AVANCES RECIENTES EN LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE melo L.: CARACTERÍSTICAS DE IMPORTANCIA AGRONÓMICA Marisela Rivera-Domínguez, María F. Lazo-Javalera, Karen R. Astorga-Cienfuegos y Martín E. Tiznado-Hernández

RESUMEN

El melón ( L.) pertenece a la familia de las Cu- a combatir estos problemas. Se han realizado esfuerzos para curbitáceas, posee una amplia diversidad morfológica y es una crear plantas transgénicas a partir de muchas variedades de me- de las especies más importantes económicamente en el mundo. lón utilizando embriones somáticos, semillas, cotiledones, tubo Además de ser una excelente fuente de nutrientes tales como car- polínico, hojas y yemas o nudos cotiledonarios mediante Agro- bohidratos, ácidos orgánicos, minerales y vitaminas, es posible bacterium tumefaciens, A. rhizogenes, biobalística e inoculación cultivarlo durante gran parte del año. Por otro lado, crece en directa, para mejorar la calidad postcosecha del fruto, conferir regiones tanto tropicales como subtropicales; dando un amplio tolerancia a factores abióticos como salinidad y estrés hídrico, margen a los países productores para mantener el abastecimien- así como resistencia a factores bióticos como virus y fitopatóge- to del producto durante todo el año. Sin embargo, los produc- nos. Como resultado, se han creado varias plantas transgénicas tores de melón se enfrentan con problemas ocasionados princi- expresando diferentes características fenotípicas deseables. En palmente por insectos, bacterias, virus y hongos. Estrategias bio- este trabajo se compila y analiza la información disponible sobre tecnológicas como la transformación genética de plantas pueden el mejoramiento genético de melón, haciendo énfasis en el desa- mejorar la tolerancia del melón a estreses bióticos que afectan rrollo de las estrategias utilizadas de manipulación genética con a la producción, a través de la inserción de genes que ayudan el objetivo de introducir características de interés agronómico.

l mejoramiento genéti- cambios dependían de la variación ge- cesamiento del producto, arquitectura co ha estado presente nética disponible en las poblaciones de la planta, producción de compuestos desde que se originó la naturales y de la estabilidad de los nutricionales, y tolerancia a factores agricultura hace alrededor de 10000 mismos a través de varias generaciones bióticos y abióticos, entre otros (Hod- años, cuando los seres humanos encon- (Chrispeels y Sadava, 2003). Desde su son, 2005). traron en el sedentarismo su nueva inicio, el mejoramiento de cultivos ha El desarrollo de las forma de vida; lo cual generó la nece- buscado responder a requerimientos de técnicas derivadas de la tecnología del sidad de utilizar nuevos métodos para producción, tales como el manejo de ADN recombinante permite la intro- abastecerse de alimentos. Así fue plagas y enfermedades, rendimiento y ducción de genes de especies no rela- cuando el hombre empezó a cruzar calidad del producto cosechado, res- cionadas filogenéticamente; es decir, plantas y animales para que aportaran puesta a la aplicación de agroquímicos, permite superar las distancias entre los ciertas características deseadas; los características adecuadas para el pro- acervos genéticos, manifestadas en ba-

PALABRAS CLAVE / Biotecnología / Embriogénesis / Ingeniería Genética / Mejoramiento Genético / Melón / Organogénesis / Recibido: 24/10/2012. Modificado: 14/03/2013. Aceptado: 25/03/2013.

Marisela Rivera-Domínguez. Doctora en Ciencias, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), Irapuato, México. Investigadora, Centro de Investigación en Ali- mentación y Desarrollo A.C. (CIAD) Dirección: Laboratorio Biotecnología de Plantas. Departamento de Ciencias de los Alimentos, CIAD. CP. 83000. Hermosillo, Sonora México. e-mail: [email protected] María Fernanda Lazo-Javalera. Biotecnóloga en Alimentos, Instituto Tecnológico de Sonora, México. Estudiante de maestría, CIAD, México. e-mail: [email protected] Karen Rosalinda Astorga-Cienfuegos. Química Bióloga, Universidad de Sonora, México. Téc- nica, CIAD, México. e-mail: [email protected] Martín Ernesto Tiznado-Hérnández. PhD. en Fisiología de Plantas, Purdue University, EEUU. Investigador, CIAD, México. e-mail: [email protected]

186 0378-1844/13/03/186-08 $ 3.00/0 MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 rreras biológicas de reproducción se- especies, sino también de otras espe- 1996; Ezura et al., 1997; Shellie, 2001; xual, las cuales impiden en condicio- cies vegetales alejadas desde el punto Silva et al., 2004; Nuñez-Palenius et nes naturales el intercambio de genes de vista evolutivo, tales como hongos, al., 2006) y con alteración en el creci- de interés agrícola (ONU, 2003). Para virus, bacterias y animales. Conviene miento de las plantas y desarrollo del lograrlo se han desarrollado diversas destacar que la transformación de fruto (Yu et al., 2008; Tian et al., formas de mejoramiento genético en plantas es una tecnología que aporta 2010). Sin embargo, la mayoría de los las plantas, iniciando con la variación variabilidad genética sin alterar el fon- ensayos realizados se han enfocado en somaclonal hasta métodos más novedo- do genético. Este último aspecto es de el establecimiento de las condiciones sos como lo son la biobalística, la mi- gran importancia, ya que en la genera- idóneas para que la transformación sea croinyección de ADN y el uso de ción de nuevas líneas o cultivares lo exitosa y obtener así un mayor porcen- Agrobacterium, entre otros. que se desea es incorporar característi- taje de eficiencia de transformación, ya El melón (Cucumis cas favorables sin perder las caracte- que esto depende del genotipo, del tipo melo L.) pertenece a la familia de las rísticas propias deseables del cultivo. de tejido, de las condiciones del culti- Cucurbitáceas y es una de las especies Se han utilizado varias vo in vitro y del método de transfor- más importantes económicamente en el estrategias para la obtención de plantas mación (Dong et al., 1991, Yoshioka et mundo. Sin embargo, los productores transgénicas, que incluyen métodos al., 1992; Vallés y Lasa, 1994; Bordas de melón enfrentan serios problemas biológicos como la utilización de la et al., 1997). ocasionados principalmente por plagas, bacteria Agrobacterium, o métodos fí- Son muchos los facto- bacterias, virus y hongos. Estrategias sicos y químicos como biobalística res que influyen en la transformación biotecnológicas, como lo es la transfor- (bombardeo de partículas), electropora- genética de una planta. Por lo tanto, es mación genética de plantas, pueden ción, abrasión con fibras, tratamiento de vital importancia antes de cualquier ayudar a resolver estos problemas. Em- con polietilenglicol (PEG), utilización ensayo de mejoramiento genético, tener pero, esta especie es considerada como de láser y microinyección (Birch, bien establecidas las condiciones del una especie recalcitrante para la trans- 1997). Sin embargo, a la fecha los mé- método de transformación y de la ma- formación genética. El primer trabajo todos más utilizados tradicionalmente nipulación in vitro del cultivar. En este realizado en este sentido en melón fue son la transformación mediante bioba- contexto, en la Tabla I se resumen al- reportado por Fang y Grumet (1990). lística y la mediada por Agrobacte- gunas de las condiciones de cultivo de A partir de ese trabajo se han desarro- rium, las cuales se han usado en una tejidos vegetales in vitro utilizadas por llado numerosos estudios enfocados gran variedad de plantas dicotiledóneas varios autores desde el 2005 a la fe- tanto para establecer los protocolos (Fraley et al., 1986; Tepfer y Case-Del- cha, para obtener la regeneración de apropiados para la regeneración in vi- bart, 1987) y algunas monocotiledó- diferentes cultivares de C. melo L. tro como para la transformación gené- neas (May et al., 1995; Songstad et al., Cabe mencionar que información ante- tica, con la finalidad de conferir cier- 1995). rior al 2005 ha sido compilada, anali- tas características agronómicas impor- zada por Nuñez Palenius et al. (2008). tantes a este cultivo. En este contexto, Mejoramiento de Melón Utilizando En la tabla mencionada, es posible ob- el objetivo de esta revisión es compilar Ingeniería Genética servar que existen 14 reportes donde y analizar la información actual dispo- se establecen protocolos de regenera- nible sobre el establecimiento de pro- Como se ha menciona- ción a partir de embriones somáticos, tocolos de regeneración (desde el 2005) do anteriormente, son dos los métodos cotiledones, hojas y yemas o nudos. y mejoramiento genético de melón más utilizados para la transformación No existe un medio de cultivo óptimo (desde el 2007), haciendo énfasis en genética en plantas. En melón, los establecido para la regeneración de los el desarrollo de las estrategias de la eventos de transformación genética se distintos cultivares de melón, por lo manipulación genética para introducir han realizado en su mayoría utilizando que se hace imperante el estableci- características de interés agronómico Agrobacterium tumefaciens con la ex- miento de un medio diferente para en melón. cepción de tres eventos de transforma- cada cultivar. ción donde se ha reportado la utiliza- Transformación Genética de Plantas ción de A. rhizogenes (Toyoda et al., Optimización de las Condiciones 1991; Sol et al., 2011; Mohiuddin et para la Transformación Genética en Una de las formas me- al., 2011), dos eventos mediante bom- Melón diante las cuales se puede modificar bardeo (Gaba et al., 1992; Gray et al., las plantas en un lapso de tiempo más 1995), un evento utilizando virus (Shi- El melón es considera- corto con respecto a las técnicas de la boleth et al., 2001) y un experimento do como una especie recalcitrante para genética tradicional (hibridación), es la donde se utilizó la inoculación directa la transformación genética. El primer ingeniería genética. Esta técnica impli- al tubo polínico (Hao et al., 2011). trabajo realizado en melón en este sen- ca la introducción de genes a una célu- Después del primer reporte exitoso de tido fue reportado por Fang y Grumet la o tejido con el uso de un vector, el mejoramiento genético de melón vía A. (1990). A partir de entonces, se han cual lleva integrado el o los genes que tumefaciens (Fang y Grumet, 1990), se realizado varios ensayos (Toyoda et se deseen transferir. Las células o los han realizado varios ensayos en melón, al., 1991; Dong et al., 1991; Gaba et tejidos candidatos a la transformación obteniendo así líneas resistentes a vi- al., 1992; Vallés y Lasa, 1994; Gray et deben poseer óptimas condiciones para rus (Fang y Grumet, 1993; Yoshioka et al., 1995; Nuñez-Palenius et al., 2002; la división celular y características de al., 1993; Gonsalves et al., 1994; Hutt- Galperin et al., 2003; Akasaka-Kenne- totipotencia; esto es, capacidad de re- ner et al., 2001), resistentes al ataque dy et al., 2004). Nuñez Palenius et al. generarse en una planta completa (Gu- de hongos (Taler et al., 2004), toleran- (2008) han compilado y analizado la tiérrez et al., 2003). De igual manera, tes a estrés salino (Bordas et al., 1997; información reportada hasta 2004. El se pueden introducir en las plantas ge- Serrano et al., 1999), con mejores ca- presente trabajo muestra los reportes nes provenientes no sólo de las mismas racterísticas del fruto (Ayub et al., posteriores a dicha fecha.

MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 187 TABLA I CONDICIONES DE REGENERACIÓN IN VITRO DE Cucumis melo L. Medio y condiciones Cultivar Explante Tiempo de Medio Tiempo en Medio elongación Tiempo de enraizamiento Tiempo Referencia desarrollo regeneración (MR) MR (ME) en ME (Men) en Men Honey Dew Segmentos MS 1 sem MS 3 sem MS Chan y nodales BA 8,0mg·l‑1 BAP 0,5mg·l‑1 Sacarosa 2% Lok, Sacarosa 2% Sacarosa 2% Agar 0,8% 2005 Agar 0,8% Agar 0,8% Amarillo Oro Cotiledones 7 días MS Souza, Sacarosa 3% 2006 Inositol 0,1g·l‑1 Tiamina-HCL 1,0g·l‑1 IAA 1,5mg·l‑1 BA 1,0mg·l‑1 ‑1 CuSO4 1,0mg·l Agar 0,8% Galia Cotiledones 2 días MS 4 sem MS 3 sem MS 3 sem Nuñez- Sacarosa 3% Sacarosa 3% IAA 1mg·l‑1 Palenuis Mio inositol 0,1g·l‑1 Mio inositol 0,1g·l‑1 Sacarosa 3% et al., Tiamina HCl 0,001 g·l‑1 Tiamina HCl 0,001gl‑1 Agar 8g·l‑1 2006 Piridoxina HCl 0,05g·l‑1 Piridoxina HCl Ac. nicotinico 0,05g·l‑1 0,05g·l‑1 Glicina 2mg·l‑1 Ac. Nicotinico BA 1mg·l‑1 0,05g·l‑1 NAA 0,001mg·l‑1 Glicina 2mg·l‑1 Agar 7g·l‑1 BA 0,025mg·l‑1 Agar 8g·l‑1 Fotoperiodo 16h, 25°C Galia Embriones E-20A 5 sem E-20A (50%) 2-5 sem Nuñez- Agua de coco 5% Agua de coco 5% Palenuis Xilosa 0,02mg·l‑1 Xilosa 002mg·l‑1 et al., Glutamina 1mg·l‑1 Glutamina 1mg·l‑1 2006 Putrescina 0,25mM Putrescina 0,25mM IBA 0,01mg·l‑1 IBA 0,01mg·l‑1 BA 0,1mg·l‑1 BA 0,01mg·l‑1 Sacarosa 2% Sacarosa 2% Agar 0,8% Agar 0.8% Fotoperiodo 16h, 25°C Maazoum Cotiledones 10 días MS MS Rhimi Agar 0,7% Sacarosa 7% et al., NAA 0,01mg·l‑1 Agar 0,7% 2007 IAA 1,5mg·l‑1 NAA 0,01mg·l‑1 BAP 0,10mg·l‑1 BAP 0,1 Cinetina 6mg·l‑1 mg·l‑1 Sacarosa 2% 22°C Fotoperiodo 16h Hale´s Cotiledones MS 3 días- MS 4-5 Sem MS Little Best BAP 5uM oscuridad BAP 2uM Sacarosa 2% et al., Jumbo ABA 1uM Agar 0,8% Agar 0,8% 2007 Agar 2,5g·l‑1 Sacarosa 2% Sacarosa 2% 26°C Pile de Sapo Cotiledones MS sales MS sales Castelblan- B5 vitaminas B5 vitaminas que et al., Sacarosa 3% Sacarosa 3% 2008 MES 0,6g·l‑1 MES 0,6g·l‑1 ‑1 ‑1 CuSO4 1mg·l CuSO4 1mg·l Agar 0,8% BA 0,5mg·l‑1 Agar 0,8% Fotoperiodo 16 h, 28°C Védrantis Paul Hojas 13 días MS MS 2-3 sem MS Chovelon BAP 0,2mg·l‑1 BAP 0,2mg·l‑1 Agar 7g·l‑1 et al., Cotiledones 5 días 2iP 0,2mg·l‑1 GA3 0,1mg·l‑1 Sacarosa 30g·l‑1 2008 Sacarosa 3% Sacarosa 30g·l‑1 Fotoperiodo 16h, Agar 0,7% Agar 7g·l‑1 25-28°C Silver Cotiledones MS 2-4 sem MS 2 sem MS 1 sem Wu et al., ligth NAA 0,02mg·l‑1 NAA 0,01mg·l‑1 BA 0,5mg·l‑1 2009 BA 0,5mg·l‑1 BA 0,1mg·l‑1 Agar 0,8% Agar 0,8% Agar 0,8 % Sacarosa 2% Sacarosa 2% Sacarosa 2% Líneas Cotiledones 3 días MS MS Valdez y criollas BAP 1mg·l‑1 Sacarosa 30g·l‑1 Gatica, OSO-1, Sacarosa 30g·l‑1 Agar 8g·l‑1 2009 OSO-2, Agar 8g·l‑1 OSO- 3,PQRG-1, PQRG-2, Fotoperiodo 16h, 25°C PQRG-3, EM1

(continúa)

188 MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 TABLA I

Medio y condiciones Cultivar Explante Tiempo de Medio Tiempo en Medio elongación Tiempo de enraizamiento Tiempo Referencia desarrollo regeneración (MR) MR (ME) en ME (Men) en Men Snake Cotiledones 7 días MS 4 sem Yalcin-Mendi BA 1,0mg·l‑1 et al., 46KSU IAA 0,25mg·l‑1 2010 Agar 0,75% Sacarosa 3% Líneas Nudos MS MS MS (50%) Zhang hibridas cotiledonarios Agar 0,8% BA 0,5mg·l‑1 Sacarosa 3% et al. CM15, Sacarosa 3% Sacarosa 3% Agar 0,8% 2011 CM23 BA 1,5mg·l‑1 Agar 0,8% IAA 0,5mg·l‑1 Fotoperiodo 16h, 25°C Védrantis Hojas 13 días MS MS 2-3 sem MS Chovelon BAP 0,2mg·l‑1 BAP 0,2mg·l‑1 Agar 0,8% et al., Cotiledones 4 días 2iP 0,2mg·l‑1 GA3 0,1mg·l‑1 Sacarosa 3% 2011 Sacarosa 3% Agar 0,8% Agar 0,7% Sacarosa 3% Fotoperiodo 16h, 26-28 °C Cantaluope, Nudos 7 días MS MS MS Ren et al., Heneydew cotiledonarios BA 1mg·l‑1 BA 0,01mg·l‑1 Sacarosa 30g·l‑1 2012 ABA 0,26mg·l‑1 Sacarosa 30g·l‑1 Agar 8g·l‑1 IAA 0,8mg·l‑1 Agar 8g·l‑1 Sacarosa 30g·l‑1 Agar 7g·l‑1

MS: medio Murashige and Skoog (1962), sem: semanas, IAA: ácido indol acético, BAP: bencil aminopurina, NAA: ácido naftalenacético, BA: bencil adenina, 2iP: 2-isopentenil adenina, CuSO4: sulfato de cobre, ABA: ácido absícico, E20: medio E20 (Sauton, 1987), IBA: ácido indolbutíri- co, B5: medio B5 (Gamborg, 1968), MES: buffer ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico.

Çürük et al. (2005) re- SPS1 en el plásmido PBI121 para trans- raíz, semillas, tallos y polen, siendo la portaron la transformación genética de formar cotiledones de melón línea M01- transformación genética mediada por A. los cultivares `Kirkagac 637´ y `Noi Ya- 3 y así suprimir la expresión de la en- tumefaciens y los cotiledones, la meto- rok´, mediante Agrobacterium utilizan- zima sacarosa fosfato sintasa. Hao et dología y el tipo de tejido más utiliza- do la cepa EHA105 conteniendo el plás- al. (2011) reportan una metodología dos respectivamente, en los protocolos mido pME504 con los genes de selec- donde se logra la introducción del con- reportados. En este trabajo de revisión, ción nptII, bar y uidA, probando diver- tructo en antisentido del gen ACC oxi- ~92% de los eventos de transformación sos medios y concentraciones de dasa bajo el promotor CaMV35S (libre aquí compilados se realizaron utilizan- kanamicina. Un trabajo similar fué rea- de marcador de selección) vía introduc- do A. tumefaciens y el 78% de los mis- lizado por Rhimi et al. (2007) con el ción directa al tubo polínico de melón mos utilizaron cotiledones como ex- cultivar `Maazoun´ utilizando la cepa cultivar `Hetao´. Chovelon et al. (2011) plante. Más aún, la mayoría de las ca- GV3101. Nuñez-Palenius et al. (2007) y lograron la transformación de cotiledo- racterísticas manipuladas en los ensayos Castelblanque et al. (2008) probaron las nes y hojas jóvenes del cultivar `Ve- de transformación genética en melón cepas de Agrobacterium ABI, AGI-1 y drantis´ utilizando las cepas de A. tu- han sido el mejoramiento en la calidad AGL0, EHA101 y EHA105 en las varie- mefaciens GV2260, AGL-1, con el plás- y la resistencia a virus. Sin embargo, es dades de melón `Galia´, `piel de sapo´, mido pBI101 y la cepa LBA4404 con muy claro que todavía es necesario es- `Vedrantais´ y `PI 161375´, para deter- pBI121. Ambos plásmidos incluyendo el tablecer las condiciones óptimas de minar el mayor porcentaje de regenera- gen reportero uid A y el de resistencia transformación genética para cada culti- ción y transformación. En otro estudio, npt II bajo el promotor CaMV35S. Ren var de melón. Lo anterior debido a que Chovelon et al. (2008) probaron dife- et al. (2012) utilizaron las cepas de A. de 14 reportes al respecto aquí mencio- rentes tipos de tejidos (hipocotilo y co- tumefaciens EHA105 y LBA4404 con el nados, el 42% se refieren al estableci- tiledón) de las variedades `Vedrantais´ y vector pCNL56 que incluyen los genes miento de las condiciones óptimas de `Paul´ con Agrobacterium cepa C58 ex- marcadores nptII y uidA bajo el promo- transformación utilizando vectores o presando el plásmido pBI101, que inclu- tor del CaMV35S para transformar coti- plásmidos conteniendo únicamente ge- ye los genes uidA y nptII. Yu et al. ledones de melón líneas `F39´ y `150´ y nes marcadores de selección y/o repor- (2008) clonaron el gen MAD en antisen- establecer los protocolos de transforma- teros (sin transgen). En la Tabla II se tido en el vector pBI121 y fue introdu- ción. Rodríguez et al. (2012) generaron listan una serie de distintas condiciones cido vía directa a cotiledones de melón líneas transgénicas de melón BGV-130 reportadas para la transformación gené- línea M01-3 utilizando la cepa utilizando hipocotilos y la cepa de A. tica de Cucumis melo L, a partir del LBA4404 de A. tumefaciens. Wu et al. tumefaciens EHA105 y la estrategia de 2007 a la fecha. (2009) obtuvieron plantas transgénicas RNA de interferencia para silenciar al de cv `Silver light´ resistentes al virus gen Cm-elF4E y generar resistencia vi- Resistencia a Virus del mosaico amarillo del calabacín me- ral. diante la agroinfección de cotiledones En resúmen, y conside- El primer ensayo de re- utilizando la cepa LBA4404 contenien- rando lo reportado por Nuñez-Palenius sistencia a virus en cultivares de melón do el vector pBI2CP3´UTR. Tian et al. et al. (2008), son 47 el número de pro- fue realizado por Yoshioka et al. (2010) utilizaron la cepa de A. tume- tocolos de transformación genética a (1992), seguido de los trabajos publica- fciens LBA4404 conteniendo el gen partir de cotiledones, pecíolos, hojas, dos por Fang y Grumet (1993), Gonsal-

MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 189 TABLA II CONDICIONES DE LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE Cucumis melo L.

Control de la Característica Método Transgen expresion Vector expresada Explante Cultivar de transformación Referencia CP4 sintasa, P-FMV pMON17204, Resistencia a Cotiledones, Galia A. tumefaciens Núñez-Palenius et nptII, uidA, gpf P-CaM35S pCAMBIA herbicidas, marcador hipocotilos y hojas ABI y AGL-1 al., 2007 de selección no expandidas etr1-1, nptII P-CaM35S PGA643 Insensibilidad al Cotiledones Hale Best Jumbo A. tumefaciens EHA105 Little et al., 2007 etileno, marcador de selección etr1-1, nptII P-AP3 pCAMBIA Insensibilidad al Cotiledones Hale Best Jumbo A. tumefaciens C58 Little et al., 2007 P-CRC etileno, marcador de selección nptII P-CaM35S pADI Marcador de selección Cotiledones Maazoun A. tumefaciens GV3101 Rhimi et al., 2007 cDNA MAI1 en P-CaM35S pBI121 Alteración en creci- Cotiledones Linea MO1-3 A. tumefaciens LBA4404 Yu et al., 2008 antisentido, miento de la planta y nptII desarrollo del fruto, marcador de selección nptII, uidA P-CaM35S pBI121 Marcador de Cotiledones Védrantais A. tumefaciens C58 Chovelon et al., selección 2008 uidA, nptII pmi, P-CaM35S pIRTA-2 Marcador de Cotiledones Védrantais A. tumefaciens LBA4404 Castelblanque et bar,ALS pIRTA-C21 selección AGLO al., 2008 pBIN35S AGL1 pGiPTV EHA105 pIRTA-5 EHA101 cDNA CP3'UTR, P-CaM35S pBI-ZCP3´_ Resistencia a virus, Cotiledones Silver ligth A. tumefaciens LBA4404 Wu et al., 2009 nptII T-Nos UTR marcador de selección cDNA SPS1 en P-CaM35S pBI121 Alteración en Cotiledones Linea MO1-3 A. tumefaciens LBA4404 Tian et al., 2010 antisentido, crecimiento de la plan- nptII ta y desarrollo del fru- to, marcador de selec- ción ACCO en P-CaM35S pPZCO-ACO1 Mejora de la calidad, Tubo polínico Hetao Inoculación Directa Hao et al., 2011 antisentido T-Nos sin marcador de selección Tumorogénesis-callo Tallos y peciolos Birdie A. tumefaciens LBA4404, Mohiuddin et al., (crown gall) A737, C58, A348 y A281 2011 Oncogénesis-(pelos A. rhizogenes 15834, 9402, radiculares) A4, 8196 y A105 uidA, nptII P-CaM35S pBI121 Marcador de Cotiledones y hojas Védrantais, Paul, A.tumefaciens, LBA4404, Chovelon et al., T-Nos selección Gynadou, AGL-1 y GV2260 2011 Vidrinski-Koravci, Gaucho 1, Chadaljak, China 51, Smith-perfect, Casaba-Golden B, Kirkagac, , URS 187 nptII, P-CaM35S pCNL56 Marcador de Cotiledones Lineas A. tumefaciens LBA4404 Ren et al., 2012 uidA selección ´F39´ y EHA105 ´I50´ ´TMS´ (RNAi) cm-e1F4E, P-CaM35S pART27 Resistencia a virus, Hipocotilo Accesión BGV-130 A. tumefaciens EHA105 Rodriguez- nptII T-OCS marcador de selección Hernández et al., 2012

NR: no reportado, P-: promotor, T-: terminador. ves et al. (1994), Clough y Ham, (1995) et al. (2001) lograron desarrollar la re- plantas transgénicas de cv `Silver light´ y Fuchs et al. (1997). Esta información sistencia contra el virus mosaico de la resistente al virus del mosaico amarillo ha sido compilada y analizada por Nu- sandia y virus del mosaico amarillo del del calabacín mediante Agrobacterium ñez Palenius et al. (2008). calabacín a los cultivares `US patent cepa LBA4404 y Rodríguez Hernández Posteriormente, Kottea- 442´ y `US patent 259´ vía Agrobacte- et al. (2012) obtuvieron plantas transgé- rachi et al. (2000) trabajaron con el cv rium utilizando el plásmido pBRL3754. nicas con el gen Cm-elF4E silenciado `Thai Jumbo´ para inducir la resistencia Yalcin-Mendi et al. (2004) confirieron mediante la técnica del RNAi, las cua- contra el virus de la mancha anular de resistencia contra virus del mosaico les mostraron resistencia a la infección la papaya (PRV; Papaya Ringspot Vi- amarillo del calabacín a un cultivar ya con los virus amarillo de pepino rus) mediante el co-cultivo por tres días resistente a cepas 0 y 1 de Fusarium (CVYV), virus de la mancha necrótica con Agrobacterium conteniendo el plás- oxysporum f. sp. melonis a Cucumis de melón (MNSV), virus de mosaico de mido pSAI039 que lleva los genes nptII, melo var. inodorus cv `Kirkagaed 637´. sandía Morrocan (MWMV) y virus del gus y nib (resistencia a PRV). Huttner Además, Wu et al. (2009) obtuvieron mosaico amarillo de calabaza (ZYMV)

190 MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 indicando que éste gen controla la sus- Tolerancia a Factores Abióticos eventos de transformación se realizaron ceptibilidad de melón a estos virus. utilizando A. tumefaciens y el 78% utili- Muy pocos reportes zó cotiledones. Además, se encontró que Resistencia contra Fitopatógenos han sido publicados sobre la generación de los eventos de transformación genéti- de líneas transgénicas de melón que ca de melón compilados en el presente En lo referente al ata- muestran el fenotipo de tolerancia a trabajo, el 42% han sido realizados in- que por fitopatógenos, se han realizado factores ambientales. En este contexto, troduciendo plásmidos conteniendo úni- muy pocos ensayos de mejoramiento Bordas et al. (1997) introdujeron en camente genes marcadores de selección genético para conferirle al melón resis- melón el gen hal1, brindando tolerancia y/o reporteros (sin el transgen), el 21% tencia contra hongos. Taler et al. (2004) a salinidad. Posteriormente Serrano et con la finalidad de mejorar la calidad utilizaron A. tumefaciens cepas al. (1999) insertaron el gen hal1 y tps1 postcosecha, el 14% para conferir resis- LBA4404 y EHA105, obteniendo plan- para brindar tolerancia a salinidad y se- tencia al ataque de virus, el 7% con el tas transgénicas de melón que sobreex- quía. También, Shiboleth et al. (2001) fin de aumentar la resistencia a fitopató- presan los genes de resistencia enzimá- desarrollaron plantas transgénicas de genos y el 7% con el fin de alterar el tica At1 y At2. También, Souza (2006) melón cv `Arava´ que presentaran resis- crecimiento de la planta. Sin embargo, realizó transformación genética de me- tencia a herbicidas, utilizando como aún cuando se han obtenido varias lí- lón con los genes chin y bgn para obte- vector al virus del mosaico amarillo del neas de melón genéticamente mejoradas ner plantas resistentes a hongos. calabacín, el cual fue insertado median- de importancia agronómica, todavía es te bombardeo de microproyectiles. Nu- necesario establecer cada uno de los Mejoramiento de Calidad Postcosecha ñez- Palenius et al. (2006, 2007) repor- protocolos y estrategias de mejoramiento del Melón taron la transformación de melón cv para los cultivares que son importantes `Galia´ con el gen de resistencia al her- en determinadas regiones del mundo. Para la selección de los bicida glifosfato CP4 syn como gen frutos, los consumidores se basan prin- marcador de selección de las líneas REFERENCIAS cipalmente en la apariencia, lo cual in- transgénica obtenidas. cluye la firmeza, el color característico Akasaka-Kennedy Y, Tomita KO, Ezura H del melón y la ausencia de daños físi- Otras Características (2004) Efficient plant regeneration and cos o indicios de alguna contaminación. Agrobacterium-mediated transformation via somatic embryogenesis in melon (Cu- Por lo tanto, es de importancia tratar de Papadopoulou et al. cumis melo L.). Plant Sci. 166: 763-769. extender al máximo la vida postcosecha (2005) incorporaron el gen de la enzi- Ayub R, Guis M, BenAmor M, Gillot L, del fruto retardando los procesos de la ma ACC sintasa de petunia en el melón Roustan JP, Latche A, Bouzayen M, Pech maduración y manteniendo la buena ca- cv `Hale´s Best Jumbo´ mediante Agro- JC (1996) Expression of ACC oxidase anti- lidad para su comercialización. Las pri- bacterium cepa EHA105, para regular sense gene inhibits ripening of meras plantas de melón transgénicas, la producción de etileno endógeno y así melón fruits. Nature Biotechnol. 14: 852- que contienen los genes involucrados en aumentar la feminidad en las flores y 866. el proceso de maduración de los frutos, por lo tanto obtener mayor número de Birch RG (1997) Plant transformation: Prob- lems and strategies for practical applica- fueron desarrolladas por Ayub et al. frutos. tion. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. (1996). Posterior a esto y con este mis- Biol. 48: 297-326. mo fin, varios autores (Clendennen et Conclusiones Bordas M, Montesinos C, Dabauza M, Salava- al., 1999; Guis et al., 2000; Nora y Pe- dor A, Roig LA, Serrano R, Moreno V ters, 2001; Silva et al., 2004; Nuñez-Pa- Debido a la gran impor- (1997) Transfer of the yeast salt tolerance lenius et al., 2006) han desarrollado en- tancia económica del melón (Cuccumis gene HAL1 to cucumis melo L. cultivars sayos de transformación genética en di- melo L.) y la variedad de cultivares and in vitro evaluation of salt tolerance. Transgén. Res. 6: 41-50. ferentes cultivares de melón. Dicha in- existentes en el mundo, se han desarro- Castelblanque L, Marfa V, Claveria E, Marti- formación ha sido reportada por Nuñez llado varias estrategias biotecnológicas nez I, Perez-Grau L, Dolcet-Sanjuan R Palenius et al. (2008). Hubo un periodo con la finalidad del mejoramiento genéti- (2008) Improving the genetic transforma- en el cual no se realizaron trabajos de co para el aumento de la producción, tion efficiency of cucumis melo subsp. transformación genética relacionados conferir resistencia y/o mejorar la cali- melo “Piel de Sapo” via Agrobacterium. con la maduración o aspectos de cali- dad de los mismos, haciéndolos más dis- En Pitrat M (Ed.) Proc. IX EUCARPIA Meet. on Genetics and Breeding of Cucur- dad en poscosecha en esta especie debi- ponibles para su comercialización y fi- bitaceae INRA. Avignon, Francia. pp. do, tal vez, a que las investigaciones se nalmente para el consumo humano. En 627-631. enfocaron en otros aspectos agronómi- los últimos años se han realizado esfuer- Cürük S, Çetiner S, Elman C, Xia X, Wang Y, cos. No fue sino hasta que Hao et al. zos al respecto y tomando en considera- Yeheskel A, Zilberstein L, Perl-Treves R, (2011) reportan la transformación de ción lo reportado por Nuñez Palenius et Wated A, Gaba V (2005) Transformation melón vía tubo polínico utilizando un al. (2008), actualmente existen 21 repor- of recalcitrant melon (Cucumis melo L.) tes donde se establecen protocolos de re- cultivars is facilitated by wounding with vector libre de marcador de selección, carborundum. Eng. Life Sci. 5: 10.1002. incorporando mediante esta técnica al generación in vitro a partir de embriones Chan LK, Lok KH (2005) In vitro plantlets re- gen de la ACC oxidasa en antisentido somáticos, cotiledones, hojas y yemas o generation from nodal segments of musk en el cv `Hetao´. La transformación me- nudos. Así como, 47 protocolos de trans- melon (Cucumis melo L.). Biotechnol. 4: diante esta vía no requiere de métodos formación genética utilizando cotiledo- 354-357. de regeneración in vitro de los tejidos nes, peciolos, hojas, raíz, semillas, tallos Chovelon V, Restier V, Dogimont C, Aarrouf J transgénicos. Los frutos obtenidos mos- y polen. La transformación genética me- (2008) Histological study of shoot organo- traron bajos niveles de etileno, mejor diada por Agrobacterium tumefaciens y genesis in melon (Cucumis melo L.) after firmeza y la vida de anaquel se exten- los cotiledones es la metodología y el genetic transformation. En Pitrat M (Ed.) Proc. IX EUCARPIA Meet. on Genetics dió hasta 30 días en contraste con 12 tipo de tejido más utilizados en los pro- and Breeding of INRA. días para los frutos no transgénicos. tocolos reportados ya que ~90% de los Avignon, Francia. pp. 633-637.

MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 191 Chovelon V, Restier V, Giovinazzo N, Dogi- Guis M, BenAmor M, Latche A, Pech JC, with an antisense ACC oxidase gene. Plant mont C, Aarrouf J (2011) Histological Roustan JP (2000) A reliable system for Cell Rep. 25: 198-205. study of organogenesis in Cucumis melo the transformation of cantaloupe Charen- Núñez-Palenius HG, Gomez-Lim MA, Ochoa- L. after genetic transformation: why is it tais melón (cucumis melo L. var. cantalu- Alejo N, Grumet R, Lester G, Cantliffe DJ difficult to obtain transgenic plants?. Plant pensis) leading to a majority of diploid re- (2008) Melon fruits: Genetic diversity, Cell Rep. 30: 2001-2011. generants. Sci. Hort. 84: 91-99. physiology and biotechnology features. Chrispeels MJ, Sadava DE (2003) Plants, Gutiérrez MA, Santacruz RF, Cabrera PJ, Ro- Crit. Rev. 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192 MAR 2013, VOL. 38 Nº 3 rhizogenes as a vector for transforming hig- Plant Cell Rep. 13: 145-148. Y, Yakuwa T, Oosawa K (1992) Suc- her plants. Microbiol. Sci. 4: 24-28. Wu H, Yu T, Raja J, Wang H, Yeh S (2009) cessful transfer of the cucumber mosaic- Tian H, Ma L, Zhao C, Hao H, Gong B, Yu Generation of transgenic oriental melon virus coat protein gene to Cucumis melo X, Wang X (2010) Antisense repression of resistant to Zucchini yellow mosaic virus L. Jap. J. Breed. 42: 277-285. sucrose phosphate syntase in transgenic by an improved cotyledon-cutting method. Yoshioka K, Hanada K, Harada T, Minobe Y, muskmelon alters plant growth and fruit Plant Cell Rep. 28: 1053-1064. Oosawa K (1993) Virus-resistance in development. Biochem. Biophys. Comm. Yalcin-Mendi Y, Ipek M, Serbest-Kobaner S, Curuk transgenic melon plants that express the 393: 365-379. S, Aka Kacar Y, Cetiner S, Gaba V, Grumet R cucumber mosaic-virus coat protein gene Toyoda H, Hosoi Y, Yamamoto A, Nishiguchi (2004) Agrobacterium-mediated transformation and in their progeny. Jap. J. Breed. 43: T, Maeda K, Takebayashi T, Shiomi T, of Kirkagac 637 a recalcitrant melon (Cucumis 629-634. Ouchis S (1991) Transformation of Melon melo) cultivar with ZYMV coat protein enco- (Cucumis melo L.) with Agrobacterium ding gene. Eur. J. Hort. Sci. 69: 258-262. Yu X, Wang X, Zhang W, Qian T, Tang G, Guo Y, Zheng C (2008) Antisense suppression rhizogenes. Plant Tiss. Cult. Lett. 8: 21-27. Yalcin Mendi Y, Comlekcioglu N, Ipek M, Ko- of an acid invertase gene (MAI1) in musk- Valdez MM, Gatica AAM (2009) Effect of caman E, Izgu1 T, Tekdal D, Curuk P BAP and IAA on shoot regeneration in co- (2010) The effect of different hormone con- melon alters plant growth and fruit develo- tyledonary explants of Costa Rican melon centrations and dark pretreatment on adven- pment. J. Exp. Bot. 59: 2969-2977. genotypes. Agron. Costarric. 33: 125-131. titious shoot regeneration in snake melon Zhang H, Peng G, Feishi L (2011) Efficcient Vallés MP, Lasa J. (1994) Agrobacterium-me- (Cucumis melo var. flexousus). Rom. Biote- plant regeneration from cotyledonary diated transformation of commercial me- chnol. Lett. 15: 5392-5395. node explants of Cucumis melo L. Afr. J. lon (Cucumis melo L., cv. Amarillo Oro). Yoshioka K, Hanada K, Nakazaki Y, Minobe Biotehnol. 10: 6757-6761.

ADVANCES IN GENETIC TRANSFORMATION OF Cucumis melo L.: IMPORTANT AGRONOMIC TRAITS Marisela Rivera-Domínguez, María F. Lazo-Javalera, Karen R. Astorga-Cienfuegos and Martín E. Tiznado-Hernández SUMMARY

The melon (Cucumis melo L.) belongs to the Cucurbitaceae transgenic plants from different melon cultivars using somatic family, shows a large morphological variation and it is one of embryos, seeds, cotyledons, polinic tube, leaf and buds or coty- the most important species from the economic point of view. ledonary leaves in early stages of development using Agrobac- Besides being a rich source of nutrients such as carbohydrates, terium tumefaciens, A. rhizogenes, particle bombardment and organic acids, minerals and vitamins, it can be grown through- direct inoculation, with the goal to improve the postharvest out the year. It grows in tropical and subtropical regions, giv- quality, develop tolerance to abiotic stresses like salinity and ing a wide margin to producing countries to maintain an ad- dehydration, and resistance to biotic stresses such as viruses equate supply all the year. However, melon producers have to and phytopathogens. As a result, several transgenic plants have deal with yield reductions due to the attack of insects, bacte- been created showing different desirable phenotypic character- rias, virus and fungi. Biotechnological strategies such as ge- istics. In this paper the available information about genetic im- netic transformation can improve the tolerance of this crop to provement of melon is reviewed and analyzed, focusing on the biotic stresses by the insertion of genes that help in the struggle different strategies of genetic manipulation that had been uti- against these problems. Efforts have been carried out to create lized with the aim to introduce agronomic important traits.

AVANÇOS RECENTES NA TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CucumIs melo L.: CARACTERÍSTICAS DE IMPORTANCIA AGRONÔMICA Marisela Rivera-Domínguez, María F. Lazo-Javalera, Karen R. Astorga-Cienfuegos e Martín E. Tiznado-Hernández RESUMO

O melão (Cucumis melo L.) pertence à família das Cucurbi- Tem-se realizado esforços para criar plantas transgênicas a táceas, possui uma ampla diversidade morfológica e é uma das partir de muitas variedades de melão utilizando embriões so- espécies mais importantes economicamente no mundo. Além de máticos, sementes, cotilédones, tubo polínico, folhas e gemas ser uma excelente fonte de nutrientes tais como carboidratos, ou nós cotiledonares mediante Agrobacterium tumefaciens, A. ácidos orgânicos, minerais e vitaminas, é possível cultivá-lo du- rhizogenes, biobalística e inoculação direta, para melhorar a rante grande parte do ano. Por outro lado, cresce em regiões qualidade pós-colheita do fruto, conferir tolerância a fatores tanto tropicais como subtropicais; dando uma ampla margem abióticos como salinidade e estresse hídrico, assim como resis- aos países produtores para manter o abastecimento do produto tência a fatores bióticos como vírus e fitopatógenos. Como re- durante todo o ano. No entanto, os produtores de melão se en- sultado, se tem criado varias plantas transgênicas expressando frentam com problemas ocasionados principalmente por insetos, diferentes características fenotípicas desejáveis. Neste trabalho bactérias, vírus e fungos. Estratégias biotecnológicas como a se compila e analisa a informação disponível sobre o melhora- transformação genética de plantas podem melhorar a tolerância mento genético do melão, fazendo ênfases no desenvolvimento do melão a estresses bióticos que afetam à produção, a través das estratégias utilizadas de manipulação genética com o obje- da inserção de genes que ajudam a combater estes problemas. tivo de introduzir características de interesse agronômico.

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