Interaction Réciproque Entre La Palmitylation Et La Phosphorylation Du Récepteur Pz-Adrénergique
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Université de Montréal Interaction réciproque entre la palmitylation et la phosphorylation du récepteur pz-adrénergique. Par Lynda Adam Département de biochimie Faculté de médecine Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.1 en biochimie Décembre 1999 Yynda Adam, 1999 National Library Biblioth$8 nationale du Cana Acqui8itiorrs and Acquisitions et 8ibliographic Sewb sewices bbüographiques The author has granteci a non- L'auteur a accordé une licence non exclusive licence allowing the exclusive permettant à la National Library of Canada to Bibliothèque nationale du Canada de reproduce, loan, distribute or seil reproduire, prêter, distribuer ou copies of this thesis in tnicrofonn, vendre des copies de cette thèse sous paper or electroaic formats. la forme de microfiche/film, de reproduction sur papier ou sur format électronique. The author retains ownership of the L'auteur conserve la propriété du copyright in this thesis. Neither the droit d'auteur qui protège cette thèse. thesis nor substantid extracts fkom it Ni la thèse ni des extraits substantiels may be printed or othewise de celle-ci ne doivent être imprimés reproduced without the author's ou autrement reproduits sans son permission. autorisation, Université de Montréal Faculté des études supérieures Cette thèse intitulée : ~NTERACTIONRÉCIPROQUE ENTRE LA PALMITYLATION ET &A PHOSPHORYLATtON DU RÉCEPTEUR P2-~~~É~~~~~~~~ Présentée par : Lpda Adam a été ivaluée par un jury composé des personnes suivantes : Dr Réjean Morais Président-rapporteur. Département de biochimie Université de Montréal Dr Guy Boileau Membre du jury, Département de biochimie Université de Montréal Dr Michel Bouvier Directeur de thèse, Département de biochimie Université de Montréal Dr Luc Berthiaume Examinateur externe, Départment de biologie cellulaire Université d'Alberta Représentant du doyen. Faculté de médecine Université de Montréai III Sommaire Le récepteur Pradrenergique est, parmi les récepteurs couplés aux protéines G, le mieux connu et, par conséquent, sert de prototype pour cette grande famille de récepteurs. Les différents mécanismes responsables de régulariser l'activité fonctionnelle du P2.4R sont relativement bien établis. Par exemple, ii la suite d'une stimulation soutenue par un agoniste, la phosphorylation et la palrnitylation du P2AR sont modifiées. Cependant, contrairement à la phosphorylation, peu d'études se sont attardées à caractériser la palmitylation du récepteur. Cette modification consiste à l'ajout d'un acide gras saniré de seize atomes de carbone sur le résidu cystéine 341 du récepteur via une liaison thioester. Selon les résultats d'études antérieures, la palmitylation pourrait correspondre à un niveau supplémentaire de régulation de l'activité fonctionnelle du P2AR. Le premier objectif vise donc à mieux comprendre la dynamique de palmitylation du récepteur. A la suite d'expériences de radiomarquages et de "pulse-chase", nous avons démontré que la palmitylation est une modification post-traductiomelle réversible durant la vie du récepteur indépendamment du système d'expression utilisé (cellules de mammifères et cellules d'insectes). De plus, l'état d'activation du récepteur influence grandement sa palmitylation. L'activation du récepteur par un agoniste aboutit 5 une au-mentation nette de la vitesse de renouvellement du palmitate associé au récepteur. Dans ce contexte d'activation, nous avons mis en évidence par mutagenese dirigée que le site de phosphorylation de la PKA ("'RRss"~) dans la portion C-terminale du récepteur y joue un rôle déterminant. La phosphorylation de ce site de la PKA serait responsable, par une répulsion entre les charges négatives des phospholipides de la membrane plasmique, et celles des sérines phosphorylées 345 et 346, de la diminution de la stabilité de l'ancrage du palmitate dans la membrane. Ultimement, la phosphorylation du récepteur favoriserait une forme non palmitylée du P2AR. La déphosphorylation du PtAR serait necessaire pour permettre au récepteur d'être de nouveau paimitylé. Dans l'ensemble. ces résultats suggèrent que la palmitylation est régulée non seulement à la suite de l'activation du récepteur, mais également par l'état de phosphorylation du P?AR. Cette interaction entre la phosphorylation et la palmitylation du récepteur a Cté observée en utilisant des cellules de mammifère et des cellules d'insectes (SB). Cependant, une différence existe entre ces deux systèmes en ce qui a à la vitesse de renouvellement du palmitate associé au récepteur. Dans les cellules de mammifères. la vitesse de renouvellement du palmitate associé au récepteur est beaucoup plus lente que celle observée dans les cellules d'insectes (SB).Pour cette raison, nous croyons que la palmitylation pourrait avoir dauues fonctions. Cependant, le ou les rôles pouvant être rattachés à cette modification demeurent à être déterminés. Nous avons également démontré que la paimitylation du PlAR pouvait être régulé indépendamment de l'activation du récepteur. Nous avons mis en évidence le fait que le monoxyde d'azote exerce une modulation sur l'état de palmitylation du P2AR. Les résultats de cette étude ont démontré que la présence de monoxyde d'azote diminue l'incorporation du palmitate tritié au niveau du récepteur activé ou pas par un agoniste tel que I'isoprotérénol. Cet effet du monoxyde d'azote est accompagne du découplage fonctionnel du récepteur avec la protéine Gas. Selon nos résultats, le monoxyde d'azote module directement la voie P-adrénergique en régulant l'état de palmitylation du P2AR. Mots clés du sommaire: récepteur Pz-adrénergique. palmitylation, phosphorylation, monoxyde d'azote, régulation. Table des matieres Sommaire .......................................................................................................................... III Table des matieres ................................................... Liste des tableaux ...................................................................................................... VIII Liste des figures ................................................................................................................. IX Liste des sigles et abréviations ............................................................................................ X Remerciements ................................................................................................................ XII 1. Introduction.......... .... ............................................................................ 1 1 . i introduction aux récepteurs couplés aux protéines G ............................................... 1 1.2 Les récepteurs adrénergiques ................................................................................... -7 1.2.1 L'historique et la classification des récepteurs adrénergiques........................... - 7 12.2 La pharmacologie des ricepteun adrénergiques .............................................. 3 12.3 Les composantes de la voie de signdisation P-adrénergique ............................ 8 1.2.3.1 Le P2AR .................................. .. ..................... .... ........................................8 1 .2.3.l.1 Les sites d'interaction ligand-hAR ................................................... 12 1 .2.3. L .2 Les sites d'interaction Pa-protdine G ......................................... 15 1.2.3.2 LesprotrmesG.. ......................................................................................... 16 1 .2.3.3 L'adénylyl cyclase ..............................................................................19 1.2.4 Aspect dynamique de la voie de signalisation du PIAR. .............................. 20 L .2.5 La r&ulation du P2AR................ ....... .................................................... 27 1-2 3.1 Le découplagr fonctionnel ...................................................................... 28 * 1.2.5.2 La séquestration ........................................................................................ 33- 1 L5.3 La réguIa~onnégative .............................................................................. -40 1.2.5.3.1 Dégrdation du P2AR..................................................................... A0 1.2.5.3-2 Régulation du niveau d'ARNm du P2AR .......................................... -42 .. 1.3 L*acylatioa des protemes ....................................................................................... 43 1 .3.1 La glypiation ................................................................................................. 47 L .3.2 La prhylation............................................................................. .. ................ 18 1-3 -3 La myristylation...... .... ......................................................................... -50 1.3.4 Lacholestérylation........................................................................................ 52 1 .3.5 La palmityktion ......................................................................................... -32 1.3 .5 .L Enzymologie de la palrnitylation ............................................................... 53 1.33.2 Rôles de la paimitylation.......................................................................... -58 1.4 Les objeaifs de la thèse ...................................................................................... 76 2.1 Article 1: Palmitoylated cysteine 34 1 modula= phosphorylation of the P2' adrenergic receptor by the cAMPdependent protein kinase ..................................