Modalidade Artigos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

Flávia Regina Santos da Paixão

Formulação peletizada de Metarhizium spp.: Produção, termotolerância e potencial no controle de Rhipicephalus microplus

Goiânia 2016

Flávia Regina Santos da Paixão

Formulação peletizada de Metarhizium spp.: Produção, termotolerância e potencial no controle de Rhipicephalus microplus

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública.

Orientador: Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes Co-orientador: Dr. Ricardo N. Marreto

Goiânia 2016

iii

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Aluno (a): Flávia Regina Santos da Paixão

Orientador (a): Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

Co-orientador (a): Dr. Ricardo N. Marreto

Membros:

1. Dr. Éverton Kort Kamp Fernandes

2. Dr. Lígia Miranda Ferreira Borges

3. Dr. Gabriel Moura Mascarin

Data:08/04/2016

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao professor Doutor Éverton Fernandes, pela oportunidade concedida e a orientação no Laboratório de Patologia de Invertebrados da UFG. Ao professor Doutor Ricardo Marreto pela co-orientação pela oportunidade concedida no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFG. Ao pesquisador Gabriel Mascarin pelas profundas contribuições e apoio estatístico. Ao professor Christian Luz, agradeço pela oportunidade concedida no Laboratório de Patologia de Invertebrados. Agradeço a MSc. Alaine Catão, mestranda Tainá Rodrigues, graduanda Bruna Oliveira e a MSc. Elen Muniz pela ajuda e dedicação para a concretização deste trabalho. Aos Mestres Cíntia Bernardo, Lucas Barreto, Ronaldo Pereira Junior e mestrando Marcos Filgueiras, e a toda equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados pelo apoio. Agradeço também pelo apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. pela concessão de bolsa de estudos (mestrado). E a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES-MERCOSUL pela concessão de bolsa de estudos (mestrado- sanduíche). Aos meus pais Joacir Paixão e Marlete Paixão um profundo agradecimento por sempre incentivar a conquistar novos objetivos apesar dos obstáculos. Agradeço a minha irmã Késia Paixão pela paciência, dedicação e apoio. Também agradeço a todos meus familiares e amigos.

v SUMÁRIO

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS...... vii SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS ...... x RESUMO...... xi ABSTRACT ...... xii 1 REVISÃO DA LITERATURA ...... 1 1.1. Controle microbiano ...... 1 1.2. Carrapatos ixodídeos ...... 3 1.3. Interferência de fatores abióticos no controle microbiano ...... 5 1.4.Formulação de propágulos fúngicos ...... 6 2 JUSTIFICATIVA ...... 12 3 OBJETIVOS ...... 13 4 MÉTODOS ...... 14 4.1 Coleta e origem dos carrapatos ...... 14 4.2 Isolados fúngicos estudados e cultivo para obtenção de conídios ...... 14 4.3 Produção de péletes ...... 15 4.4 Produção de conídios em péletes de celulose submetidos à condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura ...... 19 4.5 Eficácia de péletes de Metarhizium spp. para controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus ...... 21 4.6 Eficácia de péletes de IP 119 em diferentes doses para controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição ótima de temperatura ...... 23 4.7 Eficácia de péletes de CG 47 ou IP 119 para controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição estressante de temperatura...... 23 4.8 Produção de péletes com vermiculita ...... 24 4.9 Produção de conídios em péletes de celulose ou vermiculita com o isolado IP 119, submetidos a condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura...... 24 4.10 Análises estatísticas ...... 25 5 RESULTADOS ...... 26 6 DISCUSSÃO ...... 33 7 CONCLUSÕES ...... 38 8 REFERÊNCIAS ...... 39 ANEXOS ...... 47

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Tabela 1: Descrição dos isolados de Metarhizium estudados.

Tabela 2: Composição do meio basal utilizado no preparo do meio de cultura destinado à produção de microescleródios.

Tabela 3: Composição do Latossolo vermelho estudado.

Figura 1: Microescleródios de Metarhizium anisopliae s.l. (CG 47, IP 46, IP 119, ARSEF 1883) e Metarhizium robertsii (CG632, ARSEF 1883) quantificados em microscópio óptico em aumento de 100×. Escala igual 50 µm.

Figura 2: Diagrama esquemático do processo de obtenção dos péletes por extrusão- esferonização. Fonte de MARTINS (2015).

Figura 3: Processo de obtenção dos péletes: A) Meio líquido com microscleródios; B) Biomassa fúngica com terra diatomácea sendo filtrada; C) Homogeneização da massa fúngica com celulose microcristalina; D) e E) Processo de extrusão; F) Esferonizador; G), H) e I) Péletes de microescleródios de Metarhizium.

Figura 4: A) e B) Produção de conídios a partir de péletes à base de microescleródio de M. anisopliae s.s ARSEF 1883 ou IP 119 após 15 dias a 27 ± 1 °C; C) Suspensão para obtenção de conídios exporulados a partir dos péletes; D) Inóculo da suspensão com concentração de 1 × 106 conídios mL-1 em meio BDAL para avaliação da viabilidade de conídios

Figura 5: Processo de triagem para avaliar a eficácia de péletes de Metarhizium spp. à base de microescleródios sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus: A) Placas com latossolo vermelho estéril e adição de água destilada estéril; B) Comparação de placa com latossolo vermelho umidificado (à esquerda) e seco (à direita); C) Placa com latossolo úmido e 7 mg de péletes; D) Péletes com produção de conídios após15 dias de incubação a 27 ± 1 °C ; E) Placas preparadas para o bioensaio; F) Fémea ingurgitada de R. microplus sobre péletes (seta amarela).

vii Figura 6: A) Fêmea de R. microplus em oviposição; B) Ovos de R. microplus em tubos de vidro vedados com algodão hidrofílico; C) Larvas de R. microplus eclodidas dentro do tubo; D) Larvas transferidas para placa de Petri contendo álcool etílico 96° para quantificação com auxilio de seringa.

Figura 7: Biomassa seca (mg/mL) de vários isolados de Metarhizium spp. produzidos em meio líquido (MASCARIN et al., 2014). A biomassa (1 mL ) foi seca sobre papel filtro a 32 °C por 2 dias (F= 2.221; df = 5, 17; P= 0.09963). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam valores observados nas repetições independentes.

Figura 8: Produção de ME por diferentes isolados de Metarhizium spp. em meio líquido (MASCARIN et al., 2014) , com concentração de carbono de 16 g l-1 e relação C:N de 30:1, cultivados em agitador orbital a 250 rpm a 27 ± 1 ºC por 4 dias ( F= 1.467; df = 5, 29; P = 0.231). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam valores observados nas repetições independentes.

Figura 9: Produção de conídios a partir de péletes de Metarhizium spp. em meio agar-água 2% durante 15 dias a 27 ou 32 ± 1°C, em escotofase. Letras minusculas comparação das médias entre temperatura dentro de cada isolado fúngico pelo teste de t-Student a P < 0,05.. Letras maiúsculas comparação das médias entre isolados dentro de cada temperatura 27 ±1 ºC (F = 2,27; gl = 5, 14; P = 0,104) e 32 ±1 ºC (F = 7,01; gl = 5, 14; P = 0,0022).

Figura 10: Triagem da eficácia de péletes de Metarhizium spp. à base de microescleródios contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando seu efeito sobre o período de oviposição das fêmeas, e sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada tratamento (10 fêmeas por grupo).

viii oviposição das fêmease sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada tratamento (7 fêmeas por grupo)

Figura 12: Efeito das temperaturas 27 ± 1°C e 32 ± 1°C na eficácia de péletes de ME de M. anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando o tempo (dias) necessário para observação da conidiogênese (F = 27.199; df = 1, 87; P = 0.001). Barras de médias e desvio- padrão. (*) Redução dos dias necessários para conidiogênese do isolado IP 119 a 32 ± 1°C.

Figura 13: Eficácia de péletes de ME de M. anisopliae IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, com base no número de larvas eclodidas (X2= 43,573; df= 2; P= 0.001). Barras em vermelho representam “médias±desvio-padrão” e pontos representam eclosão de larvas.

Figura 14: Produção de conídios por grama de péletes à base de microescleródios de M. anisopliae s.s IP119 formulados com diferentes inertes, vermiculita ou celulose microcristalina e aplicados sobre meio água-ágar 2% e incubados sob duas temperaturas 27 ± 1°C ou 32 ± 1°C, em escotofase por 10 dias e por 15 dias.

Anexo: Laudo de análise do solo

ix SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS

ARSEF- Agricultural Research Service Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures

BDAL- Meio batata dextrose ágar, acrescido de extrato de levedura

CG - Coleção de fungos do laboratório de micologia de invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

CM - Celulose microcristalina

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária

IP - Coleção de fungos entomopatogênicos do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

ME – microescleródio (s)

x RESUMO

Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus procuram áreas sombreadas e úmidas no solo para realizar oviposição. Estes locais apresentam um microclima favorável para viabilizar o controle deste artrópode com fungos entomopatogênicos. O objetivo deste estudo foi produzir péletes à base de microescleródios (ME) de Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 e ARSEF 2575) e avaliar sua virulência sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus em condições de laboratório. Os péletes foram obtidos a partir de microescleródios produzidos em meio líquido específico e processados para peletização. A produção de conídios e a viabilidade de cada formulado de Metarhizium spp. foram observadas distribuindo-se 0, 03g de péletes em meio ágar-água 2%, e incubando-os a 27 ºC ou 32 ºC por 15 dias, resultados mostram que a produção de conídios pelo péletes dos isolados foi similar para a temperatura de 27 ºC, sendo a viabilidade dos conídios esporulados superior a 90% em e 32 ºC. Dois bioensaios para triagem da virulência dos isolados contra R. microplus foram conduzidos: o primeiro com 0,007 g de péletes de cada um dos isolados de Metarhizium spp. estudados; e o segundo com quantidades diferentes de péletes (0.002 a0,006 g) do isolado IP 119. Péletes foram distribuídos sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril, em Placas de Petri, umedecido com 2 mL de água destilada estéril. Foram preparadas dez réplicas para cada isolado fúngico. As placas foram incubadas por 15 dias a 27°C e UR> 90% para induzir a produção de conídios a partir dos grânulos. Placas do grupo controle não foram acrescidas de péletes. Após este período, foi adicionada uma fêmea em cada placa e avaliou-se diretamente o início da conidiogênese sobre os carrapatos por 15 dias, e após este período a massa de ovos foi retirada das placas e acondicionada individualmente em tubos de vidro para posterior quantificação das larvas eclodidas. Em ambos os bioensaios, os tratamentos fungicos reduziram o período de oviposição das fêmeas, assim comoo número de larvas eclodidas. Resultado semelhante observado paradiferentes concentrações de péletes do isolado IP 119. Bioensaio similar à metodologia descrita foi conduzido somente com IP 119 e CG 47 em duas temperatura:s 27 ºC ou 32 ºC. Os resultados mostraram que a 27 ºC péletes formulados com ME de CG 47 iniciaram a conidiogênese em fêmeas de R. microplus em tempo médio de 5 dias, e IP 119 em 9 dias. Já os ensaios conduzidos a 32 ºC mostraram que a conidiogênese sobre as fêmeas de R. microplus iniciaram entre o 5° e 6° dia. Para ambos isolados o número médio de larvas eclodidas reduziram.(X2= 43.53; df = 2; P <0.001). Péletes de ME com inerte vermiculita apresentaram maior produção de conídios do que o formulado contendo celulose (P = 0,01). Os resultados do presente estudo indicam que a formulação peletizada de ME de Metarhizium spp. foi eficaz no controle de R. microplus em condições de laboratório por reduzir o número de progênies. Esta formulação merece atenção para desenvolver potencial carrapaticida biológico, visto que as condições de temperatura e umidade requeridas para produção de conídios infectivos são similares às requeridas por este carrapato para produção de ovos e eclosão das larvas no ambiente.

xi ABSTRACT

Rhipicephalus microplus engorged females lay their eggs in shaded and humid areas on the soil; these areas seems favorable for entomopathogenic fungi development, where they could be applied for tick control. This study produced pellets based on microesclerotia (ME) of Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 and ARSEF 2575) and assessed their virulence toward R. microplus engorged females under laboratory conditions. Microsclerotia produced in specific liquid medium were processed for pelletization. Conidial production and viability of conidia from each formulated Metarhizium spp. was evaluated by distributing 0,003 g pellets 2% water-agar medium, and incubating them at 27 °C or 32 °C for 15 days. The results showed that the conidial production among isolates was similar at 27 °C or 32 °C, and the viability of the conidia was superior than 90% for conidia produced. Two bioassays were conducted for screening the virulence of isolates against R. microplus: the first one tested 0,007 g of pellets of each Metarhizium spp. isolate; the second one tested different concentrations of IP 119 pellets (0,002, to 0,006 g). Pellets were sprinkled on the surface of 5 g sterile oxisol in Petri dishes, moistened with 2 ml sterile-distilled water. Ten replicates were prepared for each fungal isolate. The plates with pellets were incubated for 15 days at 27 °C and RH > 90% to induce conidial production; plates from control groups did not receive pellets. A female was placed in each plate and monitored daily for 15 days for fungal conidiogenesis on ticks. At day 15, the egg mass was removed from each plate and transferred to a glass vial and incubated at 27 ± 1ºC to quantify the number of hatching larvae hatched. In both bioassays the fungal treatment reduced the oviposition period of females, as well as the number of hatching larvae. A bioassay was conducted with IP 47 and IP 119 at two different temperatures: 27 °C or 32 °C. CG 47 pellets incubated at 27 °C incited conidiogenesis on R. microplus females by day 5, whereas IP 119 iniciated conidiogenesis by day 9. Trials conducted at 32 C revealed conidiogenesis on R. microplus females between day 5 and 6 for both fungi. The number of larvae from females exposed to pellets of CG 47 and IP 119 was reduced.. Tests with pellets of ME produced with the different inert materials showed that pellets with vermiculite presented higher conidial production compared with the pellets prepared with cellulose. Therefore, these results together indicate that the pelletized formulation of ME of Metarhizium spp. was effective in controlling R. microplus under laboratory conditions by reducing the number of offspring. This formulation is a potential mycoacaricide, since the temperature and humidity conditions required for production of infective conidia are conducive to those required by this tick to lay eggsand hatching larva in the environment.

xii 1 REVISÃO DA LITERATURA

1.1. Controle microbiano

Os primeiros registros e tentativas de controle microbiano começaram a partir do século XIX, quando Agostino Bassi, considerado o pai da patologia de insetos, descreveu e comprovou a capacidade de o fungo Beauveria bassiana de causar doença e morte em Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), em condições bióticas e abióticas favoráveis (MESSIAS, 1989). A partir dessas observações, Metchnikoff propôs em 1879, o controle de larvas de Anisoplia austriaca (Coleoptera: Scarabaeidae) utilizando fungos entomopatogênicos (FARIA; MAGALHÃES, 2001). O controle microbiano começou no Brasil há mais de 100 anos, sendo que os primeiros registros apenas relatam a ocorrência de patógenos atacando insetos depois de 1964 com a epizootia de Metarhizium anisopliae sobre as cigarrinhas da cana de açúcar. Este método biológico de controle vem aumentando especialmente por ser eficiente em reduzir população de pragas e por apresentar baixo custo e reduzir o impacto ambiental (ALVES, 1998). Faria e Wraight (2007) observaram que os fungos entomopatogênicos mais utilizados no controle microbiano como micoinseticidas são: B. bassiana, M. anisopliae, Isaria fumosorosea, e B. brongniartii. Em 2012, Shahid et al., relatam a importância de outros gêneros fúngicos, como, Lecanicillium, Nomuraea (=Metarhizium), Entomophthora, e Neozygites. Os fungos dos gêneros Metarhizium e Beauveria são os mais empregados para controlar insetos-praga (ALVES; FARIA, 2010) Os microrganismos entomopatogênicos que são usados em áreas de cultivo comercial reduzem o uso de agrotóxicos e mantém a população de pragas abaixo do nível que causa dano econômico, possibilitando a produção de alimentos mais limpos por reduzir ou substituir o uso de agroquímicos. Dessa forma, seu uso pode beneficiar a saúde, além de preservar o ambiente (SCOPEL; ROZA-GOMES, 2011). O mercado de consumo de produtos biológicos mostra-se atraente, pois trata-se de tecnologia mais sustentável e com retorno econômico relativamente rápido (FERNANDES et al., 2012). O controle microbiano é bastante eficaz para o controle de determinadas pragas agrícolas. Diversos estudos demonstram grandes possibilidades de empregá-lo e mostram um crescente interesse em diversos países, tanto por parte de instituições públicas quanto empresas privadas que visam a buscar novas cepas em países tropicais e subtropicais.. Sendo o gênero Metarhizium, pertencente à família Clavicipitaceae, um dos mais usados

1 e estudados dos fungos entomopatogênicos para o controle de artrópodes pragas de importância agrícola, médica e veterinária em diversas partes do mundo (MENT et al., 2012; HODGE, 2003). O desenvolvimento da pesquisa brasileira em programas de controle biológico e a mudança de mentalidade dos produtores e técnicos demonstra que é viável o uso de fungos entomopatogênicos no controle de pragas (SCOPEL; ROZA-GOMES, 2011). Pesquisas com fungos entomopatogênicos reportam que M. anisopliae e B. bassiana são promissores e eficazes no controle biológico de artrópodes de importância médica, Aedes aegypti e A. albopictus (SCHOLTE et al., 2007),Triatoma infestans (LUZ et al., 2012), e veterinária, pois, possui potencial de atuar no controle de carrapatos (FERNANDES et al., 2012), por serem eficazes no controle de Rhipicephalus microplus (=Boophilus microplus) (POLAR et al., 2005; FERNANDES et al., 2011; CAMARGO et al., 2012; MUNIZ, 2015), Amblyomma cajennense (LOPES et al., 2007; D´ALESSANDRO et al., 2012). entre outros. A infecção de artrópodes por fungos entomopatogênicos começa pelo contato destes com o conídio, e é seguido por adesão, germinação, e penetração através da cutícula do artrópode Na sequência há multiplicação do fungo na hemocele e produção de toxinas, causando a morte do hospedeiro. Após a morte, no exterior do artrópode ocorre o aparecimento de micélio, e esporulação, que dissemina conídios pelo ambiente (LECUONA et al., 1996). A espécie M. anisopliae tem sido relatada como infectante para mais de 100 espécies de insetos, incluindo as espécies que vivem no solo (JACKSON; JARONSKI, 2009). Há fortes evidências de que alguns grupos genéticos de Metarhizium são adaptados a certas condições do ambiente e a uma ampla gama de hospedeiros (SMALL; BIDOCHKA, 2005), isto é essencial para regular a densidade populacional (WANG; ST. LAGER, 2014). Fungos entomopatogênicos têm se mostrado bastante promissores para o controle de carrapatos da família ixodidae (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008), os quais são susceptíveis à infecção causada por Metarhizium (MENT et al., 2012). M. anisopliae é comumente estudado para o controle de carrapatos e tem demonstrado ser patogênico para carrapatos R. microplus em condições de laboratório (POLAR et al., 2005; FERNANDES et al., 2011; MUNIZ, 2015).

2 1.2. Carrapatos ixodídeos

Carrapatos ixodídeos são caracterizados por não apresentarem segmentação corporal, por possuírem três pares de pernas as larvas e quatro pares de pernas nas ninfas e adultos. Além disso, esses artrópodes possuem um par de estigmas respiratórios laterais ou peritremas posteriores às coxas do quarto par de pernas. O corpo do carrapato é dividido em gnatossoma e idiossoma (FLECHTMANN, 1985). Os ixodídeos são popularmente denominados carrapatos duros, por possuírem um rígido escudo quitinoso que cobre toda a região dorsal do macho. Em larva, ninfa e fêmeas adultas somente 1/3 do corpo é coberto com o escudo quitinoso. Os gêneros da família Ixodidae que ocorrem no Brasil são Amblyomma, Ixodes, Rhipicephalus, Haemaphysalis e Dermacentor (REY, 2002). Todos os carrapatos são ectoparasitos obrigatórios de vertebrados e necessitam de repasto sanguíneo para completar o ciclo evolutivo. São vetores de protozoários, bactérias, e riquétsias para seus hospedeiros. A transmissão de patógenos se deve a forma de alimentação do parasito, que durante hematofagia podem infectar-se. Além disso, podem causar lesões que podem favorecer o ataque de outros artrópodes como moscas varejeiras (URQUHART et al., 1996). Rhipicephalus microplus (Canestrini, 1887)pertence à classe Arachnida, subclasse Acari, ordem Ixodida e família Ixodidae (REY, 2002). Os primeiros relatos deste carrapato asseguram que a origem foi na Ásia e veio para o Brasil durante a segunda metade do século XIX, e que os agentes patogênicos por ele transmitidos foram transportados para a Austrália, Madagascar, África do Sul, América do Sul e do Norte (MADDER et al., 2011). O ciclo de vida de R. microplus compreende em um só hospedeiro, especialmente o gado bovino. Apresenta-se três estágios: larva, ninfa e adultos . Seu desenvolvimento se completa em duas fases: fase parasitária, que ocorre sobre bovinos, onde estes ectoparasitas realizam a alimentação sanguínea; e a fase não parasitária que ocorre no solo após o carrapato abandonar o hospedeiro e compreende o período de oviposição e eclosão de larvas (URQUHART et al., 1996; GUIMARÃES et al., 2001). Fêmeas ingurgitadas de R. microplus, ovipõem no ambiente por um período de 15-20 dias, e no final da postura a fêmea morre. Após o período de 14-146 dias, ocorre a eclosão de larvas; esta eclosão depende das condições climáticas. Depois da eclosão, as larvas se fixam no hospedeiro, alimentam-se e mudam para o estágio de ninfa. Os

3 machos são encontrados sob as fêmeas e a cópula acontece no hospedeiro. Depois de fertilizadas, as fêmeas se ingurgitam até atingir o estádio de teleógena, desprendem-se da pele do hospedeiro e caem ao solo. (TAYLOR et al., 2010). Em condições de hiperinfestação, o carrapato do bovino pode parasitar outros hospedeiros (ovinos, caprinos, ungulados silvestres)(FURLONG et al., 2005). A transmissão de doenças para bovinos por R. microplus pode ocorrer em todos os estágios parasitários. R. microplus pode transmitir Babesia bigemina, B. bovis e Borrelia theileri na América do Sul, Anaplasma marginale na Austrália e Ámerica do Sul, e Coxiella burnetii também na Austrália (TAYLOR et al., 2010). O carrapato do bovino apresenta importância médico-veterinária por causar prejuízos aos animais pela perda de sangue, transmissão de doenças, emagrecimento devido a anemia dos animais, baixa produção de carne e leite, irritação da pele devido às picadas dos carrapatos. A perda de sangue diária é muito grande em bovinos ectoparasitados por centenas de carrapatos que realizam repasto sanguíneo e inoculam substancias tóxicas que comprometem sua saúde, causando anemia nos animais e perdas econômicas de produção (URQUHART et al., 1996; FORTES,1997). O impacto econômico calculado em 2008 para o controle de babesiose e anaplasmose, foi estimado na Austrália, Quênia, Zimbábue, Tanzânia, África do Sul, China, India, Indonésia e Filipinas, como sendo, respectivamente, de US$ 16.9 , US$ 5.1, U$ 5.4, U$ 6.8, U$ 21.6, U$ 19. 4, U$ 57.2, U$ 3.1 e U$ 0.6 bilhões de dólares por ano (BOCK et al., 2008). No Brasil, as perdas econômicas causadas por carrapatos bovinos R. microplus alcançam $ 3.4 bilhões de reais, e estima-se que a combinação de parasitos internos e externos cause uma perda maior, chegando a $ 13.96 bilhões de reais por ano

(GRISI et al., 2014) O controle de R. microplus é feito quase que exclusivamente por métodos químicos (banho e pulverização do gado com carrapaticida) e inspeção de animais. No Brasil, o controle é realizado principalmente na fase parasitária, através do emprego de diferentes grupos químicos. O uso indiscriminado e a má utilização dos carrapaticidas vêm acarretando sérios problemas de resistência, além de implicações diretas na poluição do solo e mananciais hídricos (GUIMARÃES et al., 2001), além do acúmulo de resíduos em alimentos, o que afeta diretamente a saúde humana e animal (FERNANDES et al., 2012). Os métodos tradicionais de controle de carrapatos de bovinos são feitos com o uso de acaricidas químicos; este controle cria risco à produção animal e ao ambiente. Dessa

4 forma, métodos sustentáveis que causaem menos danos ambientais são necessários, e o controle biológico de carrapatos utilizando fungos entomopatogênicos é considerado um método de controle alternativo viável e ecologicamente sustentável ao uso exclusivo de acaricidas químicos (URQUHART et al., 1996). Muitos fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados à carrapatos e alguns deles têm demonstrado alta virulência em condições laboratoriais por serem efetivos e causarem mortalidade (MONTEIRO et al., 1998; BITTENCOURT et al., 1999; FERNANDES et al., 2004; FERNANDES et al., 2008; REIS et al., 2008; ANGELO et al., 2012; SUN et al., 2013). M. anisopliae senso lato. e B. bassiana s.l. infectam com maior facilidade larvas de carrapatos, quando comparadas aos estágios de ninfas e adultos (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). O controle de ixodídeos baseado no emprego de fungos entomopatogênicos, requer o desenvolvimento de formulações efetivas, que contornem fatores abióticos adversos (MENT et al., 2010).

1.3. Interferência de fatores abióticos no controle microbiano

Fatores abióticos são condições climáticas ou não climáticas, tais como a radiação solar, temperatura, umidade, vento, substrato e pesticidas químicos, que influenciam na estabilidade, sensibilidade e persistência dos propágulos fúngicos no ambiente. Esses fatores afetam, de forma independente ou coletiva, a germinação, a infecção e posterior colonização do fungo no hospedeiro, assim como a sua ocorrência em epizootias ou enzootias (ALVES; LECUONA, 1998; IBRAHIM et al., 1999). Um dos principais fatores abióticos que influenciam o crescimento e desenvolvimento de fungos é a temperatura, por afetar diretamente o processo de germinação e desenvolvimento do fungo. Outros fatores importantes incluem o nível de

água, pH, nível de CO2 e presença de produtos químicos. A resposta positiva ou negativa a esses fatores depende da espécie, ou da cepa do fungo (GARRAWAY; EVANS, 1984). Os fungos entomopatogênicos têm distribuição desde o ártico até os trópicos, estando presente em florestas, savanas, zonas de costas, desertos e pântanos (WANG; ST. LAGER, 2014). A maioria dos fungos entomopatogênicos são mesofílicos por desenvolver-se entre as temperaturas de 10 e 40 ºC, sendo ótimas as temperaturas entre 25 e 35 ºC (COONEY; EMERSON, 1964). A temperatura não ótima, afeta o metabolismo de fungos entomopatogênicos e altera os processos de produção de enzimas, toxinas, germinação dos esporos,

5 desenvolvimento do tubo germinativo, penetração, colonização e esporulação. Tanto o calor quanto o frio, são fatores abióticos importantes que podem limitar a eficácia de fungos entomopatogênicos em programas de controle, podem também afetar a estabilidade dos patógenos durante o seu armazenamento e durante suas aplicações, assim como restringir a ocorrência natural destes patógenos (ALVES; LECUONA, 1998; FERNANDES et al., 2008). Os fungos entomopatogênicos respondem aos estímulos térmicos, crescem e se desenvolvem em função da temperatura (EDELSTEIN et al., 2004) e umidade adequada (DEVI et al., 2005). Elevadas temperaturas e a elevada umidade relativa quando associadas são prejudiciais ao desenvolvimento fúngico e podem afetar as células provocando desnaturação de proteínas e desorganização de membranas (CRISAN, 1973; SETLOW; SETLOW, 1998). Fungos entomopatogênicos naturalmente tolerantes a temperaturas extremas têm vantagens durante o processo de infecção e isso desperta interesse para seu uso em programas de controle biológico. Muitos estudos têm investigado a termotolerância de isolados de B. bassiana (DEVI et al., 2005; FERNANDES et al., 2008); Isaria sp. (CABANILLAS; JONES, 2009); M. acridum, M. robertsii, M. anisopliae s.l., Aspergillus nidulatus (Rangel et al., 2010). Fernandes et al. (2010) avaliaram isolados de diversas espécies de Metarhizium e demonstraram que a temperatura tanto alta quanto baixa reduze a viabilidade de conídios. A avaliação de fungos entomopatogênicos como agentes de biocontrole, além de observar a virulência do fungo contra uma determinada praga alvo, deve considerar também a adequação do fungo às condições ambientais da região destinada à aplicação do bioproduto, pois não há crescimento fúngico abaixo ou acima da temperatura limiar, e o crescimento atinge o máximo em temperatura ótima (SMITS et al., 2003). A compreensão da interação patógeno-hospedeiro, o conhecimento sobre oambiente ecológico onde vive o hospedeiro são fundamentais para direcionar a utilização de formulações apropriadas (SHAHID et al., 2012).

1.4. Formulação de propágulos fúngicos

Com o constante interesse em minimizar o uso de agrotóxicos e utilizar fungos entomopatogênicos para o controle de artrópodes, tem-se aumentado a necessidade de

6 melhorar a estabilidade durante o armazenamento e as formas de aplicação dos produtos à base de fungos, para que a virulência e a eficácia dos propágulos não sejam afetadas. A condição de armazenamento e de aplicação do bioproduto devem estar relacionadas a proteção dos propágulos, à qual pode ser conseguida pelo uso de formulações adequadas (ALVES, 1998; ALVES ; FARIA, 2010). As formulações contendo fungos entomopatogênicos devem estabilizar o propágulo após a sua produção e durante o armazenamento; facilitar a manipulação e aplicação; proteger o propágulo contra fatores abióticos; aumentar a persistência e favorecer o contato e a interação com o artrópode alvo; disponibilizar uma forma econômica e de fácil aplicação do produto; propiciar viabilidade prolongada aos propágulos (JONES; BURGES, 1998). Neste sentido, o êxito de bioinseticidas e bioacaricidas depende de formulações apropriadas, da sensibilidade do artrópode hospedeiro ao microrganismo, e de propriedades fisiológicas do material infectivo após aplicação (DORTA; ARCAS, 1996). A adaptação fisiológica do fungo entomopatogênico permite aumentar a eficácia do formulado e ajudar a contornar os efeitos deletérios de fatores abióticos estressantes (MENT et al., 2010). As formulações contendo fungos entomopatogênicos disponibilizadas comercialmente são encontradas em diferentes apresentações: 1) formulação em pó para ser suspendida em água; 2) pó para contato, aplicação direta; 3) dispersão oleosa; 4) iscas desenvolvidas para atrair e serem consumidas por pragas-alvo; 5) grânulos dispersíveis em água. Os grânulos são formas sólidas multiparticuladas que apresentam distribuição de tamanho relativamente uniforme. São formas consideradas mais elaboradas, devido à homogeneidade e compactação do propágulo na estrutura (FILHO et al., 2007). Por sua vez, os péletes também são formas sólidas multiparticuladas que, ao contrário dos grânulos, apresentam elevada esfericidade e estrutura mais densa (DUKIĆ- OTT et al., 2009). O emprego desses sistemas tem potencial para melhorar a estabilidade das células fúngicas, as quais estão inseridas em uma estrutura mais densa e com maior capacidade protetora frente à fatores abióticos, como a radiação solar. Além disso, os péletes são estruturas de tamanho mais uniforme quando comparados aos grânulos convencionais e apresentam ainda uma forma mais homogênea. A tecnologia de obtenção de péletes é comum na indústria farmacêutica, sendo sua produção viável industrial e economicamente. A peletização é um processo de aglomeração que transforma pós finos em formas esféricas de maior dimensão (diâmetro variável de 0,5 a 2,0 mm) (DUKIĆ-OTT et al., 2009; ABDUL; CHANDEWAR;

7 JAISWAL, 2010). Algumas técnicas utilizadas na peletização são a extrusão e esferonização, criopeletização, globulação e compressão. Dentre todas, a mais frequentemente empregada é a extrusão-esferonização, que foi desenvolvida em meados da década de 1960 com o propósito de desenvolvimento de formas farmacêuticas para liberação modificada de fármacos (GANDHI; LAL KAUL; PANCHAGNULA, 1999; SUPRIYA; RAJNI; RANA, 2012). A extrusão-esferonização consiste num processo com múltiplas etapas: (1) preparo de mistura seca, na qual os pós são misturados até obtenção de dispersão homogênea; (2) umedecimento da mistura de pós (malaxagem), que é realizada sob constante agitação, até formação de massa suficientemente plástica, de baixa aderência e com características lubrificantes (HARRISON; NEWTON; ROWE, 1985; SOUZA et al., 2002; GAO et al., 2013); (3) extrusão, a massa úmida é impelida através de orifícios para ganhar forma e diâmetro uniformes. Essa etapa ocorre em extrusor (parafuso e rolos são os mais comuns) (VERVAET; BAERT; REMON, 1995); (4) esferonização, etapa na qual o extrusado é submetido à alta rotação sobre prato de fricção rotatório, até que seja quebrado e talhado em numa forma cujo comprimento é igual ao seu diâmetro (DUKIĆ- OTT et al., 2009); e (5) secagem, para atingir a umidade final desejada pode-se secar os péletes obtidos à temperatura ambiente ou utilizar equipamentos com emprego de temperatura elevada, como estufas de ar circulante ou leito fluidizado (SUPRIYA; RAJNI; RANA, 2012). A celulose microcristalina é considerada o adjuvante padrão-ouro no preparo de péletes altamente esféricos, devido às suas propriedades reológicas (coesividade e plasticidade) ideais para a técnica de extrusão-esferonização. No entanto, alguns autores já relataram a utilização de outros excipientes na produção de péletes pela técnica de extrusão- esferonização (DUKIC et al., 2007). Pesquisas de desenvolvimento de formulações fúngicas superiores às comercialmente disponíveis são necessárias e importantes para aumentar a disponibilidade de micoacaricidas comerciais e beneficiar a agricultura, reduzindo o risco de resistência e o impacto ao agroecossistema relacionados à aplicação de agentes químicos (SHAHID et al., 2012). O desenvolvimento das formulações depende das propriedades fisiológicas e físicas do patógeno, assim como da localização e hábitat dos artrópodes alvos (DAOUST et al., 1983). Os micoinseticidas são produtos a base de fungos, importantes na agricultura moderna e sustentável (ALVES et al., 2001). Além dos conídios, outros propágulos

8 fúngicos têm sido investigados para produção de biopesticidas à base de fungos entomopatogênicos, como, por exemplo, os microescleródios (ME), os quais constituem um aglomerado quitinizado de hifas, formando uma estrutura compacta e de resistência do microrganismo (JACKSON; JARONSKI, 2009). A formação de propágulos fúngicos resistentes a condições ambientais desfavoráveis e na ausência de hospedeiro foi observada em Macrophomina phaseolina, um fungo fitopatogênico que persiste no ambiente na forma de microescleródio (VIANA; SOUZA, 2002). Jackson e Jaronski (2009) produziram microescleródio de três isolados de M. anisopliae s.l. para serem usados no controle de Tetanops myopaeformis (Diptera: Ulidiidae), e mostraram excelente eficiência no controle deste díptero. Neste estudo, os autores mostraram pela primeira vez que isolados de M. anisopliae produzem não somente blastosporos, micélio e clamidosporos, mas também microescleródios. A descoberta de que alguns fungos entomopatogênicos produzem microescleródios aumentou o número de pesquisas e o interesse comercial para o uso destes propágulos no controle de insetos que vivem no solo ou que desenvolvem algum estágio de seu ciclo evolutivo no solo. Foi observada a produção de microescleródio do fungo entomopatogênico Nomuraea rileyi (Ascomicota: Hypocreales) quando cultivado em meio líquido apropriado, ea virulência foi determinada usando larvas de Etilla zinckenella (Lepdoptera: Pyralidae) (SONG et al., 2014). Microescleródio obtido por meio líquido foi passível de ser formulados para facilitar sua aplicação, armazenamento e otimização do uso para controle de artrópodes alvos. A produção granular de ME de Metarhizium spp. foi primeiramente relatada por Jackson e Jaronski (2009); com o meio de cultivo contendo ME, adicionava-se terra diatomácea para dar consistência a biomassa e para obter os grânulos. Este mesmo método utilizando terra diatomácea para obteção de grânulos foi relatado por Mascarin et al. (2014) quando investigaram a produção de ME de isolados de Metarhizium spp. originados do Brasil. Behle et al. (2013) e Behle e Jackson (2014) também produziram grânulos de ME utilizando argila como matéria. A terra diatomácea e a argila têm a função de dar forma e consistência ao bioproduto, por incorporar ME de maneira uniforme e auxiliar durante a reidratação do grânulo para a produção de conídios. Os formulados com terra diatomácea ou argila em seu estado final de bioproduto não apresentam esferonicidade uniforme devido ao método de obtenção dos grânulos. No entanto, Goble et al. (2016) utilizaram argila caulim e um

9 método mais elaborado com o auxílio de um extrusor para a obtenção do formulado de ME e também obtiveram grânulos. A atividade inseticida dos microescleródios de M. brunneum foi observada para larvas de Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae) (BEHLE; JACKSON, 2014) e também para larvas de Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae) (BEHLE et al., 2015). Com o grande interesse em entender e utilizar os microescleródios como micoinseticidas, Song et al. (2015) investigaram os mecanismos moleculares de N. rileyi para entender a formação e diferenciação morfogenética do fungo em microescleródios, e os resultados mostraram que dois genes Sho1p e Sln1p estão envolvidos e têm importante papel na regulação e formação destas estruturas, além disso, estes genes são expressos durante a esporulação e virulência de N. rileyi. O desenvolvimento de péletes contendo microescleródios de Metarhizium abre novas possibilidades no controle biológico de artrópodes, pragas agrícolas ou urbanas, que dependem do solo para completar o ciclo evolutivo. O solo é um ambiente favorável para esta formulação, porque geralmente oferece condições adequadas de temperatura e umidade devido ao microclima proveniente do tipo de vegetação, forragem e evaporação do solo (MASCARIN et al., 2014). Os microescleródios quando re-hidratados produzem conídios capazes de infectar insetos suscetíveis (BEHLE; JACKSON, 2014), e a formulação granular pode contribuir para que as células fúngicas persistam no ambiente por várias semanas (BEHLE et al.,2013). Estudos têm demonstrado que Metarhizim spp. produzem microescleródios quando formulados em meio líquido rico em carbono; os propágulos mostraram boa estabilidade durante o armazenamento e potencial para o controle de insetos que vivem no solo (MASCARIN et al., 2014). A eficácia da formulação granular de microescleródio de M. brunneum (Hypocreales: Clavicipitaceae) para o controle de ninfas e adultos de Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae), carrapato vetor da doença de Lyme para humanos nos Estados Unidos, foi confirmada a partir da determinação da susceptibilidade dos indivíduos expostos aos conídios esporulados a partir do formulado granular; foi observada mortalidade tanto de ninfas quanto de adultos (BEHLE et al.,2013). O trabalho de Behle et al. (2013) é a única investigação disponível sobre o uso de microescleródio no biocontrole de carrapatos. Compreender e aprofundar os estudos nesta abordagem de biocontrole podem contribuir para o sucesso do controle biológico de carrapatos no solo durante a fase não parasitária, já que as condições exigidas para a esporulação de conídios a partir dos microescleródios no ambiente são condições

10 similares às que as fêmeas ingurgitadas de R. microplus procuram para realizar oviposição. No Brasil, péletes de Metarhizium contendo microescleródios não estão disponíveis comercialmente, o que sugere a necessidade de novas investigações (MASCARIN et al., 2014). O presente estudo investigou a união de duas estratégias originais para o controle do carrapato bovino: o uso de microescleródios e o desenvolvimento de formulações do fungo em péletes, ambas com potencial para melhorar a estabilidade e infectividade dos fungos entomopatogênicos.

11 2 JUSTIFICATIVA

Fungos entomopatogênicos estão naturalmente associados a carrapatos e alguns deles têm demonstrado alta virulência em condições laboratoriais, sendo Metarhizium anisopliae s.l. e Beauveria bassiana s.l. os mais investigados (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). No entanto, fatores abióticos, especialmente a temperatura alta, podem exercer forte influência sobre a biologia de fungos entomopatogênicos e sobre a fisiologia de muitas espécies de carrapato em suas fases parasitárias ou não parasitárias(FREITAS et al. 2004). Apesar de estudos evidenciarem o efeito acaricida de propágulos fúngicos, como conídios e blastosporos, sobre carrapatos, pouco se sabe sobre o efeito de microescleródios (ME) sobre carrapatos ixodídeos (BEHLE et al., 2013) e seu potencial como bioproduto para controle deste artrópode. Considerando que as fêmeas ingurgitadas de ixodídeos procuram locais úmidos no solo para realizar postura, torna-se muito atrativo explorar a estratégia do uso de péletes de ME no solo, já que conídios são produzidos a partir dos péletes na presença de elevada umidade, podendo estes então infectar o carrapato. Os ME têm-se mostrado mais eficazes do que produtos à base de conídios, quando aplicados diretamente no solo, para o controle de Ixodes scapularis (BEHLE el al.,2013). Controlar populações de carrapatos durante a fase não parasitária do ciclo biológico é extremamente importante para reduzir a população deste ectoparasito e consequentemente os danos causados pelo seu parasitismo, em especial a transmissão de agentes ptogênicos. Até o presente estudo, não há opções de biocontrole com fungos entomopatogênicos para tratar o ambiente contra carrapato. É relevante salientar que o uso de péletes para veiculação de fungos entomopatogênicos é original e apresenta potencial para aumentar a persistência do fungo no solo, além de facilitar sua aplicação e possivelmente melhorar a eficácia do produto.

12 3 OBJETIVOS

Objetivo geral:

. Desenvolver péletes contendo microescleródios de Metarhizium spp. para o controle microbiano de carrapatos durante sua fase de vida não parasitária.

Objetivos específicos:

. Formular péletes contendo Metarhizium spp. a partir de microescleródios (ME) produzidos por cultivo submerso em meio líquido; . Quantificar os conídios produzidos a partir dos péletes contendo ME de Metarhizium spp. incubados em condição ótima ou estressante de temperatura, e avaliar sua viabilidade; . Avaliar a patogenicidade de conídios produzidos a partir dos péletes contendo ME de Metarhizium spp. em fêmeas ingurgitadas de R.microplus em condição ótima de temperatura e umidade, e selecionar isolados com maior eficácia; . Avaliar a eficácia de conídios produzidos após a aplicação de quantidades distintas de péletes contendo ME do melhor isolado de Metarhizium spp. em fêmeas ingurgitadas de R. microplus, expostas a condições ótimas de temperatura e umidade. . Avaliar a bioeficácia de conídios produzidos a partir dos péletes contendo ME de Metarhizium spp. para fêmeas ingurgitadas de R. microplus quando submetidos à condição estressante de temperatura; . Formular péletes contendo inertes, celulose ou vermiculita e misturar com ME de Metarhizium spp. produzidos por cultivo em meio líquido; . Quantificar os conídios produzidos a partir dos péletes compostos de celulose ou vermiculita com ME de Metarhizium spp. incubados em condição ótima ou estressante de temperatura, e avaliar sua viabilidade.

13 4 MÉTODOS

4.1 Coleta e origem dos carrapatos.

Fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus foram coletadas em bovinos naturalmente infestados e mantidos na Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás/ UFG. Os carrapatos foram coletados de animais sem contato prévio com carrapaticidas por um período mínimo de 30 dias. Após coleta, as fêmeas ingurgitadas eram levadas ao laboratório, lavadas em água corrente e em seguida imersas em solução de hipoclorito de sódio a 1% durante cinco minutos. Posteriormente, eram enxaguadas em água destilada estéril e secas em papel toalha estéril; este procedimento proporcionou a antissepsia da cutícula. As fêmeas foram selecionadas e identificadas segundo BARROS-BATTESTI, ARZUA, BECHARA (2006), que estabeleceram uma chave de identificação de ixodídeos representantes da fauna brasileira. As fêmeas identificadas de R. microplus foram utilizadas em bioensaios, conforme metodologia descrita abaixo.

4.2 Isolados fúngicos estudados e cultivo para obtenção de conídios.

Foram estudados seis isolados de Metarhizium spp. (Tabela 1), sendo dois provenientes da Coleção de Fungos Entomopatogênicos do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG) (ROCHA et al., 2011), dois da Coleção de Fungos do Laboratório de Micologia de Invertebrados, da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN, Brasília, Brasil) e dois isolados proveniente da ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures, Ithaca, New York, Estados Unidos da América. Os fungos foram cultivados em placas de Petri (95 × 15 mm) com meio de cultura Batata Dextrose Ágar (DifcoTM, Laboratories, Sparks, França) acrescido de extrato de levedura 1g L-1 (BactoTM Yeast Extract, Sparks, MD, USA) (BDAL) durante 15 dias a 27±1 °C em escotofase.

14 Tabela 1: Descrição dos isolados de Metarhizium estudados. Isolados* Espécies Origem Substrato/ Ano hospedeiro CG 47 Metarhizium Distrito Federal, Brasil Galactica sp. 1980 anisopliae s.s [Lepidoptera: Galacticidae]

CG 632 Metarhizium Distrito Federal, Brasil Acromyrmex 1997 robertsii sp. [Hymenoptera: Formicidae] IP 46 M. anisopliae s.l. Parque Nacional da Solo 2001 Emas, GO, Brasil IP 119 M. anisopliae s.s. Norte de Goiás, Brasil Solo 2001 ARSEF M.anisopliae s.s Goiânia, GO, Brasil Tibraca 1985 1883 limbativentris [Hemiptera; ARSEF M. robertsii Carolina do Sul, EUA, Curculio 1988 2575 caryae [Coleoptera: Curculionidae] (*) IP: Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública; CG: Coleção de Fungos do Laboratório de Micologia de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia; ARSEF: ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures.

4.3 Produção de péletes

Conídios foram coletados da superfície da cultura com auxílio de uma espátula e suspensos em 10 mL de solução de polisorbato (Tween 80®) a 0,05% (v/v) (Sigma Chemical Co., St.Louis, EUA). As suspensões foram agitadas com pérolas de vidro em vórtex e então quantificadas em hemacitômetro e, em seguida, ajustadas à concentração final de 5,0 × 107 conídios mL-1 para inoculação em meio líquido com relação carbono nitrogênio (C:N) de 30:1. Três frascos foram preparados para cada isolado de Metarhizium spp., cada frasco (250 ml) foi preenchido com 1,5 g de extrato de levedura; 53,5 mL de meio basal (Tabela 2); 36,5 mL de solução de glicose (7,3% m/v)] e 10 mL

15 da suspensão conidial, totalizando 100 mL/ frasco (MASCARIN et al., 2014). Os fungos foram cultivados em agitador orbital (TE-420, Tecnal®, Brazil) a 250 rpm e 27 ± 1 ºC por 4 dias. Os frascos foram examinados diariamente e agitados manualmente para minimizar o crescimento micelial na parede do frasco. No quarto dia após a inoculação, as amostras foram manejadas para medir a concentração de microescleródios (ME), o acúmulo da biomassa e a dosagem volumétrica da biomassa para iniciar a formulação dos péletes.

Tabela 2: Composição do meio basal utilizado no preparo do meio de cultura destinado à produção de microescleródios. Fórmula Componentes Quantidade molecular P.A. (g/l)

C6H12O6 D (+) Glicose Anidra 200 (Dextrose) P.A. ACS

KH2PO4 Fosfato de potássio 4 monobásico P.A. CaCl2.2H2O Cloreto de cálcio 0,8 MgSO4.7H2O Sulfato de magnésio P.A 0,6 FeSO4.7H2O Sulfato ferroso P.A. 0,1 MnSO4.H2O Sulfato de manganês II 0,016 P.A. ZnSO4.7H2O Sulfato de Zinco P.A. 0,014

Um mililitro foi retirado da cultura para determinar a concentração de ME, e foi diluída em 9 mL de solução de polisorbato 80 (Tween 80®, 0,05%, v/v). Em seguida, uma alíquota de 100 µL desta suspensão de ME foi colocada sobre uma lâmina (25,4 × 76,2 mm) e coberta com lamínula de vidro (24 × 50 mm). Os ME foram quantificados em microscópio óptico (DM2500, Leica® Mycrosystems Ltd., Switzerland) em aumento de 100× (Figura 1). As suspensões de ME foram constantemente agitadas em vórtex para assegurar homogeneidade das amostras. Apenas os ME maiores que 50 µm de diâmetro, compactos e com coloração escura foram contabilizados como ME (JACKSON; JARONSKI, 2009). As medições foram feitas com o software ToupView 3.7 For Digital Camera FMA037 7,5 mm (Fixed Microscope Adapter), acoplado ao microscópico óptico.

16 Figura 1: Microescleródios de Metarhizium anisopliae s.l. (CG 47, IP 46, IP 119, ARSEF 1883) e Metarhizium robertsii (CG632, ARSEF 1883) quantificados em microscópio óptico em aumento de 100×. Escala igual 50 µm.

Para avaliação do acúmulo de biomassa, 1 mL da cultura líquida foi coletado dos frascos de cultura, e a biomassa foi separada do meio por filtração em disco de papel filtro de 5 cm com poro de 14 µm (Qualy®, JProlab, São José dos Pinhais, PR, Brasil) de 7 cm de diâmetro, com peso previamente determinado. Em seguida, a biomassa e o disco

17 de papel filtro foram secos a 32 °C por 2 dias até obter o peso da biomassa constante e, então, o peso foi registrado (JACKSON; JARONSKI, 2009). O meio líquido com ME foi transferido para proveta de vidro 500 mL, e para cada 100 mL do meio foram adicionados 5g de terra diatomácea (DE, Keepdry, Irrigação Dias Cruz Ltda- Me, São Paulo, SP, Brasil) para formar uma biomassa homogênea. Esta bioamassa foi filtrada a vácuo (Bomba de vácuo TE-05, Tecnal®, Brazil) em papel filtro com espessura de 205 µm com poro de 14 µm (Qualy®, JProlab, São José dos Pinhais, PR, Brasil), e mantida em dessecador com sílica gel por 10 dias (Sigma-Aldrich, RJ, Brasil) sob refrigeração (5 ºC), a sílica era trocada uma vez ao dia, até a umidade do dessecador atingir 20%. A umidade na câmara foi monitorada com auxílio de um Data Logger Hobbo® modelo U14-001 (Onset Computer Corporation). O preparo dos péletes foi executado no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFG. Trinta gramas da biomassa (contendo terra diatomácea e biomassa fúngica) foram acrescidos de 20 g de celulose microcristalina (Via Farma Importadadora Ltda., Ipiranga - SP, Brasil). Quantidade suficiente de água destilada foi adicionada à mistura para se obter maior homogeneidade. A massa foi então extrusada em equipamento contendo malha de aço inoxidável com abertura de 0,5 mm (Extrusor 20, Caleva Process Solution Ltd., Inglaterra) e os extrusados foram esferonizados a 1500 rpm por 3 minutos em esferonizador Caleva (Multi Bowl Spheronizer, Caleva Process Solutions Ltd., Inglaterra) (Figura 2) e (Figura 3). Os péletes foram acondicionados em dessecador até a umidade no interior do recipiente atingir 5%. Em seguida foi estocado a -20ºC, em tubos de plástico tipo Falcon de 15 mL.

Figura 2: Diagrama esquemático do processo de obtenção dos péletes por extrusão- esferonização. Fonte de MARTINS (2015).

4.4 Produção de conídios em péletes de celulose submetidos à condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura.

Trinta miligramas (0,03 g) de péletes de cada isolado (CG 47; CG 632; IP 46; IP 119; ARSEF 1883 ou ARSEF 2575) foram colocados em placas de Petri (95 × 15 mm) contendo 20 mL de meio ágar-água 2%. As placas foram incubadas a 27 ± 1 °C ou 32 ± 1 °C, por 15 dias. Após esse período, os conídios foram suspensos em solução aquosa de Tween 80® (0,05%, v/v), e as suspensões foram quantificadas em hemocitômetro para avaliação da produção de conídios na placa. Em seguida, as suspensões foram ajustadas

19 para a concentração de 1 × 106 conídios mL-1, e um teste da viabilidade dos conídios foi conduzido retirando-se de cada suspensão uma alíquota de 20 µL e inoculando-a no centro de uma placa de Petri (35 x 10 mm) com 8 ml de BDA acrescido de 1g/ L1 de extrato de levedura, 0,002% (p/v) de Benomil (BENLATE 500, Du Pont, Brasil) (MILNER et al., 1991; BRAGA et al., 2001), e 0,05% (p/v) de Cloranfenicol (Figura 4).

Figura 4: A) e B) Produção de conídios a partir de péletes à base de microescleródio de M. anisopliae s.s ARSEF 1883 ou IP 119 após 15 dias a 27 ± 1 °C; C) Suspensão para obtenção de conídios esporulados a partir dos péletes; D) Inóculo da suspensão com concentração de 1 × 106 conídios mL-1 em meio BDAL para avaliação da viabilidade de conídios

As placas foram incubadas por 48 h a 27 ± 1 ºC em ausência de luz. Para permitir a recuperação do fungo proveniente de estresse e permitir a germinação dos conídios de forma fidedigna. Após este período, duas gotas de lactofenol de Amann mais azul de algodão foram aplicadas com pipeta Pasteur sobre a amostra inoculada no meio de

20 cultura nas placas de Petri. As placas foram observadas ao microscópico óptico com magnitude de 400× para determinar a viabilidade dos conídios. Um número mínimo de 300 conídios por placa foi avaliado e o percentual de conídios germinados foi calculado (BRAGA et al. 2001). Quatro repetições foram conduzidas independentemente.

4.5 Triagem da eficácia de péletes de Metarhizium spp. para controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus.

Os testes foram conduzidos espalhando-se manualmente 0,007 g de péletes sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril seco, previamente tamizado com malha de 1 mm, e umedecido com 1 mL de água destilada em placa de Petri (65 × 15 mm). A composição do solo utilizado nos ensaios é apresentada na Tabela 3. Para cada isolado testado (CG 47; CG 632; IP 46; IP 119; ARSEF 1883 ou ARSEF 2575), 10 placas foram preparadas. Outras 10 placas contendo apenas latossolo vermelho umedecido foram usadas no grupo controle. As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1 °C e umidade próxima de saturação para permitir a esporulação dos conídios a partir dos péletes (Figura 4).

Tabela 3: Composição do latossolo vermelho. Análise Granulométrica* Argila 422 g.Kg-1 Silte 26 g.Kg-1 Areia total 552 g.Kg-1 Classificação Argilosa Tipo de solo (MAPA)** 3 (*) Laudo de análise do solo no ANEXO A. (**) MAPA: Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento.

Após esse período, em cada placa de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de R. microplus, previamente pesada (Figura 5). As fêmeas foram acompanhadas diariamente e avaliadas quanto à oviposição e o início da conidiogênese sobre os indivíduos mortos. Parâmetros como peso final da fêmea, peso de ovos, índice de produção de ovos, índice nutricional e reprodução estimada não foram determinados, devido ao ajuste da metodologia, para permitir o bioensaio com fêmeas de R. microplus

21 sobre latossolo. Todos esses parâmetros eram influenciados com grânulos de latossolo, a quantificação das larvas estabeleceu a capacidade de reprodução da fêmeas.

Ao término da postura, a massa de ovos de cada fêmea foi pesada e colocada em tubo de ensaio vedado com algodão hidrófilo, e mantidos a 27 ± 1°C e UR ≥ 80% para permitir a eclosão das larvas (Figura 6). Foi realizado uma repetição com dez réplicas . Os seguintes parâmetros foram investigados: peso inicial da fêmea ingurgitada; período de postura, e eclosão larval, avaliado através da quantificação total das larvas eclodidas em cada tubo. A quantificação das larvas foi feita mergulhando-as em álcool etílico 96° em placas de Petri, e sugando-as com auxílio de seringa de 10 mL, agulha (BD1 20 × 40 18 G1 ½) e contagem em microscópio estereoscópico.

22 Figura 6: A) Fêmea de R. microplus em oviposição; B) Ovos de R. microplus em tubos de vidro vedados com algodão hidrofílico; C) Larvas de R. microplus eclodidas dentro do tubo; D) Larvas transferidas para placa de Petri contendo álcool etílico 96° para quantificação com auxilio de seringa.

4.6 Triagem da eficácia de péletes de IP 119 em diferentes doses para controle de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição ótima de temperatura.

Cinco doses de péletes de ME (0,002, 0,003, 0.004, 0,005 ou 0,006 g) foram aplicadas sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril umidecido em placa de Petri (65 × 15 mm). As placas foram incubadas por 15 dias a 27 ± 1 °C e UR próxima da saturação para permitir a produção de conídios a partir dos péletes. O grupo controle com 10 réplicas foi mantido nas mesmas condições de temperatura e UR. Após esse período, em cada placa de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de R.microplus, e então as placas foram incubadas nas mesmas condições de temperatura e umidade. Foi realizada uma repetição com dez réplicas, e os parâmetros analisados foram os mesmos descritos para os bioensaios descritos no item 4.5.

4.7 Eficácia de péletes de CG 47 ou IP 119 sobre fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus em condição estressante de temperatura.

Sete miligramas de péletes foram aplicados sobre a superfície de 5 g de latossolo vermelho estéril umedecido com água destilada em placa de Petri (65 × 15 mm). As placas foram incubadas por 15 dias a 27± 1 °C ou 32 ± 1 °C e umidade relativa próxima de saturação para permitir a produção de conídios a partir da superfície dos péletes. Após esse período, em cada uma das 10 placas de Petri foi colocada uma fêmea ingurgitada de R.microplus, e então as placas foram incubadas novamente a 27± 1 °C ou 32 ± 1 °C e UR

23 na mesma condição. Nos grupos controle não foi aplicada a formulação peletizada. Os parâmetros analisados foram os mesmos descritos para os bioensaios realizados em temperatura ótima, 27 ± 1 °C (iten 4.5). Três repetições independentes foram realizadas.

4.8 Produção de péletes com vermiculita

Conídios do isolado IP 119 foram cultivados conforme item 4.3. Para cada 100 mL da biomassa líquida foi adicionado 5 g da mistura constituída de 78% de vermiculita expandida (AgroFloc®, Brasil Minérios, GO, Brasil) triturada até atingir o aspecto de pó, 20% de terra diatomácea e 2 % de dióxido de silício. Esta biomassa homogênea foi filtrada a vácuo (Bomba de vácuo TE-05, Tecnal®, Brazil) em papel filtro com espessura de 205 µm e poro de 14 µm (Qualy®, JProlab, São José dos Pinhais, PR, Brasil) e foi homogeneizada com o restante da mistura 95 g. Quantidade suficiente de água destilada foi adicionada à mistura para se obter maior homogeneidade. A massa foi então extrusada em equipamento contendo malha de aço inoxidável com abertura de 0,5 mm (Extrusor 20, Caleva Process Solution Ltd., Inglaterra) e esferonizada a 1500 rpm por 3 minutos em esferonizador Caleva (Multi Bowl Spheronizer, Caleva Process Solutions Ltd., Inglaterra). Os péletes foram secos em leito fluidizado (Hüttin, Bosch, Stuttgart, Alemanha) por 30 minutos em temperatura de 40°C. Balança de infravermelho (IV 2000, Gehaka, SP, Brasil) foi usada para verificar o teor de água dos péletes até atingir 5%. Os péletes foram armazenados em tubos de plástico tipo Falcon 15 ml.

4.9 Produção de conídios em péletes de celulose ou vermiculita com o isolado IP 119, submetidos à condição ótima (27 ± 1 °C) ou estressante (32 ± 1 °C) de temperatura.

Trinta miligramas de péletes do isolado IP 119 foram colocados em placas de Petri (95 × 15 mm) contendo 20 mL de meio ágar-água 2%. As placas foram incubadas a 27 ± 1 °C ou 32 ± 1 °C, por 10 e 15 dias. Após esse período, os conídios foram suspensos em solução aquosa de Tween 80® (0,05%, v/v), e as suspensões foram quantificadas em hemacitômetro para avaliação da produção total de conídios na placa. Em seguida, as suspensões foram ajustadas para a concentração de 1 × 106 conídios mL-1, e um teste da viabilidade dos conídios foi conduzido, conforme descrito no item 4.4.

24 4.10 Análises estatísticas

Os dados de produção de conídios foram submetidos à análise paramétrica usando um modelo linear com efeitos mistos, em que os efeitos fixos foram discriminados por “temperatura” e “isolados” e o termo de interação destes fatores, enquanto o efeito aleatório foi atribuído às repetições experimentais. As médias de produção de conídios entre isolados para cada temperatura foi comparada por contrastes LSmeans a P < 0,05, enquanto as comparações duas a duas para temperatura dentro de cada isolado fúngico foi realizada com o test t-Stdent a P < 0,05. Os dados de produção de microescleródios foram ajustados a um modelo geral linear com distribuição normal (Gaussiana) e os dados transformados por log(x). E os dados de produção de biomassa foram ajustados a um modelo linear misto (MLM) com distribuição normal, em que o efeito fixado foi representado por “isolados” e atribui-se o efeito aleatório para “frascos” (repetições). Em seguida, as médias de tratamentos foram comparadas por contrastes de Tukey HSD a 5% de significância. O efeito dos tratamentos fúngicos à base de microescleródios, temperatura de incubação e peso inicial de fêmeas sobre a variável resposta “número total de larvas eclodidas por fêmea” foi descrito por meio de um modelo generalizado linear inflacionado de zeros e com distribuição binomial negativa (pacote glmmADMB). Este modelo inflacionado de zeros foi empregado aqui devido ao excessivo número de valores com resposta “zero” (Long, 1997), indicando que fêmeas do carrapato não ovipositaram ou que os ovos não estavam viáveis por outros motivos que não os tratamentos fúngicos. A distribuição negativa binomial foi utilizada para modelar os dados de contagem (número de larvas eclodidas) com superdispersão (isto é, generalização da distribuição de Poisson para dados de contagem levando-se em conta o parâmetro de superdispersão dos dados). Como a interação “Tratamento vs. Temperatura” não foi significativa no modelo, logo o modelo utilizado foi o aditivo (isto é: tratamento + temperatura + peso fêmeas). As médias de tratamentos foram, em seguida, comparadas por meio de contrastes de Tukey HSD ao nível de 5% de significância. Uma análise de correlação pelo método não- paramétrico de Spearman foi aplicada para as variáveis respostas número total de larvas eclodidas e tempo para conidiogênese. Esta análise mostraou qual o tipo de associação entre essas variáveis (negativa, positiva ou neutra) com base no valor do índice r e seu respectivo p-valor. As análises foram realizadas através do software R v.3.1.3 (R Core Team, 2015).

25 5 RESULTADOS

Os isolados de Metarhizium spp. produzidos em meio líquido tiveram biomassa seca similares (F= 2.221; df= 5, 17; P= 0.09963) (Figura 7), assim como a produção de microescleródios (ME) (F = 1.467; df= 5, 29; P= 0.231) (Figura 8). A produção de conídios a partir de 0,03 g de péletes de ME de Metarhizium spp. incubados sobre meio ágar-água 2% a 27 ± 1 ºC variou entre 7,5 × 107 (IP 119) e 2,6 × 107 (ARSEF 2575), não havendo diferença significativa entre os isolados (F = 2,27; gl = 5, 14; P = 0,104). Na temperatura de 32 ± 1 ºC, a produção de conídios foi entre 1,3 × 107 e 8,7 × 106 para maioria dos isolados; no entanto, ARSEF 2575 produziu 1,5 × 105 conídios/ 30 mg de péletes, e diferiu estatisticamente dos demais isolados (F = 7,01; gl= 5, 14; P = 0,0022). A temperatura de 32 ±1 ºC interferiu negativamente na produção de conídios a partir de péletes formulados com ME (Figura 9). Os conídios produzidos a partir de péletes de ME para todos isolados apresentaram viabilidade superior a 91,6% quando produzidos a 27±1 ºC (F6, 5= 0.6278 P= 0.7079) e 32 ±1 ºC (F6, 5= 0.4859 P= 0.7973). No bioensaio de triagem conduzido com exposição de fêmeas ingurgitadas de R. microplus a conídios produzidos a partir dos péletes de ME sob a temperatura de 27 ± 1 ºC, o tempo médio para observação da conidiogênese fúngica sobre as fêmeas tratadas foi de quatro dias para o isolado CG 47, seis dias para o ARSEF 1883, sete dias para os isolados IP 46, IP 119 e ARSEF 2575, e nove dias para o isolado CG 632(Figura 10). O período de oviposição das fêmeas, assim como o número de larvas de R. microplus eclodidas, foram reduzidos pelos tratamentos das fêmeas com Metarhizium spp. (Figura 10). No teste de triagem com diferentes quantidades de péletes de ME para a produção de conídios contra fêmeas ingurgitadas de R. microplus, foi observado que o período requerido para detecção do interrompimento da oviposição e para observação da conidiogênese dos fungos sobre as fêmeas foi entre 7 dias e 11 dias nos grupos tratados com IP 119 para todas as concentrações de péletes avaliadas (Figura 11). Todas as concentrações dos péletes de ME de IP 119 reduziram o número de larvas eclodidas. (Figura 11). Nos bioensaios conduzidos nas condições de 27 ± 1 ºC ou 32 ± 1 ºC foram detectados conidiogênese sobre as fêmeas de R. microplus expostas a conídios a partir

26 dos péletes formulados com os isolados CG 47 ou IP 119 (F = 27.199; df = 1, 87; P = 0.001); CG 47 promoveu conidiogênese em fêmeas de R. microplus em tempo médio de 5 dias, enquanto que IP 119 promoveu conidiogênese em tempo médio de 9 dias nos testes conduzidos a 27 ±1 ºC. Quando os testes foram conduzidos a 32 ± 1 ºC, o tempo médio de 5 dias foi requerido para ambos isolados para detecção da conidiogênese sobre as fêmas. Além disso, a temperatura de 32 ± 1 ºC acelerou o tempo para início da conidiogênese do isolado IP 119(Figura 12). O número médio de larvas eclodidas nos grupos tratados com conídios a partir de péletes de ME de CG 47 e IP 119, indicaram que os estes isolados reduziram significamente o número de descendente em relação ao controle e não houve diferença estatística entre temperaturas sobre o número de larvas 2 eclodidas, por isso os resultados estão em um único gráfico (X = 43.57, df = 2, P < 0.001) (Figura 13). O tipo de formulação e a temperatura foram os fatores que influenciaram significativamente a produção de conídios por péletes do isolado IP119, enquanto que a produção de conídios foi similar em ambos os tempos de incubação. A produção de conídios em péletes foi consideravelmente superior quando incubado a 27 ± 1 ºC do que a 32 ± 1 ºC, indicando que altas temperaturas podem afetar este parâmetro de desenvolvimento do fungo numa formulação granular, independentemente do tipo de inerte usado na formulação. A temperatura e tempo de incubação, no geral, a formulação contendo vermiculita apresentou maior produção de conídios em relação à formulação contendo celulose. Não houve interação entre quaisquer combinação dos fatores temperatura, formulação e tempo de incubação (Figura 14).

27 Figura 7: Biomassa seca (mg/mL) de vários isolados de Metarhizium spp. produzidos em meio líquido (MASCARIN et al., 2014). A biomassa (1 mL ) foi seca sobre papel filtro a 32 °C por 2 dias (F= 2.221; df = 5, 17; P= 0.09963). Barras em vermelho representam “médias±desvio- padrão” e pontos representam valores observados nas repetições independentes.

Figura 11: Triagem da eficácia de concentrações crescentes de péletes à base de microescleródios de Metarhizium anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de R. microplus, avaliando seu efeito sobre o período de oviposição das fêmease sobre o número de larvas eclodidas. Barras de médias e erro-padrão de cada tratamento (7 fêmeas por grupo)

30 Figura 12: Efeito das temperaturas 27 ± 1°C e 32 ± 1°C na eficácia de péletes de ME de M. anisopliae s.s IP 119 contra fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus, avaliando o tempo (dias) necessário para observação da conidiogênese (F = 27.199; df = 1, 87; P = 0.001). Barras de médias e desvio-padrão. (*) Redução dos dias necessários para conidiogênese do isolado IP 119 a 32 ± 1°C.

31 Figura 14: Produção de conídios por grama de péletes à base de microescleródios de M. anisopliae s.s IP119 formulados com diferentes inertes, vermiculita ou celulose microcristalina e aplicados sobre meio água-ágar 2% e incubados sob duas temperaturas 27 ± 1°C ou 32 ± 1°C, em escotofase por 10 dias e por 15 dias.

32 6 DISCUSSÃO

Microescleródios (ME) são estruturas fúngicas de proteção formados por agregados de hifas quitinizadas que até recentemente acreditava-se que eram produzidos apenas por fungos endofíticos ou fitopatogênicos (JACKSON; JARONSKI, 2009). Em espécies de Metarhrizium, a produção de microescleródios foi relatada em 2009 (JACKSON; JARONSKI, 2009), e em 2014 para Nomuraea rileyi (=Metarhizium rileyi) (SONG et al., 2014). Estes propágulos, por serem estruturas de resistência a fatores abióticos e por persistirem no ambiente, apresentam grandes vantagens para o controle de artrópodes pragas e vetores. Os isolados de Metarhizium spp. foram selecionados com base em estudos já publicados, que mostraram a capacidade de produção de ME dos isolados de CG 47, CG 632 e ARSEF 1883 (= CG 168) (MASCARIN et al., 2014), a virulência de IP 119 para R. microplus (MUNIZ, 2015) e de IP 46 para insetos (LUZ et al., 2012; RODRIGUES et al.,2015). O isolado ARSEF 2575 foi adicionado ao presente estudo por possuir termotolerância conhecida (FERNANDES et al., 2010; RANGEL et al., 2005). Os ME de Metarhizium foram obtidos em laboratório por cultivo em meio líquido nutricionalmente apropriado, composto essencialmente por sais, extrato de levedura e glicose (JACKSON; JARONSKI, 2009; BEHLE; JACKSON, 2014; BEHLE et al., 2015; MASCARIN et al., 2014). A produção de ME no meio líquido é influenciada pela relação de Carbono: Nitrogênio (C:N) do meio (JACKSON; JARONSKI, 2009), quanto maior for a quantidade de N, maior é o acúmulo de biomassa. A relação C:N do presente estudo foi 30:1, e pôde-se observar um maior acúmulo de biomassa.. Os isolados CG 47, CG 632 e ARSEF 1883 produziram biomassa seca superior aos valores relatados por Mascarin et al. (2014), que utilizaram maior relação C:N 50:1, ou seja, havia menor concentração de nitrogênio no meio. Da mesma forma, Behle e Jackson (2014) mostraram que a biomassa acumulada em meio com relação C:N de 30:1 foi maior quando comparada à biomassa produzida em meio com relação C:N de 50:1, como mostrado no presente estudo. Meio com quantidades diferentes de relação C:N (10:1, 30:1 e 50:1) foram avaliados por Jackson e Jaronski (2009) e os resultados motraram a produção de ME em quantidade similar por isolados de M. anisopliae cultivados por 2, 4 ou 8 dias nos diferentes meios, porém, uma maior concentração foi necessária para suportar maiores concentrações de ME.

33 Todos os isolados selecionados foram capazes de produzir ME e possivelmente cada isolado produziu um morfotipo de ME, alongada em IP 119, IP 46 e arredondada em CG 47; CG 632; ARSEF 1883 e ARSEF 2575. Essas observações foram feitas durante o processo de quantificação de ME depois de cultivado no meio de fermentação por quatro dias. Para a obtenção de um formulado de ME com maior uniformidade, o processo e tecnologia de peletização foi usado no presente estudo. Os fungos entomopatogênicos foram transfomados em péletes utilizando o método de extrusão-esferonização com 60% da biomassa fúngica acrescido de terra diatomácea e 40% de celulose microcristalina. Esta é uma metodologia inovadora para produção de bioproduto com finalidade para controle microbiano de artrópodes. Os péletes poderiam permitir melhor esporulação de conídios, porquê a relação área- superfície, que geralmente tende a produzir maior esporulação para tamanhos menores de grânulos, devido a forma esférica de sua superfície, além de otimizar a aplicabilidade, porque possui tamanho uniforme com aspecto granular. O método de peletização mostrou-se viável para obtenção de péletes altamente esféricos com 0,5 mm de diâmetro, devido ao uso de celulose microcristalina (CM) que garantiu a homogeneidade da massa (DUKÍC-OTT et al., 2009) junto com a terra diatomácea e a biomassa. Esta metodologia não interferiu negativamente na biologia do fungo, pois conídios foram produzidos a partir dos péletes em meio ágar-água 2% ou latossolo vermelho; ambos os substratos foram importantes para garantir a re-hidratação dos péletes. O formulado preparado à base de ME com celulose produziu conídios, comprovando a viabilidade dos péletes, e mesmo quando submetidos a 32 ºC, a conidiogênese (produção de conídios) não foi impedida para a maioria dos isolados investigados. No entanto, péletes do isolado CG 47 apresentaram alto rendimento na produção de conídios a 27 ± 1 ºC, mas tiveram sua produção significativamente reduzida quando incubados a 32 ± 1 ºC, revelando que esta temperatura interferiu negativamente na eficácia dos péletes produzidos com este isolado. Temperaturas de 25 a 40 ºC já foram investigadas para a produção de conídios a partir de grânulos de ME sobre meio agar- água e revelou que a temperatura constante de 40 ºC reduz a habilidade da produção de conídios a partir dos grânulos; no entanto, em temperatura alta por períodos diários determinados, a produção de conídios foi maior do que quando comparado à exposição

34 constante à mesma temperatura. A temperatura de 25 ºC foi considerada favorável e ideal para melhor produção de conídios por grânulos de ME (BEHLE et al., 2015). As formulações de fungos entomopatogênicos têm a função de proteger o própagulo contra fatores abióticos estressante e facilitar sua aplicação (ALVES, 1998; ALVES; FARIA, 2010). O uso de determinadas formulações tem-se mostrado promissor para o controle de carrapatos, como relatado por Camargo et al. (2008) que demonstraram que formulações oleosas têm eficácia sobre o controle de R. microplus em condições de laboratório. Os principais métodos de controle de carrapatos baseiam-se na utilização de acaricidas químicos (organofosforados, piretroides e lactonas macrocíclicas); esta forma de controle quando utilizada de forma inadequada e indiscriminada causa poluição ambiental, seleciona indivíduos resistentes e deixa resíduos em alimentos de origem animal, pois tais produtos utilizados para controle de R. microplus são destinados exclusivamente à aplicação sobre o animal (FERNANDES; BITTENCOURT, 2008). Formulações fúngicas, ainda que se mostrem eficazes em testes laboratoriais ou em animais estabulados para controle de carrapatos, é atualmente direcionada a aplicações de conídios sobre bovinos infestados para controle de carrapatos durante a fase parasitária (LEEMON; JONSSON, 2008; CAMARGO et al., 2012). Ainda que aplicações de suspensões conidiais se mostrem eficazes para controle de carrapatos na fase de vida não parasitária quando aplicadas sobre a vegetação, devido especialmente ao fato das criações de bovinos no Brasil serem particularmente extensivas, essas aplicações seriam muito onerosas, o que limitaria sua prática (KAAYA; HASSAN, 2000). Bioprodutos a partir de fungos entomopatogênicos registrados para o controle de carrapatos, no entanto, ainda não são disponíveis no mercado brasileiro (FARIA; WRAIGHT, 2007). O biocontrole de R. microplus tem sido investigado com maior ênfase a partir de formulações conidiais, e essas formulações quando aplicadas sobre bovinos infestados demonstram o potencial e a eficácia promissora de fungos entomopatogênicos de atuar no controle desses carrapatos (FERNANDES; BITTENCOURT; ROBERTS, 2012; POLAR et al., 2005; FERNANDES et al., 2011; CAMARGO et al., 2012; MUNIZ, 2015). A partir do referencial teórico sobre utilização de grânulos de ME para controle de insetos que realizam parte do ciclo de vida no solo, o presente estudo buscou testar péletes de ME para controle do carrapato R. microplus que apresenta duas fases de vida: uma parasitária e outra não parasitária. A fase de vida não parasitária é iniciada quando as

35 fêmeas ingurgitadas desprendem-se do hospedeiro e caem ao solo (ambiente) para realizar oviposição, geralmente em locais sombreados e úmidos (BENNETT, 1974). O presente estudo propõe um método tecnológico para a obtenção de péletes de ME para o controle de R. microplus; esta formulação merece atenção como um potencial carrapaticida biológico, visto que as condições de temperatura e umidade requeridas para a esporulação de conídios infectivos são as mesmas requeridas por este carrapato para realizar oviposição e para posterior eclosão das larvas. Grânulos de microescleródios de Metarhizium spp. já foram relatados por possuírem grande potencial para o controle de ninfas do carrapato Ixodes scapularis, as quais foram susceptíveis à infecção fúngica (BEHLE et el., 2013). A virulência de conídios produzidos a partir de ME para o carrapato R. microplus foi mostrada com péletes de Metarhizium spp. aplicados sobre a superfície de solo estéril úmido para evidenciar a efetividade dos formulados, quando incubados a temperatura de 27 ± 1 ºC e UR ≥ 80%. O contato das fêmeas ingurgitadas de R. microplus com os péletes e com os conídios produzidos a partir desses péletes em placas de Petri proporcionaram uma condição favorável à infecção pelo fungo. Esta condição pode ser alcançada em condições naturais, no entanto, muitas variáveis ambientais foram desprezadas nos testes em condições controladas de laboratório. Os resultados obtidos a partir do bioensaio de triagem utilizando 0,007 g de péletes, possibilitaram selecionar dois isolados de M. anisopliae s.s., (CG 47 e IP 119) por apresentar relevante produção de conídios a partir dos péletes, menor tempo para detecção de conidiogênese sobre fêmeas ingurgitadas de R. microplus. O menor tempo (dias) para detecção de conidiogênese dos fungos sobre as fêmeas de R. microplus esteve diretamente associado ao menor número de larvas eclodidas.Isso refere-se também ao fato de que as fêmeas tiveram menos tempo para realizar oviposição, pois o número de larvas gerado por fêmea é, de forma geral, relacionado à sua capacidade de conversão do seu peso em ovos (BENET, 1974). Os testes de triagem das diferentes quantidades de péletes (g) formulados com ME do isolado IP 119 foi adicionado ao presente estudo para verificar se em quantidades menores era possível encontrar a concentração ótima a ser aplicada para garantir a efetividade do formulado. Os resultados foram favoráveis e mostrou que independente da quantidade de péletes sobre o latossolo úmido, os conídios produzidos foram capazes de infectar fêmeas e interromper precocemente a oviposição, reduzindo consequentemente o número de larvas por fêmeas.

36 Os bioensaios conduzidos sob a temperatura de 32 ± 1 ºC e UR ≥ 80% revelaram que a conidiogênese sobre as fêmeas ingurgitadas de R. microplus para CG 47 e IP 119 não foi afetada negativamente. Os dois isolados reduziram significativamente o número de larvas eclodidas, independentemente da temperatura de incubação (32 ± 1 ºC ou 27 ± 1 ºC). Os resultados destes bioensaios mostram que o controle de carrapatos com a formulação peletizada em condições de laboratório evidencia o uso de ME como ativo biológico eficaz. Os péletes à base de ME de Metarhizium spp. foram eficazes no controle de R. microplus por reduzir o número de progênies, e abre novas perspectivas para o controle biológico de R. microplus durante sua fase de vida não parasitária. A formulação a base de ME de Metarhizium spp. e terra diatomácea, acrescida de CM resultou em péletes, um bioproduto fúngico. A CM garante, no entanto, características orgânicas aos péletes produzidos. Outro inerte selecionado foi a vermiculita por ser um mineral. Os péletes foram transformados utilizando o método de extrusão-esferonização com 70% de vermiculita, 20% de biomassa fúngica acrescido de terra diatomácea e 2% de dióxido de silicio. Os dois formulados foram capazes de produzir conídios viáveis na constante temperatura de 27 ± 1 ºC ou 32 ± 1 ºC durante 10 e 15 dias. Este é o primeiro relato de um péletes composto por 100% de inertes minerais, o que contrasta a forma convencional baseada em alginato (CARNEIRO; GOMES, 1997) ou celulose microcristalina. As duas formulações peletizadas obtidas no presente estudo abrem novas perspectivas para serem usadas não somente para o controle biológico de carrapatos, mas também para outros artrópodes de importância médica e veterinária que desenvolvam uma fase da vida no solo. Os formulados com celulose ou vermiculita possuem como ingrediente ativo ME que não necessitam de nutrientes para iniciar a germinação micelogênica. Os ME necessitam apenas de umidade e condições de temperaturas favoráveis para que a produção de conídios infectantes ou infectivos seja desencadeada. O fator umidade pode ser contornado pela composição e diâmetro do pélete, e pelas características do local de aplicação devido à perspectiva de aplicação em solo coberto por vegetação (microclima úmido); essas condições podem garantir temperatura e umidade adequadas estabelecidas pelo sombreamento e pelo processo natural de gutação (formação de gotículas de água na borda das folhas, proveniente do metabolismo da respiração das plantas). Os efeitos do estresse térmico também podem ser contornados com a formulação de ME a partir de isolados fúngicos mais tolerantes ao calor.

37 7 CONCLUSÕES

1. Isolados de Metarhizium spp. (CG 47, CG 632, IP 46, IP 119, ARSEF 1883 e ARSEF 2575) foram capazes de produzir microescleródios (ME) em meio líquido submerso.

2. A tecnologia de peletização permitiu a formação de péletes de ME de Metarhizium spp.

3. A germinação micelogênica dos péletes ocorreu em temperatura constante de 27 °C e de 32 °C e em seguida conídios viáveis foram produzidos.

4. Conídios produzidos a partir de péletes de ME de Metarhizium spp. foram virulentos para fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus tanto à 27 °C como a 32 °C, sendo capazes de infectá-las e reduzirem seu período de postura e o número de larvas eclodidas.

5. Péletes de ME do isolado IP 119 constituído de inerte orgânico ou inorgânico foram capazes de produzir conídios viáveis em temperaturas constantes de 27 e 32 °C.

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46 ANEXOS