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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Mapeamento físico cromossômico de elementos repetitivos em

marsupiais amazônicos

Carlos Eduardo Faresin e Silva

Manaus-AM 2016 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Mapeamento físico cromossômico de elementos repetitivos em marsupiais amazônicos

Carlos Eduardo Faresin e Silva

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito

para a obtenção do título de Doutor em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Orientador: Eliana Feldberg, Dra. Co-orientador: Maria Nazareth Ferreira da Silva, Dra.

Manaus-AM 2016

Ficha catalográfica

S586 Silva, Carlos Eduardo Faresin e

Mapeamento físico cromossômico de elementos repetitivos em

marsupiais Amazônicos /Carlos Eduardo Faresin e Silva. --- Manaus: [s.n.], 2016.

75 f.: il.

Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2016.

Orientador: Eliana Feldberg

Coorientador: Maria Nazareth Ferreira da Silva

Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

Sinopse 1. Marsupiais - Amazônicos. 2. Citogenética. 3. Cariótipo. I. Título. No presente trabalho foram analisadas citogeneticamente 16 espécies de marsupiais, coletadas em 13 pontos da bacia hidrográfica CDD 599.29811 que compõem o bioma Amazônia. Foram realizadas comparações em coloração convencional, distribuição da heterocromatina, regiões organizadoras de nucléolo, DNAr 18S, sequências teloméricas e retroelemento LINE-1. As variações cromossômicas foram analisadas no âmbito geográfico, evidenciando padrões segregados para as diferentes formas do cromossomo X. Na família Didelphidae, sequências teloméricas intersticiais foram relacionadas como

componentes da heterocromatina e restritas a algumas linhagens; a nio distribuição do LINE-1 mostrou padrão disperso, diferente daquele já observado na literatura, sugerindo que esse elemento não participe participam da inativação do cromossomo X nas espécies analisadas

Dedicatória

Dedico este trabalho a todas as pessoas que possuem o comprometimento e respeito de ausentar-se de suas terras, visando trazer conhecimentos dos cantos mais remotos do mundo. Dedico também aos brasileiros que residem nesses locais e auxiliam na ocupação de nosso território e convivem com a natureza de forma harmônica.

Epígrafe

“A verdade é como o Sol, podes esconder durante um tempo, mas não desaparece” Elvis Presley

A realização deste projeto foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, do INPA. Ao laboratório de Genética Animal do INPA, Coordenação de Pesquisas em Biodiversidade, onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvida, com financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais (PPIs), Projeto Sisbiota Rede BIOPHAM (MCT/MEC/CAPES/FNDCT n◦ 47/2010), ao Projeto CAPES Pró-Amazônia. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pela concessão da bolsa de estudo.

Agradecimentos

Agradeço à minha orientadora Dra. Eliana Feldberg, por sempre deixar as portas de seu laboratório abertas ao longo de 10 anos, pelos incontáveis ensinamentos (científicos e de vida) e pela fé incondicional depositada na minha capacidade. À minha coorientadora Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, por compartilhar sua visão, pelo auxílio ao concatenar toda problemática com a história complexa da mastofauna amazônica. A ambas pelo apoio quase ilimitado. Ao colega Eduardo S. Eler, pela parceria de longa data, discussões e pela grande quilometragem que percorremos nessa selva desde 2006. À Érica M. S. Souza, pela amizade, auxílios e sobretudo pelo entusiasmo “didelfídico”. Aos amigos Marco Antônio A. Schetino e Rodrigo A. Andrade, pelas contribuições e auxílios valorosos em campo e laboratório. Aos colegas de laboratório Leila B. Ribeiro, Ramon M. Favarato, Lucas Barros pelas sugestões. Aos professores Dr. Fabrício Santos e Dra. Marta Svartman, por me receberem em seus laboratórios contribuindo para meu crescimento profissional. Aos amigos do projeto SISBIOTA: Fabrício Bertuol, Pedro Sena, Alexandre Almeida, Roberto Zamora e Vinícius Carvalho cujo companheirismo foi fundamental para tornar as expedições ainda mais agradáveis e exequíveis. E todos os auxiliares de campo (Sebastião “Sabá”, Oscírio “Juruna”, Flamarion “Pinduca”, Jonas Paz entre outros) que doaram sua força de trabalho, que compartilharam seu companheirismo e narraram suas experiências de vida. Essas ocasiões são oportunidades ímpares na inserção real de pesquisadores dentro da realidade amazônica.

Resumo

Os marsupiais sulamericanos estão representados principalmente pela família Didelphidae considerada conservada cariotipicamente. No presente trabalho mapeamos elementos repetitivos em 194 indivíduos, representando 16 espécies de didelfídeos, coletadas em 13 localidades ainda não exploradas, do ponto de vista científico, na Amazônia, para verificar possíveis padrões de evolução cariotípica. Para isso foram utilizados métodos citogenéticos clássicos e moleculares. Variações no cromossomo X, na distribuição da heterocromatina e no mapeamento de sequências de DNA ribossomal 18S e sequências teloméricas foram registradas. A principal variação foi na posição do centrômero do cromossomo X de Caluromys lanatus e de Marmosa murina. Os diferentes tipos de cromossomos X, de ambas espécies, mostraram uma separação em termos geográficos entre leste e oeste do Brasil, com contato na Amazônia central. Para as espécies de Marmosops spp., dois padrões de X foram evidenciados pelo método de banda C, porém não foram separados geográficamente. As regiões organizadoras de nucléolo foram confirmadas pelas sondas de DNAr 18S em todas as espécies, exceto a marcação do cromossomo Y de Monodelphis brevicaudata. A distribuição desse marcador se mostrou variável apenas no gênero Marmosa. Considerando a RON simples como um caráter plesiomórfico sugerimos que as espécies do gênero Marmosa e Didelphis marsupialis evoluíram independentemente para o sistema múltiplo. Em relação às sequências teloméricas, 11 espécies foram analisadas e cinco apresentaram ITSs, todas dentro da região de heterocromatina centromérica. A presença de ITS foi constante no cromossomo X de indivíduos de Marmosa murina e variável nas demais espécies. Acreditamos que a presença variável das ITSs seja uma característica particular de cada linhagem. O retroelemento LINE-1 foi mapeado em exemplares de cinco espécies: Caluromys philander, Gracilinanus emiliae, Marmosa murina, Marmosa demerarae e Didelphis marsupialis. As marcações se mostraram dispersas por todos os cromossomos, não havendo preferência por regiões específicas do cromossomo, nem mesmo pelo cromossomo X. A variação do cromossomo X e os padrões de distribuição dos elementos repetitivos podem ser reflexo dos eventos de especiação ocorridos nos didelfídeos.

Abstract Currently, marsupials are the second largest mammals living family. The groups evolutionary history is linked to the geological history of the continent and in South America, they are represented mainly by Didelphidae family. This family is the only present in the Amazon and in the rest of Brazil. Marsupial cytogenetic characterization shows a conservation of diploid numbers ranging from 10 to 32 chromosomes, and in didelphids are known karyotypes 14, 18 and 22 chromosomes. In this context, molecular cytogenetic allows for new inferences about the chromosomal evolution, supplying additional characters to analyze, for example, mapping repetitive regions of the genome. In this paper we map repetitive elements in species didelphids collected in 13 new locations in the Amazon in unexplored regions, seeking to understand evolutionary patterns of karyotypes. In all were analyzed 194 individuals of 16 species featured in conventional staining, band C, Ag-RON and FISH with probes DNAr18S, telomeric and transposable element LINE-1. We observed variation on the X chromosome, the distribution of heterochromatin and mapping sequences of 18S ribosomal DNA and telomeric sequences. The main variation found in the position of the centromere was the X chromosome of C. lanatus and Marmosa murina. Geographically, the different types of X, both species showed a segregation between eastern and western Brazil, with contact in the central Amazon. For species Marmosops spp. two patterns of X were evidenced by the C-band technique, but less obvious geographical distribution. The nucleolar organizer regions were confirmed by 18S rRNA gene probe in all species except the marking of the Y chromosome Monodelphis brevicaudata. The distribution of this marker showed only variable in Marmosa genre. Considering RON simple as a character plesiomorphic conclude that the species of the genus Didelphis and Marmosa evolved independently for multiple system. Marsupials are considered chromosomally conservative, however, given the current state of knowledge to this group, inter variations and intraspecific are observed and this is due to the expansion of the sample and the application of more accurate techniques, suggesting the presence of chromosomal rearrangements in evolution this animal group. Regarding the telomeric sequences, 11 species were analyzed and compared the presence of interstitial telomeric sequences (ITSs) with the distribution of the C band and found that STIs are coincident with heterochromatin blocks. Of the 11 species examined, only 5 had STIs, all within the centromeric heterochromatin region. The presence of STIs was constant on the X chromosome of Marmosa individuals and murine variable in the other species. We believe that the variable presence of STIs is a particular characteristic of each lineage. Our results support the inference that such sequences can not always be interpreted as a consequence of chromosomal rearrangement. Finally, we map the LINE-1 retroelement to five species of copies: Caluromys philander, Gracilinanus emiliae, Marmosa

murina, Marmosa demerarae and Didelphis marsupialis. The markings are shown scattered all chromosomes, with no preference for specific chromosome regions, or even the X chromosome, as reported in the literature for other marsupials. The most informative variations were in the morphology of the X chromosome, which verified the existence of geographic patterns and are possibly related to different species, showing that chromosomal variation has relation to the diversification of species. Markers of repetitive sequences (18S, telomere and L1) showed variations possibly be related to more recent events of speciation.

Sumário 1. Introdução geral ...... 1

1.1. Ordem Didelphimorphia, Família Didelphidae ...... 1

1.2. Citogenética clássica em marsupiais ...... 5

1.2.1 Citogenética molecular em marsupiais ...... 7

1.3 . Objetivo geral ...... 11

2. Material e Métodos ...... 12

2.1. Material e locais de coleta ...... 12

2.2 Métodos Citogenéticos ...... 15

2.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 15

2.2.2. Bandeamentos Cromossômicos ...... 16

2.3.1 Análise cariotípica ...... 17

2.3.2. Citogenética molecular ...... 17

2.3.2.2. Detecção de sequências de DNA repetitivo em tandem ...... 18

3. Resultados e Discussão ...... 21

Capítulo 1: Caracterização citogenética de marsupiais didelfídeos na Amazônia brasileira: uma abordagem clássica sobre o cromossomo X e heterocromatina, num contexto geográfico...... 22

Capítulo 2: Comparação cromossômica entre heterocromatina e sequências teloméricas em 11 espécies de marsupiais amazônicos (Didelphimorphia; DIdelphidae) ...... 41

Capítulo 3: Mapeamento do elemento LINE-1 em cinco espécies de marsupiais amazônicos (Didelphidae; Didelphimorphia)...... 50

4. Conclusões ...... 57

5. Referências ...... 58

Apêndice I: ...... 72

Apêndice II: ...... 72

iii

Lista de figuras:

Introdução geral

Figura 1. Relações intergenéricas simplificadas da família Didelphidae, baseada na árvore com dados morfológicos, cariotípicos e moleculares pelos métodos de análise Bayesiana de Voss e Jansa (2009). Dados de número diploide conhecidos para espécies de cada gênero à frente de cada unidade terminal. Em pontilhado a relação alternativa do gênero Glironia com o restante dos didelfídeos, encontrada pela máxima parcimônia...... 5

Figura 2. Mapa da bacia amazônica, indicando os locais de coleta das espécies de Didelphidae analisadas neste estudo. Estado do Amazonas: 1- rio Japurá, Município de Japurá; 2- rio Juruá, Município de Juruá; 3- rio Negro, Município de Santa Isabel do Rio Negro; 4- rio Purus, Município de Tapauá; 5- rio Cuieiras, Município de Manaus; 6- Município de Manaus (Campus da Universidade Federal do Amazonas e Refinaria Isaac Sabá); 7- rio Aripuanã, Município de Novo Aripuanã; 8- rio Uatumã, Município de Presidente Figueiredo; 9- rio Jatapú, Município de São Sebastião do Uatumã ; Estado do Pará 10- rio Trombetas, Município de Oriximiná; 11- rio Tapajós, Municípios de Aveiro e Santarém; 12- rio Jari, Município de Almeirim; Estado de Rondônia: 13- Município de Porto Velho. Referências geográficas no apêndice I...... 13

Capítulo 1

Figura 1. Cariótipos em Giemsa (I), Banda C (II), RON e DNAr 18S (III) e cromossomos sexuais (caixas) de: a) Caluromys philander (SISTAP-M-244, caixas: CAN 34, SISTAP-M-305); b) Caluromys lanatus (CTGA-M-701); c) Marmosa demerarae (RNL 46, caixas: MCA 27); d) Marmosa murina (RNL 69, caixa: CEF 18); e) Marmosops pinheiroi (INPA 5377, caixa: EE 192) (SISTAP-M-278, caixa: EE107, INPA 5408); f) Metachirus nudicaudatus (SISTAP-M-302; caixa: SISSIS-M-64); g) Gracilinanaus emiliae (SISTAP-M-243). Os espécimes testemunho encontram-se na Coleção de Mamíferos do INPA; a sigla INPA se refere ao registro de tombamento na coleção e as demais ao registro de campo dos indivíduos analisados...... 29

Figura 2 Cariótipos em Giemsa (I), Banda C (II), RON e DNAr 18S (III) e cromossomos sexuais (caixas) de: a) Glironia venusta (BAC 80); b) Monodelphis cf. emiliae (INPA 5388); c) Monodelphis brevicaudata (INPA 5404); d) Monodelphis sp. (CAN 44); e) Didelphis marsupialis (EE 249, caixas: EE174). Os espécimes testemunho encontram-se na Coleção de Mamíferos do INPA; a sigla INPA se refere ao registro de tombamento na coleção e as demais ao registro de campo dos indivíduos analisados...... 30

Figura 3 Localização das formas do cromossomo X de Caluromys philander na América do Sul. Os pontos em asterisco são da literatura e os pontos cículo cheio são do presente trabalho: (*1) Venezuela, Reig et al. 1977; (●2) rio Purus; (●3) REMAN Manaus, presente trabalho e Souza et al. 2013; (●4) rio Trombetas; (●5) rio Tapajós; (*6) rio Jari, Souza et al. 2013; (*7) Pernambudo, Souza et al. 1990; (*8) São Paulo, Svartman e Vianna-Morgante 1999 e Pereira et al. 2008. m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; a = acrocêntrico; p = puntiforme...... 34

Figura 4 Localização das formas do cromossomo X de Marmosa murina na América do Sul. Os pontos em asterisco são dados da literatura (*1) Villa Vivêncio, Colômbia, Hayman e Martin 1974; (*2) Loreto-Peru, Reig et al. 1977; (*3) Bolívar, Venezuela, Reig et al. 1977. Os pontos em ● são dados do presente trabalho: (●4) rio Negro; (●5) rio Juruá; (●6) rio Purus; (●7) rio Uatumã; (●8) rio Trombetas; (●9) rio Jari; (*10) Tartarugalzinho, Pará, Carvalho et al. 2002; (*11) Pacoti, Ceará, Pagnozzi et al. 2002; (*12) Pernambuco, Souza et al. 1990; (*13) Vila Rica, Pagnozzi et al. 2002; (*14) Tocantins, Lima 2004; (*15) UHE Corumba IV, Luziania, GO, Pereira et al. 2008; (*16) UHE Peixe Angical, Goiás, Pereira et al. 2008; (*17) Mambai, Goiás, Carvalho et al. 2002; (*18) Espírito Santo, Paresque 2004...... 35

Capítulo 2

Figura 1 Locais de coleta: 1- rio Japurá; 2- rio Negro; 3- rio Purus; 4- Manaus; 5- rio Aripuanã; 6- rio Uatumã; 7- rio Jatapu; 8- rio Jari; 9- rio Trombetas; 10- Rio Tapajós; 11- Porto Velho...... 43

Figura 2 Cromossomos após hibridização de sequências teloméricas (à esquerda) e após tratamento de banda C (à direita) de: a) Caluromys philander (SISTAP-M-244, caixa: SISTAP-M-297, cromossomo Y SISTAP-M-305); b) Gracilinanus emiliae (SISTAP-M-344); c) Marmosops pinheiroi (SISTAP-M-237); d) Marmosa demerarae (MCA 65), e) Marmosa murina (CEF 18); f) Metachirus nudicaudatus (SISTAP-M-302); g) Glironia venusta (BAC 80); h) Monodelphis sp. nov. (CAN 44); i) Didelphis marsupialis (EE 206). Siglas se referem ao registro de campo dos indivíduos analisados. 46

Capítulo 3

Figura 1. Hibridização in situ fluorescente do LINE-1 nos cromossomos de espécies de didelfídeos: a) Caluromys philander; b) Marmosa demerarae; c) Gracilinanus emiliae; d) Marmosa murina; e) Didelphis marsupialis...... 52

Lista de tabelas

Introdução geral

Tabela 1: Classificações da família Didelphidae por diferentes autores, de 1888 a 2009 (Voss e Jansa 2009)...... 3

Tabela 2. Número de espécimes analisados por espécie e por localidade. Entre parênteses o número da localidade representada no mapa (Figura 2)...... 14

Tabela 2: Padrões de distribuição da heterocromatina do cromossomo X nas espécies do gênero Marmosops...... 36

Tabela 1 Espécies analisadas neste trabalhoe enfatizando aquelas que apresentaram variação intraespecífica no número de ITS...... 45

1. Introdução geral Os marsupiais constituem uma das três principais linhagens de mamíferos viventes e dentre estas, representam o segundo maior grupo em número de espécies. Taxonomicamente, as 280 espécies atuais pertencem a sete ordens: Didelphimorphia, Paucituberculata e Microbiotheria presentes principalmente na América do Sul, sendo que apenas Didelphimorphia pode ser encontrada nas Américas Central e do Norte. As demais ordens: Dasyuromorphia, Diprotodontia, Notoryctemorphia e Peramelemorphia encontradas predominantemente na Austrália, Nova Guiné e ilhas adjacentes (Aplin e Archer 1987; Wilson e Reeder 2005). Szalay (1982), com base na morfologia da articulação do tornozelo, propôs classificar as ordens de marsupiais em duas coortes, Australidelphia e Ameridelphia; porém, a condição monofilética desta última permanece controversa. Ameridelphia é representada pelas ordens: Didelphimorphia, Paucituberculata e Microbiotheria. Estudos filogenéticos e anatômicos indicam que esta última possui mais afinidades com marsupiais australianos que didelfídeos (Jansa e Voss 2000; Horovitz e Sánches-Villagra 2003; Nilsson et al. 2004; Nilsson et al. 2010).

1.1. Ordem Didelphimorphia, Família Didelphidae O fóssil metatério mais antigo conhecido é do início do Cretáceo na China. Metatérios do Cretáceo foram encontrados na Ásia, Europa e América do Norte (Bennett 2012). Das três ordens de marsupiais americanos, os didelfimorfos são considerados os mais basais dentro dos metatérios (Nilsson et al. 2010) e as espécies remanescentes descendem de linhagem antiga do fim do Cretáceo, a qual teria colonizado quase todos os continentes (Marshall et al. 1990; McKenna e Bell 1997). Atualmente, a distribuição geográfica dos didelfimorfos restringe-se às Américas, desde o Canadá até o sul da Argentina. Os didelfimorfos atuais representam formas derivadas dos mais antigos metatérios fósseis do Paleoceno, cuja linhagem divergiu dos demais metatérios cerca de 69 milhões de anos atrás (Simpson 1945; Szalay 1982; Reig et al. 1987; Horovitz e Sánchez-Villagra 2003; Nilsson et al. 2004). Esta ordem possui o maior número de espécies entre os marsupiais americanos, com 18 gêneros e 91 espécies, todas classificadas na família Didelphidae (Nowak 1991; Gardner 1993; Groves 1993; Costa 2005; Gardner 2007). Esses gêneros 1

foram organizados em diferentes subfamílias e tribos por diferentes autores (Tabela 1) e a proposta filogenética mais recente é a de Voss e Jansa (2009). Esses autores revisaram a história taxonômica da família mostrando avanços sobre a filogenia do grupo e propondo uma nova classificação (Tabela 1), tendo por base caracteres morfológicos, cariotípicos e moleculares. Voss e Jansa (2009) reconhecem quatro subfamílias em Didelphidae: Glironiinae e Hyladelphinae com apenas um gênero monotípico cada, Caluromyinae com dois gêneros e Didelphinae com os demais gêneros. A última subfamília ainda é subdivida em quatro tribos: Marmosini, Metachirini, Didelphini e Thylamyini (Tabela 1). As relações intergenéricas simplificadas nesse grupo são mostradas na Figura 1.

Tabela 1: Classificações da família Didelphidae por diferentes autores, de 1888 a 2009 (Voss e Jansa 2009).

Thomas (1888) Matschie (1916) Cabrera (1919) Simpson (1945) Cabrera (1958) Família Didelphidae Família Didelphidae Família Didelphidae Família Didelphidae Família Didelphidae Gênero Didelphis Gênero Didelphis Gênero Dromiciops Gênero Philander Gênero Caluromys Subgêneros Subgêneros Gênero Glironia Gênero Monodelphis Gênero Caluromysiops Didelphis Didelphis Gênero Philander Gênero Dromiciops Gênero Glironia Metachirus Metachirus Gênero Marmosa Gênero Glironia Gênero Dromiciops Philander Metachirops Subgêneros Gênero Notodelphis Gênero Monodelphis Micoureus Micoureus Marmosa Gênero Marmosa Subgêneros Peramys Peramys Thylamys Gênero Metachirops Monodelphis Gênero Chironectes Caluromys Gênero Peramys Gênero Metachirus Minuania Marmosa Gênero Minuania Gênero Luterolina Gênero Lestodelphis Grymaeomys Gênero Lutreolina Gênero Didelphis Gênero Marmosa Marmosops Gênero Metachirus Gênero Chironectes Subgêneros Thylamys Gênero Holothylax Marmosa Dromiciops Gênero Didelphis Thylamys Glironia Gênero Chironectes Gênero Philander Monodelphis Gênero Metachirus Monodelphiops Gênero Lutreolina Microdelphis Gênero Didelphis Gênero [Chironectes] Gênero Chironectes

Tabela 1: Classificações da família Didelphidae por diferentes autores, de 1888 a 2009 (Voss e Jansa 2009). (Continuação). †- Exemplares fósseis. Reig et al. (1985) Hershkovitz (1992) Kirsch e Palma (1995) Gardner (2008) Voss e Jansa (2009) Família Didelphidae Família Marmosidae Família Didelphidae Família Didelphidae Família Didelphidae Subfamília Didelphinae Subfamília Marmosinae Subfamília Didelphinae Subfamília Caluromyinae Subfamília Glironiinae Tribo Didelphini Gênero Gracilinanus Tribo Didelphini Gênero Caluromys Gênero Glironia Gênero Chironectes Gênero Marmosops Gênero Didelphis Gênero Caluromysiops Subfamília Caluromyinae Gênero Didelphis Gênero Micoureus Gênero Philander Gênero Glironia Gênero Caluromys Gênero Lutreolina Subfamília Thylamyinae Gênero Lutreolina Subfamília Didelphinae Gênero Caluromysiops Gênero Philander Gênero Thylamys Gênero Chironectes Tribo Didelphini Subfamília Hyladelphinae Tribo Marmosini Subfamília Lestodelphynae Tribo Metachirini Gênero Didelphis Gênero Hyldelphys Gênero Lestodelphis Gênero Lestodelphis Gênero Metachirus Gênero Philander Subfamília Didelphinae Gênero Marmosa Subfamília Metachirinae Subfamília Thylamyinae Gênero Lutreolina Tribo Marmosini Gênero Micoureus Gênero Metachirus Tribo Thylamyini Gênero Chironectes Gênero Marmosa Gênero Mondelphis Subfamília Monodelphinae Gênero Thylamys Tribo Metachirini Gênero Tlacuatzin Gênero Thylamys Gênero Monodelphis Gênero Lestodelphis Gênero Metachirus Gênero Monodelphis Tribo Metachirini Família Caluromyidae Tribo Marmosopsini Tribo Monodelphini Gênero Thylatheridium† Gênero Metachirus Subfamília Caluromyinae Gênero Marmosops Gênero Chacodelphis Tribo Metachirini Subfamília Caluromyinae Gênero Caluromys Gênero Gracilinanus Gênero Cryptonanus Gênero Metachirus Gênero Caluromys Subfamília Caluromysiopsiinae Gênero Marmosinae Gênero Gracilinanus Tribo Didelphini Gênero Glironia Gênero Caluromysiops Tribo Marmosini Gênero Hyladephys Gênero Didelphis Gênero Caluromysiops Família Glironiidae Gênero Marmosa Gênero Lestodelphys Gênero Chironectes Gênero Glironia Gênero Micoureus Gênero Marmosa Gênero Lutreolina Família Didelphidae Tribo Monodelphini Gênero Marmosops Gênero Philander Gênero Philander Gênero Monodelphis Gênero Micoureus Gênero Thylophorops† Gênero Didelphis Família Caluromyidae Gênero Monodelphis Tribo Thylamyini Gênero Chironectes Subfamília Caluromyinae Gênero Thylamys Gênero Chacodelphis Gênero Lutreolina Gênero Caluromys Gênero Criptonanus Gênero Caluromysiops Gênero Gracilinanus Subfamília Glironiinae Gênero Lestodelphis Gênero Glironia Gênero Marmosops Gênero Thylamys 4

1.2. Citogenética clássica em marsupiais Apesar de uma grande diversidade morfológica e da grande divergência entre grupos, os metatérios exibem características citogenéticas compartilhadas por todas as ordens: (1) baixos números diploides, com variação de 10 a 32 cromossomos; (2) grandes cromossomos (Hayman 1990); (3) alto grau de conservação, principalmente na eucromatina (Svartman e Vianna-Morgante 1999) e (4) ausência de região de homologia entre cromossomos sexuais, e consequente modificação do comportamento

destes cromossomos durante a meiose (Solari e Bianchi 1975; Sharp 1982; Seluja et al. 1987; Graves e Watson 1991). A família Didelphidae se enquadra nesses padrões, exibindo apenas três números diploides (14, 18 e 22). Desses, o número diploide mais frequente é o 2n=14, encontrado em 15 espécies, seguido pelo 2n=18, encontrado em Monodelphis e Glironia e o 2n=22, encontrado em oito espécies da tribo Didelphini e no gênero Tlacuatzin. A origem desses cariótipos tem sido discutida na literatura e técnicas cada vez mais sofisticadas têm proporcionado novos caminhos para essa discussão. Reig et al. (1977) observaram cromossomos em coloração convencional de 14 espécies e propuseram três hipóteses alternativas para a evolução cariotípica de didelfídeos: 1) aumento do número diploide por fissões cêntricas, tendo como partida 2n=14 cromossomos; 2) redução e aumento dos números diploides, com fusões e fissões cêntricas, partindo do 2n=18, e 3) redução do número diploide por fusões cêntricas a partir do 2n=22. Dentro dessas hipóteses, ainda há discordância sobre quais eventos foram responsáveis pela evolução desses cariótipos. Inicialmente, Reig et al. (1977) descartaram a hipótese da ancestralidade em 2n=18 e 22 cromossomos, com base na hipótese da ortosseleção de White (1973), na prevalência do 2n=14 em espécies australianas e americanas e também no alto grau de derivação das espécies com 2n=22. Rofe e Hayman (1985) corroboraram a ancestralidade do 2n=14 ao observar homeologias apresentadas pelos cromossomos na banda G. De forma contrária, os segmentos de heterocromatina aparentam ser espécie-específicos (Svartman e Vianna-Morgante 1999). Na impregnação com nitrato de prata, as regiões organizadoras de nucléolo (RON) mostraram distribuição variável nos três números diploides: em espécies com 2n=14 as RON foram observadas de uma a quatro marcações em autossomos; nas espécies com 2n=18, foram observadas marcações em um par autossômico e, eventualmente, no X e em espécies com 2n=22, a quantidade de RONs ativas foi variável intraindividualmente, porém essa variação foi de no mínimo quatro marcações e no máximo oito (Svartman e Vianna-Morgante 2003; Svartman 2009 e referências inclusas).

A sobreposição dos números diploides na filogenia de Voss e Jansa (2009) não permitiu detectar um padrão de evolução cromossômica linear (2n=14 para 2n=18 e para 2n=22 ou o inverso), conforme a figura 1. Porém, Fantin e da Silva (2011) mostraram que número diploide igual a 18 é compartilhado por dois gêneros didelfídeos: Monodelphis e Glironia. Glironia localiza-se na base da filogenia da família Didelphidae e isso pode ser uma evidência adicional à ancestralidade de um número diploide maior que 14, porém não podemos descartar origens independentes.

1.2.1 Citogenética molecular em marsupiais A combinação de métodos de citogenética e biologia molecular possibilitou localizar fisicamente sequências de DNA nos cromossomos, realizando inferências sobre a organização do genoma (Guerra 1988; 2004). Variações desses métodos permitem identificar sequências de cópia única, sequências moderada ou altamente repetitivas, verificar similaridade entre genomas e mapeamento (Singer 1982). Exemplifica-se a pintura cromossômica em marsupiais australianos, que identificou de forma precisa rearranjos cromossômicos, possibilitando inferir sobre um modelo de cariótipo ancestral (Rens et al. 1999; O’Neill et al. 1999; De Leo et al. 1999; Rens et al. 2003). Além disso, a hibridização in situ fluorescente (FISH) corroborou os resultados obtidos com banda G e permitiu realizar novas discussões sobre rearranjos cromossômicos. A estabilidade cariotípica de marsupiais tem sido amplamente discutida e pela citogenética clássica é possível observar uniformidade dos números diploides e extensiva homeologia das bandas G. A pintura cromossômica e hibridização de genomas (GISH) também mostram grande similaridade desses genomas. Nesse âmbito a principal fonte de variabilidade cariotípica tem sido atribuída aos rearranjos Robertsonianos e diferenças na heterocromatina, a qual mostra padrão espécie- específico. Todder et al. (1997) analisaram a relação entre os cariótipos de Macropus eugenii e Wallabia bicolor e encontraram sequências do cromossomo Y de uma espécie com sistema de determinação sexual simples em cromossomos XY1Y2 da outra espécie com cromossomos sexuais múltiplos. Concluíram que os eventos 7

envolvidos no surgimento do sistema sexual múltiplo em uma das espécies eram um pouco mais complexos do que o revelado pela banda G. Pintura cromossômica no complexo Petrogale (Marsupialia; Macropodidae) mostrou que sondas podem revelar padrões heterogêneos de hibridização ao longo de um cromossomo, sendo que em porções distais exibiram sinais mais intensos, enquanto nas porções proximais essa intensidade foi menor. Essa heterogeneidade foi atribuída à divergência da heterocromatina centromérica e sequências repetitivas dispersas na eucromatina, por amplificação diferencial de sequências contidas nessas regiões (O’Neill et al. 1999). Esse padrão de conservação da eucromatina e especificidade de sequências relacionadas à heterocromatina pericentromérica também foi demonstrado em marsupiais da família Didelphidae, com a técnica de hibridização genômica cruzada (Svartman e Vianna-Morgante 1999). Outros elementos importantes do genoma são as sequências de DNA repetitivo, que podem pertencer a diferentes classes e algumas têm suas funções e origens já conhecidas, por exemplo: sequências teloméricas, unidades de DNA ribossomal e elementos transponíveis (Brasileiro-Vidal e Guerra 2002). Essas sequências representam um componente interessante do DNA, uma vez que há escassez de dados relacionados a eles e também pelo papel incerto que desempenham na organização genômica (Elder e Turner 1995). Em didelfídeos a AgRON e o mapeamento dos sítios ribossomais 18S mostraram que a quantidade de sítios ribossomais pode variar entre as espécies, mas pelo menos um desses pares cromossômicos é homeólogo em todas as espécies. Isso indica que a conservação dos cariótipos de marsupiais também se estende a algumas sequências de DNA repetitivo (Svartman e Vianna-Morgante 2003). As sequências teloméricas desempenham função de proteção das extremidades coesivas dos cromossomos, impedindo que elas interajam umas com as outras. Além disso, elas são consideradas sequências extremamente conservadas em todos os vertebrados (McClintock 1941; Blackburn 1991). Em marsupiais, sondas dessas sequências foram utilizadas para mostrar eventos de fusões cromossômicas, fornecendo novos dados para a discussão da evolução cariotípica do grupo. Em

espécies da família Didelphidae foram encontradas sequências teloméricas intersticiais (ITS) nos cariótipos com 2n=14 e 18, significando que estes cariótipos teriam originado por fusão a partir de um 2n=22 (Svartman e Vianna-Morgante 1998; Carvalho e Mattevi 2000). Pagnozzi et al. (2000; 2002) sugeriram que as ITS encontradas em didelfídeos brasileiros podiam ser um componente da heterocromatina, ao invés de resultado de fusões recentes. Metcalfe et al. (2004) observaram que nem todas as ITS de Macropodidae podem ser aceitas como evidências de fusões, salvo quando não forem os maiores constituintes da heterocromatina. Porém, Svartman (2009) argumenta que o estado de condensação dos cromossomos pode tornar a localização das sequências teloméricas pouco precisa por aproximar essas marcações à região de heterocromatina pericentromérica. Elementos transponíveis são reconhecidos como parte de repetições dispersas pelo genoma. Eles podem pertencer a duas classes que se diferenciam pela forma de transposição. Na classe I, temos os retrotransposons que são elementos que utilizam um intermediário de RNA para se movimentar para novos pontos, onde serão inseridos. Ainda dentro dessa classe, temos elementos com repetições terminais curtas (SINE - short interspersed elements) e elementos com longas repetições terminais (LINE – long interspersed elements). Os elementos da classe II são caracterizados por se movimentarem com auxílio de uma enzima denominada transposase, o que elimina a necessidade de um intermediário de RNA (Capy et al. 1998; Almeida e Carareto 2005). O elemento LINE-1, da superfamília dos LINEs, tem sido considerado como grande parte do genoma de mamíferos e frequentemente está relacionado com desordens genéticas (duplicação, deleção e instabilidade cromossômica por recombinação heteróloga), regulação da expressão gênica, inativação do X nas fêmeas (Ostertag et al. 2001; Kazazian e Goodier 2002) e tem sido utilizado em estudos evolutivos. Waters et al. (2007) observaram que, em mamíferos, os padrões de divergência entre os elementos LINE-1 são específicos de cada linhagem. Porém, o envolvimento desses elementos em alterações cromossômicas pode ser indireto, mas ainda assim o acúmulo desses elementos pode ser associado com os padrões de

especiação de algumas linhagens (Dogbiny et al. 2004; Waters et al. 2004). Em marsupiais, a distribuição desses elementos ainda foi pouco explorada, com exceção do sequenciamento de LINE-1 em Didelphis virginiana (Dönner e Paböo 1995). Em relação aos elementos repetitivos foi demonstrado que eles podem corroborar padrões de especiação e estarem relacionados à plasticidade cariotípica. Nesse campo, existem poucos estudos em marsupiais, contrastando com a realidade das linhagens eutérias. Considerando que marsupiais e mamíferos placentários são grupos irmãos, aqueles podem fornecer uma base de comparação como grupo externo para o estudo dos padrões de distribuição e divergência das sequências repetitivas em mamíferos placentários. Dessa forma o presente trabalho buscou obter padrões de distribuição de sequências repetitivas dispersas e in tandem para espécies de marsupiais amazônicos.

1.3 . Objetivo geral

Mapear fisicamente, em cromossomos metafásicos, regiões de sequências repetitivas in tandem e dispersas em espécies de marsupiais amazônicos, representantes dos gêneros: Caluromys, Didelphis, Glironia, Gracilinanus, Marmosa, Marmosops, Metachirus e Monodelphis a fim de ampliar o entendimento da organização genômica nestas espécies e buscar padrões evolutivos em marsupiais didelfídeos.

1.4.1, Específicos 1- Comparar padrões de bandeamento cromossômico com sequências mapeadas de espécies representantes dos gêneros de marsupiais dos gêneros prospostos. 2- Identificar padrões intraespecíficos em espécies coletadas em diferentes localidades em busca de variabilidade em espécies representantes dos gêneros de marsupiais dos gêneros propostos. 3- Comparar os padrões obtidos, na tentativa de relacioná-los aos eventos de diversificação cromossômica nas espécies representantes dos gêneros propostos 4- Determinar a localização física de elementos do tipo LINE nos cariótipos e verificar sua divergência entre as espécies escolhidas no presente estudo.

2. Material e Métodos 2.1. Material e locais de coleta Neste estudo foram analisados 194 indivíduos de 16 espécies, representantes de oito gêneros de marsupiais, coletadas em 13 localidades da Amazônia (Figura 2, Tabela 2, Apêndice I). Os espécimes foram coletados sob autorizações do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - IBAMA, de acordo com as licenças de número: 02005.000642/03-11 (IBAMA); 02000.002336/2003-93 (IBAMA); 02005.002672/04 (IBAMA); 37585-5 (SISBIO); 37592-4 (SISBIO). Os indivíduos analisados estão depositados na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA (apêndice II). No presente trabalho foram utilizadas armadilhas “live-traps” dos tipos “tomahawk” (14x14x40cm) e “sherman” (8x8x23cm). As armadilhas foram dispostas aos pares (uma “tomahawk” e uma “sherman”) em 40 estações espaçadas por uma distância de cerca de 30 metros. A disposição das armadilhas, em cada estação, foi feita obedecendo ao seguinte critério: em estações ímpares, as “shermans” foram instaladas no sub-bosque em árvores ou cipós que faziam alguma ligação com o dossel, enquanto as “tomahawks” foram instaladas no chão em frente a tocas ou troncos caídos. Em estações pares foi feito o inverso.

Em cada localidade, as armadilhas permaneceram ativadas por um período de 10 noites e foram vistoriadas a cada dia, no período matutino. As iscas foram compostas por fatias de banana com pasta de amendoim torrado e moído, que foram substituídas a cada dois dias ou de acordo com a necessidade.

Cada espécime coletado teve seus dados de idade, sexo, estágio reprodutivo, peso, medidas, localidade, ambiente e condições climáticas anotados em caderno de campo padronizado pela curadoria da Coleção de Mamíferos do INPA e foram depositados nesta coleção, onde foram identificados pela Dra. Maria Nazareth Ferreira da Silva, curadora da Coleção de Mamíferos do INPA. Os espécimes tiveram a pele, crânio, esqueleto, suspensão celular preparados e seus tecidos coletados. Os indivíduos cujas peles não foram taxidermizadas foram fixados em formol 10% e depois preservados em álcool etílico 70%. 12

Tabela 2. Número de espécimes analisados por espécie e por localidade. Entre parênteses o número da localidade representada no mapa (Figura 2). Número de indivíduos Espécie Local/ Pontos no mapa Machos Fêmeas Total Glironia venusta Porto Velho, RO (13) 1 1 rio Aripuanã, AM (7) 1 1 rio Tapajós, PA (11) 1 1 2 Caluromys philander rio Purus, AM (4) 1 1 Manaus, AM (6) 1 1 Caluromys lanatus rio Japurá, AM (1) 1 1 rio Aripuanã, AM (7) 1 1 rio Jari (12) 1 1 rio Uatumã (8) 5 3 8 Marmosa murina rio Trombetas (10) 1 1 rio Negro (3) 1 1 2 rio Purus (4) 2 2 rio Aripuanã (7) 4 4 8 Manaus, AM (6) 7 11 18 rio Cuieiras (5) 4 2 6 rio Purus (4) 3 4 7 rio Negro (3) 1 5 6 Marmosa demerarae rio Tapajós (11) 3 5 8 rio Trombetas (10) 9 5 14 rio Jari (12) 9 2 11 rio Juruá (2) 1 1 rio Jatapú (9) 1 1 Monodelphis brevicaudata rio Jari, PA (12) 3 3 Monodelphis sp. rio Purus, AM (4) 1 1 Monodelphis cf. emiliae Rio Aripuanã, AM (7) 2 1 3 rio Aripuanã, AM (7) 5 6 11 Marmosops bishop rio Purus, AM (4) 2 1 3 rio Negro, AM (3) 1 1 Marmosops pinheiroi rio Tapajós, PA (11) 4 2 6 rio Trombetas, PA (10) 8 1 9 rio Cuieiras, AM (5) 3 2 5 Marmosops parvidens rio Jari, PA (12) 2 2 rio Jatapú, AM (9) 4 3 7 Marmosops impavidus rio Juruá, AM (2) 2 1 3 Marmosops cf. pakaraimae rio Japurá, AM (1) 1 1 Gracilinanus emiliae rio Tapajós, PA (11) 3 1 4 rio Trombetas, PA (10) 1 1 rio Jari, PA (12) 1 1 Metachirus nudicaudatus rio Cuieiras, AM (5) 1 1 rio Juruá, AM (2) 1 1 rio Tapajós, PA (11) 2 2 4 rio Tapajós, PA (11) 1 3 4 rio Trombetas, PA (10) 1 2 3 Didelphis marsupialis Manaus, AM (6) 8 4 12 rio Uatumã, AM (9) 1 1 2 rio Cuieiras, AM (5) 2 2 4 Total 105 89 194

2.2 Métodos Citogenéticos

2.2.1 Obtenção de cromossomos mitóticos Os cromossomos foram obtidos pelo método in vivo segundo Ford e Harmerton (1956), utilizando-se colchicina diluída a 0,0125% em uma proporção de 1 mL para cada 100 gramas de peso animal. Esta solução foi injetada intraperitonealmente no animal vivo, que foi colocado em descanso, por um período de 30 minutos. Após esse tempo, o animal foi eutanaziado utilizando-se inalação de dosagem elevada de anestésico inalante (halotano). Em seguida, os fêmures foram removidos e suas epífises foram cortadas para a obtenção da medula óssea. A medula foi lavada do interior da diáfise femoral, com o auxílio de uma seringa de 10mL contendo solução hipotônica de cloreto de potássio 0,075M, para uma placa de Petri até a remoção total desse material. O material foi homogeneizado e colocado em banho-maria por 30 minutos para efetuar a hipotonização das células. A solução foi transferida para um tubo Falcon de 15mL e foi adicionado oito a 10 gotas de fixador Carnoy (metanol-ácido acético: 3:1) e novamente foi homogeneizado. Essa solução foi centrifugada, o sobrenadante desprezado e novamente foi ressuspendida em fixador. Esses passos foram repetidos duas vezes. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionou-se fixador na proporção de 2:1 em relação à quantidade de sedimento e homogeneizado. Por fim o material foi transferido para um tubo tipo Eppendorf devidamente identificado com o número do espécime e foi guardado em freezer (-10 °C) até a preparação das lâminas. No laboratório, as lâminas foram preparadas, pingando-se duas a três gotas da suspensão celular em uma lâmina de vidro limpa (aquecida em água destilada até 60 °C), a uma altura de 30-40cm e seca à temperatura ambiente; foram coradas com solução de Giemsa, diluída a 5% em tampão fosfato pH 6,8, por 10 minutos. Posteriormente foram lavadas e secas novamente ao ar.

2.2.2. Bandeamentos Cromossômicos

2.2.2.1. Bandeamento C segundo Sumner (1972) A localização das regiões de heterocromatina foi feita utilizando a técnica de banda C. Inicialmente a lâmina foi tratada com HCl 0,2N em temperatura ambiente, por 30 minutos; em seguida as lâminas foram lavadas com água destilada e secas ao ar. As lâminas foram incubadas em solução de hidróxido de bário octahidratado (Ba(OH)2.8H2O) a 5%, recém preparada e filtrada, por um período de cinco segundos a um minuto em uma temperatura de 42 °C. O tempo de tratamento com hidróxido de bário foi determinado para cada espécie. Após esse tratamento, as lâminas foram lavadas rapidamente em solução de HCl 0,2 N a 42 °C e posteriormente foram lavadas, várias vezes, em água destilada e novamente secas ao ar. Em seguida foram incubadas em solução 2XSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,06M em pH 6,8) a 60 °C, por 15 minutos. As lâminas foram lavadas e secas ao ar. Por fim foram coradas em Giemsa diluído a 2% em tampão fosfato pH 6,8, durante 20-30 minutos ou com Giemsa 5% por 5 a 10 minutos.

2.2.2.2. Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON) segundo Howell e Black (1980) Para a localização das regiões organizadoras de nucléolos ativas foi utilizada a técnica de precipitação de cristais de prata (AgRON), com pequenas modificações que consiste em: pingar sobre a lâmina com a suspensão celular, uma gota de solução aquosa de gelatina a 2% acrescida de ácido fórmico na proporção de 1mL/100mL de solução. Adicionar sobre a gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de nitrato de prata (AgNO3) a 50%, agitando levemente a lâmina e cobrindo com lamínula; colocar a lâmina em câmara úmida e levar ao banho-maria ou estufa à 60 °C, por um período de dois a quatro minutos, ou até a lâmina apresentar uma coloração marrom- dourada; lavar as lâminas em água destilada, permitindo que a lamínula e o excesso de soluções sejam removidos e secar ao ar. As lâminas foram coradas com solução de Giemsa diluído a 2% em tampão fosfato pH 6,8, por 20-30 segundos, lavadas e secas ao ar. 16

2.3.1 Análise cariotípica Os cromossomos foram analisados em microscópio de luz com objetiva de imersão. Foram contadas pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo, com o intuito de estabelecer o valor modal (2n) e o número fundamental (número de braços) de cada espécime. As melhores metáfases foram editadas no programa Adobe Photoshop CS4. As médias do comprimento total dos cromossomos e da razão entre os braços cromossômicos (q/p) foram calculadas com auxílio do programa livre Image J. O cariótipo foi montado emparelhando-se os cromossomos com base na razão entre os braços cromossômicos e na posição do centrômero, segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos mitóticos foram classificados em metacêntricos (RB=1,0-1,69), submetacêntricos (RB=1,7-2,99), subtelocêntricos (RB=3,00-7,0) e acrocêntricos (RB>7,00). Na determinação do número de braços (NF) foram considerados os autossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como tendo dois braços e os acrocêntricos como tendo apenas um braço. Os cromossomos sexuais não foram considerados.

2.3.2. Citogenética molecular

2.3.2.1. Extração de DNA Para a extração do DNA foi utilizado tecido muscular de espécimes de cada espécie, seguindo o protocolo de extração descrito por Sambrook e Russell (2001), com algumas modificações. O tampão de lise utilizado foi (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente acrescentou-se: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para a digestão do tecido. Em seguida lavagens sucessivas foram feitas com fenol, fenol-clorofórmio, álcool isoamílico e clorofórmio hidratado (500μL de cada um destes reagentes). Após a lise, o DNA foi

separado das proteínas por precipitação salina juntamente com centrifugação a 14.000 rpm. O sobrenadante foi precipitado com auxílio de 600 μL de isopropanol 100%, e por centrifugação. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo do tamanho do pellet (DNA precipitado) formado. Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído foi quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato- EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com GelRed. A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency).

2.3.2.2. Detecção de sequências de DNA repetitivo em tandem Obtenção das sondas de DNAr 18S Para a localização das sequências de DNAr foi utilizada uma sonda para DNAr 18S obtida via PCR a partir do DNA nuclear do marsupial Caluromys philander, usando os iniciadores 18SF (5’-CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’) e 18SR (5’-CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010).

Obtenção das sondas teloméricas (TTAGGG)n

A sonda para detecção de sítios teloméricos foi obtida pela amplificação em até

1400 pares de base dos iniciadores (TTAGGG)n e (CCCTAA)n pela reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction PCR) segundo Saiki et al. (1988) como descrito por Ijdo et al.(1991).

Obtenção das sondas de DNAs repetitivos dispersos Foi utilizado o iniciador (L1R, 5′-ATTCTRTTCCATTGGTCTA-3′; L1F, 5′- CCATGCTCATSGATTGG-3′) para amplificar o retroelemento LINE-1, conforme descrito por Waters et al. (2004). Reações de PCR (Polimerase Chain Reaction) As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 25 μL consistindo

de 1μl de DNA genômico (100 ng), 2,5μL de tampão 10X com cloreto de magnésio (2mM), 0,25μl de DNA Taq Polimerase (5 U/μL), 1,5μL de dNTP (1mM), 1,5μL de cada iniciador (5mM) e água milli-Q para completar o volume. Os parâmetros das reações de PCR seguiram: (a) para o DNAr 18S: 2 minutos a 95 °C (desnaturação); 35 ciclos por 1 minuto a 95 °C, 30 segundos a 55 °C (anelamento) e 1 minuto e 40 segundos a 72 °C (extensão); 7 minutos a 72 °C (extensão final); (b) Sonda Telomérica: primeiros 10 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 30 segundos a 55 °C e 1 minuto a 72 °C, seguidos por 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 30 segundos a 60 °C e 1,5 minuto a 72 °C e um passo final de 5 minutos a 72 °C; (c) para o retroelemento L1: 2 minutos a 95 °C (desnaturação); 35 ciclos por 1 minuto a 95 °C, 1 minuto a 52 °C (anelamento) e 1 minuto e 40 segundos a 72 °C (extensão); 7 minutos a 72 °C (extensão final).

Hibridização in situ fluorescente Os produtos de PCR foram marcados com biotina-14-dATP (Biotin Nick Translation mix; Invitrogen) e digoxigenina-11-dUTP (DigNick Translation mix; Roche) por meio da reação de nick translation. O procedimento de hibridização foi conduzido com base nos protocolos descritos por Pinkel et al. (1986) com 77% de estringência. O DNA dos cromossomos mitóticos foi desnaturado em formamida 70% diluída em 2XSSC (Cloreto de Sódio 17,53g (0,29 M), 8,82g de Citrato de Sódio e água destilada para um volume final de 1000mL, pH 7,0) a 67 °C por 10 segundos. A solução de hibridização (100ng da sonda desnaturada, 10mg/mL de dextran-sulfato (2XSSC) e 50% de formamida em um volume final de 30 μL foi adicionada em uma lâmina e hibridizada a 37 °C por uma ou duas noites, dependendo da sonda utilizada (uma noite para telômeros e 2 para 18S e L1) em câmara úmida (2XSSC). As lâminas foram lavadas após a hibridização em 2X SSC 72 °C, pH 7,0 por 5 minutos. Após essa lavagem, as lâminas foram imersas em tampão PBD para o bloqueio (20mL de 20X SSC, 1mL de Triton 100, 1g de leite em pó desnatado e água destilada para um volume de 100mL, pH7,0). Para detecção da sonda foram utilizados os anticorpos FITC- Avidina conjugada (Sigma; www.sigmaaldrich.com) em tampão C (0,1 M Bicarbonato de Sódio) e anti-digoxigenina rodamina (Roche). As lâminas foram lavadas três vezes

em detergente-tampão fosfato (PBD) a 45 °C por 2 minutos. Duas séries de amplificação foram realizadas, utilizando biotina-anti-avidina em tampão PBD (2 μL de anti-avidina em 38 μL de tampão PBD), nas quais as lâminas foram incubadas por 5 minutos em câmara úmida a 37 °C. Cada tratamento com biotina-anti-avidina conjugada em tampão PBD (2 μL de anti-avidina em 38 μL de PBD), na qual as lâminas foram incubadas por 5 minutos em câmara úmida a 37 °C. Cada tratamento com biotina-anti-avidina foi seguido pela incubação com isotiocianeto fluorescente a 0,07% (FITC)- avidina em tampão C por 8 minutos em câmara úmida a 37 °C. Seguida de cada amplificação, as lâminas foram lavadas três vezes em PBD a 45 °C por 2 minutos. Os cromossomos foram contra-corados com DAPI (2ug/mL) diluído em antifade (Vector; www.vectorlabs.com). As metáfases foram analisadas em microscópio de epifluorescência Olympus BX51, capturadas com câmera digital (Olympus DP71) através do software Image-Pro MC 6.3 e processadas no programa Adobe Photoshop CS3.

3. Resultados e Discussão

Os resultados obtidos com a análise cromossômica comparativa de marsupiais amazônicos e a discussão desses dados são apresentados na forma de três capítulos, conforme mencionado a seguir:

3.1. Capítulo 1 – Caracterização citogenética de marsupiais didelfídeos na Amazônia brasileira: uma abordagem clássica sobre o cromossomo X e heterocromatina, num contexto geográfico.

3.2. Capítulo 2 – Comparação cromossômica entre heterocromatina e sequências teloméricas em espécies de marsupiais didelfídeos (Didelphimorphia)

3.3. Capítulo 3 – Mapeamento do elemento LINE-1 em espécies de marsupiais amazônicos (Didelphidae; Didelphimorphia).

Capítulo 1: Caracterização citogenética de marsupiais amazônicos (Didelphidae; Didelphimorphia): uma abordagem clássica sobre o cromossomo X e heterocromatina, num contexto geográfico.

Resumo: Foram caracterizadas citogeneticamente 16 espécies de marsupiais amazônicos, variações no cromossomo X, na distribuição da heterocromatina e no mapeamento de sequências de DNA ribossomal 18S. Os cariótipos de 194 indivíduos de 13 localidades da Amazônia brasileira, foram analisados empregando-se métodos de coloração convencional, banda C, Ag-RON e FISH com sonda de DNAr18S. A principal variação foi registrada na posição do centrômero do cromossomo X de Caluromys philander e de Marmosa murina. Geograficamente, os diferentes tipos de cromossomo X, de ambas espécies, mostraram uma segregação entre leste e oeste do Brasil, com contato na Amazônia central. Para as espécies de Marmosops spp. dois padrões de X foram evidenciados pela técnica da banda C, porém com distribuição geográfica mais uniforme. As regiões organizadoras de nucléolo mostraram especificidade com a sonda de DNAr 18S em todas as espécies, exceto a marcação do cromossomo Y de Monodelphis brevicaudata. A distribuição desse marcador se mostrou variável apenas no gênero Marmosa (M. murina e M. demerarae). Considerando RON simples como um caráter plesiomórfico, concluímos que as espécies do gênero Marmosa e Didelphis marsupialis evoluíram independentemente para o sistema múltiplo. Marsupiais são considerados cromossomicamente conservativos; porém, dado o atual estado de conhecimento citogenético para esse grupo, variações cromossômicas intra e interespecíficas foram observadas. Isto se deve à ampliação da amostra junto a aplicação dos métodos cromossômicos de bandeamento e molecular, o que sugere a presença de rearranjos cromossômicos na evolução de marsupiais.

Introdução

Historicamente, os primeiros dados citogenéticos de marsupiais provém do trabalho de Jordan (1911) apud Reig et al. (1977) sobre a espermatogênese de Didelphis virginiana. Desde então, dados citogenéticos de espécies de marsupiais australianos e americanos têm sido ampliados e atualmente são conhecidos os cariótipos de aproximadamente 180 espécies (Hayman 1990). Citogeneticamente, marsupiais mostram pouca variação quando comparados às outras ordens de mamíferos, como por exemplo, Rodentia e Chiroptera (Baker 1967; Baker e Bickham 1980; Moratelle e Morielle-Versute 2007; Nagamachi et al. 2015 e referências). Extensas comparações de marcadores citogenéticos (banda-G, -C e região organizadora do nucléolo) entre espécies americanas e australianas revelam que a estabilidade cromossômica é verificada desde número diploide até padrões de bandeamento longitudinal (Yonenaga-Yassuda et al. 1982; Rofe e Hayman 1985; Casartelli et al. 1986; Souza et al. 1990; Svartman e Vianna- Morgante 1999). Três principais números diploides estão presentes entre espécies de ambos os continentes: 14, 18 e 22 numa amplitude de 10 a 32 cromossomos. Dentre todas as famílias, Macropodidae (ordem Diprotodontia) é a que possui maior diversidade de cariótipos, variando de 2n=10 a 32, enquanto que a família Didelphidae (ordem Didelphimorphia) mostra apenas os três números diploides predominantes (14, 18 e 22); dentre esses, o 2n=14 é o mais frequente tanto nesta família como nos demais marsupiais (Reig et al. 1977; Hayman 1990, Palma e Yates 1996; Carvalho et al. 2002). Este número diploide vem sendo sugerido como ancestral para os marsupiais (Reig et al. 1977; O’Neill et al. 1997), embora a ancestralidade desse grupo ainda seja motivo de discussão (Svartman e Vianna-Morgante 1998; Carvalho e Mattevi 2000). No bioma amazônico, a grande abrangência territorial, aliada à carência de boas amostragens, torna o conhecimento da fauna de mamíferos incipiente (Ab’Saber 1977; Voss e Emmons 1996; INPE 1999). Especificamente para as 27 espécies amazônicas de marsupiais (Paglia et al. 2012), dados citogenéticos estão disponíveis apenas para 17 (Brandão et al. 2015;

Nagamachi et al. 2015). A representatividade desses dados está sujeita às mudanças taxonômicas indicadas por estudos mais recentes, envolvendo dados filogenéticos, dificultando o reconhecimento do avanço no conhecimento citogenético, uma vez que frequentemente falta conexão entre os dados do espécime, identificação da espécie e o cariótipo. Nesse âmbito, alguns fatores limitam o conhecimento do grupo, como o número de espécies analisadas e a restrição frequente das análises citogenéticas apenas aos números diploide e fundamental (Nagamachi et al. 2015). Ainda nesse contexto, as principais discussões têm centrado na estrutura dos autossomos, enquanto que os cromossomos sexuais têm sido estudados mais em relação ao comportamento em núcleos meióticos (Solari e Bianchi 1975; Sharp 1982; Seluja et al. 1987; Graves e Watson 1991). Neste trabalho discutimos as principais diferenças morfológicas encontradas nos cromossomos sexuais e nos padrões de banda C de 16 espécies de didelfídeos coletadas na Amazônia e. Ainda, discutimos esses padrões em um contexto geográfico amplo.

Material e Métodos Neste estudo foram analisadas 194 indivíduos de 16 espécies, pertencentes a oito gêneros de marsupiais, coletadas em 13 localidades da Amazônia brasileira (Tabela 1, Apêndice I). Os espécimes foram coletados sob autorizações do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - IBAMA, de acordo com os números de licença: 02005.000642/03- 11 (IBAMA); 02000.002336/2003-93 (IBAMA); 02005.002672/04 (IBAMA); 37585-5 (SISBIO); 37592-4 (SISBIO). Os indivíduos foram depositados na Coleção de mamíferos do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) (Apêndice II). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da medula óssea, segundo Ford e Harmerton (1956). Os padrões de banda-C e da região organizadora de nucléolo foram determinados segundo as técnicas descritas por Sumner (1972) e Howell e Black (1980), respectivamente. Os cariótipos foram organizados, emparelhando os cromossomos com base na razão de

braços cromossômicos e na posição do centrômero, segundo Levan et al. (1964). A localização da sequência dos cístrons ribossomais foi determinada por meio da hibridização in situ fluorescente (Pinkel et al. 1986) utilizando a sonda DNAr 18S, obtida via PCR a partir do DNA nuclear do marsupial Caluromys philander, usando os iniciadores 18SF (5’-CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT- 3’) e 18SR (5’-CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010) e a conforme descrito em.

Resultados Dentre as 16 espécies analisadas, 11 apresentaram 2n=14, quatro 2n=18 e uma 2n=22 cromossomos (Tabela 1). Entre as espécies com 2n=14, observou-se uma variação no número fundamental de braços (NF), ocasionando mudanças nas fórmulas cromossômicas (Tabela 1), sendo NF=20 em Marmosa demerarae (Fig. 1c-I) e Metachirus nudicaudatus (Fig. 1f-I), NF=22 em Caluromys philander (Fig. 1a-I), Caluromys lanatus (Fig. 1b-I), Marmosa murina (Fig. 1d-I) e Gracilinanus emiliae (Fig.1g-I) e NF=24 nas espécies pertencentes ao gênero Marmosops (M. bishopi, M. pinheiroi, M. parvidens, M. impavidus, M. cf. pakaraimae). Todas as espécies de Marmosops analisadas apresentaram características cariotípicas similares (Fig. 1e-I – mostrado apenas M. pinheiroi).

Tabela 1: Dados cariotípicos dos espécimes aqui analisados. Em localidade, os números entre parênteses indicam as localidades dos Apêndices I e II. A morfologia dos cromossomos é indicada pelas letras: m-metacêntrico; sm-submetacêntrico; st-subtelocêntrico; a- acrocêntrico; 2n=número diploide; NF=número fundamental (de braços). Espécie Localidade Macho Fêmea Total 2n NF Fórmula Morfologia Banda C cromossômica cromossômica do X/Y Glironia venusta Porto Velho, RO (13) 1 1 18 20 4m+12a a/-- Cent. Caluromys philander rio Aripuanã, AM (7) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a a/p Cent. rio Tapajós, PA (11) 1 1 2 14 22 2m+6sm+2st+2a a/p Cent.+tel. Cent. rio Purus, AM (4) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/- Cent. Manaus, AM (6) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/- Cent. Total 5 Caluromys lanatus rio Japurá, AM (1) 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/- Cent Marmosa murina rio Aripuanã, AM (7) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/p Cent. rio Jari (12) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/p Cent. rio Uatumã (8) 5 3 9 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/p Cent. rio Trombetas (10) 1 1 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/p Cent. rio Negro (3) 1 1 2 14 22 2m+6sm+2st+2a sm/p Cent. rio Purus (4) 2 2 14 22 2m+6sm+2st+2a a/p Cent. Total 16 Marmosa demerarae rio Aripuanã (7) 4 4 8 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. Manaus, AM (6) 7 11 19 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Cuieiras (5) 4 2 6 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Purus (4) 3 4 7 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Negro (3) 1 5 7 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Tapajós (11) 3 5 9 14 20 2m+6sm+4a a/a - rio Trombetas (10) 9 5 14 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Jari (12) 9 2 11 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Juruá (2) 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. rio Jatapú (9) 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a - Total 83

Tabela 1: Continuação. Espécie Localidade Macho Fêmea Total 2n NF Fórmula cariotípica Morfologia Banda C cromossômic a do X/Y Monodelphis 3 rio Jari, PA (12) 3 18 28 2sm+2m+8st+4a a/a Cent. brevicaudata Monodelphis sp. rio Purus, AM (4) 1 1 18 32 2sm+2m+12st sm/a -

Monodelphis cf. emiliae Rio Aripuanã, AM (7) 2 1 3 18 30 2sm+2m+10st+2a a/d - rio Aripuanã, AM (7) 5 6 11 14 24 6m+6sm m/a - Marmosops bishop rio Purus, AM (4) 2 1 3 14 24 6m+6sm m/a - rio Negro, AM (3) 1 1 14 24 6m+6sm m/a Cent. Total 15 Marmosops pinheiroi rio Tapajós, PA (11) 4 2 6 14 24 6m+6sm m/a Cent. rio Trombetas, PA 9 8 1 14 24 6m+6sm m/a - (10) Marmosops parvidens rio Cuieiras, AM (5) 3 2 5 14 24 6m+6sm m/a Cent. rio Jari, PA (12) 2 2 14 24 6m+6sm m/a Cent. rio Jatapú, AM (9) 4 3 7 14 24 6m+6sm m/a Cent. Total 23 Marmosops impavidus rio Juruá, AM (2) 2 1 3 14 24 6m+6sm m/a Cent. Marmosops cf. rio Japurá, AM (1) 1 3 14 24 6m+6sm m/a Cent. pakaraimae Gracilinanus emiliae rio Tapajós, PA (11) 3 1 4 14 22 2m+6sm+2st+2a m/a Cent. Metachirus rio Trombetas, PA 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. nudicaudatus (10) rio Jari, PA (12) 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent.

rio Cuieiras, AM (5) 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent.

rio Juruá, AM (2) 1 1 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent.

rio Tapajós, PA (11) 2 2 4 14 20 2m+6sm+4a a/a Cent. Total 8 rio Tapajós, PA (11) 1 3 4 22 20 20a a/a Cent. rio Trombetas, PA 3 1 2 22 20 20a a/a Cent. (10) Didelphis marsupialis Manaus, AM (6) 8 4 12 22 20 20a a/a Cent. rio Uatumã, AM (9) 1 1 2 22 20 20a a/a Cent. rio Cuieiras, AM (5) 2 2 4 22 20 20a a/a Cent. Total 25

Em relação aos cromossomos sexuais, o X apresentou-se com três morfologias: metacêntrico em G. emiliae e em Marmosops spp.; submetacêntrico em uma fêmea C. lanatus), acrocêntrico em M. demerarae e M. nudicaudatus. Em duas espécies, Caluromys philander e Marmosa murina, a morfologia do cromossomo X variou em acrocêntrico ou submetacêntrico, em uma mesma ou em diferentes localidades. Já, o Y apresentou-se como acrocêntrico em G. emiliae, Marmosops spp., M. demerarae e M. nudicaudatus e puntiforme em C. philander e M. murina (Fig. 1).

Figura 1. Cariótipos em Giemsa (I), Banda C (II), DNAr 18S e RON (III) e cromossomos sexuais (caixas) de: a) Caluromys philander (SISTAP-M-244, caixas: CAN 34, SISTAP-M- 305); b) Caluromys lanatus (CTGA-M-701); c) Marmosa demerarae (RNL 46, caixas: MCA 27); d) Marmosa murina (RNL 69, caixa: CEF 18) (IV) variação no mapeamento de 18S encontrada nos indivíduos do rio Purus, Tapauá, Amazonas; e) Marmosops pinheiroi (INPA 5377, caixa: EE 192) (SISTAP-M-278, caixa: EE107, INPA 5408); f) Metachirus nudicaudatus (SISTAP-M-302; caixa: SISSIS-M-64); g) Gracilinanaus emiliae (SISTAP-M- 243). Os espécimes testemunho encontram-se na Coleção de Mamíferos do INPA; a sigla INPA se refere ao registro de tombamento na coleção e as demais ao registro de campo dos indivíduos analisados.

Entre as espécies com 2n=18 observou-se uma variação no número fundamental de braços (NF), sendo NF=20 em Glironia venusta (Fig. 2a-I), NF=28 em Monodelphis brevicaudata (Fig. 2c-I), NF=30 em Monodelphis cf. emiliae (Fig. 2b-I) e NF=32 em Monodelphis sp. (Fig. 2d-I). Em M. cf. emiliae e em M. brevicaudata o X foi acrocêntrico e em Monodelphis sp. foi submetacêntrico. O Y foi acrocêntrico em Monodelphis brevicaudata e em Monodelphis sp. e puntiforme em M. cf. emiliae. Didelphis marsupialis foi a única espécie que apresentou 2n=22 cromossomos e NF=20 (Fig. 2e-I), sendo o X e Y acrocêntricos.

Figura 2 Cariótipos em Giemsa (I), Banda C (II), DNAr 18S e RON (III) e cromossomos sexuais (caixas) de: a) Glironia venusta (BAC 80); b) Monodelphis cf. emiliae (INPA 5388); c) Monodelphis brevicaudata (INPA 5404); d) Monodelphis sp. (CAN 44); e) Didelphis marsupialis (EE 249, caixas: EE174). Os espécimes testemunho encontram-se na Coleção de Mamíferos do INPA; a sigla INPA se refere ao registro de tombamento na coleção e as demais ao registro de campo dos indivíduos analisados.

A localização da heterocromatina nas espécies com 2n=14 foi centromérica, apresentando-se de forma conspícua em M. demerarae (Fig. 1c- II), M. murina (Fig. 1d-II), M. pinheiroi (Fig 1e-II) e G. emiliae (Fig. 1g-II). Em C. philander e C. lanatus, os blocos heterocromáticos foram difusos, sendo que na primeira foi detectada heterocromatina na região telomérica (Fig. 1a-II e 1b-II). O cromossomo X em C. philander foi totalmente heterocromático, exceto por uma faixa distal nos braços longos (Fig. 1a-II); já em M. demerarae foi totalmente heterocromático, exceto por uma faixa proximal nos braços longos (Fig. 1c-II); e centromérica em M. murina (Fig. 1d-II), M. nudicaudatus (Fig. 1f- II) e G. emiliae (Fig. 1g-II). Para Marmosops spp. foram detectados dois padrões de banda C para o cromossomo X. No padrão 1, o X foi totalmente heterocromático, exceto por uma faixa proximal nos braços longos (Fig. 1e - caixa); no padrão 2, a heterocromatina concentrou-se nos braços curtos e centrômero (Fig. 1e - caixa). Ambos padrões estiveram presentes em M. parvidens e M. bishopi, enquanto que apenas o padrão 1 foi observado em M. cf. pakaraimae, M. impavidus e M. pinheiroi (Tabela 2). O Y foi totalmente heterocromático em todas as espécies. Nas espécies com 2n=18 cromossomos, a heterocromatina foi centromérica em G. venusta (Fig. 2a-II), M. emiliae (Fig. 2b-II) e Monodelphis brevicaudata (Fig. 2c-II). O Y foi completamente heterocromático nas duas espécies de Monodelphis (Fig. 2b-II e 2c-II). Em Monodelphis sp. não foi possível determinar o padrão de banda C. As regiões organizadoras de nucléolo (RON), confirmadas pela FISH com sonda DNAr 18S, estiveram presentes nos braços curtos do par 6 em todas as espécies com 2n=14. M. demerarae e M. murina tiveram o par 5 também marcado em posição terminal nos braços longos (Fig. 1, c-III e d-III). Nas espécies com 2n=18, a RON foi simples e confirmada pela sonda DNAr 18S. Em M. emiliae, a RON localizou-se nos braços curtos do par 7 (Fig. 2b-III) e em M. brevicaudata localizou-se nos cromossomos X e Y, embora nenhum sítio de 18S tenha sido detectado no Y (Fig. 2c-III). Em D. marsupialis, a RON foi evidenciada, tanto pela prata quanto pela sonda DNAr 18S, em três pares cromossômicos, os pares putativos 5, 7 e 8. 31

Nos pares 5 e 8 as marcações foram observadas em posição terminal dos braços longos, enquanto que no par 7 foram biteloméricas (Fig. 2e-III). Porém, quanto à atividade, houve variação de quatro a oito marcações de Ag-RON.

Discussão Nos últimos anos, avanços nos estudos sistemáticos e taxonômicos da família Didelphidae introduziram mudanças na nomenclatura para muitas de suas espécies (Jansa e Voss 2000; Voss e Jansa 2003; 2009; Gutiérrez et al. 2010). Aqui utilizamos a nomenclatura de Voss e Jansa (2009) e relacionamos nossos dados citogenéticos das 16 espécies analisadas, com a árvore consenso do referido trabalho. Observando principalmente a estrutura cromossômica dos autossomos, nossos resultados corroboram o padrão cariotípico conservado (número diploide e fórmula cromossômica) descrito na literatura para esta família, principalmente para as espécies: Didelphis marsupialis, Marmosa demerarae, Metachirus nudicaudatus, Monodelphis brevicaudata, Monodelphis cf. emiliae e para as espécies de Marmosops (Biggers et al. 1965; Reig et al. 1977; Yonenaga-Yassuda et al. 1982; Seluja et al. 1984; Casartelli et al. 1986; Hayman 1990; Souza et al. 1990; Palma e Yates 1996; Svartman e Vianna-Morgante 1998; 1999; Carvalho et al. 2002). É interessante observar que, apesar dos marsupiais serem considerados cariotipicamente conservados, ao compararmos os cariótipos de alguns gêneros, é possível associá-los a uma dada espécie, devido a presença de caracteres diagnósticos. Por exemplo, M. demerarae e M. murina diferem no número fundamental, morfologia e tamanho dos cromossomos sexuais. Já as espécies de Monodelphis, o NF é específico para cada espécie. Entretanto, o mesmo não acontece para o gênero Marmosops, no qual as cinco espécies apresentam macroestrutura cromossômica muito semelhante. Especificamente no caso do gênero Marmosa, a taxonomia é considerada complicada é considerado de taxonomia problemática e muitas espécies, inclusive Micoureus demerarae (Tate 1933) Recentemente Micoureus foi reincorporado ao gênero Marmosa (Voss e Jansa 2009), sendo atualmente considerado sub-gênero. Vale ressaltar que nesse processo de reorganização taxonômica em Didelphidae, uma defasagem pode ter ocorrido 32

quanto à nomenclatura dos espécimes já cariotipados, gerando dúvidas sobre quantas e quais espécies foram de fato cariotipadas, uma vez que determinados indivíduos podem ter sido reclassificados e espécies divididas em duas ou mais táxons válidos. Dessa forma uma revisão da nomenclatura das espécies com caiótipos já apresentados na literatura se faz necessário. Em relação à estrutura do cromossomo X, verificamos variações intraespecíficas em Caluromys philander e Marmosa murina, ao longo de suas distribuições, já considerando o grau de condensação cromossômica. Considerando primeiramente C. philander, observamos que o cromossomo X foi acrocêntrico ou submetacêntrico, visto tanto em homozigose como em heterozigose em fêmeas (Fig. 3). Os nossos dados complementam os padrões de distribuição geográfica das formas apresentadas do cromossomo X dessa espécie (Souza et al. 2013). Em uma escala geográfica maior, a forma acrocêntrica do X está presente nas regiões sudeste e nordeste do Brasil, assim como no leste amazônico (localidades 3 a 6). A forma submetacêntrica é encontrada em áreas do oeste, central e leste da Amazônia brasileira (Fig. 3) (Reig et al. 1977; Svartman e Vianna-Morgante 1999; Pereira et al. 2008), onde se observa homozigose assim como heterozigose em fêmeas. Os poucos registros de heterozigotos para o X podem ser explicados pela baixa quantidade de indivíduos capturados e/ou analisados citogeneticamente (Peres 1999).

Figura 3 Localização das formas do cromossomo X de Caluromys philander na América do Sul. Os pontos em asterisco são da literatura e os pontos cículo cheio são do presente trabalho: (*1) Venezuela, Reig et al. 1977; (●2) rio Purus; (●3) REMAN Manaus, presente trabalho e Souza et al. 2013; (●4) rio Trombetas; (●5) rio Tapajós; (*6) rio Jari, Souza et al. 2013; (*7) Pernambuco, Souza et al. 1990; (*8) São Paulo, Svartman e Vianna- Morgante 1999 e Pereira et al. 2008. m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; a = acrocêntrico; p = puntiforme.

Em M. murina o X submetacêntrico é encontrado em indivíduos provenientes de duas localidades do centro-oeste do Brasil, situadas marginalmente na distribuição da espécie. É encontrado também em todas as localidades da Amazônia brasileira analisadas, exceto no rio Purus (Fig. 4, localidade 6). Adicionalmente, cromossomos bibraquiais de forma metacêntrica são também encontrados na Amazônia, mais a oeste e ao norte das localidades com submetacêntrico (Fig. 4, localidades 1 a 3) (Carvalho et al. 2002; Reig et al. 1977). Já, o X acrocêntrico é encontrado nas regiões centro- oeste, sudeste e nordeste do Brasil (Souza et al. 1990; Palma e Yates 1996), assim como no rio Purus, Amazonas (presente trabalho) (Fig. 4). Assim, observa-se alta estruturação geográfica na distribuição das formas morfológicas do cromossomo X em Marmosa murina, com o X submetacêntrico, apresentando ocorrência restrita à bacia amazônica (Fig. 4). Em contraste, não observamos um padrão de variação para as formas 34

morfológicas do cromossomo X de M. murina, mesmo com um maior número de exemplares cariotipados por localidade, não tendo sido detectado até o momento polimorfismo das populações.

Figura 4 Localização das formas do cromossomo X de Marmosa murina na América do Sul. Os pontos em asterisco são dados da literatura e os pontos em ● são dados do presente trabalho: (*1) Villa Vivêncio, Colômbia, Hayman e Martin 1974; (*2) Loreto-Peru, Reig et al. 1977; (*3) Bolívar, Venezuela, Reig et al. 1977; (●4) rio Negro; (●5) rio Juruá; (●6) rio Purus; (●7) rio Uatumã; (●8) rio Trombetas; (●9) rio Jari; (*10) Tartarugalzinho, Pará, Carvalho et al. 2002; (*11) Pacoti, Ceará, Pagnozzi et al. 2002; (*12) Pernambuco, Souza et al. 1990; (*13) Vila Rica, Pagnozzi et al. 2002; (*14) Tocantins, Lima 2004; (*15) UHE Corumba IV, Luziania, GO, Pereira et al. 2008; (*16) UHE Peixe Angical, Goiás, Pereira et al. 2008; (*17) Mambai, Goiás, Carvalho et al. 2002; (*18) Espírito Santo, Paresque 2004.

Distribuição de Heterocromatina O padrão da heterocromatina em 8 das 16 espécies (C. lanatus, G. venusta, D. marsupialis, M. brevicaudata, M. emiliae, Monodelphis sp., G. emiliae, M. nudicaudatus) analisadas no presente trabalho foi conservado e se apresentou como pequenos blocos centroméricos, de coloração tênue em todos os autossomos. Em C. philander foram encontrados blocos heterocromáticos na região telomérica dos autossomos, divergindo do que já havia sido registrada na literatura. Já em Marmosa demerarae, Marmosa 35

murina e as cinco espécies de Marmosops spp. se destacaram por apresentar grandes blocos de heterocromatina nos centrômeros dos autossomos. Estas diferenças nos padrões da heterocromatina geralmente são explicadas pela diferença na composição (tipos de sequências) do DNA desta região, que varia tanto inter como intraespecificamente (Sumner 2003). Sendo que as regiões heterocromáticas geralmente são compostas por sequências repetitivas de DNA, especialmente DNA satélite e transposons (John 1988; Grewal e Jia 2007). Essas diferenças de composição da heterocromatina podem ser responsáveis pelos padrões observados em C. philander, M. murina, M. demerarae e Marmosops spp. Quanto a Marmosops spp., os diferentes padrões de banda C do cromossomo X, distribuídos pela bacia amazônica, ocorrem em simpatria na área compreendida entre os eixos Negro-Purus e Trombetas-Tapajós, flanqueada pelo padrão 1 a oeste e pelo padrão 2 a leste (Tabela 2). A correlação desses padrões com possíveis espécies crípticas ainda não foi possível de ser estabelecida, dependendo ainda de análises moleculares e morfológicas mais amplas (da Silva, comunicação pessoal). No entanto, a diversidade de padrões heterocromáticos do cromossomo X em Marmosops spp. pode também ser atribuída a variações presentes ao longo da bacia amazônica.

Tabela 2: Padrões de distribuição da heterocromatina do cromossomo X nas espécies do gênero Marmosops. Padrão Espécie Localidade 1 2 Marmosops bishopi Rio Purus 1 macho 2 machos; 2 fêmeas Rio Negro 1 macho Rio Aripuanã 2 machos; 4 fêmeas 1 macho; 1 fêmea Marmosops parvidens Rio Cuieiras 2 machos 2 fêmeas Rio Trombetas 5 machos 4 machos; 1 fêmea Rio Jari 2 fêmeas Marmosops pinheiroi Rio Cuieiras 1 macho Rio Tapajós 4 machos Marmosops impavidus Rio Juruá 1 macho Marmosops cf. pakaraimae Rio Japurá 1 fêmea

Segundo Sumner (2003), a identificação do padrão heterocromático é um aspecto essencial para a caracterização do cariótipo de uma espécie, mesmo porque diferenças podem ser detectadas entre populações de uma mesma espécie. A heterocromatinização também é um processo utilizado para

o silenciamento de genes, portanto, o padrão heterocromático tanto pode servir como caráter citotaxonômico, como também ser útil para compreensão dos mecanismos de evolução cromossômica e de regulação da expressão gênica. No entanto, no presente trabalho observamos que, com exceção de Marmosops spp., as espécies aqui analisadas apresentaram pouca variação intraespecífica em seus padrões de heterocromatina, inclusive do X, o que sugere que o padrão de distribuição de heterocromatina, isoladamente, não permite a distinção populacional em didelfídeos. Todavia, quando comparamos este caráter em nível específico, a distribuição da heterocromatina torna-se um marcador eficiente para caracterizá-las, como é o caso de M. demerarae e M. murina, uma vez que a primeira apresenta blocos heterocromáticos centroméricos maiores do que a segunda, permitindo melhor diferenciação dos táxons. Isto também foi observado entre as espécies congenéricas C. philander e C. lanatus, ambas com 2n=14 e NF=24, porém com padrão heterocromático distinto. Quanto à região organizadora do nucléolo (RON) em Didelphidae, esta pode ser simples ou múltipla. Segundo Hsu et al. (1975), a RON num cístron único e longo seria um caráter ancestral em mamíferos, sendo que rearranjos subsequentes levariam ao surgimento de RONs múltiplas em grupos derivados. Deste modo, os gêneros Glironia, Monodelphis, Caluromys, Gracilinanus e Marmosops possivelmente apresentam uma condição plesiomórfica, já que nas espécies desses gêneros, a RON está presente somente no par autossômico 6, confirmada pela técnica de FISH com a sonda DNAr 18S. Por outro lado, as espécies de Marmosa e Didelphis, nas quais as RONs são múltiplas, representariam uma condição derivada. O mesmo foi verificado para espécies do gênero Philander (Yonenaga-Yassuda et al. 1982; Svartman e Vianna- Morgante 2003). Quando analisamos este caráter em Monodelphis, encontramos sítios de RON presentes no par 7 e no cromossomo sexual X. No presente trabalho detectamos RON simples, presentes no par 7 em Monodelphis cf. emiliae e Monodelphis sp., RON simples presente nos cromossomos X e Y em Monodephis brevicaudata, sendo esta última uma novidade para o gênero. Genes ribossomais em cromossomos sexuais de mamíferos já foram relatados 37

numa espécie de morcego, Carollia castanea (Hsu et al. 1975), mas os mesmos autores ressaltam que RON no cromossomo X pode gerar problemas de compensação de dose em mamíferos. A presença de RON em cromossomos sexuais pode ser considerada um caráter derivado, uma vez que estaria presente originalmente em autossomos e por rearranjos, tipo translocação ou transposição, passaria a ocupar o cromossomo X. A precipitação de Nitrato de Prata pode ocorrer também em regiões de heterocromatina, levando a uma interpretação errônea sobre a distribuição desse marcador (Sumner 2003; Schneider et al. 2012). Situação semelhante foi verificada no cromossomo Y de M. brevicaudata, cuja marcação não foi confirmada pela FISH, o que nos leva a sugerir não se tratar de um sítio ribossomal, mas sim um bloco de heterocromatina. Se sobrepusermos o caráter RON à filogenia de Voss e Jansa (2009) (não mostrado) verificamos que RONs múltiplas estão distribuídas em duas linhagens derivadas, indicando surgimentos independentes; a primeira no gênero Marmosa e a segunda nas espécies com 22 cromossomos, como exemplo Didelphis e Philander. Assim, os dados de RON nos marsupiais corroboram a hipótese de Hsu et al. (1975), onde o sistema simples teria sido retido em Caluromys philander, C. lanatus, Gracilinanus emiliae, Marmosops spp., Monodelphis brevicaudata, Monodelphis kunsi, Monodelphis dimidiata e Metachirus nudicaudatus (Souza et al. 1990; Palma e Yates 1996; Carvalho et al. 2002, Svartman e Vianna-Morgante 2003; Pereira et al. 2008, Souza et al. 2011). Interessante notar que para RONs múltiplas foram identificadas variações intraespecíficas tanto em M. murina como em M. demerarae. As RONs múltiplas de M. murina descritas no presente trabalho contrastam com dados bibliográficos, uma vez que em indivíduos coletados em Goiás, a RON é simples nos braços curtos do par 6 (Palma e Yates 1996; Carvalho et al. 2002), enquanto que indivíduos de Pernambuco apresentam marcações adicionais nos braços longos dos pares 3 e 5 (Souza et al. 1990). Ainda, em M. murina, os dois indivíduos do rio Purus diferiram tanto em relação aos cromossomos sexuais quanto às RONs dos demais indivíduos dessa espécie.

Já, em M. demerarae, os indivíduos aqui analisados não tiveram os cístrons ribossomais nos braços curtos do par 5, como registrados para espécimes da Mata Atlântica (Svartman e Vianna-Morgante 2003). Em Didelphis marsupialis apenas a atividade das RONs variou, conforme já registrado em espécimes da Mata Atlântica (Yonenaga-Yassuda et al. 1982; Svartman e Vianna-Morgante 2003). Assim, entre os marsupiais da região amazônica analisados, chamam a atenção as variações relacionadas à posição do centrômero e padrões de heterocromatina do cromossomo X. Souza et al. (2013) sugeriram que inversões pericêntricas no cromossomo X de Caluromys philander ocorreram, alterando sua morfologia. Os padrões aqui observados complementam essas observações. Para M. murina as diferentes morfologias do X (m, sm, a) podem ser devidas a um reposicionamento do centrômero sem a presença de rearranjos, o que já foi observado em mamíferos e isso pode ser relacionado a três principais regiões do cromossomo: subtelomérica, próxima ao centrômero nativo e no limite entre heterocromatina e eucromatina (Rochi et al. 2012; Burrack e Berman 2012). Dutrillaux (1979) argumenta que o conhecimento acerca dos cariótipos das espécies é limitado devido à baixa amostragem de indivíduos e que o incremento na amostra pode identificar variações adicionais. Acreditamos que a ampliação da amostra e aplicação de análises integrativas e novas metodologias poderão fundamentar melhor o significado dessas variações cromossômicas. Entretanto, para a região amazônica, a grande limitação dos estudos citogenéticos ainda reside nas coletas de material, dada a sua enorme extensão e dificuldades de acesso. A irradiação de espécies da família Didelphidae ocorreu no continente sul americano. Jansa et al. (2014) encontraram evidências consistentes, que corroboram a origem dessas espécies em florestas úmidas como as florestas pluviais atuais, que existem desde o Eoceno (Morley 2000; Burnham e Johnson 2004). Se as espécies de didelfídeos tiveram origem onde atualmente se encontra a Amazônia e tiveram uma dispersão para o restante do continente, possivelmente os padrões do cromossomo X encontrados em C. philander e M.

murina refletem essa dispersão, onde o reposicionamento do centrômero aconteceu na transição entre a faixa central-leste desse bioma. O acúmulo de dados citogenéticos de marsupiais permite identificar variações em marcadores cromossômicos e o uso desses marcadores permite ainda identificar padrões de estratificação geográfica em sua distribuição, mesmo que ainda existam áreas (principalmente entre Amazônia e Cerrado), que necessitem de amostras para interpretar essas variações de forma contínua. Contudo, dada a amplitude geográfica, a variação nesses caracteres pode representar gradações intraespecíficas, mas podem também estar relacionadas a linhagens ou espécies ainda não identificadas.

Capítulo 2: Comparação cromossômica entre heterocromatina e sequências teloméricas em 11 espécies de marsupiais amazônicos (Didelphimorphia; DIdelphidae)

Resumo: Sequências teloméricas intersticiais (ITSs) têm sido mapeadas em espécies de marsupiais americanas e australianas, mostrando que nem sempre podem ser interpretadas como resquícios de fusão cromossômica. Neste trabalho analisamos o cariótipo de 11 espécies de didelfídeos amazônicos, comparando a distribuição da banda C com a das marcações teloméricas e verificamos que as ITS são coincidentes com blocos de heterocromatina. Das 11 espécies analisadas, seis apresentaram ITSs, todas dentro da região de heterocromatina centromérica. A presença de ITS foi constante no cromossomo X de indivíduos de Marmosa murina e variável nas demais espécies. Acreditamos que a presença variável das ITSs seja uma característica particular de cada linhagem. Nossos resultados corroboram as inferências de que essas sequências nem sempre podem ser interpretadas como consequência de rearranjo cromossômico.

Introdução Sequências teloméricas são altamente conservadas entre entre eucariotos e desempenham a função de proteção das extremidades coesivas dos cromossomos, impedindo a sua interação com outras cromátides e ação de DNAses (McClintock 1941; Meyne et al. 1989; Blackburn 1991). Entretanto, essas sequências podem ser encontradas também em uma posição intersticial nos braços cromossômicos ou na região centromérica. Essa situação tem sido interpretada tanto como respostas a danos no DNA ou à ação de repetições dispersas quanto à reorganização cromossômica (Azzalin et al. 2001; Ruiz- Herrera et al. 2008; Sánchez et al. 2010). Independente de sua origem, as ITSs podem ser fixadas e serem interpretadas no âmbito evolutivo (Nergadze et al. 2004). Na família Didelphidae o mapeamento de ITS em cariótipos com 2n=14 e 18 levou alguns autores a sugerirem que os mesmos teriam originado por rearranjos cromossômicos do tipo fusão a partir de um cariótipo com 2n=22 (Svartman e Vianna-Morgante 1998; Carvalho e Mattevi 2000). Já, Pagnozzi et 41

al. (2000; 2002), analisando algumas espécies de didelfídeos brasileiros, sugeriram que as ITS encontradas nas mesmas seriam um componente da heterocromatina, e não o resultado de fusões recentes. Metcalfe et al. (2004) também concordam que nem todas as ITS de marsupiais australianos da família Macropodidae podem ser aceitas como evidências de fusões, salvo quando não forem os maiores constituintes da heterocromatina. Porém, Svartman (2009) novamente argumenta que o estado de condensação dos cromossomos pode tornar a localização das sequências teloméricas pouco precisa, por aproximar essas marcações à região de heterocromatina pericentromérica. Marsupiais americanos e australianos têm se mostrado um grupo interessante para estudo, dada sua história evolutiva e o compartilhamento do padrão cromossômico. Portanto, mesmo sob o modelo da estabilidade cromossômica, no presente estudo fizemos uma análise comparativa da distribuição da heterocromatina em relação ao padrão de hibridização de sequências teloméricas em 11 espécies de marsupiais didelfídeos amazônicos.

Material e Métodos Neste estudo foram analisadas 11 espécies de marsupiais amazônicos, representantes de oito gêneros de marsupiais, coletadas em 11 localidades da Amazônia (Figura 1, Apêndice I). Os espécimes foram coletados sob autorizações do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - IBAMA, de acordo com os números de licença: 02005.000642/03- 11 (IBAMA); 02000.002336/2003-93 (IBAMA); 02005.002672/04 (IBAMA); 37585-5 (SISBIO); 37592-4 (SISBIO). Os indivíduos foram depositados na Coleção de mamíferos do INPA (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia) (Apêndice II).

Figura 1 Locais de coleta: Estado do Amazonas: 1- rio Japurá, Município de Japurá; 2- rio Negro, Santa Isabel do Rio Negro; 3- rio Purus, Município de Tapauá; 4- rio Negro, Município de Manaus; 5- rio Aripuanã, Município de Novo Aripuanã; 6- rio Uatumã, Municipio de Prestidente Figueiredo; 7- rio Jatapu, Município de São Sebastião do Uatumã; Estado do Pará; 8- rio Jari, Município de Almeirim; 9- rio Trombetas, Município de Oriximiná; 10- rio Tapajós, Municípios de Aveiros e Santarém; Estado de Rondônia: 11- Município de Porto Velho.

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da medula óssea pelos métodos in vivo e in vitro segundo Ford e Harmerton (1956) e Tjio e Whang (1962), respectivamente. O padrão de banda-C foi determinado segundo a técnica descrita por Sumner (1972). As sequências teloméricas foram mapeadas pela técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) conforme Pinkel et al. (1986), cuja sonda foi obtida por PCR (Ijdo et al.1991). Resultados O padrão de banda C utilizado nesta comparação foi descrito em Silva et al. (em preparação, capítulo 1 desta tese), para 10 espécies (Tabela 1). A sonda telomérica hibridizou nas extremidades de todos os cromossomos de todas as espécies (Fig. 2). Destas, as espécies Marmosops pinheiroi, Marmosops cf. pakaraimae, Marmosops parvidens, Marmosa demerarae,

Marmosa murina, e Monodelphis sp. tiveram esta sequência hibridizada também nas regiões centroméricas, caracterizando assim regiões teloméricas intersticiais (ITS). As ITSs estiveram co-localizadas com blocos de heterocromatina em todas as espécies (Fig. 2). Marmosops pinheiroi (Figura 2c) e Marmosops cf. pakaraimae (dados não mostrados) foram as espécies que apresentaram o maior número de cromossomos, tanto autossomos quanto o cromossomo X, com marcações intersticiais centroméricas e com um bloco conspícuo no centrômero do cromossomo X. Em Marmosops parvidens (dados não mostrados) observamos uma variação na quantidade de ITS entre os indivíduos, com cariótipos apresentando zero, duas, cinco e 13 marcações intersticiais (Tabela 1). Variação interindividual também foi observada em Marmosa demerarae, que apresentou ITSs centroméricas em todos os cromossomos, exceto nos sexuais (Fig. 2d), apresentando indivíduos com zero, quatro, cinco, seis, sete, oito, 10 e 12 marcações (Tabela 1). Em Marmosa murina, a ITS localizou-se no centrômero do segundo par autossômico e do cromossomo X (Fig. 2e). Apenas um indivíduo de Caluromys philander, coletado no rio Tapajós, mostrou uma ITS pericentromérica no par autossômico 3 (Fig. 2a, caixa). Monodelphis sp. nov. apresentou uma ITS que foi detectada no maior par autossômico (Fig 2h). Nas demais espécies (Gracilinanus emiliae, Metachirus nudicaudatus, Glironia venusta e Didelphis marsupialis) não foram detectadas ITS (Fig. 2b, f, g, i). Por outro lado, em Didelphis marsupialis, os sítios teloméricos foram menores do que os observados nas outras espécies (Fig. 2i).

Tabela 1 Espécies analisadas neste trabalhoe enfatizando aquelas que apresentaram variação intraespecífica no número de ITS.

Número de Número de Espécie Localidade indivíduos por sexo ITSs Municípios d e Aveiro e Santarém, 3 machos, 1 fêmea 0 (2) rio Tapajós Caluromys philander Município de Oriximiná, rio 1 fêmea 0 Trombetas Município de Manaus, rio Negro 1 fêmea 0 Municipio de Tapauá, rio Purus 2 fêmeas, 1 macho 4, 6, 7 Municípios d e Aveiro e Santarém, 3 fêmeas 6, 8, 12 rio Tapajós Município de Oriximiná, rio 2 fêmeas, 4 machos 6, 7, 8 Marmosa demerarae Trombetas Trombetas Município de Almeirim, rio Jari 1 macho 7 Municiípio de Novo Aripuanã, rio 1 fêmea 12 Aripuanã Município de Juruá, rio Juruá 1 macho 10 Município de Presidente Figueiredo, 1 macho, 1 fêmea 2 rio Uatumã Municipio de Tapauá, rio Purus 1 macho, 1 fêmea 0 Marmosa murina Município de Almeirim, rio Jari 2 machos 0 Municiípio de Novo Aripuanã, rio 1 fêmea 0 Aripuanã Município de Japurá, Japurá 1 macho 0 Marmosops cf. Município de Japurá, Japurá 1 fêmea 12+XX pakaraimae Município de Japurá, Jatapú 1 fêmea 10+XX Marmosops parvidens Município de Oriximiná, rio 4 machos 0, 2, 5, Trombetas 12+X Municípios d e Aveiro e Santarém, 1 macho 12+X Marmosops pinheiroi rio Tapajós Monodelphis sp. Municipio de Tapauá, rio Purus 1 macho 2

Glironia venusta Município de Porto Velho 1 fêmea 0

Municípios d e Aveiro e Santarém, 3 machos; 1 fêmea 0 Gracilinanus emiliae rio Tapajós

Município de Santa Isabel do rio 2 machos, 2 fêmear 0 Metachirus nudicaudatus Negro, rio Negro

Didelphis marsupialis Município de Manaus, rio Negro 1 macho, 1fêmea 0

Figura 2 Cromossomos após hibridização de sequências teloméricas (à esquerda) e após tratamento de banda C (à direita) de: a) Caluromys philander (SISTAP-M-244, caixa: SISTAP-M-297, cromossomo Y SISTAP-M-305); b) Gracilinanus emiliae (SISTAP-M-344); c) Marmosops pinheiroi (SISTAP-M-237); d) Marmosa demerarae (MCA 65), e) Marmosa murina (CEF 18); f) Metachirus nudicaudatus (SISTAP-M-302); g) Glironia venusta (BAC 80); h) Monodelphis sp. (CAN 44); i) Didelphis marsupialis (EE 206). Siglas se referem ao registro de campo dos indivíduos analisados.

Discussão A uniformidade dos números diploides em marsupiais gera questionamentos acerca dos eventos das mudanças cromossômicas nesses organismos. Cariótipos com 2n=14 estão presentes em espécies atuais de ambos os continentes (americano e australiano). Entretanto, diferem quanto ao número fundamental devido a rearranjos do tipo inversões pericêntricas. Ainda, evidências também apontam para fissão cêntrica, gerando números diploides maiores (Rofe e Hayman 1985). O papel desse rearranjo como principal evento para o aumento no número diploide é corroborado, quando dados de pintura cromossômica e filogenia são analisados em conjunto, concluindo que 2n=14 realmente é o candidato mais provável para o número diploide ancestral dos marsupiais (Westerman et al. 2010). Ainda do ponto de vista filogenético, Westerman et al. (2010, material suplementar 2) observaram que as ITSs estão presentes em cromossomos de poucas espécies da família Didelphidae, sendo encontradas apenas nos gêneros Marmosa, Monodelphis, Gracilinanus e Marmosops (Svartman e Vianna-Morgante 1998; Carvalho e Mattevi 2000; Pagnozzi et al. 2002). Por outro lado, se sobrepusermos esses dados na filogenia de Voss e Jansa (2009), Glironia venusta (2n=18) e Caluromys spp. (2n=14), táxons considerados basais, não apresentam ITS, o que sugere evento de fissão, pois para justificar evento de fusão teríamos que interpretar os resquícios de ITS como não retidos pelos táxons basais da família ou não detectáveis devido a limitações técnicas. Isto porque as sequências devem apresentar extensão suficiente para serem detectadas ao microscópio (Azzalin et al. 1997; Bolzán 2012). Ao sobrepormos dos dados na filogenia de Voss e Jansa (2009) observamos que os padrões de ITSs registrados estão restritos a dois clados dentro da família Didelphidae: as tribos Marmosini e Thylamyini, ambos da subfamília Didelphinae. Para cada um desses dois agrupamentos percebe-se que a distribuição das ITSs parece aumentar nas espécies mais derivadas e encontram-se reduzidas nas basais, como por exemplo em Marmosa murina com ITS no cromossomo X e M. demerarae com marcações em quase todos os centrômeros. Outro exemplo dessa situação são as espécies Gracilinanus,

onde G. emiliae não mostra marcações e G. microtarsus mostrou pelo menos em um par (Carvalho e Mattevi 2000; presente trabalho). Acerca das variações intraespecíficas nas ITSs, em Marmosa demerarae registramos ITS em 12 cromossomos, superando as 8 ITSs já registrado por Pagnozzi et al. (2000), chegando a. Essa variação não se restringe a esse táxon, pois observamos situação similar em Marmosops parvidens (Tabela 1). Tal variação parece estar correlacionada a espécies em processo recente de especiação, mas também a rearranjos cromossômicos não Robertsonianos, como inversões e/ou translocações. Marmosa murina e C. philander desse estudo tiveram variações de ITS mais discretas. Para a primeira, ITSs foram observadas apenas em nossos exemplares, enquanto que essas marcações não foram detectadas em exemplares de outras localidades examinadas em outros estudos (Carvalho e Mattevi 2000; Pagnozzi et al. 2002). Já, para C. philander, os registros restringem-se aos exemplares amazônicos analisados por Souza et al. (2013) e neste estudo. Mesmo com acréscimo de indivíduos analisados, detectamos ITSs em apenas um indivíduo, mostrando que existe variação menor para essa espécie. Quanto à sua organização, as sequências teloméricas intersticiais têm sido classificadas em het-ITSs, aquelas correlacionadas à heterocromatina e s- ITSs, sequências curtas em posições intersticiais (Ruiz-Herrera et al. 2008; Lin e Yan 2008). Considerando essas classes, podemos relacionar as ITSs observadas no presente trabalho ao tipo het-ITS, que são sequências maiores e encontradas em associação com a heterocromatina. Situação similar foi observada em marsupiais australianos (Metcalfe et al. 2004; 2007). Propomos aqui que, possivelmente que a het-ITS pode ter surgido como uma sequência curta por fatores do tipo: inserção pelo mecanismo de reparo (Nergadze et al. 2004, 2007), fusão (Bolzán e Bianchi 2006) ou transposição (Bouffler et al. 1993; Nergadze et al. 2007). Posteriormente, essas sequências aumentaram em comprimento, via duplicação por eventos específicos e independentes para cada espécie observada, integrando à heterocromatina e tornando-se detectáveis pela FISH. Essa heterocromatinização serviria como alternativa para “proteção” cromossômica, o que explicaria a associação das 48

ITSs, por nós observadas, com os blocos heterocromáticos maiores e fortemente marcados na Banda C. Neste trabalho, sugerimos que a variação no padrão de sequências teloméricas em didelfídeos é principalmente intraespecífica. Entretanto, é necessário a inclusão dos demais gêneros de didelphideos à essa análise para que possamos inferir sobre um padrão evolutivo das sequências teloméricas intersticiais na família. Por outro lado, sugerimos que nesse grupo, essas ITSs não são o resultado de eventos de fusão cromossômica, hipótese essa também corroborada pela sobreposição dos dados de Its na filogenia de Voss e Jansa (2009), na qual táxons basais apresentam menor número diploide e ainda, citogeneticamente, a associação dessas sequências com a heterocromatina indicam que as ITSs fazem parte do DNA. Entretanto, ainda não podemos formular uma hipótese para a origem destas ITS aqui encontradas e nem tão pouco para a sua variação.

Capítulo 3: Mapeamento do elemento LINE-1 em cinco espécies de marsupiais amazônicos (Didelphidae; Didelphimorphia).

Resumo: No presente trabalho mapeamos o retroelemento LINE-1 em espécies de didelfídeos, buscando entender a dinâmica desse elemento na evolução cariotípica de marsupiais amazônicos. Foram analisados exemplares de cinco espécies: Caluromys philander, Gracilinanus emiliae, Marmosa murina, Marmosa demerarae e Didelphis marsupialis. As marcações se mostraram dispersas por todos os cromossomos, não havendo preferência por regiões específicas do cromossomo, nem mesmo pelo cromossomo X, como já registrado na literatura para outros marsupiais.

Introdução Elementos transponíveis (ET) são sequências de DNA dotadas de mobilidade, o que determina sua configuração dispersa pelo genoma. A movimentação desses elementos pelo genoma pode ocorrer de forma direta via DNA-DNA ou por meio de um intermediário de RNA. Essa característica, por sua vez, pode se relacionar com funções biológicas como: transferência horizontal, regulação gênica, mudanças cromossômicas, inativação do X em fêmeas (Lyon 1998; Ostertag et al. 2001 Kazazian e Goodier 2002; Chow et al. 2010). Elementos transponíveis estão presentes em todos os organismos, abrangendo procariotos e eucariotos e correspondem a uma grande fração dos genomas dos hospedeiros (Lander et al. 2001). Em mamíferos, os LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) e SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) são os ETs mais bem representados. Em Monodelphis domestica os LINEs representam 20%, em Mus musculus 18,7% e em humanos aproximadamente 20% (Gentles et al. 2007; Rebuzzini et al. 2009). Waters et al. (2007) observaram que, em mamíferos, os padrões de divergência entre os elementos LINE-1 são específicos de cada linhagem. Porém, o envolvimento desses elementos em alterações cromossômicas pode ser indireto, mas ainda assim o seu acúmulo pode ser associado com os padrões de especiação de algumas linhagens (Dobigny et al. 2004; Waters et al. 2004). Em marsupiais, a distribuição desses elementos em cromossomos ainda foi pouco explorada, restringindo-se ao sequenciamento de LINE-1 em Didelphis virginiana e hibridização in situ fluorescente de retrovírus endógenos de cangurus (KERV) em espécies de wallaby do continente australiano (Dönner e Paböo 1995; O’Neill et al. 1998). 50

Mapeamento cromossômico desse elemento em mamíferos tem possibilitado realizar inferências sobre a estrutura e reorganização da cromatina em mamíferos Referências. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo mapear a distribuição dos elementos LINE-1 nos cromossomos de cinco espécies de didelfídeos amazônicos para conhecer sua organização.

Material e Métodos A distribuição do elemento transponível LINE-1 foi mapeada nos cromossomos de cinco espécies de didelfídeos amazônicos: Caluromys philander (1 macho e 2 fêmeas), Marmosa murina (1 macho e 1 fêmea), Marmosa demerarae (1 macho e 2 fêmeas), Gracilinanus emiliae (1 fêmea) e Didelphis marsupialis (1 macho e 1 fêmea), cujas preparações cromossômicas foram obtidas segundo Ford e Hammenrton (1956). Para a obtenção da sonda utilizamos os primers desenvolvidos por Dobigny (2002): L1-F 5' CCA-TGC- TCA-TSG-ATT-GG-3', L1-R 5' ATT-CRT-TCC-CAT-TGG-TCTA 3', seguindo os parâmetros de Waters et al. (2004), aumentando apenas o tempo de anelamento para um minuto o que permitiu melhores resultados. As sondas foram marcadas por nick translation com kits de marcação DIG-Nick, da Roche, seguindo as recomendações do fabricante. A hibridização in situ fluorescente (FISH) seguiu o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986), com estringência de 70%, onde foram obtidos os melhores resultados.

Resultados Das cinco espécies analisadas, nas quais o LINE-1 foi mapeado quatro têm 2n=14 cromossomos e uma 2n=22 (Figura 1). Em todas as espécies o LINE-1 se mostrou disperso. Entretanto, Caluromys philander (Figura 1a) e Marmosa demerarae (Figura 1b) apresentaram uma maior concentração de marcações, distribuídas por todas as cromátides. Em contraste, em G. emiliae (Figura 1c) e em M. murina (Figura 1d) a densidade pareceu ser bem menor. Didelphis marsupialis (Figura 1e) mostrou um padrão intermediário.

Discussão Padrões de hibridização de LINE-1 (L1) nos cromossomos de mamíferos foram observados em pelo menos 10 ordens: Tubulidentata, Proboscidea, Macrocelidea, Xenarthra, Sirenia, Chiroptera, Cetacea, Rodentia, Primates e Diprotodontia (O’Neill et al. 1998; Parish et al. 2002; Waters et al. 2004; Acosta et al. 2008; Rebuzzini et al. 2009; Bonifácio et al. 2012). Dentre essas, apenas Diprotodontia pertence à infraclasse Metatheria, onde estão classificados os marsupiais (Wilson e Reeder 2005). Em Macropus eugenii, marsupial australiano, a distribuição de elemento transponível (ET) mostrou-se dispersa pelos braços cromossômicos e ausente nos centrômeros, sendo que a dispersão do L1 foi limitada pela presença do retroelemento KERV-1 (Kangaroo Endogenous RetroVirus) (Ferreri et al. 2011). Apesar de não compararmos a distribuição do L1 com a de outros ET, a dispersão desse elemento não apresentou limitações claras entre regiões das cromátides. Portanto, espécies com clusters mais definidos podem apresentar esse padrão devido interações entre dois retroelementos, confinando-os à regiões específicas e separadas (como exemplo: Marmosa murina e Gracilinanus emiliae). Em relação aos eutérios, os padrões de hibridização de L1 estão disponíveis para Cetacea, Tubulidentata, Proboscidea, Macrocelidea, Xenarthra e Sirenia. Os padrões obtidos neste estudo assemelham-se mais aos padrões do xenartro amazônico Bradypus tridacylus, cujos sinais de hibridização foram mais dispersos (Waters et al. 2004;). Esse tipo de situação é contrário ao observado em roedores, onde a inserção pode ser alocada em bandas-G positiva ou dispersa por toda a cromátide, exceto no centrômero. Em espécies do gênero Taterillus, por exemplo, a dispersão desse elemento pelos cromossomos foi maior em espécies que apresentam divergência mais recente. Enquanto que no gênero Mus, essa dispersão foi constante em todas as subespécies investigadas (Dobigny et al. 2004; Rebuzzini et al. 2009). Ao contrário de Taterillus, não podemos atribuir a dispersão do LINE-1 de nossos espécimes com estimativas de tempos de divergência entre espécies, pois mesmo que a irradiação dos didelfídeos atuais seja mais recente

do que o esperado (Jansa et al. 2015), a escala temporal é muito maior do que a verificada em Taterillus. Os padrões de hibridização do L1 de espécies de elefantes, Ardvaark e xenartros, levaram Waters et al. (2004) a inferirem que padrões de L1 semelhantes a padrões de bandeamento G são característicos de Euarchotonglires (coelhos, roedores e primatas). Porém, essa organização não parece ser exclusiva desse grupo, pois registros no cetáceo Inia geoffrensis e no quiróptero Carollia brevicauda também exibiram o mesmo padrão (Parish et al. 2002; Bonifácio et al. 2012). No caso de quirópteros (Tonatia saurophila e Mimon crenulatum) foi observado um enriquecimento de L1 na região pericentromérica dos cromossomos. Isso demonstra que não existe padrão único para cada linhagem de mamífero, dado que um mesmo padrão pode ser encontrado em linhagens distantes e dois padrões podem ser vistos em um mesmo grupo. Nossos resultados também divergem da afirmativa de que exista um padrão preferencial para a inserção do L1 em quaisquer regiões cromossômicas, pois não pudemos relacionar a distribuição de padrões considerados semelhantes com algum tipo de estrutura cromossômica evidenciada por coloração convencional ou bandeamentos. Ainda, foi demonstrado que LINE-1 propaga-se verticalmente entre as linhagens de mamíferos, refletindo sua história evolutiva (Waters et al. 2007). Apesar de, essa afirmação ser um elemento-chave para compreensão dos padrões evolutivos desse elemento em mamíferos, ainda falta estabelecer uma relação clara de como a compartimentalização foi estabelecida em cada linhagem de mamíferos. Em termos de organização genômica, os bandeamentos cromossômicos (-G, -R e –C) permitem reconhecer regiões dos cromossomos em diferentes níveis de compactação da cromatina. Para didelfídeos, esses métodos são bem explorados na literatura e recentemente descrevemos padrões cariotípicos para 16 espécies, coletadas em 13 localidades da Amazônia (Rofe e Hayman 1985; Palma e Yates 1996; Svartman e Vianna-Morgante 1999; Carvalho e Mattevi 2002; Svartman 2009; Silva et al. em preparação [capítulo 1 do presente trabalho]). 54

Segundo Sumner (1998; 2003), uma das características das regiões G- positivas é serem mais ricas em genes expressos e em elementos do tipo LINE. Porém, esse acúmulo não foi verificado nas espécies aqui estudadas. Considerando que os LINEs podem participar da regulação da expressão gênica (Lippman et al. 2004; Lunyak et al. 2007), sugerimos que a falta de acúmulo de LINE nessas regiões indica que a participação desses elementos na regulação gênica, não exije uma localização física entre genes expressos e cópias do transponível. Tanto metatérios como eutérios possuem sistema de determinação sexual do tipo XX/XY, sendo que um dos cromossomos X é inativado no sexo homogamético (Lyon 1961). Porém, em marsupiais existem algumas peculiaridades em relação aos cromossomos sexuais, que abrangem: o tamanho desses cromossomos em relação ao restante do genoma, diferenças estruturais, como ausência de região de homologia entre estes, e ausência do complexo sinaptonêmico na meiose (Solari e Bianchi 1975; Sharp 1982; Seluja et al. 1987; Graves e Watson 1991; Graves 1996). Adicionalmente, podemos somar a essas diferenças, a ausência do acúmulo dos elementos LINE/L1 na inativação de um dos cromossomos X, como impulsionadores desse processo em eutérios (Lyon 1998; 2000). Nossos dados mostram essa falta de acúmulo de L1 no X. Com o sequenciamento completo do genoma de Monodelphis domestica observa-se que uma quantidade significativamente menor do ET esteve presente no cromossomo X (22%), em relação ao encontrado para camundongos (35%) e até mesmo em humanos (O’Neill et al. 1998; Mikkelsen et al. 2007). Provavelmente não haja necessidade da participação desses elementos, pois, dentre as inúmeras particularidades que diferem a inativação do X entre os dois táxons de placentários, verifica-se a presença de um gene (RSX), que substitui a função do gene Xist de eutério, responsável pela inativação (Davidow et al. 2007; Hore et al. 2007). É possível que a atuação do gene RSX não necessita da participação desse ET, durante o processo de inativação. Portanto, ambas informações suportam as evidências obtidas pela FISH da falta de acúmulo de LINE nos cromossomos X de marsupiais.

Ainda sobre o cromossomo X, cada vez mais evidências apontam para uma dinâmica evolutiva diferenciada deste, em didelfídeos. Previamente, registramos variações intraespecíficas na posição do centrômero do X de Marmosa murina e Caluromys philander e também na distribuição da heterocromatina em espécies de Marmosops (Silva et al. em preparação). Assim, acreditamos que os cromossomos sexuais desses organismos ainda ofereçam um vasto campo a ser explorado tanto no âmbito molecular quanto em estudos citomoleculares. Diferente dos eutérios, sobretudo euarchontoglires (lagomorfos, primatas e roedores), marsupiais didelfídeos não mostram padrão de distribuição preferencial dos retroelementos LINE-1 e os padrões observados em cada espécie de mamífero deve seguir uma dinâmica própria dentro de cada linhagem. Assim, a aparente falta de padrão dos didelfídeos deste estudo, tanto pode ser fruto de uma irradiação recente de espécies quanto uma interação particular dentro da família Didelphidae

4. Conclusões 1- Cariótipos dos didelfídeos mostram estabilidade, porém essa característica marcante quanto ao número diploide é atenuada, dado que é possível detectar variações no que se refere aos marcadores cromossômicos (banda-C, RON, DNAr 18S). Essas variações tornam-se mais evidentes ao incluir os cromossomos sexuais, principalmente o X nas análises. 2- A observação das variações de marcadores cromossômicos mostra estruturação geográfica em algumas espécies de didelfídeos. Os agrupamentos formados podem ser indicativos da existência de diferentes linhagens ou espécies crípticas. 3- Considerando que as sequências teloméricas intersticiais estão presentes em poucas linhagens dentro dessa família, esse marcador parece insuficiente como fonte de atribuição de fusões como principal gerador dos números diploides. Isso fica ainda mais evidente quando expandimos essas observações para as espécies basais. 4- A variação intraespecífica nas ITSs é maior do que o já registrado na literatura. Essa variação mostra uma forte correlação com a heterocromatina, indicando que essas sequências podem ser apenas um componente do DNA satélite. 5- O ET- LINE-L1 não mostrou relação com regiões específicas dos cromossomos, fortalecendo a hipótese de que sua distribuição está relacionada à dinâmica evolutiva de cada grupo. 6- A falta de acúmulo de L1 no cromossomo X dos marsupiais pode ser um resultado do mecanismo de inativação do cromossomo X nesses organismos, que difere dos demais mamíferos placentários. 7- A variação do cromossomo X e os padrões de distribuição dos elementos repetitivos podem ser reflexo dos eventos de especiação ocorridos nos didelfídeos.

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Apêndice I: Coordenadas geográficas para cada local de coleta no formato de grau decimal, coletadas no sistema de referência WGS 84:

1- rio Japurá (1.84341666667°S, -69.0264722222°W); 2- rio Juruá (3.64151111111°S, 66.1006916667°W); 3- rio Negro (0.57725000000° S, 64.8976944444°W); 4- rio Purus (4.98066666667° S; 62.9770000000° W); 5- rio Cuieiras (2.70708611111°S, 60.3738388889°W); 6- Manaus (UFAM campus: 3.100548° S, 59.974595° W; Refinaria Isaac Sabá: 3.15264166667°S, 59.9843444444°W); 7- rio Aripuanã (6.00000000000° S, 60.1666666667° W); 8- rio Uatumã (1.84998888889°S, 59.4402000000°W); 9- rio Jatapú (2.017940° S, 58.203228° W); 10- rio Trombetas (1.48163888889° S, 56.4573333333° W); 11- rio Tapajós (3.35486111111° S; 55.2031666667° W); 12- rio Jari (0.7000000000° S, 52.6666666667° W); 13- Porto Velho (8.87416666667° S, 64.0077777778° W).

Apêndice II: Material testemunho: Todos os espécimes analisados foram depositados na Coleção de Mamíferos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; os espécimes estão indicados pela espécie, sítios de coleta, gênero, e número de coletor, seguidos pelo registro do INPA (em parênteses) quando disponível.

Voucher specimens: Glironia venusta: (BAC 80) - Caluromys philander: rioTapajós (male: SISTAP-M-297; SISTAP-M-305; SISTAP-M-318; SISTAP-M-382; female: SISTAP-M-244); rio Trombetas (female: CTGA-M-652); rio Purus (female: CAN 34); Manaus (female: MSN 01); (female: BAC 102) - Caluromys lanatus: rio Japurá (female: CTGA-M-701) - Marmosops sp.: rio Aripuanã ( female: MCA 3; MCA 7; MCA 8; MCA 26; MCA 31; MCA 35; male: MCA 4; MCA 16; MCA 38; MCA 39); rio Jari (female: TAG 3459; RNL 70); rio Juruá (male: EE 107; EE 139; female: EE135); rio Cuieiras (female: EE 198; EE 211; male: EE 192; EE 201; EE216) - Marmosops bishopi: rio Negro (male: SISIS-M-127); rio Purus (male: SISPUR-M-135; SISPUR-M- 157; SISPUR-M-160; SISPUR-M-164; SISPUR-M-135; CAN 30; CAN 51; female: CAN 48) - Marmosops pinheiroi: rio Tapajós (male: SISTAP-M-237; SISTAP-M-278; female: SISTAP-M-268; SISTAP-M-277) - Marmosops parvidens: rio Trombetas (male: CTGA-M-501; CTGA-M-516; CTGA-M-531; CTGA-M-532; CTGA-M-551; CTGA-M-555; CTGA-M-581; CTGA-M-600; female: CTGA-M-533) - Marmosops impavidus: rio Purus (male: SISPUR-M-149) - Marmosops cf. pakaraime: rio Japurá (male: SISJAP-M-705) - Marmosa murina: rio Jari (male: RNL 45); rio Uatumã (male: CEF 4; CEF 8; CEF 18; CEF 27; CEF 28; CEF 32; female: CEF 16; CEF 34; CTGA-M- 8; CTGA-M-22; CTGA-M-41;), rio Negro (male: SISIS-M-57; SISIS-M-63); rio Trombetas ( female: CTGA-M—519); rio Purus (male: CAN 43); rio Japurá (male: CTGA-M-708) - Marmosa cf. lepida: rio Aripuanã (female: MCA12, rio Japurá (male: SISJAP-M-764)- Gracilinanus emiliae: rio Tapajós: (male: SISTAP- M-245; SISTAP- M-343; SISTAP- M-344; SISTAP- M-345) - Micoureus demerarae: rio Aripuanã (female: MCA 27; MCA 36; MCA 58; MCA 65; male: MCA 21; MCA59); rio Jari (female: RNL 31; RNL 48; male: RNL 30; MCA 32; MCA 46; MCA 49; MCA 58; MCA 61; MCA 64; MCA 66; MCA 67) rio Juruá (female: EE136; male: EE 143); Manaus (female: EE 149: EE 150; EE 151; EE 154; EE 158; EE 159; EE 169; EE 222; EE 228; 229; EE 234; male: EE 157; EE 167; EE 170; EE 176; EE 189; EE 194; EE 196; EE 202; EE 215; EE 220; EE 235); rio Cuieiras (female: EE 193; EE 219); rio Tapajós ( female: SISTAP-M-229; SISTAP-M-241; SISTAP-M-321; SISTAP-M-333; SISTAP-M-369; 72

male: SISTAP-M-267; SISTAP-M-279; SISTAP-M-322); rio Trombetas (female: CTGA- M-579; CTGA-M-590; CTGA-M-622; CTGA-M-667; CTGA-M-672; male: CTGA-M-535; CTGA-M-539; CTGA-M-557; CTGA-M-558; CTGA-M-572; CTGA-M-573; CTGA-M- 578; CTGA-M-580; CTGA-M-613); rio Negro (female: SISIS-M-85; SISIS-M-110; SISIS-M-117; SISIS-M-128; male SISIS-M- 86); rio Purus (female: SISPUR-M-145; CAN 25; CAN 31; CAN 50: male: SISPUR-M-144; SISPUR-M-147; SISPUR-M-148) - Monodelphis brevicaudata: rio Jari (male: TAG 2731; RNL 68) - Monodelphis sp.: rio Purus: (male: CAN 44) - Monodelphis cf. emiliae: rio Aripuanã (female: MCA 31) - Metachirus nudicaudatus: rio Jari: (RNL 47); rio Cuieiras: (fêmas: EE 200); rio Tapajós (ind: SISTAP-M-230; fêmas: SISTAP-M-230; male: SISTAP-M-251; SISTAP- M-269); rio Trombetas: (female: CTGA-M-655); rio Jatapú: (female: CTGA-M-52; CTGA-M-58); rio Negro: (female: SISIS-M-64; SISIS-M-78; male: SISIS-M-84; SISIS- M-116); rio Purus: (male: CAN 33) - Didelphis marsupialis: rio Jari: (female: RNL 44; RNL 53; RNL 59; male: RNL 52; RNL 55; RNL 62; RNL 63); Manaus: female (EE 174; EE 197; EE 204; EE 224; EE 227; EE 246; EE 250; EE 155; EE 155; EE 173; EE 183; EE 190; EE 203; EE 205; EE 206; EE 223; EE 232; EE 233; EE 237; EE 247;EE 248; EE249; EE 190); rio Uatumã (female: CEF 5; male: CEF 13); rio Trombetas (female: CTGA-M-594; CTGA-M-606; male: CTGA-M-607); rio Purus (male: SISPUR-M-185); rio Negro (male: SISIS-M-73): rio Tapajós (female: SISTAP-M-324; SISTAP-M-346; SISTAP–M-347;male: SISTAP-M-243); rio Japurá: (male: CTGA-M-732).