 Le photovieillissement

Le vieillissement cutané intrinsèque, déterminé par des facteurs chronologiques et génétiques, est amplifié par des agressions extrinsèques telles que celles provoquées par les UV, le tabac et l'alcool. Le photovieillissement, ou héliodermie, correspond à l’ensemble des altérations dermo-épidermiques bénignes résultant des expositions chroniques au soleil.

Cliniquement, une peau vieillie par le soleil associe la présence de rides très profondes, un aspect papyracé et une sécheresse cutanée. Les lésions siègent au niveau des zones photo- exposées et prédominent sur le visage, le cou et le dos des mains. Il existe très souvent des troubles de la pigmentation associés, se traduisant par des taches hyperpigmentées (éphélides, lentigos) et hypopigmentées (hypomélanose en gouttes)75. Les manifestations cliniques dépendent de l'âge du sujet, de l'importance de l'ensoleillement reçu et du phototype. Chez les individus de phototypes I et II, la peau apparaît plutôt érythémateuse, parcourue de télangiectasies et parsemée d'éphélides, tandis que la peau qualifiée de "peau citréine" chez les individus de phototypes III et IV est épaissie et parsemée de lentigos76, 77. Enfin, les lésions précancéreuses puis les carcinomes peuvent apparaître13.

Sur un plan histologique, le photovieillissement cutané est caractérisé par des modifications de l’épiderme, mais principalement du derme (Tableau 6).

Structure cutanée Modifications histologiques Répercussions Epaisseur augmentée Peau rugueuse, écaillée avec Stratum corneum Couches superficielles déshydratées formation de micro-fissures Structures sous- Epaisseur irrégulière parfois atrophique, jacentes de parfois hyperplasique Dysplasie l'épiderme Taux de renouvellement cellulaire ralenti Cellules de Diminution de l'immunité à Nombre nettement diminué Langerhans médiation cellulaire Mélanocytes hyperplasiques et en nombre Lentigo actinique Mélanocytes augmenté puis diminué Irrégularité de la pigmentation Remplacement de la matrice normale par de Rides, puis aspect jaune et flasque de Matrice dermique larges boules grossières de fibres élastiques la peau avec diminution du collagène Vascularisation Dilatation et élargissement des vaisseaux Télangiectasies dermique dans le derme papillaire Tableau 6 : Modifications histologiques liées au photovieillissement78

A un stade avancé, l’épiderme est aminci et le nombre de mélanocytes ainsi que leur fonction de pigmentation sont diminués79, 80. Les altérations au niveau du derme sont les plus importantes. La caractéristique majeure du photovieillissement est la présence dans le derme réticulaire de l’élastose solaire, accumulation et agencement anarchique de fibres élastiques épaisses et fragmentées, responsable de la "peau citréine"81. La nature et la structure de la matrice extracellulaire sont également modifiées. Elles se traduisent notamment par une diminution du contenu total en collagène et par une élévation des

35 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

teneurs en macromolécules, protéoglycanes et glycosaminoglycanes dont la fonction d'hydratation normale n'est plus assurée.

La production d'espèces réactives de l'oxygène semble être un élément déterminant du photovieillissement. En effet, les ERO sont susceptibles d'activer différentes voies de signalisation cellulaire et notamment la voie des métalloprotéinases matricielles (MMP), qui interviennent dans la dégradation des différents composants de la matrice cellulaire dermique82. Les MMP sont sécrétées par différentes cellules dont les kératinocytes et les fibroblastes. Dans cette famille, il existe 14 protéines impliquées dans la dégradation des fibres de collagène, d'élastine, des protéoglycanes et de la fibrine. A titre d'exemple, la MMP1 dégrade le collagène de types I et III, la MMP2 dégrade l’élastine et le collagène de types IV et V, et la MMP3 dégrade le collagène de type IV et les protéoglycanes.

II. La photoprotection topique

La photoprotection représente l'ensemble des moyens naturels et artificiels qui permettent de s'opposer aux effets délétères du soleil. Des moyens physiques (système pileux et couche cornée), physicochimiques (système pigmentaire) et biochimiques (systèmes antioxydants endogènes et systèmes de réparation de l'ADN) permettent une photoprotection naturelle, extrêmement variable selon les individus. Elle dépend essentiellement de la pigmentation de la peau et des capacités d'adaptation au soleil. Le recours à des moyens de photoprotection externe est donc indispensable.

II.1 Les actifs photoprotecteurs : les filtres solaires

Parmi les agents susceptibles d'atténuer le rayonnement UV se distinguent les filtres organiques qui absorbent spécifiquement certaines longueurs d'onde du spectre solaire naturel, et les filtres inorganiques qui diffractent et/ou réfléchissent le rayonnement sur l'ensemble des longueurs d'onde. Ils sont intégrés au sein de diverses formes galéniques et l'ensemble constitue les produits de protection solaire (PPS).

II.1.1 La réglementation des filtres solaires

Les filtres solaires entrant dans la composition des produits de protection solaire diffèrent considérablement à travers le monde. Trois législations dominent à l’heure actuelle ; ce sont celles des Etats-Unis, de l’Union Européenne et de l’Australie. Les différences portent sur le type, le nombre et la concentration maximale de filtres autorisés et le statut des produits les contenant (Tableau 7).

36 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

UE EU AUS FILTRES ORGANIQUES Filtres UVB Dérivés du PABA 4-Aminobenzoic acid PABA 15%

Padimate O 2-Ethylhexyl 4-dimethylaminobenzoate, 8% 8% 8% octyldimethyl PABA Ethoxylated ethyl-4 benzoic acid PEG-PABA 10% 10%

Cinnamates Ethylhexyl methoxycinnamate Octyl methoxycinnamate, OMC 10% 7,5% 10% Cinoxate 2-Ethoxyethyl p-methoxycinnamate 3% 6%

Isopentenyl-4-methoxycinnamate Isoamyl 4-methoxycinnamate, IMC, 10% 10%

Salicylates 2-Ethylhexyl salicylate Octyl salicylate, Octisalate 5% 5% 5% Homosalate Homomenthyl salicylate, HMS 10% 15% 15% Trolamine salicylate Triethanolamine salicylate 12% 12%

Dérivés du camphre Benzylidene camphor sulfonic acid BCSA 6% 6%

Polymer of N-[(2 and 4)-[(2-oxoborn-3- Polyacrylamidomethyl benzylidène 6% ylidene) methyl] benzyl] acrylamide camphor, PCB N,N,N-Trimethyl-4-(2-oxoborn-3- Camphor benzlkonium methosulfate, 6% 6% ylidenemethyl) anilinium methyl sulphate CBM 3-(4’-Methylbenzylidene)-d-1 camphor 4-Methylbenzylidene camphor, MBC 4% 4%

Triazines Benzoic acid 4,4'-((6-(((1,1-dimethylethyl) Diethylhexyl butamido triazone, DBT 10% amino) carbonyl) phenyl)amino)-1,3,5-triazine- 2,4-diyl)diimino)bis-,bis(2-ethylhexyl)ester 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2’-ethylhexyl-1’- Octyl triazone, ethylhexyl triazone 5% 5% oxy)-1,3,5-triazine Autres 2-Phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid and ist Phenylbenzimidazole sulfonic acid, 8% 4% 4% potassium, sodium and triethanolamine salts PBSA, ensulizole Dimethico-diethylbenzalmalonate DDBM 10% 10%

2-cyano-3,3-diphenyl acrylic acid 2-ethyl hexyl ester, octocrylene, 2- 10% 10% 10% ethylhexyl-2-cyano-3,3 diphenylacrylate Filtres UVA Benzophénones Benzophenone-3 Oxybenzone, Bp-3 10% 6% 10% 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic Sulisobenzone, Bp-4 5% 10% 10% acid 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic Benzophenone-5, Bp-5, Sulisobenzone 5% 10% 10% sodium salt sodium Dioxybenzone Benzophenone-8, Bp-8 3% 3%

Autres Methyl anthranilate Methyl-2-aminobenzoate, meradimate 5% 5%

1-(4-tert-butylphenyl)-3(4- Butyl methoxy dibenzoylméthane, 5% 3% 5% methoxyphenyl)propane-1,3-dione avobenzone, BMDBM 2,2’-Methylene-bis-6-(-2H-benzotriazol-2-yl)- Methylene bis-benzotriazolyl 10% 10%

4-(teramethylbutyl)-1,1,3,3-phenol tetramethylbutylphenol, MBBT

37 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Phenol,2-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-methyl-6[2- Drometrizole trisiloxane, DTS 15% 15% methyl-3[1,3,3,3-tetramethyl-1- [(trimethylsilyl)oxy]disiloxanyl] propyl 2,2’-(1,4-Phenylene)bis-(1-H-benzimidazole- Disodium phenyl dibenzimidazole 10% 10%

4,6-disulfonic acid, monosodium salt tetrasulfonate, bisimidazylate, DPDT Terephthalylidene dicamphor sulfonic acid Ecamsule, TDSA 10% 10% 10% Benzoic acid, 2-[4-(diethylamino)-2- Diethylamino hydroxybenzoyl hexyl 10% 10% hydroxybenzoyl]-hexyl ester benzoate (1,3,5)-Triazine-2,4-bis((4-(2-ethyl-hexyloxy)- Bis-ethylhexyloxyphenol 10% 10%

2-hydroxy)-phenyl)-6-(4methoxyphenyl) methoxyphenol triazine, bemotrizinol FILTRES INORGANIQUES Dioxyde de titane 25% 25% 25% Oxyde de zinc 25% Non

limité UE : Union Européenne, EU : Etats-Unis, AUS : Australie, : non autorisé Tableau 7 : Les différents filtres organiques et inorganiques autorisés et concentrations maximales tolérées dans l'Union Européenne83, aux Etats-Unis84 et en Australie85

Aux Etats-Unis, la Food and drug administration (FDA) reconnaît les produits de protection solaire comme des médicaments non soumis à prescription médicale, c'est-à-dire les médicaments Over the Counter (OTC). 16 substances sont répertoriées comme filtres solaires. Depuis 1978, seulement trois molécules ont été ajoutées : l'avobenzone, l'oxyde de zinc et récemment, l'écamsule.

Dans l'Union Européenne, les produits de protection solaire entrent dans la catégorie des produits cosmétiques. L'annexe VII de la Directive 76/768/CEE modifiée établit la liste des 25 filtres UV qui peuvent entrer dans leur composition. Contrairement aux monographies de la FDA, l’oxyde de zinc n’est pas reconnu comme un filtre autorisé. Il est pourtant utilisé dans de nombreux produits de protection solaire puisqu'il n'est pas inscrit sur la liste des substances interdites. Le Règlement N°1223/2009 est entré en vigueur en juillet 2013. La liste des filtres UV autorisés y figure en son annexe VI, modifiée le 4 avril 2013 par le Règlement (CE) N°344/2013.

En Australie, les filtres solaires utilisés dans les produits de protection solaire "thérapeutiques" sont classés en deux catégories : les filtres UV primaires et secondaires. Actuellement, 28 filtres sont approuvés.

II.1.2 Les qualités du filtre solaire idéal

Le filtre solaire idéal, et d'une façon générale le produit de protection solaire, doit allier photostabilité, substantivité, rémanence, couverture d'un large spectre et absence d'effets toxiques.

Un filtre est dit photostable s'il ne se dégrade pas sous l'effet de l'irradiation et s'il ne génère pas de photoproduit. Un filtre non photostable voit son efficacité diminuer à partir d'un certain temps d'irradiation. Tous les filtres organiques sont photolabiles dans une

38 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique certaine mesure. Néanmoins, la photoinstablité d'un filtre en particulier peut être améliorée par son association avec d'autres filtres. L'étude des photoisomères et des photoproduits est essentielle afin de s'assurer qu'ils ne provoquent pas de réactions nocives avec leur environnement. Aucune combinaison de filtres organiques ou inorganiques ne peut complètement prévenir cette photodégradation.

La substantivité d'un filtre correspond à sa capacité à se fixer au niveau de la couche cornée, sans en être éliminé trop rapidement. Les filtres qui sont facilement déplacés de leur site d'action possèdent un pouvoir protecteur de courte durée. A l'inverse, les filtres présentant une forte affinité pour la kératine constituent un réservoir d'actif au niveau cutané.

La rémanence évalue la capacité d'un produit de protection solaire à conserver son efficacité dans des conditions normales d'utilisation (bain, sudation). Elle est liée à la résistance à l'eau et à la photostabilité du mélange de filtres, et conditionne la durée maximale qui doit séparer deux applications de produit.

Les premiers produits de protection solaire ne protégeaient que de l'érythème induit par les UVB. Aujourd'hui, les effets néfastes des UVA ayant été prouvés, il est primordial que les PPS aient un large spectre de protection. Aucun filtre ne pouvant couvrir à lui seul l'ensemble du spectre UV, les produits de protection solaire associent plusieurs filtres de longueurs d'onde d'absorption maximales différentes.

Le statut de produit cosmétique pour les PPS en Europe leur impose de ne pas nuire à la santé humaine. L'innocuité est, entre autre, reliée à l'absence de passage percutané. Ainsi, un filtre solaire doit pouvoir se fixer à la surface cutanée pour être efficace, mais ne doit pas pénétrer à travers la peau.

II.1.3 Les filtres organiques

II.1.3.1 Mécanisme d'action

Les filtres organiques sont des molécules aromatiques présentant une alternance de simples et de doubles liaisons, alternance qui crée une structure de résonnance permettant l’absorption de l'énergie du rayonnement UV incident. Chaque filtre absorbe l'énergie du rayonnement UV dans des domaines de longueurs d'onde caractéristiques dépendant de sa structure chimique.

Ils agissent donc comme des chromophores. L'absorption de l'énergie du photon incident par le filtre le fait passer à un état excité. A partir de cet état excité, le filtre va revenir à son état initial en libérant l'énergie acquise de différentes façons (Figure 18).

39 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Figure 18 : Principe de fonctionnement d'un filtre organique86

Il peut revenir à son état initial en transformant l'énergie initialement absorbée en énergie de plus grande longueur d'onde, moins dangereuse pour la peau (infrarouge par exemple). Le filtre peut alors à nouveau absorber le rayonnement UV.

Néanmoins, il peut aussi se dégrader et perdre plus ou moins rapidement son efficacité photoprotectrice, ou interagir dans son état excité par transfert d'état avec son environnement et conduire à la formation d'espèces réactives potentiellement nocives.

II.1.3.2 Les principales familles de filtres organiques

Les filtres organiques sont divisés en trois grandes catégories : les filtres UVB, les filtres UVA et les filtres à large spectre87. Seuls les filtres autorisés dans l'Union Européenne seront présentés dans cette partie.

II.1.3.2.1 Les filtres UVB

Les différentes dénominations des filtres UVB sont présentées dans le tableau 8.

40 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Nom chimique Nom INCI Noms commerciaux 4-diméthyl-amino-benzoate de 2- Octyldimethyl PABA Escalol 507® Uvasorb DMO® éthylhexyle Eusolex 6007® 4-bis-polyéthoxy aminobenzoate PEG-25 PABA Unipabol U-17® Uvinul P-25® d’éthyle Salicylate de 2-éthylhexyle Homosalate Eusolex HMS® NeoHeliopan HMS® 2-éthylhexyle-2-hydroxybenzoate Ethylhexyl salicylate Escalol 587® NeoHeliopan OS® Eusolex OS® 4-méthoxycinnamate de 2- Ethylhexyl Escalol 557® Parsol MCX® éthylhexyle methoxycinnamate Eusolex 2292® Uvinul MC 80® NeoHeliopan AV® p-méthoxycinnamate d’isopentyle Isoamyl NeoHeliopan E1000® p-methoxycinnamate 1,7,7-triméthyl-3-4- 4-methylbenzylidene Eusolex 6300® NeoHeliopan MBC® (méthylphényl)méthylène) camphor bicyclo(2,2,1)heptane-2-one 2-Ester éthylhexylique de l’acide Octocrylene Escalol 597® Uvinul N539-SG® 2-cyano 3,3-diphénylacrylique NeoHeliopan 303® Parsol 340® Eusolex OCR® Acide 2-phényl-benzimidazole 5- Phenylbenzimidazole Eusolex 232® NeoHeliopan Hydro® sulfonique sulfonic acid Parsol HS® Tableau 8 : Les différentes dénominations des filtres UVB88

II.1.3.2.1.1 Les dérivés de l'acide para-amino benzoïque

Les esters dérivés de l'acide para-amino benzoïque (PABA) autorisés sont l'octyldiméthyle PABA (Padimate O) et le PEG-25-PABA. Le PABA est l'un des premiers filtres organiques à avoir été synthétisé, mais son pouvoir photoallergisant et sa photodégradation en nitrosamine carcinogène ont conduit à son interdiction en Europe en 2008. L'octyldiméthyle PABA possède un coefficient d'absorption élevé et une bonne stabilité à la température9. Il est relativement bien toléré et substantif. Le PEG-25-PABA est un dérivé éthoxylé hydrosoluble, non allergisant et non toxique89 bien qu'il soit capable de pénétrer dans la peau.

II.1.3.2.1.2 Les dérivés de l'acide salicylique

Ce sont des filtres liposolubles peu efficaces9. Les deux représentants autorisés, l'homosalate et l'octylsalicylate, sont néanmoins utilisés afin de limiter la photodégradation d'autres filtres comme l'avobenzone89 ou pour les solubiliser. De plus, leur insolubilité dans l'eau conduit à une haute substantivité90.

II.1.3.2.1.3 Les cinnamates

Ce sont les filtres UVB les plus utilisés en Europe89. Ils existent sous forme d'esters dont seuls deux représentants sont autorisés : l'octylméthoxycinnamate (OMC) et l'isoamyl 4- méthoxycinnamate. Leur spectre d'action est étroit mais encadre la longueur d'onde la plus nocive (308 nm)9. Ils sont relativement bien tolérés mais leur utilisation fréquente conduit à des allergies. L'OMC est un filtre peu photostable. Il subit une photoisomérisation,

41 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique théoriquement réversible, en cis-OMC qui absorbe moins efficacement les UVB. Afin d'augmenter sa photostabilité, il est fréquemment utilisé en association avec d'autres filtres ou peut être encapsulé dans des microsphères de polyméthylméthacrylate91. Il est très peu photosensibilisant. En raison de sa très faible solubilité dans l'eau, il est souvent utilisé pour augmenter la substantivité des préparations71. Le principal inconvénient est son incompatibilité avec l'avobenzone ; leur association est photolabile et compromet la protection large spectre90.

II.1.3.2.1.4 Les dérivés du benzylidène camphre

Il existe cinq dérivés du benzylidène camphre autorisés dans l'Union Européenne, dont quatre sont des filtres UVB et le dernier, le Mexoryl SX®, un filtre UVA. Parmi les filtres UVB, le 4-méthylbenzylidène camphre (4-MBC) est un filtre doué d'une grande stabilité à la lumière. En effet, sa photoisomérisation conduit à un isomère trans dont le spectre d'absorption est très similaire à celui de l'isomère cis. Il est également peu allergisant9. Cependant, il est suspecté d'avoir des effets systémiques toxiques et sa réévaluation est en cours par les autorités. Un autre dérivé, le 3-benzylidène camphre (3-BC) a ainsi été interdit en 2011.

II.1.3.2.1.5 L'octocrylène

Il s'agit d'un filtre photostable, introduit il y a une quinzaine d'années afin de remplacer l'oxybenzone qui provoquait des allergies fréquentes. Néanmoins depuis 2003, il est à son tour régulièrement incriminé dans des cas d'allergies71. Peu substantif, il perd de son efficacité lors de la baignade ou en cas de sudation90.

II.1.3.2.1.6 L'acide phenylbenzimidazole sulfonique

Ce filtre hydrosoluble, très utilisé sous sa forme salifiée, est sur le marché depuis 193371. Il est toujours utilisé en association, notamment afin de potentialiser les effets des filtres liposolubles.

II.1.3.2.1.7 Les triazines

Trois triazines sont utilisées comme filtres solaires mais seules l'éthylhexyle triazone et le diéthylhexylbutamidotriazone sont des filtres UVB. Elles présentent un spectre d'absorption similaire, relativement étroit.

II.1.3.2.1.8 Le diméthico-diéthylbenzalmalonate

Il s'agit d'un filtre UVB récent, ne provoquant ni photoallergie ni photosensibilité.

42 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

II.1.3.2.2 Les filtres UVA

Les différentes dénominations des filtres UVA sont recensées dans le tableau 9.

Nom chimique Nom INCI Noms commerciaux Sel de sodium de l’acide 2,2’- Disodium phenyl NeoHeliopan AP® (1,4- phénylène) bis-[1H- dibenzimidazole tetrasulfonate benzimidazole-4,6- disulfonique 4-ter-Butyl-4’méthoxy- Butyl Eusolex 9020® NeoHeliopan 357® dibenzoylméthane methoxydibenzoylmethane Parsol 1789® Nuvigard AB 1100® Escalol 515® 2-[4-(diéthylamino)-2- Diethylamino hydroxybenzoyl Uvinul A Plus® hydroxybenzoyl)- benzoate hexyl benzoate d’hexyle Tableau 9 : Les différentes dénominations des filtres UVA88

II.1.3.2.2.1 Les dérivés du dibenzoylméthane

Le butylméthoxydibenzoylméthane (BMDBM) ou avobenzone, est un filtre liposoluble, absorbant fortement le domaine UVA. Il est photolabile via des mécanismes de tautomérisation et de photo-oxydation, perdant ainsi de 50 à 90 % de ses capacités photoprotectrices après une heure d'exposition au soleil92. Il peut être stabilisé par l'octocrylène, le 4-MBC ou l'anisotriazine90.

II.1.3.2.2.2 Le diéthylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate

Ce filtre UVA liposoluble présente une excellente photostabilité et compatibilité avec les autres filtres UV.

II.1.3.2.3 Les filtres à large spectre

Le tableau 10 donne les différentes dénominations des filtres à large spectre.

Nom chimique Nom INCI Noms commerciaux 2-hydroxy-4-méthoxybenzophénone Benzophenone-3 Escalol 567® Eusolex 4360® NeoHeliopan BB® Acide 5-benzoyl-4-hydroxy-2-méthoxy- Benzophenone-4 Escalol 557® benzènesulfonique Uvinul MS 40® 2-(2H-Benzotriazol-2-yl)-4-méthyl-6-[2- methyl- Drometrizole trisiloxane Mexoryl XL® 3-{1,3,3,3-tetraméthyl-1- [(triméthylsilyl)oxy]disiloxanyl)propyl]phénol 2,2’-méthylène-bis (6-(2H-benzotriazole-2-yl)-4- Methylene bis-benzotriazolyl Tinosorb M® (1,1,3,3- tétraméthylbutyl)-phénol tetramethylbutylphenole 2,4-bis-[4-(2-éthylhexyloxy)-2- hydroxy- bis-Ethylhexyloxyphenol Tinosorb S® phényle)-6-(4- méthoxyphényle)-1,3,5-triazine] Methoxyphenyl Triazine Tableau 10 : Les différentes dénominations des filtres à large spectre88

43 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

II.1.3.2.3.1 Les benzophénones

Il existe douze benzophénones sur le marché mais seules les benzophénones 3, 4 et 5 figurent dans l'annexe VI du Règlement. Elles présentent deux pics d'absorption, l'un vers 300 nm et l'autre vers 350 nm, leur conférant une large bande d'absorption9. Elles sont utilisées dans les produits cosmétiques à la fois comme "protecteurs" pour éviter la détérioration de la formule ou directement comme filtre dans les produits de protection solaire71.

La benzophénone 3 (ou oxybenzone), liposoluble, est la plus largement utilisée. Cependant, de nombreux inconvénients ont été rapportés90 : allergies, absorption systémique et effets endocriniens. Au même titre que les dérivés du benzylidène camphre, elle est actuellement soumise à une réévaluation. Les benzophénones 4 et 5 sont hydrosolubles.

II.1.3.2.3.2 Les Mexoryl®

Les Mexoryl® sont des filtres brevetés par la société L'Oréal. Il en existe deux : l'acide téréphtadylène dicamphré sulfonique (Mexoryl SX®) et le drométrizole trisiloxane (Mexoryl XL®). Le Mexoryl SX® est un filtre à large spectre, hydrosoluble et photostable. Il absorbe principalement dans le domaine UVA93. Il représente dans ce domaine de longueurs d'onde l'un des filtres les plus efficaces à l'heure actuelle. Le Mexoryl XL® est un filtre liposoluble et photostable. Ces deux filtres montrent une synergie lorsqu'ils sont utilisés en association94.

II.1.3.2.3.3 Les Tinosorb®

Les Tinosorb® sont des filtres développés par la société Ciba Speciality Chemicals. Il s'agit du méthylène-bis-benzotriazolyltétraméthylbutylphénol (Tinosorb M®) et du bis- éthylhexyl-oxyphénol méthoxyphénoltriazine ou anisotriazine (Tinosorb S®).

Le Tinosorb M® est constitué de particules organiques microfines hydrolubles, combinant ainsi les bénéfices d'un filtre organique avec ceux d'un filtre inorganique. Grâce à l'encombrement stérique de sa structure, il ne peut pénétrer dans la peau. Le Tinosorb S® est, quant à lui, liposoluble. Ce sont des filtres hautement photostables qui permettent d'augmenter la photostabilité et l'efficacité de produits de protection solaire contenant par exemple de l'avobenzone et de l'OMC95.

II.1.4 Les filtres inorganiques

Les filtres inorganiques sont des poudres minérales inertes qui forment une couche réfléchissante et diffusante plus ou moins opaque aux rayonnements UV, visible et infrarouge. En Europe, seul le dioxyde de titane (TiO2) est autorisé comme filtre solaire.

44 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Néanmoins, l'oxyde de zinc (ZnO) est fréquemment utilisé. En effet, il n'est pas inscrit sur la liste des substances interdites et figure sur celle des colorants autorisés.

Historiquement, leur utilisation a longtemps été limitée en raison de leur opacité due à une forte diffusion de la lumière visible, responsable d'une pigmentation blanche inesthétique visible sur la peau après application. En effet, les oxydes de zinc et de titane présentent des indices de réfraction élevés (1,9 et 2,6 respectivement90). De plus, en raison de la difficulté à les disperser de façon homogène, ils procuraient une sensation granuleuse sur la peau. Actuellement, les filtres inorganiques sont utilisés sous forme nanoparticulaire. La réduction à l'échelle nanométrique par des processus de micronisation présente deux avantages. D'une part, elle entraîne des modifications des mécanismes de filtration de la lumière qui améliorent le spectre d'absorption. D'autre part, en diminuant la diffusion de la lumière visible (Figure 19), elle permet la formulation de produits de protection solaire transparents.

Spectre bleu : 20 nm ; Spectre vert : 50 nm ; Spectre rouge : 100 nm 96 Figure 19 : Spectre d'absorption UV-visible de trois TiO2 de différentes tailles

Le mécanisme d'action des filtres inorganiques est donc conditionné par la taille et le type des particules. Les formes non micronisées assurent une protection solaire par réflexion et diffusion du rayonnement UV, contrairement aux formes micronisées qui diffractent et absorbent la lumière97 (Figure 20).

Io = rayon incident ; Ir = rayon réfracté ; Ia = rayon absorbé ; Id = rayon diffusé ; It = rayon transmis Figure 20 : Mécanisme d'action des filtres inorganiques sous forme micronisée98

45 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

L'efficacité optimale est atteinte pour des tailles de particules comprises entre 60 et 120 nm 90 pour le ZnO, et entre 20 et 30 nm pour le TiO2 . L'apparition d'agrégats provoque une augmentation de l’interaction avec la lumière et ainsi une diminution de leur efficacité 99 d'absorption. Le TiO2 serait plus efficace contre les UVB et le ZnO contre les UVA .

II.2 Efficacité des filtres et produits de protection solaire

A l'heure actuelle, la détermination de l'efficacité des filtres solaires et des PPS prend en compte l'évaluation de la prévention de l'un des effets à court terme des UV, l'érythème. Il n'existe pas de méthode validée permettant d'évaluer leur efficacité contre les autres effets UV-induits tels que le photovieillissement, la photo-immunosuppression ou la photocarcinogenèse.

II.2.1 Evaluation globale de l'efficacité des produits de protection solaire

L'efficacité globale des filtres ou des produits de protection solaire, et particulièrement vis- à-vis de l'érythème, peut être évaluée par la détermination d'indices de protection à l'aide de méthodologies mises en œuvre in vitro et/ou in vivo (Tableau 11).

Paramètre mesuré Méthodologie Norme ISO associée

INDICES ANTI-UVB Appréciation d'un érythème In vivo chez l'homme ISO 24444 : 2010

Spectrophotométrie de transmission In vitro, basée sur la loi de Beer-Lambert INDICES ANTI-UVA Mesures de pigmentation persistante : PDD In vivo chez l'homme ISO 24442 : 2011 (lecture à 2 h) et IPD (lecture précoce) Spectrophotométrie de transmission In vitro, basée sur la loi de ISO 24443 : 2012 Beer-Lambert Tableau 11 : Méthodes de détermination de l'efficacité photoprotectrice globale

II.2.1.1 Les indices de protection

Le principe de la détermination d'un indice de protection repose sur l'évaluation de la valeur d'un paramètre biologique mesurable induit par une exposition en simulation solaire, et d'établir le ratio de la valeur du paramètre avec et sans produit de protection solaire.

II.2.1.1.1 L'indice de protection dans le domaine UVB

Le facteur de protection solaire, ou SPF (Sun Protection Factor), est corrélé à la protection contre l'érythème. Ce dernier étant majoritairement induit par les UVB, le SPF ne renseigne par conséquent que sur la protection offerte contre les UVB.

46 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Il est défini comme suit :

DEM d'une peau protégée par un filtre/produit de protection solaire SPF = DEM d'une peau non protégée

La dose érythématogène minimale (DEM) est la dose minimale d’énergie apportée par le rayonnement UV nécessaire pour produire une réaction érythémateuse par unité de surface de peau humaine ; elle est exprimée en J/cm2. La détermination du SPF est standardisée selon la norme ISO 24444 : 2010.

II.2.1.1.2 L'indice de protection dans le domaine UVA

La connaissance des effets biologiques néfastes liés à l'exposition aux UVA a conduit à la nécessité de définir un facteur de protection spécifique, le FP-UVA. Néanmoins, les doses d'UVA nécessaires pour induire un érythème étant bien supérieures à celles des UVB, un autre paramètre biologique doit être étudié ; il s'agit de la pigmentation (norme ISO 24442 : 2011).

II.2.1.2 Les méthodes in vivo de détermination des indices de protection

II.2.1.2.1 Détermination du SPF

La méthode d'évaluation in vivo du SPF au niveau européen est basée sur la technique mise au point par Schulze38. Une série croissante de doses d'UV érythématogènes sont délivrées par une lampe à arc au xénon sur le dos de 10 à 20 sujets volontaires sélectionnés selon des critères bien précis (phototype clair, âge, absence de toute pathologie en relation avec les UV). L’apparition du seuil d’érythème est évaluée 24 heures après irradiation. La DEM sur peau non protégée, puis la DEM sur peau protégée par l'application du produit à tester à raison de 2 mg/cm2 sont déterminées, et le SPF calculé. Le SPF du produit est obtenu en faisant la moyenne des SPF obtenus pour chaque sujet. Outre la question éthique, et bien qu'elle soit largement utilisée au niveau européen et qu'elle permette une évaluation directe de la protection exercée vis-à-vis de l'érythème solaire, cette méthode présente des limites100. La valeur obtenue est un SPF moyen qui dépend du nombre de sujets retenus, de leur phototype et de la saison au cours de laquelle le test est effectué. Par ailleurs, la dose de produit appliquée lors du test est importante et non représentative de la dose réellement appliquée par les consommateurs. De plus, ces tests n’incluent pas la diminution du SPF liée à des facteurs environnementaux (exposition à l'eau ou sudation) ou à la photodégradation des filtres lors d’expositions longues et répétées au soleil.

II.2.1.2.2 Détermination du FP-UVA

Les deux méthodes utilisées sont fondées sur la mesure d'une réponse biologique de la peau spécifique aux UVA : la pigmentation. Le FP-UVA est calculé à l'aide du rapport

47 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique entre les doses pigmentantes de la peau protégée et celles de la peau non protégée. Dans la méthode IPD (Immediate Pigment Darkening), la pigmentation immédiate induite par les UVA est mesurée directement après irradiation et jusqu’à 15 minutes après. La méthode PPD (Persistent Pigment Darkening) est dérivée de la précédente et consiste à déterminer la pigmentation immédiate induite par les UVA lorsqu'elle est stabilisée, soit 2 heures après irradiation.

La principale limite de ces méthodes est liée au fait que ce phénomène s'observe essentiellement chez les sujets de phototypes foncés. La méthode PPD présente plusieurs avantages par rapport à l'IPD. En effet, il s'agit de la mesure d'une pigmentation stabilisée qui augmente avec la dose de façon linéaire et qui ne varie pas avec l'intensité. De plus, elle permet de prendre en compte les phénomènes de photo-instabilité des filtres. Néanmoins, il s'agit d'une méthode coûteuse du fait de la mobilisation importante des volontaires de l'irradiation jusqu'à la lecture.

II.2.1.3 Les méthodes in vitro de détermination des indices de protection

L'étude in vitro de l'efficacité protectrice est basée sur la détermination, par spectrophotométrie, de l'absorption du filtre en solution ou du produit de protection solaire appliqué sur un substrat mimant le relief de la peau. Le principe repose sur la loi de Beer- Lambert : I A  logT  log I 0 A  lc avec A, Absorbance ; c, Concentration molaire ; T, Transmittance ; I, Intensité de la lumière transmise par l'échantillon ; I0, Intensité de la lumière incidente ; ɛ , Coefficient d’extinction molaire et l, Longueur d'onde du trajet optique.

La méthode de Diffey et Robson101, pratiquée depuis les années 1990, préconise une mesure comparative, à l’aide d’un spectrophotomètre à sphère d’intégration, de la transmission entre 290 nm et 400 nm par bandes de 5 nm. L’échantillon est soumis au rayonnement UV d'une lampe à arc au xénon, couvrant la totalité du spectre UV. Les intensités de rayonnement UV transmises sont déterminées grâce à un détecteur, après passage à travers un monochromateur.

Le facteur de protection monochromatique (mPFλ) est le rapport des intensités UV enregistrées, à une longueur d’onde λ, avant et après application du produit. A partir des valeurs monochromatiques obtenues, différents indicateurs de protection peuvent être calculés (Tableau 12). En sélectionnant spécifiquement la transmission entre 320 et 400 nm, la protection vis-à-vis des UVA peut être déterminée.

48 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Protection UV Protection UVA 400 400  E S   E S  290 320 SPF  400 FP UVA  400  E ST    E ST  290 320 Eλ : efficacité érythématogène spectrale (CIE) Sλ: irradiance spectrale solaire Tλ : transmittance spectrale de l’échantillon Tableau 12 : Principe de détermination des indices de protection100

Il existe plusieurs modes de calcul permettant d'exprimer la protection UVA in vitro.

La méthode australienne officielle (AS/NZS-2604) consiste à déterminer les valeurs de transmission des produits testés entre 320 et 360 nm.

La société Boots, leader sur le marché des produits de protection solaire en Grande- Bretagne, a développé un système d’étiquetage de la protection UVA à l'aide d’étoiles, le Boots Star rating system. Il va d’une étoile pour une protection "modérée" à cinq étoiles pour une protection "maximale". La classification repose sur la valeur d'un ratio correspondant au rapport entre l'absorption totale dans l'UVA sur celle dans l'UVB.

La détermination de la longueur d’onde critique (λc), enfin, est une approche intéressante car elle évalue la largeur du spectre d’absorption d’un produit de protection solaire, en particulier son extension vers les UVA. Elle correspond à la longueur d’onde à partir de laquelle l’intégrale de la courbe du spectre d’absorption atteint 90 % de l’intégrale entre 290 et 400 nm.

II.2.1.4 Les critères réglementaires d'efficacité des produits de protection solaire

Un produit peut revendiquer le statut de produit de protection solaire uniquement s'il répond à l'ensemble des trois critères suivants : - la valeur de son SPF est supérieure ou égale à 6 ; - son rapport SPF/FP-UVA est inférieur ou égal à 3 ; - sa longueur d'onde critique est supérieure ou égale à 370 nm.

Les valeurs de SPF et de FP-UVA permettent de définir l'appartenance du PPS à une catégorie de protection (Tableau 13).

49 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Catégorie SPF indiqué SPF mesuré FP-UVA Longueur d'onde critique minimale Faible protection 6 6 - 9,9 10 10 - 14,9 Protection moyenne 15 15 - 19,9 1/3 du 20 20 - 24,9 SPF 370 nm 25 25 - 29,9 indiqué Haute protection 30 30 - 49,9 50 50 - 59,9 Très haute protection 50+ 60 Tableau 13 : Classification des produits de protection solaire102

II.2.2 Efficacité dans la prévention du photovieillissement

De nombreuses études menées sur l'animal montrent que les dommages induits dans le derme, principale cible de l'héliodermie, sont prévenus par les produits de protection solaire. Cette protection n'est effective qu'à condition que le PPS couvre le domaine des UVA et notamment celui des UVA1. L'induction des métalloprotéinases matricielles de type 1 serait alors bloquée103.

Chez l'homme, peu d'essais ont été réalisés compte tenu du délai d'installation du photovieillissement et l'efficacité n'est donc pas encore démontrée. L'étude de Boyd et al.104, toutefois, a permis de mettre en évidence une diminution significative de l'élastose dermique solaire après utilisation d'un produit à large spectre appartenant à la catégorie des produits de "protection moyenne". Les conditions d'application étaient très strictes : 2 applications par jour, à renouveler en cas de bain, pendant 2 ans. L'étude de Philips et al.105 a comparé la protection offerte par un PPS appliqué quotidiennement ou de façon intermittente contre les dommages histologiques UV-induits après 4 jours d'irradiation consécutifs. Elle montre que l'oubli d'un jour sur quatre fait perdre le bénéfice apporté par l'application du produit pendant les trois autres jours. Elle révèle également que l'utilisation quotidienne d'un PPS à large spectre de SPF 15 apporte une protection supérieure à celle procurée par un PPS possèdant un SPF double mais appliqué de façon intermittente. Ces conditions d'utilisation limitent considérablement l'intérêt des PPS dans la prévention de l'héliodermie.

II.2.3 Efficacité dans la prévention de la photo-immunosuppression

Les résultats des travaux concernant photo-immunosuppression et photoprotection sont contradictoires et diffèrent selon les modèles expérimentaux, le type de réaction immunitaire, la source lumineuse ainsi que le type et les doses de PPS utilisés. Les études reposent sur l'inhibition de l'hypersensibilité de contact au dinitrochlorobenzène chez l'animal ou chez l'homme, sur l'inhibition du rejet de tumeurs chez la souris ou sur des altérations UV-induites des cellules de Langerhans102.

50 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Dans la plupart des cas, aussi bien chez la souris que chez l'homme, l'application de PPS permet de prévenir la diminution photo-induite du nombre de cellules de Langerhans épidermiques ainsi que leurs altérations fonctionnelles106, 107. Aucune corrélation ne peut être faite entre les indices de protection et la capacité à préserver l'immunité cutanée108. En effet, chez l'homme, un produit de protection solaire prévenant complètement l'érythème pour une dose de 4 DEM ne réduit que partiellement la migration des cellules de Langerhans. Néanmoins, la meilleure protection contre la photo-immunosuppression semble être apportée par les PPS couvrant à la fois le domaine des UVA et celui des UVB, et notamment ceux possédant un FP-UVA élevé109.

II.2.4 Efficacité dans la prévention des photodermatoses

Le modèle le mieux étudié est celui de la lucite estivale bénigne. Elle peut être prévenue par l'application de PPS associant des filtres UVB-UVA et des antioxydants110.

II.2.5 Efficacité dans la prévention des cancers cutanés

Depuis quelques années, une polémique sur la réelle efficacité des produits de protection solaire dans la prévention des carcinomes et des mélanomes a été soulevée. Les études in vitro mettant en évidence que la prévention des dommages de l'ADN et de la photo- immunosuppression ne peut être corrélée à la protection offerte contre l'érythème, relayées par des études épidémiologiques, sont à l'origine de cette polémique. L'utilisation régulière de PPS s'est révélée efficace dans la réduction des carcinomes spinocellulaires et des kératoses actiniques111, 112. Néanmoins, aucun effet bénéfique n'a encore été démontré contre les carcinomes basocellulaires ou les mélanomes.

II.2.5.1 Produits de protection solaire et carcinomes

Plusieurs études ont recherché l'intérêt de l'utilisation des PPS dans la prévention de l'apparition et du développement des carcinomes. Deux études ont démontré que l'emploi régulier de PPS peut diminuer significativement l'apparition des lésions précancéreuses, notamment les kératoses actiniques111, 113. L'étude de Green et al.112 menée sur 1621 volontaires pendant 5 ans, établit un lien entre l'utilisation de PPS de catégorie "moyenne protection" (SPF 15) appliqué quotidiennement sur la tête, le cou et les bras, et la prévention de la survenue des carcinomes spinocellulaires. En revanche, ces mêmes produits de protection solaire ne permettraient pas d'éviter les carcinomes basocellulaires112.

L'étude de Couteau et al.114 a évalué la protection apportée par certains PPS vis-à-vis des carcinomes, grâce à une approche de détermination d'un SPF et d'un FP-UVA associés aux cancers cutanés non mélanocytaires, les SPFcnm et FP-UVAcnm, en utilisant les facteurs de pondération associés à chaque longueur d'onde, décrits dans la norme CEI 60335-2-27 2002.

51 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Le spectre d'action des cancers cutanés non mélanocytaires est proche de celui de l'érythème (Figure 21).

Figure 21 : Variations des coefficients de pondération pour chaque longueur d'onde114

Les SPFcnm déterminés in vitro ne diffèrent pas significativement de ceux liés à l'érythème, tandis que les FP-UVAcnm sont inférieurs aux FP-UVA (Tableau 14). Les auteurs concluent sur l'intérêt en termes de santé publique de déterminer ce type d'indice.

Produit SPFm SPFcnm FP-UVAm FP-UVAcnm Lait solaire très haute protection 50 ± 6 79 ± 9 29 ± 4 22 ± 2 Enfant (Klorane) Photoderm max fluide (Bioderma) 72 ± 5 75 ± 5 70 ± 5 38 ± 2 Photoderm max spray solaire 72 ± 4 75 ± 4 70 ± 4 38 ± 2 (Bioderma) Soins soleil à l'uncaria d'Amazonie 40 ± 5 63 ± 7 22 ± 3 16 ± 2 lait velouté (Galénic) Nivéa sun Spray protecteur hydratant 57 ± 5 83 ± 6 42 ± 3 29 ± 2 (Beiersdorf) Tableau 14 : Exemples de résultats de l'efficacité des produits testés dans les domaines UVB et UVA114

II.2.5.2 Produits de protection solaire et mélanomes

La relation entre l'apparition de mélanomes et l'utilisation de PPS est bien moins claire que pour les carcinomes. Le bilan des études cas-témoins réalisées entre 1986 et 2002 est résumé dans le tableau 15.

Conclusion de l'étude Nombre d'études et références Aucun lien entre utilisation de PPS et survenue de mélanomes 4 115, 116, 117, 118

Effet protecteur des PPS 3 119, 120, 121

Effet délétère des PPS 3 122, 123, 124 Tableau 15 : Bilan des études cas-témoins réalisées entre 1986 et 2002100

52 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Plusieurs facteurs pourraient expliquer la disparité entre ces résultats.

D'une part, le SPF des produits de protection solaire évalués n'est pas toujours indiqué. De plus, le SPF moyen des PPS utilisés avant les années 1990 était compris entre 4 et 10, et les PPS contenaient majoritairement des filtres UVB. Aujourd'hui les PPS utilisés ont des SPF supérieurs et étendent leur protection aux UVA. L'étude de Gallagher et al.125 menée avec des produits de protection solaire UVA-UVB de SPF 30 montre ainsi qu'ils s'avèrent efficaces pour prévenir la survenue de nouveaux naevi chez l'enfant alors qu'une étude antérieure avait au contraire montré que l'usage de PPS était corrélé avec l'augmentation de leur nombre. En 2011, Green et al.126 ont révélé que l'application quotidienne pendant 5 ans d'un PPS large spectre (SPF 15) sur les parties découvertes pouvait prévenir la survenue ultérieure de mélanomes, particulièrement de mélanomes invasifs. D'autre part, l'effet photoprotecteur est influencé par de nombreux facteurs tels que la durée d'exposition solaire, la quantité de produit appliquée, le phototype et le comportement individuel face à l'exposition, facteurs qui ne sont pas toujours pris en compte dans ces études.

En conclusion, il n'existe actuellement aucun argument définitif permettant de corréler l'utilisation de produits de protection solaire avec la survenue de mélanomes ou la protection vis-à-vis d'eux.

II.2.6 Recommandations de bon usage des produits de protection solaire

Deux facteurs majeurs conditionnent l'efficacité d'un produit de protection solaire : la quantité appliquée et la régularité des applications.

La quantité appliquée devrait se rapprocher le plus possible de celle utilisée lors de la détermination des indices de protection, à savoir 2 mg/cm2, avec une périodicité d'application adaptée. Pourtant, les études analysant le comportement individuel face à une exposition solaire montrent que dans la pratique, la dose généralement appliquée est comprise entre 0,5 et 1,0 mg/cm2 127.

Or, l'étude de Couteau et al.128 réalisée in vitro a établi une relation de type polynomiale entre la dose appliquée et l'efficacité photoprotectrice. Lorsque la quantité de produit est divisée par deux, le SPF est diminué d'un facteur 1,5 à 3,8 en fonction du produit. Dans le cas d'une quantité 4 fois moins importante, l'efficacité est réduite d'un facteur allant de 2,5 à 13,5 (Figure 22).

53 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Figure 22 : Influence de la quantité de produit de protection solaire sur le SPF128

De plus, les consommateurs ont tendance à penser que l'utilisation de PPS hautement protecteurs empêche le bronzage, et adaptent donc la quantité de produit appliquée. L'étude de Dupuy et al.129 s'est intéressée au comportement de vacanciers auxquels ont été fournis des produits de protection solaire, sur lesquels figurent uniquement la catégorie de protection mais pas la valeur du SPF. Il s'agit d'un produit étiqueté "haute protection", correspondant à un SPF 40, et de deux produits volontairement étiquetés "faible protection", correspondant en réalité à des produits de SPF 12 et 40. L'étude montre que quel que soit le produit utilisé, la durée d'exposition est de 2 à 3 heures et que pour 96 % des utilisateurs, l'objectif final est de bronzer. Les sujets adaptent la quantité de produit appliquée à cet objectif, aboutissant à une protection qui serait apportée par un produit de SPF 6 dans de bonnes conditions d'utilisation.

Seule l'éducation des utilisateurs et la prise de conscience qu'un produit de protection solaire ne peut être utilisé comme moyen exclusif de photoprotection ou pour prolonger abusivement l'exposition pourraient garantir leur bon usage.

III. Problématique liée à l'utilisation des nanoparticules de TiO2 et de ZnO dans les produits de protection solaire

Les filtres inorganiques non micronisés présentent plusieurs avantages par rapport aux filtres organiques. Ils sont plus stables et possèdent un spectre de protection plus large, anti UVB-A et IR. Ils ne sont ni photosensibilisants, ni irritants. Cependant, le passage à la forme nanométrique entraîne des changements de leurs propriétés chimiques, optiques, magnétiques et structurales par rapport à la forme micrométrique, et soulève de nombreuses interrogations quant à leur profil toxicologique. Les filtres inorganiques nanométriques sont aujourd'hui suspectés d'avoir la capacité de modifier le système immunitaire, de former des complexes avec les protéines et surtout de créer sous l'effet de l'irradiation des radicaux libres qui pourraient être à l'origine de lésions de l'ADN130.

54 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

III.1 Propriétés physicochimiques des nanoparticules de TiO2 et de ZnO

Les oxydes de titane et de zinc sont des semi-conducteurs naturels qui possèdent des propriétés photocatalytiques pouvant conduire à la formation d'espèces réactives de l'oxygène. La photocatalyse repose sur un processus électronique qui se produit d'abord dans le cœur, puis à la surface des particules du semi-conducteur131 (Figure 23). Lorsque le semi-conducteur absorbe un photon d'énergie (hν) au moins égale à sa bande valence, un électron (-) est éjecté de sa bande de valence (BV) vers sa bande de conduction (BC), créant ainsi une lacune électronique au niveau de la bande de valence (+) (Figure 23.1). Les charges photogénérées (- et +) peuvent ensuite être transférées à la surface du semi- conducteur et réagir avec les molécules qui s'y sont adsorbées en formant des ERO (Figure 23.2).

hν : Energie du photon ; BC : Bande de conduction ; BV : Bande de valence Figure 23 : Principe de la photocatalyse131

Du fait des dommages potentiels des ERO à la fois au niveau moléculaire et sur les autres ingrédients d'une formulation, ces propriétés ne sont pas recherchées en cosmétique. Elles sont influencées par la taille et la forme cristalline des particules. Le TiO2 existe sous trois formes cristallines, mais seules les formes anatase et rutile possèdent des propriétés d'absorption des UV. Les propriétés photocatalytiques de la forme anatase sont supérieures à celles de la forme rutile132. Le ZnO existe également sous trois formes cristallines parmi lesquelles la forme hexagonale (würtzite, Figure 24) est la plus stable.

55 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Figure 24 : Structure cristallographique würtzite du ZnO133

Afin de diminuer ces propriétés indésirables, les industriels peuvent avoir recours soit à des nanoparticules enrobées de substances organiques ou inorganiques soit à des nanoparticules dopées, i.e. particules au sein desquelles ont été incorporés des ions tels que des ions manganèse130.

Peu de données du marché actualisées sont disponibles concernant le nombre exact de produits cosmétiques contenant des nanoparticules. Les seuls outils sur lesquels il est possible de s'appuyer consistent en des inventaires loin d'être exhaustifs et d'une fiabilité limitée. L'inventaire le plus complet est celui du Project on Emerging Nanotechnologies du Woodrow Wilson Institute. Dans sa dernière mise à jour datant de mars 2011, il recense 143 produits cosmétiques contenant des nanoparticules, contre une trentaine en 2006. Egalement en 2006, l'autorité australienne TGA (Therapeutic Goods Administration) estimait que 70 % du TiO2 et 30 % du ZnO utilisés dans les produits de protection solaire étaient sous forme nanoparticulaire. Au niveau des concentrations utilisées, le TiO2 est réglementé à une concentration maximale de 25 %. Selon la base de données américaine Skin Deep Cosmetic Safety Database, le ZnO est utilisé en moyenne à 6 % mais peut être retrouvé jusque 18,5 %. La taille des particules est comprise entre 15 et 30 nm en moyenne pour le TiO2 tandis que celle des particules de ZnO est située dans une gamme inférieure à 100 nm, sans être exactement précisée. L'obligation de déclaration de la présence des nanoparticules au sein des produits cosmétiques à partir de juillet 2013 devrait permettre d'obtenir prochainement des données fiables.

III.2 Le problème de la pénétration cutanée

La question de la pénétration cutanée des nanoparticules est d'autant plus importante qu'elle conditionne leur impact toxicologique. La revue de la littérature réalisée par Newman et al.134 montre que les données actuelles concernant la pénétration cutanée des nanoparticules de TiO2 et de ZnO sont dans l'ensemble rassurantes sur peau saine. Néanmoins, certaines études répertoriées présentent des limites. Elles ne sont en général réalisées qu'à court terme (le plus souvent 24 heures) et n'évaluent pas l'influence de la

56 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique modification de l'intégrité cutanée (eczéma, coup de soleil…) ou encore le rôle des promoteurs d'absorption rencontrés dans la formulation des produits de protection solaire. De plus, elles sont majoritairement réalisées in vitro.

Au contraire, certaines études in vivo ont montré que les nanoparticules ne persistent pas uniquement au niveau de la couche cornée. L'étude de Sadriech et al.135 réalisée in vivo chez le cochon nain ne montre qu'un passage négligeable du TiO2 dans le derme après l'application de formules contenant différents types de nanoparticules de TiO2, et ce 4 fois par jour, 5 jours par semaine pendant 22 jours. Néanmoins, une quantité significative a été retrouvée au niveau des ganglions lymphatiques. L'étude de Zvyagin et al.136 réalisée in vivo sur 4 volontaires met en évidence que du ZnO a été retrouvé au niveau des Stratum corneum et granulosum après application topique d'un produit contenant 19 % de nanoparticules de ZnO d'une granulométrie de 30 nm. L'étude de Gulson et al.137 ayant pour objectif de déterminer si le zinc des particules de ZnO pouvait être absorbé par la peau, montre l'augmentation significative des taux en zinc mesurés dans le sang et les urines après application sur le dos de 20 volontaires d'un produit contenant du ZnO radiomarqué pendant 5 jours.

Sur peau lésée, les résultats sont contradictoires et ne permettent pas d'exclure que toute lésion de la peau favorise l'absorption des nanoparticules. Enfin, l'hypothèse d'une pénétration des nanoparticules via les follicules pileux fait l'objet de nombreuses études, et ne peut pas être exclue138.

III.3 Etudes de cytotoxicité et de génotoxicité

III.3.1 Méthodes d'évaluation du potentiel cytotoxique et génotoxique

La cytotoxicité correspond à la capacité de certaines substances à altérer des cellules et potentiellement à les détruire. Différents tests in vitro permettent d'évaluer le potentiel cytotoxique d'une substance. Ils consistent généralement à cultiver une lignée cellulaire en présence d'une quantité déterminée de la substance à étudier, et à quantifier le déroulement d'un processus cellulaire comparativement aux cellules non traitées par la substance.

Les méthodes les plus utilisées sont fondées sur la révélation de la perturbation membranaire, soit par l'utilisation d'un colorant fluorescent ou non, soit par la détermination du relargage de molécules dans le milieu extracellulaire139.

Certains colorants, en fonction de leurs caractéristiques, vont pénétrer dans les cellules mortes ou dans les cellules vivantes. Il s'agit respectivement des colorants vitaux ou d'exclusion, et des colorants d'inclusion. Le test au rouge neutre permet d'estimer le nombre de cellules viables en évaluant par spectrophotométrie la quantité de rouge neutre incorporé dans les cellules. En effet, ce colorant n'est absorbé et retenu que par les cellules vivantes. Le test au bleu de trypan utilise un colorant qui peut pénétrer dans une cellule vivante mais qui en est rejeté par un mécanisme d'exclusion ATP-dépendant. Observées au

57 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique microscope, les cellules vivantes, incolores, peuvent être différenciées des cellules mortes qui sont colorées en bleu. D'autres colorants, quant à eux, nécessitent une étape de métabolisation. Le test au MTT ou au XTT fait appel à un colorant de type tétrazolium qui est réduit par les enzymes mitochondriales. Seules les cellules viables vont donner lieu à cette réaction colorimétrique, quantifiée par spectrophotométrie.

Parmi les méthodes de détermination du relargage de molécules dans le milieu extracellulaire, le dosage de l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) est très utilisé pour étudier la cytotoxicité de certaines substances. Cette enzyme, normalement présente dans le cytoplasme des cellules vivantes, est libérée dans le milieu de culture lorsque les membranes cellulaires sont rompues par une substance cytotoxique. La mesure de l'activité de la LDH dans le milieu de culture est effectuée par un dosage enzymatique, basé sur sa capacité à transformer le pyruvate en lactate en utilisant le nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) comme cofacteur. La vitesse d'oxydation du NADH en NAD+ est proportionnelle à l'activité de l'enzyme.

Ces méthodes permettent de déterminer la toxicité relative d'une substance, toxicité pouvant être exprimée par la concentration inhibitrice 50 % (CI50), qui correspond à la concentration de produit entraînant une inhibition de 50 % d’un processus cellulaire140, par exemple l'absorption du colorant. En dépit des nombreuses difficultés que présente l’extrapolation des données obtenues in vitro aux fins d’une exploitation in vivo, ces tests présentent l'avantage d'être simples et peu couteux.

La génotoxicité, quant à elle, se rapporte au potentiel de certaines substances à interagir avec l'ADN et/ou la machinerie cellulaire qui maintient l'intégrité du génome141. Elle inclut à la fois des effets directs et indirects sur l'ADN : l'induction de mutations qui peuvent participer à la carcinogenèse, des lésions de l'ADN pouvant conduire à des mutations, ou bien des évènements indirectement associés à des mutations. Parmi les méthodes "classiques" d'évaluation du pouvoir génotoxique d'une substance se distinguent le test d'Ames, l'essai d'aberrations chromosomiques, le test des micronoyaux, le test d'échanges de chromatides sœurs et le test des comètes.

Le test d'Ames est une technique réalisée sur des cellules procaryotes telles que les bactéries, généralement Salmonella typhimurium, inaptes à synthétiser l'histidine (souche auxotrophe, his -). La prolifération de ces bactéries est évaluée dans un milieu dépourvu d'histidine, prolifération rendue possible par mutation reverse des gènes pour l'histidine sous l'action d'une substance mutagène, redonnant des souches sauvages (his +).

L'essai d'aberrations chromosomiques permet d'identifier les substances pouvant induire des anomalies structurales de l'ADN chromosomique ou chromatidique par observation microscopique des cellules après blocage en métaphase.

58 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Le test des comètes est basé sur la détection microscopique, après une phase d’électrophorèse sur gel d’agarose, de lésions de l'ADN grâce à des marqueurs fluorescents. La version alcaline de cette technique introduite par Singh et al.142 permet de révéler les ruptures de chaînes simple et double brins ainsi que les sites alcali-labiles. Le champ électrique appliqué permet la migration différentielle des fragments de l'ADN : les molécules d’ADN intact décrivent une sphère compacte tandis qu'un ADN endommagé va voir migrer ses fragments les plus courts en dehors de cette sphère, formant ainsi un “halo” d’ADN comparable à une comète.

Le test d'échanges de chromatides sœurs consiste à étudier les substances interférant avec la réplication de l'ADN en observant les échanges symétriques et asymétriques de chromatides sœurs qui se produisent lors du phénomène de réparation des cassures double brin de l'ADN.

Le test des micronoyaux, enfin, correspond à un test de mutagenèse consistant à étudier la perte de matériel génétique sous forme de micronoyaux qui sont des entités nucléaires provenant de la perte de fragments chromosomiques, voire de chromosomes entiers, au cours de l’anaphase. La présence de micronoyaux est reliable à un événement génotoxique, clastogène ou aneugène, non ou mal réparé par la cellule.

Il existe d'autres méthodes, telles que l'utilisation de sondes fluorescentes complémentaires de la séquence génomique étudiée dans l'hybridation fluorescente in situ, FISH, ou l'étude de l'expression de protéines recrutées lors de lésions de l'ADN.

III.3.2 Etudes de cytotoxicité et génotoxicité appliquées aux nanoparticules

De nombreuses études de cytotoxicité et de génotoxocité ont été menées in vitro sur des lignées cellulaires de mammifères, et dans une moindre mesure in vivo. Les résultats sont contradictoires mais la plupart suggèrent un potentiel génotoxique in vitro et in vivo direct et/ou indirect des nanoparticules de TiO2 et de ZnO.

Plusieurs études réalisées in vitro, évaluant l'effet cytotoxique des nanoparticules de TiO2 et de ZnO sur diverses lignées cellulaires montrent les effets délétères de celles-ci à des concentrations très faibles, de l'ordre de quelques microgrammes par millilitre (Tableau 16).

59 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Lignée cellulaire Nanoparticules Test utilisé Résultats Cellules épithéliales TiO (20 nm) Test au MTT CI 72h = 6,5 µg/mL bronchiques (BEAS-2B)143 2 50

Cellules épidermiques Test au MTT TiO (50 nm) Cytotoxicité dès 8 µg/mL humaines (A431)144 2 Test au rouge neutre

Test au MTT CI 24h = 8 µg/mL Cellules épidermiques 50 ZnO (30 nm) Test au rouge neutre Relargage de LDH dès 5 humaines (A431)145 Activité de la LDH µg/mL ZnO (50-70 nm) Test colorimétrique au CI 24h = 49,56 ± 12,89 ppm Fibroblastes humains146 50 TiO2 (< 150 nm) MTS (tétrazolium) CI50 24h = 2696 ± 667 ppm Tableau 16 : Quelques résultats de tests de cytotoxicité menés in vitro

En dehors de rares études comme celle de Theogaraj et al.147 correspondant à un test d'aberrations chromosomiques sur des cellules de hamster chinois (CHO) qui établit l'absence d'effet clastogène de différentes formes de TiO2 (anatase, rutile, mélange anatase/rutile), de tailles comprises entre 14 et 60 nm et enrobées, la majorité des études de la littérature montrent la tendance inverse.

148 L'étude de Rahman et al. a comparé la génotoxicité de particules de TiO2 sous formes sub-micrométriques (> 200 nm) et nanométriques (< 20 nm) grâce au test des micronoyaux, sur des fibroblastes embryonnaires de hamster syrien. Le nombre de micronoyaux induits aux concentrations comprises entre 0,5 et 5 µg/cm2 et à différents temps d'exposition (12, 24, 48, 66 et 72 heures) n'est augmenté que dans le cas des nanoparticules. Cette observation est confirmée par le même test dans l'étude de Gurr et 143 al. sur des cellules épithéliales bronchiques exposées à des nanoparticules de TiO2 de différentes tailles ou formes cristallines. Les résultats obtenus montrent un potentiel génotoxique du TiO2 sous forme nanoparticulaire anatase, potentiel absent lorsque les nanoparticules sont sous forme rutile ou que leur taille est supérieure à 200 nm. Ces résultats positifs in vitro ont également été observés in vivo dans l'étude de Trouiller et 149 al. chez la souris exposée à des nanoparticules de TiO2 (anatase/rutile, 75/25) de 21 nm. Le test des comètes a également été utilisé pour étudier la génotoxicité des nanoparticules de ZnO et de TiO2. In vitro, il s'est révélé positif pour le ZnO sur une lignée cellulaire 145 150 épithéliale cutanée ainsi que pour du TiO2 sur une lignée de lymphoblastes humains . In vivo chez la souris, le test des comètes réalisé sur du sang périphérique indique la présence de dommages primaires à l'ADN après traitement avec du TiO2 (anatase/rutile, 75/25) de 21 nm149.

Le plus souvent, la génotoxicité des nanoparticules est reliée à la génération d'un stress oxydant, pouvant être étudié soit par la recherche de lésions de l'ADN de type 8-oxo-7,8- dihydroguanine, soit de façon indirecte en mettant en évidence les effets moléculaires du stress oxydant. L'étude de Sharma et al.145 réalisée sur une lignée cellulaire épidermique humaine avec des nanoparticules de ZnO de 30 nm a analysé divers marqueurs du stress oxydant tels que le taux de glutathion, la peroxydation lipidique et l'activité enzymatique antioxydante. Une augmentation de la peroxydation lipidique et une diminution de l'activité enzymatique sont observées dès la concentration de 0,008 µg/mL. L'étude de

60 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Trouiller et al.149 menée in vivo montre, quant à elle, la présence de 8-Oxo-dG dans l'ADN de foie de souris. Cependant, la génotoxicité des nanoparticules de TiO2 n'impliquerait pas uniquement des mécanismes indirects puisque l'étude réalisée in vivo par Li et al.151 chez la souris indique la présence de dommages directs à l'ADN, caractérisés par des liaisons de type métal (titane, Ti4+)- nucléotides et des changements de conformation de l'ADN.

Les limites des études présentées ici sont d'une part qu'elles renseignent peu sur les caractéristiques des nanoparticules utilisées et d'autre part que les nanoparticules testées ne sont pas représentatives de celles commercialisées dans les produits cosmétiques. L'étude récente de Landsiedel et al.152 a réalisé, quant à elle, plusieurs tests de génotoxicité avec des nanoparticules de TiO2 et de ZnO commercialisées en tant que filtres UV dans les produits cosmétiques (Tableau 17).

Nom commercial Composition TM T-Lite SF TiO2 rutile; enrobées d'hydroxyde d'aluminium et de diméthicone/copolymère

méthicone (pourcentage de TiO2 : 79-89 %) TM T-Lite MAX TiO2 sous forme rutile enrobées de diméthoxydiphénylsilane/polymère de triéthoxycaprylysilane, de silice hydratée et d’hydroxyde d’aluminium (pourcentage de TiO2 : 69-73 %) Z-COTE® HP1 ZnO enrobées de triéthoxycaprylysilane (pourcentage de ZnO : 96-99 %) Z-COTE® MAX ZnO enrobées diméthoxydiphénylsilane/polymère de triéthoxycaprylysilane 152 Tableau 17 : Nanoparticules de TiO2 et ZnO évaluées dans l'étude de Landsiedel et al.

Les auteurs ne rapportent aucun effet mutagène pour les T-LiteTM SF, le T-LiteTM Max et le Z-COTE® MAX suite à la réalisation du test d'Ames avec des souches de Salmonella typhymurium. Toutefois, le test d'Ames ne serait pas adapté à l'évaluation du pouvoir mutagène des nanoparticules, puisque les cellules procaryotes sont incapables d'internaliser les nanoparticules par endocytose153. Le test des micronoyaux sur cellules V79 effectué après 4 et 24 heures d'exposition au T-LiteTM SF ne rapporte aucune augmentation du nombre de micronoyaux. Enfin, les auteurs réalisent un test des comètes sur des cellules pulmonaires de rats mâles après inhalation d'un aérosol contenant du T-LiteTM SF et concluent à une absence d'effet génotoxique. Bien qu'il s'agisse d'une étude menée sur des formes commerciales représentatives, plusieurs remarques peuvent être faites. D'une part, le potentiel génotoxique des quatre substances n'est, en fait, pas évalué puisque le T-LiteTM SF a été étudié avec trois modèles différents (test d'Ames, test du micronoyau et test des comètes) et les trois autres filtres uniquement avec un seul (test d'Ames), qui, de surcroît, ne serait pas adapté à l'étude de la génotoxicité des nanoparticules. D'autre part, la méthodologie du test des comètes présente plusieurs biais tels que le délai de réalisation du test après exposition, le faible nombre d'animaux inclus et l'absence de réalisation d'un témoin positif.

En considérant l'ensemble des résultats disponibles, il n'apparaît donc pas possible de conclure quant au potentiel génotoxique des nanoparticules de TiO2 et de ZnO lorsqu'elles sont introduites dans les produits cosmétiques. En effet, les tests de toxicité conventionnels ne sont pas toujours adaptés aux nanoparticules. De plus, une fois incorporées dans les

61 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

produits finis, les nanoparticules se trouvent souvent sous forme d'agrégats, dont la toxicité n'est pas explorée. Enfin, étant donnée la variabilité des résultats concernant le potentiel cytotoxique ou génotoxique des nanoparticules en fonction de leurs propriétés (taille, forme cristalline, enrobage), il apparaît nécessaire de réaliser des études au cas par cas.

IV. Etude de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans les produits de protection solaire

IV.1 Objectifs de l'étude

Les filtres solaires jouent un rôle fondamental dans la protection vis-à-vis des effets néfastes du rayonnement UV et particulièrement dans la prévention de l'érythème actinique. L'évolution de la composition des produits de protection solaire, intégrant des filtres permettant de couvrir un large spectre, devrait permettre de progresser en termes de protection vis-à-vis des effets à long terme. Néanmoins, les filtres inorganiques aujourd'hui utilisés sous forme nanoparticulaire soulèvent de nombreuses interrogations quant à leur innocuité. En 2011, l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (AFSSAPS) a émis des recommandations. La principale préconise de ne pas utiliser de

produit cosmétique, notamment de PPS, contenant du TiO2 sous forme nanoparticulaire sur peau lésée, sur le visage et dans les locaux fermés lorsque les nanoparticules sont contenues dans des sprays aérosol. Elle rappelle également que le ZnO ne peut pas être utilisé comme filtre solaire puisqu'il n'est pas inscrit sur la liste des filtres autorisés.

L'AFSSAPS estimerait alors nécessaire la réalisation d'études complémentaires en utilisant des nanoparticules représentatives de celles entrant dans la composition des produits de protection solaire et en réalisant une caractérisation préalable de celles-ci afin de pouvoir évaluer l'influence des propriétés physicochimiques.

Dans notre étude, nous nous sommes particulièrement intéressés au cas de l'oxyde de zinc, en raison de son utilisation fréquente dans les produits de protection solaire, notamment les produits labellisés "bio" et de son inscription sur la liste des colorants autorisés. De plus,

les données de la littérature sur le ZnO sont moins nombreuses que celles sur le TiO2. Dans un premier temps, nous avons réalisé au laboratoire Cibles et Médicaments des Infections et du Cancer (IICiMed) de Nantes, sous la responsabilité du Pr Christos ROUSSAKIS, l'évaluation de la sécurité d'emploi de différentes formes commerciales d'oxyde de zinc en recherchant, à partir d'un modèle in vitro de kératinocytes humains, une éventuelle activité sur la prolifération cellulaire (cytotoxicité) et en étudiant les cibles moléculaires impliquées (génotoxicité). La croissance cellulaire a été évaluée par un test colorimétrique au MTT puis les cibles moléculaires ont été étudiées par une application de la réaction de polymérase en chaîne (PCR) : la PCR quantitative. Nous nous sommes placés dans le contexte le plus simple à savoir l'étude de l'innocuité des substances non irradiées par les UV. Dans un deuxième temps, nous avons analysé les résultats des tests réalisés au sein du Laboratoire de Pharmacie Industrielle et de Cosmétologie (LPIC) de Nantes, évaluant l'efficacité photoprotectrice de plusieurs produits de protection solaire du commerce dits

62 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique minéraux. Ces tests ont consisté à déterminer selon une méthodologie in vitro l'indice de protection SPF des produits puis à le comparer à la valeur affichée sur le produit, valeur obtenue selon la méthodologie in vivo.

IV.2 Matériels et méthodes

IV.2.1 Produits de protection solaire et formes commerciales évalués

IV.2.1.1 Produits de protection solaire minéraux

Des tests d'évaluation de l'efficacité photoprotectrice de plusieurs produits minéraux, i.e. ne contenant que des filtres inorganiques seuls ou en mélange, ont été réalisés au laboratoire LPIC ces dernières années. Les produits, ainsi que leur composition, sont présentés dans le Tableau 18.

A noter qu'il n'est pas possible de savoir si les oxydes de zinc et de titane contenus dans ces produits sont de nature micrométrique ou nanométrique.

63 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Nom du produit Composition Caprylic/capric triglyceride, Zinc oxide, Helianthus annuus seed oil, Titanium dioxide, Silica, Bioregena crème Cetearyl alcohol, Glyceryl isostearate, Stearic acid, Alumina, Polyhydroxystearic acid, Pongamia solaire Enfants et glabra seed oil, Calendula officinalis flower extract, Tocopherol, Helianthus annuus seed oil, peaux sensibles SPF 50 Cetearyl glucoside, Aqua. Aqua, Titanium Dioxide, Glycine Soja Oil, Caprylic/Capric Triglyceride, Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate, Polyglyceryl-3 Diisostearate, Butyrospermum Parkii Butter, Glycerin, Olea Europaea Fruit Oil, Camellia Sinensis Leaf Extract, Olea Europaea Leaf Extract, Glyceryl Oleate, Crème solaire UV Bio Zinc Oxide, Canola Oil, Simmondsia Chinensis Oil, Chamomilla Recituta Flower Extract, 50 Oenothera Biennis Oil, Hippophae Rhamnoides Oil, Oryza Sativa Bran Oil, Macadamia Ternifolia Oil, Stearic Acid, Soy Bean, Lecithin, Parfum, Bisabolol, Tocopherol, Tocopheryl Acetate, Aluminium Hydroxide, Magnesium Sulfate, Citronellol, Limonene, Linalool. Caprylic/capric triglyceride, Zinc oxide, Aqua (water), Alcohol, Glycerin, Titanium dioxide, Mentha piperita water (mentha piperita (peppermint) leaf water), Dicaprylyl carbonate, Lauryl glucoside, Lovea Kids 30 Polyglyceryl-2 dipolyhydroxystearate, Glyceryl isostearate, Polyhydroxy stearic acid, Pongamia glabra seed oil, Polyglyceryl-2 stearate, Tocopherol, Xanthan gum, Citric acid, Dehydroacetic acid, Benzyl alcohol, Sodium benzoate, Potassium sorbate. Aqua, Glycine Soja Oil, Titanium Dioxide, Caprylic/Capric Triglyceride, Polyglyceryl 3 Ricionoleate , Glyceryl Oleate Butyrospermum Parkii Butter, Glycerin, Punica Granatum Extract, Ecocosmetics baby 45* Hippophae Rhamnoides Extract, Olea Europaea Leaf extract, Olea Europaea Oil, Simmondsia Chinensis Oil, Oenothera Biennis Extract, Hippophae Rhamnoides Oil, Oriza Sativa Bran Oil, Glycyrrhiza Glabra Extract, Mica, Tocopherol, Macadamia Ternifolia Oil , Parfum. Aqua, Glycine Soja Oil, Titanium Dioxide, Caprylic/Capric Triglyceride, Glycerin, Canola Oil*, Polyglyceryl-3 Ricionoleate, Alcohol, Olea Europaea Oil*, Olea Europaea Leaf Extract, Glyceryl Oleate, Zinc Oxide, Tocopheryl Acetate, Butyrospermum Parkii Butter*, Simmondsia Chinensis UV bio solaire 24 Oil*, Cocos Nucifera Oil*, Rice Brain Oil, Hippophae Rhamnoides Oil*, Glycyrrhiza Glabra Extract, Punica Granatum Extract*, Magnesium Sulfate, Macadamia Ternifolia Oil, Oenothera Biennis Oil, Mica, Xanthan Gum, Stearic Acid, Tocopherol, Parfum, Limonene, Linalool , Citronellol. Zinc oxide and Caprilic (capric triglyceride), Aqua (water), Dicaprylyl carbonate, Titanium dioxide, Alcool, Lauryl glucoside and polyglyeryl-2 dipolyhydroxystearate and glycerin, Metha piperita Alphanova bébé 30 water, Glycerin, Caprilic (capric triglyceride), Cocos nucifera (and) Gardiena tahitensis, Pongamia galbra seed oil, Polyglyceril-2 stearate, Xanthan gum, Tocopherol, Glyceryl caprylate, Citric acid, Polyepsilon-lysine. Caprylic/Capric Triglyceride, Zinc Oxide, Aloe Barbadensis Leaf Juice, Titanium Dioxide, Octyldodecanol, Glycerin, Polyglyceryl-3 Polyricinoleate, Sorbitan Isostearate, Cetearyl Alcohol, Crème solaire visage Silica, Glyceryl Isostearate, Alumina, Stearic Acid, Polyhydroxystearic Acid, Mauritia Flexuosa Florame 50 Fruit Oil, Helianthus Annuus (Sunflower) Seed Oil, Prunus Amygdalus Dulcis (Sweet Almond) Oil, Tocopherol, Cetearyl Glucoside, Bisabolol, Aqua (Water), Sodium Phytate, Parfum (Fragrance), Alcohol, Sodium Hydroxide. Titanium dioxide, C12-15 alkyl benzoate, Aqua (water), Uriage thermal spring water, Paraffinum liquidum (minera oil), Zinc oxide, Cyclopentasiloxane, Butylene glycol, Sodium chloride, Glycerin, Cyclohexasiloxane, Alimina, CI 77891 (titanium dioxide), PEG-30 dipolhydroxystearate, Stearic Crème minérale acid, hydroganated polydecene, magnesium stearate, PEG-45 (dodecyl glycol copolymer), Bariesun (Uriage) 50+ Stearalkonium hectorite, Magnesium ulfate, Glucose, Diphenyl dimethicone, Propylene carbonate, Ricinus communis (castor) seed oil, CI 77492 (iron oxides), Triethoxycaprylylsilane, Citric acid, Tocopheryl acetate, trehalose, CI 77491 (iron oxides), Ascorbyl tetraisopalmitate, CI 77499 (iron oxides), Glyceryl oleate, Ascorbyl palmitate, Tocopherol, Talc. Zinc Oxide, Caprylic/Capric Triglyceride, Aqua (Water), Dicaprylyl Carbonate, Glycerin,Coco- Caprylate, Coco-Caprylate/Caprate, Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate, CI 77891 (Titanium dioxide), Butyrospermum Parkii (Shea) Butter, Polyglyceryl-3 Diisostearate, Glyceryl Isostearate, Natessance IP30 Polyhydroxystearic Acid, Phenethyl Alcohol, Prunus Armeniaca (Apricot) Kernel Oil, Magnesium Sulfate, Glyceryl Undecylenate, Parfum (Fragrance), Glyceryl Caprylate, Alumina, Stearic Acid, Tocopherol, Aloe Barbadensis Leaf Juice Powder, Helianthus Annuus (Sunflower) Seed Oil, Sodium Hydroxide. Tableau 18 : Composition des produits de protection solaire minéraux testés

64 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

IV.2.1.2 Formes commerciales d'oxyde de zinc

Dans le cadre de l'évaluation de la sécurité d'emploi de l'oxyde de zinc, nous avons testé six formes commerciales différentes afin d'étudier l'influence de leurs caractéristiques physicochimiques (Tableau 19). En parallèle, le laurylsulfate de sodium (Cooper, Melun, France) a été utilisé comme témoin positif.

Forme commerciale Fournisseur Informations fournisseur

Goldschmidt, Essen, INCI : Zinc oxide Tego Sun Z500® Allemagne Taille : 10-60 nm INCI : Zind oxide, dimethoxydiphenylsilane, Z-Cote Max® BASF, Ludwigshafen, triethoxycaprylulsilane crosspolymer Allemagne Taille : < 0,2 μm Symrise, Holzminden, INCI : Zinc oxide ZnO Neutral® Allemagne Taille : particules : 41 nm / agglomérats 0,2 μm

® Symrise, Holzminden, INCI : Zinc oxide / dimethicone ZnO NDM Allemagne Taille particules < 50 nm / agglomérats : 2,8 μm Elementis specialities, INCI : Zinc oxide Nanox 200® Delden, Pays-Bas Taille particules : 60 nm INCI : Zinc oxide ZnO retamisé Cooper, Melun, France Taille : pigmentaire Tableau 19 : Les différentes formes commerciales de ZnO testées

IV.2.2 Caractérisation des formes commerciales d'oxyde de zinc

Conformément aux recommandations émises par les autorités de santé, nous avons réalisé une caractérisation des échantillons de ZnO testés, reposant sur la diffraction des rayons X et la microscopie électronique à transmission. Ces méthodes ont été mises en œuvre au Centre de Recherche sur la Matière Divisée à Chartres, sous la responsabilité du Dr Thierry DEVERS.

IV.2.2.1 Diffraction des rayons X

La diffraction des rayons X (DRX) est une méthode utilisée principalement pour identifier la nature des produits cristallins, i.e. des produits ayant un arrangement périodique et ordonné de leurs atomes constitutifs, ainsi que la taille du domaine cristallin, ou cristallite.

IV.2.2.1.1 Principe de la méthode

La DRX consiste en l'irradiation d'un échantillon à l'aide d'un faisceau de rayons X sous un angle θ, puis à mesurer l'intensité diffractée en fonction de l'angle 2θ. Lorsque les rayons X frappent un composé cristallin, les atomes de celui-ci les diffractent suivant des angles et des intensités spécifiques, dès lors que la condition de Bragg est remplie (Figure 25) :

65 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

2dhkl . sinθ = n . λ

avec dhkl, Distance inter-réticulaire ; θ, Angle de Bragg ; n, Ordre de diffraction et λ, Longueur d'onde des rayons X.

Figure 25 : Réflexion de Bragg

Un détecteur à rayons X enregistre l’intensité des rayons diffusés, en fonction de l’angle entre les rayons incidents et l'échantillon sur le support, et constitue un diagramme de diffraction ou diffractogramme : I = f (2θ). Les positions et les intensités des différentes raies de diffraction observées sont comparées à celles disponibles dans la banque de données ICDD (International Centre for Diffraction Data) regroupant les fiches de référence JCPDS (Joint Commitee Powder Diffraction Standards) qui permettent l'identification de l'échantillon.

L'estimation de la taille moyenne des cristallites a également été extraite de ces diffractogrammes, à partir de la formule de Scherrer et de la largeur à mi-hauteur des pics les plus intenses.

T = (K. λ) / (B. cos θ)

B = Bobs/Bstd avec T, Taille moyenne des cristallites ; K, Constante de Scherrer ; λ, Longueur d’onde du rayonnement incident ; Bobs, Largeur à mi-hauteur du pic de diffraction considéré ; Bstd, Contribution instrumentale à la largeur à mi-hauteur et θ, Angle de diffraction.

Afin de comparer les résultats obtenus avec les différents échantillons et d’optimiser la précision des résultats, la formule de Scherrer a toujours été appliquée aux trois pics les plus intenses, correspondant aux plans (100), (002), (101).

IV.2.2.1.2 Conditions expérimentales

Les mesures ont été effectuées avec un diffractomètre X’Pert PRO (PANanalytical) équipé d’une anti-cathode de cuivre, en utilisant la raie Kα de longueur d'onde λ = 0,154059 nm. Les échantillons, préalablement broyés dans un mortier en agate, sont déposés sur un

66 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique porte-échantillon en aluminium. Ils sont analysés dans un domaine angulaire compris entre 20° et 100° avec un pas de 0,007° et une durée de pas de 0,2 seconde.

Dans nos conditions expérimentales, la valeur de la constante de Scherrer est de 0,9.

IV.2.2.2 Microscopie électronique à transmission

La microscopie électronique à transmission (MET) fournit deux types d'informations : une image classique permettant d'étudier la taille et la morphologie des particules, ainsi qu'un diagramme de diffraction sous forme d'anneaux concentriques permettant de calculer les distances inter-réticulaires et d'identifier l'échantillon.

IV.2.2.2.1 Principe de la méthode

Les images sont obtenues par observation des électrons transmis au travers d'un échantillon (Figure 26). Un faisceau d'électrons est fourni par une pointe métallique en tungstène (cathode), soumise à un champ électrique intense et accéléré par des anodes ("canon à électron"). La différence de potentiel entre la cathode et l'anode définit la tension d'accélération des électrons. Le faisceau est dirigé vers l'échantillon grâce à des lentilles magnétiques. L'échantillon disperse les électrons qui le traversent et le faisceau est focalisé par des lentilles magnétiques pour former une image agrandie de l'échantillon.

Figure 26 : Principe d'un microscope électronique à transmission154

Les diagrammes de diffraction en aire sélectionnée sont obtenus à partir des électrons diffractés par les produits cristallins, recombinés pour former une image grâce à des lentilles magnétiques. La diffraction en aire sélectionnée permet d'identifier les phases cristallines en comparant les distances inter-réticulaires calculées à celles des fiches standards.

λ.L = R.dhkl

avec λ.L, Constante du microscope ; R, Rayon des anneaux de diffraction et dhkl, Distance inter-réticulaire.

67 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

L'analyse en MET étant plus locale que la DRX, elle permet la détection éventuelle d'impuretés cristallines non détectables avec la seconde méthode.

IV.2.2.2.2 Conditions expérimentales

Les clichés ont été réalisés à l'aide du microscope CM20 (Philips), avec une tension d'accélération de 200 kV. Les échantillons sont préalablement mis en suspension dans de l'éthanol et dispersés par passage aux ultrasons pendant 5 minutes. Après dispersion, une goutte est déposée sur une grille carbonée support.

IV.2.3 Evaluation de la sécurité d'emploi de l'oxyde de zinc

IV.2.3.1 Modèle cellulaire

IV.2.3.1.1 Caractéristiques de la lignée cellulaire

La lignée utilisée pour l'évaluation de l'activité des substances étudiées sur la prolifération cellulaire et pour la recherche des cibles moléculaires est la lignée NCTC2544 (ICLC HL97002, Institut National de Recherche pour le Cancer). Il s’agit d’une lignée épithéliale humaine, issue d’un kératinocyte sain, correspondant aux kératinocytes de la couche basale de la peau. Elle est cultivée en flacons de culture à bouchon filtrant dans un milieu de culture constitué de milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal (SVF, Gibco), de 1 % de glutamine 2 mM (Gibco) ainsi que de 1 % d'antibiotiques (Pénicilline-Streptomycine, Gibco). Les cellules sont maintenues à 37°C dans un incubateur sous une atmosphère contrôlée à 5 % de dioxyde de carbone (CO2). Dans ces conditions, le temps de doublement des cellules est d’environ 24 heures.

IV.2.3.1.2 Entretien des cellules

Le milieu est régulièrement renouvelé tous les 3 à 4 jours. Les cellules sont rincées avec du tampon phosphate (PBS, Gibco), puis mises en contact avec de la trypsine (Gibco) pendant 5 minutes à 37°C. La trypsine est une enzyme peptidasique qui permet de scinder les protéines liant les cellules au support de culture. Du milieu de culture est ajouté afin de stopper l’action de la trypsine. Après comptage des kératinocytes en cellule de Malassez, une partie de la suspension cellulaire est transférée dans un nouveau flacon de culture, avec du milieu de culture.

IV.2.3.1.3 Synchronisation des cellules

Les cibles moléculaires étudiées interviennent à différents niveaux du cycle cellulaire. Afin de pouvoir mettre en évidence une tendance pour l’expression génique de ces cibles, les travaux sur la recherche des cibles moléculaires ont donc été réalisés avec des cellules synchronisées, i.e. cellules qui se trouvent pour une grande majorité dans la même phase du cycle cellulaire. La synchronisation a été réalisée sans traitement chimique, selon le

68 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique protocole de Moreau et al.155. Les cellules qui entrent en mitose perdent leur cytosquelette, prennent une forme arrondie et n’adhèrent plus que faiblement au fond du flacon de culture pendant toute la durée de la mitose. Les cellules ayant achevé leur mitose reconstituent leur cytosquelette et adhèrent à nouveau au fond du flacon de culture lorsqu’elles entrent en phase G1. Il est donc possible de récupérer et d’isoler les cellules en mitose, par simple agitation du flacon de culture. Les cellules se décrochent et se trouvent en suspension dans le milieu. La suspension cellulaire est alors récupérée et les cellules sont directement utilisées pour le test de recherche des cibles moléculaires.

IV.2.3.2 Détermination des concentrations inhibitrices 50 %

IV.2.3.2.1 Principe de la méthode

La détermination de l’activité antiproliférative a été réalisée en évaluant la concentration de substance inhibant 50 % de la croissance cellulaire (CI50) par rapport à un témoin cultivé dans les mêmes conditions en l’absence de la substance étudiée, afin de minimiser l’influence du milieu de culture sur les effets observés.

La détermination de la viabilité cellulaire est basée sur le test colorimétrique au MTT qui permet de rendre compte de l’activité de la succinate deshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes, enzyme qui coupe le cycle tétrazolium du MTT de couleur jaune. Des cristaux de formazan violets sont alors formés. Après dissolution des cristaux, une lecture spectrophotométrique de l’absorbance est réalisée à 570 nm. Le clivage se produisant uniquement dans les cellules vivantes, l’intensité de la coloration est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. Ce test a été choisi en raison de son utilisation très fréquente lors des études de la détermination des effets cytotoxiques des nanoparticules.

IV.2.3.2.2 Protocole

Le test de détermination des CI50 est réalisé en microplaque 96-puits (Falcon) selon le protocole établi par Roussakis et al.156. La veille du test, les cellules sont placées en phase exponentielle de croissance par repiquage. Le jour du test, une solution-mère aqueuse de la substance à tester à une concentration de 1 mg/mL est préparée. Les substances qui ne sont pas solubles dans l'eau sont préalablement dissoutes dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), dont la concentration finale, inférieure à 1 %, ne présente aucun effet délétère sur la croissance cellulaire.

Distribution du milieu de culture : Dans une première plaque, 100 µL de milieu de culture sont distribués dans plusieurs puits (Figure 27) : - les puits périphériques, qui ne sont pas utilisés du fait d’une évaporation trop importante ; - les puits de la colonne 2 : blanc optique ; - les puits de la colonne 7 : témoin ;

69 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

- 1 puits sur 2 dans les colonnes restantes (3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11) : substances à tester.

Figure 27 : Distribution du milieu de culture

100 µL de milieu de culture sont également distribués dans 6 puits d’une seconde plaque

("plaque J0") qui est révélée le jour même de la préparation afin d’évaluer le nombre de cellules au temps initial.

Préparation et distribution des substances à tester : Chaque colonne contient une substance, à trois dilutions différentes en dupliqua. Pour chaque substance, une solution à 540 µg/mL est préparée à partir de la solution-mère. Lors de la distribution des substances dans la plaque, trois dilutions au tiers vont être réalisées, conduisant aux trois concentrations : 180 µg/mL, 60 µg/mL et 20 µg/mL. L'ajout ultérieur de la suspension cellulaire entrainera une dilution au 1/2. Il en résulte que chaque substance est testée à trois concentrations différentes : 90 µg/mL, 30 µg/mL et 10 µg/mL.

50 µL de la solution de substance à tester sont déposés dans le puits B3 (dilution au 1/3 de la solution). Une dilution en cascade est réalisée dans les puits D3 (dilution au 1/3 du puits B3) et F3 (dilution au 1/3 du puits D3). Enfin, chaque puits est dédoublé : 50 µL de B3, D3 et F3 sont déposés dans C3, E3 et G3 respectivement (Figure 28). Les colonnes 4, 5, 6, 8, 9, 10 et 11 sont préparées de la même manière.

Figure 28 : Distribution des substances

70 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Préparation et distribution de la suspension cellulaire : Une suspension cellulaire à 4x104 cellules/mL est préparée par repiquage à partir des cellules préparées la veille du test. Les puits des colonnes 3 à 11, ainsi que les puits de la plaque "J0" sont complétés avec 50 µL de cette suspension cellulaire (dilution au 1/2 des substances). La plaque contenant les substances à tester est ensuite placée à l’incubateur pendant 72 heures, à 37°C sous atmosphère contrôlée à 5 % de CO2. La plaque "J0" est placée dans les mêmes conditions pendant 1 heure.

Révélation : A l’issue de l’incubation, la croissance cellulaire est estimée par un test colorimétrique décrit par Mosmann et al.157. Dans chaque puits sont distribués 10 µL de MTT (Sigma- Aldrich, solution à 4 mg/mL dans du PBS). La plaque est à nouveau incubée pendant 3 heures. 100 µL d’isopropanol acide (Sigma-Aldrich) sont ensuite ajoutés afin de solubiliser les cristaux violets formés suite à la réduction du MTT par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes. L'absorbance (A) de chaque puits est déterminée à 570 nm sur un lecteur de microplaque ELISA (Titertek multiscan) afin d’évaluer la croissance cellulaire.

La proportionnalité entre l'absorbance et le nombre de cellules vivantes permet le calcul d'un pourcentage de croissance cellulaire.

A cellules traitées (J3) – A (J0) % de croissance cellulaire = 100 x A témoin (J3) – A (J0)

La CI50 est calculée à partir de l’équation : % de croissance = log (concentration).

IV.2.3.3 Cinétiques de croissance continue et discontinue

Afin d'évaluer le profil de l'activité des différentes formes commerciales de ZnO sur la prolifération cellulaire, des cinétiques de croissance cellulaire ont été réalisées. En pratique, il s’agit du suivi de la croissance des cellules en présence de la substance testée au cours du temps, par évaluation de la concentration cellulaire toutes les 24 heures, pendant 72 heures. En fonction du profil de croissance obtenu, un mécanisme d’activité peut être associé. De plus, il est possible de déterminer si cette activité est réversible en étudiant la reprise ou non de la croissance des cellules, après traitement pendant 72 heures par la substance.

IV.2.3.3.1 Protocole

IV.2.3.3.1.1 Cinétiques de croissance continue

La veille du test, les cellules sont placées en phase exponentielle de croissance par repiquage. Le jour du test (J0), trois plaques 96-puits sont préparées afin d'évaluer la croissance cellulaire après respectivement 24, 48 et 72 heures de traitement. Une solution-

71 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique mère aqueuse de chaque substance à tester à une concentration de 1 mg/mL est préparée. Les substances insolubles dans l'eau sont préalablement dissoutes dans du DMSO.

Distribution du milieu de culture : Dans les trois plaques, 100 µL de milieu de culture sont distribués dans les puits périphériques ainsi que dans les puits de la colonne 2 (blanc optique). 50 µL sont distribués dans les puits de la colonne 7 (témoin) (Figure 29).

Figure 29 : Distribution du milieu de culture

50 µL sont également distribués dans 6 puits d’une plaque "J0" qui est révélée le jour même de la préparation du test afin d’évaluer le nombre de cellules au temps t0.

Préparation et distribution des substances à tester : Chaque plaque contient deux substances distinctes à tester, à quatre concentrations différentes (une concentration par colonne) permettant d'encadrer la valeur de CI50. Pour chaque substance, quatre solutions sont préparées à partir de la solution-mère : 160 µg/mL, 120 µg/mL, 80 µg/mL et 40 µg/mL. L'ajout ultérieur de la suspension cellulaire entraînera une dilution au 1/2. En conséquence, chaque substance est testée à quatre concentrations différentes : 80 µg/mL, 60 µg/mL, 40 µg/mL et 20 µg/mL.

50 µL de chaque solution de substance à tester sont distribués dans les puits de la colonne correspondant à la concentration (Figure 30).

Figure 30 : Distribution des substances

72 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Préparation et distribution de la suspension cellulaire : Une suspension cellulaire à 4x104 cellules/mL est préparée, et 50 µL de cette suspension sont ajoutés dans les puits des colonnes des substances (dilution au 1/2 des substances), du témoin et de la plaque "J0". Les plaques sont ensuite incubées à 37°C sous 5 % de CO2 pendant : 1 heure (plaque "J0"), 24 heures (plaque n°1), 48 heures (plaque n°2) ou 72 heures (plaque n°3).

Révélation :

De J0 à J3, la croissance des cellules est déterminée par le test colorimétrique au MTT, toutes les 24 heures, pendant 72 heures.

IV.2.3.3.1.2 Cinétiques de croissance discontinue

Dans ce cas de figure, les cellules sont d’abord soumises à l’action de la substance pendant 72 heures et la croissance n’est évaluée qu’après retrait de celle-ci. Quatre plaques sont préparées selon le même protocole que celui des cinétiques de croissance continue, mais à une densité inférieure de cellules afin de ne pas saturer les puits (3x104 cellules/mL). L’évaluation de la croissance cellulaire par le test colorimétrique est alors effectuée à partir de l’arrêt du traitement (t0 ; plaque n°1), toutes les 24 heures pendant 72 heures (plaques n° 2, 3 et 4).

IV.2.3.4 Observation des changements morphologiques des cellules

La morphologie des cellules traitées au ZnO a été observée au microscope puis un marquage par un fluorochrome permettant la caractérisation des corps apoptotiques a été réalisé.

L’acridine orange est un fluorochrome qui se fixe au niveau des acides nucléiques. Il permet de colorer les cellules en culture en marquant différentiellement l’ADN en vert et l’acide ribonucléique (ARN) en rouge. Après traitement, les cellules sont incubées 15 minutes avec 10 μg/mL d’acridine orange avant d’être observées avec un microscope à fluorescence Provis AX70 (filtre excitant : BP 450-480, Olympus) sous lumière bleue. Les cellules apoptotiques présentent une morphologie facilement identifiable : condensation puis fragmentation du noyau, cassure régulière des chromosomes, et bourgeonnement du cytoplasme sous forme de petits ballonnets nommés corps apoptotiques.

IV.2.3.5 Recherche des cibles moléculaires impliquées dans le phénomène de génotoxicité

IV.2.3.5.1 Les cibles moléculaires explorées

Afin de mettre en évidence un éventuel pouvoir génotoxique des nanoparticules de ZnO, nous avons étudié leur influence sur l'expression de deux gènes spécifiques. D'une part, nous nous sommes intéressés au gène P53, puisqu'il s'agit d'un gène-clé dans la réponse

73 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique cellulaire à un stress génotoxique. D'autre part, nous avons décidé d'étudier le gène HEF1 qui fait l'objet de travaux depuis de nombreuses années au laboratoire IICiMed. Il s'agit d'un gène qui code pour une protéine impliquée dans les processus de migration, de différenciation, de prolifération et d’apoptose cellulaires158. Le but de ces expérimentations est d'évaluer l'influence du traitement des cellules par les nanoparticules au niveau de l'expression de ces gènes grâce à la technique de PCR quantitative ou qPCR. Une surexpression serait le témoin d'une génotoxicité.

IV.2.3.5.2 Principe de la méthode

La PCR quantitative est une application de la PCR reconnue comme la technique la plus sensible et la plus fréquemment utilisée pour la détection et la quantification de l’ARN. La PCR est une technique de réplication ciblée in vitro qui permet d'obtenir, à partir d'un échantillon peu abondant et après n cycles, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie. L'avantage de la qPCR est qu'elle permet de suivre au cours du temps la quantité de produits amplifiés, en détectant la fluorescence émise par les produits néo-formés grâce à un système de mesure externe. Les données de fluorescence sont collectées à chaque cycle de la PCR, et représentent la quantité de produits amplifiés à cet instant.

Le suivi de la fluorescence au cours du temps montre trois phases : - une phase de bruit de fond durant laquelle la quantité de fragment amplifié est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond ; - une phase exponentielle de croissance qui démarre lorsque la quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil. Ce point est défini comme le cycle seuil Ct, ou « cycle treshold » (Figure 31). Durant cette phase, le nombre de produits amplifiés double à chaque cycle. - une phase de plateau liée à l'épuisement en réactifs.

Figure 31 : Evolution de la fluorescence en valeur logarithmique au cours des cycles de PCR

74 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Pour chaque expérimentation, une gamme d’étalonnage est réalisée à partir de dilutions en série d’un témoin non traité au temps initial (t0). Elle représente les valeurs de Ct obtenues en fonction du logarithme des concentrations en molécules cibles du témoin. A partir de cette courbe, il est possible d’obtenir une quantité relative d’ARN messager (ARNm) du gène cible et d’observer s’il existe une surexpression de ce gène, entre un échantillon traité après un temps déterminé et l’échantillon non traité correspondant.

IV.2.3.5.3 Protocole

Traitement des cellules : La veille de la manipulation, les cellules sont placées en phase exponentielle de croissance par repiquage. Le jour même, elles sont synchronisées et comptées, puis sont ensemencées dans des plaques 6-puits à une densité au moins égale à 10 000 cellules/mL, afin d'obtenir une quantité suffisante d'ARNm. Après une incubation pendant 1 heure à 37°C, 5 % de

CO2, les cellules sont traitées avec la substance à tester à une concentration correspondant à la moitié de la CI50. L'expérience du laboratoire IICiMed dans la recherche de la surexpression du gène HEF1 dans d'autres lignées cellulaires nous a conduits à utiliser des durées de traitement s'échelonnant entre 20 et 30 heures. Pour chaque temps de traitement, des puits contenant des cellules non traitées (contrôle) sont préparés. En raison des durées et des coûts de ces manipulations, un seul échantillon a été sélectionné correspondant à une forme non enrobée de ZnO (Tego Sun Z500®).

Extraction d'ARN : Les ARN totaux (ARNt) sont extraits à partir des kératinocytes NCTC2544, préalablement traités ou non, grâce au kit d'extraction Dynabeads® mRNA DIRECTTM (Invitrogen) selon les indications du fournisseur. Ce kit est constitué de billes qui s’hybrident avec l’ARN. La qualité et la quantité des ARN sont déterminées par spectrophotométrie à la longueur d’onde de 260 nm. Les ARN sont ensuite conservés à -80°C.

Reverse transcription : La reverse transcription a pour but d'obtenir les ADN complémentaires (ADNc) à partir des ARNt et d’amorces aléatoires. Elle est effectuée sur une quantité de 1 à 2 µg d’ARN dans un volume final de 25 µL contenant 2 µL d’amorces aléatoires Random Primers (Promega). Les ARN sont linéarisés à 70°C pendant 10 minutes, puis déposés immédiatement sur de la glace afin de conserver cette linéarisation. Après cette étape, un mélange de désoxyribonucléotides (2mM), de tampon 1X M-MLV (Tris HCL 250 mM, ® KCL 375 mM, MgCl2 15 mM et DTT 50 mM), de 25 unités de RNAsin ribonucléase inhibiteur recombinante et de 200 U de M-MLV Reverse transcriptase sont ajoutés aux échantillons d’ARN linéarisés. Enfin, le mélange est complété avec de l’eau "RNAse free" pour un volume réactionnel final de 45 µL. Les échantillons sont incubés pendant 2 heures à 37°C. Les ADNc peuvent être testés par qPCR ou être conservés à -20°C.

75 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

Réaction de polymérase en chaîne quantitative : Le système de fluorescence utilisé dans nos expérimentations est le Sybr® Green, un agent intercalant qui émet une fluorescence lorsqu’il se fixe à l’ADN double brin. Les dosages d’ARN sont réalisés en plaque 96-puits, organisée de façon à pouvoir contenir une gamme étalon pour chaque gène testé, les échantillons réalisés en dupliqua, et des contrôles permettant de vérifier qu’il n’existe pas de contamination ou d’amplification aspécifique.

Lors de la préparation des échantillons, les ADNc sont préalablement dilués afin d’obtenir une concentration finale de 0,002 µg/mL dans les plaques. 5 µL de cette dilution sont mis en présence de 20 µL d'un mélange contenant 10 pmol d’amorces sens et 10 pmol d’amorces antisens du gène cible et 1X de Sybr® Green PCR Master mix™ (Applied Biosystems). En parallèle, ce même mélange est effectué avec un gène de référence sélectionné du fait de son expression constante dans tous les tissus, la β-actine. Les séquences des amorces utilisées pour les gènes HEF1, P53 et β-actine sont répertoriées dans le tableau 20.

Gène Amorce sens Amorce anti-sens P53 5’GTTCCGAGAGCTGAATGAGG3’ 5’TCTGAGTCAGGCCCTTCTGT3’ HEF1 5’CCGCTGCCGAAATGAAGTAT3’ 5’CCCTGTGTTCTGCTCTATGACG3’ β-actine 5’TTGCTGACAGGATGCAGAAG3’ 5’GTACTTGCGCTCAGGAGGAG3’ Tableau 20 : Amorces utilisées pour la PCR quantitative

Une fois le processus de qPCR terminé, les résultats sont analysés par le logiciel GeneAmp® 5700 SDS, qui calcule pour chaque échantillon une valeur de Ct à partir des courbes logarithmiques. La quantité d’ARN du gène cible est pondérée par la valeur du gène contrôle. Un test de Student (α = 0,01) est réalisé à l'aide du logiciel XLStat2010® afin d’examiner la significativité des différences entre les résultats obtenus pour l’échantillon traité par le Tego Sun Z500® et l’échantillon témoin.

IV.2.4 Evaluation de l’efficacité photoprotectrice

Le niveau d'efficacité photoprotectrice des produits de protection solaire minéraux a été déterminé au LPIC par une méthodologie in vitro, adaptée du protocole in vivo décrit dans la norme ISO 24444 : 2010159. Le produit à tester est étalé sur une plaque de polyméthylméthacrylate (PMMA, Europlast), de 5 cm de côté, préalablement nettoyée à l’éthanol afin d’éliminer d’éventuelles impuretés. 50 mg de produit sont déposés sur toute la surface de la face rugueuse de la plaque, puis sont étalés avec un doigtier par effleurement jusqu’à obtention d’un film homogène. L’objectif est d’atteindre une masse de 15 ± 0,5 mg, soit 0,6 mg/cm2, valeur obtenue par corrélation avec la méthode in vivo159. Pour chaque produit à tester, trois plaques sont préparées.

76 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

La transmittance de neuf points par plaque est déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre à sphère d’intégration UV-2000S (Labsphere), après réalisation d’un blanc correspondant à une plaque de PMMA imprégnée de glycérine. La moyenne et l’écart-type des 27 valeurs générées pour chaque produit testé sont ensuite calculés.

IV.3 Résultats

IV.3.1 Caractérisation des formes commerciales d'oxyde de zinc

Tous les diffractogrammes obtenus par DRX à partir des six poudres d'oxyde de zinc testées ont montré la présence de pics attribuables à la phase ZnO (cf annexe n°1) (JCPDS N°36-1451). Cette analyse a été confirmée par les diagrammes de diffraction électronique en aire sélectionnée obtenus par microscopie électronique à transmission. Néanmoins pour certaines formes commerciales, le calcul de la taille moyenne des cristallites à partir de la formule de Scherrer montre des différences avec les valeurs annoncées par les fournisseurs, notamment pour l'oxyde de zinc retamisé, présenté comme une poudre d'oxyde de zinc pigmentaire (Tableau 21).

Forme Taille des cristallites obtenue par DRX (nm) Taille issue des données commerciale (moyenne ± écart type) fournisseur ZnO retamisé 77,03 ± 6,53 pigmentaire Z-Cote Max® 54,00 ± 6,25 < 0,2 µm Tego Sun Z500® 36,8 ± 3,85 10-60 nm ZnO Neutral® 32,56 ± 1,55 41 nm ZnO NDM® 28,20 ± 1,37 < 50 nm Nanox 200® 20,03 ± 1,04 60 nm Tableau 21 : Comparaison des tailles des cristallites des échantillons de ZnO

Il est intéressant de noter que certains fournisseurs ne mentionnent pas toujours si la taille des particules donnée sur la fiche des spécifications correspond à la taille des cristallites ou à celle des agrégats, ce qui peut rendre l’interprétation difficile.

Les différents clichés réalisés en MET montrent que selon la forme commerciale de ZnO testée, la morphologie des particules est différente (Figure 32). Pour trois d'entre-elles (Tego Sun Z500®, Z-Cote Max® et oxyde de zinc retamisé), nous observons une hétérogénéité dans la forme et la taille des particules. Les différences sont particulièrement importantes entre les particules du ZnO retamisé, pour lequel apparaissent des particules rectangulaires d'une cinquantaine de nanomètres et des bâtonnets de plusieurs centaines de nanomètres.

77 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

ZnO Neutral®

Tego Sun Z500®

Z-Cote Max®

ZnO Neutral®

ZnO NDM®

Nanox 200®

Figure 32 : Images obtenues en MET avec les différentes formes commerciales de ZnO testées

78 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

IV.3.2 Evaluation de la sécurité d'emploi de l'oxyde de zinc

IV.3.2.1 Détermination des CI50

L'influence des six formes commerciales de ZnO étudiées sur la prolifération cellulaire a

été évaluée. Toutes entraînent une diminution de la croissance cellulaire, avec des CI50 variant de 11,1 à 45,2 µg/mL (Tableau 22).

Forme commerciale CI50 72h (µg/mL) Rappel des caractéristiques (enrobage et taille moyenne déterminée par DRX) ZnO retamisé 45,2 ± 1,0 Particules non enrobées Ŕ 77 nm Z-Cote Max® 33,9 ± 2,5 Particules enrobées Ŕ 54 nm Tego Sun Z500® 31,2 ± 2,3 Particules non enrobées Ŕ 37 nm ZnO Neutral® 26,5 ± 1,1 Particules non enrobées Ŕ 33 nm ZnO NDM® 12,1 ± 1,3 Particules enrobées Ŕ 28 nm Nanox 200® 11,1 ± 0,7 Particules non enrobées Ŕ 20 nm

Tableau 22 : Valeurs de CI50 obtenues pour les différentes formes commerciales de ZnO

Nous pouvons déduire de cette première observation plusieurs remarques. En comparant les valeurs des CI50 des formes commerciales de ZnO non enrobé, nous constatons que la diminution de la croissance cellulaire semble corrélée avec la diminution de la taille des particules. En effet, ce sont les nanoparticules de plus petites tailles (Nanox 200® et ZnO ® NDM ) qui présentent les valeurs de CI50 les plus faibles, tandis que celles possédant les plus grandes tailles (ZnO retamisé) montrent la valeur de CI50 la plus élevée. En revanche, l'inhibition de la prolifération cellulaire ne semble pas diminuer avec la présence d'un enrobage. En effet, le ZnO NDM®, dont les particules sont enrobées de diméthicone, entraîne une inhibition de 50 % de la croissance cellulaire à des doses plus faibles que les filtres non enrobés tels que le Tego Sun Z500® et le ZnO Neutral®. Il est important de noter qu'à l'exception de l'oxyde de zinc retamisé, les formes commerciales de ZnO inhibent davantage la prolifération cellulaire que le laurylsulfate de sodium (CI50 = 40,7 µg/mL).

Les valeurs de CI50 observées pour les différentes formes commerciales d'oxyde de zinc testées nous ont conduits à étudier la croissance des cellules exposées au cours du temps, afin de déterminer un profil d'activité. En effet, il peut s'agir d’une activité antiproliférative (i.e. inhibition réversible de la croissance cellulaire), d’une activité cytostatique (i.e. inhibition de la prolifération cellulaire irréversible) ou d’une activité cytotoxique (i.e. entraînant des effets délétères sur la structure ou les fonctions cellulaires, provoquant in fine la mort cellulaire).

IV.3.2.2 Réalisation des cinétiques de croissance cellulaire

L'ensemble des cinétiques de croissance cellulaire, après traitement par les différentes formes commerciales de ZnO, montrent une diminution de la croissance cellulaire par

79 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique rapport au témoin, à partir de 24 heures (Figure 33). Il apparaît également que l'inhibition de la prolifération cellulaire est dose-dépendante. Un plateau est observé pour les expositions aux concentrations les plus fortes, à partir de 24 ou de 48 heures selon la forme commerciale de ZnO étudiée, ce qui peut représenter le profil d’une activité antiproliférative ou d'une activité cytostatique.

a) Tego Sun Z500®, b) Nanox 200®, c) ZnO NDM®, d) Z-Cote MAX®, e) ZnO retamisé, f) ZnO Neutral® Figure 33 : Cinétiques de croissance continue des kératinocytes NCTC2544 après traitement par du ZnO

Les cinétiques de croissance discontinue nous permettent d'évaluer le caractère réversible ou non de l'activité observée. A l'exception du ZnO NDM® et du ZnO Neutral® aux plus fortes doses, nous observons que les cellules reprennent une croissance similaire à celle du témoin (Figure 34a, b, d, e) et que l’activité est donc réversible. En revanche, la non reprise

80 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique d’une croissance cellulaire normale après traitement aux ZnO NDM® et Neutral® représente le profil typique d’une activité cytostatique (Figure 34c, f), qui doit mener vers une mort cellulaire de type apoptotique.

a) Tego Sun Z500®, b) Nanox 200®, c) ZnO NDM®, d) Z-Cote Max®, e) ZnO retamisé, f) ZnO Neutral® Figure 34 : Cinétiques de croissance discontinue des kératinocytes NCTC2544 après traitement par du ZnO

IV.3.2.3 Observations microscopiques

La morphologie des cellules après traitement avec les nanoparticules a été étudiée à l'aide d'un microscope Provis AX70 (Olympus). Par rapport au contrôle, les clichés des cellules

81 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique exposées au ZnO Neutral® ou au ZnO NDM® montrent une diminution du nombre de cellules et la présence de vésicules, qui pourraient être des corps apoptotiques (Figure 35).

a) cellules non traitées (contrôle), b) cellules traitées au ZnO Neutral® Figure 35 : Observation des kératinocytes NCTC2544 en microscopie

Les observations en microscopie à fluorescence confirment que les formes commerciales de ZnO ayant induit une activité cytostatique (ZnO NDM® et Neutral®) entraînent l’apoptose. En effet, nous observons la présence de cellules présentant une condensation du noyau, laissant apparaître plus facilement l’ARN cellulaire coloré en rouge, et la formation de corps apoptotiques (Figure 36b, c).

a) cellules témoins, b) cellules traitées au ZnO NDM® , c) cellules traitées au ZnO Neutral® Figure 36 : Observation des kératinocytes NCTC2544 marqués à l'acridine orange

Les différentes études concernant l'activité des nanoparticules sur la prolifération cellulaire, complétées par le test à l'acridine orange, montrent que l'exposition des kératinocytes NCTC2544 à de l'oxyde de zinc nanométrique peut conduire à l'apoptose. Or, il s'agit d'une réponse cellulaire face à des lésions de l'ADN, suggérant un potentiel génotoxique de ces nanoparticules.

IV.3.2.4 Activité génotoxique

L'étude du pouvoir génotoxique du ZnO a été évalué par qPCR sur le gène P53 entre 20 heures et 30 heures de traitement. Au temps t = 24 heures, et lors de deux expériences ® distinctes, les cellules traitées par le Tego Sun Z500 (CI50/2 = 15,5 µg/mL) présentent une

82 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique surexpression significative du gène P53, mettant en évidence son caractère génotoxique (Figure 37).

a) expérience n°1, b) expérience n°2 Figure 37 : Histogrammes représentant l’expression du gène P53 dans les cellules NCTC2544 à 24 et 25 heures avec traitement ou non par le Tego Sun Z500® à 15,5 µg/mL

L’étude de l’expression du gène HEF1 a été réalisée dans les mêmes conditions, afin d’évaluer si une augmentation de l’expression du gène P53 entraînait également la

83 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique surexpression du gène HEF1. Les résultats de deux qPCR distinctes montrent une surexpression significative au temps t = 26 heures (Figure 38).

a)

b)

a) expérience n°1, b) expérience n°2 Figure 38 : Histogrammes représentant l’expression du gène HEF1 dans les cellules NCTC2544 à 25 et 26 heures avec traitement ou non par le Tego Sun Z500® à 15,5 µg/mL

84 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique

IV.3.3 Evaluation de l'efficacité photoprotectrice des produits de protection solaire minéraux

Les produits évalués in vitro au LPIC par spectrophotométrie de transmission présentent des valeurs de SPF largement inférieures aux valeurs affichées (Tableau 23).

Composition filtrante (position dans la Produit et SPF affiché SPF déterminé in vitro liste des ingrédients) Bioregena crème solaire Enfants et Zinc oxide (2) / Titanium dioxide (4) 16 peaux sensibles SPF 50 Crème solaire UV Bio 50 Titanium dioxide (2) / Zinc oxide (12) 24 Lovea Kids 30 Zinc oxide (2) / Titanium dioxide (6) 9 Ecocosmetics baby 45 Titanium dioxide (3) 22 UV bio solaire 24 Titanium dioxide (3) / Zinc oxide (12) 12 Alphanova bébé 30 Zinc oxide (1) / Titanium dioxide (4) 10 Crème solaire visage Florame 50 Zinc oxide (2) / Titanium dioxide (4) 15 Crème minérale Bariesun (Uriage) 50+ Titanium dioxide (1) / Zinc oxide (5) 28 Natessance IP30 Zinc oxide (1) / Titanium dioxide (9) 10 Tableau 23 : SPF des produits obtenus in vitro

La différence est d'autant plus marquée que les produits de protection solaire revendiquent leur appartenance à la catégorie "haute protection" (SPF > 50), tels que la crème solaire visage Florame 50® qui, d'après les résultats obtenus devrait appartenir à la catégorie "moyenne protection" et afficher un SPF de 15.

Nous constatons également que les écarts les plus importants sont retrouvés pour les produits contenant de l'oxyde de zinc en quantité supérieure à celle de dioxyde de titane, suggérant une efficacité du TiO2 supérieure à celle de ZnO.

Bien que la formule quantitative ne soit pas connue, il est possible d'estimer que les filtres inorganiques en première place dans la liste des ingrédients ne se trouvent pas au-delà de 15 %, valeur limite à ne pas dépasser pour obtenir une texture commercialement acceptable.

IV.4 Discussion

La photoprotection topique, utilisée depuis plus d'un demi-siècle, s'appuie sur l'incorporation d'actifs photoprotecteurs, les filtres solaires, au sein de diverses formes galéniques telles que les émulsions, les huiles ou les sticks. A l'origine, la protection apportée était faible et ne couvrait que le domaine des UVB. Les progrès technologiques, notamment en chimie, ont permis la mise à disposition d'une large gamme de filtres solaires au spectre d'action englobant le domaine UVA. La catégorie des filtres inorganiques, majoritairement représentée par le dioxyde de titane et l'oxyde de zinc, suscite aujourd'hui une véritable polémique. Actuellement utilisés sous forme nanoparticulaire, ils sont notamment suspectés d'avoir la capacité de créer des radicaux

85 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique libres, qui pourraient être à l'origine de lésions de l'ADN130. Pourtant, les filtres inorganiques sont largement rencontrés dans les produits de protection solaire. En 2007, l'analyse de 308 produits révélait que 3,6 % ne contenaient que des filtres inorganiques, 54,8 % ne contenaient que des filtres organiques et 41,6 % un mélange des deux160. Par conséquent, il est important d'obtenir des conclusions précises quant à leur innocuité. En 2011, l'AFSSAPS préconisait de réaliser de nouvelles études, sur des nanoparticules représentatives de celles utilisées dans les produits de protection solaire.

Dans cette étude, nous avons évalué l'efficacité photoprotectrice de produits de protection solaire à base d'oxyde de zinc, ainsi que la sécurité d'emploi de la matière première.

L'analyse des résultats concernant l'efficacité photoprotectrice de neuf produits de protection solaire minéraux révèle que le SPF déterminé in vitro est inférieur à celui annoncé par l'étiquetage. Cette différence entre l'indice de protection solaire dans les UVB affiché et celui obtenu au LPIC est principalement liée au fait que les tests réalisés par l'industriel sont effectués in vivo. Il est en effet connu que de nombreux facteurs tels que le phototype des volontaires et la saison influencent les résultats obtenus avec la méthodologie in vivo. Cette différence pourrait également être directement liée aux ingrédients de la formulation. Couteau et al.161 ont montré que l'oxyde de zinc, ainsi que d'autres filtres solaires, présentait des propriétés anti-inflammatoires qui permettent de surestimer le SPF déterminé in vivo en inhibant l'apparition de l'érythème, sans pour autant protéger. L'action anti-inflammatoire du zinc dans la peau est d'ailleurs à la base de son usage thérapeutique. Sous forme de gluconate, il est utilisé dans le traitement de différentes dermatoses inflammatoires162, telles que l'acné inflammatoire de sévérité mineure à modérée. En considérant que les produits minéraux sont souvent conseillés aux populations à risques (enfants, femmes enceintes et personnes souffrant d'hypersensibilité cutanée), il est préoccupant de savoir qu'ils n'offrent pas l'efficacité attendue.

Une seconde préoccupation concerne l'innocuité du ZnO intégré dans les produits de protection solaire. L'étude réalisée in vitro sur la prolifération cellulaire de la lignée de kératinocytes NCTC2544 évoque un potentiel cytotoxique et génotoxique des nanoparticules d'oxyde de zinc. Le test au MTT employé, basé sur la révélation colorimétrique de l'activité mitochondriale des cellules vivantes, est un test largement utilisé pour la détermination des effets cytotoxiques des nanoparticules. L'ensemble des formes commerciales de ZnO testées est responsable d'une inhibition de la croissance cellulaire très nette, avec des valeurs de concentration inhibitrice 50 % à 72 heures comprises entre 11,1 et 45,2 µg/mL. Les cinétiques de croissance continue montrent un effet antiprolifératif dose-dépendant. De nombreuses études mettent en évidence la cytotoxicité dose-dépendante de nanoparticules de ZnO sur diverses lignées cellulaires humaines, telles que des cellules épithéliales bronchiques (BEAS-2B)163, des cellules épithéliales du poumon (A549)164, des cellules épidermiques (A431)145 ou des cellules endothéliales aortiques (HAECs)165. La cytotoxicité la plus importante a été retrouvée sur la lignée A431, dont l'activité cellulaire est complètement inhibée après une exposition à des concentrations de 10 µg/mL de nanoparticules de ZnO. Les études portant sur les

86 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique lignées A549 et BEAS-2B ont montré des effets à des concentrations similaires, avec des valeurs de CI50 comprises entre 10 et 20 µg/mL. Nous avons également mis en évidence que plus la taille des particules non enrobées de ZnO était faible, plus l'activité antiproliférative sur les kératinocytes NCTC2544 était marquée. L'influence de la taille des particules de ZnO sur la cytotoxité a été démontrée dans certaines études166, 167. Pour d'autres, la cytotoxicité est indépendante de la taille des particules164, 168. En revanche, en comparant les particules de ZnO enrobées et non enrobées, il apparaît que la taille des particules n'est pas un indicateur de cytotoxicité. L'étude des cinétiques de croissance discontinue révèle des différences de profil d'activité selon la forme commerciale de ZnO testée. Dans la plupart des cas, la reprise d'une croissance cellulaire similaire à celle du témoin montre qu'il s'agit d'une activité antiproliférative réversible, tandis qu'aux plus fortes concentrations, une activité de type cytostatique a été mise en évidence pour deux d'entre elles. L'observation des kératinocytes après traitement par les nanoparticules de ZnO en microscopie et un test à l'acridine orange ont confirmé les études d'activité antiproliférative. En effet, le traitement par le ZnO a entraîné la formation de vésicules, dont la caractérisation par un marquage spécifique a révélé la nature apoptotique.

Après avoir déterminé les effets sur la prolifération cellulaire et afin d'évaluer le potentiel génotoxique, nous avons recherché l'impact d'un traitement des kératinocytes NCTC2544 par les nanoparticules sur l'expression de deux gènes : P53 et HEF1. D'une façon générale, les cellules sont constamment soumises à des événements conduisant à des dommages de l'ADN. La première réponse de la cellule consiste à réparer ces lésions. Lorsque la lésion est irréparable, la cellule peut s'engager vers la voie de l'apoptose, afin de prévenir l'apparition de mutations qui pourraient être transmises aux cellules-filles, et d'éviter leur prolifération anarchique. Les gènes suppresseurs de tumeurs, parmi lesquels le gène P53, sont les gènes permettant de s'assurer du fonctionnement correct des mécanismes de défense. Nous avons donc voulu chercher en premier lieu si la voie des dommages à l'ADN via P53 était activée ou non après exposition aux nanoparticules de ZnO des kératinocytes NCTC2544 synchronisés. Les résultats de PCR quantitative montrent une surexpression du gène P53 après 24 heures de traitement par le Tego Sun Z500®, signifiant qu'il y a eu induction d'un stress génotoxique. Une surexpression retrouvée à 24 heures est cohérente avec le temps de dédoublement de la lignée. L'activation de la voie du gène P53 après exposition à des nanoparticules d'oxyde de zinc a également été retrouvée dans une lignée de fibroblastes humains, et ce dès la concentration de 10 µg/mL169. Enfin, nous avons recherché si la surexpression du gène P53 était corrélée à une surexpression du gène HEF1. Le traitement des cellules par le ZnO a montré une surexpression du gène HEF1 à 26 heures, mettant en évidence une voie de l'apoptose liée à ce gène.

Les résultats de l'évaluation du pouvoir génotoxique pourraient s'expliquer par les mécanismes indirects des nanoparticules de ZnO décrits dans la littérature. En effet, de nombreuses études montrent que les nanoparticules de ZnO entraînent un stress oxydant145, 163 dû à la formation d'espèces réactives de l'oxygène. La formation des ERO est souvent corrélée aux propriétés photocatalytiques des particules. Cependant, notre étude réalisée en l'absence d'irradiation UV évoque que ces propriétés ne sont pas les seules à l'origine des

87 Evaluation de la sécurité d'emploi et de l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique effets délétères des nanoparticules. Plusieurs études réalisées in vitro ont également invoqué une toxicité liée au zinc (Zn) provenant de la dissolution du ZnO en milieu de culture168, 170, 171. Dans leur étude menée in vivo, Gulson et al.137 ont mis en évidence que de faibles proportions de zinc provenant de particules de ZnO contenues dans un produit de protection solaire pouvaient être absorbées à travers la peau. Le zinc est un métal physiologique qui intervient notamment comme cofacteur de nombreuses métallo-enzymes et dans l'activation des facteurs de transcription possédant des motifs moléculaires de liaison au zinc ou "zinc-binding motifs". Il peut devenir toxique lors d’une accumulation intracellulaire excessive172. Or, la dissolution du ZnO provoque une augmentation de la concentration extracellulaire en ions Zn2+, conduisant à une augmentation de leur concentration intracellulaire susceptible de diminuer l'activité des facteurs de transcription et des enzymes Zn2+-dépendants173. Les ions Zn2+ libérés par dissolution de l'oxyde de zinc pourraient ainsi être responsables d'une déplétion des antioxydants intracellulaires (GSH, vitamine E et C) et de l'inhibition de l’activité d’enzymes antioxydantes172, augmentant le nombre d'ERO intracellulaires. Dans le cas où les ERO excèdent la capacité de la machinerie antioxydante cellulaire, des dommages oxydatifs peuvent survenir et affecter considérablement la cellule et son fonctionnement.

Malgré l'ensemble de ces résultats, il faut garder à l'esprit qu'une cytotoxicité ou qu'une génotoxicité potentielle est conditionnée par la pénétration percutanée des nanoparticules, et qu'il s'agit ici de travaux menés in vitro. Bien que la majorité des études montrent que les nanoparticules persistent à la surface de la couche cornée134, il existe des études réalisées in vivo qui démontrent qu'un passage dans les couches plus profondes de la peau est possible135, 136, 137. La voie transfolliculaire représente une voie potentielle de pénétration des nanoparticules138 qui doit faire l'objet d'études complémentaires.

Enfin, il est important de souligner l'importance de la caractérisation préalable des nanoparticules testées, quel que soit le type d'étude réalisé. En effet, il n'est pas toujours facile de savoir si les données issues des fiches de spécifications de celles-ci correspondent à la taille des particules elles-mêmes ou à celle des agrégats. La précision de ces données est pourtant capitale, comme en témoigne l'affaire du ZinClear® IM. Il s'agit d'un oxyde de zinc fabriqué par la société australienne Antaria Ltd et vendu à des entreprises cosmétiques produisant des produits de protection solaire. Initialement revendiqué comme étant de taille micrométrique par le fournisseur, et certifié "bio" par Ecocert, des études métrologiques ont été réalisées en 2012 à la demande d'une ONG australienne. Ces études ont montré qu'il s'agissait en fait d'un nanomatériau au sens de l'Organisation internationale de normalisation (ISO).

88 Conclusion générale

CONCLUSION GENERALE

Les effets néfastes des UVB et des UVA sur la peau imposent de prendre des mesures de protection lors d'une exposition au soleil. Le recours aux produits de protection solaire, dans la mesure où ils ne sont pas utilisés comme moyen exclusif de photoprotection ou pour prolonger abusivement l'exposition, permet de lutter contre l'apparition de l'érythème actinique.

Pourtant depuis quelques années, ces produits inquiètent. Les études scientifiques relayées par les autorités de santé évoquent les effets indésirables potentiels de certains actifs photoprotecteurs, filtres solaires organiques et inorganiques, pouvant conduire à leur réévaluation. Plus spécifiquement, l'innocuité des filtres inorganiques est remise en cause du fait de leur utilisation sous forme nanoparticulaire et de leurs propriétés photocatalytiques, à l'origine d'un potentiel cytotoxique et génotoxique.

Dans ce contexte, nous avons voulu tester la sécurité d'emploi et l'efficacité de l'oxyde de zinc dans le domaine de la photoprotection topique. Les résultats obtenus suggèrent que cet ingrédient ne devrait pas être utilisé dans les produits de protection solaire. En effet, pour des raisons techniques, il ne permet pas d'obtenir des produits offrant une protection élevée. De plus, son activité anti-inflammatoire surestime le niveau de protection déterminé selon la méthodologie in vivo, conduisant à une fausse idée de sécurité et dont les conséquences pourraient être néfastes, notamment dans le cas des populations à risques. Plus préoccupant encore, l'oxyde de zinc pourrait être lui-même à l'origine de dommages à l'ADN. Ainsi, en l'absence de preuve définitive de la non pénétration de ce type de particules et en raison de la vulnérabilité qu'une peau lésée par le soleil peut représenter, le principe de précaution s'impose.

Au vu du rôle important que les produits de protection solaire pourraient jouer en termes de santé publique, nous pourrions nous demander si un statut de médicament, et non plus un statut de produits cosmétique, ne serait pas plus adapté à ces "produits frontières".

89 Liste des figures

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Représentation 3D de la peau et ses annexes2 ...... 11 Figure 2 : Représentation schématique des principales étapes de la différenciation épidermique4 ...... 12 Figure 3 : Structure des sous-couches de l’épiderme observées en microscopie5 ...... 13 Figure 4 : Structure de la couche cornée8 ...... 14 Figure 5 : Structures chimiques des deux types de mélanine ...... 15 Figure 6 : Les voies de synthèse des mélanines10 ...... 15 Figure 7 : Spectre solaire et filtration atmosphérique14 ...... 18 Figure 8 : Pénétration du rayonnement solaire dans la peau3 ...... 19 Figure 9 : Conséquences de l'absorption des rayons UV par un chromophore16 ...... 20 20 Figure 10 : Formation de la vitamine D3 dans la peau ...... 22 Figure 11 : Structures chimiques des psoralènes ...... 24 Figure 12 : Lésions de l'ADN UV-induites45 ...... 27 Figure 13 : Rôle de la protéine p53 dans la photocarcinogénèse47 ...... 29 Figure 14 : Carcinome basocellulaire nodulaire54 ...... 30 Figure 15 : Carcinome spinocellulaire58 ...... 30 Figure 16 : Grain de beauté versus mélanome63 ...... 31 Figure 17 : Différentes formes cliniques de la réaction phototoxique15 ...... 33 Figure 18 : Principe de fonctionnement d'un filtre organique86 ...... 40 96 Figure 19 : Spectre d'absorption UV-visible de trois TiO2 de différentes tailles ...... 45 Figure 20 : Mécanisme d'action des filtres inorganiques sous forme micronisée98...... 45 Figure 21 : Variations des coefficients de pondération pour chaque longueur d'onde114 ...... 52 Figure 22 : Influence de la quantité de produit de protection solaire sur le SPF128 ...... 54 Figure 23 : Principe de la photocatalyse131 ...... 55 Figure 24 : Structure cristallographique würtzite du ZnO133 ...... 56 Figure 25 : Réflexion de Bragg ...... 66 Figure 26 : Principe d'un microscope électronique à transmission154...... 67 Figure 27 : Distribution du milieu de culture ...... 70 Figure 28 : Distribution des substances ...... 70 Figure 29 : Distribution du milieu de culture ...... 72 Figure 30 : Distribution des substances ...... 72 Figure 31 : Evolution de la fluorescence en valeur logarithmique au cours des cycles de PCR ...... 74 Figure 32 : Images obtenues en MET avec les différentes formes commerciales de ZnO testées ...... 78 Figure 33 : Cinétiques de croissance continue des kératinocytes NCTC2544 après traitement par du ZnO...... 80 Figure 34 : Cinétiques de croissance discontinue des kératinocytes NCTC2544 après traitement par du ZnO ..... 81 Figure 35 : Observation des kératinocytes NCTC2544 en microscopie ...... 82 Figure 36 : Observation des kératinocytes NCTC2544 marqués à l'acridine orange ...... 82 Figure 37 : Histogrammes représentant l’expression du gène P53 dans les cellules NCTC2544 à 24 et 25 heures avec traitement ou non par le Tego Sun Z500® à 15,5 µg/mL ...... 83 Figure 38 : Histogrammes représentant l’expression du gène HEF1 dans les cellules NCTC2544 à 25 et 26 heures avec traitement ou non par le Tego Sun Z500® à 15,5 µg/mL ...... 84

90 Liste des tableaux

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Les différents phototypes11 ...... 16 Tableau 2 : Influence des facteurs photoclimatologiques sur l'ensoleillement reçu par les individus13 ...... 18 Tableau 3 : Effets bénéfiques et néfastes du soleil sur la peau ...... 21 Tableau 4 : L'abécédaire du mélanome64 ...... 32 Tableau 5 : Phototoxicité et photoallergie69, 74 ...... 34 Tableau 6 : Modifications histologiques liées au photovieillissement78 ...... 35 Tableau 7 : Les différents filtres organiques et inorganiques autorisés et concentrations maximales tolérées dans l'Union Européenne83, aux Etats-Unis84 et en Australie85 ...... 38 Tableau 8 : Les différentes dénominations des filtres UVB88 ...... 41 Tableau 9 : Les différentes dénominations des filtres UVA88 ...... 43 Tableau 10 : Les différentes dénominations des filtres à large spectre88 ...... 43 Tableau 11 : Méthodes de détermination de l'efficacité photoprotectrice globale ...... 46 Tableau 12 : Principe de détermination des indices de protection100 ...... 49 Tableau 13 : Classification des produits de protection solaire102 ...... 50 Tableau 14 : Exemples de résultats de l'efficacité des produits testés dans les domaines UVB et UVA114 ...... 52 Tableau 15 : Bilan des études cas-témoins réalisées entre 1986 et 2002100 ...... 52 Tableau 16 : Quelques résultats de tests de cytotoxicité menés in vitro ...... 60 152 Tableau 17 : Nanoparticules de TiO2 et ZnO évaluées dans l'étude de Landsiedel et al...... 61 Tableau 18 : Composition des produits de protection solaire minéraux testés ...... 64 Tableau 19 : Les différentes formes commerciales de ZnO testées ...... 65 Tableau 20 : Amorces utilisées pour la PCR quantitative ...... 76 Tableau 21 : Comparaison des tailles des cristallites des échantillons de ZnO ...... 77

Tableau 22 : Valeurs de CI50 obtenues pour les différentes formes commerciales de ZnO ...... 79 Tableau 23 : SPF des produits obtenus in vitro...... 85

91 Références

REFERENCES

1. Mélissopoulos A, Levacher C. La Peau : structure et physiologie, Ed. Tec & Doc Lavoisier, 1998, 152 p, Paris.

2. Ferraq Y. Développement d'un modèle de cicatrisation épidermique après une désépidermisation laser. Thèse de doctorat, Université de Toulouse III, 2007.

3. Schmitt D. Biologie de la peau, Ed. INSERM, 1995, 326 p, Paris.

4. Denecker G, Ovaere P, Vandenabeele P, Declercq W. Caspase-14 reveals its secrets. The Journal of cell biology, 2008, 180(3): 451-458.

5. Ly E. Caractérisation des lésions cutanées par microspectroscopies optiques vibrationnelles : applications ex vivo et in vivo. Thèse de doctorat, Université de Reims, 2009.

6. Haftek M. Kératinisation épidermique. EMC - Dermatologie, 2010, 98-010-A-10.

7. Forster M, Bolzinger MA, Fessi H, Briancon S. Topical delivery of cosmetics and drugs. Molecular aspects of percutaneous absorption and delivery. European journal of dermatology : EJD, 2009, 19(4): 309-323.

8. Rolland P. Décontamination du cuir chevelu humain après exposition aux agents chimiques de guerre. Thèse de doctorat, Université de Lyon I, 2012.

9. Martini M. Introduction à la dermopharmacie et à la cosmétologie, Ed. Tec & Doc Lavoisier, 2006, 411 p, Paris.

10. Passeron T, Ballotti R, Ortonne JP. La mélanogénèse. EMC - Cosmétologie et Dermatologie esthétique, 2005, 50-020-C10.

11. Malvy DJ, Guinot C, Preziosi P, Galan P, Chapuy MC, Maamer M, et al. Relationship between vitamin D status and skin phototype in general adult population. Photochemistry and photobiology, 2000, 71(4): 466-469.

12. Kanitakis J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology : EJD, 2002, 12(4): 390-399.

13. Meunier L. Rayonnement solaire : bases physiques, effets cutanés biologiques et cliniques. EMC - Cosmétologie et Dermatologie esthétique, 2012, 50-020-B-40.

14. Jeanmougin M. Le soleil. In: Soleil et peaux. Bénéfices, risques et prévention, Ed. Masson, 2002, 279 p, Paris.

15. Beani J. Photodermatoses. EMC - Dermatologie, 2008, 98-785-A-10.

92 Références

16. Applegate LA, Frenk E. Action des rayons UV sur les constituants cellulaires autres que l'ADN. In: Rayonnement ultraviolet et peau, Ed. John Libbey Eurotext, 2001, 268 p, Paris.

17. Darr D, Fridovich I. Free radicals in cutaneous biology. J Invest Dermatol, 1994, 102(5): 671-675.

18. Mouret S, Baudouin C, Charveron M, Favier A, Cadet J, Douki T. Cyclobutane pyrimidine dimers are predominant DNA lesions in whole human skin exposed to UVA radiation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(37): 13765-13770.

19. Page CP, Curtis MJ, Cheymol G, Sutter MC, Walker MJ, Hoffman BB. Pharmacologie intégrée, Ed. De Boeck université, 1999, 606 p, Bruxelles.

20. Khan M, Pray W. Why patients need protection from the sun. US Pharm 2009, 34(7): 14-19.

21. Dumoulin G, Moussard C, Nguyen NU, Toussirot E. Photobiologie de la vitamine D. In: Rayonnement ultraviolet et peau, Ed. John Libbey Eurotext, 2001, 268 p, Paris.

22. Holick MF. Vitamin D: its role in cancer prevention and treatment. Progress in biophysics and molecular biology, 2006, 92(1): 49-59.

23. Egan K, Sosman J, Blot W. Sunlight and reduced risk of cancer : is the real story vitamin D ? . J Natl Cancer Inst, 2005, 97: 161-163.

24. Lim HW, Gilchrest BA, Cooper KD, Bischoff-Ferrari HA, Rigel DS, Cyr WH, et al. Sunlight, tanning booths, and vitamin D. J Am Acad Dermatol, 2005, 52(5): 868-876.

25. Moon S, Fryer AA, Strange R. Ultraviolet radiation : effects on risk of prostate cancer and other internal cancers. Mutat Res, 2005, 571: 207-219.

26. Osborne J, Hutchinson P. Vitamin D and systemic cancer : is this relevant to malignant melanoma ? Br J Dermatol, 2002, 147: 197-213.

27. Lam RW, Goldner EM, Solyom L, Remick RA. A controlled study of light therapy for bulimia nervosa. The American journal of psychiatry, 1994, 151(5): 744-750.

28. Meynadier J, Bédane C. Dépression saisonnière-Luminothérapie. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

29. Golden RN, Gaynes BN, Ekstrom RD, Hamer RM, Jacobsen FM, Suppes T, et al. The efficacy of light therapy in the treatment of mood disorders: a review and meta-analysis of the evidence. The American journal of psychiatry, 2005, 162(4): 656-662.

93 Références

30. Roelandts R. Mécanismes et actions de la photochimiothérapie. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, Ed. Arnette, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

31. Beani JC. Photothérapies et photo-chimiothérapies par ultraviolets. EMC - Dermatologie, 2006, 98-930-A-10.

32. Bedane C. Photothérapie de l'eczéma de contact. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, Ed. Arnette, 2008, 449 p, Rueil- Malmaison.

33. Verret J. Complications précoces des photothérapies. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

34. Meunier L, Amblard P. Effets secondaires tardifs des photothérapies. Moyens de les prévenir. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, Ed. Arnette, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

35. Stern RS, Vakeva LH, Study PF-u. Noncutaneous malignant tumors in the PUVA follow-up study: 1975-1996. J Invest Dermatol, 1997, 108(6): 897-900.

36. Mantoux F, Ortonne JP. Physiologie du système pigmentaire. EMC - Dermatologie, 2003, 98-0156-A-10.

37. Meunier L. Photoprotection (interne et externe). EMC - Dermatologie, 2008, 98-944- A-10.

38. Urbach F. The historical aspects of sunscreens. J Photochem Photobiol B, 2001, 64(2- 3): 99-104.

39. Young AR. The sunburn cell. Photo-dermatology, 1987, 4(3): 127-134.

40. Kitajima T, Takashima A. Langerhans cell responses to ultraviolet B radiation. Journal of dermatological science, 1999, 19(3): 153-160.

41. Byrne SN, Limon-Flores AY, Ullrich SE. Mast cell migration from the skin to the draining lymph nodes upon ultraviolet irradiation represents a key step in the induction of immune suppression. Journal of immunology, 2008, 180(7): 4648-4655.

42. Meunier L. Photo-immunologie. In: Photodermatologie: Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, Ed. Arnette, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

43. Kappes UP, Luo D, Potter M, Schulmeister K, Runger TM. Short- and long-wave UV light (UVB and UVA) induce similar mutations in human skin cells. J Invest Dermatol, 2006, 126(3): 667-675.

94 Références

44. Hutchinson F. Induction of tandem-base change mutations. Mutat Res, 1994, 309(1): 11-15.

45. Marrot L, Meunier JR. Skin DNA photodamage and its biological consequences. J Am Acad Dermatol, 2008, 58(5 Suppl 2): S139-148.

46. Shibutani S, Takeshita M, Grollman AP. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, 1991, 349(6308): 431-434.

47. Black HS, de Gruijl FR, Forbes PD, Cleaver JE, Ananthaswamy HN, de Fabo EC, et al. Photocarcinogenesis: an overview. J Photochem Photobiol B, 1997, 40(1): 29-47.

48. Giglia-Mari G, Sarasin A. TP53 mutations in human skin cancers. Human mutation, 2003, 21(3): 217-228.

49. Gasparro FP, Mitchnick M, Nash JF. A review of sunscreen safety and efficacy. Photochemistry and photobiology, 1998, 68(3): 243-256.

50. Melnikova VO, Ananthaswamy HN. Cellular and molecular events leading to the development of skin cancer. Mutat Res, 2005, 571(1-2): 91-106.

51. Brash DE. Sunlight and the onset of skin cancer. Trends in genetics : TIG, 1997, 13(10): 410-414.

52. Nishigori C. Cellular aspects of photocarcinogenesis. Photochemical & photobiological sciences : Official journal of the European Photochemistry Association and the European Society for Photobiology, 2006, 5(2): 208-214.

53. DePinho RA. The age of cancer. Nature, 2000, 408(6809): 248-254.

54. Basset-Séguin N, Chaussade V, Vilmer C. Carcinomes basocellulaires. EMC - Dermatologie, 2011, 98-620-A-10.

55. Ramachandran S, Rajaratnam R, Smith AG, Lear JT, Strange RC. Patients with both basal and squamous cell carcinomas are at a lower risk of further basal cell carcinomas than patients with only a basal cell carcinoma. J Am Acad Dermatol, 2009, 61(2): 247-251.

56. Bonerandi J, Monestier S. Carcinome épidermoîde (spinocellulaire) et ses précurseurs. EMC - Dermatologie, 2011, 98-625-A-10.

57. Dubina M, Goldenberg G. Viral-associated nonmelanoma skin cancers: a review. The American Journal of dermatopathology, 2009, 31(6): 561-573.

58. Hawrot A, Alam M, Ratner D. Squamous cell carcinoma. Current problems in dermatology, 2003, 15(3): 91-133.

95 Références

59. Société Française de dermatologie. Carcinome épidermoïde cutané (carcinome spinocellulaire). Recommandations de pratique clinique pour la prise en charge diagnostique et thérapeutique. Ann Dermatol Venereol, 2009, 136 Suppl 5: S166-186.

60. Gandini S, Sera F, Cattaruzza MS, Pasquini P, Zanetti R, Masini C, et al. Meta- analysis of risk factors for cutaneous melanoma: III. Family history, actinic damage and phenotypic factors. European journal of cancer, 2005, 41(14): 2040-2059.

61. Clark WH, Goldman LI, Mastrangelo MJ. Human Malignant Melanoma, Ed. Grune & Stratton, 1979, 509 p, New-York.

62. Gandini S, Sera F, Cattaruzza MS, Pasquini P, Abeni D, Boyle P, et al. Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma: I. Common and atypical naevi. European journal of cancer, 2005, 41(1): 28-44.

63. Roussakis C. Cours de pharmacie 2ème année, 2012.

64. Thomas L, Cochran AJ. Prise en charge du mélanome cutané. Cancer radiotherapie : journal de la Societe francaise de radiotherapie oncologique, 1998, 2(6): 732-746.

65. Quereux G, Dréno B. Mélanomes. In: Manifestations dermatologiques des maladies du système hématopoïétique et oncologie dermatologique: Dermatologie et médecine, vol. 3, Ed. Springer 2009, 394 p, Paris.

66. Knol AC, Nguyen JM, Pandolfino MC, Quereux G, Brocard A, Peuvrel L, et al. Tissue biomarkers in melanoma patients treated with TIL. PloS one, 2012, 7(12): e48729.

67. Marguery MC. Photodermatoses médicamenteuses. La Revue du praticien, 2000, 50(12): 1315-1319.

68. Gould JW, Mercurio MG, Elmets CA. Cutaneous photosensitivity diseases induced by exogenous agents. J Am Acad Dermatol, 1995, 33(4): 551-573; quiz 574-556.

69. Marguery M. Photosensibilisation - Réactions phototoxique et photoallergique, principaux agents photosensibilisants. In: Photodermatologie. Photobiologie cutanée, photoprotection et photothérapie, Ed. Arnette, 2008, 449 p, Rueil-Malmaison.

70. Marguery M. La réaction photoallergique : mécanisme d'apparition et technique d'exploration. Rev Fr Allergol, 1998, 38: 394-400.

71. Avenel-Audran M. Sunscreen products: finding the allergen. European journal of dermatology : EJD, 2010, 20(2): 161-166.

72. Jeanmougin M, Petit A, Manciet JR, Sigal M, Dubertret L. Eczéma photoallergique de contact au kétoprofène. Ann Dermatol Venereol, 1996, 123(4): 251-255.

96 Références

73. Durieu C, Marguery MC, Giordano-Labadie F, Journe F, Loche F, Bazex J. Allergies de contact photoaggravées et photoallergies de contact au kétoprofène : 19 cas. Ann Dermatol Venereol, 2001, 128(10 Pt 1): 1020-1024.

74. Bourrain J, Amblard P. Les photoallergies. Rev Fr Allergol Immunol Clin, 1997, 37(5): 661-667.

75. Ortonne JP. Dyspigmentation of aged skin. European journal of dermatology : EJD, 2001, 11(2): 168-169.

76. Oikarinen A. The aging of skin: chronoaging versus photoaging. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 1990, 7(1): 3-4.

77. Monestier S, Gaudy C, Gouvernet J, Richard MA, Grob JJ. Multiple senile lentigos of the face, a skin ageing pattern resulting from a life excess of intermittent sun exposure in dark-skinned caucasians: a case-control study. Br J Dermatol, 2006, 154(3): 438-444.

78. Passeron T, Ortonne JP. Le vieillissement cutané et sa prévention. Presse medicale, 2003, 32(31): 1474-1482.

79. Bhawan J, Andersen W, Lee J, Labadie R, Solares G. Photoaging versus intrinsic aging: a morphologic assessment of facial skin. Journal of cutaneous pathology, 1995, 22(2): 154-159.

80. Breathnach AS, Nazzaro-Porro M, Passi S, Picardo M. Ultrastructure of melanocytes in chronically sun-exposed skin of elderly subjects. Pigment cell research / sponsored by the European Society for Pigment Cell Research and the International Pigment Cell Society, 1991, 4(2): 71-79.

81. Werth VP, Shi X, Kalathil E, Jaworsky C. Elastic fiber-associated proteins of skin in development and photoaging. Photochemistry and photobiology, 1996, 63(3): 308-313.

82. Quan T, Qin Z, Xia W, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher GJ. Matrix-degrading metalloproteinases in photoaging. The journal of investigative dermatology Symposium proceedings / the Society for Investigative Dermatology, Inc [and] European Society for Dermatological Research, 2009, 14(1): 20-24.

83. Directive du conseil de l'UE (76/768/CEE). Liste des filtres UV autorisés que les produits cosmétiques peuvent contenir. Annexe VII, 2005, 011.002: 102-104.

84. Department of Health and Human Services FDA. Sunscreen drug products for over the counter use : final monograph. Fed Reg, 1999, 64: 27666-27693.

85. Therapeutics Goods Administration. Australian regulatory guidelines for OTC medicines. 2012.

97 Références

86. Lightburn E, Bonerandi JJ. Photoprotection externe. In: Rayonnement ultraviolet et peau, Ed. John Libbey Eurotext, 2001, 268 p, Paris.

87. Latha MS, Martis J, Shobha V, Sham Shinde R, Bangera S, Krishnankutty B, et al. Sunscreening agents: a review. The Journal of clinical and aesthetic dermatology, 2013, 6(1): 16-26.

88. Choquenet B. Mise en place de protocoles in vitro pour la détermination de l’efficacité des produits solaires. Valorisation de molécules d’intérêt. Thèse de doctorat, Université de Nantes, 2010.

89. Kullavanijaya P, Lim HW. Photoprotection. J Am Acad Dermatol, 2005, 52(6): 937- 958.

90. Wang SQ, Balagula Y, Osterwalder U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatol Ther, 2010, 23(1): 31-47.

91. Gogna D, Jain SK, Yadav AK, Agrawal GP. Microsphere based improved sunscreen formulation of ethylhexyl methoxycinnamate. Current drug delivery, 2007, 4(2): 153-159.

92. Deflandre A, Lang G. Photostability assessment of sunscreens. Benzylidene camphor and dibenzoylmethane derivatives. International journal of cosmetic science, 1988, 10(2): 53- 62.

93. Lautenschlager S, Wulf HC, Pittelkow MR. Photoprotection. Lancet, 2007, 370(9586): 528-537.

94. Moyal D. Prevention of ultraviolet-induced skin pigmentation. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2004, 20(5): 243-247.

95. Chatelain E, Gabard B. Photostabilization of butyl methoxydibenzoylmethane (Avobenzone) and ethylhexyl methoxycinnamate by bis-ethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine (Tinosorb S), a new UV broadband filter. Photochemistry and photobiology, 2001, 74(3): 401-406.

96. Wang SQ, Tooley IR. Photoprotection in the era of nanotechnology. Semin Cutan Med Surg, 2011, 30(4): 210-213.

97. Dunford R, Salinaro A, Cai L, Serpone N, Horikoshi S, Hidaka H, et al. Chemical oxidation and DNA damage catalysed by inorganic sunscreen ingredients. FEBS letters, 1997, 418(1-2): 87-90.

98. Truffault L. Synthèse et caractérisation de nanoparticules à base d’oxydes de cérium et de fer pour la filtration des UV dans les produits solaires. Thèse de doctorat, Université d'Orléans, 2010.

98 Références

99. Popov AP, Prezzhev AV, Lademann J, Myllylä R. TiO2 nanoparticles as an effective UV-B radiation skin-protective compound in sunscreens. Journal of Physics D: Applied Physics, 2005, 38: 2564-2570.

100. AFSSAPS. Produits cosmétiques de protection solaire. Rapport de synthèse élaboré par le groupe de réflexion de l'AFSSAPS sur les produits de protecion solaire. 2006.

101. Diffey B, Robson J. A new substrate to measure sunscreen protection factors throughout the ultraviolet spectrum. J Soc Cosmet Chem, 1989, 40: 127-133.

102. Thomas P, Bonnevalle A. Produits de protection solaire. EMC - Cosmétologie et Dermatologie esthétique, 2011, 50-200-A-10.

103. Vielhaber G, Grether-Beck S, Koch O, Johncock W, Krutmann J. Sunscreens with an absorption maximum of > or =360 nm provide optimal protection against UVA1-induced expression of matrix metalloproteinase-1, interleukin-1, and interleukin-6 in human dermal fibroblasts. Photochemical & photobiological sciences : Official journal of the European Photochemistry Association and the European Society for Photobiology, 2006, 5(3): 275-282.

104. Boyd AS, Naylor M, Cameron GS, Pearse AD, Gaskell SA, Neldner KH. The effects of chronic sunscreen use on the histologic changes of dermatoheliosis. J Am Acad Dermatol, 1995, 33(6): 941-946.

105. Phillips TJ, Bhawan J, Yaar M, Bello Y, Lopiccolo D, Nash JF. Effect of daily versus intermittent sunscreen application on solar simulated UV radiation-induced skin response in humans. J Am Acad Dermatol, 2000, 43(4): 610-618.

106. Beasley DG, Montgomery MA, Moloney SJ, Edmonds S, Roberts LK. Commercial sunscreen lotions prevent ultraviolet radiation-induced depletion of epidermal Langerhans cells in Skh-1 and C3H mice. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 1998, 14(3-4): 90-99.

107. Dumay O, Karam A, Vian L, Moyal D, Hourseau C, Stoebner P, et al. Ultraviolet AI exposure of human skin results in Langerhans cell depletion and reduction of epidermal antigen-presenting cell function: partial protection by a broad-spectrum sunscreen. Br J Dermatol, 2001, 144(6): 1161-1168.

108. Poon TS, Barnetson RS, Halliday GM. Prevention of immunosuppression by sunscreens in humans is unrelated to protection from erythema and dependent on protection from ultraviolet a in the face of constant ultraviolet B protection. J Invest Dermatol, 2003, 121(1): 184-190.

109. Baron ED, Fourtanier A, Compan D, Medaisko C, Cooper KD, Stevens SR. High ultraviolet A protection affords greater immune protection confirming that ultraviolet A contributes to photoimmunosuppression in humans. J Invest Dermatol, 2003, 121(4): 869- 875.

99 Références

110. Jeanmougin M, Peyron JL, Thomas P, Beani JC, Guez E, Bachot N. Lucite estivale bégnine: prévention par un topique associant des filtres UVA et des antioxydants. Ann Dermatol Venereol, 2006, 133(5 Pt 1): 425-428.

111. Darlington S, Williams G, Neale R, Frost C, Green A. A randomized controlled trial to assess sunscreen application and beta carotene supplementation in the prevention of solar keratoses. Archives of dermatology, 2003, 139(4): 451-455.

112. Green A, Williams G, Neale R, Hart V, Leslie D, Parsons P, et al. Daily sunscreen application and betacarotene supplementation in prevention of basal-cell and squamous-cell carcinomas of the skin: a randomised controlled trial. Lancet, 1999, 354(9180): 723-729.

113. Naylor MF, Boyd A, Smith DW, Cameron GS, Hubbard D, Neldner KH. High sun protection factor sunscreens in the suppression of actinic neoplasia. Archives of dermatology, 1995, 131(2): 170-175.

114. Couteau C, Couteau O, Alami-El Boury S, Coiffard LJ. Sunscreen products: what do they protect us from? Int J Pharm, 2011, 415(1-2): 181-184.

115. Herzfeld PM, Fitzgerald EF, Hwang SA, Stark A. A case-control study of malignant melanoma of the trunk among white males in upstate New York. Cancer detection and prevention, 1993, 17(6): 601-608.

116. Holman CD, Armstrong BK, Heenan PJ. Relationship of cutaneous malignant melanoma to individual sunlight-exposure habits. J Natl Cancer Inst, 1986, 76(3): 403-414.

117. Naldi L, Gallus S, Imberti GL, Cainelli T, Negri E, La Vecchia C. Sunscreens and cutaneous malignant melanoma: an Italian case-control study. International journal of cancer Journal international du cancer, 2000, 86(6): 879-882.

118. Youl P, Aitken J, Hayward N, Hogg D, Liu L, Lassam N, et al. Melanoma in adolescents: a case-control study of risk factors in Queensland, Australia. International journal of cancer Journal international du cancer, 2002, 98(1): 92-98.

119. Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, Kang S, et al. Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature, 1996, 379(6563): 335-339.

120. Holly EA, Aston DA, Cress RD, Ahn DK, Kristiansen JJ. Cutaneous melanoma in women. II. Phenotypic characteristics and other host-related factors. American journal of epidemiology, 1995, 141(10): 934-942.

121. Bakos L, Wagner M, Bakos RM, Leite CS, Sperhacke CL, Dzekaniak KS, et al. Sunburn, sunscreens, and phenotypes: some risk factors for cutaneous melanoma in southern Brazil. International journal of dermatology, 2002, 41(9): 557-562.

100 Références

122. Westerdahl J, Olsson H, Masback A, Ingvar C, Jonsson N. Is the use of sunscreens a risk factor for malignant melanoma? Melanoma research, 1995, 5(1): 59-65.

123. Westerdahl J, Ingvar C, Masback A, Olsson H. Sunscreen use and malignant melanoma. International journal of cancer Journal international du cancer, 2000, 87(1): 145- 150.

124. Autier P, Dore JF, Schifflers E, Cesarini JP, Bollaerts A, Koelmel KF, et al. Melanoma and use of sunscreens: an Eortc case-control study in Germany, Belgium and France. The EORTC Melanoma Cooperative Group. International journal of cancer Journal international du cancer, 1995, 61(6): 749-755.

125. Gallagher RP, Rivers JK, Lee TK, Bajdik CD, McLean DI, Coldman AJ. Broad- spectrum sunscreen use and the development of new nevi in white children: A randomized controlled trial. JAMA : the journal of the American Medical Association, 2000, 283(22): 2955-2960.

126. Green AC, Williams GM, Logan V, Strutton GM. Reduced melanoma after regular sunscreen use: randomized trial follow-up. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2011, 29(3): 257-263.

127. Wulf HC, Stender IM, Lock-Andersen J. Sunscreens used at the beach do not protect against erythema: a new definition of SPF is proposed. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 1997, 13(4): 129-132.

128. Couteau C, Paparis E, El-Bourry-Alami S, Coiffard LJ. Influence on SPF of the quantity of sunscreen product applied. Int J Pharm, 2012, 437(1-2): 250-252.

129. Dupuy A, Dunant A, Grob JJ, Reseau d'Epidemiologie en D. Randomized controlled trial testing the impact of high-protection sunscreens on sun-exposure behavior. Archives of dermatology, 2005, 141(8): 950-956.

130. Gilbert E, Pirot F, Bertholle V, Roussel L, Falson F, Padois K. Commonly used UV filter toxicity on biological functions: review of last decade studies. International journal of cosmetic science, 2012.

131. Mills A, Le Hunte S. An overview of semiconductor photocatalysis. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 1997, 108: 1-35.

132. Buchalska M, Kras G, Oszajca M, Lasocha W, Macyk W. Singlet oxygen generation in the presence of titanium dioxide materials used as sunscreens in suntan lotions. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 2010, 213: 158-163.

133. Wang ZL. ZnO nanowire and nanobelt platform for nanotechnology. Materials Science and Engineering: R: Reports, 2009, 64(3Ŕ4): 33-71.

101 Références

134. Newman MD, Stotland M, Ellis JI. The safety of nanosized particles in titanium dioxide- and zinc oxide-based sunscreens. J Am Acad Dermatol, 2009, 61(4): 685-692.

135. Sadrieh N, Wokovich AM, Gopee NV, Zheng J, Haines D, Parmiter D, et al. Lack of significant dermal penetration of titanium dioxide from sunscreen formulations containing nano- and submicron-size TiO2 particles. Toxicol Sci, 2010, 115(1): 156-166.

136. Zvyagin AV, Zhao X, Gierden A, Sanchez W, Ross JA, Roberts MS. Imaging of zinc oxide nanoparticle penetration in human skin in vitro and in vivo. Journal of biomedical optics, 2008, 13(6): 064031.

137. Gulson B, McCall M, Korsch M, Gomez L, Casey P, Oytam Y, et al. Small amounts of zinc from zinc oxide particles in sunscreens applied outdoors are absorbed through human skin. Toxicol Sci, 2010, 118(1): 140-149.

138. Lademann J, Richter H, Teichmann A, Otberg N, Blume-Peytavi U, Luengo J, et al. Nanoparticles-an efficient carrier for drug delivery into the hair follicles. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV, 2007, 66(2): 159-164.

139. Guillouzo A, Adolphe M, Marano F. Toxicologie cellulaire in vitro: Méthodes et applications, Ed. INSERM, 1995, 462 p, Paris.

140. Stellman JM, Dufresne C, travail Bid. Encyclopédie de sécurité et de santé au travail, volume 3, Ed. International Labour Organization, 2000, 4838 p.

141. Kirsch-Volders M, Decordier I, Lison D. Génotoxicité et exposition professionnelle ou environnementale. EMC - Pathologie professionnelle et de l'environnement, 2012, 16-537-C- 10.

142. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research, 1988, 175(1): 184- 191.

143. Gurr JR, Wang AS, Chen CH, Jan KY. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicology, 2005, 213(1-2): 66-73.

144. Shukla RK, Sharma V, Pandey AK, Singh S, Sultana S, Dhawan A. ROS-mediated genotoxicity induced by titanium dioxide nanoparticles in human epidermal cells. Toxicol In Vitro, 25(1): 231-241.

145. Sharma V, Shukla RK, Saxena N, Parmar D, Das M, Dhawan A. DNA damaging potential of zinc oxide nanoparticles in human epidermal cells. Toxicol Lett, 2009, 185(3): 211-218.

102 Références

146. Dechsakulthorn F, Hayes A, Bakand S, Joeng L, Winder C. In vitro cytotoxicity assessment of selected nanoparticles using human skin fibroblast. AATEX, 2007, 14: 397-400.

147. Theogaraj E, Riley S, Hughes L, Maier M, Kirkland D. An investigation of the photo- clastogenic potential of ultrafine titanium dioxide particles. Mutat Res, 2007, 634(1-2): 205- 219.

148. Rahman Q, Lohani M, Dopp E, Pemsel H, Jonas L, Weiss DG, et al. Evidence that ultrafine titanium dioxide induces micronuclei and apoptosis in Syrian hamster embryo fibroblasts. Environ Health Perspect, 2002, 110(8): 797-800.

149. Trouiller B, Reliene R, Westbrook A, Solaimani P, Schiestl RH. Titanium dioxide nanoparticles induce DNA damage and genetic instability in vivo in mice. Cancer research, 2009, 69(22): 8784-8789.

150. Wang JJ, Sanderson BJ, Wang H. Cyto- and genotoxicity of ultrafine TiO2 particles in cultured human lymphoblastoid cells. Mutat Res, 2007, 628(2): 99-106.

151. Li N, Ma L, Wang J, Zheng L, Liu J, Duan Y, et al. Interaction Between Nano- Anatase TiO(2) and Liver DNA from Mice In Vivo. Nanoscale research letters, 2009, 5(1): 108-115.

152. Landsiedel R, Ma-Hock L, Van Ravenzwaay B, Schulz M, Wiench K, Champ S, et al. Gene toxicity studies on titanium dioxide and zinc oxide nanomaterials used for UV- protection in cosmetic formulations. Nanotoxicology, 2010, 4: 364-381.

153. Singh N, Manshian B, Jenkins GJS, Griffiths SM, Williams PM, Maffeis TGG, et al. NanoGenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials, 2009, 30(23Ŕ24): 3891-3914.

154. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, et al. Biologie moléculaire de la cellule, Ed. De Boeck Université, 2005, 1096 p, Bruxelles.

155. Moreau D, Jacquot C, Tsita P, Chinou I, Tomasoni C, Juge M, et al. Original triazine inductor of new specific molecular targets, with antitumor activity against nonsmall cell lung cancer. International journal of cancer Journal international du cancer, 2008, 123(11): 2676- 2683.

156. Roussakis C, Robillard N, Riou D, Biard JF, Pradal G, Piloquet P, et al. Effects of bistramide A on a non-small-cell bronchial carcinoma line. Cancer chemotherapy and pharmacology, 1991, 28(4): 283-292.

157. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983, 65(1-2): 55-63.

103 Références

158. Singh MK, Cowell L, Seo S, O’Neill GO, Golemis EA. Molecular basis for HEF1/NEDD9/Cas-L action as a multifunctional coordinator of invasion, apoptosis and cell cycle. Cell Biochem Biophys, 2007, 48(1): 54-72.

159. Couteau C, Pommier M, Paparis E, Coiffard LJ. Study of the efficacy of 18 sun filters authorized in European Union tested in vitro. Die Pharmazie, 2007, 62(6): 449-452.

160. Wahie S, Lloyd JJ, Farr PM. Sunscreen ingredients and labelling: a survey of products available in the UK. Clinical and experimental dermatology, 2007, 32(4): 359-364.

161. Couteau C, Chauvet C, Paparis E, Coiffard L. UV filters, ingredients with a recognized anti-inflammatory effect. PloS one, 2012, 7(12): e46187.

162. Poiraud C, Quereux G, Knol AC, Allix R, Khammari A, Dreno B. Zinc gluconate is an agonist of peroxisome proliferator-activated receptor-alpha in the epidermis. Experimental dermatology, 2012, 21(5): 347-351.

163. Huang CC, Aronstam RS, Chen DR, Huang YW. Oxidative stress, calcium homeostasis, and altered gene expression in human lung epithelial cells exposed to ZnO nanoparticles. Toxicol In Vitro, 2010, 24(1): 45-55.

164. Lin W, Xu Y, Huang CC, Ma Y, Shannon KB, Chen DR, et al. Toxicity of nano- and micro-sized ZnO particles in human lung epithelial cells. J Nanopart Res, 2009, 11: 25-39.

165. Gojova A, Guo B, Kota RS, Rutledge JC, Kennedy IM, Barakat AI. Induction of inflammation in vascular endothelial cells by metal oxide nanoparticles: effect of particle composition. Environ Health Perspect, 2007, 115(3): 403-409.

166. Xu M, Fujita D, Kajiwara S, Minowa T, Li X, Takemura T, et al. Contribution of physicochemical characteristics of nano-oxides to cytotoxicity. Biomaterials, 2010, 31(31): 8022-8031.

167. Nair S, Sasidharan A, Divya Rani VV, Menon D, Nair S, Manzoor K, et al. Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. Journal of materials science Materials in medicine, 2009, 20 Suppl 1: S235-241.

168. Song W, Zhang J, Guo J, Zhang J, Ding F, Li L, et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicol Lett, 2010, 199(3): 389-397.

169. Meyer K, Rajanahalli P, Ahamed M, Rowe JJ, Hong Y. ZnO nanoparticles induce apoptosis in human dermal fibroblasts via p53 and p38 pathways. Toxicol In Vitro, 2011, 25(8): 1721-1726.

170. Xia T, Kovochich M, Liong M, Madler L, Gilbert B, Shi H, et al. Comparison of the mechanism of toxicity of zinc oxide and cerium oxide nanoparticles based on dissolution and oxidative stress properties. ACS Nano, 2008, 2(10): 2121-2134.

104 Références

171. Brunner TJ, Wick P, Manser P, Spohn P, Grass RN, Limbach LK, et al. In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: comparison to asbestos, silica, and the effect of particle solubility. Environ Sci Technol, 2006, 40(14): 4374-4381.

172. Formigari A, Irato P, Santon A. Zinc, antioxidant systems and metallothionein in metal mediated-apoptosis: Biochemical and cytochemical aspects. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 2007, 146(4): 443-459.

173. Vandebriel RJ, De Jong WH. A review of mammalian toxicity of ZnO nanoparticles. Nanotechnology, Sciences and Applications, 2012, 5: 61-71.

105 Annexes

ANNEXES Annexe n°1 : Diffractogrammes des rayons X des différentes formes commerciales de ZnO

106 Annexes

UNIVERSITE DE NANTES Année de la soutenance FACULTE DE PHARMACIE 2013

Nom - Prénom : BOUTARD Tifenn Titre du mémoire-Thèse : EVALUATION DE LA SECURITE D'EMPLOI ET DE L'EFFICACITE DE L'OXYDE DE ZINC DANS LE DOMAINE DE LA PHOTOPROTECTION TOPIQUE.

Résumé du Mémoire - Thèse :

Objectif : L'utilisation des filtres inorganiques sous forme nanoparticulaire dans les produits de protection solaire (PPS) soulève actuellement de nombreuses questions quant à leur innocuité. L'objectif de ce travail est d'évaluer la sécurité d'emploi et l'efficacité de l'oxyde de zinc (ZnO) dans le domaine de la photoprotection topique. Matériels et méthodes : La sécurité d'emploi de 6 formes commerciales de ZnO a été évaluée in vitro sur une lignée de kératinocytes humains (NCTC2544) par des tests de cytotoxicité (test au MTT) et de génotoxicité (PCR quantitative). L'efficacité de plusieurs PPS dits minéraux a été discutée en comparant le facteur de protection solaire obtenu par une méthodologie in vitro avec celui affiché. Résultats : L'ensemble des formes commerciales de ZnO testées inhibent la croissance cellulaire, de façon réversible ou non. Le gène P53, témoin d'une agression génotoxique, est surexprimé après traitement des cellules au ZnO. De plus, les résultats obtenus in vitro montrent que les produits de protection solaire minéraux ne permettent pas d'atteindre l'efficacité attendue. Conclusion : Bien que la question de la pénétration de telles particules ne soit pas résolue et en l'absence d'études supplémentaires, le principe de précaution s'impose : l'oxyde de zinc, comme l'avait rappelé l'AFSSAPS en 2011, ne doit pas être utilisé dans les produits de protection solaire.

Mots clés : Photoprotection, Oxyde de zinc, Nanoparticules, Cytotoxicité, Génotoxicité.

Jury : PRESIDENT : Mme Liliane ACAR, Professeur, UFR Pharmacie de Rennes

ASSESSEURS : Mme Laurence COIFFARD, Professeur, UFR Pharmacie de Nantes Mme Gaëlle QUEREUX, Professeur - Praticien Hospitalier, CHU de Nantes M. Nicolas MARIE, Praticien Hospitalier, CH Guillaume Régnier de Rennes

Adresse de l'auteur : Mme BOUTARD Tifenn 44000 Nantes