Modulation Du Chémoréflexe Et De La Stabilité Respiratoire Par Les Récepteurs Nucléaires Et Membranaires De La Progestérone

Modulation du chémoréflexe et de la stabilité respiratoire par les récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone

Thèse

Ryma Boukari

Doctorat en médecine expérimentale Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

Résumé

La progestérone stimule le chémoréflexe ventilatoire et réduit l’occurrence des apnées. En revanche, ses mécanismes d’actions sont peu élucidés. Les récepteurs nucléaires (nPR) et les récepteurs membranaires (mPRs) de la progestérone de type α et β sont exprimés dans les centres respiratoires au niveau du tronc cérébral. En premier, nous avons postulé que la délétion des nPR chez la souris femelle (PRKO) affecte le chémoréflexe ventilatoire et augmente la fréquence des apnées durant le sommeil. Nos résultats ont montré que les nPR stimulent la réponse ventilatoire à l’hypercapnie et réduisent la fréquence des apnées post- soupirs durant le sommeil calme. Ensuite, nous avons postulé que le mPRα et le mPRβ modulent le chémoréflexe et la stabilité ventilatoire chez la souris adulte. La réduction de l’expression des récepteurs mPRβ ou le mPRα exprimés au niveau des centres de contrôle ventilatoire de la médulla oglongata a mis en évidence que ces récepteurs contribuent à la régulation du chémoréflexe ventilatoire. De plus, le mPRβ contribue à la stabilité respiratoire chez la souris adulte mâle et femelle. Enfin, nous avons postulé que la réduction de l’expression des nPR, mPRα ou le mPRβ dans le système nerveux central affecte le chémoréflexe et la stabilité ventilatoire chez des rats de 10 jours de vie. Nos résultats ont indiqué que le nPR et le mPRβ contribuent à la stabilité du patron ventilatoire chez le nouveau-né. Nous concluons que la progestérone signale par les récepteurs nPR, mPRα et le mPRβ pour réguler le chémoréflexe ventilatoire chez l’adulte. En outre, le nPR et le mPRb contribuent à la stabilité ventilatoire à la fois chez la souris adulte et le rat nouveau-né. Ces deux récepteurs pourraient être de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l’apnée du sommeil chez l’adulte et l’apnée du nouveau-né.

iii

Abstract

Progesterone stimulates the ventilatory chemorefelx and reduces the occurrence of apnea, but the mechanisms are not well understood. The nuclear (nPR) and membrane progesterone receptors (mPRs) sutypes α and β are expressed in the respiratory centers of the brainstem. First, we postulated that the nPR deletion in female mice (PRKO) affects ventilatory chemoreflex and increases the frequency of apnea during the quiet sleep. Our results showed that the nPR stimulate the ventilatory response to hypercapnia and reduce the frequency of post-sigh apneas during the quiet sleep. Next, we postulated that the mPRα and mPRβ modulate chemoreflex and ventilatory stability in adult mice. The reduction of the expression of the mPRβ or the mPRα, expressed at the level of the ventilatory control centers at the level of the medulla oblongata, has demonstrated that these receptors contribute to the regulation of the ventilatory chemoreflex. In addition, mPRβ contributes to respiratory stability in male and female adult mice. Finally, we have postulated that reduced expression of the nPR, mPRα, or mPRβ in the central nervous system affects chemoreflex and ventilatory stability in 10-day-old rats. Our results indicated that the nPR and mPRβ contribute to the stability of the ventilatory pattern in neonates. We conclude that progesterone signals via nPR receptors, mPRα and mPRβ to regulate ventilatory chemorefelx in adults. In addition, nPR and mPR contribute to ventilatory stability in both adult mice and neonatal rats. These two receptors could be new therapeutic targets for the treatment of sleep apnea in adults and apnea of the newborn.

Tables des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... iv Tables des matières ...... v Liste des figures ...... x Liste des tableaux ...... xiii Liste des abréviations et des sigles ...... xiv Remerciements ...... xvii Avant-propos ...... xix ...... 1 Introduction ...... 1 Introduction générale ...... 2 La fonction respiratoire chez les mammifères ...... 4 La fonction respiratoire ...... 4 La ventilation pulmonaire...... 4 Échanges gazeux et circulation ...... 5 La respiration cellulaire ...... 6 La physiologie du chémoréflexe ventilatoire chez les mammifères ...... 8 Le chémoréflexe périphérique ...... 8 Le chémoréflexe central ...... 14 Les mécanorécepteurs ...... 21 Intégration centrale et genèse de la commande ventilatoire motrice ...... 21 Intégration des afférences sensorielles respiratoires ...... 21 Genèse du rythme et de la commande ventilatoire motrice ...... 24 La physiopathologie de l’apnée du sommeil chez l’adulte ...... 26 Définition de l’apnée du sommeil (AS) ...... 26 Les types de l’AS ...... 28 L'apnée obstructive du sommeil (AOS) ...... 28 L'apnée centrale du sommeil (ACS) ...... 28 L’apnée mixte ...... 31 Épidémiologie et le dimorphisme sexuel de l’AS ...... 31 Conséquences pathologiques de l’AS ...... 32 Les mécanismes physiopathologiques de l’AS ...... 33 Obstruction des voies aériennes supérieures (VAS) ...... 34 Mécanisme de l’apnée centrale ...... 44 Les approches thérapeutiques disponibles ...... 51 L’impact de la progestérone sur la fonction respiratoire chez les mammifères ...... 52 Généralités sur la progestérone ...... 52 Définition de la progestérone ...... 52 Les voies de la biosynthèse et le métabolisme de la progestérone ...... 53

Le lieu de la biosynthèse de la progestérone ...... 53 Taux de la progestérone chez le mâle et la femelle (humains et rongeurs) : ...... 56 Actions pléiotropiques de la progestérone ...... 58 Effet de la progestérone sur le contrôle ventilatoire chez l’adulte ...... 58 La ventilation chez la femelle et le mâle : Le dimorphisme sexuel ...... 58 Impact de la progestérone sur la fonction respiratoire...... 60 Les mécanismes expliquant les effets respiratoires de la progestérone ...... 65 La pathophysiologie de l’apnée du nouveau-né ...... 75 La définition de l’apnée du nouveau-né ...... 75 Épidémiologie de l’apnée du nouveau-né ...... 75 Les types d’apnée chez le nouveau-né ...... 75 Les mécanismes physiopathologiques de l’apnée de nouveau-né ...... 76 Les principales approches thérapeutiques disponibles en clinique ...... 78 La thérapie par les xanthines ...... 78 La ventilation à pression positive continue (CPAP) ...... 79 Effet de la progestérone sur le contrôle respiratoire chez le nouveau-né ...... 79 Hypothèses et objectifs de recherche ...... 81 Objectif global ...... 81 Hypothèse globale ...... 81 Hypothèses et objectifs spécifiques ...... 81 ...... 84 The nuclear progesterone receptor reduces post-sigh apneas during sleep and increases the ventilatory response to hypercapnia in adult female mice...... 84 Résumé...... 85 Abstract...... 86 Introduction ...... 87 Material and Method ...... 89 Animals ...... 89 Instrumentation for sleep recordings ...... 89 Recording of respiratory and metabolic parameters ...... 90 Data analysis ...... 91 Determination of sleep/wake states and EEG spectral density analysis...... 91 Respiratory and metabolic parameters...... 92 Sigh and post-sigh apnea frequency...... 93 Statistical Analysis ...... 93 Results ...... 95

Respiratory and metabolic variables during non-REM and REM sleep in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment...... 98 Sigh frequency during non-REM sleep in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment ...... 101 Hypoxic and hypercapnic ventilatory responses in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment ...... 104 Discussion...... 107 Conclusion ...... 110 ...... 112 Membrane progesterone receptor b, but not a in dorsal brainstem establishes sex- specific chemoreflex responses and reduces apnea frequency in adult mice...... 112 Résumé...... 113 Abstract...... 114 Introduction ...... 116 Material and method ...... 117 Animals ...... 117 Experimental Design ...... 118 Recording of respiratory and metabolic parameters ...... 119 Set-up details...... 119 Respiratory and metabolic signal analysis at rest ...... 120 Respiratory signal analysis for chemoreflex responses ...... 121 Sigh, post-sigh apnea, and spontaneous apnea frequency...... 121 Immunohistochemistry ...... 121 Statistical Analysis ...... 122 Results ...... 123 Treatment with siRNA against mPRα or mPRβ reduces immunostaining of mPRα or mPRβ in the brainstem ...... 123 The siRNA against mPRα or mPRβ increases respiratory frequency at rest in males but not in females ...... 124 The siRNA against mPRβ increases apnea frequency at rest in male and female mice 127 The siRNA against mPRβ decreases the hypoxic and hypercapnic ventilatory responses 128 mPRb establishes sex-specific differences on ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia ...... 131 Discussion...... 133 Expression of mPRb controls apnea frequency and establishes sex-specific chemoreflex function ...... 133

vii

Methodological Considerations ...... 136 Conclusion ...... 137 ...... 139 Ovarian steroids act as respiratory stimulant and antioxidant against the causes and consequences of sleep-apnea in women...... 139 Résumé...... 140 Abstract...... 141 Introduction ...... 142 A complex network of progesterone receptors likely involved in respiratory control 144 Role of nuclear progesterone receptor in respiratory control and apnea frequency . 145 Role of membrane progesterone receptors in respiratory control and apnea frequency 146 Role of nuclear and membrane progesterone receptors in respiratory control and apnea frequency in males ...... 150 Antioxidant roles of Estradiol and progesterone in intermittent hypoxia and sleep apnea? ...... 152 Sleep apnea is an oxidative stress disorder ...... 152 Estradiol reduces blood pressure and oxidative stress in intermittent hypoxia ...... 154 Estradiol receptor alpha reduces blood pressure in intermittent hypoxia ...... 155 Does estradiol protect against vascular damages in intermittent hypoxia? ...... 156 Influence of aging on oxidative stress disorders induced by IH and hormonal effects on respiratory control ...... 157 Conclusions ...... 158 ...... 160 Progesterone receptors expressed in central nervous system contribute to breathing stability of 10 days old rats...... 160 Résumé...... 161 Abstract...... 162 Introduction ...... 163 Materials and methods ...... 165 Animals: ...... 165 Experimental Design ...... 165 Recording of Respiratory and Metabolic Parameters: ...... 166 Sigh, post-sigh apnea, and spontaneous apnea frequency: ...... 167

viii

Statistical Analysis ...... 168 Results ...... 168 Effects of siRNA against mPR-α, mPRβ and nPR on minute ventilation and metabolic rate in normoxia: ...... 168 Effect of treatment with siRNA against mPR-α, mPRβ and nPR on sighs and apnea Frequency during normoxia: ...... 172 Discussion...... 172 Conclusion ...... 175 ...... 176 Discussion générale ...... 176 Précisions méthodologiques...... 178 Définition des petits ARN interférents ...... 178 Fonctionnement des siRNA in vivo ...... 178 Administration des siRNA in vivo ...... 179 Infusion chronique dans le IVe ventricule chez la souris adulte ...... 179 La pléthysmographie à corps entier : ...... 182 Critères de sélections des périodes de repos dans l’étude III ...... 185 La pertinence de nos modèles expérimentaux ...... 187 La diversité des voies de signalisations impliquées dans les effets respiratoires de la progestérone ...... 191 Le rôle des récepteurs nucléaires de la progestérone dans le chémoréflexe et la fréquence de l'apnée ...... 191 Le rôle des récepteurs membranaires de la progestérone dans le chémoréflexe et la fréquence de l'apnée ...... 196 Rôle des récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone dans le contrôle respiratoire et la fréquence de l'apnée chez le rat nouveau-né ...... 201 Les limites de nos études : ...... 205 Étude chapitre II ...... 205 Étude du chapitre III ...... 206 Perspectives ...... 207 ...... 209 Conclusion générale ...... 209 ...... 213 Références ...... 213

Liste des figures

Figure 1:L’appareil respiratoire chez les humains...... 5 Figure 2: Schéma représentatif des échanges gazeux respiratoires...... 7 Figure 3: La régulation du chémoréflexe respiratoire par les stimuli chimiques ; CO2 ou O2...... 9 Figure 4: Les différentes phases de la réponse ventilatoire selon le temps d’exposition à l’hypoxie...... 11 Figure 5 : Localisation et structure des corps carotidiens...... 13 Figure 6: Schéma du modèle de chémodétection de l'O2 par les cellules glomiques du corps carotidien de souris...... 15 Figure 7: La relation linéaire entre la PACO2 et la ventilation alvéolaire...... 17 Figure 8: La chémoréception centrale...... 18 Figure 9: Localisation des chémorécepteurs au niveau central...... 20 Figure 10: L’organisation fonctionnelle des principaux noyaux respiratoires du tronc cérébral des mammifères...... 22 Figure 11: Schéma illustrant l’intégration des afférences respiratoires périphériques au niveau central...... 23 Figure 12: Représentation des commandes motrices bulbo-spinales...... 25 Figure 13: L’apnée du sommeil...... 27 Figure 14: Enregistrement par polysomnographie montrant une série d'apnées obstructives au cours du sommeil nREM...... 29 Figure 15: Enregistrement par polysomnographie montrant une série d'apnées centrales au cours du sommeil chez un patient atteint de défaillance cardiaque congestive...... 30 Figure 16: Les mécanismes physiopathologiques de l’apnée du sommeil...... 35 Figure 17: Anatomie des voies aériennes supérieures chez les humains...... 37 Figure 18:Diagramme montrant les trois principaux facteurs régulant l’activité du muscle génioglosse pendant l'éveil et le sommeil...... 39 Figure 19:Illustration des anomalies de la commande ventilation vers les neurones moteurs hypoglosses dans la physiopathologie de l’AOS...... 42 Figure 20: Représentation graphique de la courbe isométabolique...... 46 Figure 21:Mécanismes de l’ACS...... 48 Figure 22: La genèse du soupir est associée à l'éveil et l’apnée centrale (tracé VT)...... 50 Figure 23: Les voies de biosynthèse et du métabolisme de la progestérone chez les mammifères...... 54 Figure 24:Source et taux plasmatiques de la progestérone chez la femme et l’homme...... 55 Figure 25: Un schéma illustrant les multiples récepteurs impliqués dans les actions de la progestérone et de l'alloprégnanolone au niveau du système nerveux...... 66 Figure 26: Structure des isoformes des récepteurs nucléaires de la progestérone ; le nPRA et nPRB et le nPRC...... 68 Figure 27: Illustration de la localisation du mPRb au niveau du système nerveux central chez un embryon de souris et une souris jeune adulte (49 jours)...... 73 Figure 28: Les réponses ventilatoires à l’hypoxie et à l’hypercapnie chez le nouveau-né. . 77

Figure 29: Typical recordings of respiratory flow, instantaneous breathing frequency (breaths/min), EMG, and EEG obtained in 1 animal throughout the recording session (A), during non-REM (B), and REM sleep (C)...... 96 Figure 30: EEG power density (%) during wakefulness, non-REM, and REM sleep in Wild- Type (WT) or PRKO mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog) for 7 days. . 97 Figure 31: Respiratory parameters recorded during non-REM and REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog)...... 99 Figure 32: Metabolic parameters recorded during non-REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog)...... 100 Figure 33: Representative examples of brief wake episodes typically occurring with sigh ...... 102 Figure 34: Sighs and post-sigh apneas during non-REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog)...... 103 Figure 35: Ventilatory responses to hypoxia (12% O2), hypercapnia (5% CO2), and hypoxic- hypercapnia (12% O2-5% CO2) in WT or PRKO mice treated with vehicle or progesterone...... 106 Figure 36: Representative examples of immunostaining on brainstem slices from mice treated with aCSF (control) or with the siRNA against mPRα or mPRb in the dorsal region of the brainstem (around bregma level -7.08, at the caudal opening of the 4th ventricule. 125 Figure 37: Representative examples of immunostaining on brainstem slices from mice treated with aCSF (control) or with the siRNA against mPRα or mPRb in the caudal region of the brainstem (around bregma level -7.76)...... 126 Figure 38: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on breathing instabilities recorded at rest...... 127 Figure 39: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on chemoreflex function in female mice ...... 129 Figure 40: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on chemoreflex function in male mice...... 130 Figure 41: Mean responses to hypoxia and hypercapnia in male and female mice...... 132 Figure 42: Effect of siRNA against mPRβ on chemoreflex function evaluated by exposure to hyperopia in unanesthetized adult male and female mice treated with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) or siRNA against mPRβ...... 149 Figure 43: Contribution of progesterone receptors on frequency of sighs and post-sigh apneas in adult mice ...... 151 Figure 44: Effect of propylpyrazole triol (PPT – a specific αER agonist) or vehicle on arterial pressure of adult ovariectomized female rats exposed to intermittent hypoxia (IH) during 7 days...... 157 Figure 45: Effect of siRNA against nPR, against mPRα or against mPRβ on ventilation recorded during normoxia in female and male 10 days-old rats...... 169 Figure 46: Effect of siRNA against nPR , mPRα or mPRβ injection on respiratory metabolism recorded during normoxia in female and male 10 days-old rats ...... 170 Figure 47: Effect of siRNA against nPR, mPRα or mPRβ on chemoreflex function in female and male 10 days-old rats...... 171 Figure 48: Effect of siRNA against mPRα, against mPRβ or against nPR on breathing instabilities recorded during normoxia with female and male 10 days-old rats...... 173

Figure 49: Fonctionnement des siRNA in vivo...... 180 Figure 50: Vérification histologique du site d’injection i.c.v. dans le 4e ventricule par une injection du bleu de méthylène...... 181 Figure 51: Un exemple de cycle respiratoire obtenu par la pléthysmographie à corps entier (tracé vert) chez une souris adulte en normoxie...... 183 Figure 52: Un schéma de pléthysmographie à corps entier associé à un système de télémétrie pour l’enregistrement de l’EEG et l’EMG de la nuque...... 184 Figure 53: Des exemples d’enregistrements du débit ventilatoire, le VT et la fR durant les périodes de repos ou les périodes actives de la souris...... 186 Figure 54: Exemples de soupirs, d’apnées post-soupirs, et d’apnées spontanées enregistrées en normoxie recueillis chez de souris C57BL/6J non anesthésiées...... 189 Figure 55: Illustration de la contribution des récepteurs de la progestérone à la stabilité ventilatoire dans le cadre d’un équilibre entre l’effet de la progestérone et son métabolite l’alloprégnanolone...... 205 Figure 56: Un schéma de synthèse des mécanismes d'action par lesquels la progestérone produit, au moins en partie, ses effets respiratoires chez la souris adulte...... 212

xii

Liste des tableaux

Table 1: Body weight (BW, g), serum progesterone concentration (ng/ml), % time spent awake, non-REM, and REM sleep during recordings of respiratory variables ...... 95

Table 2: Tidal volume ( : ml/100 g), respiratory frequency (Fr: breaths/min), and minute ventilation ( : ml/min/100 g) during baseline recordings, and exposure to hypercapnia (5% CO2), hypoxia (12% O2), and hypercapnic-hypoxia (5% CO2+12% O2), WT: wild-type mice...... 105

. Table 3: Body weight, rectal temperature, minute ventilation ( V E ), respiratory frequency .  (fR), tidal volume (VT), O2 consumption, and CO2 production rates ( V O2 , VCO ), respiratory 2 . . . .  equivalent of O2 and CO2 ( V E V O2 and V E V CO2 ), and respiratory exchange ratio ( VCO / 2 .

V O2 ) recorded in normoxia in adult female mice treated with the artificial cerebrospinal fluid (aCSF - control) or siRNA against mPRα or β...... 124

Tableau 4: Specific contributions of nPR, mPRα or mPRβ on ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia in adult female mice...... 148

xiii

Liste des abréviations et des sigles

V O2 : volume d’O2 consommé  VCO : volume de CO2 produit 2 ♀ : femelle ♂ : mâle 3α-HSD : 3α-hydroxystéroïde déhydrogénase 3β HSD : 3β-hydroxystéroïde déhydrogénase 4V : quatrième ventricule 5-HT : 5-hydroxytryptamine 5α-DHP : 5α-dihydroprogestérone ACS : apnée centrale du sommeil AF : fonction activatrice AMPc : adénosine monophosphase cyclique AOS. : apnée obstructive du sommeil AP : aire postréma AR : potentialisation à court terme ARNm : acide ribonucléique messager AS : apnée du sommeil ATP : adénosine tri-phosphate BötC : complexe Bötzinger BSA : bovine serum albumin Ca2+ : ion calcium CMA : chlormadinone acétate CO2 : dioxyde de carbone DBD : domaine de liaison à l’ADN DR : raphé dorsal DRG : groupe respiratoire dorsal EMG : électromyogramme Fe : la fraction de gaz mesurée dans les conduitee de sortie Fi : la fraction de gaz mesurée dans les conduites de l’entrée Flowi : le débit de gaz entrant dans la chambre de la pléthysmographie FN : noyau fastigial GABA : Acide g-aminobutyrique GG : génioglosse H+ : proton H2CO3 : acide carbonique H2O : eau - HCO3 : ion bicarbonate HD: hypoxic desensitization HI : hypoxie intermittente HSP : heat shock protein i.p. : intra-péritoneale. i.v. : intra-veneuse

xiv

IAH : indice d’apnée et d’hypopnée K+ : potassium Kd : constante de dissociation KF : noyau de Kölliker-Fuse L : litre LBD : domaine de liaison au ligand LH : hormone lutéinisante LHA : hypothalamus latéral min : minute mm Hg : millimètre de mercure MPA : médroxyprogestérone mPR : récepteurs membranaires de la progestérone. N2 : azote NM : noyau moteur Non-REM : non rapid eye movement nPR : Récepteurs nucléaires de la progestérone NTS : noyau du tractus solitaire O2 : oxygène P : pression partielle PACO2 : pression partielle alvéolaire en CO2 PaCO2 : pression partielle artérielle en CO2 PAO2 : pression partielle alvéolaire en O2 PaO2 : pression partielle artérielle en O2 PAQR: progestin and adipoQ receptor PBr/KF : noyau parabrachial/Kölliker-Fuse et PETCO2 : pression en CO2 en fin d’expiration pFRG : groupe parafacial PGi : noyau réticulaire paragigantocellulaire PRE : éléments de réponse palindromiques preBötC : complexe pré-Bötzinger PRG : groupe respiratoire du pont PRKO : knockout en récepteurs nucléaires de la progestérone Px : nombre (x) de jours de vie post-nataux REM : rapid eye movement RM : raphé médullaire RTN : noyau rétrotrapézoïde RVH : la réponse ventilatoire à l’hypoxie RVHC: réponse ventilatoire à l’hypercapnie SaO2 : saturation artérielle en oxygène sec : seconde siRNA: petits ARN interférents StAR : protéine régulatrice aiguë de la stéroïdogenèse STD : dépression à court terme STP : la potentialisation à court terme TP : tensor palatini

VAH : acclimatation ventilatoire à l’hypoxie. VAS: voies aériennes supérieures VPPC : ventilation en pression positive continue VRGc: groupe respiratoire caudal VRGr : groupe respiratoire ventral rostral VRGv : groupe respiratoire ventral WT : souris de type sauvage

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Remerciements

La présente thèse est le fruit de plusieurs années de travail. Il s'agit d'un aboutissement que je dois aux nombreuses personnes qui m'ont aidé et accompagné quotidiennement dans la réalisation de mes études et dans l'achèvement de mon troisième cycle universitaire.

En premier lieu, je voudrais remercier le docteur Vincent Joseph. Il m'a offert la formidable aventure de faire un doctorat dans son laboratoire. Je tiens à lui témoigner toute ma reconnaissance pour tous ses conseils et encouragements surtout dans mes moments de doute. Les années passées dans ce laboratoire m'ont permis de développer grandement mon sens de l'organisation et ma rigueur scientifique. Je tiens également à remercier Pre Aida Bairam, Pr Richard Kinkead et le Pr Jorge Soliz pour leurs nombreux éclairages scientifiques, recommandations et conseils dont ils m'ont gratifié. De plus, les portes du laboratoire du Dr Richard Kinkead ont toujours été toujours ouvertes pour moi. Durant toutes ces années de travail, j’ai utilisé sans limites le matériel de son laboratoire, je resterai reconnaissante à ce laboratoire toute ma vie.

Je voudrais également témoigner ma gratitude Roumiana Gulmotova, François Marcouiller et Stéphanie Fournier et Rose Tam ; des assistants de recherche qui m’ont beaucoup aidé durant toutes mes années de recherche. Je veux également témoigner ma gratitude aux autres membres du groupe de recherche Hayet Kouchi, Dre Cécile Baldy, Dre Orlane Rossignol, Naga Praveena Upari, Luana Tonerio, Dre Tara Adel-Janes à toutes ces personnes je veux dire « un très gros Merci » pour tous ces moments passés ensemble, les discussions et surtout vos sourires. Merci pour les rires, les encouragements ainsi qu'aux remarques destinées à me faire aller de l'avant, bref merci pour tout. Sans oublier mes chères stagiaires Florence Trembley, Iseult Greunier-Ouelette et Célia De Bruyn. Merci pour votre aide et votre agréable compagnie.

Également, un merci spécial à mes chères amies Dre Alexandra Jochmans-lemoine et Dre Ikhlasse Hadjsalem d’avoir participé aux corrections de ma thèse. Merci pour vos conseils, vos encouragements et surtout de m’avoir écouté.

xvii

Depuis toujours, j'ai bénéficié du soutien indéfectible des membres de ma famille. Ils ont toujours été présents depuis le début de mes études et m'ont toujours encouragé à aller plus loin et à laisser de côté mes appréhensions. Je veux donc, leur exprimer mon éternelle gratitude à ma mère et mon père ainsi que mes chers frères et sœur. À mon mari qui m’a toujours poussé à ne pas baisser les bras, à poursuivre mes études et à toujours donner le meilleur de moi-même dans chaque chose. Merci de ton aide dans la rédaction et surtout en s'occupant des petits lorsque je ne pouvais pas le faire. Je ne peux pas oublier mes deux précieux enfants Idris et Insaf. Je m’excuse pour tous les moments où je n’étais pas disponible pour jouer plus avec vous. Promis, nous allons nous rattraper !

Ryma Boukari

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Avant-propos

Les études intégrées à l’appui de cette thèse ont été réalisées au cours de mes études doctorales entre 2013 et 2018 dans le laboratoire de mon directeur de thèse Pr Vincent Joseph au sein du centre de recherche de l'Hôpital St-François D'Assise du CHUQ (Université Laval) puis au centre de recherche de l’Institut de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (Université Laval).

La première étude qui constitue le chapitre II et présentée à l'appui de cette thèse de doctorat a été réalisée dans le laboratoire de mon directeur de recherche, le Pr Vincent Joseph au centre de recherche de l'Hôpital Saint François d'Assise affilié au Centre Hospitalier Universitaire de Québec (Université Laval). Ces études ont été menées grâce aux supports financiers des Instituts de Recherche en Santé du Canada (IRSC) octroyés à mon directeur de recherche. Je suis deuxième coauteur avec le co-auteur Sofien Laouafa. J'ai participé à une partie des expériences, particulièrement les chirurgies pour l’implantation des sondes de télémétrie et des enregistrements respiratoires. J'ai également participé aux corrections du manuscrit. François, est un professionnel de recherche, a contribué dans les expériences et les révisons du manuscrit. Sofien Laouafa, était un étudiant en maîtrise, il a participé aux révisions du manuscrit. Raphaël Lavoie, est un ex- professionnel de recherche dans l’équipe, il a participé également aux expériences.

La deuxième étude présentée à l'appui de cette thèse de doctorat constitue le chapitre III. Elle a été réalisée dans le laboratoire de mon directeur de recherche le Pr Vincent Joseph au centre de recherche de l'Hôpital Saint François d'Assise affilié au Centre Hospitalier Universitaire de Québec (Université Laval). Ces études ont été menées grâce aux supports financiers des Instituts de Recherche en Santé du Canada octroyés au Pr Vincent Joseph, ainsi que les bourses attribuées par la faculté de médecine de l’Université Laval. J'ai participé à l’ensemble des expériences de cette étude, à l’analyse et à l’interprétation de toutes les données. J'ai également participé activement à la rédaction et aux corrections et la révision du manuscrit. Dre Orlane Rossignol, était stagiaire postdoctorale, elle a participé aux expériences et à l’analyse des données de la partie qui a porté sur l’étude du rôle mPRa. Cécile Baldy, était

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étudiante au doctorat, elle a participé aux immunohistochimies du mPRa. François Marcouiller nous a assuré l’assistance technique et a participé aux révisions du manuscrit.

La troisième étude, qui constitue le chapitre IV, a été réalisée dans le laboratoire de mon directeur de recherche le Pr Vincent Joseph au centre de recherche de l’Institut de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (Université Laval). Cette revue a été menée grâce aux supports financiers des Instituts de Recherche en Santé du Canada octroyés au Pr Vincent Joseph, ainsi que ma bourse attribuée par Fonds de Recherche en Santé de Québec (FRSQ). Je suis première auteure, J'ai participé aux expériences, analyses et interprétation des données générées, j'ai également participé à la rédaction et aux corrections du manuscrit. Sofien Laoufa étudiant au doctorat a participé aux expériences et aux révisions du manuscrit. Alexandra Ribon étudiante au doctorat a participé à la rédaction du manuscrit.

Ces différentes études publiées sont intégrées sans modifications majeures.

La quatrième étude a été réalisée au laboratoire du Pr Joseph au sein du centre de recherche de l'Hôpital St-François d'Assise du CHUQ (Université Laval) puis au centre de recherche de l’Institut de Cardiologie et de Pneumologie de Québec (Université Laval). Cette étude inclut des données supplémentaires et elle est réalisée dans le cadre de ma thèse. J'ai participé aux expériences, au développement du projet, à l’analyse et à l’interprétation des données.

J’ai également participé au développement du projet et la correction du manuscrit de l’étude intitulée :

"Respiratory regulation by steroids in newborn rats: a sex-specific balance between allopregnanolone and progesterone receptors" Exp Physiol. 2018 Feb 1;103(2):276-290

Vincent Joseph, NagaPraveena Uppari, Hayet Kouchi, Celia De Bruyn, Ryma Boukari, and Aida Bairam.

Introduction

Introduction générale

Le contrôle de la ventilation permet une régulation précise des niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone au niveau artériel. Certains troubles de ce contrôle peuvent apparaitre au cours du sommeil et entraînent des anomalies de la ventilation. Il en résulte des perturbations des échanges gazeux respiratoires pouvant entraîner une interruption du sommeil. L’apnée du sommeil (AS) est l’une des conséquences cliniques les plus fréquentes de l’altération du contrôle ventilatoire, dont l’apnée obstructive (AOS) est la forme la plus commune (Young et al., 2002; Eckert et al., 2009). Les études épidémiologiques mettent en évidence une prévalence élevée de cette pathologie même dans la population générale non diagnostiquée. Cette prévalence varie en fonction du sexe, les hommes étant plus sujets à développer de l’AS que les femmes chez qui le risque augmente après la ménopause (Young et al., 2002; Senaratna et al., 2017).

L’étiologie de l’AS est multifactorielle. La diminution voire l’absence de la commande ventilatoire durant le sommeil joue un rôle principal dans l’obstruction des voies aériennes ou la perte de l’effort ventilatoire (Ramirez et al., 2013; Orr et al., 2017). Si elle n’est pas traitée, l’AS est responsable d’une somnolence diurne excessive et peut également entraîner des altérations neurocognitives favorisant l’apparition des accidents liés aux troubles de la vigilance tels que des accidents de travail et de la route. Ce trouble ventilatoire peut causer également des altérations cardiovasculaires et métaboliques considérables (Young et al., 2002; Dempsey et al., 2004; Baguet et al., 2012; Almendros et al., 2014).

La ventilation en pression positive continue (VPPC) est un mode de ventilation assistée couramment utilisé pour traiter l’AS. De nombreuses études suggèrent que l'utilisation de la VPPC pendant plus de 6 heures par nuit est très favorable. Cependant, lorsque consultés, 46 à 83 % des patients souffrant d’AOS ne sont pas ou peu adhérents au traitement, et utilisent la VPPC moins de 4 h par nuit, ce qui réduit considérablement son efficacité (Weaver & Grunstein, 2008; Libman et al., 2017).

Par ailleurs, les nouveau-nés prématurés sont également susceptibles de développer des instabilités respiratoires telles que les apnées. Cette condition est communément appelée « apnée du prématuré ». Le traitement le plus utilisé pour traiter l’apnée du prématuré est la caféine. Malgré l’efficacité de ce traitement, un pourcentage non négligeable d'apnées persiste, en particulier chez les enfants nés avant la 28e semaine d’aménorrhée (Zhao et al., 2011; Martin & Wilson, 2012; Spitzer, 2012).

Ainsi, à la fois chez l’adulte et le nouveau-né, la recherche de nouvelles thérapies pour le traitement des apnées reste une préoccupation majeure. Les hormones stéroïdiennes sexuelles, dont la progestérone, ont un impact sur la fonction respiratoire.

La progestérone est un puissant stimulant de la ventilation, agissant à la fois au niveau du système de contrôle ventilatoire central et périphérique (Behan & Wenninger, 2008). De plus, des études cliniques ont prouvé que la progestérone améliore la ventilation chez des patients ayant des troubles ventilatoires liés au sommeil y compris l’AS. Cette hormone peut donc être considérée comme un outil potentiel pour le traitement de l’AS chez l’adulte. En outre, il a été suggéré que la progestérone puisse être une alternative thérapeutique pour le traitement de l’apnée chez les nouveau-nés (Finer et al., 2006). En revanche, les mécanismes d’action expliquant les effets respiratoires de la progestérone sont peu connus. Il semble alors important de chercher à comprendre les mécanismes d’actions responsables des effets respiratoires de la progestérone à la fois chez l’adulte et le nouveau-né. La progestérone exerce ses effets via plusieurs types de récepteurs, essentiellement les récepteurs nucléaires de la progestérone (nPR) et les récepteurs membranaires de la progestérone (mPR). Ces récepteurs sont exprimés au niveau du système de contrôle ventilatoire (Behan & Thomas, 2005; Behan & Wenninger, 2008; Boukari et al., 2015).

Donc, le but principal de ce projet de thèse est de comprendre la contribution relative de ces deux types de récepteurs dans les effets respiratoires de la progestérone. Pour ce faire, nous utiliserons comme modèle des souris adultes et des rats nouveau-nés mâles et femelles.

La fonction respiratoire chez les mammifères

L’air qui nous entoure contient environ de 20.9% d’oxygène (O2), 78% d’azote (N2) et

1% d’un mélange d’autres gaz comme le dioxyde du carbone (CO2), l’argon, l’hélium et l’eau

(H2O). À l’instar des autres organismes aérobies, l’O2 est essentiel à la survie des mammifères. Le rôle primaire de l’O2 est de transformer les nutriments issus de la digestion (sucres, lipides et acides aminés) en un substrat énergétique directement utilisable par la cellule sous la forme de molécule d’adénosine triphosphate (ATP). En présence d’O2, une molécule de glucose peut donner trente-six molécules d’ATP, mais sans l’O2, elle ne produira que deux molécules d’ATP. Ces réactions cataboliques produisent un déchet métabolique qu’est le CO2 (Hlastala & Berger, 2001).

Le transport de l’O2 environnemental vers la cellule et le rejet du CO2 à l’extérieur de l’organisme sont possibles grâce à la fonction respiratoire assurée par l’appareil respiratoire.

(Figure 1). Cette fonction maintient les pressions partielles artérielles en O2 (PaO2) et en CO2

(PaCO2) du sang artériel à des niveaux physiologiques constants assurant le fonctionnement optimum des différents tissus et organes (Hlastala & Berger, 2001; Porcar et al., 2015).

La fonction respiratoire

Chez les mammifères, la fonction respiratoire est un ensemble de processus incluant la ventilation pulmonaire, les échanges gazeux et la respiration cellulaire (Hlastala & Berger, 2001; Porcar et al., 2015).

La ventilation pulmonaire

C’est un processus mécanique qui assure le renouvellement de l’air dans les alvéoles pulmonaires (Figure 1). Elle comporte l’inhalation (inspiration) et l’exhalation (expiration) de l’air. L’inspiration et l’expiration constituent les principales étapes de ce que l’on appelle le cycle respiratoire, dont le nombre par minute correspond à la fréquence respiratoire. La ventilation est un phénomène autonomique et inconscient (Hlastala & Berger, 2001; Porcar

et al., 2015). Elle entraîne des mouvements de l’air dans les voies aériennes que sont engendrés par des mouvements pulmonaires, eux-mêmes dus à la contraction et au relâchement des muscles respiratoires tel que le diaphragme et les muscles intercostaux (Figure 1). Lors de l’inspiration, le diaphragme et les muscles intercostaux externes se contractent ce qui engendre une augmentation du volume de la cavité thoracique et une diminution de la pression intra pleurale. Cette étape correspond à l’inspiration. Lors de l’expiration, le diaphragme se relâche et la capacité volumique des poumons diminue (Hlastala & Berger, 2001; Porcar et al., 2015).

Figure 1:L’appareil respiratoire chez les humains. L’air entre par les fosses nasales ou la cavité buccale, puis dans le pharynx, le carrefour des voies respiratoires et digestives. Ensuite, l’air passe le larynx et est ensuite acheminé par la trachée dans les poumons. La trachée se divise en deux branches, qui se ramifient progressivement dans chaque poumon (Hlastala & Berger, 2001).

Échanges gazeux et circulation

Lors de l’inspiration, l’air entre dans les poumons, il est chauffé, humidifié et acheminé par les voies aériennes qui mènent du nez ou de la bouche à la trachée jusqu’aux alvéoles (Cohen,

1979) (Figure 1). Dans les alvéoles, l’O2 diffuse vers les capillaires entourant les alvéoles.

La pression en O2 alvéolaire (PAO2 = 104 mm Hg) est plus élevée que dans les capillaires veineux (PaO2 = 40 mm Hg). L’O2 diffuse passivement dans le sens de son gradient de pression, sortant des alvéoles et pénétrant dans le sang des capillaires où l'O2 se lie à l'hémoglobine des globules rouges (hématies) (Porcar et al., 2015).

Le rôle des hématies est d’acheminer l’O2 aux capillaires sanguins qui entourent les tissus.

En même temps, la pression alvéolaire en CO2 est plus faible (PACO2 = 40 mm Hg) que la

PaCO2 capillaire veineuse (PaCO2 = 45 mm Hg). Le CO2 dissous dans le plasma des hématies diffuse dans le sens de son gradient de pression, sortant des capillaires et pénétrant dans les alvéoles pour être expulsé vers l’atmosphère lors de l’expiration (Porcar et al., 2015) (Figure 2).

Le sang alors oxygéné est ainsi transporté vers les différents organes (tissus et cellules) par les artères grâce à la circulation sanguine. Dans les capillaires artériels, la pression partielle de l’O2 est de 100 mm Hg, tandis qu’au niveau tissulaire elle est de 40 mm Hg. Ce gradient de pression entraîne la diffusion de l’O2 hors des capillaires vers les cellules. En même temps, la pression des capillaires en CO2 est de 40 mm Hg et au niveau tissulaire de 45 mm Hg. Ce gradient de pression entraîne la diffusion du CO2 des cellules vers les capillaires. Le sang revenant aux poumons par les artères pulmonaires à une PaO2 veineuse de 40 mm Hg et une

PaCO2 de 45 mm Hg. Le sang entre ensuite dans les capillaires pulmonaires où le processus d'échange gazeux entre les capillaires et les alvéoles recommence (Porcar et al., 2015) (Figure 2).

La respiration cellulaire

Une fois entré dans les cellules, l’O2 est utilisé pour effectuer la respiration cellulaire, qui se produit dans des organites spécialisés appelés les mitochondries, site de la phosphorylation oxydative (Mik et al., 2008).

La fonction respiratoire chez les mammifères est soumise à un contrôle très précis par le système de contrôle ventilatoire. Nous allons décrire les principaux éléments de ce contrôle avant de décrire comment les altérations de ce système sont impliquées dans la physiopathologie de l’AS.

Figure 2: Schéma représentatif des échanges gazeux respiratoires. Les échanges gazeux se produisent à deux niveaux : au niveau des alvéoles pulmonaires (respiration externe), et au niveau des tissus avec le sang (respiration interne) (Porcar et al., 2015).

La physiologie du chémoréflexe ventilatoire chez les mammifères

Le chémoréflexe est un ensemble de mécanismes importants dans le maintien de l’homéostasie à la fois des fonctions cardiovasculaires et respiratoires (Calvelo et al., 1970; Heistad et al., 1975; Narkiewicz et al., 1999).

La fonction ventilatoire est régulée par un système de rétrocontrôle qui permet de maintenir avec précision les PaO2 et PaCO2 et l'équilibre acido-basique dans les limites normales dans tous les états physiologiques tels que le repos, le sommeil et l’exercice (Skatrud & Dempsey, 1983; Nattie, 1999). Cette régulation est connue sous le terme de ‘chémoréflexe ventilatoire’, qui peut être représenté à l’aide d’un modèle graphique (Duffin, 1990) (Figure 3).

Le chémoréflexe ventilatoire a deux composantes : une composante centrale et une composante périphérique. Le chémoréflexe central correspond à la stimulation chimique de la ventilation par une élévation de la PaCO2 (une hypercapnie), alors que le chémoréflexe périphérique est stimulé essentiellement par une diminution de la PaO2 (une hypoxie) (Figure 3). L’ajustement de la ventilation à la demande métabolique implique l'intégration complexe de rétroactions afférentes aux centres de contrôle respiratoire dans le tronc cérébral (Taylor et al., 2010) (Figure 3).

Le chémoréflexe périphérique

Le chémoréflexe périphérique est la stimulation de la ventilation provoquée par l'activation des chémorécepteurs périphériques des corps carotidiens et aortiques en réponse à une hypoxie. Cependant, les chémorécepteurs périphériques sont également sensibles à l’hypercapnie (Kumar & Bin-Jaliah, 2007; Kumar & Prabhakar, 2012).

Figure 3: La régulation du chémoréflexe respiratoire par les stimuli chimiques ; CO2 ou O2. Cette stimulation se produit au niveau de deux sites : (1) une stimulation du chémoréflexe central par l’augmentation de la PaCO2 (pression partielle artérielle en CO2) au niveau des chémorécepteurs centraux (2) stimulation du chémoréflexe périphérique par la diminution de la PaO2 (pression partielle artérielle en O2) au niveau des chémorécepteurs périphériques. La stimulation du chémoréflexe augmente la ventilation pour rétablir la PaCO2 et la PaO2. La diminution de la PaCO2 peut exercer une rétroaction négative de ce chémoréflexe et ainsi réduire la ventilation. Une stimulation est indiquée par un (+) et des flèches bleues et une inhibition par un (-) et des flèches rouges une augmentation et ¯ une diminution. Adaptée de (Porcar et al., 2015).

La réponse ventilatoire à l’hypoxie

Une hypoxie se définit comme une réduction de la PaO2. Les mammifères possèdent des mécanismes pour compenser la diminution de la disponibilité de l’O2. L’hypoxie est un stimulus puissant qui provoque une hyperventilation caractérisée par une augmentation du rythme et de l’amplitude de la ventilation pour améliorer l’absorption de l’O2. Cela correspond à la réponse ventilatoire à l’hypoxie (RVH) chez les mammifères (Teppema & Dahan, 2010). L’hypoxie peut être provoquée par plusieurs situations telles que la diminution de la pression barométrique, l’apnée, une altération des échanges gazeux pulmonaire, l’anémie, une intoxication au monoxyde de carbone. La durée de l’hypoxie, de quelques minutes à quelques jours, détermine les mécanismes impliqués pour compenser le manque d’O2 (Teppema & Dahan, 2010).

La RVH est initiée par une augmentation immédiate de la ventilation (AR pour acute réponse) (Figure 4B). Cette réponse aiguë est importante pour limiter la chute de la PaO2. Elle implique essentiellement l'activation des chémorécepteurs périphériques carotidiens. L’activation de ces derniers par l’hypoxie entraîne l’activation rapide du nerf phrénique, le nerf moteur du muscle du diaphragme responsable de l’inspiration (Figure 4A). L’augmentation se poursuit quelques minutes après le début de l’hypoxie. Cette phase est appelée potentialisation à court terme (STP pour short-term potentiation). La STP est suivie par une seconde phase caractérisée par un déclin de la ventilation de 25 à 30 % du pic connu sous le terme de dépression à court terme (STD pour short-term depression). Si l’hypoxie est prolongée, la STD est suivie par la formation d’un plateau correspondant à l’atteinte de l’équilibre ventilatoire, 10 à 30 min après le début de l’hypoxie (indiqué par des pointillés dans la figure 4C). Cette étape est appelée la dépression ventilatoire à l’hypoxie (HVD pour hypoxic ventilatory decline) (Weil & Zwillich, 1976; Huang et al., 1984; Easton et al., 1986). Cette phase fait intervenir à la fois les centres respiratoires du tronc cérébral et les chémorécepteurs carotidiens, et est modulée par l’action inhibitrice au niveau du système nerveux central provenant notamment du pont et certaines régions corticales (Powell et al., 1998; Neubauer & Sunderram, 2004; Teppema & Dahan, 2010).

Figure 4: Les différentes phases de la réponse ventilatoire selon le temps d’exposition à l’hypoxie. A : Stimulation de l’activité du nerf phrénique d’un rat anesthésié en réponse à l’hypoxie ou par une stimulation électrique directe du nerf du sinus carotidien (CSN) (Barre d'échelle = 120 sec). Noter l’augmentation rapide de l’activité du nerf phrénique lors de sa stimulation. B : Les étapes de la réponse ventilatoire à l’hypoxie à court terme (AR : acute response, STP : short-term potentiation, STD : short-term depression). C: les phases de la réponse ventilatoire à long terme (HVD = hypoxic ventilatory decline; VAH = ventilatory acclimatization to hypoxia; HD = hypoxic desensitization) (Powell et al., 1998).

Durant la phase de dépression secondaire, la ventilation demeure légèrement plus élevée que le niveau de base chez l’adulte. L’équilibre ventilatoire est maintenu quelques heures avant de laisser place à l’acclimatation ventilatoire à l’hypoxie, qui se prolonge de quelques heures à quelques jours selon les espèces (VAH pour ventilatory acclimatization to hypoxia) puis une désensibilisation à l’hypoxie peut survenir (HD pour hypoxia desensibilization) (Powell et al., 1998) (Figure 4C).

Les chémorécepteurs périphériques

La RVH est initiée par les chémorécepteurs périphériques localisés au niveau des corps carotidiens, les principaux organes responsables de la détection des variations de la PaO2 chez les mammifères. Les corps aortiques jouent seulement un rôle secondaire dans la chémodétection de l’O2 (Gonzalez et al., 1994; Powell et al., 1998) (Figure 3 et Figure 5).

Les corps carotidiens forment une glande à sécrétion interne située bilatéralement au niveau de la bifurcation carotidienne de part et d’autre du cou, empiétant sur l’artère carotidienne interne, et sont généralement situés près de la surface ventrale du ganglion cervical supérieur (Figure 5 A et B). Le corps carotidien est l’un des organes les plus irrigués du corps, il reçoit le sang par l’artère carotidienne externe. Chez l’humain adulte sa taille est d'environ 5 mm x 3 mm x 2 mm. Le corps carotidien est sensible à plusieurs stimuli. En plus de l’hypoxie, il détecte une augmentation de la PaCO2 (hypercapnie) et une diminution du pH artériel (acidose). En réponse, il augmente la fréquence respiratoire, le volume courant, la fréquence cardiaque et la tension artérielle, et induit une vasoconstriction (Frey & Karoll, 1966; Kumar & Bin-Jaliah, 2007). Le parenchyme du corps carotidien est constitué de deux types cellulaires, les cellules de type I et de type II (Gonzalez et al., 1994) : i) les cellules chémoréceptrices dites glomiques (cellules de type I) sont en contact étroit avec un dense réseau de capillaires fenestrés. Cette proximité des capillaires permet la diffusion des gaz et métabolites sanguins jusqu’aux cellules. On note également la présence d’une innervation sensorielle afférente assurée par le nerf du sinus carotidien (Gonzalez et al., 1994).

Figure 5 : Localisation et structure des corps carotidiens. A : Localisation des corps carotidiens au niveau du cou. B : photographie de la bifurcation carotidienne humaine. Le corps carotidien est indiqué par la flèche noire. Barre d'échelle, 1 cm. Homme, âgé de 42 ans. C : un schéma du parenchyme du corps carotidien. Les cellules glomiques (type I, en rouge) enveloppées par les cellules sustentaculaires (type II, en bleu) et vaisseaux sanguins (v). Les cellules progénitrices (en vert) D : photographie au microscope électronique montrant l'ultrastructure d’un corps carotidien de souris. Noter l'abondance des mitochondries et des vésicules de sécrétion du noyau dense dans les cellules de type I démontré dans le carré blanc agrandi (Lopez-Barneo et al., 2016).

ii) Les cellules sustentaculaires (cellules de type II), qui entourent les cellules glomiques et jouent un rôle de support dans diverses conditions pour les cellules de type I (Gonzalez et al., 1994) (Figure 5 C et D).

Le seuil d’excitation des cellules glomiques est atteint pour des valeurs de PaO2 de 75 mm Hg (Gonzalez et al., 1994). Les cellules glomiques contiennent plusieurs classes de canaux + potassiques (K ) sensibles à l’O2. La probabilité d’ouverture de ces canaux diminue durant l’hypoxie. L’inhibition des canaux K+ provoque une dépolarisation de la membrane plasmique et crée un potentiel d’action. Il en résulte une ouverture des canaux calciques (Ca2+) voltage-dépendants, un afflux de Ca2+ intracellulaire et une libération des neurotransmetteurs. L’hypoxie entraîne la libération de catécholamines, d’acétylcholine et d’ATP qui sont les principaux neurotransmetteurs responsables de la chémosensibilité (Lopez-Barneo et al., 2001; Teppema & Dahan, 2010). La dopamine est aussi un neurotransmetteur puissant, mais principalement inhibiteur de la chémosensibilité à l’hypoxie (Gonzalez et al., 1994). Ces neurotransmetteurs agissent au niveau des terminaisons nerveuses afférentes du nerf du sinus carotidien et induisent une augmentation du flux nerveux vers les centres respiratoires (Lopez-Barneo et al., 2016) (Figure 6).

Le chémoréflexe central

Le chémoréflexe central correspond à la stimulation ventilatoire provoquée par l’augmentation de la PaCO2 c.-à-d. l’hypercapnie (Nattie, 1999; Guyenet et al., 2010; Nattie & Li, 2012; Guyenet & Bayliss, 2015) (Figure 3).

Themes

ACUTE OXYGEN SENSING C631 progenitors, which form clonal colonies (neurospheres) that ing the patch-clamp technique it was shown that glomus cells, give rise to THϩ glomus cells (Fig. 1E). The CB is highly which were thought to be nonexcitable, contain voltage-depen- innervated by afferent nerve fibers that, together with glomus dent Naϩ, Ca2ϩ, and Kϩ currents and can therefore generate cells, form chemical synapses. It also contains numerous au- action potentials (37, 85). It was found that Kϩ channel open tonomic efferent fibers that terminate in the parenchyma and probability in glomus cells is inhibited within a few seconds of near blood vessels. CB glomeruli are “organoid”-like struc- exposure to low O2 tension (30, 48, 85, 124, 154), thereby tures with a sophisticated organization; they support a myriad providing the basis for a mechanism of CB chemotransduction of complex functional interactions among their different cel- (Fig. 2A). These observations, complemented by experiments lular elements, the nature of which is only beginning to be in which membrane potential, cytosolic Ca2ϩ concentration understood (108, 133, 134, 161). ([Ca2ϩ]), and catecholamine secretion were monitored and controlled in single cells (16, 84, 103, 163) (Fig. 2, B and C), Physiology of Carotid Body Glomus Cells. O -Sensitive Ion 2 supported the current “membrane model” in which glomus Channels cells function as O2-sensitive presynaptic elements. In this Although early research on the CB firmly established its role scheme, blockade of Kϩ channels, which are open at the cell’s as a major arterial chemoreceptor (41), the mechanism of CB resting potential, leads to glomus cell depolarization, Ca2ϩ O2 sensing remained obscure for several decades until techno- entry, and transmitter release, which activate the afferent fibers logical advances facilitated physiological measurements in the of the sinus nerve (88) (Fig. 2D). As discussed below, this small glomus cells. Early neurochemical studies in dispersed “membrane model” of chemotransduction is not in opposition glomus cells demonstrated dopamine release in response to with the potential role played by cell metabolism in O2 sensing hypoxia in an extracellular Ca2ϩ-dependent manner (40). Us- and signaling to membrane ion channels during hypoxia. The

ABHypoxic inhibition of K+ channels Increase in cytosolic Ca2+

800 H H H pipette 0 Ca2+ 600 ] (nM) ] cell 2+ 400 2 min 50 pA 200 Cytosolic [Ca

-20 mV 0 Vr ~8 mV 050100150 O tension (mmHg) -80 mV 2 -90 mV

CDSecretorySecretorSecretoryy resresponse responseponse to to hhypoxia hypoxiaypoxia Membrane model of acute O2-sensing by arterial chemoreceptors 16 Ca2+ hypoxia Ca2+ channel + 12 K channel 10 pA Vm

l 8 el [Ca2+]

ss + ? K 1 min ve 4 d O 2 ? oo Secretion rate (pC/min) O2 sensor Blood vessel Bl Sensory fiber 0 Glomus cell 0 50 100 150

O2 tension (mmHg)

Fig. 2. Responses to hypoxia in single rodent glomus cells. A: whole cell membrane currents from a glomus cell recorded with the perforated patch technique during the application of a depolarizing ramp. Note the reversible inhibition of the holding and voltage-dependent Kϩ currents during repeated (h1 and h2) exposures to hypoxia (PO2 ϳ10 mmHg). Control (c) and recovery (r) recordings were obtained in normoxic conditions (PO2 ϳ145 mmHg). Reversal of the current was displaced by 8 mV to depolarized membrane potentials during exposure to hypoxia. B and C: cytosolic Ca2ϩ (B) and catecholamine secretion (C) of rodent 2ϩ glomus cells as a function of O2 tension. Inset in B illustrates the rise of cytosolic [Ca ] in response to hypoxia and the abolition of this signal upon removal of external Ca2ϩ. Inset in C is the secretory response to hypoxia of a cell in CB slices as monitored by amperometry. [Data in B from Urena et al. (163); A and

C, modiﬁed from Montoro et al. (103) and Ortega-Saenz et al. (115), with permission from the Rockefeller University Press.] D: membrane model of acute O2 sensing by carotid body glomus cells. See text for further explanation. [Modiﬁed from Lopez-Barneo et al. (82), with permission from Elsevier.] Figure 6: Schéma du modèle de chémodétection de l'O2 par les cellules glomiques du corps carotidien de souris. AJP-Cell Physiol • doi:10.1152/ajpcell.00265.2015 • www.ajpcell.org + Downloaded from www.physiology.org/journal/ajpcell by ${individualUser.givenNames}Une cellule glomique ${individualUser.surname} possède des canaux potassiques (132.203.227.063) (K ) sensibles on February à l’O4, 2018.2. Durant Copyright © 2016 Americanl’hypoxie, Physiological l’inhibition Society. des All canaux rights reserved.K+ provoque une dépolarisation de la membrane plasmique. Il en résulte une ouverture des canaux calciques voltage-dépendants (Ca2+), un afflux de Ca2+intracellulaire et ainsi une libération des neurotransmetteurs. Ces neurotransmetteurs agissent au niveau des terminaisons nerveuses afférentes du nerf du sinus carotidien et induisent une augmentation du flux nerveux (Lopez-Barneo et al., 2016).

La réponse ventilatoire à l’hypercapnie

Au cours de l’eupnée soit la respiration normale en normoxie au repos, la PaCO2 est maintenue à des valeurs se trouvant autour de 40 mm Hg (Duffin et al., 1980). Les petites fluctuations autour du point physiologique de la PaCO2 ne sont pas consciemment perçues et n'ont aucun impact sur l'état de vigilance (Duffin et al., 1980; Marshall, 1994). En revanche, une augmentation importante de la PaCO2 est appelée l’hypercapnie. Une hypercapnie est provoquée par exemple lors d’une apnée, par le blocage des voies respiratoires, une bronchite ou l’exposition accidentelle ou expérimentale au CO2 (Parshall et al., 2012; Kaur et al., 2013). L’hypercapnie est un stimulus très puissant de l’arc chémoréflexe. Ce stimulus induit une augmentation du volume courant et de la fréquence respiratoire et par conséquent une augmentation de leur produit, soit le débit ventilatoire (ventilation minute). Cette hyperventilation correspond à la réponse ventilatoire à l’hypercapnie (RVHC) (Haldane & Priestley, 1905; Fraigne et al., 2008) (Figure 7).

Les chémorécepteurs centraux

La RVCH est initiée par les chémorécepteurs centraux, qui jouent un rôle important dans la + régulation de la ventilation en réponse aux changements de CO2/H au niveau du système nerveux central. Dans le liquide céphalorachidien, le CO2 est rapidement hydraté en acide + carbonique (H2CO3), qui se dissocie en ion bicarbonate (HCO3) et proton (H ). Par conséquent, l’augmentation du CO2 entraîne une réduction du pH (Staub, 1991; Nattie, 1999; Nattie & Li, 2012) (Figure 8 A).

Il est admis que ce sont les H+ qui sont détectés par les chémorécepteurs (Nattie, 1999; Nattie & Li, 2012). Chez la chèvre, il est démontré que la variation de la ventilation est très sensible aux changements du pH du liquide céphalorachidien. En fait, une petite variation du pH du liquide interstitiel cérébral de 7.30 à 7.25 est associée à un doublement de la ventilation alvéolaire (Nattie, 1999; Nattie & Li, 2012) (Figure 8 B).

CO2, Brainstem Chemoreceptors and Breathing 307

Fig. 5. Ventilation increases dramatically when CO2 increases in alveolar space (and arterial blood). The data shown are representative values in man during normoxic conditions (middle line), hypoxic conditions (left line) and during sleep (right line). With a normal or above normal oxygen level, the response to increased CO2 is steep. This response is potentiated if the peripheral chemoreceptors are, at the same time, stimulated by hypoxia and the response is decreased if the animal is asleep. The open circle marks the normal locus of ventilation and PCO2. At PCO2 values below normal, ventilation may Figurebe maintained, 7: La relation at least partially, linéaire if the entre subject la is awake;PACO in2 sleepet la or ventilation anesthesia, ventilation alvéolaire. decreases and may stop with PCO2 values below normal (see Fig. 6 and text). The increased CO2 is sensed at both La ventilationperipheral and central augmente chemoreceptors. avec Theirl’augmentation relative roles have been de dicultla PA toCO pinpoint2 ; pression and may vary partielle du CO2 with arousal state [modi®ed from Staub (1991)]. alvéolaire. Les données sont présentées dans des conditions normoxiques (ligne médiane, isP neededaO2>100 to maintain mm Hg) the et normal des conditions interactions hypoxiquessleep (Smith (ligne et al., 1995). à gauche These, data PaO indicate2=50 mmthat Hg). En amongnormoxie the dierent, la types réponse of the ventilatoire respiratory neurons à l'augmentationhypocapnia can duresult CO in apnea, est but forte. only Cettein sleep réponseor est and, as mentioned above, to provide a `drive' to the during anesthesia, and that2 central chemoreceptors system.potentialisée Experiments, si that les limit chém theorécepteurs hypocapnia to périphériquesare crucially important sont in en this même response. temps stimulés par central chemoreceptors in an anesthetized animal l'hypoxie (hypercapnie-hypoxie). Le cercle ouvert marque la PACO2 normale (Staub, 1991; suggest that the threshold for hypocapnic apnea involves input from bothPaO the2 : pression central and par thetielle periph- de l’O2 artérielle. Nattie, 1999). 3.5. Metabolic Acid±base Disorders eral chemoreceptors (Berkenbosch et al., 1984). In the unanesthetized mammal, the situation is If changes in pH result from metabolic acid±base more complicated (Fig. 6). Hypocapnia induced by disorders, chemoreceptors can bring about appropri- voluntary or by passive hyperventilation using a ate ventilatory homeostatic responses (Fig. 7). For mechanical ventilator has produced con¯icting example, a metabolic acidosis stimulates ventilation results. Most studies do not show prolonged apnea, via peripheral and central chemoreceptors resulting as demonstrated in the anesthetized animal. Some in hyperventilation and lowering of arterial PCO2,a studies have shown reduced ventilation during the response that elevates (corrects) the arterial pH. hypocapnic period. Analysis of the breathing period With metabolic alkalosis, ventilation is inhibited on a cycle-by-cycle basis showed an increase in and PCO2 rises alleviating the alkalosis [see variability including prolonged periods of expiration Dempsey and Forster (1982)]. Chemoreceptor sites that could be called `apnea'. The absence of a repro- within the brainstem are, in general, protected to ducible and sustained apnea with hypocapnia in some degree from rapid changes in blood pH that wakefulness led to the description of a `wakefulness arise independently from changes in CO2. The drive' for breathing (Fink, 1961; Orem, 1990); some blood±brain barrier and associated ion transport other input to the respiratory control neurons main- processes provide this protection (Nattie, 1998b). tains ventilatory output even in the absence of The ventilatory response due to stimulation of cen- stimulation from peripheral and central chemorecep- tral chemoreceptor sites that detect changes in blood tors. However, in sleep, even mild systemic hypocap- pH must be slightly delayed or these sites must be nia, aecting both central and peripheral located near areas with less eective blood±brain chemoreceptors, can result in apnea (Fig. 6) (Datta barrier function. Sites that serve to detect blood pH et al., 1991). And hypocapnia limited to the periph- changes could have quite dierent anatomical lo- eral chemoreceptors decreases ventilation without cations17 than those that serve primarily to detect apnea in wakefulness (Daristotle et al., 1990) and in CO2.

A B

Figure 8: La chémoréception centrale.

+ La chémoréception centrale désigne la détection des changements de CO2/H dans le cerveau. + (A) un schéma de la chémodétection centrale. au CO2/H (Sofroniou, 2012). (B) Relation entre la ventilation alvéolaire (VA) et le pH du liquide céphalorachidien (CSF pour cerebrospinal fluid) chez une chèvre éveillée soumise à des variations chroniques acido-basiques et à une inhalation aiguë de CO2. Notez qu'une petite diminution du pH du CSF de 7.30 à 7.25 double la ventilation alvéolaire (Fencl et al., 1966; Nattie, 1999).

Les chémorécepteurs centraux sont des cellules spécialisées localisées dans une multitude de régions au niveau du cerveau (Figure 9). Ceux qui sont localisés au niveau du tronc cérébral + sont principalement sensibles aux variations de PaCO2/H du liquide qui les entoure (O'Regan & Majcherczyk, 1982; Guyenet et al., 2010). Les chémorécepteurs centraux regroupent le noyau rétrotrapézoïde (RTN), le raphé médullaire rostral et caudal (RM), le locus coeruleus et le noyau du tractus solitaire (NTS). Le RTN est le site de la chémoréception centrale le mieux étudié (Nattie, 1999; Feldman et al., 2003; Guyenet et al., 2010; Nattie & Li, 2012). L’activation du RTN entraîne la libération de glutamate, qui va aller stimuler les centres respiratoires au niveau du tronc cérébral responsable de la génération du rythme et de la formation du patron respiratoire (Rosin et al., 2006; Mulkey et al., 2007).

Les chémorécepteurs centraux sont aussi sensibles à la diminution de la PaCO2. En effet, la diminution de la PaCO2 dans le liquide céphalorachidien diminue le niveau d’activation des chémorécepteurs centraux et ainsi le débit ventilatoire est réduit. La réduction de la ventilation pouvant aller jusqu’à s’arrêter complètement (Nattie & Li, 2012). Cette action inhibitrice du chémoréflexe ventilatoire est illustrée dans la figure 3. Ce mécanisme est impliqué dans la genèse de l’apnée et est repris dans la section 3.2.2.

De plus, les expériences de chémodénervation des corps carotidiens chez des chiens perfusés ont démontré que la contribution des chémorécepteurs centraux correspond aux 2/3 de la réponse ventilatoire à l'hypercapnie, mettant en évidence que les corps carotidiens sont également impliqués dans la RVHC (Smith et al., 2006). L’interaction entre les chémorécepteurs périphériques des corps carotidiens et les chémorécepteurs centraux est déterminante dans la vitesse et la sensibilité de la RVHC. En fait, la RVHC est plus forte en condition hypoxique en comparaison de la RVHC en condition de normoxie (Staub, 1991; Nattie, 1999) (Figure 7).

Figure 9: Localisation des chémorécepteurs au niveau central. Noter l’existence de plusieurs populations neuronales chémoréceptrices, qui sont indiquées en rouge. Abréviations : LHA, hypothalamus latéral; DR, raphé dorsal; FN, noyau fastigial; 4V, quatrième ventricule; LC, locus coeruleus; 7N, nerf facial; cNTS, noyau du tractus solitaire caudal; AMB, noyau ambigu; VII, noyau facial; SO, olive supérieure; PBC, complexe pré-Bötzinger; rVRG, groupe respiratoire ventrale rostral; cVLM, médullaire ventrolatérale caudale; RTN / pFRG, noyau rétrotrapézoïde / groupe respiratoire parafacial; et Pn, pont (Nattie & Li, 2012).

Les mécanorécepteurs

D’autres modulateurs affectent également la ventilation tels que les mécanorécepteurs pulmonaires (Kubin et al., 2006), les récepteurs des voies aériennes, les propriocepteurs, les barorécepteurs artériels, les récepteurs de la douleur et de la température peuvent tous influencer le patron respiratoire (Plataki et al., 2013).

Les mécanorécepteurs sont des récepteurs localisés dans les parois des bronches et des bronchioles pulmonaires. Ils sont sensibles à l’étirement et ils fournissent de l’information sur le volume et le taux d’inflation pulmonaire. Breuer et Hering (1868) ont introduit le concept de l’autorégulation de la respiration par le nerf vague. L'inflation des poumons inhibe de façon réflexe l'inspiration tandis que la déflation stimule l’inspiration (Widdicombe, 1982; Perez-Padilla et al., 1983).

Intégration centrale et genèse de la commande ventilatoire motrice

Intégration des afférences sensorielles respiratoires

Le noyau du tractus solitaire (NTS) est le site principal d’intégration de multiples afférences viscérales, incluant les afférences impliquées dans les réflexes cardiorespiratoires. Dans sa partie caudale, il reçoit les afférences sensorielles liés à la respiration (Finley & Katz, 1992; Andresen & Kunze, 1994; Kline et al., 2010).

Dans le tronc cérébral des mammifères, le NTS est une structure bilatérale multifonctionnelle située dans la médulla oblongata dorsomédiale et dorsolatérale (Dampney, 1994; Alheid & McCrimmon, 2008; Alheid et al., 2011) (Figure 10). Le NTS s’allonge de la portion caudale du noyau facial jusqu’à la portion caudale de la décussation des voies pyramidales (Dampney, 1994; Alheid & McCrimmon, 2008; Alheid et al., 2011). Il est formé par une série de sous-noyaux très hétérogènes, qui représentent le point d’entrée des afférences sensorielles viscérales des voies gastro-intestinales, gustatives, cardiovasculaires et respiratoires (Altschuler et al., 1989; Andresen & Yang, 1990; Altschuler et al., 1991; Jean,

1991; Barraco et al., 1992). En se basant sur la nature des afférences entrantes, le NTS peut être subdivisé en trois parties : Le NTS rostral (NTSr), le NTS intermédiaire (NTSi) et le NTS caudal (NTSc). Plusieurs études précédentes ont démontré que le NTSi et NTSc reçoivent plusieurs afférences cardiorespiratoires venant des chémorécepteurs et des barorécepteurs carotidiens, des mécanorécepteurs pulmonaires et des récepteurs cardiaques (Kumada et al., 1990; Finley & Katz, 1992; van Giersbergen et al., 1992), alors que le NTSr reçoit des afférences gustatives et somatiques projetées de la région oropharyngée (Jean, 1991; Li et al., 2002).

Figure 10: L’organisation fonctionnelle des principaux noyaux respiratoires du tronc cérébral des mammifères. Vue dorsale du tronc cérébral illustrant les compartiments fonctionnels dans la colonne ventilatoire. KF, noyau de Kölliker-Fuse; PB, noyau parabrachial; RTN, noyau rétrotrapézoïde; PGi, noyau réticulaire paragigantocellulaire; BötC, complexe de Bötzinger; preBötC, complexe pré- Bötzinger; rVRG, groupe respiratoire ventral rostral; cVRG, groupe respiratoire ventral (Evans et al., 2016).

Le NTSc joue un rôle prépondérant dans le contrôle neuronal de la ventilation. Il est localisé au niveau du tiers caudal du NTS qui se trouve à proximité de l’aire postréma au niveau de l’obex. C’est une agrégation de neurones essentiellement inspiratoires. Il est désigné sous le terme de groupe respiratoire dorsal (GRD) (Alheid & McCrimmon, 2008; Alheid et al., 2011; Smith et al., 2013). Les noyaux moteurs (NM) des nerfs crâniens vague (NM X) et hypoglosse (NM XII) font partie du DRG (Smith et al., 2013).

Le DRG reçoit des afférences sensorielles respiratoires venants des mécanorécepteurs, des chémorécepteurs carotidiens et aortiques voyageant essentiellement via les nerfs crâniens glossopharyngien (IX) et vague (X). Il reçoit également des afférences chémosensorielles venant des structures de la colonne respiratoire ventrale et du pont (Alheid & McCrimmon, 2008; Alheid et al., 2011; Smith et al., 2013) (Figure 11).

Figure 11: Schéma illustrant l’intégration des afférences respiratoires périphériques au niveau central. Les afférences respiratoires périphériques venant des corps carotidiens voyagent par le nerf du sinus carotidien (CSN pour « carotid sinus nerve ») ; une branche du nerf glossopharyngien (IX). Elles sont intégrées au niveau du NTS caudal, qui est situé près de l'aire postréma (AP), puis elles sont transmises vers les centres respiratoires (Evans et al., 2016).

Genèse du rythme et de la commande ventilatoire motrice

Dans le tronc cérébral, les centres respiratoires sont organisés en trois principales colonnes respiratoires. Le groupe respiratoire dorsal (GRD) et la colonne respiratoire ventrale (CRV) situés dans la médulla oblongata. Le pont contient le groupe respiratoire du pont (GRP) (Feldman et al., 2003; Alheid & McCrimmon, 2008; Smith et al., 2013) (Figure 10).

Les afférences sensorielles respiratoires intégrées au niveau du GRD sont transmises aux neurones inspiratoires de la partie rostrale du groupe respiratoire ventral (GRVr) (Figure 10). Le GRVr transmet ces informations vers les NM du nerf phrénique (NM VII) et les NM du nerf intercostal externe contrôlant l'activité des principaux muscles inspiratoires, le diaphragme et les muscles intercostaux externes. Le diaphragme est innervé par les NM VII qui naissent aux racines cervicales C3, C4 et C5 pour stimuler l'inspiration. Alors que les muscles intercostaux sont innervés par les NM thoraciques (Hlastala & Berger, 2001; Smith et al., 2009) (Figure 12). Les neurones expiratoires de la partie caudale du groupe respiratoire ventral (GRVc) activent les NM thoracolombaires pour stimuler l'activité des muscles respiratoires responsables de l'expiration incluant les muscles intercostaux internes et abdominaux respectivement (Alheid & McCrimmon, 2008; Smith et al., 2009; Smith et al., 2013). Les neurones moteurs abdominaux innervent les muscles abdominaux. Ils sont situés dans la partie thoracique et lombaire de la moelle épinière, et facilitent l'expiration (Hlastala & Berger, 2001) (Figure 12).

Au niveau du tronc cérébral, des études ont démontré l’existence d’un générateur de patron respiratoire, dont le noyau principal est le complexe de pre-Bötzinger (preBötC) et le complexe de Bötzinger. Le preBötC est localisé au niveau ventral de la CRV. Il fournit le rythme inspiratoire, alors que, le complexe de Bötzinger (BötC) fournit le rythme expiratoire. Le groupe respiratoire du pont (GRP) est composé du noyau du noyau parabrachial/Kölliker- Fuse (PBr/KF) (Alheid & McCrimmon, 2008; Smith et al., 2009; Smith et al., 2013).

Figure 12: Représentation des commandes motrices bulbo-spinales. Ce sont des projections allant du groupe respiratoire ventral jusqu’au niveau des noyaux moteurs de la moelle épinière cervicale (localisation du nerf phrénique), thoracique (localisation des nerfs intercostaux) et lombaire (localisation du nerf abdominal) (Hlastala & Berger, 2001).

Le GRP assure l'alternance entre les phases du cycle respiratoire et coordonne la respiration (Alheid & McCrimmon, 2008; Smith et al., 2009; Smith et al., 2013) (Figure 10).

Par ailleurs, une modulation de la ventilation non liée aux modifications du métabolisme est rendue possible dans différentes situations telles que les réactions émotionnelles ou la parole par la mise en jeu de structures cérébrales suprapontiques incluant le cortex moteur et une modulation de la respiration liée aux émotions par le système limbique ainsi que le système d’activation réticulaire dans le tronc cérébral (Richter & Smith, 2014).

Le sommeil est un des principaux challenges pour la stabilité du système de contrôle respiratoire et de la régulation homéostatique du transport de l’O2 et du CO2 chez l’adulte (Dempsey et al., 2004). Également, la majorité des nouveau-nés et notamment les prématurés présentent des troubles de la ventilation. Ces troubles sont expliqués au moins en partie par l’immaturité du contrôle ventilatoire (Mahoney & Jain, 2013). Ainsi, à la fois chez l’adulte et le nouveau-né, les troubles ventilatoires peuvent se manifester par des apnées pouvant causer une respiration inadéquate et donc une mauvaise oxygénation de l’organisme (Nakamura et al., 2003).

La physiopathologie de l’apnée du sommeil chez l’adulte

Définition de l’apnée du sommeil (AS)

L’apnée du sommeil (AS) est un désordre ventilatoire observé durant le sommeil. L’AS se caractérise par des épisodes répétitifs et fréquents d’arrêt complet (apnée) ou de diminution du flux d’air (hypopnée) au niveau des voies aériennes supérieures (VAS) (Figure 13 A). Ces épisodes se terminent en général par un bref réveil avec réouverture des VAS nécessaire pour la reprise de la ventilation et le retour au sommeil (Saaresranta & Polo, 2003; Eckert et al., 2009). Ce cycle peut être répété des dizaines de fois au cours d'une heure de sommeil (Dempsey et al., 2010) (Figure 13 B).

A 1

SLEEP ONSET \I

UPPER AIRWAY OBSTRUCTION j --....---

ASPHYXIA -i AROUSAL ’

FIG. 9. The fundamental2 problem in obstructive sleep apnea IS collapse3 of the upper airway during sleep

B SLEEP ONSET

h:g::r: Hypocapnia \ Hypoxia I Hypercapnia Hyperventilation I

Upper airway Increased effort patency restored to breathe

AROUSAL from sleep

FIG. 10. The cycle of events surrounding an obstructive apnea in OSA.

DM, April 1994 319 Figure 13: L’apnée du sommeil. A1 : Flux d’air (flèches) normal au niveau des voies aériennes supérieures (VAS); A2 : Obstruction partielle des VAS induisant une réduction du flux d’air (une hypopnée); obstruction complète des VAS entraînant un arrêt du flux (une apnée) (Somers et al., 2008). B: Le cycle des évènements lors de l’apnée obstructive du sommeil (Wiegand & Zwillich, 1994).

L’hypopnée est considérée comme significative si le flux d’air est réduit d’au moins 50 % et accompagné par une désaturation de l’hémoglobine en O2 de 3 % ou un éveil (Spector et al., 2016).

En clinique, l’indice d’apnée et d’hypopnée (IAH) est utilisé pour identifier et évaluer le degré de sévérité de l’AS. L’IAH correspond au nombre total d’apnée et d’hypopnée par heure de sommeil (Spector et al., 2016). L’AS est considérée comme (i) significative si l’IAH est supérieur ou égal à 5 évènements par heure de sommeil ou inférieur à 5 et accompagné par une somnolence diurne, (ii) légère si l’IAH est de 5-15 / heure, (ii) modérée si l’IAH est de 15-30 / heure et (iii) sévère si l’IAH est supérieur à 30 / heure (Young et al., 1993; Ruehland et al., 2009; Spector et al., 2016).

Les types de l’AS

Nous distinguons trois formes d’AS chez l’adulte : l’apnée obstructive, l’apnée centrale et l’apnée mixte (Wiegand & Zwillich, 1994; Eckert et al., 2009).

L'apnée obstructive du sommeil (AOS)

L’AOS se caractérise par des pauses ventilatoires récurrentes causées par des rétrécissements ou un effacement complet des VAS pendant le sommeil. En conséquence, la ventilation est fortement réduite (hypopnée) ou absente (apnée), malgré un effort ventilatoire persistant (Fogel et al., 2004; Eckert et al., 2009; Dempsey et al., 2010) (Figure 14).

L'apnée centrale du sommeil (ACS)

Cette forme d’apnée est définie comme un arrêt du flux d’air avec absence d’effort ventilatoire, causé par un manque de la commande respiratoire pendant le sommeil (Eckert et al., 2007; Eckert et al., 2009; Dempsey et al., 2010) (Figure 15).

Figure 14: Enregistrement par polysomnographie montrant une série d'apnées obstructives au cours du sommeil nREM. Les enregistrements sont issus d'un patient obèse atteint d’AOS (homme de 48 ans, indice de masse corporelle = 41,5 kg / m2, indice d'apnée-hypopnée = 123 apnées. h-1). Chaque AOS est représentée par une absence du flux d’air (airflow), accompagnée par de la désaturation artérielle en O2 (SpO2) et de l'activation corticale (éveil visible sur le EEG) suivie par un rétablissement du flux d'air. On note la persistance de l’effort respiratoire thoracique (Chest wall). C’est le motif caractéristique de l’AOS. Airflow = enregistrement de la pression nasale du flux d’air ; Chest wall = mouvement de la paroi thoracique ; ECG = électrocardiogramme ; EEG = électro-encéphalogramme; EMG = électromyogramme des muscles du cou sous le menton ; EOG = électro-oculogramme; SpO2 = saturation artérielle percutanée en oxygène (O2) (Isono, 2009).

Figure 15: Enregistrement par polysomnographie montrant une série d'apnées centrales au cours du sommeil chez un patient atteint de défaillance cardiaque congestive. Chaque apnée est représentée par un épisode d’absence du flux d’air (airflow), accompagné d'une cessation des efforts thoracoabdominaux (Chest, abdomen). L’apnée est accompagnée d’une désaturation artérielle en O2 (périodes surlignées en gris dans le tracé SaO2). Ces évènements sont précédés par un éveil cortical (périodes surlignées en gris dans le tracé EEG) et par un rétablissement du flux d'air. C’est un motif d’enregistrement caractéristique de l’ACS. EEG = électro-encéphalogramme; EMG = électromyogramme des muscles thoraciques et abdominaux; SaO2= saturation artérielle percutanée en oxygène (Eckert et al., 2009).

L’apnée mixte

Elle associe les deux formes précédentes d’apnées. Cette forme d'apnée débute par un mécanisme central auquel succède un mécanisme obstructif. En effet, la plupart des patients souffrants de troubles ventilatoires liés au sommeil présentent les deux types d’apnées. Ceci est connu sous le terme d’apnées mixtes (Eckert et al., 2009). Comme il sera expliqué dans les mécanismes physiopathologiques de l’AS, l’AOS résulte au moins en partie, d’un problème neuronal, plus précisément d’un contrôle respiratoire instable durant le sommeil (Hudgel & Thanakitcharu, 1998; Younes et al., 2001; Asyali et al., 2002; Wellman et al., 2004). De même, l’absence de commande ventilatoire chez les patients atteints d’ACS peut conduire à une obstruction des VAS (Badr et al., 1995). Effectivement, il est généralement difficile de trancher entre AOS et ACS.

Épidémiologie et le dimorphisme sexuel de l’AS

Plusieurs études ont indiqué des pourcentages très variables de la prévalence de l’AS, mais les plus récentes montrent que l’AS présente une prévalence élevée dans la population générale et que le sexe masculin et l’âge sont des facteurs de risque.

Récemment, Heinzer et al. ont évalué la prévalence de l’AS (Heinzer et al., 2015). Pour se faire, des enregistrements de polysomnographie durant le sommeil sont réalisés dans un grand échantillon de la population dans l'environnement familial des participants. Cette étude a inclus 2124 participants dont 48 % sont des hommes. Dans cette population, la moyenne d’âge est de 57 ans (40 à 85 ans) (Heinzer et al., 2015). Dans cette étude, la prévalence de l’AS est subdivisée selon le degré de sévérité de l’AS chez les hommes et les femmes. Les résultats ont indiqué que dans le cas de l’AS légère à sévère, 83.8 % chez les hommes et 60.8 % des femmes sont atteints d’AS. Alors que dans le groupe d’AS modérée à sévère, la prévalence est de 49,7% des hommes et 23,4% chez les femmes (Heinzer et al., 2015).

À l’instar des études précédentes (Young et al., 1993; Redline et al., 1994; Bixler et al., 2001; Tishler et al., 2003; Reddy et al., 2009), cette étude confirme que l’AS présente une

prévalence élevée dans la population générale et qu’elle est plus commune chez les hommes que les femmes. Ce qui suggère un rôle protecteur des hormones sexuelles. Un point qui est détaillé dans la section 4.2. De plus, le risque de l’AS augmente avec l’obésité, la consommation d’alcool et le tabagisme sont également décrit comme facteurs de risque (Franklin & Lindberg, 2015; Heinzer et al., 2015; Senaratna et al., 2017).

Conséquences pathologiques de l’AS

Il est largement reconnu que si l’hypoxie récurrente résultante est suffisamment sévère (exemple : supérieure à 20-30 évènements d’apnées par heure associée à une saturation artérielle en O2 inférieure à 90 %), cela entraîne un sommeil fragmenté, une somnolence diurne excessive et des altérations neurocognitives. En conséquence, on observe une augmentation du risque des accidents de travail et de la route lié à des troubles de la vigilance. De plus, l’AS est associée à une augmentation de l’hypertension artérielle, une augmentation des risques de problèmes cardiovasculaires et une forte probabilité de mortalité (Dempsey et al., 1986; Peppard et al., 2000; Young et al., 2002; Leung et al., 2004; Phillips, 2005; Ruehland et al., 2009; Baguet et al., 2012; Almendros et al., 2014).

Chez les humains, l’exploration des effets néfastes de l’hypoxie intermittente associée à l’AS est déterminée par une corrélation entre les conséquences pathologiques observées et un index de sévérité de l’hypoxémie intermittente nocturne (Heinzer et al., 2015).

En recherche, l’étude chez l’humain est difficile pour des raisons évidentes d’éthique et d’accessibilité aux patients. Pour cela, des modèles d’animaux, essentiellement chez les rongeurs, sont développés afin de mimer la symptomatologie de l’AS. Pour se faire, les animaux sont exposés à une hypoxie intermittente (HI) mimant l’hypoxie récurrente engendrée chez les patients souffrant d’AS afin de mieux comprendre les conséquences physiopathologiques chez les humains. Pour se faire, l’animal est placé dans une chambre d’exposition où il reçoit par intermittence soit un mélange hypoxique enrichi en azote soit de l’air. Un groupe témoin est exposé aux mêmes conditions cependant en remplaçant

l’alternance air/azote par une alternance air/air (Almendros et al., 2014; Jorba et al., 2017). Cette approche expérimentale est intéressante, car elle permet d’étudier l’AS en s’affranchissant des facteurs confondants présents dans les études cliniques comme l'âge, l'indice de masse corporelle (IMC), le sexe, la durée d’évolution de la maladie, etc. Il est mis en évidence un lien entre l’HI et les altérations cardiovasculaires, métaboliques et cognitives associées à l’AS. En fait, les désaturations en O2 artérielle récurrentes induites par l’HI favorisent les variations des niveaux de l’O2 dans l'organisme en entier. L’HI induit une augmentation de l’expression des facteurs induits par l’hypoxie (HIF pour hypoxia-inducible factors). L’activation des HIF contribue à l’augmentation de la production des espèces réactives de l’O2 et réduit l’activité des enzymes anti oxydantes produisant ainsi un stress oxydatif. L’augmentation des espèces réactives de l’O2 stimule le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier augmente la transcription de plusieurs gènes pro-inflammatoires tels que des gènes de cytokines inflammatoires (facteur de nécrose tumorale, interleukine-6 et interleukine-8), chémokines, molécules d'adhésion de surface. De plus, certaines cellules qui sont plus dépendantes de l'O2 tel que les neurones ou les cardiomyocytes peuvent subir une apoptose ou une nécrose. L’ensemble de ces évènements favorise l’inflammation (Almendros et al., 2014), qui est associée à la majorité des conséquences de l'AS tel que l’apparition des troubles cardiovasculaires, des syndromes métaboliques et des altérations cognitives. Elle est également associée à l’augmentation de la sévérité tumorale dans les tissus où le métabolisme et la demande en O2 sont élevés (Almendros et al., 2014; Almendros & Garcia-Rio, 2017).

Les mécanismes physiopathologiques de l’AS

La compréhension des effets du sommeil sur la ventilation est cruciale pour assimiler la physiopathologie de l’AS. Cependant, il faut garder à l’esprit que d’autres facteurs ou anomalies peuvent se rajouter, dont l’ensemble favorise le développement de l’AS. En effet, il est mis en évidence que l’AS n’est pas une pathologie unifactorielle, mais plutôt une interaction complexe et dynamique entre plusieurs facteurs centraux et périphériques (Dempsey & Smith, 2014). Ces facteurs sont résumés dans la figure 16. En fait, la pathogenèse de l’AS est basée sur des facteurs anatomiques prédisposant à l’obstruction des

voies aériennes supérieurs (VAS). Dans le cas où cette prédisposition est combinée à un contrôle ventilatoire instable durant le sommeil, la résultante de cette interaction conduit au développement de l’AS (Dempsey & Smith, 2014). Certains mécanismes physiopathologiques contribuant au développement de l’AOS et l’ACS sont communs (Eckert et al., 2009; Ramirez et al., 2013).

Obstruction des voies aériennes supérieures (VAS)

À l’instar des muscles squelettiques de tout le corps, des modifications fondamentales du tonus des muscles dilatateurs pharyngés des VAS apparaissent au cours du sommeil (Fogel et al., 2004; Horner, 2008).

Il a été mis en évidence que lors du sommeil, il y a une diminution de l’activité des muscles dilatateurs pharyngés. Cette diminution compromet la perméabilité des VAS, favorisant leur obstruction, et ainsi l’apparition de l’apnée (Fogel et al., 2004; Horner, 2008). La compréhension de cet évènement représente un mécanisme clé dans les recherches cliniques et fondamentales visant à comprendre la physiopathologie de l’AS (Remmers et al., 1978; Martin et al., 1980).

Figure 16: Les mécanismes physiopathologiques de l’apnée du sommeil. La physiopathologie de l’apnée du sommeil est essentiellement basée sur une interaction entre des anomalies anatomiques et l’effet du sommeil sur la fonction respiratoire. UAW, voies aériennes supérieures ; FRC, capacité résiduelle fonctionnelle. Adaptée de (Dempsey & Smith, 2014).

Anatomie et rôles des voies aériennes supérieures

Les VAS s’étendent de l’entrée de la cavité des narines et de la cavité buccale jusqu’à la glotte au niveau de l'entrée du larynx. Les VAS sont subdivisées en quatre régions anatomiques incluant le nasopharynx, le velopharynx, l’oropharynx et l’hypopharynx (Donner et al., 1985; Fogel et al., 2004) (Figure 17).

Les VAS jouent un rôle dans plusieurs fonctions physiologiques incluant l’échauffement et l’humidification de l’air, la respiration, la déglutition et la vocalisation (Horner, 2007). Pour effectuer ces fonctions, les VAS sont constituées d’une combinaison de tissus : mous (incluant 24 muscles et d’autres tissus mous), cartilagineux (le cartilage thyroïde, épiglotte) et osseux (la plaque dure, mandibule et l’os hyoïdien). À l’exception de la colonne vertébrale postérieure qui fournit un support dorsal, les VAS ne sont pas entourées par un autre support solide (cartilagineux ou osseux) comme la trachée par exemple, ce qui les rendent déformables (Fogel et al., 2004; Horner, 2008). Cette caractéristique est importante pour effectuer les différentes fonctions physiologiques des VAS, notamment la déglutition et la vocalisation. En revanche, elle favorise l’obstruction durant le sommeil chez les humains (Fogel et al., 2004; Horner, 2008).

Les muscles dilatateurs pharyngés jouent un rôle important dans le maintien de l’ouverture des VAS, et contribuent à l’efficacité de la ventilation et des échanges gazeux pulmonaires (Fogel et al., 2004; Horner, 2008). Chez les humains, selon le type de l’activité ; tonique et/ou phasique, il existe deux types de muscles pharyngés incluant des muscles posturaux et des muscles inspiratoires phasiques (Figure 17): (i) Muscles posturaux : Ce sont des muscles qui n'ont pas d’activité phasique inspiratoire telle que le tenseur palatini (TP). Ils maintiennent un niveau d'activité relativement constant tout au long du cycle respiratoire, afin de maintenir la perméabilité des VAS. (ii) Les muscles inspiratoires phasiques : Comme leur nom l’indique, ces muscles ont une activité phasique inspiratoire. En fait, la pression négative crée lors de la contraction des muscles inspiratoire, notamment le diaphragme, a tendance à produire une obstruction au niveau des VAS. Un mécanisme protecteur est mis

en jeux par une augmentation de l’activation des muscles inspiratoires phasiques avant même l'inspiration, contribuant au maintien de l’ouverture des VAS et permettant ainsi le flux d’air. Lorsque la pression à l'intérieur des VAS devient plus positive pendant l'expiration, l’activité de ces muscles est sensiblement réduite tout en maintenant un niveau tonique. Le génioglosse (GG) est l’exemple type de ce groupe de muscles pharyngés et c’est le plus étudié chez les rongeurs et les humains (Fogel et al., 2004; Horner, 2007, 2008, 2012) (Figure 17).

Figure 17: Anatomie des voies aériennes supérieures chez les humains. Tirée de (Fogel et al., 2004).

Beaucoup d’expérimentations sur le contrôle de l’activité des muscles pharyngés se sont concentrées sur l’étude de l’activité du GG. Ceci est expliqué par la difficulté de l’enregistrement de l’activité des autres muscles. De plus, le GG est considéré comme un facteur important dans la pathogenèse de l’AOS (Fogel et al., 2004; Horner, 2007, 2008; Jordan & White, 2008; Horner, 2012).

Effets du sommeil sur la perméabilité des VAS

L’activité du GG est fortement influencée par les états de vigilances ; sommeil, éveil (Wiegand et al., 1988; Wiegand & Zwillich, 1994; Xie, 2012). Les activités toniques et

phasiques des muscles pharyngés diminuent avec le sommeil à des degrés variables selon le type de muscle (Fogel et al., 2004; Horner, 2008).

Anch et all. ont effectué des enregistrements simultanés de la résistance naso-pharyngée et des électromyogrammes (EMG) du GG et du TP, ainsi que des électroencéphalogrammes de sommeil et électro-oculogrammes chez un patient obèse atteint d’OSA. Ces enregistrements indiquent qu’au début du sommeil, le flux d'air diminue et la pression supra-glottique est plus négative pendant l'inspiration, ce qui entraîne une augmentation de la résistance naso- pharyngée. L'activité du TP a diminué continuellement, et lorsque le flux d'air cessait, le TP est atonique. La fin de l’occlusion coïncide avec l’apparition d’un pic d’activité dans l'EMG du GG et la réapparition des potentiels d'action au niveau du TP (Anch et al., 1981). Ces observations sont en accord avec la suggestion de Remmmers et al, 1978, selon laquelle la pathogenèse de l’AOS chez les humains est liée à une diminution de l’activité du muscle GG (hypotonie). De plus, ils suggèrent que le début de l’obstruction au niveau oropharyngée est principalement liée à la diminution de l'activité du TP plutôt qu’à la diminution de l’activité GG, mais sa réouverture dépend principalement de la réactivation du GG (Remmers et al., 1980; Fogel et al., 2004).

Durant l’éveil, l'activité du GG est soigneusement contrôlée par un certain nombre de facteurs incluants (Figure 18) : 1) l’amplitude des « stimuli de l’éveil » vers les centres respiratoires et des NM XII qui innervent le GG. 2) les centres respiratoires responsables de la genèse de la commande ventilatoire influencent l’activité des NM XII. Cette influence est décrite précédemment (activation phasique inspiratoire), et inclut les stimuli respiratoires chimiques

(l’augmentation de la PaCO2 et la diminution de la PaO2). 3) l’amplitude de la pression négative au niveau des VAS et la sensibilité du réflexe à cette pression (Fogel et al., 2004; Jordan & White, 2008) (Figure 18). Durant le sommeil, la diminution de l’activité du GG est liée à la perte de ses stimuli, à savoir : A) une perte des stimuli de l’éveil, B) la réduction ou des anomalies de la commande respiratoire centrale, C) la diminution des réflexes sensoriels et de la chémosensibilité (Figure18).

Figure 18:Diagramme montrant les trois principaux facteurs régulant l’activité du muscle génioglosse pendant l'éveil et le sommeil. Pendant le sommeil, il y a une perte à la fois du stimulus de la commande ventilatoire venant des centres respiratoires, l’amplitude de la pression négative au niveau des VAS et la sensibilité du réflexe à cette pression et des « stimuli de l’éveil » vers les neurones moteurs hypoglosse innervant le GG (génioglosse). Une perte des stimuli de l’éveil conduit à une diminution de l’acctivité du GG durant le sommeil non-REM et encore plus durant le sommeil REM. Cette diminution est indiquée par une diminution de l’EMG du GG. Adaptée de (Fogel et al., 2004).

A. La perte des stimuli de l’éveil

Durant l’éveil, « les stimuli de l’éveil » et le métabolisme sont deux facteurs déterminants de la ventilation minute nécessaire pour maintenir l’eucapnie ; le niveau de la PaCO2 durant l’eupnée. Les stimuli de l’éveil correspondent aux stimuli neuronaux non spécifiques excitateurs venant des régions supra-pontiques cérébrales (cortex, système limbique) et du système d’activation réticulaire et allant vers les centres respiratoires du tronc cérébral. Durant l’éveil, cette commande stimule la ventilation et compense les anomalies de la commande respiratoire de telle sorte que l’apnée est très rare chez les sujets éveillés (Bulow, 1963; Asmussen, 1977; Orem, 1990; Xie, 2012). La perte des stimuli de l’éveil durant le sommeil entraîne une diminution de la commande ventilatoire. Par conséquent, les fluctuations de la PaCO2 deviennent le seul déterminant de la stabilité du système de contrôle ventilatoire (Skatrud & Dempsey, 1983; Dempsey et al., 2010) (Figure 16 et 18).

B. Altération de la commande ventilatoire durant le sommeil

Il est mis en évidence qu’une hypoventilation se produit chez l’humain au cours du sommeil. Ce qui témoigne une diminution de la commande ventilatoire durant le sommeil. Il en résulte une diminution de l’activité des muscles pharyngés (Dempsey et al., 2004; Horner, 2008; Dempsey et al., 2010; Dempsey & Smith, 2014). Plusieurs explications neuronales sont proposées pour comprendre les mécanismes de la réduction, perte ou anomalie de la commande respiratoire, nous présenterons ici les plus pertinentes :

B.1. Instabilité de la commande ventilatoire : La perte de la commande de l’éveil au cours du sommeil est liée à une réduction de l’amplitude de l’activité des neurones inspiratoires des centres respiratoires médullaires, entraînant une réduction de l’activité rythmique et tonic des NM XII et ainsi, une réduction de l’activité de la plupart des muscles dilatateurs pharyngés. Cette hypotonie/atonie musculaire favorise l’obstruction au niveau des VAS et prédispose à l’apnée (Eckert et al., 2007; Eckert et al., 2009). Ramirez et al. ont mis en évidence une synchronisation 1 :1 entre les pics d’activités du pré-BötC et les NM XII dans des coupes cérébrales autorythmiques de

la médulla chez des souris nouveau-nées. Cependant, après 4 jours de vie postnatale, cette synchronisation diminue, suggérant un échec de la transmission de certaines bouffées d’activité rythmique inspiratoire générées et envoyées par le pré-BötC via des prémotoneurones vers les populations de neurones inspiratoires dans les NM XII entraînant une réduction ou une cessation temporaire de l’activité de ces neurones moteurs (Ramirez et al., 1996). Cet échec de la transmission est encore plus élevé au cours d’une exposition en hypoxie chez la souris (Pena et al., 2008). En parallèle, les bouffées d’activités inspiratoires générées par le pré-BötC continuent à être transmises et reçues par les neurones moteurs du nerf phrénique. Ceci peut bien expliquer l’obstruction des VAS avec persistance de l’effort ventilatoire mise en évidence chez des patients atteints d’OSA (Ramirez et al., 2013; Ramirez, 2014) (Figure 19).

B.2. Modification des systèmes de neurotransmetteurs : Plusieurs systèmes de neurotransmetteurs montrent des changements de leur niveau d’activité à travers les états de vigilances éveil/sommeil. Par exemple, les transmissions excitatrices sérotonergique [5-hydroxytryptamine (5-HT)], noradrénergique et histaminergique sont élevées durant l’éveil et réduites durant le sommeil calme (non-REM pour non rapid eye movement) et surtout pendant le sommeil paradoxal (REM pour rapid eye movement). Alors qu’il y a une activation des systèmes de neurotransmetteurs inhibiteurs lors du passage au sommeil tels que les transmissions GABAergique (GABA pour Acide g- aminobutyrique) et glycinergique. Ces mécanismes importants contribuent à la modulation états-dépendante des muscles dilatateurs des VAS. Les mécanismes impliquant les NM XII et le GG sont les plus étudiés (Horner, 2007, 2008, 2012).

Des systèmes de neurotransmetteurs excitateurs projettent vers la médulla influençant les centres respiratoires et les NM. Par exemple, des transmissions excitatrices noradrénergiques et sérotoninergique projettent vers les NM XII chez le rat (Aldes et al., 1992; Horner, 2008, 2012).

Figure 19:Illustration des anomalies de la commande ventilation vers les neurones moteurs hypoglosses dans la physiopathologie de l’AOS. A : Enregistrements réels de l’activité du noyau moteur hypoglosse (XII, tracé supérieur) obtenus simultanément avec un enregistrement d'un neurone inspiratoire du complexe pré- Bötzinger (N, tracé inférieur). B : Ces enregistrements sont obtenus à partir d’une coupe transversale de tronc cérébral de rat. La préparation contient le complexe pré-Bötzinger (N, bleu), le noyau du tractus solitaire (NTS, rose) et le noyau moteur hypoglosse (XII, vert). C : Tracés schématiques inspirés des enregistrements réels en A. Nous observons que l’activité complexe pré-Bötzinger (tracé bleu) est synchronisée avec celle du nerf phrénique (tracé noir) entraînant une activité diaphragmatique, tandis que l'activité du pré-Bötzinger n’est pas synchronisée avec celle du noyau moteur XII (tracé vert, apnée). D : Par conséquent, il y a une perte de l'activité au niveau du XII et entraînant une perte de l’activité du génioglosse (dessin de la langue) et l’obstruction des voies aériennes pharyngées. En parallèle, l’activité du diaphragme continue. Adaptée de (Ramirez et al., 2013).

In vitro, des enregistrements d’électrophysiologie indiquent que la noradrénaline ou la sérotonine dépolarisent et augmentent l’excitabilité des NM XII chez les rongeurs (Berger et al., 1992; Funk et al., 1994; Parkis et al., 1995). Il est également intéressant de remarquer que le preBötC, une région importante dans la genèse du rythme inspiratoire, reçoit également des projections noradrénergiques et sérotonergiques. Cette région est activée par une variété de récepteurs noradrénergiques et sérotonergique tels que le récepteur alpha1 noradrénergique, et le récepteur 5-HT2 de la sérotonine chez la souris (Doi & Ramirez, 2008, 2010). Ces résultats suggèrent qu’un lien existe entre la diminution de la commande noradrénergique et sérotonergique durant le sommeil, et la diminution de l’activité neuronale au niveau des centres respiratoires. Des études in vivo par une microdialyse des agents pharmacologiques au niveau des NM XII ont été réalisées afin de mieux comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents au contrôle moteur pharyngé dans le sommeil naturel. Cependant, ces expériences n’ont pas confirmé les données obtenues in vitro, du moins concernant la sérotonine et l’histamine (Jelev et al., 2001; Horner, 2012).

D’autre part, des enregistrements électrophysiologiques intracellulaires ont démontré l’existence de systèmes inhibiteurs dans les pré-motoneurones GABAergiques et glutamatergiques (Horner, 2007; Chase, 2013) ainsi que l’action inhibitrice de la glycine sur les NM XII au cours du sommeil REM (Yamuy et al., 1999). Pour soutenir le rôle de ces acides aminés inhibiteurs dans la modulation de la commande motrice du nerf XII in vivo, l’infusion des agonistes de la glycine et des récepteurs GABA-A dans le NM XII a produit une suppression de l'activité GG en normoxie et en hypercapnie chez des rats anesthésiés. L'antagonisme de ces récepteurs augmente l'activité du GG et inverse cette suppression (Morrison et al., 2003; Liu et al., 2005).

C. Diminution des réflexes sensoriels et de la chémosensibilité durant le sommeil

L’activation des mécanorécepteurs localisés au niveau des parois intra-luminales des VAS induite par la pression négative produite durant l’inspiration initie un mécanisme important dans la régulation de l’activité du NM XII et par conséquent, l’activation du muscle GG. Ce réflexe représente un mécanisme important dans la prévention contre l’obstruction des VAS

(Malhotra et al., 2000; Chamberlin et al., 2007; Eckert et al., 2007). Durant le sommeil, ce réflexe est atténué, ce qui peut être un facteur important dans la physiopathologie de l’OSA (Wheatley et al., 1993). De plus, l’hypercapnie et l’hypoxie arrivent simultanément lors de l’hypoventilation liée au sommeil. Il est démontré que les réponses ventilatoires à ces deux stimuli sont réduites durant le sommeil (Douglas et al., 1982; Kara et al., 2003). Cette réduction pourrait être expliquée essentiellement par une réduction de la chémosensibilité (Zwillich et al., 1978; Douglas et al., 1982; Wiegand et al., 1988; Xie, 2012).

Donc, les modifications de la commande ventilatoire durant le sommeil affectent l’activité des muscles dilatateurs pharyngés. Par conséquent, la perméabilité des VAS est compromise en favorisant leur obstruction, et ainsi l’apparition de l’apnée obstructive (Figure 16 et 19).

Mécanisme de l’apnée centrale

Il est connu que la réduction de la commande ventilatoire provoque une hypoventilation lors du sommeil. Cette hypoventilation peut conduire à une hypercapnie significative (2 à 8 mmHg au-dessus de l’eucapnie) (Dempsey et al., 2004). Afin de rétablir la PaCO2, une hyperventilation transitoire souvent accompagnée d’un microéveil. Si cette l’hyperventilation baisse la PaCO2 au-dessous du seuil apnéique (une hypocapnie de quelques mmHg sous le niveau de la PaCO2 l’eupnée), elle entraîne une apnée, qui est donc une apnée centrale (Dempsey et al., 2004; Dempsey et al., 2010; Xie, 2012). La même série d’événements peut être déclenchée suite à une apnée obstructive (Figure 16).

Le seuil d’apnée sensible à l’hypocapnie est déterminé expérimentalement à la fois chez des patients trachéotomisés atteints d’OSA (Iber et al., 1986) ou des chiens (Chow et al., 1994), par provocation de brèves occlusions des voies respiratoires entraînant des hyperventilations transitoires (et souvent un éveil) à la fin de l'occlusion suivie par des apnées et une reprise du sommeil (Skatrud & Dempsey, 1983; Iber et al., 1986; Henke et al., 1988; Chow et al., 1994; Dempsey et al., 2004; Dempsey et al., 2010; Dempsey & Smith, 2014).

Pour mieux comprendre ce mécanisme, une représentation graphique de la courbe isométabolique qui décrit la relation entre la ventilation alvéolaire et la PACO2 est représentée dans la figure 20. À l’éveil, si la PaCO2 varie, la ventilation varie par conséquent tout au long de la ligne diagonale. Son interaction avec la courbe isométabolique correspond à la PaCO2 de l’eupnée (X dans la figure figure 20). Chez les sujets éveillés, on peut expérimentalement augmenter la ventilation pour faire diminuer la PaCO2 jusqu'à un niveau qui déclenche l’apnée (ventilation nulle). Ce point est appelé « le seuil d’apnée » (A). Le gradient en PaCO2 entre la PaCO2 eupnée et l’apnée est appelé, entre les points X et A correspond à la « réserve en CO2 » (Figure 20). La pente de la ligne diagonale correspond à la réponse ventilatoire au

CO2 (gain de contrôleur) qui nous informe sur la sensibilité de la réponse aux variations de

PaCO2. La modification de la commande ventilatoire durant le sommeil provoque une relocalisation de la ligne diagonale au niveau de la courbe isométabolique (Skatrud & Dempsey, 1983; Dempsey et al., 2004). Cette modification chez les sujets endormis entraîne une augmentation du seuil d’apnée (Y dans la figure 20) comparativement au stade d’éveil

(X dans la figure 21), ainsi, la réserve en CO2 est rétrécie au cours du sommeil et même une petite augmentation transitoire entrainant une hypocapnie peut déclencher l’apnée (figure 20). Par conséquent, l’hypocapnie peut induire une apnée plus facilement durant le sommeil et rarement en éveil. En fait, l’hypocapnie peut inhiber la boucle de rétrocontrôle du chémoréflexe ventilatoire conduisant à une perte de la commande ventilatoire (Skatrud & Dempsey, 1983; Dempsey et al., 2004). Cette rétroaction inhibitrice de l’arc chémoréflexe est illustrée dans la figure 3. Ceci explique l’origine centrale de ce type d’apnée (Dempsey et al., 2004; Xie, 2012; Dempsey & Smith, 2014). De plus, nous observons une pente plus petite de la ligne diagonale lors du sommeil en comparaison à l’éveil, cette figure illustre bien la réduction de la sensibilité centrale au CO2 au cours du sommeil (réduction de la pente) (Figure 20), comme nous avons décrit précédemment.

Figure 20: Représentation graphique de la courbe isométabolique.

Cette courbe décrit la relation entre la ventilation alvéolaire (V) et PETCO2 (ET pour end- tidal : la pression en CO2 en fin d’expiration qui reflet de la PCO2 alvéolaire). Les flèches indiquent la réserve en CO2 pendant le sommeil et l’éveil : noter une réserve en CO2 est plus large durant l’éveil (flèche rouge continue) par rapport au sommeil (flèche bleue pointillée). Les points A et B représentent les seuils apnéiques au cours de l’éveil et le sommeil, respectivement pour lesquels la ventilation est nulle. Le X et le Y correspondent à la PETCO2 de l’eupnée à l’éveil et au sommeil respectivement. La modification de la commande durant le sommeil provoque une relocalisation de la ligne diagonale au niveau de la courbe isometabolique, noter que chez le sujet endormit, le seuil apnéique et eupnéique sont plus proche par rapport à l’éveil. PETCO2 = Pression en CO2 en fin d'expiration. Adaptée de (Chowdhuri & Badr, 2017).

Par ailleurs, il y a des preuves expérimentales indiquant une potentialisation de la sensibilité des chémorécepteurs périphériques chez les patients atteints d’AOS. Cette altération peut être impliquée dans la pathogenèse de l’AOS (Kimoff et al., 1997; Narkiewicz et al., 1999; Ramirez et al., 2013). Effectivement, l’augmentation de la sensibilité des chémorécepteurs périphériques peut être à l’origine de l’augmentation de la RVH entraînant des périodes d’hypocapnie fréquente (de quelques mmHg sous le niveau de l’eupnée), ce qui peut conduire à l’augmentation de la fréquence des d’apnées centrales (Prabhakar, 2001). Xie et al. ont démontré que la réserve en CO2 est significativement diminuée chez les patients atteints d’AOS et ACS. Chez ces patients, les résultats ont indiqué un seuil d’apnée plus faible chez les patients avec AOS et ACS en comparaison avec le groupe contrôle (sans apnée), ce qui contribuerait au développement de l’apnée (Xie, 2012).

Ramirez et al. proposent une explication neuronale de l’apnée centrale. En fait, ils expliquent qu’une cessation de la genèse de l’activité rythmique inspiratoire, peut être générée au niveau du pré-BötC lui-même, ainsi qu’au niveau des NM XII et IX (phrénique). Cette perturbation de la production des unités rythmiques inspiratoires est généralement précédée par une bouffée d’activité de grande amplitude connue sous le terme de « soupirs » (Ramirez et al., 2013; Ramirez, 2014) (Figure 21).

Effectivement, l'étude de Lieske et al. (2000) a démontré que le préBötC, même isolé dans une tranche de tronc cérébral, est capable de produire trois différents types de rythmes neuronaux respiratoires : l'eupnée, les soupirs et la respiration agonique (ou « gasping » en anglais) (Lieske et al., 2000). De plus, il est connu que la réouverture des VAS est liée à un éveil et une réactivation soudaine du GG. Wulbrand et al. ont proposé que cette réactivation du GG soit synchronisée avec la génération des mécanismes neuronaux responsable du soupir (Wulbrand et al., 2008). Par définition, le soupir est une respiration d’amplitude élevée où le volume courant est doublé. Il peut être spontané ou associé à des évènements émotionnels tel que la tristesse, le soulagement ou l'épuisement (Haldane et al., 1919; Perez-Padilla et al., 1983).

Figure 21:Mécanismes de l’ACS. A : Enregistrements réels de l’activité extracellulaire (tracé supérieur) et intracellulaire (tracé médian) obtenus simultanément. B : Ces enregistrements sont obtenus à partir d’une coupe de tronc cérébral d'un rat. La préparation contient le complexe pré-Bötzinger (N, bleu), le noyau du tractus solitaire (NTS, rose). Le noyau moteur hypoglosse (XII, vert). C : Des tracés schématiques inspirés des enregistrements réels en A plus un enregistrement de la ventilation par pléthysmographie chez les humains (tracé inférieur). Noter que la perte de certaines bouffées inspiratoires au niveau du complexe pré-BötC autorythmique (tracé bleu) est à l’origine de la perte d’activité dans le noyau phrénique (tracé noir), et hypoglosse (tracé vert, apnée). D : La perte des unités motrices inspiratoires est précédée par la genèse du soupir au niveau du pré-Bötzinger. Le soupir et l’apnée centrale sont associés avec l’éveil comme illustré en D (Ramirez et al., 2013).

L’origine de l’amplitude élevée est expliquée par une double bouffée d’activité eupnéique c.à.d. deux bouffées fusionnées ou très proches (Ruangkittisakul et al., 2008). L’apnée suivant le soupir est appelée apnée post-soupir (Ramirez et al., 2013; Ramirez, 2014) (Figure 21).

Le soupir peut provoquer une altération du patron respiratoire. En effet, il est démontré que le soupir provoque une altération des paramètres cardiorespiratoires, se manifestant par une hypoventilation ; une réduction de la fréquence respiratoire et du volume courant dans les 10 à 20 cycles respiratoires post-soupir ainsi qu’une augmentation de variabilité cardiorespiratoire durant le soupir chez les patients anesthésiés avec du propofol ou en sommeil. De plus, le soupir peut être accompagné occasionnellement par une apnée centrale, au moins durant le sommeil. Ces altérations peuvent indiquer une inhibition de la commande respiratoire centrale (Perez-Padilla et al., 1983; Goodman & Dow, 1993; Patroniti et al., 2002). En effet, le soupir peut être accompagné d’un éveil et d’une diminution significative de la PaCO2. Si cette diminution est au-dessous du seuil d’apnée, une inhibition de la commande respiratoire centrale se produit entraînant une apnée (Eckert et al., 2007; Eckert et al., 2009) (Figure 22).

Un autre mécanisme est impliqué dans l’inhibition de la commande ventilatoire centrale après le soupir. L’activation des mécanorécepteurs lors de l’inflation des poumons inhibe de façon réflexe l'inspiration (le réflexe Hering-Breuer) (Widdicombe, 1982; Perez-Padilla et al., 1983). Ce réflexe est déjà décrit dans la section 2.3

Figure 22: La genèse du soupir est associée à l'éveil et l’apnée centrale (tracé VT).

Notez que le soupir (« sigh » tracé inférieur) est associé à une réduction du PETCO2 qui peut être responsable de l’apnée post-soupir. EEG : Électroencéphalogramme, PETCO2 : pression partielle du CO2 en fin d’expiration, VT : volume courant. Adaptée de (Ramirez et al., 2013).

Les approches thérapeutiques disponibles

Le traitement de référence de l’AS reste la ventilation en pression positive continue (VPPC), qui augmente la pression d'air dans les voies aériennes afin qu'elles ne se referment pas. Une utilisation d'une durée minimale de 4 heures par nuit est nécessaire pour observer une amélioration. L’amélioration est quantifiée par un sommeil et un éveil de meilleur qualité accompagné d’une réduction de l’hypertension artérielle et la disparition des symptômes associés à l’AOS (Naughton et al., 1995). L’utilisation de la VPPC pendant plus de 6 heures est très favorable. La thérapie VPPC a été rapportée comme améliorant la fonction cardiaque, réduisant l'activité sympathique et améliorant la continuité du sommeil (Naughton et al., 1995). Cependant, 46 à 83% des patients souffrant d'apnée obstructive du sommeil sont déclarés non adhérents au traitement, lorsque l'adhérence est définie comme supérieure à 4 heures d'utilisation nocturne (Weaver & Grunstein, 2008). Des appareils buccaux peuvent être utilisés pour permettre d'élargir les VAS, mais certains effets secondaires peuvent apparaître comme des lésions buccales (Weaver & Grunstein, 2008). La chirurgie peut être envisagée dans le cas des anomalies anatomiques ou si les autres traitements sont inefficaces (Camacho et al., 2015).

Il existe également des approches pour activer les muscles des VAS pendant le sommeil : une approche consiste à stimuler directement les muscles des VAS ou le nerf hypoglosse. Cliniquement, ceci est réalisé par l'implantation chirurgicale d'un dispositif de stimulation relié à un brassard placé autour du nerf XII (Malhotra, 2014; Gillespie et al., 2017). D’autres approches visent à développer une pharmacothérapie pour augmenter l'activité des muscles des VAS pour traiter l'AOS. Les cibles ont inclus les systèmes sérotononergiques, noradrénergiques et GABAergiques (White, 2016; Horner et al., 2017), mais pour l’instant, ces approches restent peu efficaces, et ne sont pas utilisées comme traitement régulier pour l’AS.

L’impact de la progestérone sur la fonction respiratoire chez les mammifères

Avant d’aborder les effets respiratoires de la progestérone, des informations générales sur cette hormone à savoir sa biosynthèse, son métabolisme et ses taux physiologiques chez le mâle et la femelle sont données.

Généralités sur la progestérone

Définition de la progestérone

La progestérone est une hormone stéroïdienne. Par définition, un stéroïde est une molécule qui possède un squelette de base appelé noyau stérol constitué de 17 atomes de carbone. Ce noyau est composé de 3 anneaux de cyclohexane (appelés anneaux A, B et C) et un anneau de cyclopentane. Différents groupements chimiques peuvent se fixer sur le noyau stérol formant ainsi différents stéroïdes aux propriétés et activités biologiques très différentes (Schumacher et al., 2014) (Figure 23).

Les hormones stéroïdiennes peuvent être regroupées en deux classes. On trouve (i) les corticostéroïdes qui sont généralement synthétisés au niveau du cortex surrénalien, incluant les glucocorticoïdes et les minéralocorticoïdes, et (ii) les stéroïdes sexuels qui sont généralement synthétisés dans les gonades ou le placenta, incluant les androgènes, les estrogènes et la progestérone (Funder et al., 1997; Schaaf & Cidlowski, 2002; Frye, 2009).

Le nom de la progestérone est dû à son rôle essentiel dans le maintien de la grossesse, soit un rôle « pro-gestational ». De plus c’est un précurseur de la biosynthèse des autres stéroïdes (Brunton & Russell, 2011; Brunton et al., 2014).

Les voies de la biosynthèse et le métabolisme de la progestérone

La biosynthèse de la progestérone est un processus hautement compartimenté. Elle implique comme première étape une translocation du cholestérol à partir du cytoplasme de la cellule vers la membrane mitochondriale interne. Il s'agit d'une étape limitante rétrocontrôlée qui implique la protéine régulatrice aiguë de la stéroïdogenèse (StAR) (Lavaque et al., 2006) et la protéine translocatrice de 18 kDa (TSPO) (Papadopoulos et al., 2006). Une fois dans la mitochondrie, le cholestérol est converti en prégnénolone par l’enzyme du clivage de la chaine latérale du cholestérol ; la cytochrome P450scc (scc pour « side chain cleavage »), puis en progestérone par la 3β-hydroxystéroïde déhydrogénase (3β HSD) (Luu The et al., 1989; Panzica & Melcangi, 2008) (Figure 23).

La progestérone est métabolisée en 5α-dihydroprogestérone (5α-DHP) par la 5α-réductase. La 5α-DHP peut être métabolisé à son tour en alloprégnanolone (3α, 5α- tétrahydroprogestérone) par des aldo-céto réductases (ARK, 3α-HSD = 3α-hydroxystéroïde déshydrogénase) (Schumacher et al., 2014) (Figure 24).

Le lieu de la biosynthèse de la progestérone

La progestérone est synthétisée par les corps lutéaux des ovaires et par le placenta chez la femelle (Chamberlin et al., 2007; Schumacher et al., 2014) .

Chez les humains et chez le rat, il est démontré que la progestérone est produite également par les surrénales à la fois chez la femelle et le mâle (Feder et al., 1968; Fajer et al., 1971; Coirini et al., 2002; Romeo et al., 2005; Romeo, 2010; Brunton & Russell, 2011) (Figure 24).

Figure 23: Les voies de biosynthèse et du métabolisme de la progestérone chez les mammifères. Le cholestérol pénètre dans la mitochondrie, puis il est converti en prégnénolone par le cytochrome P450scc, puis en progestérone par la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (3β HSD). La progestérone est métabolisée en 5α-dihydroprogestérone (5α-DHP) par la 5α- réductase. La 5α-DHP peut être métabolisé à son tour en alloprégnanolone (3α, 5α- tétrahydroprogestérone) par des aldo-céto-réductases (AKR, 3α-HSD = 3α-hydroxystéroïde déshydrogénase. Adaptée de (Chamberlin et al., 2007; Schumacher et al., 2014).

Figure 24:Source et taux plasmatiques de la progestérone chez la femme et l’homme. Les différentes sources de la progestérone (en bleu les glandes endocrines et en jaune pour le système nerveux) et ses niveaux de référence plasmatiques chez les femmes et les hommes. TBI: niveau plasmatique après lésion cérébrale traumatique (Schumacher et al., 2014).

En revanche, les surrénales sont une source mineure de progestérone en comparaison avec les taux globaux dans l’organisme (MacLusky & McEwen, 1980). La progestérone est également considérée comme un neurostéroïde puisqu’elle est synthétisée au niveau du système nerveux central et périphérique (Schumacher et al., 2014) (Figure 24).

La progestérone est synthétisée par les neurones, mais également par les cellules gliales, regroupant les astrocytes, oligodendrocytes et cellules de Schwann à partir de précurseurs circulants ou de novo à partir du cholestérol (Baulieu, 1997; Garcia-Segura & Melcangi, 2006; Mellon, 2007; Schumacher et al., 2007; Panzica & Melcangi, 2008). De plus, des enzymes stéroïdogéniques sont détectées dans le système nerveux (Coirini et al., 2002)

Taux de la progestérone chez le mâle et la femelle (humains et rongeurs) :

Chez la femelle :

Il est connu que la sécrétion hormonale chez la femelle varie selon le cycle de reproduction, qui est appelé le cycle menstruel chez les humains. Ce cycle est constitué par deux phases, une phase folliculaire et une phase lutéale durant lesquelles les taux des hormones fluctuent (Kunduk et al., 2017). Les taux circulants de la progestérone sont faibles chez les femmes pendant la phase folliculaire du cycle menstruel (1-3 nM), et ils augmentent de façon transitoire et marquée pendant la phase lutéale (20-40 nM) (Genazzani et al., 1998; Havlikova et al., 2006; Mumford et al., 2010). Chez les femmes ménopausées, les taux de progestérone sont proches de ceux observés pendant la phase folliculaire (Genazzani et al., 1998). La progestérone atteint des niveaux très élevés au cours de la grossesse humaine jusqu’à 200-400 nM au cours du troisième trimestre. En parallèle, les concentrations des dérivés de la progestérone ; la 5α-DHP et l'alloprégnanolone atteignent respectivement environ 100 nM et 30 nM (Gilbert Evans et al., 2005; Hertig et al., 2010).

Le cycle menstruel chez les humains correspond au cycle œstral chez les rongeurs. Les rats femelles ont des cycles rapides de 4-5 jours constitués de quatre étapes communément appelées proestrus, œstrus, diestrus-1 et diestrus-2 (Mittelman-Smith et al., 2017). Les niveaux de la progestérone sont faibles pendant l'œstrus et à la fin du diestrus-2 (10-20 nM)

atteignant leurs valeurs maximales pendant le proestrus et le diestrus-1 (60-120 nM) (Butcher et al., 1974; Haim et al., 2003; Baranda-Avila et al., 2009). Des valeurs maximales similaires aux rats femelles sont détectées pendant le cycle œstral chez la souris soit environ 60 nM (DeLeon et al., 1990; Walmer et al., 1992). De façon analogue aux humains, des taux plasmatiques de progestérone atteignant 150-300 nM sont rapportés à la fin de la troisième semaine de gestation chez la souris (Murr et al., 1974; Virgo & Bellward, 1974; Barkley et al., 1979).

Des études chez des modèles animaux suggèrent un équilibre entre les concentrations plasmatiques et cérébrales de progestérone (Concas et al., 1998; Kellogg & Frye, 1999; Meffre et al., 2007). Pendant la gestation chez le mouton et le rat, les niveaux de progestérone et d’alloprégnanolone dans le système nerveux central et les concentrations plasmatiques sont similaires, indiquant que ces molécules franchissent la barrière hématoencéphalique permettant une diffusion rapide dans tous les tissus nerveux (Concas et al., 1998; Nguyen et al., 2004).

Chez le mâle :

Comme indiqué précédemment, la synthèse de la progestérone a lieu au niveau du cortex des glandes surrénales et du système nerveux chez la femelle et le mâle. Les taux plasmatiques de base détectés chez l’homme sont de 1-3 nM, similaires à ceux rapportés chez la femme durant la phase folliculaire du cycle menstruel (Schumacher et al., 2014) (Figure 24).

Donc, la progestérone et ses métabolites neuroactifs sont présents à la fois chez la femelle et le mâle. Cependant, il est suggéré que les concentrations de la progestérone et de ses métabolites dans le système nerveux central et périphérique sont différentes selon le sexe ; les concentrations de progestérone chez les rats femelles sont plus élevées dans le système nerveux en comparaison avec les mâles. Il semble que ce dimorphisme sexuel puisse en partie expliquer les différences du nombre de cas d’hommes vs femmes rapporté dans plusieurs troubles neurologiques tel que la maladie d'Alzheimer ou de la maladie de Parkinson (Melcangi et al., 2014).

Actions pléiotropiques de la progestérone

De nombreuses études mettent en évidence une action pléiotrope de la progestérone, cette hormone jouant un rôle important dans de nombreux processus physiologiques. Il est reconnu qu’au cours de la grossesse, la progestérone est essentielle au développement du fœtus, des glandes mammaires pour l'allaitement et au maintien de l'intégrité utérine et placentaire (Mendelson, 2009). De plus, elle a un impact sur les fonctions cardiovasculaires, le sommeil et le système nerveux central étant une de ses cibles principales (Schumacher et al., 2014; Guennoun et al., 2015). L’hypothalamus et l’hypophyse sont les premières régions identifiées comme cibles de la progestérone au niveau du cerveau. La progestérone affecte l'excitabilité de la membrane neuronale (Reddy, 2010) et ainsi influence l’activité neuronale. La progestérone a des effets trophiques, car elle favorise la ramification des dendrites et la myélinisation. Elle a aussi des effets sur le développement cognitif, la plasticité neuronale et la mémoire (Thomas & Pang, 2012; Fortress et al., 2015; Guennoun et al., 2015; Kasubuchi et al., 2017).

De plus, il est également démontré que la progestérone agit au niveau central et périphérique du système de contrôle ventilatoire (Behan & Wenninger, 2008). Cette action, étant l’axe principal de la présente thèse, et sera détaillée dans la section suivante.

Effet de la progestérone sur le contrôle ventilatoire chez l’adulte

La ventilation chez la femelle et le mâle : Le dimorphisme sexuel

La première mise en évidence d’un dimorphisme sexuel au niveau de la fonction respiratoire e date du début du 20 siècle. En effet, il a été démontré que des femmes adultes ont une PACO2 plus faible que les hommes (Haldane & Priestley, 1905). Plus récemment, Joseph et al. ont repris les données de l’étude de Haldane et al. afin de mieux comprendre le rôle de l’âge et du sexe sur la ventilation pulmonaire chez les humains. Ils ont repris les données des tableaux I-IV de l’étude à l’origine sous forme graphique et ont effectué une analyse statistique. Ces données sont issues de garçons et de filles âgés de 7.5 à 15.5 ans et des hommes et femmes

adultes de plus de 17 ans. Les résultats indiquent un effet significatif de l’âge et du sexe sur la PACO2 (Joseph et al., 2013). Ce qui indique l’existence d’un dimorphisme sexuel au niveau de la fonction respiratoire.

Les études de Hasselbach et al. ont démontré que durant la grossesse, l’augmentation importante des taux de progestérones est associée à une amélioration de la respiration ; une réduction de la PACO2 et la PaCO2 (Hasselbach & Gammeltoft, 1915) . Ces résultats sont cohérents avec les études de Moore et al. où l’analyse de l'oxygénation artérielle pendant la grossesse et 3 mois après l'accouchement chez des sujets en altitude à 3 100 m a révélé une hyperventilation plus importante pendant la grossesse qui contribue à l’augmentation de la saturation de l'O2 artérielle (SaO2) des femmes enceintes en comparaison des femmes qui ne le sont pas (Moore et al., 1987). Pour le fœtus, l’augmentation de la ventilation de la femme au cours de la gestation implique une amélioration de la SaO2 et un rejet efficace du CO2, et ainsi le protège contre les effets néfastes de l’acidose et de l’hypoxémie (Joseph et al., 2013).

En outre, des changements cycliques de la respiration sont observés durant les phases du cycle menstruel. La ventilation minute et la PaCO2 au repos sont plus faibles durant la phase lutéale en comparaison avec la phase folliculaire. Nous rappelons que les taux de progestérones et des estrogènes sont plus élevés durant la phase lutéale que durant la phase folliculaire. Les taux hormonaux élevés durant la phase lutéale sont corrélés positivement avec la réduction de la PaCO2. Ce qui cohérent avec les résultats indiquent que les taux élevés de progestérone durant la phase lutéale sont associés à une hyperventilation, une réduction de la PACO2 (Slatkovska et al., 2006), ainsi qu’une réduction de la résistance au niveau des voies aériennes pendant le sommeil (Driver et al., 2005). Également, la ménopause est un facteur de risque important pour le développement de l’AS, probablement lié à la réduction des taux d’estrogène et de progestérone (Young et al., 2003; Heinzer et al., 2015). En effet, l’hormonothérapie combinant progestérone et estradiol réduit l’AS chez la femme post- ménopausée (Bixler et al., 2001; Shahar et al., 2003).

La fonction respiratoire chez les mammifères est donc influencée par des phénomènes sexe- dépendants dans lesquels les hormones stéroïdiennes sexuelles jouent un rôle important. Les hormones stéroïdiennes incluant la progestérone, l’estrogène, et la testostérone peuvent influencer la fonction respiratoire chez les humains et les animaux (Dempsey et al., 1986; Tatsumi et al., 1991; Tatsumi et al., 1997; Behan & Wenninger, 2008).

Impact de la progestérone sur la fonction respiratoire

Études cliniques

Des études cliniques ont démontré que les thérapies à base de dérivés synthétiques de la progestérone (progestins synthétiques) tels que la médroxyprogestérone acétate (MPA) ou chlormadinone acétate (CMA) apportent des effets respiratoires bénéfiques ; elles facilitent la ventilation et améliorent le chémoréflexe ventilatoire à la fois chez la femme et l’homme. Un rappel historique de ces effets en recherche clinique est rapporté dans cette partie.

Les premières études réalisées au cours des années cinquante et soixante, ont démontré que le traitement par la progestérone augmente la ventilation et réduit la PaCO2 chez les personnes en santé (Heerhaber et al., 1948), chez six patients avec rétention de CO2 due à un emphysème pulmonaire stable (Tyler, 1960), ainsi que chez sept patients hommes atteints d'emphysèmes pulmonaires graves et chez deux sujets normaux (Cullen et al., 1959). Plus tard, ces résultats ont été confirmés par plusieurs autres études. En effet, il est démontré que la MPA améliore l’oxygénation et l'hypercapnie artérielle chez des patients atteints de maladies pulmonaires obstructives chroniques (Dolly & Block, 1983; Skatrud & Dempsey, 1983; Al-Damluji, 1986), ainsi que chez les patients atteints d’AS (Rajagopal et al., 1986). L’analyse de l’évolution temporelle de l’effet stimulateur d’une injection de 60 mg par jour de la MPA pendant une semaine sur la ventilation a été réalisée au repos chez des hommes en santé. Les résultats ont montré que cet effet est apparu dans les 48 h après le début du traitement avec un pic atteint après 7 jours et est disparu dans les 14 jours après l’arrêt du traitement (Skatrud et al., 1978). La stimulation de la ventilation est associée à une réduction significative de la PaCO2 et à une augmentation de la PaO2 (Strohl et al., 1981). La MPA

stimule non seulement la ventilation au repos, mais également la RVH et la RCVH chez des hommes sains (Zwillich et al., 1978).

Chez des femmes ménopausées atteintes d'hypercapnie épisodique ou d’une insuffisance respiratoire hypoxémique permanente ou antérieure, le traitement par la MPA (60 mg par jour) pendant 14 jours a réduit de PaCO2 pendant au moins 3 semaines après l'arrêt de l’administration de la PMA (Saaresranta et al., 1999). Ce traitement a permis également une amélioration de la ventilation chez les femmes ménopausées présentant une obstruction partielle des VAS pendant le sommeil, en stimulant la ventilation et réduisant la PaCO2, sans compromettre le sommeil. L'amélioration ventilatoire est maintenue également pendant au moins trois semaines après l’arrêt du traitement (Saaresranta et al., 2001).

Kimura et al. ont étudié les effets respiratoires d’un autre progestatif synthétique puissant ; la CMA, chez des hommes en santé. Après quatre semaines de traitement par la CMA, la

PaCO2 a diminué significativement avec une augmentation de la ventilation minute au repos, de la RVHC (Kimura et al., 1984) et de la RVH (Okita et al., 1987). En outre, la CMA stimule la ventilation au repos, les RVH et RVHC et réduit la PaCO2 chez des patients avec des maladies pulmonaires obstructives chroniques (Tatsumi et al., 1986; Vos et al., 1994).

En plus de l’effet stimulant de la progestérone sur le système de contrôle ventilatoire, nous nous intéressons également à l’effet de la progestérone sur la stabilité ventilatoire c.-à-d. la genèse de l’apnée durant le sommeil. Par conséquent, l’effet de l’hormonothérapie et le contrôle respiratoire et la pathologie de l’AS sont abordés.

L’hormonothérapie par les hormones sexuelles stéroïdiennes, incluant les estrogènes et la progestérone, peut avoir un effet protecteur contre l'AS. Une étude prenant en compte deux patients obèses atteints d’AOS chez lesquels le traitement par la progestérone a amélioré leur pathologie ; un cas, où l'AOS est altérée en hypopnée obstructive, tandis que dans l'autre, l'apnée est complètement disparue. Cette amélioration remarquable est associée à une amélioration de la désaturation en O2 au cours du sommeil et à une réduction de la

somnolence diurne dans les deux cas (Kimura et al., 1988). D’autres résultats corrélés avec cette étude ont indiqué que l’utilisation de CMA réduit l’indice d'apnée-hypopnée chez certains hommes atteints d’AS (Kimura et al., 1989). Ces résultats suggèrent que la thérapie avec CMA peut être utile dans le traitement du syndrome d'AS (Okita et al., 1987; Kimura et al., 1989).

La MPA a également des effets bénéfiques dans le traitement de l’AS. L’utilisation de la polysomnographie après une monothérapie au MPA (60-120 mg par jour) indique que quatre patients sur neuf ont montré une résolution de la somnolence diurne et une réduction significative de la fréquence des apnées obstructives. Cependant, l’arrêt de la thérapie induit le retour des symptômes de l’AS (Strohl et al., 1981). Ces résultats concordent avec d’autres études de polysomnographie chez des patients adultes atteints d’AOS dont la maladie est aggravée par l'ingestion d'éthanol. Le MPA améliore l'oxygénation pendant les événements obstructifs, mais sans améliorer leur nombre ou leur durée (Collop, 1994). De plus, le traitement par désogestrel, un analogue puissant de la progestérone, améliore la respiration en restaurant la chémosensibilité centrale manquante chez des patients atteints du syndrome d’hypoventilation congénitale (Straus et al., 2010; Straus & Similowski, 2011). La plupart des études mettent en évidence que combiner la progestérone et l’estradiol est plus efficace pour améliorer les symptômes de l’AS chez les femmes ménopausées (Pickett et al., 1989; Regensteiner et al., 1989; Franklin et al., 1991; Keefe et al., 1999; Manber et al., 2003; Shahar et al., 2003; Young et al., 2003). Cet effet peut être expliqué au moins en partie, par l’augmentation de l’expression des récepteurs de la progestérone exercée par l’estradiol (Brinton et al., 2008).

Donc, l’ensemble des études indiquent que l’hormonothérapie à la progestérone améliore la ventilation au repos, en réponse à des stimuli gazeux chez des sujets en santé, ainsi que des patients atteints de pathologies respiratoires. En particulier, la progestérone peut réduire la sévérité des maladies pulmonaires obstructives et de l’AS et peut donc être suggérée comme une thérapie alternative en clinique.

Études chez les modèles animaux

Chez le rat adulte mâle, le traitement par la progestérone associée à l'estradiol stimule la RVHC (Tatsumi et al., 1991) et la RVH (Kimura et al., 1990). Donc, ces études fondamentales démontrent l’influence positive de la progestérone sur le chémoréflexe ventilatoire. L’effet d’une injection de progestérone par voie intraveineuse (i.v.) ou directement dans la médulla oblongata, précisément dans le NTS, sur la ventilation a été étudié chez des chats mâles et femelles anesthésiés, paralysés et ventilés. Chez ces animaux, les nerfs du sinus carotidien et le nerf vague sont coupés, la température et la PACO2 sont maintenues constantes. Pour déterminer l’effet de la progestérone sur la commande respiratoire centrale, l’activité du nerf phrénique est mesurée avec ou sans prétraitement à l’estradiol. Lorsque les animaux sont prétraités par l’estradiol, la progestérone stimule l’activité du nerf phrénique de façon dose dépendante (Bayliss et al., 1987). L’injection de progestérone au niveau du NTS, induit également une facilitation prolongée de l’activité du nerf phrénique (Bayliss et al., 1987). Dans un modèle in vitro de tronc cérébral isolé de rat, l’exposition à l’étonogestrel (un puissant agoniste des récepteurs de progestérone) stimule la fréquence respiratoire en réponse à l’acidose, suggérant une potentialisation de la

+ chémosensibilité centrale au CO2/H . Cet effet implique des structures centrales supramédullaires localisées niveau du pont, mésencéphale ou diencéphale (Loiseau et al., 2014).

Plusieurs études ont démontré un impact de la progestérone sur le chémoréflexe périphérique. Les expériences de Hannhart et al. ont révélé une augmentation de la ventilation de base et de la PaO2 ainsi qu' une augmentation de l’activité du nerf du sinus carotidien en réponse à l’hypoxie chez des chattes gestantes anesthésiées vs des chattes non gestantes. Ce résultat suggère que l'augmentation de la chémosensibilité des corps carotidiens en réponse à l'hypoxie serait nécessaire pour améliorer la RVH durant la grossesse (Hannhart et al., 1989). De plus, ces résultats suggèrent également une influence des hormones stéroïdiennes sur le chémoréflexe périphérique. Pour déterminer précisément l’implication de la progestérone et des estrogènes dans la stimulation de la RVH et l’activité du nerf du sinus carotidien, Hannhart et al. ont mesuré l’activité du nerf du sinus carotidien avant et après une semaine

de traitement par un placebo (contrôle), estrogène, progestérone ou œstrogène plus progestérone chez des chats mâles castrés. L’activité du nerf du sinus carotidien en réponse à l’hypoxie est plus élevée chez les animaux ayant reçu la progestérone seule ou en association avec des œstrogènes en comparaison avec le groupe contrôle ou le groupe traité avec les œstrogènes seuls. L'administration des deux hormones, progestérone et œstrogène a un effet stimulant plus consistant sur la RVH que la progestérone seule. L’ensemble des travaux de Hannhart et al. ont mis en évidence que l’augmentation de la RVH observée chez la femelle gestante implique l’action de la progestérone dans les corps carotidiens chez le chat (Hannhart et al., 1989; Hannhart et al., 1990).

Chez le rat, Joseph et al. ont testé l'hypothèse que les hormones stéroïdiennes stimulent la ventilation par un mécanisme dopaminergique dans les corps carotidiens. Ils ont démontré qu’en haute altitude (3 600 m), les femelles ovariectomisés ont présenté une activité plus élevée de la tyrosine hydroxylase, l'enzyme limitante de la synthèse des catécholamines dans le corps carotidien. De plus, le contenu en dopamine dans le corps carotidien augmente suite à l’ovariectomie. Ces effets sont associés à une réduction de la ventilation et de la RVH. Ces résultats montrent que les hormones stéroïdiennes sexuelles stimulent la ventilation en réduisant l’effet inhibiteur dopaminergique dans le corps carotidien (Joseph et al., 2002).

De plus, Yamazaki est al. ont examiné les effets de l’injection intrapéritonéale (i.p.) de la progestérone (1 et 30 mg / kg) sur les événements apnéiques durant le sommeil chez des rats mâles âgés de 4, 14 et 26 semaines en mesurant la ventilation par pléthysmographie en corps entier. Les résultats de cette étude ont indiqué une augmentation de la fréquence et de la durée des apnées post-soupirs et spontanée avec la progression de l’âge. Les effets de la progestérone varient selon la dose et l’âge des rats. À une faible dose (1 mg/kg), la progestérone diminue de manière significative le nombre des apnées spontanées et des apnées post soupirs d’une manière âge-dépendante sans affecter la durée des apnées, ni la fréquence respiratoire basale, ni le temps total de sommeil. Une dose plus élevée (30 mg/kg) de la progestérone n'a eu aucun effet sur le nombre des deux types d’apnées, alors qu'elle a

prolongé la durée de l’apnée post-soupir et le temps de sommeil total sans affecter la fréquence respiratoire basale (Yamazaki et al., 2005).

Donc, la fonction respiratoire est influencée par la progestérone. Cette dernière agit au niveau central et périphérique du système de contrôle respiratoire pour stimuler la ventilation (Bayliss et al., 1987; Bayliss et al., 1990; Hannhart et al., 1990; Joseph et al., 2012). Toutefois, les mécanismes expliquant ses effets respiratoires ne sont pas encore bien élucidés.

Les mécanismes expliquant les effets respiratoires de la progestérone

Nomenclature des récepteurs de la progestérone (PR)

La progestérone peut agir par une voie de signalisation classique impliquant des récepteurs nucléaires ou par une voie non classique impliquant des récepteurs localisés au niveau de la membrane cytoplasmique (Faivre et al., 2005; Losel et al., 2005; Brinton et al., 2008) (Figure 25).

Figure 25: Un schéma illustrant les multiples récepteurs impliqués dans les actions de la progestérone et de l'alloprégnanolone au niveau du système nerveux.

La progestérone peut se lier à des récepteurs nucléaires (nPR) et à des récepteurs localisés dans la membrane plasmique incluant la famille des récepteurs membranaires de la progestérone (mPR) et les PGRMC-1 (progesterone receptor component-1). En outre, la progestérone peut être convertie en 5α-dihydroprogestérone (5α-DHP) puis en allopregnanolone dans le cerveau. L'alloprégnanolone peut lier et modifier le flux ionique à travers les récepteurs GABA-A. Adaptée de (Cooke et al., 2013).

Actions de la progestérone par la voie classique

A. Structure et fonctionnent du récepteur nucléaire de la progestérone (nPR)

Les actions classiques de la progestérone s’effectuent par les récepteurs nucléaires (nPR). Les nPR sont des membres de la famille des récepteurs des hormones stéroïdiennes appartenant à la superfamille des facteurs de transcription activés par un ligand, agissant pour activer ou réprimer la transcription de gènes cibles (Brinton et al., 2008). Ces récepteurs possèdent une affinité élevée pour la progestérone (Kd 0.3 nM, Kd : constante de dissociation) (MacLusky & McEwen, 1980). Chez plusieurs espèces, les nPR sont exprimés principalement sous deux isoformes appelées le nPR-A (72-86 kDA) et nPR-B (110-120 kDA) codées par un seul gène localisé dans le chromosome 11 chez l’homme et 9 chez la souris. Cependant, ces deux isoformes sont transcrites par deux promoteurs distincts (Kastner et al., 1990; Conneely et al., 2003).

Les nPR-A et nPR-B ont en commun les domaines de la fonction activatrice (AF), AF1 et AF2. Le rôle des AF est de stimuler ou d’inhiber l’activité transcriptionnelle en modulant l’interaction avec les corégulateurs. Le nPR-B contient un segment spécifique appelé AF3 ou domaine BUS (B-upstream segment) constitué de 164 acides aminés en plus dans la région N terminale, qui est absent dans l’isoforme nPR-A (Grimm et al., 2016) (Figure 26). Comme tous les récepteurs nucléaires, les isoformes du PR sont composés d’un domaine N terminal contenant le domaine de liaison à l’ADN (DBD), un domaine C terminal et un domaine de liaison au ligand (LBD) (Figure 26). Un troisième isoforme appelé le nPR-C de 45-50 kDA est identifié dans des cellules du cancer du sein. Cette isoforme est tronquée au niveau de l’extrémité N terminal, il possède le LBD, mais il lui manque le domaine de fixation à l’ADN (Wei et al., 1997) (Figure 26).

nPR-B

nPR-A

nPR-C

Figure 26: Structure des isoformes des récepteurs nucléaires de la progestérone ; le nPRA et nPRB et le nPRC. Le PR-A est tronqué au niveau de la région N terminale de 165 acides aminés (BUS), cette région héberge la AF3 (fonction activatrice-3), alors que le nPR-B constitue l’isoforme le plus long. Le nPR-B possède trois fonctions activatrices AF-1, AF-2 et AF-3. Les isoformes de nPR-A, comme nPR-B, sont composés d’un domaine N terminale (NTD), d’un domaine de liaison à l’ADN (DNA Binding Domain – DBD) et un domaine de liaison au ligand. Le nPR-C est tronqué au niveau de l’extrémité N terminal, il possède le LBD, mais il manque la DBD (Grimm et al., 2016).

En absence de la progestérone (le ligand), les PR sont localisés dans le cytoplasme. À ce niveau, les PR sont associés à des protéines chaperonnes de choc thermique (« heat shock proteins »: HSP 70 et 90) (Smith et al., 1995) qui les maintiennent dans un état stable, inactif et les protègent de la dégradation par le protéasome dans le cytoplasme (Pratt et al., 1999) (Figure 25).

À l’instar des autres hormones sexuelles, dont l'œstrogène et la testostérone, la progestérone est lipophile, et ainsi peut diffuser librement à travers la membrane plasmique dans le cytosol et le noyau, où elle interagit avec ses récepteurs (Brinton et al., 2008). En présence de la progestérone, la liaison des PR à la progestérone entraîne leurs dissociations des HSP. Ensuite, les récepteurs forment des dimères et transloquent vers le noyau où ils se lient aux éléments de réponse palindromiques (PRE) dans les promoteurs des gènes cibles pour réguler leur expression, par conséquent, réguler les fonctions des cellules (Faivre et al., 2005; Brinton et al., 2008). De plus, le promoteur proximal contrôlant la transcription des nPR-A et nPR- B contient des éléments de réponse à l’œstrogène, qui se lient à des récepteurs de l’œstrogène. Ceci explique que le niveau d’expression des nPR est fortement augmenté en réponse à l’estradiol au niveau de l’utérus, de l’hypophyse et de l’hypothalamus (Brinton et al., 2008) (Figure 25).

A. Les rôles respiratoires des nPR

Plusieurs études expérimentales ont démontré que la progestérone signale par les nPR pour exercer certains de ses effets respiratoires.

Bayliss et al. ont montré que l’effet stimulant de l’activité motrice du nerf phrénique induit par la progestérone, administré par voie i.v ou dans le NTS, est inhibé par un prétraitement au RU486 (antagoniste des récepteurs de la progestérone) chez des chats mâles et femelles (Bayliss et al., 1987). En outre, chez les chats ovariectomisées, l’expression des nPR dans le diencéphale est fortement dépendante de l’exposition préalable à l’estradiol. En fait, l’expression des nPR n’est pas détectable en condition normale, mais elle devient très dense après un traitement avec l’estradiol (Bayliss et al., 1991).

Ces travaux ont fourni plus de détails concernant la neuroanatomie de l’action respiratoire de la progestérone. Dans l’ensemble, ces travaux révèlent que la progestérone agit au niveau du système nerveux central par les nPR pour stimuler la ventilation chez le chat. Cette action stimulatrice implique des récepteurs estrogène-dépendants, identifiés dans des zones hypothalamiques. En outre, elle peut impliquerait également des nPR au niveau des centres respiratoires de la médulla oblongata, telle que le NTS (Bayliss et al., 1987; Bayliss & Millhorn, 1991; Bayliss et al., 1991). Effectivement, d’autres études ont indiqué que les nPR sont exprimés au niveau du NTS, du locus coeruleus, de l’hypothalamus (Bayliss et al., 1991; Kastrup et al., 1999; Helena et al., 2006; Brinton et al., 2008) et des corps carotidiens chez des rats adultes (Joseph et al., 2006). Cette présence des nPR au niveau centrale et périphérique est cohérente avec l'hypothèse que la progestérone est impliquée dans le contrôle neuronal de la respiration. De plus, l’effet bénéfique de la progestérone à faible dose sur l’apnée pendant le sommeil mis en évidence dans l’étude de Yamazaki et al (décrit à la fin de la section 4.2.2.2), est inhibé lorsque les rats sont prétraités avec un antagoniste des récepteurs de la progestérone (mifepristone). Ces résultats indiquent que la signalisation de la progestérone à faible dose (1 mg/kg) implique les nPR pour contrer les apnées liées au sommeil chez le rat (Yamazaki et al., 2005).

Actions de la progestérone par la voie non classique

A. Structure et fonctionnement des récepteurs membranaires de la progestérone

Plusieurs actions de la progestérone sont très rapides (quelques minutes) et ne peuvent pas être expliquées par des mécanismes génomiques ; des voies qui se mettent en place en 30-45 minutes. La progestérone possède également des voies de signalisation alternatives (non classique), qui sont rapides et initiées au niveau de la membrane cytoplasmique. Elles se produisent sur une échelle de temps de quelques minutes. Ces voies non classiques impliquent l’activation des récepteurs membranaires ainsi que les voies de signalisations qui leur sont associées (Revelli et al., 1998; Watson & Gametchu, 1999; Norman et al., 2004).

Plusieurs processus physiologiques impliquent les récepteurs de la progestérone liés à la membranaire plasmique, tels que l’action de la progestérone sur la motilité des

spermatozoïdes, la maturation méiotique des oocytes (Zhu et al., 2003a), l’immunorégulation de l’activité des lymphocytes (lymphocyte T et macrophage) (Dosiou et al., 2008; Lu et al., 2015), un rôle régulateur dans le cancer du sein (Dressing et al., 2011; Dressing et al., 2012) ainsi que des rôles cardiovasculaires (Pang et al., 2015).

L’utilisation de la progestérone conjuguée à l’albumine au niveau de la position 3-ketone ou 11 alpha hydroxyl (BSA-3-progestérone) a fourni des preuves expérimentales de ses effets au niveau de la membrane cytoplasmique. À savoir que le conjugué BSA-3-progestérone n’est pas lypophile et ne peut pas donc pénétrer à l’intérieur des cellules. Au niveau du système nerveux central, la BSA-3-progestérone induit une modification de la signalisation cellulaire en quelques minutes, suggérant des actions de la progestérone initiées au niveau de la membrane plasmique (Zheng et al., 1996; Bashour & Wray, 2012). Par exemple, une infusion du conjugué BSA-3-progestérone au niveau de l’hypothalamus de rat démontre une forte affinité de fixation sur des fractions membranaires du cerveau de rat, avec un Kd de 28.5 +/- 2.1 nM. De plus, ce conjugué stimule la libération de l'hormone lutéinisante hypothalamique (LH). Ces résultats indiquent que la progestérone possède des récepteurs membranaires pour moduler les fonctions spécifiques du système nerveux (Ramirez et al., 1990).

La progestérone se lie à plusieurs types de récepteurs membranaires incluant : i) les récepteurs membranaires de la progestérone (mPR) qui constituent une famille de 5 isoformes (α, β, γ, δ, ξ), ii), le récepteur membranaire de la progestérone composant 1 (PGRMC-1 pour « progesterone receptor component-1 ») et le PGRMC-2 (Smith et al., 2008; Thomas, 2008; Pang et al., 2013). De plus, la progestérone peut moduler indirectement le récepteur GABA-A, via son métabolite neuroactif l’alloprégnanolone (Faroni & Magnaghi, 2011) (Figure 25).

A.1. Récepteurs membranaires de la progestérone (mPR)

Une étape importante dans la compréhension des actions rapides de la progestérone est atteinte avec la découverte des mPR en 2003. Les mPR sont des protéines d’environ 40 kDA

qui appartiennent à la classe II de la famille des récepteurs de progestine et des adipoQ (PAQR). Plusieurs sous-types de mPR ont été identifiés chez les vertébrés (Zhu et al., 2003a; Zhu et al., 2003b), ils sont nommés : mPRα (PAQR7), mPRβ (PAQR8), mPRγ (PAQR5), mPRδ (PAQR6), mPRε (PAQR9) (Thomas & Das, 1997; Thomas, 2008). Ces récepteurs possèdent une haute affinité pour la progestérone au niveau de la membrane cytoplasmique (Kd 5nM) (Thomas & Das, 1997; Thomas, 2008).

L’ADN copie (ADNc) des trois mPR (mPRα, mPRβ et mPRγ) est cloné pour la première fois à partir d’ovaires de la truite de mer (Zhu et al., 2003b), puis à partir de plusieurs vertébrés incluant les humains et la souris (Zhu et al., 2003a). L’analyse de la séquence d’acides aminés a démontré que ces récepteurs sont des protéines à sept segments transmembranaires couplés à une protéine G (Figure 25). Les mPRα, mPRβ et mPRγ sont couplés à la protéine Gi (G inhibitrice) et leur activation conduit à la suppression de l’activité de l’adénylate cyclase et une réduction de la production de l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). Tandis que mPRδ et mPRε sont couplés à la protéine Gs (G stimulatrice) (Zhu et al., 2003a; Zhu et al., 2003b; Thomas, 2008; Petersen et al., 2013).

A.2. Autres récepteurs membranaires la progestérone

Le PGRMC-1 et le PGRMC-2 sont deux protéines transmembranaires uniques. Le PGRMC- 1 est une protéine a un seul segment transmembranaire de 26 à 28 Kda (Figure 25). Il est identifié pour la première fois à partir du foie de porc. Ce récepteur possède des sites de fixation à la fois de forte affinité (Kd 11 nM) et de faible affinité (Kd 286 nM). Le PGRMC- 1 est exprimé au niveau du système nerveux central. Son activation par la progestérone conduit à une cascade de signalisation intracellulaire (Thomas, 2008).

B. Les rôles respiratoires des récepteurs membranaires de la progestérone

Un effet direct de la progestérone sur les activités neuronales est démontré en utilisant des coupes de tronc cérébral de rat incluant le NTS (Pascual et al., 2002). L’activité synaptique, l'électro-réactivité intrinsèque des neurones et la chémosensibilité centrale ont été testées en normoxie et en réponse à l’hypoxie avec et sans traitement par la progestérone (Pascual et

al., 2002). L’hypoxie a provoqué deux types d’effets au niveau du NTS : une hyperpolarisation et une diminution de la résistance et de l'activité spontanée dans la majorité des neurones enregistrés. Tandis que, dans d’autres neurones, l'hypoxie a provoqué une dépolarisation et une augmentation de l'activité spontanée. Dans tous les neurones enregistrés, les potentiels synaptiques évoqués par la stimulation du NTS sont diminués par l'hypoxie. En normoxie, la progestérone à 1 µM n'a induit aucun effet. Cependant, elle a partiellement inversé toutes les réponses neuronales induites en réponse à l’hypoxie. Cet effet s'est développé en 2-3 minutes et s'est reversé en 5 minutes lorsque la progestérone n’est plus présente. En comparaison avec la voie classique impliquant la transcription génique et la synthèse de nouvelles protéines, ces effets rapides de la progestérone suggèrent un mécanisme d'action non génomique, c.-à-d. une voie non classique (Pascual et al., 2002).

Les mPR sont largement exprimés au niveau du système nerveux : cerveau et moelle épinière. En particulier, les ARN messager (ARNm) et les protéines des mPRα et le mPRb présentent une large expression et distribution dans le cerveau chez les souris adultes mâles et femelles (Meffre et al., 2013; Kasubuchi et al., 2017). Le mPRb est principalement exprimé au niveau central, au niveau des structures hypothalamiques et de l’hippocampe chez le rat et la souris (Zuloaga et al., 2012; Kasubuchi et al., 2017) (Figure 27).

Figure 27: Illustration de la localisation du mPRb au niveau du système nerveux central chez un embryon de souris et une souris jeune adulte (49 jours).

Noter la localisation du mPRb au niveau du cerveau et la moelle épinière d’un embryon de souris et sur des coupes transversales au niveau de l’hypothalamus de souris mâle (coupe supérieure) et femelle (coupe inférieure). Le marquage est réalisé par hybridation in situ avec une sonde antisens d'ARN mPRb de souris marquée au S35. Des grains rouges superposés sur une coloration hématoxyline-éosine indiquent la localisation de l'ARNm de mPRβ (Kasubuchi et al., 2017).

De plus, le mPRα et le mPRb sont localisés dans les régions impliquées dans la respiration au niveau du tronc cérébral, notamment au niveau du NTSc et NTSr, des NM vague (NM X) et hypoglosse (NM XII) (Boukari et al., 2015), et dans la moelle épinière (Labombarda et al., 2010).

L’ensemble des informations indique que la progestérone est un stimulant du chémoréflexe centrale et périphérique ventilatoire et favorise la stabilité respiratoire chez l’adulte. Ces effets impliquent la signalisation de la progestérone par le nPR. De plus, il est également suggéré que la signalisation par des récepteurs localisés au niveau de la membrane plasmique serait impliquée.

À l’instar de l’adulte, le nouveau-né notamment né prématuré développe également des apnées. Ce point est l’accent de la prochaine section (Zhao et al., 2011; Martin & Wilson, 2012; Spitzer, 2012).

La pathophysiologie de l’apnée du nouveau-né

La définition de l’apnée du nouveau-né

Ce type d’apnée est définie par l'académie américaine de pédiatrie comme un épisode inexpliqué d’arrêt ventilatoire pendant 20 secondes ou plus, ou une pause ventilatoire plus courte associée à une désaturation artérielle en O2 (SaO2 ≤ 80% pendant ≥4 s) avec une bradycardie (fréquence cardiaque < 2/3 de la ligne de base pendant ≥4 s), une cyanose, une pâleur ou une hypotonie. Elle est très fréquente chez les prématurés c.-à-d. moins de 37 semaines d’aménorrhée. Dans ce cas, elle est connue sous le terme d’apnée du prématuré (Moriette et al., 2010; Eichenwald et al., 2016).

Épidémiologie de l’apnée du nouveau-né

L’incidence de l’apnée du prématuré est inversement proportionnelle à l’âge gestationnel. Les chances de développer l’apnée du prématuré sont de 7% chez les prématurés nés entre 34 et 35 semaines d’aménorrhée, 15% chez des prématurés nés entre 32 et 33 semaines d’aménorrhée et 54% chez des prématurés nés entre 30 et 31 semaines d’aménorrhée et presque tous les prématurés nés à moins de 29 semaines d’aménorrhée. Chez le nouveau-né à terme (plus de 40 semaines de gestation) l’apnée est un phénomène rare (Morrison et al., 2003; Stokowski, 2005; Eichenwald et al., 2016).

Les types d’apnée chez le nouveau-né

Comme chez l’adulte, les nouveau-nés peuvent avoir trois types d’apnées, à savoir : obstructive, centrale et mixte. Le dernier type étant le plus fréquent (Finer et al., 1992; Stokowski, 2005). L’incidence de l’apnée obstructive est estimée à 10.5 %, l’apnée centrale à 39.9 %, alors que l’apnée mixte 49% (Finer et al., 1992).

Comme chez l’adulte, l’apnée du prématuré entraîne des épisodes de désaturations en O2 qui peuvent avoir des conséquences néfastes à court et long terme (Poets, 2010). De plus, il est

suggéré que la mort subite du nourrisson peut être dû à l’incapacité du nouveau-né de se réveiller lors de l’apnée prolongée (Horne et al., 2001; Kahn et al., 2003).

Les mécanismes physiopathologiques de l’apnée de nouveau-né

L’apnée du nouveau-né et particulièrement l’apnée du prématuré est un problème développemental. Les rats nouveau-nés à terme présentent également des irrégularités ventilatoires, souvent associées à des apnées et des bradycardies (Cummings et al., 2009). Ceci est plus prononcé immédiatement après la naissance, au cours des premiers jours de vie et devenant plus régulier avec le temps (Zhou et al., 1996). Au niveau central, le réseau neuronal respiratoire est immature. Cette immaturité s'améliore spontanément à mesure que l’âge postnatal augmente (Henderson-Smart, 1981; Finer et al., 2006). En périphérie, les nouveau-nés prématurés manifestent une hyperactivité du chémoréflexe laryngé et presque tous les nouveau-nés prématurés présentent un reflux gastro-œsophagien. La combinaison de ces deux facteurs peut favoriser l’apparition des apnées (Praud, 2010; Poets, 2013). De plus, les RVH et la RVHC sont immatures, ce qui peut également contribuer à la pathogenèse de l’apnée (Cardot et al., 2007; Darnall, 2010).

La RVH chez le nouveau-né est dite biphasique et se caractérise par une augmentation initiale rapide de la ventilation, suivi par une chute rapide de la fréquence respiratoire. La dépression secondaire de la RVH est plus importante chez le nouveau-né en comparaison avec l’adulte (Mortola et al., 1989) (Figure 28A). La cause de cette phase dépressive n'est pas totalement bien comprise. Ce type de réponse peut persister pendant plusieurs semaines de vie postnatale chez les humains (Gauda et al., 2004) et plusieurs jours chez les rongeurs (Eden & Hanson, 1987; Teppema & Dahan, 2010). Donc, le nouveau-né est plus sensible aux effets inhibiteurs de l’hypoxie.

Figure 28: Les réponses ventilatoires à l’hypoxie et à l’hypercapnie chez le nouveau-né. A : Représentation graphique pour illustrer la comparaison de la réponse ventilatoire à l’hypoxie chez le nouveau-né et l’adulte chez le cochon d’Inde (Funk, 2013). B : Le développement de la RVHC à 5% de CO2 chez le rat Le graphique représente le pourcentage (%) de l’augmentation de la ventilation normalisée par apport à la ventilation durant la normoxie, en fonction de l’âge du rat nouveau-né (en jours). Trois phases sont évidentes dans le développement précoce: (I) une réponse ventilatoire précoce à l'hypercapnie qui diminue pendant la première semaine de vie; (II) une RVHC minimale; (III) une augmentation de la RVHC à des niveaux comparables à ceux des adultes pendant la deuxième semaine de vie (Putnam et al., 2005).

Comme chez l’adulte, l’hypercapnie induit une augmentation de la ventilation chez les mammifères nouveau-nés, en revanche, elle est faible à la naissance surtout chez l'enfant né prématuré (Darnall, 2010).

Putnam a analysé l’évolution temporelle de RVHC chez le rat nouveau-né (Putnam et al., 2005). Il a décrit que cette réponse se produit en trois étapes. Une première étape est caractérisée par une réponse ventilatoire élevée à l'hypercapnie à la naissance qui diminue progressivement jusqu'à la fin de la première semaine de vie. La deuxième étape est caractérisée par une stabilisation à un niveau faible jusqu'au milieu de la deuxième semaine de vie. Vers le 14e jour de vie, la réponse augmente progressivement jusqu’à atteindre un niveau proche de la RVHC chez le rat adulte (Putnam et al., 2005) (Figure 28B).

Par ailleurs, les défaillances ventilatoires peuvent également être liées à l’immaturité des muscles respiratoires et de la coordination entre les mouvements des muscles inspiratoires (diaphragme et intercostaux) et les muscles des VAS (Brozanski et al., 1989; Gaultier, 1995). Le GG est trop faible chez les prématurés en conséquence, le pharynx s'effondre plus facilement lors de la pression négative générée lors de l'inspiration (Gauda et al., 1987; Brozanski et al., 1989). Une fois effondrées, les forces adhésives de la muqueuse ont tendance à empêcher la réouverture de la voie respiratoire pendant l'expiration. Les sécrétions excessives dans le nasopharynx et l'hypopharynx et la flexion du cou peuvent favoriser le développement d'une apnée obstructive (Vialet & Nau, 2009). En outre, comme chez l’adulte, le soupir est un mécanisme important dans le déclenchement de l'apnée chez les nouveau-nés prématurés (Alvarez et al., 1993).

Les principales approches thérapeutiques disponibles en clinique

La thérapie par les xanthines

Depuis des décennies, les méthylxanthines sont administrées aux nouveau-nés prématurés comme un stimulant ventilatoire et un traitement pharmacologique de l'apnée du nouveau-né (Martin et al., 2004). Les xanthines telles que la caféine, la théophylline et l’aminophylline

ont de multiples effets bénéfiques sur la ventilation. Elles stimulent la ventilation minute, diminuent la dépression secondaire de la RVH, augmentent la chémosensibilité au CO2 et réduisent les apnées (Martin et al., 2004; Aranda et al., 2010; Henderson-Smart & Steer, 2010). Le principal mécanisme d'action est le blocage des récepteurs A1 de l'adénosine qui aura pour conséquence une augmentation de l’activité neuronale. Cependant, malgré l’efficacité du traitement à la caféine, un pourcentage important d'apnée persiste, en particulier chez les nouveau-nés nés avant 28 semaines d’aménorrhée (Zhao et al., 2011; Martin & Wilson, 2012).

La ventilation à pression positive continue (CPAP)

La CPAP s’est avérée un traitement efficace pour l’apnée du nouveau-né. La CPAP peut prévenir l'effondrement du pharynx, donc réduire l'incidence de l'obstruction. Elle améliore également la capacité résiduelle fonctionnelle des poumons et l'oxygénation et diminue la bradycardie (De Paoli et al., 2008; Pantalitschka et al., 2009).

Effet de la progestérone sur le contrôle respiratoire chez le nouveau-né

La progestérone figurait parmi les produits à prendre en considération dans de futures recherches dans le cadre d’un éventuel nouveau traitement pour l’apnée du prématuré (Finer et al., 2006). Notre laboratoire s’intéresse à mieux comprendre les effets respiratoires de la progestérone chez les nouveau-nés, ainsi que les mécanismes impliqués. En fait, il a été montré que la progestérone peut stimuler la RVH et réduire la fréquence des apnées chez les rats mâles nouveau-nés. En effet, des ratons âgés de 10 jours de développement postnatal (P10) sont traités à la progestérone à travers le lait maternel pendant une semaine. Les résultats ont indiqué une stimulation de la RVH et une réduction significative de la fréquence des apnées spontanées et post-soupirs en comparaison avec des ratons ayant reçu une solution véhicule (contrôle). Comme chez l’adulte, le blocage des récepteurs D2 de la dopamine au niveau périphérique par une injection de dompéridone augmente la ventilation minute et diminue les apnées dans le groupe contrôle, mais pas chez le groupe traité à la progestérone. Ce qui suggère que les effets respiratoires de la progestérone impliquent une inhibition

dopaminergique au niveau du corps carotidien (Joseph et al., 2002). Dans le même sens, la progestérone aiguë stimule la RVH chez des ratons aux âges postnataux 1, 4, 7 (P1, P4 et P7), mais pas chez les rats P12 (Hichri et al., 2012; Bairam et al., 2013).

La P450scc, l’enzyme clé de biosynthèse de la progestérone, est exprimée dans le système nerveux au niveau central et périphérique chez le rat mâle et femelle durant le développement embryonnaire (Compagnone et al., 1995; Joseph et al., 2006). De plus, les nPR sont détectés dans le cerveau, particulièrement au niveau du noyau ventromédian de l'hypothalamus, ainsi qu’au niveau du corps carotidien chez des ratons. La présence des PR dans le système nerveux en développement suggère l'implication de la progestérone dans les mécanismes fondamentaux du fonctionnement neural et du développement (Quadros et al., 2007; Quadros et al., 2008). Il est donc pertinent d’étudier l’implication des PR et leurs sites d’actions au niveau du système de contrôle ventilatoire pour expliquer ses effets respiratoires. L’activité du nerf du sinus carotidien issu de ratons mâles à P11 et à P14 qui ont été traités quotidiennement avec un antagoniste non spécifique des récepteurs de la progestérone depuis le 3e jour de développement postnatal a été mesurée. Les résultats indiquent une diminution de l’activité du nerf sinus carotidien en réponse à l'hypoxie et à la nicotine. Donc, l’action de la progestérone endogène via ses récepteurs au niveau des chémorécepteurs périphériques est un mécanisme important dans la RVH et la maturation des chémorécepteurs périphériques chez les rats nouveau-nés (Joseph et al., 2012).

En outre, en utilisant des souris knock-out en nPR (PRKO), il est démontré une réduction de la RVH chez les souris mâles à P1 et à P10 et chez les souris mâles et femelles à P10. En revanche, la délétion des nPR n’a pas affecté la fréquence des apnées mesurée en normoxie. Donc, la signalisation par les nPR est un mécanisme clé de la RVH chez les souris nouveau- nées (Potvin et al., 2014).

À la lumière des tous ces informations, il est évident que la progestérone à impact sur la fonction respiratoire au cours du développement postnatal, mais les mécanismes expliquant

ses effets respiratoires sont peu connus. Nous avons quelques informations sur la contribution des nPR, mais le rôle des mPR est inconnu.

Hypothèses et objectifs de recherche

Objectif global

L’objectif général à cette thèse est d’explorer les mécanismes expliquant les effets respiratoires de la progestérone. Précisément, le but est d’étudier la contribution relative des récepteurs de la progestérone (PR); les nPR, le mPRβ et le mPRα dans la régulation de la fonction chémoréflexe ventilatoire.

Hypothèse globale

Nous postulons que les nPR, le mPRβ et le mPRα régulent le chémoréflexe et la stabilité du patron respiratoire chez l’adulte et le nouveau-né, un effet qui peut varier selon de sexe.

Hypothèses et objectifs spécifiques

1. Dans l’étude qui constitue le chapitre 2, l’objectif spécifique est d’étudier l’implication des nPR dans la régulation du chémoréflexe ventilatoire chez la souris adulte. L’hypothèse spécifique est que la progestérone signale par les nPR pour moduler le chémoréflexe ventilatoire chez la souris femelle adulte durant le sommeil. Cette hypothèse est explorée en utilisant les souris femelles knock-out en nPR afin d’évaluer les conséquences de l’absence du nPR dans l’organisme de la souris sur : • La ventilation de base. • Le chémoréflexe ventilatoire. • La stabilité ventilatoire.

2. Dans l’étude qui constitue le chapitre 3, l’objectif spécifique est d’étudier l’implication du mPRβ et le mPRα dans la régulation chémoréflexe ventilatoire chez la souris adulte. L’hypothèse spécifique est que les mPRs au niveau des centres respiratoires du tronc cérébral modulent le chémoréflexe ventilatoire chez la souris mâle et femelle adulte. Cet effet pourrait varier selon le sexe de la souris. La réduction de l’expression des récepteurs cibles est réalisée par une infusion à long terme de petits ARN interférents spécifiques (siRNA) anti-mPRβ ou anti-mPRα au niveau du 4e ventricule afin de cibler les récepteurs exprimés au niveau des centres de contrôles ventilatoires au niveau du tronc cérébral. Les objectifs spécifiques de cette étude sont de déterminer les effets de la réduction de l’expression du mPRβ ou le mPRα sur : • La ventilation de base. • Le chémoréflexe ventilatoire. • La stabilité ventilatoire. • L’existence d’un dimorphisme sexuel dans les rôles du mPRβ ou le mPRα dans le contrôle ventilatoire mature.

3. L’étude qui constitue le chapitre 4, est une revue de synthèse qui résume les données les plus pertinentes des études précédentes ainsi que des données de mon laboratoire. En outre, des données complémentaires à l’étude du chapitre précédent sont rapportées dans cet article. En fait, nous étions intrigués par l’effet profond du traitement par le siRNA anti- mPRβ sur la RVH. L’objectif spécifique est de tester la

chémosensibilité périphérique à l'O2 après le traitement par le siRNA anti-mPRβ. L’hypothèse spécifique est que la réduction de l’expression du mPRβ a altéré le fonctionnement du chémoréflexe périphérique. Cette hypothèse est testée en exposant un nombre complémentaire des souris traitées par le siRNA anti-mPRβ à une brève hyperoxie.

4. Dans l’étude qui constitue le chapitre 5, l’objectif spécifique est d’évaluer l’implication des nPR, mPRβ et le mPRα dans le chémoréflexe ventilatoire chez le rat nouveau-né. L’hypothèse spécifique est que la réduction de l’expression des nPR,

mPRβ ou le mPRα dans le système nerveux central, affecte le chémoréflexe ventilatoire chez des rats nouveau-nés âgés de 10 jours (P10). La réduction de l’expression des récepteurs cibles est réalisée par des injections aiguës des siRNA spécifiques anti-nPR, anti-mPRβ ou anti- mPRα dans la cavité de la cistérna magna afin de réduire spécifiquement l’expression de ces récepteurs au niveau du tronc cérébral. Les objectifs spécifiques de cette étude sont de déterminer les effets de la réduction de l’expression du nPR, mPRβ ou le mPRα sur: • La ventilation de base. • Le chémoréflexe ventilatoire. • La stabilité ventilatoire. • L’éventuel rôle du mPRβ ou le mPRα dans le contrôle ventilatoire chez le rat nouveau-né pourrait être différent entre les ratons mâles et femelles.

The nuclear progesterone receptor reduces post-sigh apneas during sleep and increases the ventilatory response to hypercapnia in adult female mice.

François Marcouiller, Ryma Boukari*, Sofien Laouafa*, Raphael Lavoie, Vincent Joseph.

*: equal contributions from RB and SL.

Department of Pediatrics and Research Centre CHU de Québec, Université Laval. Québec (QC), Canada.

Published in Journal of PLOS ONE, June 19th, 2014, Volume 9, Issue 6: e100421.

Résumé

Nous postulons que le récepteur nucléaire de la progestérone (nPR) est impliqué dans le contrôle respiratoire. Des souris femelles adultes portant une mutation du gène nPR (PRKO) et des souris contrôles de type sauvage (WT) sont traitées avec une solution véhicule ou de la progestérone. Les souris sont instrumentées avec des électrodes électroencéphalographie et électromyographie des muscles posturaux pour caractériser les états de vigilance. Les animaux sont placés dans la pléthysmographie à corps entier pour enregistrer la ventilation en normoxie, hypercapnie, hypoxie et à l'hypercapnie hypoxique. Les PRKO présentent des fréquences plus élevées de soupirs et d'apnées post-soupir pendant le sommeil non-REM. La progestérone stimule la ventilation en hypercapnie chez les WT, mais pas chez les PRKO. Nous concluons que le nPR réduit la fréquence de l'apnée pendant le sommeil non-REM et stimule la réponse ventilatoire à l'hypercapnie après le traitement à la progestérone chez les souris femelles adultes.

Abstract

We tested the hypothesis that the nuclear progesterone receptor (nPR) is involved in respiratory control and mediates the respiratory stimulant effect of progesterone. Adult female mice carrying a mutation in the nPR gene (PRKO mice) and wild-type controls (WT) were implanted with an osmotic pump delivering vehicle or progesterone (4 mg/kg/day). The mice were instrumented with EEG and neck EMG electrodes connected to a telemetry transmitter. The animals were placed in a whole-body plethysmograph 7 days after surgery to record ventilation, metabolic rate, EEG and neck EMGs for 4 consecutive hours. The animals were exposed to hypercapnia (5% CO2), hypoxia (12% O2) and hypoxic-hypercapnia

(5% CO2 + 12% O2 – 5 min each) to assess chemoreflex responses. EEG and EMG signals were used to characterize vigilance states (e.g., wake, non-REM, and REM sleep). PRKO mice exhibited similar levels of minute ventilation during non-REM and REM sleep, and higher frequencies of sighs and post-sigh apneas during non-REM sleep compared to WT. Progesterone treatment increased minute ventilation and metabolic rate in WT and PRKO mice during non-REM sleep. In WT mice, but not in PRKO mice, the ventilation under hypercapnia and hypoxic hypercapnia was enhanced after progesterone treatment. We conclude that the nPR reduces apnea frequency during non-REM sleep and enhances chemoreflex responses to hypercapnia after progesterone treatment. These results also suggest that mechanisms other than nPR activation increase metabolic rate in response to progesterone treatment in adult female mice. Key words: Progesterone receptor, control of breathing, sleep, sighs, hypoxia, hypercapnia.

Introduction

Progesterone has a respiratory stimulant effect (Dempsey et al., 1986; Joseph et al., 2013). Clinical studies have established that progesterone administration reduces apnea frequency in adult women (Young et al., 2003), and progesterone in combination with estradiol treatment after menopause reduces apnea and desaturation events during sleep (Shahar et al., 2003). Progesterone acts on the hypothalamus (Bayliss et al., 1990), nucleus tractus solitarius (Bayliss et al., 1987) (NTS - the major site of peripheral chemoreceptor integration in the brainstem), and the peripheral chemoreceptors (mainly localized within the carotid bodies) to increase ventilation under normoxic or hypoxic conditions in cats (Bayliss et al., 1987; Bayliss et al., 1990; Hannhart et al., 1990; Shahar et al., 2003; Young et al., 2003; Joseph et al., 2013). The so-called "nuclear" form of progesterone receptors (nPR) is present in these areas (Haywood et al., 1999; Joseph et al., 2006; Brinton et al., 2008). The nPR is a member of the "steroid receptor super-family", and it primarily acts as a transcription factor to increase or reduce the expression of target genes (Brinton et al., 2008). Some experimental results suggest that nPR mediates responses to progesterone injection on phrenic nerve activity in anesthetized cats (Bayliss et al., 1987; Bayliss et al., 1990), apnea frequency in adult rats (Yamazaki et al., 2005), and peripheral chemoreceptor responses to hypoxia in newborn rats (Joseph et al., 2012). However, we have limited information on the contribution of nPR to the regulation of breathing during sleep, or on the response to the stimulation of the chemoreflex pathway by hypoxia or hypercapnia and there is no characterization of the respiratory phenotype in mice lacking nPR expression. In addition, progesterone also binds to specific membrane receptors (Brinton et al., 2008). These membrane receptors include 5 distinct proteins from the "membrane progesterone receptor" family, 2 distinct "membrane-associated progesterone receptor components", and the Na+/K+ ATPase channel (Smith et al., 2008; Thomas, 2008; Morrill et al., 2013; Pang et al., 2013). Structural predictive studies suggest that most of these proteins function as ion channels (Morrill et al., 2013), while membrane progesterone receptors are coupled with intracellular Gi proteins (Smith et al., 2008; Thomas, 2008; Morrill et al., 2013; Pang et al., 2013). Finally, the progesterone metabolite, allopregnanolone, enhances GABA-A receptor activity

(Lambert et al., 2003), which inhibits breathing in fetal and newborn rats (Ren & Greer, 2006).

The relative contributions of these diverse receptors on respiratory control are unknown. The present study asked whether deletion of nPR in adult female mice alters breathing. To test this hypothesis, we used mice carrying a null mutation of the gene encoding the nPR protein (PRKO mice) and their wild-type (WT) controls (Ismail et al., 2002). In addition, we postulated that progesterone treatment in PRKO mice would reveal effects on respiratory control if other types of progesterone binding proteins are involved in these responses. WT and PRKO mice were treated for 7 days with progesterone or vehicle to test this hypothesis. We used whole body plethysmography to measure the frequency of sighs (a typical breathing pattern, often followed by apneas) and post-sigh apneas during non-REM sleep (assessed by EEG and EMG) to verify the potential effects of progesterone on breathing stability during sleep. The mice were exposed to hypoxia, hypercapnia, and hypoxic-hypercapnia to estimate chemoreflex responses.

Material and Method

Animals

This study was performed in strict accordance with the recommendations of the Canadian Council on Animal Care. The committee on the protection of animals of the CHUQ Research Center approved the protocol (Permit Number: 2012-023 for the experimental protocol, and 2012-024 for the colony of PRKO mice). All efforts were made to minimize suffering, reduce the number of animals used, and provide enrichment in housing conditions. WT and PRKO adult female mice (3-5 months old) were obtained from our breeding colony (the founders of the colony were a generous gift from J. Lydon –Baylor College of Medicine – Houston, TX, USA). Homozygous (nPR-/-) females exhibit numerous defects in reproductive tissues, including the inability to ovulate, uterine hyperplasia and inflammation, limited mammary gland development, and a lack of sexual behavior. Therefore, the colony was maintained by mating heterozygous females with PR-/- males.

The genotypes of adult female mice were determined before the experiments using genomic DNA extracted by boiling ear punches in an alkaline solution (30 min, 95°C). A total of 1 µl of DNA was used for PCR amplification using a Taq DNA polymerase (New England Biolab, Ipswich, MA, USA). The following primers were used: PrlacZ (5’-ctt cac cca ccg gta cct tac gct tc-3’), P1 (5’-tag aca gtg tct tag act cgt tgt tg-3’), and P3 (5’-gat ggg cac atg gat gaa atc- 3’). The presence of the PCR products was detected using agarose (1.7%) gel electrophoresis with a DNA gel stain and DNA ladder. The primer pair of P1 and P3 amplified a 590-bp band in PR+/+ mice, and the primer pair of P1 and PRlacZ amplified a 148-bp band in PR-/- mice (Lydon et al., 1995; Ismail et al., 2002).

Instrumentation for sleep recordings

We used a total of 60 mice for this study, and 30 of them underwent simultaneously recording of breathing parameters and EEG/EMG traces. The other 30 mice were not instrumented for EEG/EMG recordings. One week before recording, the animals were instrumented under

isoflurane anesthesia with cranial and neck electrodes connected to a telemetry emitter (PhysioTel® F20-EET probe, Data Science International - DSI, New Brighton, MN, USA, bandwidth of transmitted data: 1-50 Hz) placed in the peritoneal cavity for EEG and EMG recordings. All procedures to install the electrodes were performed according to the instructions provided by DSI. Briefly, EEG and EMG electrode wires were routed under the skin from the peritoneal cavity, and the mice were placed on a stereotaxic frame. We inserted screws through the skull + 1-mm lateral to midline/+ 1-mm to bregma, and -1-mm lateral to midline/– 3-mm to bregma. The bare ends of EEG electrodes were tightly wrapped around the screws, and the skull and EEG electrodes were covered with dental cement. In this configuration, the caudal electrode over the hippocampus recorded theta oscillation characteristics of REM sleep and exploratory behavior, and the rostral electrode over the frontal cerebral cortex recorded EEG slow waves that are characteristic of NREM sleep (Mang & Franken, 2012). The bare ends of EMG electrodes were placed in the neck muscles at the base of the skull, 2-3 mm apart.

An osmotic pump filled with progesterone or vehicle solution was implanted in a subcutaneous pocket in the back of all the studied animals (Alzet pump model 1007D, reservoir volume 100 µl, flow rate 0.5 µl/hr). The dose of progesterone corresponded to a daily administration of 4 mg/kg for 7 days.

Recording of respiratory and metabolic parameters

On the day of recording, the animals were housed in a whole-body, flow-through plethysmograph chamber for adult mice (Emka Technologies, Paris, France). The chamber was constantly flushed with room air (250 ml/min), and a sub-sampling pump (75 ml/min) was used to collect out-flowing air. A built-in pneumotachograph measured airflow related to breathing. Before the experiment, the chamber was calibrated via measurement of the airflow generated by the rapid injection of 0.5 ml of air. Water pressure, CO2 and O2 levels in the out-flowing air were continuously measured using specific gas analyzers (RH-300, CA-10 and FC-10, Sable Systems, Las Vegas, NV, USA) calibrated using a certified dry gas mix (Linde Canada Limité, Vanier, Qc, Canada). The temperature of the plethysmograph

chamber was recorded with a thermocouple, and the body temperature of the mouse was recorded via the telemetry probe or rectal temperature measured at the end of the recording. The telemetry signals were transmitted through a receiver and adapter (RPC-1 PhysioTel® receiver, DL-10 adapter, DSI) to provide analog signals for EMG, EEG, and animal temperature. All signals were digitized (Micro 1401 data acquisition system, Cambridge Electronic Design, Cambridge, England) and stored on a computer running Spike 2 software (version 7.06 - CED). Measurements of sleep and breathing were performed continuously between 9:00 and 13:00. Acute respiratory stimuli: Once the continuous recordings were completed, mice were sequentially exposed to hypercapnia (5% CO2), hypoxia (12% O2), and hypoxia + hypercapnia for 5 minutes each, separated with normoxia for 5 minutes. Mice were asleep just before exposure, but most mice were awakened by the hypoxia or hypercapnia. We only analyzed portions of respiratory traces during which the breathing trace was regular. The animals were sacrificed, and a sample of blood was collected, kept at room temperature for 5 minutes, and centrifuged for 5 minutes at 13 000 rpm. The serum was immediately separated and stored at −80 °C for further analysis. Serum progesterone assays were performed from each sample using in duplicate an enzyme immunoassay kit in accordance with the manufacturer’s instructions (Progesterone EIA kit, ref: 582601, Cayman Chemical, Michigan USA; detection limit 10 pg/ml; 50% sensitivity at 70 pg/ml).

Data analysis

Determination of sleep/wake states and EEG spectral density analysis.

EMG and EEG signals were used to classify sleep/wake states with a sleep scoring script in Spike 2, based on a previous study (Costa-Silva et al., 2012). The states are scored using epochs of 20 seconds divided into 5-second segments. Each segment is classified as wakefulness, non-REM sleep, or REM sleep, and each epoch is classified according to the predominant score of the segments and neighbor segments, see for details. We reported the % of time spent awake in non-REM sleep, REM sleep, and in non-determined states during the recording. For the analysis of the EEG’s spectral density, the EEG channel was subjected to a Fast Fourier Transform with a Hanning window, and the spectral densities for the

following bands were calculated: δ (2 – 4 Hz); θ (4 – 7.5 Hz); α (7.5 – 13.5 Hz); β (13.5 – 35 Hz) and reported for each state (e.g., Wake, Non-REM, REM sleep). Non-REM sleep in mice that were not instrumented with electrodes for EEG/EMG recordings was determined as a long period (> 10 minutes) of stable and regular breathing (Figure 29). REM sleep was determined as brief periods (30-60 seconds) of irregular breathing with higher respiratory frequency and lower tidal volume compared to non-REM sleep. The REM sleep episodes typically occurred during a longer period of non-REM sleep (Figure 29). There was no difference between the values obtained in each state between the animals in which we determined sleep state using EEG/EMG traces and the animals in which we had no EEG/EMG recordings.

Respiratory and metabolic parameters.

Episodes of non-REM and REM sleep were selected for each animal. Metabolic parameters and body temperature were not calculated during REM-sleep because most episodes were of short duration, which prevented the adequate equilibration of respiratory gases. Respiratory traces were analyzed to determine the frequency (fR, breaths/min), tidal volume (VT, ml),

 E and minute ventilation ( V = fR x VT). Vt was obtained via integration of the negative downward deviations of the flow trace and corrected using a standard equation (Lighton &

Halsey, 2011). O2 consumption and CO2 production rates were calculated using the following equations :

flow × ⎡ O − O − O × CO − CO ⎤ ⎣( 2in 2out ) 2out ( 2out 2in )⎦ O2consumption = 1− O ( 2out )

⎡ CO − CO − CO × O − O ⎤ ⎣( 2out 2in ) 2out ( 2in 2out )⎦ CO2 production = flow × , 1− CO ( 2out )

where "flow" is the flow of air measured before entry into the chamber, "O2 in" and "CO2 in" are the gas fractions in the inflowing air (considered at 20.9% and 0.038%, respectively), and

"O2out" and "CO2 out" are the gas fractions measured in the outflowing line. In these

equations, O2 and CO2 concentrations were corrected with the following term:

PB PB − PH O P PH O ( 2 ), where B is barometric pressure, and 2 is the partial pressure of water in the inflowing or outflowing air. This correction compensates for the diluting effect of water pressure on measured O2 and CO2 levels (Melanson et al., 2010). The ventilatory equivalent for oxygen and carbon dioxide exchange was calculated as ( V! V! and V! V! ). The E O2 E CO2 respiratory quotient (RQ) was calculated as CO2 production / O2 consumption. Tidal volume, minute ventilation, oxygen consumption and CO2 production were expressed as units per 100 g body weight.

Respiratory responses to hypoxia and hypercapnia were analyzed 3-5 minutes after the onset of exposure by selecting periods of stable breathing patterns without movements (assessed by EMG and a stable breathing pattern). All responses were normalized as a % increase compared to a baseline value measured before the exposure to test gas.

Sigh and post-sigh apnea frequency.

Sighs are characterized by a profound inspiration with a volume that is at least twice the normal tidal volume, and a rapid expiration that can be followed by apneas (2 missed breath) (Nakamura et al., 2003). We determined the frequency of sighs and of post-sigh apneas as performed previously in newborn rats (Lefter et al., 2007). We selected a period of non-REM sleep lasting 20 to 30 minutes that contained approximately 10 sighs for each animal. Post- sigh apneas are defined as a breath with a frequency at least 50% below the mean value of the corresponding group (i.e., 2 missed breaths) that occur a few seconds after the sigh. We reported the mean duration of apnea (in seconds), the frequency of post-sigh apnea (#/hour of non-REM sleep), and the total time spent in apnea (seconds/hour of non-REM sleep).

Statistical Analysis

We used GraphPad Prism software (version 6.0c for Mac OSX) for all analyses. All values are reported as the means ± sem, and the significant P value was set a 0.05. P values are

reported in the figures with the following general pattern: *, **, ***, and **** are used to report P< 0.05, 0.01, 0.001, and 0.0001, respectively.

Two-way ANOVA with repeated measures were performed with group and sleep-state as independent variables. We used one-way ANOVA for values analyzed during one sleep state (metabolic rate). For the EEG power spectrum densities, for each sleep state we performed a two-way ANOVA using frequency band and group. All ANOVAs were followed by Fisher’s LSD test to address specific group effects within each state or the effects of sleep within each group.

Results

Table 1 reports the total number of animals used for each group, their body weight, serum progesterone level one week after the implantation of the osmotic pump, and the time spent in each vigilance state. Figure 29 shows a typical recording with the respiratory trace, EEG, EMG and sleep/wake-state channels, and examples of recordings in each vigilance state. There was a significant interaction between time spent in each vigilance state and group (P=0.03). Compared to WT mice, PRKO mice spent less time awake, and more time in non- REM sleep. Progesterone treatment increased the time spent in non-REM sleep in WT, but not in PRKO mice. During wakefulness, the power density of the low frequency δ band was slightly lower in PRKO mice treated with vehicle compared to other groups (P value for group x frequency band = 0.01 - Figure 3o). No other group differences were apparent for the power densities of the EEG signal. There was no difference between groups on the time spent in each state (Table 1).

Table 1: Body weight (BW, g), serum progesterone concentration (ng/ml), % time spent awake, non-REM, and REM sleep during recordings of respiratory variables

Figure 30: EEG power density (%) during wakefulness, non-REM, and REM sleep in Wild- Type (WT) or PRKO mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog) for 7 days. EEG power bands are as follows: δ(2–4 Hz); θ(4–7.5 Hz); α(7.5–13.5 Hz); β(13.5–35 Hz). **: P<0.01 for PRKO mice treated with vehicle vs. other groups.

Respiratory and metabolic variables during non-REM and REM sleep in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment.

Progesterone treatment increased minute ventilation in WT mice during non-REM and REM sleep (Figure 31 A – P value for group=0.0007). During non-REM sleep, the value of minute ventilation was 113 ± 7 ml/min/100 g in WT mice treated with vehicle and 150 ± 10 ml/min/100 g in WT mice treated with progesterone (P=0.002). This effect was due to a higher tidal volume in WT mice treated with progesterone (0.88 ± 0.05 ml/100 g vs. 0.70 ± 0.05 ml/100 g in non-REM sleep – P=0.006, Figure 31 B). No significant effect of progesterone treatment was observed in PRKO mice for minute ventilation despite a tendency towards higher values during non-REM sleep (129 ± 8 ml/min/100 g vs. 111 ± 8 ml/min/100 g, P=0.07). Minute ventilation was not different between non-REM and REM sleep, but tidal volume was lower and respiratory frequency was higher in REM sleep compared to non-REM sleep (P<0.0001 for both values). The post-hoc analysis showed that tidal volume declined significantly only in WT and PRKO mice treated with progesterone. This result indicates that progesterone specifically increases tidal volume during non-REM sleep compared to REM sleep in WT mice and PRKO mice.

Progesterone treatment increased V! and V! in WT mice (P value for group = 0.004 and O2 CO2 0.002, respectively, Figures 4A-B). V! was 1.93 ± 0.23 ml/min/100 g in WT mice treated O2 with vehicle, and 2.41 ± 0.16 ml/min/100 g in WT mice treated with progesterone (P=0.05). V! was 1.59 ± 0.19 and 2.06 ± 0.16 ml/min/100 g in WT mice treated with vehicle and CO2 progesterone, respectively (P=0.03). Progesterone treatment increased V! in PRKO mice O2

(P=0.04) but not V! (P=0.09). There was no group effect for the oxygen or CO2 convection CO2 ratios, body temperature, or the respiratory quotient (Figures 32 C-F).

Figure 31: Respiratory parameters recorded during non-REM and REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog). A: Minute ventilation (ml/min/100 g), B: Tidal volume (ml/100 g), C: Respiratory frequency (breaths/min). *, and **, respectively P<0.05 and 0.01 for the effect of progesterone treatment in WT or PRKO mice. °, °°, °°°, and °°°°: respectively P<0.05, 0.01, 0.001 and 0.0001 REM sleep vs. non-REM sleep.

Figure 32: Metabolic parameters recorded during non-REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog).

A: Oxygen consumption, B: CO2 production rate ( – : ml/min/100 g - STPD), C: oxygen, D: CO2 convection ratio ( – ), E: respiratory quotient ( ), and F: body temperature (Tb: °C). *: P<0.05 Progesterone vs. vehicle treatment.

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Sigh frequency during non-REM sleep in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment

Sighs were characterized by a sequence of events, including a brief pattern of respiratory instability starting a few seconds before the sigh that was generally accompanied by body movements (assessed by EMG) and a brief arousal (assessed by EEG - see Figure 33 A). EEG arousal occurred even in the absence of body movements (Figures 33 B & C). After the sigh, respiratory frequency declined, and in some cases, apnea or a series of apneas occurred during this period.

Sigh frequency during non-REM sleep was higher in PRKO mice treated with vehicle (27.5 ± 1.7 sighs/hr) compared to WT (21.7 ± 1.4, P=0.02 - Figure 6A), and in PRKO mice treated with progesterone (30.5 ± 1.1 sighs/hr) than in WT mice treated with progesterone (23.9 ± 1.7 sighs/hr, P=0.01). The frequency of post-sigh apneas was higher in PRKO mice treated with vehicle (36.4 ± 6 apneas/hr) compared to WT mice (13.7 ± 3.9 apneas/hr – P=0.006 - Figure 34 B). Despite an apparent trend, the difference in apnea frequency between WT and PRKO mice was not significant in progesterone-treated mice (P=0.16). However, closer examination of the data showed a clear trend of PRKO mice to have a high frequency of post- sigh apnea even after progesterone treatment (Figure 34 C). We performed a Kaplan-Meier analysis followed by a Mantel-Cox log-rank test for curve comparisons because the data set of post-sigh apnea values was clearly skewed (Figure 34 D). This analysis shows a different pattern of apnea frequency in PRKO mice treated with vehicle or progesterone compared to WT mice.

There was no difference of mean duration of post-sigh apnea (PRKO mice treated with vehicle 1.34 ± 0.2 seconds – range 0.84 – 3.33) compared to WT mice treated with vehicle (0.92 ± 0.04 seconds - range 0.80 – 1.09 - Figure 34 E - P value for ANOVA = 0.3, post-hoc P value = 0.09).

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Figure 33: Representative examples of brief wake episodes typically occurring with sigh A (WT mice): Note the irregular breathing pattern, body movements, and reduction of EEG amplitude before the sigh. B (WT) and C (PRKO): when body movements are not present, the amplitude of the EEG briefly decreases before the sigh. C: Note the long post-sigh apnea found in some PRKO animals (see text).

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Figure 34: Sighs and post-sigh apneas during non-REM sleep in WT or PRKO female mice treated with vehicle (Veh) or progesterone (Prog). A: Frequency of sighs (#/hour of non-REM sleep), B: frequency of post-sigh apneas (#/hour– group values), C: individual values of frequency of post-sigh apneas, D: Kaplan Meier curve of post-sigh apnea frequency. E: Mean duration of post-sigh apnea (seconds). F: Total duration of post-sigh apnea (seconds/hour). *, and **P<0.05, and 0.01 PRKO vs. WT mice.

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The total duration of post-sigh apnea was not different between groups (P value = 0.11), however if animals are pooled according to genotype, there is a significant difference between WT and PRKO mice (P = 0.02 - Figure 34 F).

Hypoxic and hypercapnic ventilatory responses in WT and PRKO mice following vehicle or progesterone treatment

Absolute values for tidal volume, respiratory frequency, and minute ventilation recorded during exposure to hypercapnia, hypoxia, and hypoxic-hypercapnia are presented in Table 2. Progesterone treatment increased tidal volume (P Value for group effect <0.0001) and minute ventilation (P=0.0002) under hypercapnia and hypoxic-hypercapnia in WT mice only but had no effect in PRKO mice. Relative (% vs. baseline) changes in minute ventilation, tidal volume, and respiratory frequency in response to each test gas are presented in Figure 35. There was no significant effect of group, but a tendency towards a group x gas level for

 E % V and %VT was observed (P=0.06 for both values). Post-hoc analyses showed that the ventilatory response to hypoxic-hypercapnia was higher in WT mice treated with progesterone compared to PRKO mice treated with progesterone (Figure 35A for % V E and

35B for %VT).

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Figure 35: Ventilatory responses to hypoxia (12% O2), hypercapnia (5% CO2), and hypoxic- hypercapnia (12% O2-5% CO2) in WT or PRKO mice treated with vehicle or progesterone.

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Discussion

Our results indicate that deletion of the nuclear PR enhances the frequency of sighs and post- sigh apneas during non-REM sleep and that the nPR is required to enhance ventilatory responses to hypercapnia and hypoxic-hypercapnia after progesterone treatment. Accordingly, this receptor has an important modulatory effect on the regulation of breathing during non-REM sleep, and on respiratory reflexes. On the other hand, progesterone treatment increased metabolic rate and minute ventilation in WT and, to a lesser extent, in PRKO mice during non-REM sleep. These results indicate that the effects of progesterone on the regulation of breathing likely involve different progesterone receptor types, with each receptor type mediating distinct responses.

Serum progesterone concentration was not significantly increased by progesterone treatment. Similar effects have been described previously with chronic steroid treatment in newborn (Lefter et al., 2008) and adult rats (Fournier et al., 2007), which might be a limitation of the ELISA assay when performed on serum samples without prior extraction of steroids. This observation does not imply that biological responses are not elicited by progesterone treatment. The fact that there is no change in progesterone levels in PRKO mice might indicate a higher concentration of serum components that interfere with the assay, but it might also possibly reflect differences of progesterone metabolism or distribution in PRKO mice.

We mainly used EEG and EMG recordings as a tool to properly identify respiratory events during REM / non-REM sleep. However, there are apparent effects of the genotype and progesterone treatment (only in WT mice) on the time spent awake or asleep, and we also noted a small but significant difference on the EEG power spectrum in awake PRKO mice compared to other groups. While these results were obtained on a limited number of animals, this might likely indicate specific effects of the progesterone receptor on sleep homeostasis that could warrant further specific studies.

PRKO mice exhibit signs of uterine inflammation , and nPR exerts a potent anti-

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inflammatory role in the uterus in response to estradiol and progesterone treatment (Tibbetts et al., 1999). Accordingly, we cannot completely exclude the hypothesis that some of the effects reported in PRKO mice were due to a local or systemic inflammatory process within the respiratory control system.

The nPR belongs to the superfamily of steroid receptors, and this receptor directly interacts with specific response elements in the promoter regions of target genes (Brinton et al., 2008). This receptor is found in several parts of the central and peripheral nervous systems that are involved in breathing control, including the carotid bodies (Joseph et al., 2006), nucleus tractus solitarius (Haywood et al., 1999), and the preoptic, paraventricular, ventromedial, dorsomedial, and arcuate nuclei in the hypothalamus (Brinton et al., 2008). Functional studies support a role for this receptor in respiratory control because the effect of progesterone injection on apneic episodes recorded during sleep (identified by behavioral criteria) in adult rats is abolished by mifepristone (a non-specific antagonist for nPR and glucocorticoid receptors) (Yamazaki et al., 2005). Similarly, previous studies in anesthetized cats showed that i.v. progesterone administration enhances phrenic nerve activity. This effect is not elicited by other steroids, and it is blocked by pre-treatment with mifepristone . In this model of vagotomized and chemodenervated cats, the effects of progesterone on respiratory activity is primarily mediated by the hypothalamus (Bayliss et al., 1990), but the injection of progesterone in the NTS also increases respiratory activity (Bayliss et al., 1987). Chronic treatment with mifepristone in newborn rats abolished carotid body responses to hypoxia , while progesterone treatment in adult cats enhances the carotid body response to hypoxia (Hannhart et al., 1990). Progesterone combined with estradiol in rats enhances ventilation by decreasing the synthesis of the inhibitory neurotransmitter dopamine in the carotid body (Joseph et al., 2002), which is consistent with the effect of the progesterone receptor on the expression of tyrosine hydroxylase (Gonzalez-Flores et al., 2011), the rate-limiting enzyme in dopamine synthesis. While the effects of progesterone on peripheral chemoreceptors would suggest that it increases hypoxic ventilatory response, in adult female rats treated with estradiol + progesterone minute ventilation increases (Brodeur et al., 1986; Joseph et al., 2002; Gonzalez-Flores et al., 2011), but the effects on hypoxic ventilatory response were

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small (Joseph et al., 2002). In adult male rats, progesterone + estradiol treatment increases minute ventilation and hypercapnic ventilatory response (Tatsumi et al., 1991), and etenogestrel (a potent progesterone receptor agonist) enhances response to metabolic acidosis on in-vitro preparation of the central nervous system in newborn rats (Loiseau et al., 2014). Accordingly, the available findings indicate that in adults progesterone mainly increases ventilation under hypercapnic condition, our data indicate that this effects is mediated by the nuclear progesterone receptor.

An additional feature observed in PRKO mice was the higher frequency of sighs and post- sigh apneas during non-REM sleep. Sighs are part of the normal breathing pattern (Bendixen et al., 1964), and they are most likely generated by the activation of pulmonary mechanoreceptors (Larrabee & Knowlton, 1946) or peripheral chemoreceptors (Glogowska et al., 1972), which send afferent inputs into the NTS, which relays these inputs to the central respiratory generator. In the present study, sighs were accompanied by brief awakenings (noted on the EEG and EMG signals), an index of sleep fragmentation and poor sleep quality (Deurveilher et al., 2013). Sighs in human infants are followed by skin vasoconstriction, which is an index of sympathetic activation (Galland et al., 2000). However, vagal tone increases after the sigh (Franco et al., 2003; Vlemincx et al., 2010). Spontaneous sighs in adult humans reduce tension in the trapezius muscle and restore autonomic respiratory control, as evidenced by increased structured breathing variability after the sigh (as opposed to higher random variability before) (Vlemincx et al., 2010). These findings indicate that sighs engage an array of autonomic processes and help maintain breathing stability. Similarly, our recordings indicate that breathing is irregular before each sigh, but it becomes much more regular after the sigh. It is a common observation in rats (Montandon et al., 2006), mice (Nakamura et al., 2003), and human infants (Franco et al., 2003; Montandon et al., 2006; Vlemincx et al., 2010)that sighs might be followed by an apnea, which is likely an inhibitory response initiated by the activation of pulmonary stretch receptors. Since PRKO mice had higher sighs and post-sigh apnea frequency, the processes regulating this specific respiratory pattern and the responses that are elicited by the sighs are likely regulated by nPR either directly, or indirectly.

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Progesterone increased minute ventilation and metabolic rate during sleep in WT and PRKO mice, but V! V! and V! V! were not affected by progesterone treatment, and therefore, E O2 E CO2 it is likely that the higher ventilation is simply an "adjustment" to the higher metabolic rate. Metabolic rate increases during pregnancy (Moore et al., 1987), and combined progesterone and estradiol treatment increases metabolic rate in cats (Hannhart et al., 1990). Our results suggest that this effect is not mediated by the nuclear progesterone receptor, but it may involve non-genomic progesterone receptors. Currently, five different membrane progesterone receptors have been identified (Pang et al., 2013), and these receptors are members of the progestin and adipoQ receptor (PAQR) family. These proteins have 7 transmembrane domains with extracellular and intracellular terminals that confer selective progesterone binding and activation of intracellular Gi proteins (Smith et al., 2008; Thomas, 2008; Pang & Thomas, 2011). Recent computational structural analyses suggest that these receptors might also function as ion channels (Morrill et al., 2013). The first reports on these receptors showed a predominant expression of mPRa in reproductive tissues and mPR bin the brain (Zhu et al., 2003b). In mice, mPRa and mPRb proteins and mRNAs are expressed in the spinal cord with a distinct staining pattern that likely underlies the important trophic and protective effects of progesterone at this level (Labombarda et al., 2010). The mRNAs for mPRa and mPRb in rats are expressed in the cortex and thalamic nuclei (Intlekofer & Petersen, 2011). In addition, progesterone receptor membrane component 1 (pgrmc1) has been identified in the NTS, and in the pre-Bötzinger complex in adult rats (Tan et al., 2012). Finally, a truncated form of the nuclear progesterone receptor that lacks the DNA binding domain is present in mitochondria, and increases oxygen consumption . However if this truncated form of nPR shares the same promoter of the nPR it should also be absent in PRKO mice, so far we have no relevant information on this point. Therefore, these components may also mediate some effects of progesterone on respiratory or metabolic control.

Conclusion

We conclude that the nuclear progesterone receptor plays an important role in respiratory control: it enhances the ventilatory response to hypercapnia and hypoxic-hypercapnia during

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progesterone treatment, contributes to the reduced frequency of sighs during sleep (and likely reduces sleep fragmentation), and reduces the frequency of post-sigh apneas. However, some effects of progesterone are present despite the absence of this receptor, which implicates different receptors in these effects. The elucidation of the roles of these additional progesterone receptors in respiratory control will require additional experiments, which could open new avenues to explain the respiratory stimulant effects of progesterone.

Acknowledgments: The authors acknowledge the support of Mélanie Pelletier for animal care.

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Membrane progesterone receptor b, but not a in dorsal brainstem establishes sex-specific chemoreflex responses and reduces apnea frequency in adult mice.

Ryma Boukari, Orlane Rossignol, Cécile Baldy, François Marcouiller, Aida Bairam, Vincent Joseph*.

Unité de recherche en périnatalogie, Centre Hospitalier Universitaire de Québec, Hôpital Saint-François d’Assise, Département de Pédiatrie, Université Laval, Québec, Canada.

Running title: mPRb, apnea frequency, and chemoreflex in male and female mice

Published in Journal of Applied Physiology, 21s septembre 2016, volume 121, issue 3:781- 791

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Résumé

Nous postulons que les récepteurs membranaires de la progestérone (mPR) contribuent au contrôle ventilatoire chez les souris adultes. Nous avons perfusé pendant 14 jours de petits ARN interférents (siRNA) dirigés contre le mPRα, le mPRβ ou le véhicule dans le quatrième ventricule pour réduire l’expression de ces récepteurs aux niveau des centres du groupe respiratoire dorsal. Nous avons enregistré la ventilation par pléthysmographie à corps entier en normoxie, hypoxie et hypercapnie. En normoxie, le siRNA anti-mPRα et anti-mPRβ a augmenté la fréquence respiratoire chez les mâles. Le siRNA anti-mPRβ a augmenté la fréquence des apnées chez les mâles et chez les femelles. Le traitement par le siRNA anti- mPRβ a réduit les réponses ventilatoires à l'hypoxie et à l'hypercapnie chez les mâles et femelles, tandis que le siRNA anti-mPRα a eu des effets plus limités. Nous concluons que le mPRβ réduit la fréquence de l'apnée chez les souris mâles et femelles.

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Abstract

We tested the hypothesis that membrane progesterone receptors (mPR) contribute to respiratory control in adult male and female mice. Mice were implanted with osmotic minipumps for continuous infusion of small interfering RNA (siRNA) directed against mPRa, mPRb, or a control solution in the 4th ventricle (to target brainstem respiratory areas) for 14 days. We then performed respiratory and metabolic recordings by whole body plethysmography at rest, and in response to hypoxia (12% O2) or hypercapnia (5% CO2 – 5 minutes each). For each treatment, we have verified with immunohistochemistry that the staining intensity of mPRa or mPRb in the brainstem is decreased. At rest, the siRNA against mPRa and mPRb increased respiratory frequency in males only. The siRNA against mPRb almost tripled the frequency of apneas in male and in female mice, while the siRNA against mPRa had no effect. Regarding respiratory chemoreflex, the siRNA against mPRb suppressed the response to hypoxia in male and female mice, and reduced by about 50% the response to hypercapnia, while the siRNA against mPRa had more limited effects. Interestingly, control females had higher ventilatory response to hypoxia and hypercapnia than males and these sex-specific effects were suppressed by the siRNA against mPRb, whereas they were still present after treatment with the siRNA against mPRa. We conclude that mPRb reduces apnea frequency in male and female mice and establishes sex-specific ventilatory chemoreflex.

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New and Noteworthy We tested the hypothesis that membrane progesterone receptors (mPR) contribute to respiratory control in adult male and female mice. The main results show that reduced expression of mPRb (achieved by intra-cerebro-ventricular treatment with siRNA) increases (3x) the frequency of apnea, suppresses the chemoreflex response to hypoxia, and reduces the response to hypercapnia. By contrast mPRa had limited effects, slightly reducing the ventilatory response to hypercapnia.

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Introduction

The prevalence of sleep apnea is higher in men than in women (Block et al., 1979), and its occurrence increases after menopause (Block et al., 1980; Bixler et al., 2001; Young et al., 2003). Although progesterone is not a clinically approved treatment for respiratory disorders, it is a powerful respiratory stimulant (for a recent review, see (Behan & Kinkead, 2011), acting in the central nervous system (Bayliss et al., 1987) and on the peripheral chemoreceptors (Joseph et al., 2002), and reduces the frequency of apnea in postmenopausal women (Shahar et al., 2003). Progesterone exerts its functions through distinct receptor types, but their relative contributions to the respiratory effects of progesterone are not known, thus impeding the development of efficient therapies based on the respiratory stimulant effect of this hormone. The classical form of the progesterone receptor is the ligand-activated transcription factor (or nuclear progesterone receptor - nPR) that is expressed in hypothalamic and brainstem areas, and clear evidences suggest that it contributes to respiratory control (Bayliss & Millhorn, 1991; Haywood et al., 1999; Behan & Thomas, 2005). In adult female mice the deletion of nPR (PRKO mice) results in higher frequency of apnea during sleep, and while in control wild-type mice progesterone administration increased the ventilatory response to hypercapnia, this effect was reduced in PRKO mice (Meffre et al., 2013).

Membrane progesterone receptors (mPRs) are seven-transmembrane proteins that belong to the Progestin and AdipoQ Receptor Family (PAQR) that selectively bind progesterone to activate G proteins and intracellular signalling pathways. So far five members of the mPR family have been identified, with different distribution in the brain and peripheral tissues, likely underlying a vast array of functions (Zhu et al., 2003b; Brinton et al., 2008; Thomas, 2008; Dressing et al., 2011; Thomas & Pang, 2012). In mice, mPRα (PAQR7) and mPRβ (PAQR8) are expressed in the brain and spinal cord (Thomas, 2004; Labombarda et al., 2010; Meffre et al., 2013), and we provided evidence that mPRα and mPRβ proteins are expressed in the dorsal part of the brainstem, at the level of the nucleus tractus solitarius (NTS) and in the motor nuclei of the Xth (vagus) and XIIth (hypoglossal) cranial nerves (Boukari et al.,

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2015). These brainstem areas are part of the so-called “dorsal respiratory group” that contains both excitatory and inhibitory respiratory neurons (Stornetta, 2008): the NTS is the main projection site of sensory afferents from the peripheral chemoreceptors, baroreceptors and lung mechanoreceptors (Horner, 2008; Spyer, 2009; Dempsey et al., 2010; Horner, 2012; King et al., 2012). The Xth and XIIth cranial nerves provide innervation for the upper airways and the tongue to coordinate their activity to the inspiratory drive, hence playing a key role to maintain airway patency and avoid total or partial obstruction during sleep (Horner, 2008; Spyer, 2009; Horner, 2012). Direct injection of progesterone in the NTS rapidly increases (within minutes) phrenic nerve activity (Bayliss et al., 1987) and on brainstem slices; application of progesterone reverses NTS neuronal responses to hypoxia (Pascual et al., 2002), indicating that mPRs might mediate some respiratory effects of progesterone.

In the present study, we tested the hypothesis that mPRa and mPRb are involved in respiratory control in adult mice. In females, progesterone is mainly synthesized by the ovaries, but it is also a classical neuro-steroid hormone (Guerra-Araiza et al., 2008; Meffre et al., 2013) that is synthesized in the central and peripheral nervous system in males and females, and may therefore also have biological functions in males. We therefore used adult male and female mice to perform long-term [14 days – to ensure efficient knock-down of target genes using non-viral siRNA – (Thakker et al., 2004) ] infusion of small interfering RNA (siRNA) against mPRa or mPRb into the 4th ventricle, and recorded ventilation at rest in normoxia and in response to hypoxia and hypercapnia.

Material and method

Animals

This study was performed in strict accordance with the recommendations of the Canadian Council on Animal Care. The committee on the protection of animals of the CHUQ Research Centre approved the protocol (Permit Number: 2012-023). All efforts were made to minimize suffering, reduce the number of animals used, and provide enrichment in housing conditions.

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We used a total of 33 male and 42 female mice (3-4 months old – C57bl/6J-129sv) from our breeding colony.

Experimental Design

We first verified that the intra-cerebro-ventricular (i.c.v.) injection site effectively targeted the 4th brain ventricle. Three adult female mice were deeply anesthetized under 2 % isoflurane for stereotaxic implantation of a permanent stainless-steel cannula (28-gauge, Alzet Osmotic Pumps, Durect Corporation, Cupertino, CA, USA) at the following coordinates: Bregma - 6.12 mm, lateral 0.0 mm, dorsoventral - 4.0 mm (based on mice brain atlas, see ref. (Frankin & Paxinos, 2007), then we injected 1µl (in 20 seconds) of 1% methylene blue via the catheter. The mice were sacrificed with an overdose of anesthetic, the brain was removed, frozen on dry ice, and 30 µm sections were cut on a cryostat. We observed the presence of the blue dye at the 4th ventricle of the brain, confirming the site of implantation.

For micro-infusion of the siRNA, an osmotic pump (Alzet pump model 1002, reservoir volume 100 µl, flow rate 0.24 µl/hour) was connected to the cannula with medical-grade vinyl tubing and placed in a subcutaneous pocket in the dorsal region. Pumps were filled with siRNAs against mPRα (CGUGUUGCACCGCAUCAUAtt) or mPRβ (CCACUACACGUUCUACUUUtt) (Ambion® in vivo siRNA, ThermoFisher Scientific; 40µg/day) or an artificial cerebrospinal fluid (aCSF - mM: 129 NaCl, 3.35 KCl, 0.58

NaH2PO4, 1.15 MgCl2, 1.26 CaCl2, 21 NaHCO3, 30 Glucose). After the surgery, the mice were kept on a warm blanket until recovery. Pre- and post-operative analgesia was administered following standard procedures. Previous studies in adult mice showed that two weeks infusion of non-viral siRNA in the 3rd ventricle ensured efficient (around 50%) and widespread (5-6 mm around the infusion point) knockdown of target genes in the brain . After two weeks of continuous siRNA infusion, the animals were placed in the plethysmograph chamber for continuous respiratory and metabolic recordings for 4 hours (9:00 – 13:00). The chamber was then opened for measurement of rectal temperature. To measure respiratory chemoreflexes the animal was replaced in the chamber. When breathing becomes regular the recording was reinitiated for 20-30 minutes under normoxic

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(baseline) conditions, then under hypercapnia (5% CO2) and hypoxia (12% O2) in randomized order, 5 minutes each, separated with normoxia for at least 5 minutes, or until the animal had a stable breathing pattern with a breathing frequency similar to the baseline value.

Recording of respiratory and metabolic parameters

Set-up details.

As performed previously in adult or newborn mice , we used whole body plethysmography  to record respiratory frequency (fR), tidal volume ( VT ), and minute ventilation ( VE = fR x VT ). The mice were placed in a 600 ml chamber (Emka, Technologies, Paris, France) continuously supplied with fresh air (180 ml/min) at room temperature (inside the plethysmograph, temperature is around 25°C). A built-in pneumotachograph is used to measure the changes of air-flow related to breathing. A single injection of 500 µl of air inside the chamber was used for the calibration of the flow trace. A subsampling pump was used to draw (~50-75 ml/min) a sample of outflowing air for analysis of respiratory gases. Water pressure, CO2 and O2 levels in the outflowing air were continuously measured using specific gas analyzers (RH-300, CA-10 and FC-10, Sable Systems, Las Vegas, NV, USA) calibrated using a certified dry gas mix (Linde Canada Limité, Vanier, Qc, Canada). During baseline recordings the subsampling pump was derived to the inflowing gas line every hour for at least 5 minutes. This procedure was used to record values of inflowing O2, CO2 and H2O for calculation of metabolic rate (see below). All signals were acquired and recorded on a computer with the Spike 2 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK), and used offline to calculate respiratory frequency (fR), tidal volume ( VT ), minute ventilation (

. .  V E = fR x VT), CO2 production ( VCO ), and O2 consumption rate ( V O2 ). Body weight was 2 . measured routinely after experiments to express VT in ml/100g and V E in ml/min/100g.

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Respiratory and metabolic signal analysis at rest

For all animals, we selected periods of stable and regular breathing pattern that lasted at least 10 minutes. We reported in a previous study (Marcouiller et al., 2014) that these periods correspond to non-REM sleep (assessed by EEG/EMG recordings), while REM sleep episodes are characterized by brief periods of irregular breathing, high respiratory frequency and lower tidal volume (cf. representative traces in (Marcouiller et al., 2014)). Since EEG/EMG recordings were not performed in the present study, we will refer to these periods of recordings as “rest”, but one can keep in mind that they most likely represent non-REM sleep.

Respiratory frequency and tidal volume were calculated breath-by-breath using a custom script in Spike 2. For each breath, the software integrated the portion of the calibrated flow trace corresponding to inspiration (defined as a deviation below 0 in our set-up), and the corresponding volume was corrected by using the standard equation described for whole

. body plethysmography.  V O2 and VCO were calculated as follows: 2

. V O2 = Flowi {FiO2 −[FeO(1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]} and

. V CO 2 = Flowi {[FeCO2 (1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]− FiCO2 }

Where Flowi is the flow rate of gas measured in the inflowing line, Fi and Fe are the fractions of the corresponding gas measured in the inflowing (Fi) and outflowing (Fe) lines respectively. This equation allows the correction for the changes of gas composition in the inflowing and outflowing gas lines due to the activity of the animal, and the day-to-day

. . variability of CO2 and H2O in ambient air (Morgan et al., 2014). V E , V O and V values 2 CO 2

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. . were used to report minute ventilation as a function of O2 consumption ( V E V O2 ) and CO2

. . production rate ( V E V CO2 ) during baseline conditions.

Respiratory signal analysis for chemoreflex responses

During hypoxic or hypercapnic exposures we selected the longest portions of stable and regular breathing pattern for each minute of recording (these portions typically lasted 15-20 seconds of continuous breathing). All ventilatory variables were expressed as a percentage of variation from baseline values obtained before the test gas exposure (baseline values were similar to the values obtained at rest). To compare ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia in males and females we used the mean response of % changes from baseline.

Because we limited the hypoxic and hypercapnic exposure to only 5 minutes during which metabolic rate is less likely to be affected and measured with our set-up (Morgan et al., 2014),

. . . . we did not report V E V O or V E V CO for ventilatory responses to hypoxia or hypercapnia. 2 2

Sigh, post-sigh apnea, and spontaneous apnea frequency.

The respiratory recordings were visually analyzed to count apnea at rest. For each recording, we selected periods of stable breathing pattern - typically over 1 hour or more. We used the standard criteria to determine sighs as a profound inspiration with a volume that is at least twice the normal tidal volume, and a rapid expiration that can be followed by apneas (2 missed breaths – determined by breathing frequency at rest for each animal(Nakamura et al., 2003). We determined the frequency of sighs, post-sigh apneas, and spontaneous apneas as performed previously in adult mice (Marcouiller et al., 2014).

Immunohistochemistry

At the end of the recordings, we randomly selected 4 males and 4 females in each group to be deeply anesthetized (ketamine-xylazine), perfused with cold PBS solution via a cardiac catheter, then the brain was dissected, immediately frozen, stored at -80°C and used for immunostaining of mPRa or mPRβ to verify the effect of siRNA infusion. The brainstem

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was cut at 15 µm with a cryostat and the sections were collected on Super frost slides. Prior to immuno-staining, brainstem slices were post-fixed in 4% paraformaldehyde in PBS solution for 30 minutes with gentle agitation. Tissue slices were washed 3 x 5 minutes in PBS after post fixation and between every consecutive step. Endogenous peroxidase activity was blocked for 30 minutes with 0.1% H2O2 in PBS. Non-specific binding was blocked for 4 hours in blocking solution (0.5% BSA in 0.1% triton diluted in PBS). Tissues were then incubated 18 hours at 4° C with the primary antibody against mPRa (Santa Cruz Biotechnology sc-50113 – dilution 1/200) or mPRb (Abcam ab46535 - 1/1000) in blocking solution and incubated with a biotinylated secondary antibody (horse anti-goat for mPRa and goat anti-rabbit for mPRb - dilution 1/200 – Vector Laboratories) with blocking solution for 2 hours at room temperature. The Vectastain Elite avidin-biotinylated enzyme complex (ABC) and diaminiobenzidine peroxidase (DAB – Vector Laboratories) methods were used to reveal biotynilated secondary antibody. Sections were then dehydrated using alcohol and cleared with xylene before coverslipping.

All preparations were visualized under a microscope (Eclipse E600 - Nikon) with a camera (Infinity 3 – Lumenera Corporation) and stored as digital images. For pairwise comparisons (control vs. treated in one “experiment”: 1 siRNA and 1 sex) of the staining intensity, all immunohistochemistry staining and photographs have been performed in parallel (same days, same batch of chemicals, same photographic setting, etc). For each animal, one representative image from the rostral and caudal brainstem was used to analyze the staining intensity: the image was opened in the ImageJ software (NIH, USA), an area corresponding to the NTS was overlaid on the image and the grey histogram inside this area was exported to a spreadsheet and normalized to the total number of pixels analyzed. Since the histogram encodes 256 grey intensities between black (intensity value = 0) and white (255), a lighter staining has a right-shifted histogram compared to a stronger staining.

Statistical Analysis

All values obtained at rest (respiratory and metabolic parameters, apnea frequencies) have been analyzed with a two-way ANOVA by using sex and treatment (aCSF, siRNA mPRa ,

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siRNA mPRb) as grouping variables. When significant effects of sex, treatment, or a significant interaction between sex and treatment appeared, we used a post-hoc analysis (Fisher's LSD test) to test for significant effects within each sex (effect of treatment in males and females) or treatment (effect of sex in each siRNA group). Responses to hypoxia and hypercapnia were analyzed separately in males and females with a two-way ANOVA for repeated measures with treatment as the independent variable and time of exposure as the repeated variable. A post-hoc analysis (Fisher's LSD test) was used when necessary to assess the effects of each treatment at different time points of the exposure. To compare hypoxic and hypercapnic ventilatory responses between male and female mice in control and in animals treated with siRNA against mPRa or mPRb, we performed a multiple unpaired t- test analysis, with individual analysis for each treatment group. We used the GraphPad Prism software (version 6.0 for Mac OSX) for all analyses. All values are reported as the means ± sem, and the significant P value was set a 0.05. P values are reported in the figures with the following general pattern: *, **, ***, and **** are used to report P< 0.05, 0.01, 0.001, and 0.0001, respectively.

Results

Treatment with siRNA against mPRα or mPRβ reduces immunostaining of mPRα or mPRβ in the brainstem

Figures 1 and 2 represent examples of immunostaining on brainstem slices in mice treated with vehicle (aCSF), or the corresponding siRNA. Visual examination of the slices showed expression of mPRα and mPRβ at the rostral (Figure 36) and caudal (Figure 37) levels. Treatment with the siRNA against mPRα or mPRβ decreased the staining in male and female mice, confirmed with a rightward shift of the grey level histogram at the caudal and rostral brainstem areas.

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The siRNA against mPRα or mPRβ increases respiratory frequency at rest in males but not in females

Female mice had a lower body weight than males, but neither body weight nor rectal temperature was affected by the treatment (Table 3). In males, the siRNA against mPRa or mPRb significantly increased respiratory frequency (cf. table 3 - ANOVA P value for treatment = 0.004) without significant effects on minute ventilation (P=0.07). However, in females there was no effect of siRNA treatment on respiratory frequency (P value for sex x treatment=0.015). Control females had higher tidal volume than control males (ANOVA P value for sex = 0.006), and although there was no significant interaction between sex and treatment (P=0.96), the post-hoc analysis shows a significant difference between males and females only in control mice (P=0.007), but not in mice treated with the siRNA against mPRa (P=0.083) and mPRb (P=0.058). In all groups, female mice had lower respiratory

. . frequency than males (P value for sex < 0.0001), and higher V E V CO2 (ANOVA P Value for sex <0.0001 - Table 3).

. Table 3: Body weight, rectal temperature, minute ventilation ( V E ), respiratory frequency .  (fR), tidal volume (VT), O2 consumption, and CO2 production rates ( V O2 , VCO ), 2 . . . . respiratory equivalent of O2 and CO2 ( V E V O2 and V E V CO2 ), and respiratory exchange .  ratio ( VCO / V O2 ) recorded in normoxia in adult female mice treated with the artificial 2 cerebrospinal fluid (aCSF - control) or siRNA against mPRα or β. All values are mean +/- sem. number of animal used in each group (n). °, °°, °°°, °°°°: P<0.05, <0.01, <0.001 and <0.0001 females vs males. **, ***: P<0.01 and <0.001 vs aCSF.

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Figure 36: Representative examples of immunostaining on brainstem slices from mice treated with aCSF (control) or with the siRNA against mPRα or mPRb in the dorsal region of the brainstem (around bregma level -7.08, at the caudal opening of the 4th ventricule. A: Neuroanatomical drawing at bregma -7.08 mm . B-C: Immunological staining for mPRa in adult male mice treated with aCSF (B) or the siRNA against mPRα (C). D-E: Immunological staining for mPRb in adult male mice treated with aCSF (D) or the siRNA against mPRb (E). The area used for the measurement of pixel density is indicated on each image. On the right, pixel density curve for aCSF or siRNA treated animals. Note the lower staining intensity (right shift of the histogram) in mice treated with the siRNA against mPRα or mPRb compared to their controls. CC: central canal, SolM, SolC, SolG, SolDL, SollM, SolV,. subdivision of the NTS. 12N (or XII): hypoglossal nucleus, 10N (or X): vagal nucleus. ****:P<0.0001 for interaction between siRNA treatment and grey level (ANOVA). All scalebars: 100 µm [ Panel A reproduced from Franklin and Paxinos ((Frankin & Paxinos, 2007)) with permission from Elseiver.]

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Figure 37: Representative examples of immunostaining on brainstem slices from mice treated with aCSF (control) or with the siRNA against mPRα or mPRb in the caudal region of the brainstem (around bregma level -7.76).

A: Neuroanatomical drawing at bregma -7.76 mm . B-C: Immunological staining for mPRa in adult male mice treated with aCSF (B) or the siRNA against mPRα (C). D-F: Immunological staining for mPRb in adult male mice treated with aCSF (D-E) or the siRNA against mPRb (F). The area used for the measurement of pixel density is indicated on each image. On the right, pixel density curve for aCSF or siRNA treated animals. Note the lower staining intensity (right shift of the histogram) in mice treated with the siRNA against mPRα or mPRb compared to their controls. CC: central canal, SolM, SolC, SolG, SolDL, SollM, SolV,. subdivision of the NTS. 12N (or XII): hypoglossal nucleus, 10N (or X): vagal nucleus. ****:P<0.0001 for interaction between siRNA treatment and grey level (ANOVA). All scalebars: 100 µm. [ Panel A reproduced from Franklin and Paxinos ((Frankin & Paxinos, 2007)) with permission from Elseiver.]

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The siRNA against mPRβ increases apnea frequency at rest in male and female mice

Sighs and post-sigh apneas are observed in all animals, but spontaneous apneas are only present in some of the animals. Figure 38 A shows the proportion of mice presenting spontaneous apneas in each group: interestingly, while around 60% of the mice in the control group had spontaneous apnea, all mice in the group treated with the siRNA against mPRb had spontaneous apneas (Chi-square test: P=0.005).

Figure 38: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on breathing instabilities recorded at rest. A: for each group, proportion of animals in which spontaneous apneas have been observed B) frequency of spontaneous apneas (#/hour), C: frequency of sighs (#/hour), D: frequency of post-sigh apneas (#/hour) recorded in adult female and male mice treated with aCSF (control) or siRNA against mPRα or β. All values are mean +/- sem. *, **, ***, ****: P< 0.05, <0.01, <0.001 or <0.0001 for effect of siRNA vs aCSF. ºº < 0.01 females vs males.

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The siRNA against mPRb increased the frequency of spontaneous (Figure 38 B - P<0.0001) and post-sigh apneas (Figure 38 D - P<0.0001) in male and female mice, and increased sigh frequency (Figure 38 C - P=0.02), but the post-hoc analysis showed a significant effect only in males. In addition, in mice treated with the siRNA against mPRa there was a higher frequency of post-sigh apnea in females than in males (Figure 38 D - ANOVA P value for sex = 0.038).

The siRNA against mPRβ decreases the hypoxic and hypercapnic ventilatory responses

In female mice, the ventilatory response to hypoxia was almost abolished by the treatment with the siRNA against mPRb (Figure 39 A – ANOVA P value for treatment = 0.004 – interaction between treatment and hypoxia P<0.0001) due to a suppression of the respiratory frequency and tidal volume responses (Figure 39 B and 40 C). There were more limited effects of the siRNA against mPRa: significant effects were present only on the tidal volume and restricted to the first 2 minutes of the exposure (Figure 39 C). The ventilatory response to hypercapnia was reduced by 50-60% by the treatment with the siRNA against mPRb (Figure 39 D – ANOVA P value for treatment = 0.005 - interaction between treatment and hypoxia P=0.0003), due to reduced responses of respiratory frequency and tidal volume (Figure 39 E and 39 F). The post-hoc analysis also showed a significant effect of the siRNA against mPRa for the first 2 minutes of exposure (Figure 39 D-F). In male mice, the treatment with the siRNA against mPRa and mPRb decreased the hypoxic ventilatory response (Figure 40 A - ANOVA P value for treatment = 0.039), due to a decreased response of the respiratory frequency (Figure 40 B - P=0.01). The treatment with the siRNA against mPRa and mPRb also reduced the ventilatory response to hypercapnia (ANOVA P value = 0.025) by decreasing frequency (P=0.006) and tidal volume (ANOVA P value treatment x hypercapnia = 0.007 – Figures 40 E-F). Contrasting with the effects in females, the treatment with the siRNA against mPRa significantly decreased the response to hypoxia or hypercapnia throughout the exposure (Figure 40 D).

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Figure 39: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on chemoreflex function in female mice

Ventilatory responses to hypoxia (12% O2) and hypercapnia (5% CO2) in adult female mice treated with aCSF (control) or siRNA against mPRα or mPRβ. All values are % changes vs baseline for minute ventilation (Ve), respiratory frequency (fR), and tidal volume (VT) and presented as mean +/- sem. **: P<0.01 for effect of siRNA against mPRα vs aCSF. +, ++, +++ P< 0.05, <0.01 or <0.001 for effect of siRNA against mPRα vs aCSF.*, **, ***, ****: P< 0.05, <0.01, <0.001 or <0.0001 for effect of siRNA against mPRβ vs aCSF.

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Figure 40: Effect of siRNA against mPRα or mPRβ on chemoreflex function in male mice.

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mPRb establishes sex-specific differences on ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia

Because the time course of the response in females appears different than in males, we are reporting the mean of the % changes from baseline in response to hypoxia and hypercapnia for each variable during the 5 minutes of exposure. This is a way to normalize the response over time, and allows comparing the ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia in males and females to assess the potential sex-specific effects of the siRNA treatment (Figure 41). In control mice and in mice treated with the siRNA against mPRa, females had higher ventilatory response to hypoxia than males (Figure 41 A-C). In mice treated with the siRNA against mPRb sex-specific effects are no longer present (Figure 42 A-C). Similarly, in control mice, the mean hypercapnic ventilatory response over the five minutes was higher in females (Figure 41 D-F). This effect of sex on the ventilatory response to CO2 was not eliminated by siRNA against mPRa, but was eliminated by siRNA against mPRb (Figure 41 D-F).

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Figure 41: Mean responses to hypoxia and hypercapnia in male and female mice. All values are mean +/- sem. º, ºº, ººº, ºººº P<0.05, <0.01, <0.0001 and <0.0001 males vs females .

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Discussion

In the present study, we determined that reducing the expression of mPRα and mPRβ in the brainstem by RNA interference have distinct effects on respiratory control in male and female mice. The key results indicate that mPRβ: i) has a profound effect on the ventilatory chemoreflex, ii) contributes to establishing sex-specific responses to hypoxia and hypercapnia, and iii) is a key player for the control of apnea frequency in males and females. On the other hand, mPRα modulates the hypercapnic ventilatory response, without sex- specific effects, and without affecting apnea frequency. Therefore mPRβ could potentially be a pharmacological target for the treatment of sleep apnea in men and women. The classical nuclear receptor also reduces apnea frequency in adult rats (Yamazaki et al., 2005) and mice (Marcouiller et al., 2014), and contributes to increase the respiratory response to hypercapnia (Marcouiller et al., 2014). Therefore, our data shows that the respiratory effects of progesterone are under the control of several progesterone receptor types.

Expression of mPRb controls apnea frequency and establishes sex-specific chemoreflex function

The discovery and identification of functional mPR in vertebrate (Zhu et al., 2003a; Zhu et al., 2003b) led to an increasing number of studies to determine their localization and physiological roles (Brinton et al., 2008; Thomas, 2008; Thomas & Pang, 2012; Pang et al., 2013). In the central nervous system mPRs are able to enhance hippocampal memory (Fortress et al., 2015), mPRα and mPRb mediate the effects of progesterone on sexual behaviour in females (Frye et al., 2014), and mPRα regulates myelinisation, water homeostasis and inflammation following traumatic brain injury (Meffre et al., 2013). The respiratory stimulant effects of progesterone in animal models (Bayliss et al., 1987; Joseph et al., 2002), and its potential to reduce apnea frequency in postmenopausal women receiving hormonal therapy (Shahar et al., 2003) are well known, and previous studies in rats and mice showed an implication of the nuclear PR to mediate these effects (Yamazaki et al., 2005; Marcouiller et al., 2014). On the other hand, progesterone reverses neuronal responses to

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hypoxia on NTS slices from male rats in less than 5 minutes (Pascual et al., 2002). Such rapid effects could not be mediated by the genomic response elicited by the nuclear receptor, suggesting that membrane progesterone receptors are localized in the NTS and could be involved in respiratory control. We showed previously that mPRα and mPRβ are indeed present in the dorsal respiratory group in the mice brainstem, with a clear expression of both receptors in the NTS and in the hypoglossal nucleus (Boukari et al., 2015).

Our data shows lower respiratory frequency, but higher tidal volume and minute ventilation with similar metabolic rate at rest in control females compared to males. Therefore

. . V E V CO 2 is higher in females, a sign of hyperventilation relatively to their metabolic needs. Control females also had higher ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia, and the treatment with the siRNA against mPRβ reduced the hypoxic and hypercapnic respiratory responses and suppressed the sex-specific differences of these responses. Interestingly, the blunted ventilatory response to hypoxia following the deletion of mPRβ evokes a depression of oxygen sensing such as occurring after denervation of the peripheral chemoreceptors (Izumizaki et al., 2004). We used a preparation that ensures efficient entry of the siRNA into the cells, and since the nerve terminals from the peripheral chemoreceptors project in the NTS (Housley et al., 1987), we cannot exclude that the siRNA have migrated along the glossopharyngeal nerve, driven by the chronic infusion pressure in the IVth ventricle over 14 days. Accordingly mPRβ might play a critical role for O2 sensing or chemo-transduction in the peripheral chemoreceptors, this would be in line with data showing that progesterone enhances the peripheral chemoreceptor response to hypoxia in cats (Hannhart et al., 1990) and enhances minute ventilation in normoxia and hypoxia by decreasing the synthesis of dopamine in peripheral chemoreceptors in female rats (Joseph et al., 2002).

Despite these well-known effects of progesterone, the available literature shows that the estrous cycle in rats and mice has no influence on normoxic ventilation or ventilatory responses to hypoxia or hypercapnia (Young et al., 2003; Marques et al., 2015), and for this reason we have not determined the estrous cycle in female mice. It is also noteworthy to mention that there are non-consistent results on sex-specific differences on ventilatory

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chemoreflexes in mice: some studies report that ventilatory response to hypoxia is higher in females than in males (Gassmann & van Patot, 2009), similar , or lower in females vs males (Huey et al., 2000; Palmer et al., 2013). Similarly for the hypercapnic ventilatory response in mice, some studies show higher response in females than in males (Huey et al., 2000), similar (Polotsky et al., 2001), or lower during REM sleep in females (Polotsky et al., 2001). These discrepancies are also apparent in other species (see -(Behan & Kinkead, 2011; Palmer et al., 2013)) and they might be explained by several factors including strains, species, age, or the experimental procedure specific to each study. In the present study we have normalized hypoxic and hypercapnic responses to baseline values that have been obtained under conditions that ensure a resting state, in line with protocols recommended for basal metabolic rate recordings (Speakman, 2013). Most previous studies used shorter times of habituation for baseline measurements, typically 45-60 minutes, and it is possible that in these conditions the sex-specific effects for baseline recordings and chemoreflex responses are masked by other stimuli affecting respiration and metabolism (also suggested by (Palmer et al., 2013)).

Our data strongly suggest that mPRb is responsible for the higher ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia observed in females compared to males. By contrast, mPRa had more limited effects, mostly reducing the hypercapnic ventilatory response, and is apparently not necessary to establish the sex-specific chemoreflex responses. We showed previously that in female mice the nPR contributes to mediating the effects of progesterone on the hypercapnic ventilatory response (Marcouiller et al., 2014). Therefore, it might be concluded that mPRa, mPRb and nPR are able to modulate respiratory responses to hypoxia or hypercapnia, each with specific effects and pattern of response. Among these receptors, mPRb seems to play the most important role for respiratory control in response to hypoxia and hypercapnia, at least in mice, while nPR and mPRa increase more specifically the response to hypercapnia. Our data also show that the treatment with the siRNA against mPRa or mPRb increases respiratory frequency at rest in males, but not in females.

Although we cannot completely exclude a (sex-specific) side effect of siRNA infusion (see methodological section below), these results are intriguing as they could underlie that mPRα

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and mPRb might also contribute to inhibiting respiratory activity at rest. It is noteworthy to report that both excitatory and inhibitory respiratory neurons are present in the dorsal brainstem and NTS (Stornetta, 2008), and that in vitro, the rapid effects of progesterone on rat brainstem slices might be excitatory or inhibitory, depending on neuronal response to hypoxia (Pascual et al., 2002). This heterogeneity of respiratory functions might well underlie the diverse responses observed after the treatment with the siRNA against mPRa and mPRb.

With our actual state of knowledge on the functions of mPRa and mPRb in the brain, the mechanisms underlying the different respiratory effects of these receptors remain unclear: it has been shown that mPRa is widely expressed in the brain, and is expressed in neurons but not in oligodendrocytes and astrocytes (Meffre et al., 2013), but the neurochemical phenotype of mPRa or mPRb positive neurons in the brainstem, and the precise relations of these neurons with the central elements of the respiratory control system remains to be determined. Interestingly, activation of mPRa and mPRb potentiates the transcriptional activity of the nuclear PR in myometrial cells via a mechanism involving Gi proteins (Karteris et al., 2006). Because the nPR is also densely expressed at the level of the NTS (Haywood et al., 1999), we cannot exclude that some of our results are mediated by a reduced nPR activity induced by the down-regulation of mPRb. This appears as an interesting hypothesis to be addressed, and if confirmed this could also have important implications for the design of therapeutic approaches against apnea using the specific respiratory stimulant effects of these receptors.

Methodological Considerations

We didn’t use a scrambled (random order of the same bases) or non-targeting siRNA (that has no target in mice) to control the specificity of the phenotype reported. Because these siRNA have a different sequence compared to the siRNA that targets the expected mRNA, they don’t eliminate the concern of off-target silencing due to the imperfect sequence alignments of the specific siRNA with non-specific mRNA targets (Jackson & Linsley,

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2010). In-vitro, the most desirable control to reduce off-target effects is to use different targeting siRNAs in repeated experiments, or as a pool in a single experiment (Jackson & Linsley, 2010). This approach is, however, much less convenient in-vivo, where higher quantities of siRNA are used, rapidly increasing costs. Yet, for several reasons we are confident that the phenotypic results obtained are specific: we used siRNAs that are pre- designed to avoid immune responses, ensure stability in-vivo, and reduce off-target effects (Ambion® in vivo siRNA, ThermoFisher). Furthermore, it appears extremely unlikely that a random off-target effect of the mPRb siRNA could suppress sex-specific differences for the hypoxic and hypercapnic ventilatory responses, while this response might be expected when targeting a sex-steroid receptor. We obtained different phenotypes with two siRNA showing that these are not due to the delivery method or chemical design. As such, the only result for which we cannot discard a non-specific effect of siRNA delivery is the higher (sex-specific) respiratory frequency in males treated with the siRNA against mPRα or mPRb.

We performed recordings for 4 hours to obtain resting values of respiratory and metabolic variables and ensure that enough respiratory events (sighs, apneas) are recorded to estimate their frequency. In adult mice, to obtain a basal metabolic rate (a major determinant of basal ventilation) it is necessary to wait at least 2 hours once the animal is placed in the recording chamber (Speakman, 2013), and we previously reported that these resting periods are episodes of non-REM sleep assessed by EEG/EMG recordings (Meffre et al., 2013).

Conclusion

We conclude that mPRb is a key element of respiratory control in adult male and female mice. Its expression is necessary to sex-specific ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia, and explains the higher responses in females compared to males. Because knockdown of mPRb in males and females almost tripled the frequency of apneas, it might be an interesting pharmacological target for the treatment of sleep-apnea, particularly in women around menopause. mPRa has only modest effects on respiratory control, and is

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apparently not important for the stability of breathing pattern and apnea frequency. As long as drugs specifically targeting this receptor are not available genomic tools are promising to further understand the roles of mPRb.

Acknowledgments: The authors acknowledge the help of Mélanie Pelletier and Karine Trudel for animal care. Study founded by CIHR (VJ: MOP-102715).

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Ovarian steroids act as respiratory stimulant and antioxidant against the causes and consequences of sleep-apnea in women.

Ryma Boukari, Sofien Laouafa, Alexandra Ribon-Demars, Aida Bairam, Vincent Joseph.

Centre de Recherche de l'Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec, Université Laval, Quebec City, Quebec, Canada.

Running title: Ovarian hormones against the causes and consequences of sleep apnea.

Published in the journal Respiratory Physiology and Neurobiology, May 2017, Volume 239: 46-54

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Résumé

Les hormones ovariennes sont un outil potentiel contre l’apnée du sommeil (AS) chez les femmes. La progestérone stimule la ventilation et réduit les apnées, mais les mécanismes impliqués restent peu connus. Chez la souris, il est montré que les effets respiratoires de la progestérone sont médiés par au moins deux classes de récepteurs de la progestérone, y compris les récepteurs nucléaires (nPR) et membranaires (mPR). Les nPRs réduisent la fréquence des apnées chez la femelle, tandis que les mPRb agissent aussi bien chez les mâles que chez les femelles. Par ailleurs l'AS induit un stress oxydatif dans plusieurs tissus, ce qui contribue aux conséquences délétères de l’AS. Cette revue inclut des données récentes soutenant un rôle antioxydant de l'estradiol dans un modèle expérimental de l'AS. Les hormones ovariennes pourraient potentiellement être utilisées comme outils efficaces contre les causes (apnées) et les conséquences (stress oxydatif) de l'AS.

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Abstract

Evidence supports the importance of ovarian hormones as potential tools against sleep apneas in women. On one hand, progesterone is largely acknowledged as being a respiratory stimulant that reduces the frequency of apneas, but the underlying mechanisms remain poorly understood. Recent studies in mice showed that the respiratory effects of progesterone are mediated by at least two classes of progesterone receptors, including the nuclear (nPR) and membrane receptors (mPR). Some of these receptors (nPR) have sex-specific effects on the frequency of apneas recorded during sleep in mice, while mPRb acts in males as well as in females. Moreover, sleep apnea is a condition that induces an “oxidative stress” response in several tissues, and this contributes to the deleterious consequences of sleep apneas, including the development of hypertension. While estradiol is recognized as an antioxidant hormone, its potential protective role has remained mostly ignored in the field. We will review recent data supporting an antioxidant role of estradiol in female rats exposed to intermittent hypoxia, a reliable animal model of sleep apnea. Since estradiol has two main receptors (ERa and ERb) we will discuss their relative implications, and present new data showing a key role for ERa to prevent the hypertension induced by intermittent hypoxia. Overall this review highlights the fact that ovarian hormones could potentially be used as efficient tools against the causes (i.e. instabilities of the respiratory control system) and consequences (oxidative stress) of sleep apnea.

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Introduction

Sleep-apnea is a chronic health condition characterized by repeated cessations of breathing occurring during sleep. This atypical breathing pattern results in abrupt and repeated variations of arterial oxygen pressure, known as intermittent hypoxia (IH). IH induces several pathological responses (hypertension, cognitive impairments, and metabolic disorders), and produces cellular damages mostly linked to exaggerated production and impaired protection against reactive oxygen species (ROS), which are one of the inevitable by-products of cellular O2 consumption (Almendros et al., 2014; Lavie, 2015; Prabhakar et al., 2015). It is largely acknowledged that sleep apnea is a sex specific disease: its prevalence is higher in men than in premenopausal women and its occurrence (with a men to: women ratio of 2:1 to 3:1- (Redline et al., 1994; Bixler et al., 2001) and occurrence is 3-4 times higher in women after vs before menopause (Redline et al., 1994; Bixler et al., 2001; Young et al., 2003).

It is noteworthy that beyond their roles in reproductive biology, ovarian hormones (estradiol and progesterone) regulate a large variety of homeostatic functions, including the cardio- circulatory (Pang et al., 2015; Hay, 2016), respiratory (Dempsey et al., 1986; Boukari et al., 2015), and metabolic (Shen & Shi, 2015; Stefanska et al., 2015) systems. The fact that progesterone is a respiratory stimulant is largely acknowledged in humans or in animal models (reviewed in (Dempsey et al., 1986; Behan & Kinkead, 2011; Boukari et al., 2015). Based on these data, there has been a clinical interest to address the hypothesis that progesterone could reduce the frequency of apneas or airway obstructions during sleep (Pickett et al., 1989; Polo-Kantola et al., 2003; Saaresranta et al., 2006). Population-based studies supported this hypothesis by showing that hormone replacement therapy in postmenopausal women was associated with a lower frequency of sleep apneas, with more potent effects being obtained in women taking both estrogens and medroxyprogesterone, compared to women taking only estrogens (Bixler et al., 2001; Shahar et al., 2003). The roles of these hormones as potential tools against apnea in women was also supported by studies showing an inverse relation between the level of circulating ovarian hormones and apnea frequency in women (Netzer et al., 2003; Galvan et al., 2016).

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Hormone replacement therapy for the treatment of menopause symptoms in women has gone through drastic changes over the past 15 years. The preliminary results of the Women's Health Initiative (WHI) study showed an increased risk of coronary heart disease, breast cancer, stroke, and thromboembolic complications in women taking hormones therapy (Rossouw et al., 2002), and therefore, the rate of prescription and use of hormone therapy has fallen drastically. However, these data should have been stratified by age and time since menopause at the initiation of treatment, and recent reports suggest that the decreased rate of prescription may have had harmful effects in women (Lobo et al., 2016). It is now clear that starting hormone therapy within 10 years of menopause has more benefits than risks (Bassuk & Manson, 2016; Hodis et al., 2016). In terms of apnea frequency, a recent study showed that following the reduced treatment rate, the effect of hormone therapy on apnea frequency is no longer apparent (Mirer et al., 2015). This could be due to the prescription of lower doses of hormones for the treatment of menopausal symptoms, or to a "healhty user bias": before the results of the WHI study, hormone therapy was perceived as a healthy habit, and a high proportion of women taking hormone therapy had a healthier life-style than women not taking medication (Mirer et al., 2015). Finally, the authors suggested that the biological basis of the effects of ovarian hormones on breathing during sleep should be questioned, and that hormone therapy is unlikely to benefit sleep health in postmenopausal women.

On the contrary, there are clear-cut and consistent evidence from humans and animal models that progesterone is a powerful respiratory stimulant (Dempsey et al., 1986; Behan & Kinkead, 2011; Boukari et al., 2015). Despite this large knowledge, several aspects of the precise functions and mechanisms explaining the respiratory effects of sex hormones remain to be clarified. In this review, we will discuss two major points, which are key aspects suggesting potential avenues for the treatment of respiratory disorders during sleep in women. We believe that these should be taken into consideration for future development in this field.

- It is becoming clear that the mechanisms by which progesterone stimulates the respiratory system are far more complex than initially thought. There are now 8 identified progesterone receptors: the nuclear progesterone receptor (nPR), 5

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members of membrane progesterone receptors family (mPR), and at least 2 members of the Progesterone receptor membrane component family (Pgrmc) (Brinton et al., 2008; Pang et al., 2013; Petersen et al., 2013). Their relative roles on respiratory control are only partially known. Future research should identify which progesterone receptors are involved in respiratory control and the occurrence of apnea during sleep, which ultimately could help developing more specific drugs. - Sleep apnea is an oxidative stress disorder: most of its consequences are thought to be due to an imbalance between the generation and clearance of reactive oxygen species in different tissues, including the central and peripheral nervous system, the liver, or the circulatory system (Quintero et al., 2013; Almendros et al., 2014; Lavie, 2015; Prabhakar et al., 2015). Estradiol and progesterone are well known for their anti-oxidant functions, and we should ask how relevant this is for the development or treatment of sleep apnea in women.

One should keep in mind that an important drawback of the sex-specific occurrence of sleep- apnea is that women are largely under-represented in sleep apnea clinics and research protocols: in a population-based survey including 389 participants (16-84 years of age) 38% of men and 15% of women had sleep-apneas, (men:women ratio = 2.5:1), but in the same population, the men:women ratio referred for clinical evaluation of sleep apneas was 8:1 (Redline et al., 1994). On this background, the Society for Women's Health recently recommended the use of animal models to better understand sex-specific sleep disorders (Mallampalli & Carter, 2014). Our current studies are in line with these recommendations: we are using animal models to better understand the effects of progesterone and estradiol as tools acting both as respiratory stimulants and antioxidant agents, therefore modulating both the causes, and the consequences of sleep apnea.

A complex network of progesterone receptors likely involved in respiratory control

Progesterone exerts its physiological functions by binding and activating several specific

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receptors. We have recently reviewed this topic (Joseph et al., 2013; Boukari et al., 2015), and provided data supporting the hypothesis that the respiratory effects of progesterone are mediated by the classic nuclear receptors (Marcouiller et al., 2014), but also by membrane progesterone receptors (Boukari et al., 2016).

Role of nuclear progesterone receptor in respiratory control and apnea frequency

Several isoforms of the nPR can be synthesized by alternative splicing of a common gene, among these nPR-A and nPR-B are transcription factors regulating gene expression in presence of their ligands and coactivators (Camacho-Arroyo et al., 2007; Gonzalez-Flores et al., 2011). nPRs are present in brain areas involved in respiratory control such as brainstem and hypothalamic nuclei, at the middle and caudal levels of the nucleus tractus solitarius (NTS - (Haywood et al., 1999), which are also the main projection sites of the peripheral chemoreceptors (Finley & Katz, 1992).

A weak nPR immunostaining has also been reported in the hypoglossal nuclei (Behan & Thomas, 2005)- that provides innervation of the upper airways dilator muscles - and nPR are also expressed in the peripheral chermoreceptors (Joseph et al., 2006). Therefore, the nPRs are expressed in the peripheral and central components of the chemoreflex pathways. We showed that in adult female mice lacking expression of nPRs, the frequency of sighs and apneas during sleep was enhanced and that the stimulating effect of progesterone on ventilation during sleep and in response to chemoreflex stimulation was reduced (Marcouiller et al., 2014). These results were in line with previous studies in rats showing that systemic administration of progesterone decreases the frequency of apneic episodes recorded during sleep by almost 80% in 26-weeks old rats and that these effects were blocked by pre- treatment with mifepristone, a nPR antagonist (Yamazaki et al., 2005).

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Role of membrane progesterone receptors in respiratory control and apnea frequency

Aside from these classical receptors, most steroid hormones, including progesterone, are also able to elicit rapid (within minutes) neuronal responses, and it has long been thought that membrane-bound steroid receptors should be present to mediate these effects(Orchinik et al., 1991; Revelli et al., 1998; Watson & Gametchu, 1999). The discovery and characterization of membrane progesterone receptors in sea trout ovaries (Zhu et al., 2003a; Zhu et al., 2003b), lead to rapid progresses in this field, and it is now clear that these receptors mediate several important effects of progesterone in the central nervous system (Thomas & Pang, 2012) and on vascular reactivity (Pang et al., 2015). Membrane progesterone receptors (mPRs) are seven-transmembrane proteins, belonging to the progestin and adipoQ receptor family (PAQR) (Smith et al., 2008; Thomas, 2008; Thomas & Pang, 2012). Five distinct mPRs that are encoded by different genes have been identified, designated as mPRα (PAQR7), mPRβ (PAQR8), mPRγ (PAQR5), mPRδ (PAQR6), mPRε (PAQR9) (Pang et al., 2013). mPRα, mPRβ, and mPRγ are coupled to inhibitory G-proteins while mPRδ and mPRε are coupled to stimulatory G-proteins (Pang et al., 2013).

All mPRs are expressed in the brain, and among them mPRδ appears to have the highest level of mRNA expression in the human brain, including in the hypothalamus, pons and medulla (Pang et al., 2013), which are known for their contributions to the respiratory control system (Behan & Kinkead, 2011). mPRε and mPRβ are also expressed at high level in the human brain, while mPRα has a lower level of mRNA expression (Pang et al., 2013). In rats and mice, there is a widespread expression of mPRa mRNA and protein in neurons, and in rats, the expression of mPRα protein is induced in oligodendrocytes, astrocytes and reactive microglia following traumatic brain injury (Meffre et al., 2013). Previous experiments also showed consistent expression of mPRα and mPRb in the spinal cord in mice (Labombarda et al., 2010). Interestingly, the expression levels of mPRa and mPRb are similar in males and females, and in males the expression level of mPRα is not affected by the circulating level of progesterone or estradiol (Meffre et al., 2013). In the spinal cord of male and female mice the expression level of mPRα and mPRb are not affected by the deletion of nPR

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(Labombarda et al., 2010). These later results suggest that the functions of mPRs do not vary between sexes, and are not affected by circulating hormones. Finally, it is also highly intriguing that based on their binding properties, distinct mPRs could be activated by different steroids: mPRα and mPRb have the highest affinity for progesterone (compared to mPRδ and mPRε), while mPRε is preferentially activated by allopregnanolone (Pang et al., 2013), the neuroactive metabolite of progesterone.

To assess whether these receptors could be involved in the respiratory effects of progesterone, we first sought to determine if they are expressed in the central respiratory areas. We provided evidence that mPRα and mPRb are localized in brainstem areas that are involved in respiratory control, including the NTS and the hypoglossal motor nuclei. Our preliminary experiments suggested a key role for mPRb on the respiratory response to hypoxia (Boukari et al., 2015). To further document the role of mPRα and mPRb on respiratory control, we used adult male and female mice to perform infusion of siRNA against mPRα or mPRb into the IVth ventricle over 2 weeks (Boukari et al., 2016). The treatment reduced the expression of the mPRα or mPRb in caudal and rostral parts of the NTS, in line with previous studies showing that such long-term treatment with siRNA reduces the expression of the target protein by about 50% with a radius of action of 5 to 6 mm around the infusion point (Thakker et al., 2004). After 2 weeks of treatment, we performed long- term (4 hours) recordings of the breathing pattern to ensure a resting state during which mice are most likely to be asleep. We then assessed assess the frequency of apnea at rest and the ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia. Interestingly, our results showed that treatment with a siRNA against mPRb tripled the frequency of apneas during sleep and completely abolished the ventilatory response to hypoxia in male and female mice. By contrast the treatment with a siRNA against mPRa had no effect of apnea frequency during sleep, and reduced by about 50-60% the ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia (Boukari et al., 2016). These data are summarized in table 4, comparing the effects of the nPR, mPRα and mPRb on respiratory responses to hypoxia and hypercapnia as reported from our previous studies in adult female mice (Marcouiller et al., 2014; Boukari et al., 2016). Of note, in table 4 the effect of nPR on the ventilatory response to hypoxia is seen only in rats

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treated with progesterone .

The treatment with the siRNA against mPRb had profound effects on the ventilatory response to hypoxia. To further document this effect, a subset of the mice treated with the siRNA against mPRb or with the vehicle (aCSF) have been exposed to a brief (60 seconds) period of hyperopia (70% O2) during our recordings. Here we report that the decrease of respiratory frequency during the hyperoxic exposure is abrogated by the siRNA against mPRb in male and female mice (Figure 42).

Tableau 4: Specific contributions of nPR, mPRα or mPRβ on ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia in adult female mice.

-: no effect, ++ contributes to about 50% of the response, ++++ contributes to >90% of the response. Data from (Marcouiller et al., 2014; Boukari et al., 2016).

nPR mPRα mPRβ

Hypoxia - - ++++

Hypercapnia ++ ++ ++

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Figure 42: Effect of siRNA against mPRβ on chemoreflex function evaluated by exposure to hyperopia in unanesthetized adult male and female mice treated with artificial cerebrospinal fluid (aCSF) or siRNA against mPRβ.

A: Typical respiratory recording in a control mouse before and during exposure to 70% O2. B: Regular breathing pattern before the hyperoxic exposure. C: Transient decline of ventilation in response to hyperopia. Respiratory frequency (fR, breaths/min). D: Absolute difference of respiratory frequency (Delta fR in breaths/min) between groups. E: Absolute difference of tidal volume (Delta Vt in ml/100g) between groups. Data are means ± S.E.M. *, *** p<0.05 and p<0.001 for the effect of siRNA against mPRβ vs aCSF.

149

This finding corroborates our previous study showing the effects of the siRNA against mPRb, and thus give further support to the hypothesis that mPRb is essential for adequate integration of the peripheral chemoreceptors inputs in the brainstem. In future experiments, it would be interesting to address whether this effect is mediated by pre- or post-synaptic components of the respiratory chemoreflex pathway, and which intracellular mediators are involved.

Role of nuclear and membrane progesterone receptors in respiratory control and apnea frequency in males

One of the intriguing results that we obtained is the role of mPRa and mPRb on the frequency of apnea during sleep and on the chemoreflex functions in male mice. Progesterone is produced in males by the adrenals and in the central nervous system, where it has neuroprotective functions (Guennoun et al., 2015). Our data suggest that progesterone receptors contribute to respiratory regulation in females but also in males. Indeed, in mice treated with the siRNA against mPRb the frequency of apneas during sleep is increased and the ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia are reduced in males and females (Boukari et al., 2016). Figure 43 summarizes these effects, by presenting the frequency of sighs and post-sigh apneas recorded during sleep in male and female mice treated with the siRNA against mPRa and mPRb (Boukari et al., 2016). We also compare these data with those reported in male and female mice knocked-out for the nuclear progesterone receptor (PRKO). Data from the female PRKO mice have been previously published (Marcouiller et al., 2014), while the data from the male PRKO mice have been obtained under strictly similar conditions and analyzed using similar criteria, but were not published so far. The deletion of nPR increases the frequency of sighs similarly in male and female mice, while the reduced expression of mPRb induced by siRNA increased the frequency of sighs only in males (Figure 43). In contrast, the deletion of nPR increased the frequency of post-sigh apneas in females but not in males, while the treatment with the siRNA against mPRb increased apnea frequency in males and females to a similar extent. These data indicate that sex-specific effects of these receptors should be considered in further research.

150

Figure 43: Contribution of progesterone receptors on frequency of sighs and post-sigh apneas in adult mice

A: sex-specific effects of the nuclear progesterone receptor on the frequency of sigh and post- sigh apneas during non-REM sleep. B: effects of membrane progesterone alpha (mPRα) and beta (mPRb) on the frequency of sigh and post-sigh apneas during non-REM sleep. We previously published the fata from PRKO female mice (Marcouiller et al., 2014) and mice treated with the siRNA against mPRα or mPRb (Boukari et al., 2016). Please see text for further details. Data from PRKO male mice are unpublished data from our laboratory.

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Overall, these data indicate that the effects of progesterone as a respiratory stimulant are not mediated by a single mechanism, but most likely by a series of complex interactions between different types of receptors localized in the central and peripheral elements of the respiratory control system. We need to recognize the complexity of these mechanisms, ask which of these receptors mediate the respiratory effect of progesterone, and assess their potential effects in males as well as in females. Ultimately, this could lead to innovative treatment strategies for sleep apnea, at least in women.

Antioxidant roles of Estradiol and progesterone in intermittent hypoxia and sleep apnea?

Sleep apnea is an oxidative stress disorder

Besides the obvious interest of using respiratory stimulant drugs or devices such as CPAP to avoid airway collapse during sleep, one additional strategy to alleviate the consequences of sleep apnea could be to mitigate the noxious cellular responses that are mainly produced by intermittent hypoxia (IH) generated by the apneas. In that regards, numerous studies in humans and animal models support the notion that IH induces a potent oxidative stress (Peng et al., 2003; El Solh et al., 2006; Dumitrascu et al., 2013; Peng et al., 2013; Eisele et al., 2015; Lavie, 2015; Prabhakar et al., 2015). In human suffering from sleep apneas, there are clear-cut signs of oxidative stress such as excessive production and release of reactive oxygen species (ROS) by leukocytes, increased lipid peroxidation and reduced antioxidant capacity (Eisele et al., 2015).

"Oxidative Stress" is defined as an imbalance between the production of ROS and antioxidant defenses, which may lead to tissue injury (Betteridge, 2000). Free radicals are chemical species that contain an unpaired electron (such as the hydroxyl radical •OH, or superoxide •- O2 ) that increase their chemical reactivity. These molecules have a very short-half life and react locally causing alterations in the chemical structure of any nearby molecules (proteins, fatty acid, or DNA), which ultimately will alter cellular functions and lead to pathological

152

• •- responses. Production of OH and O2 is inherent to the chemical reduction of oxygen during

•- aerobic respiration, and cannot be avoided. For example, the ion superoxide (O2 ) is generated as electrons leak from the electron transport chain to react with molecular oxygen in the mitochondrial matrix (Cadenas & Davies, 2000). Free radicals are also produced by cytosolic enzymes such as NADPH Oxidase (NOX), Xanthine Oxidase, and Monoamine Oxidase for the most important (Lavie, 2015). ROS are rapidly converted to less aggressive chemical species by the “antioxidant enzymes” including superoxide dismutase (SOD) that

•- reduces O2 to hydrogen peroxide (H2O2), and gluthatione peroxidase (GPx) or catalase that reduces H2O2 to H2O. In general, it is admitted that the balance between the activities of pro- oxidant and antioxidant enzymes determines the overall load of “oxidative stress”: for example, an increased activity of pro-oxidant enzyme can be compensated by a parallel increase of the activity of antioxidant enzymes to avoid excessive oxidative stress.

Many studies suggest a tight link between sleep apnea, oxidative stress, the development of systemic hypertension, neurological impairments, or metabolic alterations (Almendros et al., 2014; Olea et al., 2014; Gileles-Hillel et al., 2016): 60% of untreated sleep apnea patients are three times more likely to develop hypertension (Nieto et al., 2000; Peppard et al., 2000), and sleep apnea syndrome is present in 70 to 85% of patients with resistant hypertension (Logan et al., 2001; Torres et al., 2015). Furthermore, in apneic patients, oxidative stress correlates with markers of cardio-vascular diseases such as high blood pressure and endothelial dysfunction (Eisele et al., 2015). Experimental studies show that exposure to intermittent hypoxia increases the mean arterial pressure in young healthy humans (Foster et al., 2009; Tamisier et al., 2011)and animals (Fletcher, 2001). One the most largely acknowledge mechanism underlying this response is an increased activity of the sympathetic system triggered by oxidative stress and enhanced activity of the peripheral chemoreceptors (Fletcher, 2001; Peng et al., 2003; Peng et al., 2013; Prabhakar et al., 2015). Indeed, in the peripheral chemoreceptors of rats exposed to IH the activity of the complex I of the mitochondrial electron transport chain is reduced (Peng et al., 2003) and the expression of the NADPH oxidase family members Nox1, Nox2, and Nox3 is increased (Kahn et al., 2003; Peng et al., 2003; Prabhakar et al., 2015).

153

Because of these widespread evidence that IH-induced ROS synthesis contributes to the deleterious effects of IH, it has been proposed that antioxidant drugs could be used to mitigate the morbidities associated with the oxidative stress. Some successful experiments have been conducted: in rats, MnTMPyP, a membrane-permeable SOD mimetic, prevents the effects of IH on the sensory activity of the peripheral chemoreceptors (Peng et al., 2003). Other antioxidant molecules such as ibuprofen and ascorbic acid also reduce these effects, and efficiently prevent the development of hypertension in rats exposed to IH (Iturriaga et al., 2015). Clinical studies are consistent with these data, and it has been shown in apneic patients that treatment with the antioxidant vitamin C (Grebe et al., 2006; Buchner et al., 2011) or with allopurinol, a xanthine oxidase inhibitor (El Solh et al., 2006) can reduce vascular dysfunction.

Estradiol reduces blood pressure and oxidative stress in intermittent hypoxia

Estradiol (E2) and progesterone are well known as anti-oxidant drugs (Moorthy et al., 2005; Borras et al., 2010). These two hormones can regulate the activity of NADPH oxidase (Brann et al., 2012), increase mitochondrial respiration thereby reducing ROS production (Nilsen & Brinton, 2004; Razmara et al., 2008; Borras et al., 2010), and they also increase SOD and GPx activity (Pajovic & Saicic, 2008). Based on these observations, we hypothesized that E2 could have a protective effect against oxidative stress induced by exposure to intermittent hypoxia. To address this hypothesis, we used ovariectomized female rats exposed to intermittent hypoxia for 7 days (IH: nadir 10% O2, 10 cycles/hour, 8 hours/day) and treated with vehicle or with E2 continuously delivered by an osmotic pump (Laouafa et al., 2016). We performed a series of physiological measurements (arterial blood pressure, stability of the breathing pattern during sleep, and ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia). Finally, we assessed the activity of pro- and antioxidant enzymes in the brainstem, brain cortex, and adrenal glands.

As expected, our results showed that IH enhanced the arterial blood pressure, increased the frequency of apneas during sleep, and enhanced the ventilatory response to hypoxia, which

154

are indirect evidence of increased activity of the peripheral chemoreceptors (Peng et al., 2014; Prabhakar et al., 2015). The brain cortex showed the strongest effect concerning enzyme activities: IH increased the activity of NADPH and xanthine oxidase and decreased SOD and GPx activity. SOD activity was equally decreased by IH in the cytosolic and mitochondrial fractions showing damages linked to oxidative stress in different cellular compartments.

Female rats exposed to IH and treated with E2 had a normal blood pressure, a stable breathing pattern during sleep and a normal ventilatory response to hypoxia. In the brain cortex, E2 treatment also prevented the effects of IH on pro-oxidant and antioxidant enzymes activities.

Interestingly, E2 normalized SOD activity both in the cytosol and mitochondrial fractions, potentially through different estradiol receptors (see below). Overall, these results clearly demonstrate the protective effects of E2 against oxidative stress damages induced by IH, and suggest an effect of E2 on mitochondrial functions during exposure to IH. This is in line with previous studies showing that at normal intracellular concentrations (in the nM range) E2 prevents the formation of ROS by mitochondria, protects mitochondrial integrity (indicated by an increase in mitochondrial membrane potential), and prevents the leakage of cytochrome c from mitochondria (a process that induces apoptosis) (Borras et al., 2010).

Estradiol receptor alpha reduces blood pressure in intermittent hypoxia

Both estradiol receptors are present in the mitochondria: ERα mediates the effects of estradiol to increase the expression of cytochrome c (transfer electron between complexes III and IV of the electron transfer chain) in brain endothelial cells (Razmara et al., 2008). ERβ on the other hand activates the mitochondrial transcription of cytochrome oxidase I subunit (COXI), presumably through biding on mitochondrial DNA, and both ER (ERα and ERβ) enhance the transcription of the COXIV, which is coded by nuclear DNA (Irwin et al., 2012). These modulations of mitochondrial function by E2 are thought to mediate some of the cardiovascular and neurological protective effects observed in women before menopause, and have even been proposed to be responsible for the longer life expectancy in women compared to men (Nilsen & Brinton, 2004; Razmara et al., 2008; Arnold et al., 2012; Irwin et al., 2012).

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Accordingly, future experiments should seek to determine the relative contribution of ERα and ERβ in the protective effects of E2 reported under IH exposure. To approach this question, we repeated our experimental protocol: as exposed above, adult female rats were ovariectomized (OVX) and at the same time were implanted with an osmotic minipump (subcutaneous) that continuously deliver vehicle or propylpyrazole triol (PPT – a specific ERα agonist – 30 µg/kg/day). Two weeks following the surgery, the animals are exposed to IH for 7 days, and then we recorded arterial pressure via a non-invasive approach with a tail cuff sensor. Control animals are OVX female rats implanted with a minipump delivering vehicle and kept in room air throughout the experiment. The results clearly support the hypothesis that ERα protects against the elevation of arterial blood pressure induced by IH (Figure 44), supplemental analysis and experiments should be carried out, including treatment with a selective ERβ agonist. Once completed, we will have clearly established the roles of ERα and ERβ against the deleterious consequences of IH, and we expect that this knew knowledge could be translated to improve women’s respiratory health.

Does estradiol protect against vascular damages in intermittent hypoxia?

While IH activates the sympathetic system through oxidative stress in peripheral chemoreceptors, IH and elevated ROS production also activate transcription factors that enhance the expression of pro-inflammatory pathways and the production of adhesion molecules in the vascular endothelium. This may lead to endothelial dysfunction – a common finding in patients with obstructive sleep apnea (Budhiraja et al., 2007; Foster et al., 2007; Atkeson & Jelic, 2008; Atkeson et al., 2009), promotes atherosclerosis, and further re-enforce the arterial hypertension (Lavie, 2015). “Endothelial dysfunction” specifically refers to an impairment of endothelium dependent vasodilation caused by a decreased bioavailability of vasodilator substances in the vessel wall (Poredos, 2002).

Pre-menopausal women have significantly lower risk of developing cardiovascular diseases than men of the same age or postmenopausal women (Amigoni et al., 2000; Cannoletta & Cagnacci, 2014; Maric-Bilkan et al., 2014). It was also shown that this sexual dimorphism of cardiovascular diseases is mainly mediated by estrogens, which play a key role in

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regulation of the vascular tone. By binding to the estrogen receptor (ERα), estrogens increase the production of vasodilator substances such as nitric oxide, or prostaglandins (Chambliss & Shaul, 2002; Darblade et al., 2002) and reduce the production of pro-inflammatory cytokines (Vegeto et al., 1993), increase the bioavailability of nitric oxide, and increases the expression of genes encoding antioxidant enzymes (Vina et al., 2013). Therefore, and based on the results that we obtained in our model of IH and E2 supplementation in OVX female rats, a plausible hypothesis is that E2 also protects against the vascular and circulatory deleterious consequences of IH, thus potentially providing another advantage of hormone therapy in women suffering from sleep apnea.

Figure 44: Effect of propylpyrazole triol (PPT – a specific αER agonist) or vehicle on arterial pressure of adult ovariectomized female rats exposed to intermittent hypoxia (IH) during 7 days. Data are means ± S.E.M. * p<0.5, ** p<0.01, **** p<0.0001

Influence of aging on oxidative stress disorders induced by IH and hormonal effects on respiratory control

Respiratory function declines with age, as well as the ventilatory and peripheral chemoreceptor responses to hypoxia.

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Because peripheral chemoreceptors are essential for the development of hypertension in response to IH, a recent study asked if age protects against the harmful effects of sleep apnea. In aged rats (22–24 months) exposure to IH for 2 weeks has limited effects on the function of peripheral chemoreceptors, does not alter the release of catecholamines (a reflect of the activity of the sympathetic nervous system), does not induce excessive ROS production and oxidative damages, and does not cause hypertension (Quintero et al., 2013). These results are in line with clinical data showing that in aging subjects (>65 years) the severity of the cardiovascular disorders depend on the age of the onset of sleep apnea: less severe disorders occurred if apnea onset was >60 years than <50 years (Kobayashi et al., 2010). Interestingly, in women, the protective effects of hormone replacement therapy on apnea frequency during sleep are no longer apparent above 70 years of age (Shahar et al., 2003). Although much remains to be documented, this lower effect of hormone therapy on apnea frequency in aged women might be due to age-specific effects of ovarian hormones as respiratory stimulant (Wenninger et al., 2009; Fournier et al., 2015), but it could be interesting to determine if the anti-oxidant effects are also reduced or still efficient.

Conclusions

We have presented in this brief review a series of experimental data supporting the hypothesis that progesterone and estradiol are important candidates to consider against sleep apnea in women. Interestingly, these data suggest that ovarian hormones protect against the causes and the consequences of sleep apnea by acting respectively as respiratory stimulant and antioxidant drugs. Our results showing the contribution of nuclear and membrane receptors to mediate the respiratory effects of progesterone lend further support to the hypothesis that progesterone reduces apnea frequency due to its respiratory stimulant role. It therefore critical to pursue specific research to uncover which are the mechanisms underlying this effect, and further consider the variety of progesterone receptors that could be involved, including their potential sex-specific effects. On the other hand, we have reviewed the evidence that estradiol is a potent anti-oxidant drug, and our most recent results show that it protects against oxidative stress damages due to IH. This effect is likely due to a modulation of several

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signalling pathways by activation of ERα and ERβ, affecting cytosolic and mitochondrial components. Moreover, estradiol could be protective against oxidative stress damages in the peripheral chemoreceptors and in the central nervous system, but also in the cardio-vascular system (although this last point remains speculative), and antioxidant functions of progesterone should also be considered. We believe that these observations open new perspectives to understand the effects of IH and sleep apnea in women of different ages and hormonal status, and could lead to new therapeutic avenues.

Acknowledgments: The authors acknowledge François Marcouiller for his contributions to the experimental studies in the laboratory.

Funding: RB supported by a PhD fellowship from Fond de Recherche du Québec - Santé. SL and ARD supported by Région Rhône Alpe (Programme Explo'ra Doc), SL supported by Consulat Général de France à Québec (Programme Frontenac). Study founded by the Canadian Institutes of Health Research (VJ: MOP-102715 and AB: MOP-119272).

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Progesterone receptors expressed in central nervous system contribute to breathing stability of 10 days old rats.

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Résumé

Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle les récepteurs nucléaires de la progestérone (nPR) et les récepteurs membranaires de la progestérone α (mPRα) et β (mPRα) exprimés dans le système nerveux central contribuent dans le contrôle ventilatoire chez le rat nouveau né. L'expression du nPR, du mPRα ou du mPRβ dans le tronc cérébral est atténuée par l'injection intracisternale de petits ARN interférents spécifiques (siRNA) anti-nPR, anti-mPRα, anti- mPRb ou le véhicule (contrôle) chez des rats mâles et femelles de 10 jours. 24 heures après l'injection, la ventilation est enregistrée par la pléthysmographie en normoxie, hypoxie et hypercapnie, 5 mim chacun. Le siRNA-mPRβ a augmenté la fréquence des apnées chez les mâles, mais pas chez les femelles, et le siRNA anti-nPR a augmenté la fréquence des apnées chez les femelles, mais pas chez les mâles. Nous concluons que différents récepteurs de la progestérone ont des effets respiratoires spécifiques chez les rats nouveau-nés mâles et femelles.

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Abstract

We recently demonstrated that nuclear and membrane progesterone receptors contribute to ventilatory chemoreflex or breathing stability in adult mice (Boukari et al, 2017). In the present study, we tested the hypothesis that the nuclear progesterone receptors (nPR) and membrane progesterone receptors α (mPRα) and β (mPRβ) contribute to respiratory regulation of newborns rats. METHODS: Expression of nPR, mPRα or mPRβ in the brainstem region was attenuated by intracisternal injection of specific small interference RNA (siRNA) in 10-day-old male and female rats. An artificial cerebrospinal fluid was administered to the control animals. 24 hours after the injection, minute ventilation

(ml/100g/min) was recorded using whole body plethysmography during normoxia (21% O2,

50 min), hypoxia (12% O2, 5 min) And hypercapnia (5% CO2, 5 mim). The frequency of sighs and apnea was determined in normoxia. RESULTS: Treatments with siRNA-mPRα, mPRβ or nPR did not affect ventilation in normoxia as well as ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia. The treatment with siRNA-mPRα had no effect on apnea frequency, while the siRNA-mPRβ increases the frequency of apneas in males but not in females, and the siRNA against nPR increases the frequency of apnea in females but not in males. CONCLUSION: Different progesterone receptors have specific respiratory effects in male and female newborn rats. This data could be useful to developing pharmacological treatments of apnea of prematurity.

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Introduction

The immaturity of the ventilatory control system in the neonate, especially in the preterm newborn, is at the origin of important respiratory problems such as apnea of prematurity (Brozanski et al., 1989; Cardot et al., 2007; Darnall, 2010; Praud, 2010), which is the most common manifestation related to immature respiratory control systems (Stokowski, 2005). The xanthine therapy is the standard treatment for this type of apnea, but in some cases, apnea persists beyond 37 weeks of gestational age (Martin et al., 2004; Mueni et al., 2009; Martin & Wilson, 2012; I et al., 2017). Interestingly, progesterone has a therapeutic potential to counter respiratory problems not only in adults (Tatsumi et al., 1986; Okita et al., 1987; Kimura et al., 1988; Kimura et al., 1989; Jelev et al., 2001) but also in those associated with prematurity. In fact, Finer et al. suggested that progesterone should be considered in future studies as part of research for a new treatment for apnea of prematurity (Finer et al., 2006). Indeed, progesterone is a well-known respiratory stimulant and reduces apneas in adult human (Skatrud & Dempsey, 1983; Saaresranta & Polo, 2002; Shahar et al., 2003) and in adult and neonate rats (Kimura et al., 1984; Bayliss et al., 1987; Lefter et al., 2007). Thus, progesterone could be a potential solution to replace the xanthine therapy against resisting apneas (Finer et al., 2006) but the mechanisms underlying these effects remain poorly understood.

Progesterone is considered as a neurosteroid synthesized within the central and peripheral nervous system (Baulieu & Robel, 1990; Baulieu, 1998). In addition, several studies have reported the presence of progesterone-sensitive neurons in the brain. The presence of progesterone receptors expression in the developing brain could indicate their involvement in fundamental mechanisms of neural functioning and development (Mellon, 2007; Quadros et al., 2007; Quadros et al., 2008). The data indicate that the membrane peogestreone receptor a and β (mPRa and mPRβ) are expressed centrally; in spinal cord and brain including in the corpus callosum, hippocampus, hypothalamus, cerebellum (Guennoun et al., 2008; Labombarda et al., 2010; Meffre et al., 2013; Pang et al., 2013; Guennoun et al., 2015). The Interestingly, these receptors have been localized in regions involved in respiration at the

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level of the brainstem, in particular at the caudal and rostral NTS and the cranial motor nuclei of the vagus (X) and hypoglossal (XII) nerves in adulte mice (Boukari et al., 2015), and at the level of the spinal cord (Labombarda et al., 2010). In addition, the nuclear progesterone receptors (nPR) are localized in the carotid body (Joseph et al., 2006), and the brain during postnatal developpement (Quadros et al., 2007; Quadros et al., 2008).

Some studies were undertaken in our laboratory in order to understand the mechanisms underlying the beneficial respiratory effects of progesterone in neonates. It was demonstrated that daily administration of mifepristone (a non-speciﬁc progesterone receptor antagonist) in newborn rats, significantly decreases the carotid sinus nerve response to hypoxia (Joseph et al., 2012). Then, we showed in new born knockout nuclear progesterone receptors (PRKO) mice the presentece of a significant decrease of ventilatory response to hypoxia in comparison to wild type mice (Potvin et al., 2014). Those results indicate a key contribution of endogenous progesterone for adequate development of the respiratory response to hypoxia. Interestingly, we also demonstrated that the respiratory effect of progesterone is a balance between the stimulant effects of progesterone and inhibiting action of its neurometabolite allopregnanolone (Joseph et al., 2018). Interestingly, in newborn rats (postnatal days 10-12, P10 and P12) systemic admiration of R5020, a nPR agonist, decreased the frequency of apnea in males, Org-OD-02-0, a mPR agonist, decreased the frequency of apnea in males and females, indicating sex-specific contribution of the diverse progesterone receptors (Joseph et al., 2018).

In adult male and female mice, we also showed that mPRβ is also an important element for stability of the breathing pattern and ventilatory chemoreflex. mPRβ expression is necessary to estabilish sex-speciﬁc ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia in adult mice (Boukari et al., 2016). In the present experiments we sought to determine the contribution of mPRα, mPRβ and nPR on the breathing stability and ventilatory chemoreflex in neonates.

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Materials and methods

Animals:

All animals were maintained in strict accordance with the recommendations of the Canadian Council on Animal Care. Our experimental protocols were approved by the committee on the protection of animals of the Centre Hospitalier Universitaire de Québec Research Centre (permit no.: 2012023). Twelve Sprague-Dawley female rats (Charles River colony, Qc) were mated with males. Pregnant and lactating females were maintained in a temperature- and light-controlled room (14:10 light:dark) with food and water available ad libitum. Pregnant females were left undisturbed for the duration of their pregnancy.

All efforts were made to minimize suffering, reduce the number of animals used, and provide enrichment in housing conditions. We used a total of 33 male and 42 female newborn rats.

Experimental Design

We first verified that the intracisternal injection site effectively targeted the cysternal cavity. Two females and two males rats 10 days old (P10) were deeply anesthetized under 4 % isoﬂurane. We carefully injected 10 µL of 0.5 % methylene blue. The rats were sacrificed 1 hour later with an overdose of anesthetics, the brain was removed and the whole brain examined to check intracranial vasculature changes following intracisternal injections. We observed clear colouration with the blue dye at the cisternal cavity and around it in the brain, conﬁrming the site of the injection.

For central injection of the siRNA, P10 rats were anesthetised with 3 % isoﬂurane. During the time of anesthesia induction, the rat was kept on a warm pad. Then it is placed in stereotaxic frame and the head is secured. The surgical site is cleaned with 10% povidone iodine, and a sagittal incision of the skin is made inferior to the occiput. The rat is laid down with the head forming a nearly 135o angle with the body. The dura mater is blotted dry with sterile cotton swab and we carefully injected 10 µL of 5 µg/mL (50 µg) of siRNA, as

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previously described in (Boukari et al., 2016). siRNAs against mPR α (GCCCUUCUGUCACAAGUtt), against mPRβ (GAAGAUCUGUCAAGUGGUAtt), or against nPR (GAGAUGAGGUCAAGCUAUAtt) (Ambion in vivo siRNA, ThermoFisher Scientific) or an artificial cerebrospinal fluid (aCSF; in mM: 129 NaCl, 3.35 KCl, 0.58

NaH2PO4, 1.15 MgCl2, 1.26 CaCl2, 21 NaHCO3, 30 glucose). After the surgery, the rats were returned back into their litter to recovery. Pre- and postoperative analgesia was administered following standard procedures. 24 hours after the siRNA injection, the animals were placed in the whole-body plethysmograph chamber for continuous respiratory and metabolic recordings for 1 hour. The chamber was then opened after 10 min for measurement of rectal temperature. To measure respiratory chemoreﬂexes, the animals were exposed to hypercapnia (5% CO2) and hypoxia (12% O2) in randomized order, 5 min each, separated with normoxia for at least 5 min, or until the animal had a stable breathing pattern with a breathing frequency similar to the baseline value. Those stimuli were randomized and followed by 5 min of normoxia for recovery.

Recording of Respiratory and Metabolic Parameters:

Set up details and respiratory, metabolic signal analysis at rest and in response to gas challenges are the same as previously used (Boukari et al., 2016; Joseph et al., 2018). Briefly, for all animals we selected periods of stable and regular breathing pattern that lasted few minutes to determine the respiratory and metabolic variables. During hypoxic or hypercapnic exposures, we have selected portions of stable and regular breathing pattern during the last two minutes of exposure, and all ventilatory variables were expressed as percentage of variation from baseline.

Respiratory frequency and tidal volume were calculated breath-by-breath using a custom script in Spike 2, then values of baseline ventilation were determined on the portions of the recording during which the breathing pattern was stable and regular, with the lowest respiratory frequency. For each breath, the software integrated the portion of the calibrated flow trace corresponding to inspiration, and the corresponding volume was corrected by using the standard equation described for the whole body plethysmography (Drorbough &

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Fenn, 1955; Bartlett & Tenney, 1970). Metabolic rate was determined during baseline recordings by selecting portions where CO2 in the outflowing gas line displayed the lowest . V V O CO value. 2 and 2 were calculated as follows:

. V O2 = Flowi {FiO2 −[FeO(1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]} and

. V CO 2 = Flowi {[FeCO2 (1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]− FiCO2 }

Where Flowi is the flow rate of gas measured in the inflowing line, Fi and Fe are fractions of the corresponding gas measured in the inflowing (Fi) and outflowing (Fe) lines respectively. This equation allows the correction for the changes of gas composition in the inflowing and outflowing gas lines due to the activity of the animal, and the day-to-day variability of CO2

. . and H2O in ambient air V E , V O and V values were used to report minute ventilation as 2 CO 2 . . . . a function of O2 consumption ( V E V O2 ) and CO2 production rate ( V E V CO2 ) during baseline conditions.

Sigh, post-sigh apnea, and spontaneous apnea frequency:

For breathing instability analysis, we have selected periods of about 20 min of stable breathing pattern typically towards the end of the baseline recording. We used the standard criteria to determine a sigh as a profound inspiration with a volume that is at least twice the normal VT, and a rapid expiration that can be followed by apneas (2 missed breaths, determined by breathing frequency at rest for each animal) (38). We determined the frequency of sighs, post-sigh apneas, and spontaneous apneas, as performed previously in P10 rats (Lefter et al., 2007; Boukari et al., 2016).

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Statistical Analysis

All values obtained during normoxia including respiratory and metabolic parameters and apnea frequencies have been analyzed with a two-way ANOVA by using sex and treatment (aCSF, siRNA mPRa, siRNA mPRb and siRNA-nPR) as grouping variables. We used a post-hoc analysis (Fisher's LSD test) to test for significant effects within each sex (effect of treatment in males and females) or treatment (effect of sex in each group), where needed. Responses to test gas have been analyzed separately in males and females with a two-way ANOVA. We used the GraphPad Prism software (version 6.0c for Mac OSX) for all analyses. All values are reported as the means ± S.E.M, and the significant P value was set a 0.05. P values are reported in the figures with the following general pattern: *, ** or ***: used to report P< 0.05, 0.01, 0.001 respectively.

Results

Effects of siRNA against mPR-α, mPRβ and nPR on minute ventilation and metabolic rate in normoxia:

Treatment with siRNA against-mPR-α, mPR-β or siRNA-nPR didn’t significantly alter respiratory variables in normoxia (Figure 45). However, there was significant interaction between sex and treatment (P = 0.04) and the post hoc analysis has indicated that the siRNA against mPR-α significantly decreased respiratory frequency in male (P = 0.01) but not in female, without affecting, tidal volume and minute ventilation (Figure 45). The treatments

.  with the different siRNA didn’t significantly affect the V O2 , VCO , the metabolic equivalent 2 . . . E E  ( V / V O2 and V / VCO ) (Figure 46), or the ventilatory responses to hypoxia and 2 hypercapnia (Figure 47).

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Figure 45: Effect of siRNA against nPR, against mPRα or against mPRβ on ventilation recorded during normoxia in female and male 10 days-old rats.

VE (minute ventilation), fR (respiratory frequency) and VT (tidal volume ) recorded in normoxia in adult female mice treated with the artificial cerebrospinal fluid (aCSF, control), siRNA against nPR (siRNAnPR), siRNA against mPRα (siRNAmPRα) or siRNA against mPRβ (siRNAmPRβ). All values are mean ± S.E.M. * : P< 0.05

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Figure 46: Effect of siRNA against nPR , mPRα or mPRβ injection on respiratory metabolism recorded during normoxia in female and male 10 days-old rats

O2 consumption, and CO2 production rates (VO2, VCO2), respiratory equivalent of O2 and CO2 (VE/VO2 and VE/VCO2) recorded in normoxia in adult female mice treated with the artificial cerebrospinal fluid (aCSF, control), siRNA against nPR ( siRNAnPR), siRNA against mPRα (siRNAmPRα) or siRNA against mPRβ (siRNAmPR β). All values are mean +/- S.E.M.

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Female Male

Figure 47: Effect of siRNA against nPR, mPRα or mPRβ on chemoreflex function in female and male 10 days-old rats.

VE (minute ventilation), fR (respiratory frequency) and VT (tidal volume ) recorded in hypoxia (12% O2) and in hypercapnia (5% CO2) in P10 rat female mice treated with aCSF (control), siRNA against nPR ( siRNA-nPR), siRNA against mPRα (siRNAmPRα) or siRNA against β (siRNAmPR β). All values are mean +/- S.E.M.

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Effect of treatment with siRNA against mPR-α, mPRβ and nPR on sighs and apnea Frequency during normoxia:

The treatment with the siRNA against nPR induced a significant increase of spontaneous apnea frequency in female rats (13.1± 3.0 vs 40.4 ± 12.0 apnea/hour, P= 0.001), post-sigh apnea (61.01 ± 7.9 vs 33.7 ± 3.64 apnea/hour, P= 0.001) and total apnea freaquency (101.46 ± 15.39 vs 46.86 ± 4.64 apnea/hour, P=0.0003) in comparison with the control rats, with no effect on sigh frequency. The siRNA against mPR-β increased the total apnea frequency in male (treatment 82.4 ± 15.8 vs 51.3 ± 10.0 apnea/hour, P=0.046, P value for sex x treatment = 0.01) with no effect of the siRNA against mPRa on apnea frequency in both sexes (Figure 48).

Discussion

The result of the present study indicates that nPR and the mPR-β located in the brain contribute to breathing stability in developing rats in a sexe-specific manner in P10 rats. The endogenous progesterone signalling via nPR could therefore reduce the frequency of apnea in female P10 rats, while the action of progesterone via mPR-β could reduce apnea frequency in male rats. Those effects are not associated with significant effects on ventilation during normoxia, or in response to hypoxic or hypercapnic stimuli.

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Sigh Post-sigh apneas Spontaneous apneas 80 ** 60 ** 40 60 40 40 20 20 20 0 0 0

frequency (n/hour) Male Female Male Female Male Female

Spont+post-sigh apnea 150 aCSF *** 100 * siRNAmPRα siRNAmPRβ 50 siRNA-nPR 0 Male Female

Figure 48: Effect of siRNA against mPRα, against mPRβ or against nPR on breathing instabilities recorded during normoxia with female and male 10 days-old rats. Frequency of sighs (n/hour), frequency of post-sigh apneas (n/hour) and frequency of spontaneous apneas (n/hour), recorded in adult female and male mice treated with aCSF (control), siRNA against nPR ( siRNA-nPR), siRNA against mPRα (siRNAmPRα) or siRNA against β (siRNAmPR β). All values are mean +/- sem. *, **, ***: P< 0.05, <0.01 or <0.001 for effect of siRNA vs aCSF.

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Several studies have reported the presence of progesterone-sensitive neurons in the brain. The presence of PR expression in the developing brain could indicate the involvement of progesterone signalling in the fundamental mechanisms of neural functioning and development (Mellon, 2007; Quadros et al., 2007; Schumacher et al., 2007; Quadros et al., 2008; Schumacher et al., 2014).

Indeed, the work of Lefter et al., indicated that the effect of chronic treatment with progesterone in P10 rats significantly increases the ventilatory response to hypoxia and reduced the frequency of spontaneous and post-sigh apneas. Recently, more relevant details have been reported. In fact, contrary to the positive respiratory effects following chronic treatment of progesterone in the pups, acute injection of progesterone reduces minute ventilation and increases the frequency of apneas in P10 to P12 pups. These effects are explained by a balance between the action of progesterone and its rapid conversion to allopregnanolone, an allosteric modulator of GABAA receptors. Interestingly, R5020, a nPR agonist decreased the frequency of apnea only in males, while Org-OD-02-0, an mPR agonist decreased the frequency of apnea in males and females. This indicates that apnea in newborns is a sex-influenced balance in rat, between the stimulatory effects exerted via the progesterone receptors or the inhibitory effects exerted by allopregnanolone via the GABA receptors (Joseph et al., 2018).

In the presented study, the central administration of siRNA against- mPRβ significantly increase apneas in males with a small tendancy to increase apnea frequency in female but it was not statistically significant. So, the mPRβ could contribute to reduce the total apneas frequency at least in males. On the other hand, the central administration of siRNA against- nPR increases the frequency of spontaneous and post sigh apnea in female only. However, Joseph et al. demonstrated that the systemic stimulation of nPR by admiration R5020, decreased the frequency of apnea only in males. In addition, in mice knocked-out for the nPR the frequency of apnea was not affected compared to control wild-type mice (Potvin et al., 2014). Overall, these results could indicate a contribution of progesterone receptors in peripheral level contribute to breathing stability, Also, we have to take into consideration that

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non-coherent effect between systemic and central effects could result from the variety of experimental models (mouse vs rat), systemic vs local treatment and the timing of injection.

Regarding the respiratory chemoreflex, there are evidences that progesterone signalling via nPR is a key mechanism of hypoxic ventilatory response in newborns. Indeed, the daily administration of mifepristone (a nonspecific progesterone receptor antagonist) in neonatal rats have been shown to significantly decrease the response of the carotid sinus nerve to hypoxia (Joseph et al., 2012). In addition, it was demonstrated that in mice the hypoxic ventilatory response is lower in PRKO at P10 in comparison to wild type mice, indicating a key contribution of endogenous progesterone signalling via nPR in ventilatory response to hypoxia (Potvin et al., 2014). However, our results indicate that the treatment with the siRNA against nPR did not affect neither the ventilation during normoxia nor the ventilatory responses to hypoxia and hypercapnia. This discrepancy may be due to: (i) the fact that centrally located nPRs do not contribute to the developing ventilatory chemoreflex. Also, the effects reported in P10 PRKO mice indicated decresed ventilatory response to hypoxia (Potvin et al., 2014). Thus, it reveals a contribution of progesterone receptors at the level of the carotid body. (ii) This could be explained also by compensatory neuronal mechanisms that could be activated after siRNA injections to compensate for the local loss of receptor expression instead of global loss of nPR in PRKO mice. The data set indicates the complexity of progesterone action patterns and thus a significant divergence of induced physiological effects.

Conclusion

Membrane and nuclear progesterone receptors have specific respiratory effects in male and female rats. Consistent with our results in adult model, nPR and mPRb could be potential target to reduce apnea geneses.

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Discussion générale

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Le fait que la progestérone soit un stimulant respiratoire et réduit les troubles respiratoires liés au sommeil est largement reconnu chez les humains ainsi que dans les modèles animaux. En revanche, les mécanismes impliqués sont mal connus.

Les études de ce projet de thèse démontrent que les récepteurs nucléaires (nPR) et les récepteurs membranaires (mPR) de la progestérone influencent la fonction respiratoire chez les rongeurs. Concernant la contribution des nPR, nos résultats indiquent que la délétion de ces récepteurs augmente la fréquence des apnées post-soupirs pendant le sommeil non-REM et réduit la RVHC chez la souris adulte femelle. De plus, nous avons déterminé que la délétion des mPRβ et le mPRα affecte la régulation du chémoréflexe ventilatoire chez la souris adulte mâle et femelle. Le mPRb contribue également à la stabilité respiratoire et son expression semble importante pour l’établissement du dimorphisme sexuel de la RVH et RVHC chez la souris adulte. Concernant le rôle des récepteurs de la progestérone dans la régulation du chémoréflexe chez le nouveau-né, nous avons trouvé les récepteurs nPR et mPRb contribuent chacun à la stabilité respiratoire. Cette contribution dépend du sexe du raton.

L’ensemble de ces résultats est discuté dans ce chapitre. Pour commencer, nous donnons des précisions méthodologiques supplémentaires nécessaires pour la compréhension et l’interprétation de résultats relatifs à cette thèse. Cette partie est suivit par une justification des modèles animaux utilisés dans les différentes expérimentations. Nous discutons par la suite les résultats obtenus. Nous discutons en premier les rôles respiratoires des nPR puis ceux des mPR chez la femelle et le mâle adulte. En fin, nous discutons les rôles de ces récepteurs de la progestérone chez les nouveau-nés. Avant de conclure notre travail, nous suggérons quelques perspectives de recherche.

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Précisions méthodologiques

Puisqu’il n’existe pas d’agoniste ni d’antagoniste spécifique pour le mPRα ou le mPRβ, nous avons eu recours à une méthode génétique en utilisant de petits ARN interférents anti-mPRa ou anti-mPRβ pour réduire spécifiquement l’expression de ces récepteurs au niveau central dans l’étude du chapitre III.

Définition des petits ARN interférents

Les petits ARN interférents (siRNA pour small interfering RNA) sont de petits acides ribonucléiques (ARN) à double brin de 21 à 24 nucléotides (Figure 49). Les siRNA peuvent se lier spécifiquement à une séquence d’ARN messager (ARNm) conduisant à sa dégradation, et ainsi les siRNA induisent une réduction de l’expression de la protéine cible (Guissouma et al., 2006). Les siRNA sont capables de fournir un knock-down spécifique des gènes cibles dans des contextes physiologiques. C’est donc un outil puissant pour évaluer la fonction des gènes ou des protéines issues de ces gènes in vivo (Decherf et al., 2008).

Fonctionnement des siRNA in vivo

Le siRNA exerce un contrôle post-transcriptionnel de la synthèse des protéines. Les siRNA à l'état de double brin sont reconnus dans le cytoplasme de la cellule par le complexe RISC (pour RNA-induced silencing complex) qui est un complexe multiprotéique qui catalyse la séparation des deux brins du siRNA. Le complexe RISC s'active en libérant le brin complémentaire de l'ARN (le brin sens). Une fois activé, ce complexe va reconnaître par complémentarité de bases nucléiques son transcrit cible, un ARN messager. Ce système de reconnaissance assure la haute spécificité de ce mécanisme. Une fois la cible liée, l’endonucléase appelée Argonaute (Ago), faisant partie du complexe RISC, va couper le transcrit au niveau du site de reconnaissance. Les deux morceaux du transcrit clivés par Ago vont être rapidement dégradés par leurs extrémités par des exonucléases. La transfection de petits ARN interférents dans les cellules a donc pour conséquence la destruction spécifique

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des ARN messagers ciblés, empêchant toute nouvelle traduction de la protéine codée par ces ARNm (Figure 49).

Administration des siRNA in vivo

Nous avons choisi des siRNA qui sont conçus pour être stables et induire une réduction efficace du gène cible en minimisant les risques de déclenchement des réponses immunitaires (Ambiom in vivo siRNA, ThermoFisher). De plus, nous avons pris toutes les précautions nécessaires lors de la dilution des siRNA au laboratoire pour éviter la dégradation des siRNA. En fait, tous nos instruments, solutions et la paillasse de travail sont stériles et surtout ne sont pas contaminés par les RNAase. Les solutions sont décontaminées des ARNase à l’aide d’un autoclavage à 0.1% de DEPC (Diethyl pyrocarbonate, Sigma Aldrich), qui est un inhibiteur puissant des nucléases.

Infusion chronique dans le IVe ventricule chez la souris adulte

Nous avons vérifié les coordonnées stéréotaxiques de l'injection intracérébrale ventriculaire (i.c.v.) afin de s’assurer que nous ciblons efficacement le 4e ventricule du cerveau. Pour se faire, trois souris femelles adultes ont été profondément anesthésiées sous isoflurane à 2 % pour l'implantation stéréotaxique d'une canule en acier inoxydable (calibre 28, pompes osmotiques Alzet, Durect Corporation, Cupertino, CA, USA) aux coordonnées suivantes: Bregma -6,12 mm, latéral 0,0 mm, dorso-ventral -4,0 mm (Frankin & Paxinos, 2007).

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Figure 49: Fonctionnement des siRNA in vivo.

Le siRNA (petit ARN interférent) bicaténaire pénètre dans le cytoplasme. Une fois dans le cytoplasme, il est reconnu par le RISC (« RNA-Induced Silencing Complex) catalisant la libération du brin complémentaire du siRNA. Une fois que le brin complémentaire est libéré il s’hybride par complémentarité de séquence à l’ARN messager (mRNA) du gène cible entraînant sa dégradation par des endonucléases du complexe RISC (Santa Cruz Biotechnology, 2018).

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Ensuite, nous avons injecté 1µl de bleu de méthylène à 1% par le cathéter à l’aide d’une picopompe. Les souris sont sacrifiées avec un surdosage d'anesthésie. Les cerveaux sont récupérés, puis rapidement congelés sur de la glace carbonique. Une fois bien congelé, le tronc cérébral de chaque cerveau est coupé à 30 µm d'épaisseur au cryostat puis observé au microscope (Eclipse E600 - Nikon) avec une caméra (Invinity 3 lumenera corporation). Nous avons observé la présence du colorant bleu au niveau du 4e ventricule du cerveau, ce qui valide les coordonnées stéréotaxiques sélectionnées (Bregma -7,08 mm, Figure 50). Page 37 of 38 European Respiratory Journal

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

16 17 18 19 20 Figure 50: Vérification histologique du site d’injection i.c.v. dans le 4e ventricule par une 21 FIGURE 1 22 injection du bleu de méthylène. 23 e 24 Noter la présence de la couleur bleue bien distribuée au niveau du 4 ventricule. 25 26 27 28 29 Figure 1: Histological verification of i.c.v. injection site into the 4th ventricle of the brain by 30 31 injection of methylene blue. See the presence of the blue dye into the 4th ventricle. 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 181 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 7

La pléthysmographie à corps entier

La pléthysmographie à corps entier est une technique non invasive qui permet d’enregistrer les paramètres ventilatoires à savoir la fréquence respiratoire (fR) et le volume courant (VT),

. dont le produit représente la ventilation minute ( V E ). Pour l’enregistrement de la ventilation, l’animal (non contraint et non anesthésié) est placé dans une chambre hermétique appelée chambre de pléthysmographie (Gallego, 2010). Les mouvements ventilatoires de l’animal provoquent des variations de pression à l’intérieur de la chambre de pléthysmographie. Lors de l’inspiration, l’air qui rentre dans les poumons est réchauffé et se trouve saturé en vapeur d’eau. Lors de l’expiration, l’air sera refroidi, et une partie de la vapeur d’eau est condensée. Dans une chambre fermée, les modifications de la température et les gains et pertes de vapeur d’eau déterminent une variation de pression qui est mesurable en utilisant un capteur de pression suffisamment sensible (Drorbough & Fenn, 1955). Comme le système que nous utilisons n’est pas fermé, la ventilation alvéolaire induit une différence de débit plutôt que de pression. En intégrant la valeur du débit, il est possible de calculer le changement de volume équivalent. Les tracés enregistrés sont formés par une succession de cycles respiratoires. Chaque cycle respiratoire est formé par une inspiration suivie d’une expiration (Figure 51).

Les débits et les compositions de l’air entrant et sortant et la température de l’air de la chambre sont des paramètres connus et contrôlés. De plus, la masse de l’animal et sa température rectale sont déterminées. Les différents éléments du poste de travail de la pléthysmographie à corps entier sont représentés dans la figure 52.

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Figure 51: Un exemple de cycle respiratoire obtenu par la pléthysmographie à corps entier (tracé vert) chez une souris adulte en normoxie. 0.1 mL/ min L’aire sous la courbe hachurée en rouge = volume inspiratoire, l’aire hachurée en bleu= volume expiratoire. 0.2 sec

La fR est définie comme le nombre de cycles respiratoires par minute. Le VT est calculé en modifiant les valeurs de volume mesuré par la pléthysmographie en fonction des paramètres ci-dessus, pour être exprimé en mL et normalisé par 100 g d’animal. Le VT est calculé selon l’équation suivante :

�� (�� − ��) �� = �� × �� (�� − ��) − ��(�� − ��)

À savoir que :

Pc= pression de vapeur d’eau dans la chambre d’enregistrement (mmHg), Pr = pression de vapeur d’eau en vapeur d’eau pulmonaire, Pb= pression barométrique. Tr= Température corporelle de l’animal (Kelvin), Tc= Température de la chambre de la pléthysmographie. Vc = le volume de la chambre (mL).

. . Enfin le ( V E , mL/min/100 g) est déterminé selon la relation suivante ( V E = fRxVT). De plus, on mesure également le métabolisme par la méthode de la calorimétrie indirecte, en

. V calculant le volume d’O2 consommé et de CO2 produit par l’animal ( V O2 et CO ) en 2 mL/min/100 g). Pour ce faire, on calcule la différence entre les valeurs initiales de l’air ambiant entrant dans la chambre et les valeurs mesurées à la sortie de la chambre de pléthysmographie selon les équations suivantes :

. V O2 = Flowi {FiO2 −[FeO(1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]}

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. V CO 2 = Flowi {[FeCO2 (1− FiO2 − FiCO2 − Fi H 2O) / (1− FeO2 − FeCO2 − FeH 2O)]− FiCO2 }

À savoir : Flowi = le débit de gaz entrant dans la chambre, Fi et Fe sont les fractions du gaz correspondant mesurées respectivement dans les conduites d'entrée (Fi) et de sortie (Fe). Le

. V rapport de la ventilation minute par rapport au V O2 ou par rapport CO correspondent aux 2

équivalents respiratoires en O2 et en CO2 respectivement ( V! V! et V! V! ). E O2 E CO2

Figure 52: Un schéma de pléthysmographie à corps entier associé à un système de télémétrie pour l’enregistrement de l’EEG et l’EMG de la nuque. Le poste est constitué par un débitmètre (modèle 4140; TSI, Shoreview, MN) permettant de mesurer le débit d’air entrant dans la chambre, un analyseur de pression de vapeur d’eau (« humidity ») (RH 300, Sable systems International, Las Vegas, NV, U.SA) et un capteur de pression différentielle (Emka Technologies, Paris, France), une pompe (EMKA Technologies, Pris, France) qui permet de prendre des échantillons de l’air sortant, des analyseurs d’O2 et du CO2 (Sable Systems International, Las Vegas, NV, U.SA) permettent d’analyser les pourcentages des gaz de l’air entrant et sortant. Les signaux électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG) sont enregistrés par le système. Le signal est amplifié et numérisé avec un système d’acquisition (Micro 1401 data acquisition system Cambridge Electronic Design), puis enregistré sur un ordinateur avec le logiciel Spyke 2 – (version 7.01 - CED).

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Critères de sélections des périodes de repos dans l’étude III

Dans l’étude du chapitre II, nous avons combiné les enregistrements EEG/EMG avec les enregistrements de la ventilation par pléthysmographie pour analyser la ventilation en fonction des états du sommeil. En analysant ces enregistrements, nous avons mis au point des critères permettant de disséquer les périodes d’éveil des périodes de sommeil et encore des états de sommeil non-REM et REM. Les périodes d’éveil sont caractérisées par une amplitude élevée du débit ventilatoire en comparaison des périodes où la souris est au repos ou elle est endormie. Durant le sommeil, nous avons observé deux types de patrons ventilatoires: (i) un patron ventilatoire caractérisé par une fréquence respiratoire et un volume courant régulier qui correspond au sommeil non-REM, et (i) un patron ventilatoire qui correspond au sommeil REM caractérisé par une fréquence respiratoire irrégulière ainsi qu’un volume courant plus petit et irrégulier. Par conséquent, pour la suite de nos expériences du chapitre III, nous avons utilisé ces critères pour sélectionner les périodes du sommeil non- REM. Pour tous les animaux, nous avons choisi des périodes de ventilation stables et régulières qui ont duré au moins 10 minutes. Ces périodes peuvent correspondre au sommeil non-REM, mais par précaution, nous les avons considérées comme des périodes de repos. Ces périodes ont servi pour l’analyse des paramètres respiratoires et des apnées en normoxie (Figure 53 C). Les périodes irrégulières correspondant au sommeil REM ne sont pas considérées dans les analyses (Figure 53 D de l’étude III).

Nos observations sont validées plus tard par Bastiamini et al, qui ont procédé de la même façon pour mettre en évidence cette méthodologie non invasive pour distinguer les états de vigilance éveil/sommeil en se basant seulement sur les enregistrements de la ventilation par pléthysmographie à corps entier et les mouvements chez des souris C57BL/6J (Bastianini et al., 2017).

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Figure 53: Des exemples d’enregistrements du débit ventilatoire, le VT et la fR durant les périodes de repos ou les périodes actives de la souris. A et B représentent les périodes de ventilation régulière et irrégulière respectivement observées durant la période de repos. Les paramètres respiratoires sont déterminés durant les périodes de ventilation régulière. C et D sont les périodes A et B respectivement à une échelle plus large.

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La pertinence de nos modèles expérimentaux

Dans le cadre de ce projet de thèse, les études de la contribution relative de différents récepteurs de la progestérone dans la régulation du chémoréflexe ventilatoire adulte et chez le nouveau-né sont réalisées chez les rongeurs, la souris et les ratons respectivement.

Au cours des deux dernières décennies, la souris et le rat ont été beaucoup utilisés pour comprendre les mécanismes par lesquels les hormones stéroïdiennes influencent la fonction respiratoire. Dans cet axe de recherche, l’utilisation des rongeurs a fourni beaucoup d’informations sur les effets respiratoires de la progestérone, y compris les effets sur le chémoréflexe ainsi que sur la stabilité du patron ventilatoire (Kimura et al., 1990; Joseph et al., 2000; Joseph et al., 2002; Joseph et al., 2006; Lefter et al., 2007; Joseph et al., 2012; Potvin et al., 2014).

D’autre part, les rongeurs sont largement utilisés pour étudier les bases physiopathologiques de l’AS. Leur utilisation a fourni beaucoup d’informations sur les mécanismes de genèse et de la prédisposition aux apnées ainsi que sur les comorbidités causées par l'AS, notamment sur la santé cardiovasculaire, métabolique et cognitive (Fletcher, 2001; Horner, 2007, 2008, 2012; Almendros et al., 2014; Almendros & Garcia-Rio, 2017).

En résumé, les rongeurs comme modèle expérimental ont grandement amélioré notre compréhension de l'AS chez les humains. Donc, ils constituent un modèle intéressant pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette pathologie. Le choix des rongeurs est justifié par plusieurs raisons, dont nous rapportons les plus pertinents ci-dessous.

Les patrons ventilatoires des rongeurs ; le rat et la souris sont caractérisés par une ventilation périodique incluant des apnées. Ces apnées sont produites en absence d'activité électromyographique diaphragmatique (EMG). Donc, les apnées chez les rongeurs sont de type centrales. Christon et al. ont analysé les apnées chez le rat en fonction des différents états du sommeil. Pour ce faire, ils ont combiné l’enregistrement de la ventilation par la pléthysmographie à corps entier aux enregistrements des signaux électromagnétiques (EEG) étéléctromyographiques (EMG) des muscles posturaux du cou, afin de caractériser le sommeil. Ils ont observé des apnées en normoxie et en condition d'hypoxie, d'hypercapnie et

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d'hyperoxie. Une apnée chez les rongeurs est définie comme une cessation du signal de la pléthysmographie pour au moins deux cycles respiratoires (choisis pour imiter une pause supérieure à 10 secondes chez les humains) et elles sont subdivisées en deux types (i) apnée post-soupir, si elle est précédée par un soupir ou (ii) apnée spontanée s'il n'y a pas un soupir précédent. En normoxie, les apnées sont produites à un rythme plus élevé pendant le sommeil REM (environ 11 apnées / heure) par rapport au sommeil non-REM (environ 4 apnées / heure). Dans cette étude, les apnées spontanées sont les moins fréquentes, leur incidence est seulement un quart de celles des apnées post-soupir chez le rat adulte mâles (Christon et al., 1996).

De même, chez la souris adulte de type 129 / Sv, l’analyse du sommeil est réalisée via les signaux électriques EEG et EMG du diaphragme et un EMG des muscles intercostaux. Ces mesures sont combinées à l’enregistrement de la ventilation par pléthysmographie. Encore une fois, les apnées sont subdivisées en deux types ; spontanées ou post-soupir selon les mêmes critères utilisés dans les études précédentes réalisées chez le rat. Les résultats indiquent que 32 apnées sont produites en moyenne pendant une période d'enregistrement de 6 heures en normoxie. Dans cette étude, les apnées post-soupirs sont observées exclusivement pendant le sommeil non-REM, alors que les apnées spontanées sont rares (Nakamura et al., 2007).

En fait, les souris sont de plus en plus utilisées pour étudier la fonction respiratoire et les interactions entre le sommeil et la fonction respiratoire (Nakamura et al., 2007; Terada et al., 2008). Les souris utilisées dans les études de cette thèse sont de type C57BL/6J. Le patron respiratoire des souris C57BL/6J présente également des apnées centrales, incluant des apnées spontanées et des apnées post-soupirs (Yamauchi et al., 2008) (Figure 54). Ces données sont cohérentes avec ce qui a été obtenu dans les présentes études. Nous avons également observé les deux types d’apnées. Par exemple, nous avons obtenu 21.7 ± 1.4 apnées post-soupirs par heure de sommeil non-REM, les apnées post-soupirs sont plus fréquentes que les apnées spontanées durant le sommeil non-REM.

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Figure 54: Exemples de soupirs, d’apnées post-soupirs, et d’apnées spontanées enregistrées en normoxie recueillis chez de souris C57BL/6J non anesthésiées. Un soupir se définit comme une augmentation d’au moins 100% de l’amplitude du volume inspiratoire par rapport à la moyenne des 6 secondes précédentes de respiration (a). Une apnée post-soupir de type 1 = une apnée survenant après plusieurs cycles respiratoires normaux après le soupir (1b). Une apnée post-soupir de type 2 = une apnée immédiatement après un soupir (1c) (Yamauchi et al., 2008).

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En résumé, il est évident que l’AS se produit non seulement chez les humains, mais également chez des modèles d’animaux ; les rats et les souris. Ces deux espèces peuvent servir de modèles naturels pour des études plus approfondies de l’apnée (Yamauchi et al., 2008), et ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux traiter l’AS.

En outre, la souris est considérée comme modèle animal intéressant car il y a la possibilité de manipulations génétiques afin d’étudier la contribution spécifique de certains gènes et protéines dans la fonction respiratoire. La souris knock-out en récepteurs de la progestérone (PRKO) que nous avons utilisée est une souche de souris qui a une délétion globale de l’expression nPR. Ce modèle permet de mieux comprendre les rôles physiologiques joués par les PR ainsi que d'étudier directement la fonction des nPR dans un contexte in vivo (Humphreys et al., 1997).

Après le clonage et la caractérisation des récepteurs de la progestérone B et A (PR-B et -A), la délétion de ces récepteurs chez la souris (PRKO) a fourni des informations importantes sur les rôles divers et souvent indispensables de l’action de la progestérone via la voie classique dans la reproduction féminine (Lydon et al., 1995; Giangrande & McDonnell, 1999; Conneely et al., 2002; Conneely et al., 2003; Ismail et al., 2003). Dans notre axe de recherche, nous avons estimé que c’est très pertinent également d’utiliser la souris PRKO de la lignée C57BL/6J pour mieux comprendre la contribution de des nPR sur le chémoréflexe ventilatoire.

Par ailleurs, il existe des différences entre les humains et les rongeurs qui font que les rongeurs ne font pas des apnées obstructives (Horner, 2012). La souris n’a pas de tissus mous au niveau des VAS, ce qui réduit le risque de développer des AOS. Chez les rongeurs, l’os hyoïdien est bien articulé avec d’autres os, alors que chez les humais il est flottant pour permettre la vocalisation, ce qui prédispose les humains à développer des AOS. L’utilisation des rongeurs a permis d’accumuler une grande quantité de connaisses sur la physiopathologie de l’AS, mais ces différences anatomiques doivent être prisent en considération pour une

190

extrapolation en clinique (Horner, 2012).

Concernant l’étude de la contribution relative des PR dans la régulation chez le nouveau-né, nous avons utilisé des rats âgés de 10 jours. Selon les travaux de recherche de Niane et al, le rat est un modèle intéressant pour l'étude du développement du système de contrôle de la ventilation (Niane et al., 2011).

À la naissance, chez les rats nouveau-nés le développement neuronal général est immature par rapport aux humains. Les premiers jours postnataux chez le rat correspondent au développement utérin tardif chez les humains (Clancy et al., 2001). Le développement du chémoréflexe ventilatoire de rats à P10 correspond au développement fœtal tardif chez les humains (Bissonnette, 2000; Lefter et al., 2007). Par conséquent, ce modèle est intéressant pour explorer l’impact des hormones sur un contrôle ventilatoire immature.

Dans nos expérimentations, nous avions besoin de réaliser des injections dans la cavité de la cisterna magna à l’aide d’une chirurgie stéréotaxique. La maman rat de la portée accepte très bien ces ratons nouveau-nés et prend bien soin d’eux après la chirurgie. Par contre, ce comportement n’est pas développé chez la souris, ce qui justifie l’utilisation des rats nouveau-nés.

Pour toutes ces raisons, le rat nouveau-né à l’âge de 10 jours est un bon modelé pour étudier la contribution relative des différents récepteurs de la progestérone, exprimés dans le système nerveux central, dans le contrôle ventilatoire immature.

La diversité des voies de signalisations impliquées dans les effets respiratoires de la progestérone

Le rôle des récepteurs nucléaires de la progestérone dans le chémoréflexe et la fréquence de l'apnée

Malgré les preuves suggérant un rôle respiratoire des nPR, il n’y a pas de donnée disponible

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sur un modèle montrant les effets d’une délétion génétique de l’expression du nPR sur la régulation du chémoréflexe ventilatoire et sur la stabilité du patron ventilatoire durant le sommeil. Nous avons enregistré par pléthysmographie à corps entier la ventilation chez des souris adultes femelles de type PRKO et de type sauvage (WT, contrôle) traitées de façon chronique par la progestérone ou une solution véhicule (contrôle). Ces souris sont instrumentées avec des électrodes permettant l’enregistrement de l’EEG et de l’EMG des muscles posturaux du cou connectés à un émetteur de télémétrie afin d’analyser le sommeil simultanément à la ventilation. Ce modèle est intéressant, car il nous permet d’avoir plus d’information sur les conséquences de l’absence de la signalisation de la progestérone par les nPR sur le chémoréflexe ventilatoire au cours des différentes étapes du sommeil.

Nos résultats révèlent que la délétion des nPR provoque certaines altérations de la fonction respiratoire incluant (i) une augmentation de la fréquence des soupirs et des apnées post- soupirs durant le sommeil non-REM (Figure 40 du chapitre II) et (ii) une absence d’effet de la progestérone sur la respiration en hypercapnie ou en l’hypercapnie-hypoxie (Figure 41 et tableau 2 du chapitre II). Ces résultats signifient que les nPR jouent un rôle dans la stabilité respiratoire durant le sommeil non-REM ainsi que dans la régulation de la chémosensibilité au CO2 chez la souris femelle.

Les actions par la voie classique de la progestérone sont médiées par les nPR. Nous rappelons que les nPR sont des membres de la famille des récepteurs nucléaires des hormones stéroïdiennes appartenant à la superfamille des facteurs de transcription activés par un ligand. Ils fonctionnent en se liant à des gènes cibles spécifiques, soit par des éléments de réponse de la progestérone (PRE). En réponse à la liaison à la progestérone, les nPR régulent l'expression de gènes spécifiques et donc, contrôlent de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques (Brinton et al., 2008).

Chez les humains, le traitement avec de la progestérone stimule la ventilation minute au repos, augmente la RVHC (Skatrud et al., 1978; Zwillich et al., 1978; Kimura et al., 1984) et la RVH (Zwillich et al., 1978; Okita et al., 1987). Chez le rat, la progestérone associée à l'estradiol améliore la RVHC chez le rat mâle (Tatsumi et al., 1991), et l'éténogestrel (un

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puissant dérivé de la progestérone) améliore la réponse à l'acidose métabolique sur la préparation in vitro du tronc cérébral isolé chez le nouveau-né (Loiseau et al., 2014).

Un fait intéressant est que les nPR sont localisés au niveau central et au niveau périphérique du système de contrôle ventilatoire, au moins chez les rongeurs et les chats. Les nPR sont largement distribués dans le cerveau incluant les régions impliquées dans le contrôle ventilatoire dans le tronc cérébral tels le NTS, les NM X et XII et le locus coeruleus (Romeo et al., 2005; Helena et al., 2006; Boukari et al., 2015) et au niveau des noyaux de l’hypothalamus (Bayliss & Millhorn, 1991; Brinton et al., 2008). Les nPRs sont localisés également au niveau des corps carotidiens des rats adultes et des rats en développement (Joseph et al., 2006).

L’ensemble de ces expériences souligne l’importance de la signalisation de la progestérone par les nPR dans l’impact de la progestérone sur le chémoréflexe ventilatoire central. La signalisation de la progestérone par le nPR stimule le chémoréflexe ventilatoire particulièrement la RVHC.

Il est démontré que l’action de la progestérone par le nPR-A contribue à la régulation de l'expression de la tyrosine hydroxylase, l'enzyme limitant la vitesse de synthèse de la dopamine (Gonzalez-Flores et al., 2011). D’autre, il est démontré que la dopamine diminue la RVHC (Nishino & Lahiri, 1981). Nous suggérons que le même mécanisme pourrait être impliqué dans les effets observés chez les PRKO. La progestérone pourrait stimuler la RVHC en diminuant la synthèse de la dopamine au niveau des centres ventilatoires, comme déjà démontré au niveau des chémorécepteurs périphériques (Joseph et al., 2002). L’absence des nPR y compris le nPR-A affecterait synthèse de la dopamine endogène au niveau central, et ainsi affecte la sensibilité du chémoréflexe chez les souris PRKO en comparaison du WT. En revanche, notre suggestion est limitée, car cela n’explique pas le manque d’effets sur la RVH chez les PRKO.

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Par ailleurs, le traitement pendant une semaine avec la progestérone a augmenté la ventilation de base chez les souris WT durant le sommeil (REM et non-REM), mais pas chez les souris PRKO (Figure 31 A du chapitre II). Ce qui pourrait indiquer que l’augmentation de la ventilation de base durant le sommeil implique l’action de la progesterone par les nPR. En

. revanche, nous avons également observé une èlèvation des taux du metabolisme ( V O2 et/ou

. V . . V CO ) sans que les équivalents ventilatoires soient affectés ( V E / V O2 et V E / CO ) chez les 2 2 deux types de souris (Figure 32 C et E du chapitre II). Chez les souris WT, l’augmentation

. de la V E par la progestérone peut être expliquée par une augmentation du VT durant le sommeil non-REM, et puisque, les équivalents respiratoires ne sont pas élevés chez les souris WT, il est donc probable que l’augmentation de la ventilation en réponse à la progestérone soit simplement une conséquence du taux métabolique plus élevé (Figure 32 A). Ce qui indiquerait l’implication de d’autres récepteurs de la progestérone dans l’effet stimulateur de la ventilation de base durant le sommeil non-REM (Figure 31 A du chapitre II).

Nous avons également analysé la stabilité ventilatoire durant le sommeil non-REM. Nous avons observé que les souris PRKO ont des fréquences de soupirs et d’apnées post-soupirs plus élevées que les souris WT au cours du sommeil non-REM (Figure 34 A et B du chapitre II). Ces résultats sont cohérents avec des études précédentes. En fait, le traitement par les progestins réduit les apnées chez les femmes ménopausées et chez les hommes (Okita et al., 1987; Kimura et al., 1988; Kimura et al., 1989; Young et al., 2002; Shahar et al., 2003). Chez le rat, il est démontré que l'injection intrapéritonéale de progestérone diminue la fréquence des apnées enregistrées pendant le sommeil de 50% chez les rats mâles de 14 semaines et de près de 80% chez les rats de 26 semaines. Cet effet est aboli lorsque la mifépristone, un antagoniste des nPR, est injectée 1,5 heure avant l'injection de la progestérone (Yamazaki et al., 2005). L’ensemble des études indique donc que l’activation des nPR réduit les apnées et contribue ainsi à la stabilité du système de contrôle ventilatoire chez l’adulte durant le sommeil non-REM.

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Nous sommons également intrigué par la fréquence élevée des soupirs chez les souris PRKO durant le sommeil non-REM (Figure 34 A du chapitre II).

Le soupir est souvent considéré comme un événement ventilatoire anormal ou altéré, par exemple dans le cas du syndrome d'hyperventilation (Brashear, 1983; Bass & Gardner, 1985). En revanche, le soupir aide à préserver la fonction pulmonaire et fait partie du patron respiratoire normal (Bendixen et al., 1964). Il peut empêcher la réduction de la compliance pulmonaire (Davis & Moscato, 1994) et améliore les échanges gazeux et le volume pulmonaire chez les patients atteints de détresse respiratoire aiguë (Patroniti et al., 2002). Vlemincx et al. ont défini le soupir comme un "resetter du système respiratoire", car ils ont montré que les soupirs spontanés rétablissent la variabilité respiratoire structurée lorsqu'elle est perturbée, par exemple par le stress ou les émotions de soulagement (Vlemincx et al., 2010; Vlemincx et al., 2013). Effectivement, nos enregistrements indiquent que le patron respiratoire est irrégulier avant le soupir, mais il devient régulier après le soupir (Figure 33 du chapitre II ).

Les signaux EEG et EMG ont indiqué que le soupir est accompagné par un éveil (Figure 33 du chapitre II ), un signe de sommeil fragmenté et de mauvaise qualité (Deurveilher et al., 2013). Ce qui est en parfaite cohérence avec la littérature indiquant que la genèse du soupir est associée à l’éveil (Al-Damluji, 1986; Eckert et al., 2007; Eckert et al., 2009; Ramirez et al., 2013). De plus, les soupirs peuvent être également suivis par des apnées ou un ralentissement de la ventilation (Perez-Padilla et al., 1983; Goodman & Dow, 1993; Patroniti et al., 2002). Selon la littérature, les causes des événements ventilatoires suivant le soupir sont multifactorielles impliquant des facteurs périphériques et centraux. Les facteurs périphériques incluant une inhibition des chémorécepteurs périphériques, ou un réflexe d’inhibition de l’inspiration déclenchée par la stimulation des mécanorécepteurs pulmonaires

(le reflex Hering-Bruer) (Perez-Padilla et al., 1983). De plus, un soupir peut réduire la PaCO2 et cette réduction peut être suffisante pour induire une inhibition de la commande respiratoire centrale et contribuer à la genèse de l'apnée (Eckert et al., 2007; Eckert et al., 2009). Étant donné que les souris PRKO ont des fréquences élevées de soupirs et d’apnées post-soupirs,

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nous nous demandons si le seuil d’apnée et la réserve en CO2 sont altérés chez ces souris. En revanche, nous n’avons pas observé un indice de l’altération de la chémosensibilité au CO2 chez les souris PRKO puisque nous avons noté que la progestérone induit une augmentation des valeurs absolues de ventilation minute en réponse à l’hypercapnie mais sans augmenter les valeurs normalisées chez les souris WT. Dans ce modèle, nous suggérons que les nPR localisés dans le système nerveux central contribuent à la régulation du processus physiologique des soupirs et des apnées post soupirs de façon directe ou indirecte.

Nous avons noté qu'il y a des effets apparents du génotype et du traitement à la progestérone (seulement chez les souris WT) sur le temps passé éveiller ou endormi. Nous avons également noté une différence faible, mais significative sur le spectre de puissance EEG chez les souris PRKO éveillées par rapport aux autres groupes. Bien que ces résultats soient obtenus sur un nombre limité d'animaux, cela peut indiquer des effets spécifiques des nPR sur l'homéostasie du sommeil qui justifier d'autres études plus spécifiques.

Donc, les nPR améliorent la RVHC et réduisent les apnées durant le sommeil chez la souris femelle. Ils seraient donc des cibles pharmacologiques potentielles pour le traitement de l’AS chez la femme.

Le rôle des récepteurs membranaires de la progestérone dans le chémoréflexe et la fréquence de l'apnée

Alors que la voie classique de la progestérone implique une régulation de l’expression des gènes, et nécessite des minutes ou des heures pour établir les effets physiologiques, il existe des mécanismes non classiques, plus rapides (exemple : 2-3 min) initiées par des récepteurs localisés au niveau de la membrane plasmique. L’activation de ces récepteurs conduit à des cascades d’activation de messagers intracellulaires (Revelli et al., 1998; Watson & Gametchu, 1999; Norman et al., 2004). Dans l’introduction, nous avons détaillé les différents types de récepteurs membranaires de la progestérone. Nous trouvons essentiellement : i) les récepteurs membranaires de la progestérone (mPR) qui constituent une famille de 5 isoformes (α, β, γ, δ, ξ), ii), et les PGRMC 1 et 2 (pour « progesterone receptor membrane

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component »). De plus, la progestérone peut moduler indirectement le récepteur GABA-A, via son métabolite neuroactif l’alloprégnanolone (Faivre et al., 2005; Losel et al., 2005; Brinton et al., 2008).

Les mPR sont impliqués dans certaines actions de la progestérone, par exemple, dans la biologie de la reproduction, tels que la motilité des spermatozoïdes, la maturation méiotique des oocytes (Zhu et al., 2003b) et dans les effets bénéfiques de la progestérone sur le système cardiovasculaire (Pang et al., 2015). Au niveau central, il semble que la progestérone signale par les mPR au niveau du système nerveux incluant des actions trophiques et neuroprotectrices (Thomas & Pang, 2012; Guennoun et al., 2015).

Nos résultats montrent que le mPRβ joue un rôle important dans la régulation du chémoréflexe ventilatoire incluant la RVH et la RVHC. De plus, il contribue à l’établissement du dimorphisme sexuel du chémoréflexe ventilatoire entre la souris mâle et femelle, et enfin, il contribue à la stabilité respiratoire et la genèse de l’apnée chez les souris adultes. Par ailleurs, le mPRα joue également un rôle dans la RVHC.

Dans le cadre de notre travail, nous avons porté un intérêt particulier aux expériences électrophysiologies pionnières de Pascual et al. Ces expériences ont indiqué une action rapide de la progestérone au niveau du contrôle ventilatoire chez le rat. En fait, il est démontré que la progestérone est capable de rétablir la diminution de la transmission des signaux afférents dans le NTS en réponse à l'hypoxie. Comme ces effets ont nécessité seulement entre 2 et 3 minutes pour s’établir, il est suggéré qu'un mécanisme d'action non- classique serait impliqué (Pascual et al., 2002).

Un fait important est que les mPR sont localisés au niveau du système nerveux. Chez les souris, les mPRα et mPRβ sont exprimés dans la moelle épinière (Labombarda et al., 2010) et au niveau des régions importantes dans le contrôle ventilatoire incluant le NTS, et les NM X et NM XII (Boukari et al., 2015). Il est également indiqué que le mPRα présente une large distribution au niveau périphérique. En revanche, le mPRβ est particulièrement localisé au

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niveau du cerveau des souris (Kasubuchi et al., 2017). De plus, les mPRα et mPRβ sont exprimés dans le cortex, les noyaux thalamiques et l’hypothalamus chez la souris et le rat (Guennoun et al., 2008; Zuloaga et al., 2012; Meffre et al., 2013).

Au repos, nos résultats ont indiqué quelques différences entre les souris mâles et femelles :

(i) la fréquence respiratoire (fR) est plus faible, mais le volume courant (VT) et la ventilation

. minute ( V E ) sont plus élevés chez les souris femelles en comparaison des mâles. (ii) Ces

. V paramètres sont associés à des valeurs similaires de métabolisme ( V O2 , CO ) et d’équivalent 2 . . respiratoire de l’O2 ( V E / V O2 ) entre les souris mâles et femelles (tableau 3 de l’étude III). Nous avons également noté un signe d’hyperventilation chez les souris femelles indiquée par .  une élévation de l’équivalent respiratoire du CO2 ( V E / VCO ) en comparaison des mâles. La 2 délétion des mPR n’affecte pas la ventilation de base chez la femelle. En revanche, le seul effet des traitements dans ces conditions est observé chez les mâles où le traitement par le siRNA anti-mPRα ou anti- mPRβ a augmenté significativement la fR en comparaison du groupe contrôle.

Concernant le chémoréflexe ventilatoire, les groupes contrôles mâles et femelles présentent une augmentation importante de la ventilation en réponse à l’hypoxie ou à l’hypercapnie (Figure 39 et 40 de l’étude III). Le traitement par le siRNA anti-mPRβ a réduit significativement la RVH et la RVHC à la fois chez les souris mâles et femelles. Le traitement par le siRNA anti-mPRα a réduit seulement la RVHC à la fois chez les souris mâles et femelles (Figure 39 et 40 de l’étude III). Donc, mPRα et mPRβ jouent un rôle dans le chémoréflexe ventilatoire chez la souris adulte.

Nous étions intrigués par l’effet profond du traitement par le siRNA anti-mPRβ sur la RVH, car elle évoque clairement une dépression significative de la détection de l'O2 telle que survenant après la chémodénervation des chémorécepteurs périphériques. Ainsi, nous avons testé la chémosensibilité périphérique à l'O2 par un test d’hyperoxie chez des souris pour

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produire une chémodénervation chimique. Des souris traitées par le siRNA anti-mPRβ ou le liquide céphalorachidien artificiel sont exposés à une courte durée d’hyperoxie à 70 % O2 pendant 60 s. Chez les souris contrôle, nous avons observé une diminution transitoire de la fréquence ventilatoire durant l’exposition à l’hyperoxie. Cette diminution est plus faible chez les souris traitées par le siRNA anti-mPRβ. Autrement dit, le déclin de la fR est moins important chez les souris mâles et femelles traitées avec mPRβ (Figure 42 de l’étude IV).

Une des explications serait que les récepteurs mPRβ soient exprimés au niveau des chémorécepteurs périphériques. La progestérone à des effets importants à ce niveau (Hannhart et al., 1990; Joseph et al., 2002), et les récepteurs nPR sont exprimés dans les chémorécepteurs périphériques (Joseph et al., 2006), il est donc possible que d’autres types de récepteurs de progestérone incluant les mPRβ soient exprimés à ce niveau. Nous avons utilisé des siRNA capables d’affecter de façon efficace les cellules in vivo. Les terminaisons nerveuses projetées des chémorécepteurs périphériques sont intégrées au niveau du NTS (Figure 11 du chapitre I), nous supposons que (i) les molécules des siRNA ont migré par le nerf glosso-pharyngien durant l’infusion chronique, et ainsi a affecté le niveau d’expression des mPRβ au niveau des corps carotidiens. D’autre part, notre analyse par immunohistochimie indique que l’expression du mPRβ est significativement réduite au niveau du NTS dans la médulla oblongata dorso-caudale. De ce fait, on suppose également que la réduction de l’expression du mPRβ a altéré l’intégration des afférences neuronales venant des chémorécepteurs périphériques au niveau du NTS. En résumé, nous postulons que l’altération du chémoréflexe chez les souris traitées par siRNA anti-mPRβ pourrait être expliqué par une réduction de la chémosensibilité périphérique à l'O2 ou une altération de l'intégration des afférents périphériques dans le système nerveux central.

La cinétique des réponses ventilatoires est différente entre les mâles et les femelles. Afin de mieux voir la différence, nous avons rapporté la moyenne du pourcentage du changement par rapport à la ligne de base en RVH ou RVHC pour chaque variable ventilatoire durant les 5 min d’exposition. C’est une façon pour normaliser la réponse dans le temps et ainsi nous pouvons comparer facilement les RVH et les RVHC entre les mâles et les femelles (Figure

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41 du chapitre III). Le résultat était intéressant. Nous avons observé que les RVH et RVHC chez le groupe contrôle femelle sont plus élevées que chez le groupe contrôle mâle. Alors que ce dimorphisme persiste avec le traitement par le siRNA anti-mPRα, cette différence n’existe plus avec le traitement par siRNA anti-mPRβ. Donc, le mPRβ joue un rôle important dans l’établissement du dimorphisme sexuel du chez la souris adule. Les effets stimulants ventilatoires de la progestérone par son action centrale (Bayliss et al., 1987; Pascual et al., 2002) et au niveau des chémorécepteurs périphériques en réponse à l’hypoxie (Hannhart et al., 1989; Hannhart et al., 1990; Joseph et al., 2002) peuvent donc impliquer le mPRβ.

Chez la souris femelle, en combinant les résultats clés des deux études précédentes (études II et III). Le mPRβ joue un rôle important dans l’établissement de la RVH et la RVHC. Alors que l’action de la progestérone par nPR et le mPRα semble être impliquée dans la RVHC chez la souris femelle adulte. Nous postulons qu’une synergie entre les trois types de PR pourrait être nécessaire pour l’établissement et le maintien de la RVHC chez la souris (Tableau 4 de l’étude IV).

Concernant la stabilité respiratoire, l’analyse de la fréquence des apnées spontanées et post- soupirs en normoxie indique la délétion du mPRβ entraîne une augmentation significative des apnées à la fois chez les souris mâles et femelles en comparaison du contrôle (Figure 38 de l’étude III). Donc la réduction des apnées chez les humains suite au traitement par le traitement de la progestérone ou ses dérivés (Kimura et al., 1988; Kimura et al., 1989; Redline et al., 1994; Younes et al., 2001; Young et al., 2002; Mirer et al., 2015), peut impliquer la signalisation de la progestérone via le mPRβ.

Par ailleurs, nous avons également fait une synthèse de la contribution des différents PR étudiés dans la stabilité respiratoire c.-à-d. une synthèse des données de la fréquence des soupirs et des apnées post-soupirs issues de résultats des études réalisées dans le cadre de cette thèse (PRKO femelle et souris traitées avec les siRNA) et des données issues d’une étude avec PRKO mâle. Cette dernière étude est réalisée dans les mêmes conditions en utilisant les mêmes critères et méthodes d’analyse que chez les femelles. La délétion des nPR augmente la fréquence des soupirs et des apnées post-soupirs chez les souris femelles, mais

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elle augmente seulement la fréquence des soupirs chez les souris mâles. Alors que la délétion du mPRβ augmente les fréquences des soupirs et des apnées post-soupirs chez les souris femelles et seulement la fréquence des apnées post-soupirs chez les souris mâles (Figure 43 de chapitre IV). De plus, la délétion du mPRβ augmente la fréquence des apnées spontanées à la fois chez les souris femelles et mâles (Figure 38 de chapitre III).

Nous concluons que les nPR et le mPRβ jouent un rôle important dans la stabilité respiratoire. Cette contribution semble varier selon le sexe de l’animal. Les nPR (femelle) et le mPRβ (mâle et femelle) pouvant être des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’AS chez les hommes ou les femmes. Des expériences supplémentaires sont nécessaires.

Rôle des récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone dans le contrôle respiratoire et la fréquence de l'apnée chez le rat nouveau-né

Nos résultats indiquent que le traitement par le siRNA anti-nPR augmente la fréquence des apnées post-soupirs et spontanées ainsi que la fréquence totale des apnées à la fois chez les ratons de sexe masculin et féminin. Alors que le traitement par le siRNA anti- mPRβ a augmenté la fréquence totale des apnées seulement chez les ratons mâles. Ces résultats indiquent que les nPR et le mPRβ contribuent à la stabilité du patron ventilatoire de ratons au cours du développement postnatal selon le sexe des ratons. Par ailleurs, les traitements par le siRNA anti-nPR, le siRNA anti-mPRβ ou le siRNA anti-mPRα n’a pas affecté la ventilation en normoxie ainsi que la RVH et la RVHC. En revanche, une petite diminution significative du VT est observée suite au traitement avec le siRNA anti-mPRα. Ces résultats indiquent que les trois types de PR localisés au niveau central ne contribuent pas à la régulation du chémoréflexe des ratons à 10 jours de développement postnatal (P10).

Finer et al. ont proposé la progestérone comme un produit à prendre en considération dans les futures études dans le cadre des recherches pour un nouveau traitement pour l’apnée de prématuré (Finer et al., 2006). En revanche, les mécanismes d’actions expliquant ces effets respiratoires doivent être encore plus explorés pour que la progestérone ou ses dérivés puissent être cliniquement approuvés comme un traitement pour l’apnée du prématuré.

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Plusieurs études ont démontré la présence de neurones sensibles à la progestérone dans le cerveau de rat au cours du développement (Mellon, 2007; Quadros et al., 2007; Quadros et al., 2008; Schumacher et al., 2014). Chez la souris mâle et femelle durant le développement embryonnaire (18.5 jours embryonnaires), le mPRβ est spécifiquement localisé au niveau du cerveau, alors que le mPRα, en plus de son expression au niveau du cerveau, est exprimé dans plusieurs tissus en périphérie incluant les poumons, les reins, les testicules (Kasubuchi et al., 2017).

De façon comparable à l’adulte, la progestérone chez le nouveau-né est qualifiée de stimulant respiratoire. En fait, la RVH est stimulée par la progestérone chez les rats mâles âgés de 1, 4, 7 et 10 jours postnataux (P1, P4, P7 et P 10) (Lefter et al., 2007; Hichri et al., 2012; Bairam et al., 2013). De plus, il existe des preuves que la signalisation de la progestérone par les nPR est un mécanisme clé dans la RVH chez nouveau-nés souris à P10. Effectivement, il est démontré que l'administration quotidienne du mifépristone (un antagoniste non spécifique des récepteurs nucléaires de la progestérone) chez les rats nouveau-nés diminue significativement la réponse du nerf du sinus carotidien à l'hypoxie (Joseph et al., 2012). De plus, il est démontré que la RVH est plus faible chez les souris PRKO comparées aux contrôles à P10 (Potvin et al., 2014). Ces résultats indiquent une contribution clé de la signalisation de la progestérone endogène par le nPR dans le développement de la RVH chez les rongeurs. En revanche, la contribution des récepteurs membranaires est inconnue.

Selon les résultats de l’étude qui constitue le chapitre IV de cette thèse, nous rappelons que le traitement par le siRNA anti-nPR, anti-mPRα ou anti-mPRβ n’affecte pas la ventilation (Figure 45 du chapitre V), le métabolisme (Figure 46 chapitre V) en normoxie, ni les RVH et la RVHC (Figure 47 chapitre V). Donc, dans notre modèle, la signalisation de la progestérone endogène au niveau central par les nPR, mPRα ou le mPRβ n’a pas un impact sur le chémoréflexe ventilatoire en développement. En revanche on ne pas exclure la contribution des nPR, mPRα ou mPRβ localisé en périphérie ou une interaction entre le niveau central et périphérique pour accomplir efficacement les actions respiratoires de la progestérone sur le chémoréflexe immature. Cela peut être également expliqué par des

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mécanismes neuronaux compensatoires qui pourraient être activés chez les ratons, ce qui aurait pour effet de supprimer les conséquences de la perte partielle de nPR par rapport à l'effet de knock-out généralisé dans l’organisme. Par exemple, des effets compensatoires sont observés chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Certains de ces patients gardent une performance cognitive normale malgré la perte de la dopamine (Poston et al., 2016). Par ailleurs, il reste évident que la vérification de l’efficacité des traitements de siRNA reste nécessaire pour valider nos conclusions.

Chez le rat nouveau-né, le traitement chronique par la progestérone stimule la RVH et réduit la fréquence des apnées spontanées et post-soupirs (Joseph et al., 2018), alors que l’injection aiguë de la progestérone réduit la ventilation minute et augmente la fréquence des apnées chez des ratons de P10 à P12 (Joseph et al., 2018). Ces effets inhibiteurs peuvent être expliqués par l’action de la progestérone après sa conversion rapide en alloprégnanolone (Melcangi et al., 2014). Ce dernier est un neurométabolite actif capable d’induire une modulation allostérique des récepteurs GABA (Faroni & Magnaghi, 2011). Cette hypothèse est vérifiée dans la même étude par un traitement par le finastéride, un antagoniste de la 5α- réductase qui bloque la transformation de la progestérone en alloprégnanolone. Effectivement, le traitement par le finastéride a diminué la fréquence des apnées, mais a diminué la ventilation minute chez les rats femelles. La signalisation directe de la progestérone réduit les apnées, et cet effet est balancé par l’action de son métabolite l’alloprégnanolone qui favorise l’augmentation des apnées en activant les récepteurs GABAA (Joseph et al., 2018) (Figure 55) . La suite intéressante était de déterminer les récepteurs impliqués dans les effets de la progestérone. En effet, le R5020, un agoniste des nPR a diminué la fréquence des apnées seulement chez les mâles, tandis que le Org-OD-02-0 (10- éthényl-19-norprogestérone), un agoniste des mPR, a diminué la fréquence de l'apnée chez les mâles et les femelles (Joseph et al., 2018). Le Org-OD-02-0 utilisé dans cette étude est un dérivé synthétique de progestérone. Il présente une affinité élevée pour le mPRα (Kelder et al., 2010), mPRδ et mPRε (Pang et al., 2013). Par conséquent, nous suggérons que les effets respiratoires observés peuvent être dus à la stimulation de ses récepteurs plutôt que le mPRb au niveau systémique ou central.

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Dans notre modèle, nous avons également évalué la contribution spécifique des mPRα, mPRβ ou les nPR exprimés au niveau central dans la stabilité ventilatoire des rats en développement à P10. Nos données indiquent que le traitement avec le siRNA-mPRα n'a eu aucun effet sur la fréquence des apnées, tandis que le siRNA anti-mPRβ augmente la fréquence des apnées chez les mâles, mais pas chez les femelles, alors que le siRNA anti- nPR augmente la fréquence d'apnée chez les femelles, mais pas chez les mâles. Dans le modèle des siRNA chez l’adulte, les résultats ont indiqué également la contribution des nPR et du mPRβ dans les mécanismes de genèse des apnées. Par ailleurs, la délétion des nPR chez la souris PRKO n’affecte pas la fréquence des apnées chez les deux sexes à P10 (Potvin et al., 2014).

En effet, les différents résultats concernant les effets respiratoires des PR chez le nouveau- né sont différents selon le modèle utilisé. On peut souligner que l’un ou l’autre des éléments suivants ait pu influencer nos résultats : (i) l’utilisation de souris ou de rats, (ii) le type et la durée du traitement, et (iii) la cible anatomique du traitement : systémique vs central.

L’ensemble des données indiquent la complexité des modes d’action de la progestérone et ainsi une divergence importance des effets physiologiques induits selon le mode expérimental. Il est de plus en plus admis l’existence d’un dimorphisme sexuel au niveau du système de contrôle ventilatoire chez le nouveau-né. Effectivement, l’ensemble de notre résultat indique que les PR ont des effets sexe spécifiques sur la stabilité respiratoire chez les rats nouveau-nés. Le nPR et le mPRβ peuvent être des cibles pharmacologiques pour le traitement de l'apnée chez le nouveau-né . Au niveau central, le nPR peut réduire les apnées chez la femelle, alors que le mPRb peut réduire les apnées chez le mâle (Figure 55).

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Figure 55: Illustration de la contribution des récepteurs de la progestérone à la stabilité ventilatoire dans le cadre d’un équilibre entre l’effet de la progestérone et son métabolite l’alloprégnanolone. La progestérone augmente les apnées par les récepteurs de l'alloprégnanolone et réduit la genèse des apnées par les récepteurs de la progestérone localisés au niveau du système nerveux central, à savoir le nPR (la femelle) et le mPRβ (mâle) chez les rats nouveau-nés. Adaptée de (Joseph et al., 2018).

Les limites de nos études :

Étude chapitre II

Les concentrations sériques de la progestérone ne sont pas significativement augmentées après le traitement chronique à la progestérone (Tableau 2 de chapitre II). Des effets similaires sont décrits précédemment avec le traitement stéroïdien chronique chez les rats nouveau-nés par la progestérone (Lefter et al., 2007) et adultes par les corticostérones (Fournier et al., 2007). Ce fait pourrait être expliqué par une limitation de test ELISA, lorsque l’analyse est effectuée avec des échantillons sans extraction préalable de stéroïdes, c.à.d. que

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la concentration élevée de composants sériques interfère avec la sensibilité du test d’ELISA. Les stéroïdes sont lipophiles et ainsi ils peuvent quitter la circulation et diffusent facilement dans l’ensemble de l’organisme. Il est possible que ce soit la cause des résultats limités du dosage ELISA.

Les souris PRKO présentent des signes d'inflammation utérine (Lydon et al., 1995). Le nPR possède une action anti-inflammatoire dans l'utérus en réponse au traitement à l'estradiol et à la progestérone (Lydon et al., 1995), par conséquent, leur absence chez les souris PRKO contribuerait au processus inflammatoire au niveau de l'utérus ou d’autres tissus exprimant les nPR. Donc, nous ne pouvons pas exclure complètement la possibilité d’une interférence de ce processus inflammatoire local ou systémique au niveau du système de contrôle respiratoire chez les souris PRKO.

Nos souris PRKO présentent une abrogation globale des nPR, il n’est pas donc possible de disséquer la contribution des nPR-A vs nPR-B. De plus, nous ne pouvons pas également déterminer la contribution des nPR localisés au niveau du système de chémoréflexe central vs périphérique.

Étude du chapitre III

Dans le groupe contrôle, nous n'avons pas utilisé un siRNA contrôle, à savoir un siRNA avec ordre aléatoire des mêmes bases (siRNA « scramble ») ou un siRNA qui n'a pas de cible spécifique chez la souris. Ces siRNA contrôles permettent de vérifier la spécificité des réponses physiologiques obtenues. Nous n'avons pas eu recours à ces contrôles, car ces siRNA n'éliminent pas la possibilité d’action non spécifique en raison des alignements de séquences imparfaits du siRNA avec d’autres ARNm (Jackson & Linsley, 2010). Afin d’éliminer le souci de la spécificité de l'action des siRNA, le contrôle le plus adéquat est d'utiliser un cocktail de siRNA ayant la même cible dans des expériences répétées, ou en tant que pool dans une seule expérience in vitro (Jackson & Linsley, 2010). Vu les quantités et les coûts élevés de l’utilisation siRNA in vivo, ce contrôle n’était pas une option réaliste dans ce travail.

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De plus, nous avons obtenu différentes réponses physiologiques avec l'utilisation de différents siRNA et nous avons utilisé des siRNA désignés pour éviter les réponses immunitaires, assurer la stabilité in vivo et réduire les effets non spécifiques (Ambion in vivo siRNA, ThermoFisher).

Perspectives

Les expériences de ce projet visent à mieux comprendre le rôle des récepteurs nucléaires et membranaires de la progestérone dans la régulation du chémoréflexe ventilatoire ainsi que la stabilité du patron respiratoire durant le sommeil. Les présents résultats donnent des détails mécanistiques importants sur l’action modulatrice de la progestérone sur le contrôle ventilatoire et le fonctionnement du chémoréflexe. À terme, ils peuvent aider à développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour mieux traiter l’AS. Dans ce sens, le mPRβ et le nPR peuvent être des cibles pharmacologiques qui stimulent la fonction chémoréflexe et réduisent les apnées des patients atteints d’AS aussi bien chez l’adulte que chez le nouveau-né. Pour avoir plus de détails mécanistiques sur les rôles respiratoires de ces récepteurs, nous proposons les explorations suivantes :

§ En s’inspirant des études qui ont disséqué les contributions spécifiques des sous-types de nPR; PR-A et PR-B dans la biologie de la reproduction et de la glande mammaire, l'ablation sélective des isoformes PR-A ou PR-B est intéressante pour connaître la contribution sélective de ces récepteurs dans le chémoréflexe ventilatoire. Nous suggérons des études in vivo chez des souris PRKO- PR-A et PRKO- PR-B dans un modèle d’hypoxie intermittente pour mieux mimer l’AS. - Il est également pertinent de réaliser ces études à la fois chez les mâles et les femelles afin de déterminer un éventuel dimorphisme sexuel des rôles respiratoires de ces récepteurs.

§ Nous estimons également l’importance de déterminer le site d’action des récepteurs de progestérone au niveau central ou périphérique du système de contrôle ventilatoire chez l’adulte. Pour ce faire, il convient de réaliser des études électrophysiologiques

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afin d’enregistrer (i) l’effet de la progestérone ou des agonistes spécifiques de ses récepteurs sur l’activité neuronale sur des préparations du tronc cérébral isolées et (ii) l’effet de la progestérone ou des agonistes spécifiques de ses récepteurs sur l’activité du nerf du sinus carotidien.

§ Vu le rôle important du mPRβ dans la régulation du contrôle et la stabilité respiratoire, le développement d’un outil pharmacologique, précisément un agoniste spécifique est pertinent pour mener des études supplémentaires afin de mieux comprendre les rôles respiratoires du mPRβ.

§ Par ailleurs, il est également intéressant d’explorer d’autres âges postnataux pour connaître le rôle respiratoire des PRKO- PR-A et PRKO- PR-B et mPR mPRβ et le mPRα.

§ D’autres types de récepteurs membranaires de la progestérone localisés au niveau central existent tels que le PGRMC1 et les mPRg, d, et e. Il est intéressant d’étudier leurs rôles dans la régulation du chémoréflexe et la stabilité du patron ventilatoire à la fois chez l’adulte et le nouveau-né.

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Conclusion générale

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En premier, nous avons démontré que l’absence du nPR engendre une altération du chémoréflexe ventilatoire chez la souris femelle adulte. En fait, la ventilation en condition d’hypercapnie d’hypercapnie-hypoxie sont augmentées avec un traitement chronique par la progestérone chez les souris de type sauvage. Ces effets stimulateurs de la progestérone ne sont pas obtenus chez les souris PRKO. De plus, les souris PRKO présentent une augmentation de la fréquence des soupirs et des apnées post-soupirs durant le sommeil non- REM. Ce qui suggère que la signalisation de la progestérone par les nPR est impliquée dans la stabilité du patron ventilatoire de la souris femelle adulte durant le sommeil. Dans l’ensemble, la stimulation des nPR peut stimuler la RVHC et réduire les apnées chez la souris femelle durant le sommeil (Figure 56).

Nous avons démontré également que les récepteurs mPRβ et mPRα localisés au niveau central sont impliqués dans la régulation du chémoréflexe ventilatoire chez la souris adulte mâle et femelle. En effet, la réduction de leurs expressions au niveau central diminue la RVH et la RVHC. Particulièrement, le mPRβ peut jouer un rôle dans le dimorphisme sexuel du chémoréflexe ventilatoire chez la souris. De plus, les résultats indiquent que la délétion du mPRβ au niveau central augmente la fréquence des apnées de type post-soupirs et spontanées au cours du sommeil à la fois chez la femelle et le mâle. Ce qui suggère que la signalisation de la progestérone endogène par le mPRβ est impliquée dans la stabilité du patron ventilatoire de la souris adulte au repos. Dans l’ensemble, la stimulation du mPRβ peut stimuler la RVH, la RVHC et réduire les apnées chez la souris femelle et mâle durant le sommeil (Figure 56).

Chez le nouveau-né rat âgé de 10 jours de vie postnatale, nos résultats indiquent que le traitement au niveau central par les siRNA-mPRα, siRNA anti-mPRβ et le siRNA anti-nPR n’affecte pas la ventilation de base ni la RVH et la RVHC. Dans ce modèle, ces résultats montrent que la signalisation de la progestérone endogène par le mPRα, mPRβ et le nPR ne contribue pas à la modulation du chémoréflexe ventilatoire des rats nouveau-nés. En revanche, le traitement par siRNA anti-mPRβ ou le siRNA anti-nPR augmente la fréquence des apnées. Cet effet varie selon le sexe du raton. Le traitement par le siRNA anti-nPR augmente la fréquence des apnées post-soupirs, des apnées spontanées ainsi que la fréquence

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des apnées totale chez les ratons femelles, alors que le traitement par le siRNA anti-mPRβ augmente la fréquence totale des apnées chez les ratons mâles. Donc, la stimulation des nPR et mPRβ peut réduire la fréquence des apnées chez le rat nouveau-né. Le sexe est un facteur à prendre en considération.

Nos études ont contribué à l’avancement des connaissances concernant la compréhension des mécanismes sous adjacents aux effets respiratoires de la progestérone. Particulièrement, la contribution relative des récepteurs nucléaires et membranaires dans l’impact de la progestérone sur le chémoréflexe et la stabilité ventilatoire. À terme, il peut aider à développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour mieux traiter les apnées du sommeil. Dans ce sens, le nPR et le mPRβ semblent être des cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l’AS chez l’adulte et le nouveau-né.

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Figure 56: Un schéma de synthèse des mécanismes d'action par lesquels la progestérone produit, au moins en partie, ses effets respiratoires chez la souris adulte. Adaptée de (Boukari et al., 2015)

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