UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE DOS EXTRACTOS DE Grindelia boliviana rusby (CHIRI CHIRI) Y Mentha spicata L. (HIERBA BUENA), AREQUIPA – 2019”

PRESENTADO POR: Bach. Prado Arcos Tania Bach. Huanca Luque Yony

ASESORA: MSc. Betty Marilia Salazar Pinto CO-ASESOR: MSc. Elvis Gilmar Gonzáles Condori

AREQUIPA – PERÚ 2021

UNIVERSIDAD PRIVADA AUTÓNOMA DEL SUR FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS

“DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE DOS EXTRACTOS DE Grindelia boliviana rusby (CHIRI CHIRI) Y Mentha spicata L. (HIERBA BUENA), AREQUIPA – 2019”

PRESENTADO POR: Bach. Prado Arcos Tania Bach. Huanca Luque Yony

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO: Dra. Sara Pastora Meza Málaga SECRETARIO DEL JURADO: Mg. Ruth Elena Gárate de Dávila VOCAL DEL JURADO : Mg. Carmen Beatriz Burgos Macedo

DEDICATORIA

Esta tesis se la dedico a Dios quién supo guiarme por el buen camino, darme fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se presentaban, enseñándome a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento.

A mi familia por el apoyo que siempre me brindaron en el transcurso de cada año de mi carrera universitaria.

A mi hijito Matteo por ser mi fuente de inspiración para poder culminar esta tesis y seguir creciendo profesionalmente día a día.

Yony Huanca Luque

Quiero comenzar esta dedicatoria agradeciendo infinitamente a Dios por regalarme vida, salud y bendecir cada uno de mis días durante el transcurso de mi carrera profesional para poder alcanzar mi anhelado sueño.

A mis amados hijos, Johan y Nirvanita que son mi mayor motivación, por apoyarme incondicionalmente en mis noches de estudio, en el trabajo y demás actividades, prestos en todo momento a darlo todo por mamá y yo feliz de contar con el apoyo de mis adorados y amados hijos.

I

A mi esposo por su comprensión y apoyo constante, quien estuvo para mí en todo momento y teniendo fe de que este día llegaría; también le agradezco por las veces que estuve ausente dedicando tiempo a mis estudios y trabajo.

No fue fácil, pero al fin lo logramos y hoy culminando mi carrera profesional estoy inmensamente feliz de dedicarles este título profesional a mis hijos y esposo, porque no solo es mío, sino, es de los cuatro; ahora me queda ver el logro de cada uno de ellos, estoy segura de que llegará ese día y el gozo será enorme.

Tania Prado Arcos.

II

AGRADECIMIENTO

Primeramente, agradecemos a Dios por ser guía y luz en nuestro camino, por darnos la fortaleza, valentía para seguir adelante y hacer posible la culminación de nuestra tesis.

Agradecemos a nuestros docentes de la Escuela de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Privada Autónoma del Sur, por compartir sus conocimientos estos cinco años para la preparación de nuestra profesión, de manera especial, a nuestra Asesora de tesis Mg.

Betty Marilia Salazar Pinto y a nuestro Co-asesor Mg. Elvis Gilmar

Gonzales Condori por su apoyo incondicional y desinteresado.

Yony Huanca L. y Tania Prado A.

III

RESUMEN

El Perú es un país que presenta diversidad de especies vegetales al contar con diversos climas y regiones; además, la medicina tradicional recomienda el uso de algunas especies para el tratamiento o prevención de diversas enfermedades, lo que motiva a realizar investigaciones para contribuir con evidencia científica sobre sus propiedades. Por tal motivo, la presente investigación tuvo por objetivo determinar la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Menta spicata L. (Hierba buena). Los resultados, mostraron que la concentración de fenoles totales en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) fue de 157.393 y 190.977 Ác. Gálico en mg /L, respectivamente. La concentración de fenoles totales en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Menta spicata L. (Hierba buena) fue de 622.556 y 469.173 Ác. Gálico en mg /L, respectivamente. Con respecto a la capacidad antioxidante en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) se determinó 0.841 y 1.165 mmol de Trólox/L, respectivamente. La capacidad antioxidante en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Menta spicata L. (Hierba buena) fue de 1.875 y 2.606 mmol de Trólox/L.

Finalmente, según los resultados obtenidos se concluye que la concentración de fenoles totales y la capacidad antioxidante de la Menta spicata L. (hierba buena) fue superior con relación a la Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri).

Palabras clave. Grindelia boliviana rusby, Menta spicata L., fenoles totales, capacidad antioxidante.

IV

ABSTRACT

Peru is a country that presents diversity of plant species as it has diverse climates and regions, in addition, traditional medicine recommends the use of some species for the treatment or prevention of various diseases, which motivates research to contribute with scientific evidence about its properties. For this reason, the objective of this research was to determine the concentration of total phenols and antioxidant capacity in the ethanolic and hydroalcoholic extracts of Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) and Menta spicata L. (good grass). The results after the specific analyzes that the concentration of total phenols in the ethanolic and hydroalcoholic extracts of Grindelia boliviana rusby is 157,393 and 190,977 mg AG / L respectively. The concentration of total phenols in the ethanolic and hydroalcoholic extracts of Menta spicata L. was 622,556 and 469.173 mg AG / L respectively. The antioxidant capacity of the ethanolic and hydroalcoholic extracts of Grindelia boliviana rusby is 0.841 and 1,165 mmol Trolox / L, respectively. The antioxidant capacity in the ethanolic and hydroalcoholic extracts of Menta spicata L. was 1,875 and 2,606 mmol Trolox / L.

Finally, according to the results obtained, it is concluded that the concentration of total phenols and the antioxidant capacity of the Menta spicata L. (good grass) is higher in relation to the Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri).

Keywords. Grindelia boliviana rusby, Menta spicata L., total phenols, antioxidant capacity.

V

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA ...... I

AGRADECIMIENTO...... III

RESUMEN ...... IV

ABSTRACT ...... V

ÍNDICE DE CONTENIDOS ...... VI

ÍNDICE DE TABLAS ...... X

ÍNDICE DE FIGURAS ...... XII

ÍNDICE DE ANEXOS ...... XIV

INTRODUCCIÓN ...... XV

CAPÍTULO I ...... 1

EL PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN ...... 1

1.1. Descripción de la realidad problemática ...... 1

1.2. Formulación del problema ...... 3 1.2.1. Problema principal ...... 3 1.2.2. Problemas secundarios ...... 3

1.3. Objetivos ...... 4 1.3.1. Objetivo general ...... 4 1.3.2. Objetivos específicos ...... 4

1.4. Justificación del estudio ...... 5

CAPÍTULO II ...... 6

MARCO TEÓRICO ...... 6

2.1. Antecedentes investigativos ...... 6 2.1.1. A nivel internacional ...... 6

VI

2.1.2. A nivel nacional ...... 9 2.1.3. A nivel local ...... 11

2.2. Base teórica...... 13 2.2.1. Mentha spicata L. (Hierba buena) ...... 13 2.2.2. Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) ...... 16 2.2.3. Compuestos fenólicos ...... 19 2.2.4. Radicales libres ...... 23 2.2.5. Especies reactivas del oxígeno (ERO) ...... 24 2.2.6. Estrés oxidativo (OS) ...... 26 2.2.7. Antioxidantes ...... 29 2.2.8. Métodos para determinar el efecto antioxidante ...... 36 2.2.9. Método 2,2-difenil-2-picrilidracilo (DPPH), determinación de capacidad antioxidante ...... 38 2.2.10. Método Folin-Ciocalteu, determinación de fenoles totales ...... 39 2.2.11. Espectrofotometría ...... 39

2.3. Conceptos básicos ...... 41

2.4. Hipótesis ...... 43 2.4.1. Hipótesis principal ...... 43 2.4.2. Hipótesis secundaria ...... 43

2.5. Variables ...... 44 2.5.1. Identificación de variables ...... 44

2.6. Operación de variables ...... 45

CAPÍTULO III ...... 46

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN ...... 46

3.1. Tipo de la investigación ...... 46 3.1.1. Nivel de la investigación ...... 46 3.1.2. Tipo de investigación ...... 46 3.1.3. Diseño de la investigación ...... 46

VII

3.2. Planteamiento operacional ...... 47 3.2.1. Ámbito de estudio ...... 47

3.3. Población, muestra y muestreo ...... 47 3.3.1. Población ...... 47 3.3.2. Muestra ...... 47 3.3.3. Muestreo ...... 47

3.4. Identificación de la unidad de estudio ...... 48 3.4.1. Criterios de inclusión ...... 48 3.4.2. Criterios de exclusión ...... 48

3.5. Técnicas e instrumentos de recojo de datos ...... 48 3.5.1. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos ...... 48 3.5.2. Recolección y acondicionamiento de la planta ...... 50 3.5.3. Identificación de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) ...... 52 3.5.4. Obtención de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) 53 3.5.5. Identificación de metabolitos secundarios ...... 54 3.5.6. Determinación de fenoles totales ...... 56 3.5.7.Determinación de la capacidad antioxidante por el método de DPPH 57

CAPÍTULO IV ...... 59

RESULTADOS ...... 59

4.1. Identificación taxonómica ...... 59

4.2. Identificación de metabolitos secundarios ...... 60 4.2.1. Alcaloides ...... 60 4.2.2. Taninos ...... 61 4.2.3. Saponinas ...... 62 4.2.4. Flavonoides...... 63

VIII

4.3. Concentración de fenoles totales de los extractos alcohólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) ...... 67

4.4. Determinación de la capacidad antioxidante de los extractos alcohólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) ... 72

CAPÍTULO V ...... 77

DISCUSIÓN ...... 77

CONCLUSIONES ...... 81

RECOMENDACIONES ...... 82

BIBLIOGRAFÍA ...... 83

ANEXOS ...... 92

IX

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Clasificación taxonómica ...... 15

Tabla 2: Clasificación taxonómica ...... 18

Tabla 3: Clasificación según el número de carbono en sus moléculas ...... 21

Tabla 4: Transformaciones de formación de H2O2 y O2 ...... 28

Tabla 5: Tipos de métodos in vitro para la determinación del efecto antioxidante ...... 37

Tabla 6: Operacionalización de variables ...... 45

Tabla 7: Fase móviles y reveladores ...... 55

Tabla 8: Ubicación taxonómica de Chiri chiri ...... 59

Tabla 9: Ubicación taxonómica de Hierba buena ...... 60

Tabla 10: Resultados de identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos en hojas de Hierba buena...... 65

Tabla 11: Resultados de identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos en hojas de Chiri chiri...... 66

Tabla 12: Datos del gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles totales...... 67

Tabla 13: Resultados de la cuantificación de fenoles totales ...... 69

Tabla 14: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación del contenido de fenoles totales en los extractos de Chiri Chiri...... 70

Tabla 15: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación del contenido de fenoles totales en los extractos de Hierba buena...... 71

X

Tabla 16. Datos del gráfico de calibración para la cuantificación de capacidad antioxidante...... 72

Tabla 17: Resultados de la cuantificación de la capacidad antioxidante...... 74

Tabla 18: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación de la capacidad antioxidante de los extractos de Chiri Chiri ...... 75

Tabla 19: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación de la capacidad antioxidante de los extractos de Hierba buena...... 76

XI

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Menta spicata L. (Hierba buena) ...... 14 Figura 2: Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) ...... 18 Figura 3: Papel del estrés oxidativo en la carcinogénesis ...... 26 Figura 4: Los radicales libres y otros reactantes enzimáticamente se eliminan de las células por una serie de enzimas antioxidantes...... 32

Figura 5: Oxígeno y radicales libres nitrogenados y reactivos asociados que se generan en las células por varios procesos...... 33

Figura 6: Clasificación de los antioxidantes ...... 34

Figura 7: Principio del método DPPH ...... 38

Figura 8: Hojas de Menta spicata L. (Hierba buena) ...... 50 Figura 9: Hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) ...... 51 Figura 10: Pulverización de hojas de estudio ...... 52 Figura 11: Obtención de los extractos etanólicos por el método de extracción por Soxhlet ...... 53 Figura 12: Evaporación del solvente para la obtención del extracto fluido de 20 mL a Baño Maria a tempertura de 60° ...... 54 Figura 13: Procesamiento de muestras para la determinación de los fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu ...... 57 Figura 14: Procesamiento de muestras para la determinación de la capacidad antioxidante por el método de DPPH ...... 58 Figura 15: Identificación de alcaloides ...... 61 Figura 16: Identificación de taninos ...... 62 Figura 17: Identificación de saponinas ...... 63 Figura 18: Identificación de flavonoides ...... 64 Figura 19: Gráfico de calibración correspondiente a la concentración de Ácido Gálico versus la absorbancia...... 68 Figura 20: Gráfico de calibración para cuantificar la capacidad antioxidante. .. 73

XII

Figura 21: Método Folin-Ciocalteu ...... 96 Figura 22: Método DPPH...... 96

XIII

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1: Clasificación taxonómica de Chiri chiri ...... 92

Anexo 2: Clasificación taxonómica de Hierba buena ...... 93

Anexo 3: Peso de las hojas pulverizadas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) en balanza analítica ...... 94

Anexo 4: Obtención de los extractos etanólicos por el método de extracción por Soxhlet ...... 95

Anexo 5: Diluciones y muestras según métodos ...... 96

Anexo 7: Matriz Operacional ...... 97

XIV

INTRODUCCIÓN

Se sabe que el Perú al ser un país megadiverso posee diversas especies vegetales que podrían presentar actividad farmacológica; sin embargo, hasta la fecha existen muchas especies vegetales que aún no se han estudiado o hay escasa información sobre sus posibles efectos benéficos ya sea individual o en asociaciones (1). En la demarcación peruana se encuentran ecosistemas conocidos a nivel mundial por su extensa diversidad de especies como el mar frío de la Corriente Peruana; los bosques secos en la costa norte; la puna; la selva alta, y los bosques tropicales amazónicos, en donde la variedad de especies llega a su máxima expresión. Por esta gran variedad biológica, el Perú es conocido como uno de los 15 países de mega diversidad a nivel global, junto con Brasil, Colombia, Zaire, Madagascar, México y China, entre otros. Asimismo, es uno de los centros más sustanciales de recursos genéticos, conocidos como Centros de Vavilov, a nivel mundial, por el gran número de especies domesticadas originarias de esta parte del mundo (2).

Hoy en día, en el Perú y en el mundo, se utilizan Antiinflamatorios no Esteroideos (AINES) para el tratamiento de lesiones, contusiones, desgarros que a su vez van acompañados de relajantes musculares como el pridinol mesilato, que muchas veces presentan efectos secundarios no deseados (3). Desde la antigüedad, las poblaciones se valieron en el uso de diversas plantas para tratar enfermedades y en la actualidad dicha actividad se sigue dando por los resultados positivos que generan. Por otro lado, el uso de especies vegetales para tratar signos y síntomas, así como infecciones muchas veces se dan debido a que en zonas alejadas de la ciudad no hay acceso a medicamentos (4). En la actualidad, se están desarrollando estudios para evaluar los efectos de las diferentes plantas medicinales acorde al uso popular que se les atribuye, e investigando los principios activos responsables de una determinada acción farmacológica y los metabolitos secundarios que presentan (4). Por lo expuesto, es necesario realizar estudios en laboratorio para evaluar tanto el efecto farmacológico individual como en conjunto de diversas especies vegetales que

XV presenten propiedades farmacológicas similares, a fin de demostrar, si existe sinergismo entre ellas para potenciar un efecto dado.

XVI

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. Descripción de la realidad problemática

Las enfermedades degenerativas han despertado, en los últimos años, un gran interés científico en el área farmacológica, principalmente en virtud de la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en el desarrollo de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios (5).

Desarrollar investigación en temas relacionados a la inflamación es importante en todos los países, debido a que, es un proceso defensivo natural del sistema inmunológico que surge como respuesta al daño causado a sus células y tejidos vascularizados por agentes lesivos como traumatismos, necrosis, agentes químicos o físicos, o respuestas inmunitarias entre otros. En esencia, es una respuesta favorecedora que se da con el fin de aislar, contener la lesión, destruir al agente agresor y para que más adelante pueda preparar al tejido para su reparación, proceso que consta de cambios vasculares y celulares mediados por factores químicos que se manifiestan clínicamente (4,5).

Según el Instituto Nacional de Estadística e Informática (INEI) en todo lo que se refiere a la diversidad biológica, el Perú está entre los 17 países de mayor diversidad de la Tierra, razón por la cual es considerado “país megadiverso” por su diversidad de ecosistemas, de especies, de recursos genéticos y de culturas aborígenes con cognición resaltantes (6,7).

Por otro lado, en terreno de bosques es el segundo país en América Latina y el cuarto a nivel mundial, y posee el 13% de los bosques tropicales amazónicos. Razón por la cual el Perú posee una gran diversidad de especies vegetales que presentan usos

1 medicinales y muchas de ellas aún no son estudiadas, investigadas, ni identificadas científicamente (7).

2

1.2. Formulación del problema

1.2.1. Problema principal

- ¿Cuál es la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)?

1.2.2. Problemas secundarios

- ¿Cuáles son los componentes fitoquímicos presentes en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)?

- ¿Cuál es la concentración de fenoles totales de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)?

- ¿Cuál es la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) determinada por el método de DPPH?

3

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo general

- Determinar la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena). 1.3.2. Objetivos específicos

- Identificar los componentes fitoquímicos presentes en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

- Determinar la concentración de fenoles totales Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

- Evaluar la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) determinada por el método de DPPH.

4

1.4. Justificación del estudio

Las poblaciones antiguas se valieron del uso de diversas plantas para tratar enfermedades, en la actualidad, esta actividad se sigue dando por los resultados positivos que generan. Por otro lado, el uso de especies vegetales para tratar signos, síntomas e infecciones se da ya que el acceso a medicamentos en zonas alejadas es escaso (4).

El Perú es un país rico en diversidad de especies vegetales y se sabe que muchas de ellas fueron utilizadas desde la antigüedad por sus beneficios terapéuticos, lo que, justifica el realizar estudios científicos con relación a sus propiedades a fin de generar información sobre su actividad farmacológica y se busque identificar los metabolitos responsables de dichos beneficios (8). Es ese sentido, el tratamiento de diversos signos y síntomas de distintas patologías son tratados con medicamentos que contienen principios activos como es el caso de los AINES que son utilizados para el manejo del dolor, además de estos, existen otros fármacos que son utilizados y que podrían causar efectos adversos (9). El cual, no se presentaría cuando se utilizan plantas medicinales con estudios de toxicidad totalmente establecidos.

Por lo expuesto, es necesario realizar estudios en laboratorio para evaluar tanto el efecto farmacológico individual como en conjunto de diversas especies vegetales que presenten propiedades farmacológicas similares, con el fin de demostrar, si existe sinergismo entre ellas para potenciar un efecto dado.

Se sabe que Grindelia boliviana rusby y Mentha spicata L. presentan propiedades balsámicas, antinflamatorias, tónico estomacal, entre otras (6). Por lo expuesto en el presente proyecto se busca evaluar la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

5

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. Antecedentes investigativos

2.1.1. A nivel internacional

Hussain et al., (10) en el 2010, en su investigación titulada “Composición química y las actividades antioxidantes y antimicrobianas del aceite esencial aislado de partes aéreas de Mentha spicata L. (Menta verde)”, encontraron que el contenido de aceite era del 1.2%, e identificaron un total de 19 componentes químicos en el aceite de menta verde usando GC y GC / MS, siendo los componentes principales: carvona (51.7%) y cis-carveol (24.3%), seguidos de limoneno (5.3%), 1.8 cineol (4.0%), cis- dihidrocarvona (2.2%), acetato de carvilo (2.1%) e hidrato de cis-sabineno (1.0%). El aceite investigado exhibió una buena actividad antioxidante según la evaluación de la capacidad de eliminación de radicales libres del DPPH e inhibición de la oxidación del ácido linoleico. La actividad antimicrobiana del aceite de menta verde y sus componentes principales (cis-carveol y carvona) fue seguida por ensayos de difusión en disco y concentración mínima inhibitoria (CMI) contra cuatro cepas de bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pasturella multocida y cinco patógenos; hongos: Aspergillus niger, Mucor mucedo, Fusarium solani, Botryodiplodia theobromae y Rhizopus solani. Todos los microorganismos probados se vieron fuertemente afectados, lo que indica un potencial antimicrobiano apreciable del aceite de menta verde.

Snoussi et al., (11) en el 2015, en su investigación “Aceite Esencial de Mentha spicata L.: composición química, actividades antioxidantes y antibacterianas contra cultivos planctónicos y de biopelícula de Vibrio spp.”, identificaron 63 componentes químicos en el aceite de menta verde mediante GC / MS. Los componentes principales fueron carvona (40.8% ± 1.23%) y limoneno (20.8% ±

6

1.12%). También identificaron un gran potencial antimicrobiano y una alta potencia antioxidante, según cuatro pruebas diferentes en comparación con BHT (11).

Kannat et al., (12) en el 2007, investigaron la “Eficacia de las hojas de menta como antioxidante natural para la carne de cordero procesada por radiación”. El extracto de menta (ME) tuvo un buen contenido total de fenólicos y flavonoides, mostrando una excelente actividad antioxidante, medida por los ensayos de blanqueamiento de β-caroteno y 2.2-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). A su vez se identificaron una alta actividad de eliminación de superóxido e hidroxilo, pero baja capacidad de quelación del hierro. Encontraron una correlación positiva entre el poder reductor y la actividad antioxidante; que la actividad antioxidante de ME es comparable a la del antioxidante sintético, hidroxitolueno butilado (BHT). La idoneidad de la ME como antioxidante se determinó durante el procesamiento por radiación de la carne de cordero. ME retrasó la oxidación de lípidos, monitoreada como sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), en carne de cordero sometida a tratamiento por radiación. Los valores de TBARS de ME que contiene carne irradiada almacenada a temperaturas frías fueron significativamente más bajos (p <0.05) que las muestras sin ME. Después de 4 semanas de almacenamiento refrigerado, TBARS en la carne irradiada que contenía ME (0.1%) era la mitad que en la carne irradiada sin tratar (12).

Adam et al., (13) en 1998, en su estudio “Actividades antifúngicas de Origanum vulgare subsp. Hirtum, Mentha spicata L., Lavandula angustifolia y Salvia fruticosa, aceites esenciales contra hongos patógenos humanos”, exhibieron propiedades antifúngicas contra los patógenos humanos Malassezia furfur, Trichophyton rubrum y Trichosporon beigelii. De los cuatro aceites, O. vulgare subsp. El aceite de Hirtum mostró la mayor actividad fungicida en una dilución de 1/50000 provocó una reducción del 95% en el número de células metabólicamente activas dentro de las 6 h de exposición. Entre los componentes principales de los cuatro aceites, carvacrol y timol exhibieron los niveles más altos de actividad antifúngicas. La eficacia terapéutica de O. vulgare subsp. El aceite esencial de Hirtum se probó en ratas infectadas experimentalmente con T. rubrum y arrojó resultados prometedores. Además, los

7 aceites esenciales anteriores se probaron con la prueba de Ames y no mostraron ninguna actividad mutagénica (13).

Bimakr et al., (14) en el 2011, en su investigación titulada “Comparación de diferentes métodos de extracción de los principales compuestos flavonoides bioactivos de hojas de menta verde (Mentha spicata L.)” obtuvieron, diferentes compuestos como flavonoides bioactivos que incluyen catequina, epicatequina, rutina, miricetina, luteolina, apigenina y narigenina a partir de hojas de menta verde (Mentha spicata L.) mediante extracción convencional de soxhlet (CSE) y extracción de dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) en diferentes extracciones esquemas y parámetros. Los extractos de hojas de menta verde obtenidos por CSE y las condiciones óptimas de extracción de SC-CO2 se analizaron adicionalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para identificar y cuantificar el perfil de los principales compuestos flavonoides bioactivos. Se obtuvieron resultados comparables mediante condiciones óptimas de extracción de SC-CO2 (60 °C, 200 bar, 60 min) y extracción de soxhlet con etanol al 70%. Según lo revelado por los resultados, la extracción de soxhlet tuvo un rendimiento de extracto crudo mayor (257.67 mg/g) en comparación con la extracción de SC- CO2 (60.57 mg/g). También encontraron que el extracto de dióxido de carbono supercrítico (condición óptima) tiene más compuestos flavonoides principales (siete flavonoides bioactivos) con alta concentración en comparación con la extracción de soxhlet con etanol al 70% (cinco flavonoides bioactivos). Por tanto, la extracción de SC-CO2 se consideró un proceso alternativo al CSE para la obtención de los compuestos flavonoides bioactivos con alta concentración a partir de hojas de Hierba buena (14).

Chipana et al., (15) en el 2006, en su investigación detalla que, en Bolivia se recurre a la medicina tradicional por su alta diversidad cultural y biológica. El objetivo de Chipana fue documentar los conocimientos y usos de plantas medicinales identificando 105 especímenes, 94 identificadas hasta especie, 11 hasta género y 10 indeterminadas. El 47% corresponde a especies nativas y 41% a introducidas. Se registraron 31-40 familias de plantas con mayor número de especies en Asteraceae

8

(24%), Lamiaceae (11%), Solanaceae (7%), Fabaceae Papilionoideae y Brassicaceae (5%). Las especies de uso con mayor reiteración para el tratamiento de dolencias de hombres (con el 40%) y mujeres (con el 60%) y las especies con mayor valor de uso fueron Clinopodium bolivianum, Tripodanthus acutifolius y Baccharis latifolia, mientras que siete especies son exclusivas para los dolores femeninos. Así mismo reportaron el uso de cinco estructuras morfológicas para contrarrestar de 27-53 dolencias, como hojas (41.64%), tallos (29.34%), flores (15.56%), raíz (5.34%), frutos (3.1%) y toda la planta (4.8%) (15).

2.1.2. A nivel nacional

Cárdenas T., (16) en el 2014, estudió la actividad antiinflamatoria y analgésica de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), siendo el objetivo general determinar la acción Analgésica, antiinflamatoria de la infusión acuosa de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) en ratones albinos, utilizando el modelo biológico de edema de pata inducido por formol al 5% descrito por Winter en 1962 y posteriormente alterado para ratones por Sugishita en 1981 y la prueba del analgésimetro es el método descrito por Randall, para el cual se utilizó ratones albinos de 23 ± 2 g de peso aproximado los cuales fueron sometidos a un ayuno de 24 horas, que se le administrará por vía peritoneal la Aspirina 10 mg/Kg, Paracetamol 10 mg/Kg, indometacina 15 mg/Kg y 12.5 mg y 25 mg de extracto liofilizado de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri). Según los resultados que se obtuvieron y gracias a la evaluación de los diseños experimentales los porcentajes de inflamación, se determinó que la infusión de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) presentó efecto antiinflamatorio y analgésico in vivo a dosis de 12.5 mg y 25 mg con significancia estadística (p<0.05). La evaluación de la toxicidad de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), se determinó por medio de la dosis letal 50 (DL 50), utilizando 5 lotes de ratones albinos de peso aproximado de 23 ± 2 g, a los cuales por vía peritoneal a dosis única de 0.543 g/Kg, 1.086 g/kg y 2.17 g/Kg de peso corporal, evaluando las alteraciones o bien la muerte del ratón a la 1, 2, 4, 6, 24, 48 horas y un máximo de 5 días. Por último, se concluyó que el extracto a 0.543 mg/g presentan toxicidad y a mayor dosis la letalidad aumenta (16).

9

Zelada J., (17) en el 2019, demostró el efecto antibacteriano in vitro que posee el aceite esencial de hojas de Mentha spicata L. (Menta) frente a cepas de Staphylococcus aureus. Se trabajó con 28 placas con cultivos de las cepas divididas en 4 grupos: grupo control negativo (dimetilsulfóxido al 10%), grupo estándar farmacológico (Ciprofloxacino 5 μg/disco) y 2 grupos experimentales a concentraciones de 45% y 75% de aceite esencial de hojas de M. spicata. La cantidad administrada fue de 25 μL de aceite esencial. El efecto antibacteriano se evaluó mediante el método de Kirby Bauer. Las medidas de los halos de inhibición para el aceite esencial al 45% fue 17.06 ± 0.25 mm; al 75% fue de 23.90 ± 0.31 mm; para el control estándar (ciprofloxacino) fue de 22.06 ± 0.39 mm, diferenciándose entre ellos significativamente según la prueba ANOVA (P<0.05). Según la prueba de T-Student al comparar el efecto antibacteriano del aceite esencial de hojas de Menta spicata al 45% con Ciprofloxacino si presentó distinción alguna; en tanto que el efecto antibacteriano del aceite esencial al 75% comparado con Ciprofloxacino no difiere significativamente. Se concluye que el aceite esencial de las hojas de Mentha spicata L. sí tiene efecto antibacteriano in vitro frente a cepas de Staphylococcus aureus. Presentando un efecto similar al ciprofloxacino cuando el aceite esencial se encuentra al 75% (17).

Cervantes y Berrios, (18) en el 2018, en su trabajo cuyo objetivo fue “evaluar el efecto cicatrizante de las hojas de la planta Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), de las preparaciones en aceite esencial, extracto alcohólico y extracto acuoso, originaria del sur andino recolectada del distrito Héroes Albarracín-Tarata y del distrito Pocollay-Tacna”. Material y Método: Estudio experimental, comparativo, prospectivo y transversal. Se usaron Ratas albinas “Rattus norvegicus” variedad Sprague Dawley de seis meses de edad. El tamaño de muestra fue 30 especímenes distribuidos en: 6 para el pre-ensayo y 24 para el experimento. Resultados: La aplicación de la planta Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), en aceite esencial y extracto alcohólico y acuoso, aplicado en forma de gel obtuvo mayor efecto cicatrizante sobre las heridas producidas en ratas; y el tiempo de cicatrización de las heridas dérmicas causadas en Rattus

10 norvegicus fue de veinte días para el grupo sin tratamiento, 17 días para el grupo tratamiento con extracto acuoso y un promedio de quince días para el grupo tratamiento con extracto alcohólico y aceites esenciales de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri).Se concluye que, la Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) tiene mayor efecto cicatrizante sobre las heridas y los tratamientos que más favorecen la cicatrización son las dos formas de extracto alcohólico y aceite esencial (18).

2.1.3. A nivel local

Flores y Chara, (19) en el 2019, determinaron el efecto antiinflamatorio tópico del extracto y gel de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri) en animales de experimentación. Se obtuvo dos extractos de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri) mediante el método de extracción por Soxhlet, estos dos extractos tuvieron las siguientes concentraciones al 30% y 50%. Se identificó los principales grupos de metabolitos secundarios que se encontraban en el extracto de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri) mediante el método de cromatografía en capa fina, detectando la presencia de terpenos, esteroles, saponinas, triterpenos, flavonoides, taninos y alcaloides, Se elaboró dos geles con el extracto de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri), usando como base el gel de carbopol, estos geles fueron uno al 15% y otro al 30% se evaluó el efecto antiinflamatorio tópico del extracto y del gel de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri) mediante el método de inducción de edema inflamatorio con carragenina. Se comparó el efecto antiinflamatorio tópico del extracto y gel de las hojas de Grindelia glutinosa (Chiri chiri) con gel diclofenaco al 1%, el estudio estadístico de análisis de Varianza y la Prueba de Múltiples Rangos, determinó que el grupo tratado con un gel con extracto de (Chiri chiri) al 30% es el grupo de mayor eficacia con 41.77%, en comparación con el diclofenaco 1% de 45.42%.

Alfaro et al., (20) en el 2018, evaluaron la actividad antinflamatoria de los extractos en gel de Baccharis genistelloides Pers. y Grindelia boliviana rusby. en animales de experimentación, mediante dos etapas, una que determinó la concentración de los extractos de ambas drogas en gel y otra segunda, que evaluó las

11 asociaciones de estos extractos en forma de gel farmacéutico, se obtuvieron extractos fluidos de Baccharis genistelloides Pers. y Grindelia boliviana rusby. Mediante destilación en equipo Soxhlet utilizando alcohol etílico como disolvente, la concentración del extracto fluido fue de (1:2). Se llevó a cabo un análisis fitoquímico preliminar a los extractos fluidos de Baccharis genistelloides Pers. y Grindelia boliviana rusby, detectándose para el primer extracto la presencia de terpenos, saponinas, esteroles, flavonoides y taninos, para el segundo extracto se detectó los mismos grupos de compuestos con la diferencia de mayor ocurrencia de manchas, se formularon geles para la incorporación de los extractos fluidos de Baccharis genistelloides Pers. y Grindelia boliviana rusby, utilizando como base el gel de carbopol al que se incorporó 10 y 30% de los extractos como monodroga, y asociaciones de ambos, una denominada Asociación 1 al 40% (10% de Grindelia boliviana rusby + 30% de Baccharis genistelloides Pers) y otra Asociación 0.5 al 20% (5% de Grindelia boliviana rusby + 15% de Baccharis genistelloides Pers). Se determinó la concentración eficaz de los extractos fluidos de ambas drogas incorporadas al gel frente a un grupo control al que se le administró solo la base del gel, para Baccharis genistelloides Pers. Fue del 30% y de Grindelia boliviana rusby al 10%, se evaluó las asociaciones de los extractos fluidos de Baccharis genistelloides Pers. y de Grindelia boliviana rusby, además de un grupo farmacológico, concluyéndose a un grado de certeza del 95% y por una significancia menor a 0.05, que de los cuatro grupos experimentales con drogas (gel con extracto fluido de Grindelia boliviana rusby al 10%, grupo con extracto fluido de Baccharis genistelloides Pers al 30%, grupo Asociación 1, grupo Asociación 0.5), el grupo tratado con la asociación 1 (30% de extracto fluido de Baccharis genistelloides L. y 10% de extracto fluido de Grindelia boliviana rusby), fue el de mayor eficacia antiinflamatoria, y al ser su efecto mayor a las monodrogas, se alega que tendría un sinergismo farmacológico.

Condori et al., (21) en el 2018, evaluaron el efecto antiinflamatorio tópico del gel a base del extracto de las hojas de Mentha spicata L. (Hierba buena) en edema plantar inducido en animales de experimentación, obteniendo extractos etanólicos al 70%, por los métodos extractivos de soxhlet y maceración obteniendo rendimientos

12 de 21.09 % y 32.60 % respectivamente. Por otra parte, se distinguieron taninos y flavonoides por cromatografía en capa fina, teniendo mayor cantidad de compuestos en el extracto realizado por maceración. Los extractos procedentes de la extracción por soxhlet y maceración lograron disminuir la inflamación en un estudio piloto hasta un 59.57 % y 93.91 % respectivamente, siendo el macerado el que tuvo un mayor efecto antiinflamatorio. Después de realizar la etapa piloto se formuló y evaluó geles de 10 %, 20 % y 30 % del extracto de maceración ya que se cuantificó mayor porcentaje de utilidad y logró reducir la inflamación. Los geles nombrados disminuyen la inflamación hasta un 56.25 %, 58.28 % y 64.91 % respectivamente en la etapa experimental, en este análisis no se halló alguna variedad significativa entre geles, por otro lado, los geles del 20 % y 30 % lograron obtener hallazgos casi iguales a los obtenido al diclofenaco de 68.70 % hallando la falta de diferencia significativa según la prueba de Tukey.

2.2. Base teórica

2.2.1. Mentha spicata L. (Hierba buena)

A. Descripción

Es una hierba aromática perenne, con tallo rastrero cuadrangular, pubescente, 1 m de altura. Tiene hojas verdes brillante, sin peciolo, elíptico-oblongas, lanceoladas, ápice puntiagudo, 3 – 8 cm de largo, dentadas. Inflorescencias delgadas, flores funeliformes, 4 lóbulos, lavanda o rosada, brácteas delgadas, al final de las ramas. Presenta 4 semillas, aunque la mayoría son abortadas (22).

El origen de esta planta es desconocido posiblemente es europeo, ampliamente naturalizada en lugares soleados, húmedos y templados de Europa y Norte América de 1500 – 2700 msnm. Cultivada en el Altiplano central en huertos y jardines familiares. Planta domesticada desde épocas remotas, su propagación y conservación es fácil,

13 aunque su entrecruzamiento es muy frecuente, por lo que es difícil conservar especies puras. Requiere suelo profundo, humífero y clima templado.

Se propaga por estolones, su crecimiento es rápido, se hacen dos cortes al año. Las hojas se colectan al máximo follaje antes de la floración, se separan del tallo y se secan a la sombra a no más de 35 º C (22).

Figura 1: Mentha spicata L. (Hierba buena)

Fuente: Mariño L. (23).

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B. Taxonomía

Tabla 1: Clasificación taxonómica

División Magnoliophyta

Clases Magnoliopsida

Sub clase Asteridae

Orden Lámiales

Familia Lamiaceae

Género Mentha L

Especie Mentha spicata L., Mentha viridis L

Fuente: Condori y Quispe (21).

C. Composición química

Los polifenoles totales en las hojas de Mentha spicata L. (Hierba buena) son de aproximadamente 19 - 23% dentro de este porcentaje se encuentra 59 - 67 % eriocitrina y ácido rosmarínico, 7 - 12 % luteolina 7-O-rutinósido, 6 - 10 % hesperidina, Ácido Cafeico y Ácido Gálico (24).

Flavonoides 12% que está compuesta de apigenina, rutina, catequina, epicatequina, miricetina, luteolina y diosmetina (24).

Aceite esencial 0,5 - 1%. Este está compuesto de L-carvona (50 – 70%), Llimoneno (13 – 20%), felandreno, α-y β-pineno (2 – 5%), δ-pineno, mentol 35 - 45%, mentona 15-20%, acetato de metilo 3 - 5%, isomentona 2 - 3%, cineol (2 – 4%) (24).

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D. Uso medicinal

Se sabe que la planta está dotada de una variedad de propiedades biológicas debido a su alto contenido de metabolitos secundarios (25). Se descubrió que era antialérgica (26), antioxidante (27), antiplaquetaria (28), anticitotóxico (29) y quimiopreventivo (30), además también posee actividad antimutagénico. Recientemente, encontramos que Mentha spicata L. contiene potente actividad antioxidante, carminativa, antiespasmódica, antiséptica, estimulantes, antifúngicas, eupépticas, colagogo, antiemético, espasmolítico, antipruriginoso, colerético, analgésico, energética, antiinflamatorio y vasodilatador para tratar enfermedades respiratorias (31).

Tópicamente se emplean en cataplasma y compresas para tratar abscesos, reumatismo y tumores; en baños para desodorizar los pies, lavar heridas y raspones. La decocción de hojas se aplica en cataplasmas y baños para tratar cáncer, endurecimientos, tumores y úlceras (32).

Las hojas frescas se emplean para condimentar ensaladas y el extracto para saborizar chicles y caramelos (33).

2.2.2. Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri)

A. Descripción

Arbusto perenne de aproximadamente un metro de altura. El tallo puede tener la base algo lignificada, pero lo más frecuente es que tenga consistencia herbácea (34,35).

Las hojas son sésiles, de forma triangular, terminadas en punta, de borde dentado y consistencia coriácea. Las flores, de color amarillo anaranjado y aspecto semejante al de la Margarita crecen en la extremidad de los tallos. Las flores de la Grindelia boliviana rusby tienen propiedades balsámicas, antinflamatorias, tónico estomacal y tónico cardíaco. La forma más frecuente de uso es como infusión, a razón de 10 g. de flores por litro de agua. Dosis recomendada: dos o tres tazas al día. También se puede

16 elaborar una tintura, así como jarabes. Para el uso de manera externa, se suministra de manera de cataplasma de flores machacadas ya que tiene propiedades calmantes y antinflamatorias en casos de irritación de piel (34,35).

Contusiones/inflamaciones: parche de las hojas y flores; vulneraria: se mastican las hojas; asma: calma los ataques de tos asmática (infusión de la flor); bronquitis: ingerir la infusión de las flores y frutos (36).

El género Grindelia abarca unas 70 especies americanas, de las cuales 45 se encuentran en América del norte y las otras 25 especies se pueden encontrar en la porción Austral de América del Sur. La flora peruana alberga innumerables especies vegetales con propiedades curativas, entre las que se encuentran plantas con efecto antinflamatorio. Resalta entre estas la especie Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), planta herbácea, silvestre altoandina que crece como mala hierba y de la cual se conocen varios nombres comunes entre los que destacan: Chiri, Kiri, Papaya papaya, Carahua (de origen aymara), flor de chiri y árnica puneña, es autóctona del sur y los Andes del Perú, a la que se le atribuye propiedades antiinflamatorias, antirreumáticas, antitusivas, antiasmáticas, entre otras (24).

Frecuentemente es empleada en parches de hojas para el tratamiento de artritis y para calmar las dolencias musculares, y asociados a golpes, también se usa de manera tópica en afecciones a los huesos, contusiones, dislocaduras, luxaciones, torceduras, fracturas, desgarro de tendones y músculo, dolores reumáticos y alergias a la piel; existen algunas referencias de uso en hemorragias internas, inflamación del hígado, afecciones de las vías respiratorias, vías urinarias, asma y tratamiento de tuberculosis.

Es necesario señalar que se han hallado algunos reportes sobre estudios botánicos y fitoquímicos preliminares de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri), pero casi nada sobre estudios farmacológicos (37,38).

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Figura 2: Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) Fuente: Tola (39).

B. Taxonomía

Tabla 2: Clasificación taxonómica

División Magnoliophyta

Clases Magnoliopsida

Sub clase Asteridae

Orden Asteranae

Familia Asterales

Género Grindelia

Especie Grindelia boliviana rusby

Fuente: Choquenaira y Perea (40).

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C. Composición química

Esta planta tiene compuestos fenólicos, flavonoides y en moderada cantidad azúcares reductores, no presentan alcaloides, taninos, saponinas, quinonas y lactonas. A la presencia de flavonoides y compuestos fenólicos se le atribuye la actividad anti micobacteriana (21), flavonoides, aminoácidos, cardenólidos y alcaloides (41).

D. Uso medicinal

Frecuentemente es usada como emplastos de hojas, para el tratamiento de artritis y para calmar dolores musculares y asociados a golpes, también se usa en forma tópica en afecciones de los huesos, contusiones, dislocaduras, luxaciones, torceduras, fracturas, desgarro de tendones y músculos, dolores reumáticos y alergias a la piel; algunas referencias de uso en hemorragias internas, inflamación del hígado, afecciones de las vías respiratorias, para la vía interna es utilizada la masticación de las hojas en forma idéntica a la coca en afecciones broncopulmonares como resolutivo y expectorante afecciones urinarias, asma y tratamiento de la tuberculosis (42,43).

2.2.3. Compuestos fenólicos

El término compuestos fenólicos engloba a todas aquellas sustancias que poseen varias funciones fenol, nombre popular del hidroxibenceno, unido a estructuras aromáticas o alifáticas. Solo algunos de los compuestos fenólicos de la familia de los ácidos fenoles no son polifenoles, sino monofenoles (44).

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Se localizan en todas las partes de las plantas y su concentración es variable a lo largo del ciclo vegetativo. Estos compuestos son responsables de varias funciones, tales como la asimilación de nutrientes, la síntesis proteica, la actividad enzimática, la fotosíntesis, la elaboración de componentes estructurales, la alelopatía y de defensa ante los factores adversos del ambiente (45).

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Los polifenoles compuestos presentes en la naturaleza que poseen anillos aromáticos con sustituyentes hidroxilos. Estos compuestos son en su mayoría poderosos antioxidantes por su estructura química (donador de H+ o electrones) vitales para el funcionamiento de las células vegetales; que se encuentran en frutas y verduras, por ejemplo, manzanas y cebollas, y en bebidas como té y vino (46).

Según Muñoz et al. (47) Los compuestos fenólicos son metabolitos necesarios para el crecimiento y reproducción de las plantas y actúan como agentes defensores frente a patógenos, siendo secretados como mecanismo de protección a condiciones de estrés, tales como infecciones, radiaciones ultravioletas (UV), entre otros.

Esta síntesis se da a partir de fenilalanina por la vía del shikimato. Juegan un rol vital en las plantas y regulan el metabolismo y síntesis de la lignina, por lo que las plantas presentan un gran número de componentes fenólicos (flavonoles, chalconas, flavonas, flavononas, isoflavonas, taninos, estilbenos, curcuminoides, ácidos fenólicos, coumarinas, lignanos,etc). Los compuestos fenólicos poseen una estructura ideal para eliminar radicales libres, estudios in vitro han revelado que los fenoles son antioxidantes más efectivos que tocoferol y el ácido ascórbico (48).

Los compuestos fenólicos están asociados al color, las características sensoriales (sabor, astringencia, dureza), las características nutritivas y las propiedades antioxidantes de los alimentos de origen vegetal. Sus características antioxidantes se deben a la reactividad del grupo fenol (44). Existe una gran variedad de fenoles ácidos distribuidos en productos de origen vegetal con efectos beneficiosos a la salud. Ellos pueden disminuir el riesgo de enfermedades cardiovasculares y desarrollo de tumores y cáncer (49).

A. Clasificación de los compuestos fenólicos

La naturaleza de los compuestos fenólicos varía desde moléculas simples como los ácidos fenólicos hasta los compuestos altamente polimerizados (44). Así los

20 compuestos fenólicos van desde moléculas simples como los ácidos benzoicos hasta polímeros complejos como los taninos condensados. Cada una de las familias agrupa un número de compuestos fenólicos más o menos diversos, siendo la familia de los flavonoides, con cerca de 4000 estructuras diferentes una de las más estudiadas (50). Los compuestos fenólicos pueden ser clasificados de diferentes formas. Harbone y Simmonds en 1964 los clasificaron según el número de carbono en sus moléculas (51).

Tabla 3: Clasificación según el número de carbono en sus moléculas

Estructura Clase

C6 Fenólicos simple

C6-C1 Ácidos fenólicos y compuestos relacionados

C6-C2 Acetofenonas y ácidos fenilacéticos

C6-C3 Acido cinámico, cinamil aldehído, alcoholes cinamílicos

C6-C3 Cumarinas, isocumarinas y cromonas

C15 Chalconas, auronas, dihidrochalconas

C15 Flavanos

C15 Flavonas

C15 Flavononas

C15 Flavonoles

C15 Antocianidinas

C15 Antocianinas

C30 Biflavonilas

C6-C1-C6, C6-C2-C6 Benzofenonas, xantonas, estilbenos

C6, C10, C14 Quinonas

C18 Betacianinas Lignanos, neolignanos Dímeros u oligómeros Lignina Polímeros Taninos Oligómeros o polímeros Flobáfenos Polímeros

Fuente: Tomado de Grotewold (51).

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B. Flavonoides

Son pigmentos amarillos próximos químicamente a los taninos, son derivados polihidroxilados de las estructuras básicas del 2-fenilcromano que se usan contra la fragilidad de los capilares, protegen frente a estados tóxicos, antiinflamatorios y colorantes, combaten alergias, agregados plaquetarios, radicales libres, microbios, virus, tumores, hipertensión, protegen el sistema circulatorio. Disminuyen el peligro de varios tipos de cáncer y algunos trastornos de la vista. Los flavonoides propiamente dichos pueden ser clasificados de acuerdo con el estado de oxidación del anillo de pirano central en al menos 12 grupos como flavonas, flavonoles, flavanonas, dihidroflavonoles, flavan-3-oles, flavan-3-dioles, chalconas, auronas y antocianidinas (52).

C. Taninos

Son un tipo de compuestos fenólicos poliméricos que tienen la capacidad de unirse a las proteínas para desnaturalizarla. El término tanino deriva de la antigua práctica de usar extractos de origen vegetal para convertir la piel animal en cuero (unión al colágeno, aumenta su resistencia al agua, calor y a microorganismos). Se usa el tanino como reactivo químico, y en medicina como astringente y como contraveneno (52). Los taninos, son sustancias de alto peso molecular, complejos polímeros de ácidos fenólicos, algunos contienen además azúcares. Tenemos dos tipos de categorías: taninos condensados y los hidrolizables (53).

D. Saponinas

Son heterósidos (azúcar + aglicón) que se caracteriza por su capacidad para producir espuma cuando se agita una solución acuosa que las contiene. La formación de espuma se debe a que las saponinas disminuyen la tensión superficial del agua (son por lo tanto tensioactivos naturales). Debido a esta propiedad, a las plantas que las contienen se les usa como jabón. Se clasifican como esteroidales o triterpénicos,

22 dependiendo de la naturaleza de la aglicona. Las saponinas por hidrólisis ácida o enzimática dan origen a una sustancia libre de los azúcares, formando así la sapogenina (54).

E. Alcaloide

Son el grupo más extenso de metabolitos secundarios, aunque se reporta, que algunos intervienen como reguladores del crecimiento, repelentes o atrayentes de insectos; aproximadamente el 80 % de las plantas no contienen alcaloides lo que hace suponer que no son vitales para las plantas.

Por su acción farmacológica son conocidas como antiespasmódicas, estimulantes, analgésicas, sedantes, hipnóticas, eméticas, relajantes musculares, etc. (55).

2.2.4. Radicales libres

Desde el punto de vista químico los radicales libres son átomos que poseen uno o más electrones no apareados girando en sus órbitas externas. Esta condición químicamente muy voluble, lo vuelve muy activo ya que el electrón impar busca otro electrón para salir del desequilibrio atómico. Para esto quita un electrón a la molécula más próxima, es decir, “oxidando" la molécula, modificando su estructura y transformándola a su vez en otro radical libre deseoso por atraer un electrón, produce así una reacción en cadena que dañará muchas células y puede ser indeterminado si un agente antioxidante no interviene (56).

Desde el punto de vista molecular son diminutas moléculas que están presentes al mismo tiempo en todas partes y además difusibles que se generan por diferentes mecanismos entre los que se encuentran la cadena respiratoria mitocondrial, la cadena de transporte de electrones a nivel microsomal y en los cloroplastos, y las reacciones de oxidación, por lo que producen daño celular (oxidativo), al interactuar con las principales biomoléculas del organismo (57).

23

Sin embargo, lo expresado anteriormente, los radicales libres del oxígeno poseen una función fisiológica en el organismo como la de participar en la fagocitosis, mejorar la síntesis de colágeno, mejora la síntesis de prostaglandinas, activan enzimas de la membrana celular, reduce la síntesis de catecolaminas por las glándulas suprarrenales, alteran la biomembrana y favorecen la quimiotaxis (57).

Hay un vocablo que abarca a los radicales libres y a otras especies no radicalarias, pero que son participes en reacciones que llevan a la elevación de los agentes prooxidantes y son las especies reactivas del oxígeno (ERO) (58).

Las principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son:

- Radical hidroxilo (OH).

- Peróxido de hidrógeno (H2O2)

- Anión superóxido (O2-) 1 - Oxígeno singlete ( O 2) - Peróxido (ROO) - Semiquinona (Q)

- Ozono (O3)

2.2.5. Especies reactivas del oxígeno (ERO)

Las ERO son radicales libres (RL) o precursores de radicales, esto se puede explicar mediante los orbitales moleculares, en donde los electrones giran en pares con un espín particular. A esto se le llama máxima estabilidad natural; por ello, si hay electrones desapareados en un orbital, se generan especies moleculares altamente reactivas que suelen quitar un electrón de cualquier otro átomo para compensar su deficiencia electrónica. El oxígeno, es el principal radical libre, ya que él tiene dos electrones desapareados., al mismo tiempo que involucra un riesgo enorme gracias a las características paramagnéticas de este gas, que se hace responsable de la elaboración de intermediarios parcialmente reducidos y dotados de una alta reactividad

24 conocidas como “Especies Reactivas de Oxígeno” (ERO) o (ROS). Entre las especies reactivas de oxígeno como anteriormente se mencionó se encuentran los radicales libres (RL) que poseen alta capacidad (59).

A. Origen de las especies reactivas del oxígeno (ERO)

Las ERO tienen un origen tanto endógeno, como exógeno. Entre las fuentes endógenas destacan:

- La cadena respiratoria, donde la reducción monovalente de la molécula de oxígeno da lugar al desarrollo de la mayoría de las especies reactivas del oxígeno (ROS).

- Las células fagocitarias (neutrófilos, monocitos o macrófagos), utilizan el sistema de la NADPH oxidasa generando directamente al ion superóxido (O2). Por otra parte, como mecanismo de defensa, dichas células también generan óxido de nitrógeno (NO), por acción de la óxido-nítricosintasa sobre la arginina intracelular. La - mezcla del O2 con el NO da lugar a la formación del ONOO capaz de inducir peroxidación lipídica en las lipoproteínas (60).

- La autooxidación de compuestos de carbono tales como aminoácidos, proteínas, lípidos, glicósidos y ácidos nucleicos dan lugar también a la formación de estos radicales.

- La activación catalítica de diversas enzimas del metabolismo intermediario como la hipoxantina, xantina oxidasa, aldehído oxidasa, monoamino oxidasa y ciclooxigenasa, lipoxigenasa, son fuentes representativas de esta producción.

Las fuentes exógenas de radicales libres pueden ser: Ambientales. Radiación electromagnética, luz solar, ozono, tabaco, etc. Farmacológicas. Xenobióticos, drogas, etc. Nutricionales. Contaminantes, aditivos, pesticidas, etc. (60).

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2.2.6. Estrés oxidativo (OS)

El estrés oxidativo se da en los organismos que por mala nutrición, enfermedad u otros factores pierden el equilibrio entre radicales libres y antioxidantes, es en ese momento de estrés oxidativo en la que se muestran las lesiones que producen los radicales libres, que reaccionan químicamente con lípidos, proteínas, carbohidratos y ADN al interior de las células y con componentes de la matriz extracelular, ya que esto puede causar un agravio irreversible que si se extiende demasiado, puede hacer que la celular muera (60).

Figura 3: Papel del estrés oxidativo en la carcinogénesis

Fuente: Bernal y Tunqui 2019 (61).

Entre las principales enfermedades o procesos asociados al daño oxidativo en las moléculas biológicas se tienen:

A. Desórdenes neurológicos

La evidencia concluyente sugiere que el estrés oxidativo es uno de los principales contribuyentes a la fisiopatología de una diversidad de enfermedades

26 neurodegenerativas, como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington, la discinesia tardía, la epilepsia y las enfermedades agudas del sistema nervioso central, como las lesiones de la médula espinal y/o trauma cerebral.

B. Envejecimiento

Peroxidación de los ácidos grasos de la membrana celular y daño del ADN.

C. Arterioesclerosis

Peroxidación de lípidos en las partículas de LDL con daño de otros componentes.

D. Cáncer

Daño del ADN.

E. Cataratas

Modificaciones irreversibles en las proteínas.

F. Cuadros inflamatorios crónicos

Activación de genes relacionados con la respuesta inflamatoria.

G. Infecciones

•- Los efectos patológicos de NO y O2 en la infección por virus están en claro contraste con sus efectos antimicrobianos beneficiosos en infecciones bacterianas y fúngicas. En las infecciones por virus, NO y ONOO-, causan daño oxidativo inespecífico en el tejido infectado por el virus, el cual produce varios eventos patológicos. Se ha informado estrés oxidativo inducido por virus durante las infecciones con el virus de

27 inmunodeficiencia humana, el virus de la influenza, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus del dengue y otros. El virus de la influenza es probablemente la homeostasis redox moduladora de patógenos mejor caracterizada. La elaboración de ROS causada por la gripe se ha asociado con respuestas inmunitarias e inflamatorias del huésped, así como con la modulación de la replicación viral. Los radicales de oxígeno y sus derivados son reconocidos como mediadores principales de la lesión pulmonar inducida por el virus de la influenza (61).

Como consecuencia el daño Oxidativo a biomoléculas ocurre por la presencia de radicales libres, muchas de las ERO actúan como oxidantes biológicos, pero el O2 es el mayor reductor la simple adición de un protón da lugar a la formación de HO2, convirtiéndose este en un agente oxidante muy activo. Estas transformaciones se resumen de la siguiente forma:

Tabla 4: Transformaciones de formación de H2O2 y O2

- - + O2 + HO2 + H → H2O2 + O2

- - HO2 + HO2 → H2O2 + O2

- - + O2 + O2 + 2H → H2O2 + O2

Fuente: Trejo Márquez (60).

Según, Trejo Márquez Andrea (60), en las reacciones 1.1, 1.2 y 1.3, se muestra las transformaciones de formación de H2O2, y O2, en donde se muestra el poder oxidante y actividad de la especie HO2 del radical superóxido. Las especies reactivas del oxígeno producen acciones diversas sobre el metabolismo en la elaboración del estrés oxidativo, que pueden ser el origen del daño celular sobre ciertos sustratos y moléculas:

28

- Sobre los lípidos poliinsaturados de las membranas produciendo pérdida de fluidez y lisis celular como consecuencia de la peroxidación lipídica (PL).

- Sobre los glicósidos, actúan modificando las funciones celulares tales como las asociadas a la actividad de las interleucinas y la elaboración de prostaglandinas, hormonas y neurotransmisores.

- Sobre las proteínas produciendo inactivación y desnaturalización.

- Sobre los ácidos nucleicos mediante la modificación de bases produciendo mutagénesis y carcinogénesis.

De esta forma los radicales libres ayudan mayormente al proceso del envejecimiento cuando toman el electrón que les hace falta de las células del tejido colágeno de la piel, dando como consecuencia, que la piel pierda su elasticidad al dañarse las fibras elásticas y la aparición precoz de arrugas y sequedad (56).

2.2.7. Antioxidantes

Los antioxidantes son sustancias que presentes en bajas concentraciones respecto a las de un sustrato oxidable (biomoléculas), retardan o previenen la oxidación. Al interactuar con el radical libre, el antioxidante cede un electrón, se oxida y se transforma en un radical libre no tóxico y débil (56).

A. Principales características de los antioxidantes

Los antioxidantes se caracterizan por ser muy heterogéneos puede ser hidrosolubles y liposolubles, localizarse intra y extracelularmente y proceder de diferentes fuentes ya que algunos son nutrientes o proceden de éstos y otros son productos del metabolismo (62). Entre estos mecanismos se evidencia la acción de los antioxidantes y su forma de actuar en los procesos del estrés oxidativo, lo cual se menciona a continuación:

- Previniendo la elaboración de las especies reactivas del oxígeno.

29

- Interceptando el ataque de las especies reactivas del oxígeno.

- Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menos reactivas.

- Facilitando la reparación del daño causado por las especies reactivas del oxígeno.

- Manteniendo un ambiente beneficioso para la actuación de otros antioxidantes.

- Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de las especies reactivas del oxígeno.

B. Función de los antioxidantes

En el organismo humano los radicales libres están regulados por un amplio espectro de antioxidantes de origen endógeno (enzimas antioxidantes, glutatión, albúmina, transferrina, ácido úrico, bilirrubina) y exógenos a través de la dieta (vitamina E y C, carotenoides, selenio, compuestos fenólicos). Entre los componentes del sistema antioxidante endógeno tienen mayor relevancia las enzimas antioxidantes: catalasa, superóxido dismutasa (SOD) y glucosa fosfato deshidrogenasa. La SOD es una enzima distribuida en todo el organismo. Hay dos tipos intracelulares de SOD: la que está presente en la mitocondria, que contiene manganeso en su centro activo (Mn- SOD) y la del citosol, que tiene iones de cobre y zinc (Cu-Zn-SOD). La Catalasa es una enzima intracelular que se localiza en el interior de los glóbulos rojos (62). El equilibrio entre la actividad de la Catalasa respecto de SOD es fundamental para mantener el balance reacciones de oxidación-reducción (REDOX). La enzima glutatión peroxidasa (GPx), es un complejo enzimático, existen cuatro formas diferentes de esta enzima y todas ellas tienen selenio en su centro activo.

Cuando la agresión supera las defensas se habla de estrés oxidativo, es decir, el balance oxidativo entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes se rompe. Si esto ocurre las especies reactivas generadas pueden iniciar procesos

30 patológicos graves como diabetes, cáncer, enfermedades cardiovasculares, envejecimiento (62). Tanto los antioxidantes naturales y sintéticos son ampliamente utilizados en la medicina moderna. Algunos demostraron para ser eficiente geroprotectores, que extiende la vida de animales de laboratorio cuando se añade a alimentos o agua potable sobre una base regular. In vitro, antioxidantes inhiben reacciones de oxidación de cadena de radicales libres, dando por resultado la oxidación de ácidos grasos, grasas comestibles, etc. Sin embargo, su eficacia como carroñeros de los radicales libres de oxígeno en los tejidos y células es insignificante en comparación con las enzimas antioxidantes naturales. De tal manera este compuesto antioxidante previene la oxidación de otras sustancias químicas, protegiendo los componentes clave de la célula mediante la neutralización de los efectos dañinos de los radicales libres, lo cual se puede observar en la Figura 4, que se llevan a cabo como consecuencia del estrés oxidativo (OS) inducido por ERO, el cual ocasiona un desequilibrio dinámico entre las cantidades de radicales libres generados en el cuerpo.

Los niveles del consumo de antioxidantes son importantes para calmar o limpiar y proteger el cuerpo contra los efectos deletéreos, como son las cantidades excesivas de ERO que pueden ser perjudiciales, porque pueden iniciar dos oxidaciones bimoleculares que conducen a lesión de la célula y la muerte y crean estrés oxidativo que provoca numerosas enfermedades y trastornos tales como son el envejecimiento, cáncer ateroesclerosis, cirrosis y cataratas. Ha habido un creciente interés considerable para identificar nuevas fuentes de antioxidantes seguro y de bajo costo y el potencial antimicrobiano de origen natural. Los radicales libres se forman cuando el oxígeno es metabolizado o formado en el cuerpo y son especies químicas que tienen un electrón desapareado en la cáscara externa (bastidor) de la molécula. Esta es la razón por qué los radicales libres son altamente reactivos y puede tener algún tipo de reacción con las proteínas, los lípidos, carbohidratos y ADN. (63). Así pues, el papel fundamental que despeñan los compuestos antioxidantes para combatir la producción y el daño es muy importante en el organismo humano.

31

Figura 4: Los radicales libres y otros reactantes enzimáticamente se eliminan de las células por una serie de enzimas antioxidantes.

Fuente: Emad A. Shalaby, et al. (63).

En el mecanismo de formación de los radicales libres se sabe que estos atacan a las moléculas estables más cercanas, robándoles un electrón. Cuando la molécula atacada pierde su electrón, se convierte en un radical libre, comenzando una reacción en cadena, finalmente dando por resultado la descripción de una célula viva pueden ser radicales libres derivados del oxígeno (ROS, especies reactivas de oxígeno) o derivados del nitrógeno (RNS, especies de nitrógeno reactivo). Las moléculas - derivadas del oxígeno son O 2 (superóxido), HO (hidroxilo), HO2 (hidroperoxilo), ROO.

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(Radical), RO (alcoxilo) como los radicales libres y oxígeno de H2O2 no radical. Especies de oxidantes derivados de nitrógeno son principalmente NO. – (óxido nítrico),

ONOO. – (peroxi Nitrato), NO2 (dióxido de nitrógeno) y N2O3 (trióxido de dinitrogen) como se muestra en la Figura 5. En una célula normal, hay oxidantes apropiados que mantienen un equilibrio antioxidante. Sin embargo, este equilibrio puede ser cambiado de puesto, cuando se incrementa la elaboración de especies de oxígeno o cuando se disminuyen los niveles de antioxidantes. Como resultado del estrés oxidativo se producen daños a los biopolímeros, como los ácidos nucleicos, proteínas, ácidos grasos poliinsaturados e hidratos de carbono. (63).

Figura 5: Oxígeno y radicales libres nitrogenados y reactivos asociados que se generan en las células por varios procesos.

Fuente: Emad A. Shalaby, et al. (63).

33

C. Tipos de antioxidantes

Existen tipos de antioxidantes los cuales se clasifican como: antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, y su clasificación según su modo de acción en: antioxidantes en primarios, secundarios y terciarios En los antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos, algunas de las enzimas antioxidantes que se encuentran para proporcionar una protección contra las ERO son las dismutasas de superóxido, catalasas y peroxidasas de glutatión, además de numerosas pequeñas moléculas no enzimáticas capaces de eliminar radicales libres, que se observan en la Figura 6 y se encuentran distribuidas ampliamente en el sistema biológico (63).

Figura 6: Clasificación de los antioxidantes

Fuente: Bernal y Tunqui (61).

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Según el modo de acción, los antioxidantes se clasifican en primarios, secundarios y terciarios:

A. Antioxidantes primarios

Previenen la elaboración de nuevos radicales libres, convirtiéndolos en moléculas menos perjudiciales antes de que lleguen a reaccionar o evitando la producción de radicales libres gracias a otras moléculas (56). Estos impiden la formación de radicales libres, frenan la reacción en cadena de los radicales libres, especialmente de las especies reactivas del oxígeno (ROS) y son quelantes de metales de transición y se comportan como captadores de estos ROS. Algunos ejemplos son: La enzima glutatión peroxidasa (GPx), que convierte el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los peróxidos lipídicos en moléculas inofensivas antes de que formen radicales libres, como son las catalasas (el glutatión reductasa y el glutatión S transferasa). Las proteínas que se unen a metales (ferritina, transferrina) y limitan la disponibilidad de hierro necesario para crear el radical OH• (62).

B. Antioxidantes secundarios

Cuando el nivel de antioxidantes primarios ha sido rebasado, el organismo humano tiene un segundo nivel de protección, llamado antioxidantes secundarios. El papel de los antioxidantes secundarios es “atrapar” a los RL que fueron formados, de esta forma impiden la iniciación de una cadena oxidativa interrumpiendo su propagación. De tal manera bloquean en alguna etapa la cadena de oxidación, una vez iniciada, al captar radicales libres: vitaminas E y C, enzima superóxido dismutasa (62).

C. Antioxidantes terciarios

Reparan las biomoléculas dañadas por los radicales libres. Es decir, reparan el daño causado a las moléculas por los radicales libres (62). Algunos ejemplos: Las enzimas

35 reparadoras de ADN (endonucleasas, exonucleasas). Las metioninas sulfóxido reductasa (56).

D. Plantas como fuente potencial de antioxidantes

La naturaleza es siempre una fuente importante y rica de innumerables ingredientes que pueden servirse como agentes promotores de la salud. Muchas de estas fuentes naturales incluyen frutas, verduras, hierbas, especias y hongos comestibles usados habitualmente que muchas veces son parte de una dieta de rutina. Además de eso, hay una gran lista de plantas medicinales que tienen un gran potencial para mejorar la salud. Uno de los efectos más beneficiosos de estas fuentes naturales es debido a sus posibles propiedades antioxidantes. En cuanto a la capacidad antioxidante, los investigadores han centrado sus estudios para explorar las fuentes más potenciales junto con sus ingredientes activos. Los investigadores han agregado algunas fuentes marinas como algas y pastos marinos también en la lista de estas fuentes naturales (61).

Los antioxidantes exógenos se derivan principalmente de alimentos y plantas medicinales, como frutas, verduras, cereales, champiñones, bebidas, flores, especias y hierbas medicinales tradicionales. Además, las industrias que procesan subproductos agrícolas también son fuentes potencialmente importantes de antioxidantes naturales. Estos antioxidantes naturales de materiales vegetales son principalmente polifenoles (ácidos fenólicos, flavonoides, antocianinas, lignanos y estilbenos), carotenoides (xantofilas y carotenos) y vitaminas (vitamina E y C) (61).

2.2.8. Métodos para determinar el efecto antioxidante

La actividad antioxidante no debe concluirse con base en un solo modelo de prueba antioxidante. Y en la práctica se realizan varios procedimientos de prueba in vitro para evaluar las actividades antioxidantes con las muestras de interés. En la Tabla 5 se

36 señalan los métodos in vitro para determinar el efecto antioxidante según el modo de reacción (61).

Tabla 5: Tipos de métodos in vitro para la determinación del efecto antioxidante

Tipo de Método Ensayo

Capacidad de absorción del radical de oxígeno (ORAC)

Parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP) Método de acuerdo con la transferencia de átomos de hidrógeno (HAT) Inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)

Inhibición de la oxidación de ácido linoleico

Ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico (ABTS)

2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)

Método de acuerdo a la transferencia de un solo N, N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) electrón (SET)

Capacidad de reducción antioxidante del cobre (CUPRAC

Poder de reducción antioxidante de hierro (FRAP)

Fuente: Bernal y Tunqui (61).

37

2.2.9. Método 2,2-difenil-2-picrilidracilo (DPPH), determinación de capacidad antioxidante

El ensayo de eliminación de radicales DPPH fue descrito por primera vez en 1958 por Blois y luego fue modificado ligeramente por numerosos investigadores (61). Es uno de los ensayos antioxidantes más utilizados para muestras de plantas. DPPH es un radical libre estable que reacciona con compuestos que pueden donar un átomo de hidrógeno. Este método se basa en suprimir el DPPH mediante la adición de una especie radical o un antioxidante que decolora la solución de DPPH (Figura 7). La actividad antioxidante se mide luego por la reducción de la absorción cercana a 515 nm. En este método, se prepara una solución de DPPH en etanol, y se agrega esta solución a la muestra diluida en etanol. Minutos después, se mide la absorbancia a aproximadamente 515 nm. Una gran reducción en la absorbancia de la mezcla de reacción indica una significativa actividad de suprimir radicales libres del compuesto o elevada actividad antioxidante (61).

Figura 7: Principio del método DPPH

Fuente: Bernal y Tunqui (61).

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2.2.10. Método Folin-Ciocalteu, determinación de fenoles totales

Es una determinación espectrofotométrica de fenoles totales en la que el reactivo amarillo de Folin-Ciocalteu (wolframato sódico y molibdato sódico en ácido fosfórico) reacciona con restos fenólicos dando color azul (61).

Este método se fundamenta en el carácter reductor de los polifenoles, es decir su capacidad de donar electrones, en el caso de los compuestos polifenólicos de la muestra se oxidarán por el reactivo Folin-Ciocalteu, originando un complejo de Wolframio - Molibdeno, dando una coloración azul directamente proporcional al contenido de polifenoles y que son medibles a 725 nm.

2.2.11. Espectrofotometría

A. Fundamento de la espectrofotometría

La espectrofotometría UV-Visible es una técnica de medición de concentración de masa de elementos y compuestos químicos, como principio es la interacción entre la energía electromagnética con la materia. La espectrofotometría se fundamenta en medir la radiación monocromática absorbida por un elemento o molécula causante de desplazamientos electrónicos a capas superiores, estas transiciones determinan la región del espectro en la que tiene lugar la absorción (64).

La ley fundamental en que se basa los métodos espectrofotométricos es la ley de Lambert–Beer, la cual establece que existe una relación lineal entre la absorbancia, la concentración y el camino óptico. La cual se puede expresar en la siguiente formula:

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A = εlC

Donde: A: Absorbancia. I: Camino óptico. ε: Coeficiente de asertividad molar C: Concentración

Esta ley es de mucha utilidad para la cuantificación de determinado analizo en una muestra (64).

La transmitancia (T) de una sustancia en solución, es la relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, 퐼푡, y la cantidad de luz que inicia sobre ella, 퐼표, y se representa normalmente en tanto por ciento: % 푇= 퐼푡/퐼표 x 100. Nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa (65).

La absorbancia (A), nos indica la cantidad de la luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T =-log 퐼푡/퐼표. Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io=It), la transmitancia es del 100 % e indica que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda y entonces A vale log 1=0 (65).

La densidad óptica, es la absorbancia de un elemento óptico para una longitud de onda determina; a veces la misma expresión se usa sin referencia a una longitud de onda específica, y en este caso debe considerarse sinónimo de absorbancia. Dicho de otra manera, la densidad óptica es la absorbancia de un elemento óptico por unidad de distancia, para una longitud de onda determinada (65).

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2.3. Conceptos básicos

A. Fenoles totales

Los fenoles totales se analizan principalmente por el método propuesto por Singleton, el cual utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteu, que se reduce al oxidar los fenoles formando una coloración azul, lo cual puede ser medido a una absorbancia de 750 nm. (66).

B. Polifenoles

Son moléculas naturales del metabolismo secundario de las plantas que derivan de las vías de Shikimato y de los Fenilpropanoides (67).

C. Capacidad antioxidante

Actividad biológica responsable de inhibir la oxidación de biomoléculas, promoviendo un efecto preventivo sobre determinadas enfermedades.

D. Antioxidante

Se definen como sustancias capaces de inhibir la tasa de oxidación de radicales libres (bajan las defensas, generan daño celular promueven las enfermedades degenerativas y el envejecimiento) (69).

E. Metabolitos secundarios

Son compuestos químicos sintetizados por las plantas que se encargan de funciones no esenciales en ellas, de manera que su ausencia no es dañina para el organismo, al contrario que los metabolitos primarios. Los metabolitos secundarios forman parte de las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente (68).

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F. Trólox

Es un análogo de la Vitamina E, soluble en agua, se utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo o daño (69).

G. Soxhlet

Es un sistema de extracción solido-líquido que consiste en un sistema con un cuerpo extractor donde tendrá lugar el disolvente orgánico y la droga, generalmente envuelta en material poroso de filtración rápida. En el matraz de fondo plano se coloca el disolvente se lleva a ebullición y los vapores del disolvente asciende por el tubo lateral y llevan al refrigerante donde condensan y caen sobre la droga situada en el cuerpo extractor (70).

H. Extracción por soxhlet

Técnica de extracción solido-líquido que se fundamenta en la interacción del solvente con la muestra empaquetada en una cama de extracción, el procedimiento consiste en el calentamiento del solvente cuyos vapores suben a la cámara de extracción, se condesa y toma contacto con la muestra múltiples veces hasta su agotamiento (70).

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2.4. Hipótesis

2.4.1. Hipótesis principal

Dado que existen antecedentes de actividad terapéutica de diversos extractos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena), es probable determinar la presencia de fenoles totales y su capacidad antioxidante en las hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri Chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

2.4.2. Hipótesis secundaria

- Es probable identificar los componentes fitoquímicos presentes en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena). - Es probable determinar la concentración de fenoles totales Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

- Es probable evaluar la capacidad antioxidante de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) determinada por el método de DPPH.

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2.5. Variables

2.5.1. Identificación de variables

A. Variable independiente

Extractos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Menta spicata L. (Hierba buena).

B. Variable dependiente

Fenoles totales y capacidad antioxidante.

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2.6. Operación de variables

En la Tabla 6 se observa la operacionalización de variables involucradas en la presente investigación.

Tabla 6: Operacionalización de variables

VARIABLES INDICADOR SUB INDICADOR

Variable Independiente Extracto alcohólico Extractos de Grindelia Extractos obtenidos boliviana rusby (Chiri chiri) y usando etanol de 70° y Extracto hidroalcohólico Menta spicata L. (Hierba 96° buena) Extracto etanólico

Fenoles Totales Ácido Gálico mg/L Variable Dependiente Fenoles totales y capacidad Capacidad antioxidante mmol Trolox/L antioxidante determinada por el mg Trolox/L método de DPPH

Fuente: Elaboración propia.

45

CAPÍTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. Tipo de la investigación

3.1.1. Nivel de la investigación

- Descriptivo

3.1.2. Tipo de investigación

- Según manipulación de variables: Experimental

- Según número de mediciones: Transversal

- Según la temporalidad: Prospectivo

- Enfoque: Cuantitativo

- Por el propósito o finalidad: Aplicada

- Paradigma: Positivista

3.1.3. Diseño de la investigación

- Experimental

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3.2. Planteamiento operacional

3.2.1. Ámbito de estudio

A. Ubicación espacial

El presente trabajo de investigación se realizó en los laboratorios de la Universidad Privada Autónoma de Sur de Arequipa.

B. Ubicación temporal

El presente trabajo de investigación se llevó a cabo durante los meses de diciembre 2019 a marzo del 2020.

3.3. Población, muestra y muestreo

3.3.1. Población

- La población corresponde a hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

3.3.2. Muestra

- Se utilizó 25 g de hojas secas de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

3.3.3. Muestreo

- No probabilístico

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3.4. Identificación de la unidad de estudio

3.4.1. Criterios de inclusión

Hojas completas en buen estado y de tamaño regular de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

3.4.2. Criterios de exclusión

Hojas que se encontraban en estado de descomposición de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

3.5. Técnicas e instrumentos de recojo de datos

3.5.1. Técnicas e instrumentos para la recolección de datos

A. Reactivos e insumos

- Reactivo de Dragendorff - Reactivo de Folin-Ciocalteu 2N - Cintas de Magnesio - Cloruro férrico - Agua destilada - Etanol 70° - Etanol 96 °

- Carbonato de sodio p.a. Na2CO3 - Ácido gálico p.a. C7H6O5 - Ácido ascórbico p.a. C6H8O6 - Ácido Clorhídrico p.a. HCl - Ácido sulfúrico p.a. H2SO4

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B. Materiales

- Tubos de ensayo - Beaker de 250, 500 mL

- Matraces de 250 mL - Fiolas 5 mL, 25 mL y 50 mL

- Gradillas - Baguetas - Goteros - Papel filtro

- Pipetas de 5, 10 y 20 mL - Micro pipetas 0-100 μL y 100 – 1000μL - Propipetas - Probeta 100 mL - Pera de decantación - Mecheros - Lunas de reloj

- Embudo de vidrio

C. Equipos

- Equipo Soxhlet - Espectrofotómetro UV/ Visible Genesys ThermoScientific - Refrigeradora Electrolux - Estufa Memmert - Balanza analítica Kyntel

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D. Software

- El presente estudio se realizó usando el software Microsoft Excel 2013 para el diseño de gráficos y la aplicación de la estadística utilizada en este trabajo de investigación.

3.5.2. Recolección y acondicionamiento de la planta

A. Recolección de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

El material vegetal se recolectó de la región Puno, el cual fue empaquetado de manera adecuada en sobres de papel Kraft y fueron trasportadas a las instalaciones de la Universidad Privada Autónoma del Sur de la ciudad de Arequipa.

Figura 8: Hojas de Mentha spicata L. (Hierba buena)

Fuente: Elaboración propia

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Figura 9: Hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri)

Fuente: Elaboración propia

B. Secado y lavado

La selección fue minuciosa para poder separar las hojas que se encontraban en buen estado; después se procedió a lavar mediante un flujo continuo de agua potable hoja por hoja, después se dejó escurrir (71).

C. Desecación y estabilización

Una vez realizada la selección, el lavado de las hojas y la desecación se realizaron a temperatura ambiente aislado de la luz (71).

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D. Pulverización

Después de secar y estabilizar las hojas se pulverizaron con un mortero de porcelana, hasta que se obtuvo un polvo uniforme y fino con el fin de aumentar la superficie de contacto al momento de interaccionar con el solvente, así optimizar la extracción de metabolitos secundarios (71).

Figura 10: Pulverización de hojas de estudio

Fuente: Elaboración propia

3.5.3. Identificación de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

Las plantas obtenidas de la ciudad de Puno se trasladaron a la ciudad de Arequipa en papel Kraft en completa ausencia de luz. Las plantas recolectadas se llevaron al área

52 de Biología de la Universidad Nacional de San Agustín para su identificación y clasificación taxonómica.

3.5.4. Obtención de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de hojas Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

Se pesaron 25 g de cada muestra, seguidamente se empaquetó en papel filtro, para ser llevado a la cámara de extracción de un equipo Soxhlet. En el balón del equipo extractor se midieron 150 mL de solvente, después se sometió a calor constante de 70 °C por un tiempo de 7 horas hasta que el solvente haya consumido toda la muestra del cartucho poroso (71).

Figura 11: Obtención de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos por el método de extracción por Soxhlet

Fuente: Elaboración propia

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Figura 12: Evaporación del solvente para la obtención del extracto fluido de 20 mL a Baño Maria a tempertura de 60° Fuente: Elaboración propia

3.5.5. Identificación de metabolitos secundarios

A. Identificación de flavonoides (Ensayo de Shinoda)

A la muestra se agrega un trozo de tira de magnesio, seguido por gotas de HCl, las coloraciones rojas (flavonas), roja a carmesí (flavonoles), carmesí a magenta (flavononas) y algunas veces azul o verdes son consideradas positivas (72).

B. Identificación de taninos (Ensayo de Cloruro Férrico)

Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Tomar muestra suficiente del extracto etanólico, añadir 2 ó 3 gotas de solución acuosa de FeCl3 al 5 %. El ensayo es positivo si aparece un color intenso azul, negro o verde (72).

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C. Identificación de saponinas (Ensayo de espuma)

Nos ayuda a reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto esteroidales como triterpénicas. De manera que, si la alícuota está en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 min. El ensayo es considerado como positivo si percibe espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm y se mantiene por más de 2 min (72).

D. Identificación de alcaloides (Ensayo de Dragendorff)

Este ensayo consiste en añadir 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si hay precipitado color rojo o anaranjado, es positivo (72).

A continuación, en la Tabla 7 se muestran las pruebas para identificar metabolitos secundarios en el extracto obtenido (71).

Tabla 7: Fase móviles y reveladores Metabolito Medio de Prueba Reactivo secundario identificación HCl (1 mL), Mg0, Verde, amarillo, rojo y Flavonoides Shinoda Etanol (1 mL) azul. Azules, verdes y Taninos Cloruro férrico FeCl3 5% (1 mL) rojizas Formación de Saponina Agitación Espuma Espuma Reactivo de Precipitados Alcaloides Dragendorff Dragendorff anaranjados a marrón

Fuente: Adaptado de Cruz y Quispe (73).

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3.5.6. Determinación de fenoles totales

A. Fundamento del método Folin-Ciocalteu

El reactivo está compuesto por una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdico en medio básico, los que sufren reducción al oxidar los compuestos fenólicos, originando un complejo wolframio-molibdeno de color azul cuya absorbancia es dependiente de la concentración de los polifenoles de la muestra y se midió en un espectrofotómetro a 765 nm. Los resultados se expresan como mg equivalentes de Ácido Gálico/100 g de muestra fresca (74).

B. Procedimiento

En fiolas de 10 mL se prepararon una curva de calibración adicionando concentraciones de 0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µL de Ácido Gálico luego se adicionaron 4 mL de agua destilada, posteriormente de agregaron 0.25 mL del reactivo de Folin- Ciocalteu y finalmente 2 mL de carbonato de calcio al 20 % y se dejó reaccionar 2 horas en la oscuridad. Luego de las 2 horas se leyeron en el espectrofotómetro a 725 nm. Respecto a la muestra 0.2 mL fueron medidos en una fiola de 10 mL y se procesó de igual manera que el Ácido Gálico (75).

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Figura 13: Procesamiento de muestras para la determinación de los fenoles totales por el método de Folin-Ciocalteu

Fuente: Elaboración propia

3.5.7. Determinación de la capacidad antioxidante por el método de DPPH

A. Fundamento del método DPPH

El fundamento del método desarrollado por Brand-Willams et al; DPPH, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante, siendo medida espectrofotométricamente a 517 nm. A diferencia de la absorbancia se halla el porcentaje de captación de radical libre DPPH a una concentración de 20 mg/L (76).

57

B. Procedimiento

Se hizo una solución madre de DPPH pesando 3 mg de reactivo y se enrazó en una fiola de 25 mL protegiendo de la luz, por otro lado, posteriormente se preparó una solución Stock de Trólox a 1598 µM con etanol al 96 %, pesando 4 mg de reactivo y se enrazó en una fiola de 10 mL, luego se prepararon los estándares de concentración 20.0, 40.0, 60.0, 80.0 y 100.0 mg/L agregando 1.25, 2.50, 3.75, 5.00 y 6.35 uL de solución Stock de Trólox respectivamente. Posteriormente, se preparó 5 patrones de fiolas de 5 mL agregando 1.2 mL de estándar de Trólox preparados anteriormente y 1.5 ml de DPPH ya preparado y se enrazó con etanol al 96%, se dejó reposar en la oscuridad por 30 minutos y se procedió a leer a una longitud de onda de 515 nm en el espectrofotómetro. Para el análisis de la muestra se siguió el mismo procedimiento excepto la adición de Trólox (68).

Figura 14: Procesamiento de muestras para la determinación de la capacidad antioxidante por el método de DPPH

Fuente: Elaboración propia

58

CAPÍTULO IV

RESULTADOS

4.1. Identificación taxonómica

En las Tablas 8 y 9, se observan los resultados obtenidos luego de la identificación taxonómica realizada en la Universidad Nacional de San Agustín.

Tabla 8: Ubicación taxonómica de Chiri chiri

Categoría Descripción

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Asterales

Familia Asteraceae

Género Grindelia

Especie Grindelia boliviana rusby

Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa.

59

Tabla 9: Ubicación taxonómica de Hierba buena

Categoría Descripción

Reino Plantae

División Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Lamiales

Familia Lamiaceae

Género Mentha

Especie Mentha spicata L.

Fuente: Herbarium Areqvipense (HUSA) de la Universidad Nacional de San Agustín de Arequipa.

4.2. Identificación de metabolitos secundarios

4.2.1. Alcaloides

En la Figura 15, se observa que de los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies solo el extracto hidroalcohólico de hojas de Chiri chiri dio negativo al ensayo con el reactivo de Dragendorff lo cual indicaría la ausencia de alcaloides en este extracto.

En las Tablas 10 y 11, se observan las interpretaciones, encontrando que, los extractos etanólico e hidroalcohólico de Hierba buena presentan un precipitado pardo naranja (++) y extracto etanólico de Chiri chiri presenta un precipitado pardo oscuro (+++) lo

60 cual indica que existe presencia de alcaloides. En cambio, el extracto hidroalcohólico de Chiri Chiri no formó el precipitado dando negativo al reactivo de Dragendorff.

Figura 15: Identificación de alcaloides

Fuente: Elaboración propia

Donde:

M-EtOH = Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Hierba buena CH-EtOH = Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri.

4.2.2. Taninos

En la Figura 16, se pudo ver que los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies todas indican presencia de taninos. En las Tablas 10 y 11, se observan las interpretaciones, encontrando que, los extractos etanólico e hidroalcohólico de Hierba buena y el extracto etanólico de Chiri chiri presentan un color

61 azul negruzco (+++) lo cual indica que existe presencia de Taninos hidrolizables o gálicos. En cambio, el extracto hidroalcohólico de Chiri chiri presenta un color verde oscuro lo cual indicaría la presencia de Taninos condensados.

M-Hidr M-EtOH CH-Hidr CH-EtOH

Figura 16: Identificación de taninos

Fuente: Elaboración propia

Donde:

M-EtOH= Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr= Extracto hidroalcohólico de Hierba buena CH-EtOH= Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr= Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri

4.2.3. Saponinas

En la Figura 17, se puede ver que de los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies sólo el extracto hidroalcohólico de Hierba buena presenta saponinas al formar espuma en el ensayo.

62

Figura 17: Identificación de saponinas

Fuente: Elaboración propia

Donde:

M-EtOH= Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr= Extracto hidroalcohólico de Hierba buena CH-EtOH= Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr= Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri

4.2.4. Flavonoides

En la Figura 18, se observa que de los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies sólo el extracto hidroalcohólico de Chiri chiri dio negativo a flavonoides.

En las Tablas 10 y 11, se observan las interpretaciones, encontrando que, el extracto etanólico dio un color anaranjado oscuro (+) lo cual, indica la presencia de flavonas, el extracto hidroalcohólico de Hierba buena presenta un color anaranjado-marrón (++) que indica también la presencia de flavonas.

63

En otra instancia, el extracto etanólico de Chiri chiri presentó un color anaranjado- marrón (+) que indica también la presencia de flavonas. En cambio, el extracto hidroalcohólico de Chiri chiri presenta un amarillo-anaranjado lo cual indicaría la presencia de isoflavonas.

M-EtOH CH-EtOH M-Hidr CH-Hidr

Figura 18: Identificación de flavonoides

Fuente: Elaboración propia

Donde:

M-EtOH=Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr=Extracto hidroalcohólico de Hierba buena CH-EtOH=Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr=Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri

64

Tabla 10: Resultados de identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos en hojas de Hierba buena.

Ensayo/Extracto Resultado Indicativo Interpretación

M-EtOH +++ Taninos Taninos Azul negruzco hidrolizables o M-Hidr ++ gálicos

Anaranjado M-EtOH + oscuro Presencia de Flavonoides flavonas Anaranjado- M-Hidr ++ Marrón

M-EtOH - NR - Saponinas Existe presencia M-Hidr + Espuma de saponinas

M-EtOH ++ Precipitado Existe presencia Alcaloides pardo naranja de alcaloides M-Hidr ++

Fuente: Elaboración propia

Donde:

M-EtOH = Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Hierba buena NR = No reacciona (+)(++)(+++) = Presencia (-) = Ausencia

65

Tabla 11: Resultados de identificación de metabolitos secundarios en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos en hojas de Chiri chiri.

Ensayo/Extracto Resultado Indicativo Interpretación

Taninos CH-EtOH ++ Azul negruzco hidrolizables o gálicos Taninos Taninos CH-Hidr +++ Verde oscuro condensados

Anaranjado- Presencia de CH-EtOH + Marrón flavonas Flavonoides Amarillo Presencia de CH-Hidr ++ anaranjado isoflavonas

CH-EtOH - NR - Saponinas CH-Hidr - NR -

Precipitado Existe presencia CH-EtOH +++ pardo oscuro de alcaloides Alcaloides CH-Hidr - NR -

Fuente: Elaboración propia

Donde:

CH-EtOH = Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri NR = No reacciona (+)(++)(+++) = Presencia (-) = Ausencia

66

4.3. Concentración de fenoles totales de los extractos alcohólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

En la Tabla 12 se observan los resultados correspondientes al gráfico de calibración donde se observa las absorbancias correspondientes a concentraciones de Ácido Gálico de 0.5 a 5 mg/L (n=6).

Tabla 12: Datos del gráfico de calibración para la cuantificación de fenoles totales.

Concentración de Ác. Gálico en mg /L Absorbancia 0.5 0.025 1 0.043 2 0.081 3 0.121 4 0.163 5 0.204

Fuente: Elaboración propia

Por otro lado, graficando los datos de la Tabla 12 se obtiene la Figura 19 donde se observa la ecuación de la recta y el coeficiente de determinación R2 el cual es de 0.9995.

Asimismo, la ecuación de la recta es la siguiente:

푦 = 0.0399푥 + 0.0031

Donde “y” corresponde a la absorbancia y “x” a la concentración equivalente a Ácido Gálico en mg/L. Reemplazando se obtiene que:

퐴푏푠표푟푏푎푛푐푖푎 = 0.0399[퐹푒푛표푙푒푠] + 0.0031

67

0.25

0.2 y = 0.0399x + 0.0031 R² = 0.9995

0.15

0.1 Absorbancia

0.05

0 0 1 2 3 4 5 6 Concentración, Ác. gálico mg/L

Figura 19: Gráfico de calibración correspondiente a la concentración de Ácido Gálico versus la absorbancia.

Fuente: Elaboración propia

Finalmente, despejando se obtiene la ecuación utilizada para cuantificar los fenoles en Ác. Gálico en mg /L

퐴푏푠표푟푏푎푛푐푖푎 − 0.0031 푃표푙푖푓푒푛표푙푒푠 Ác. gálico en (mg/퐿) = 0.0399

En la Tabla 13 se observan las absorbancias determinadas en el análisis de 0.5 mL de extracto fluido de las muestras obtenidas que fueron diluidos hasta 50 mL de agua destilada. En la Tabla se observa la concentración de fenoles totales equivalentes a Ácido Gálico.

68

Tabla 13: Resultados de la cuantificación de fenoles totales

Fenoles totales Fenoles totales Muestras Absorbancia Ác. Gálico mg /L Ác. Gálico mg/L x FD CH-EtOH 0.0659 1.57 157.393 CH-Hidr 0.0793 1.91 190.977 M-EtOH 0.2515 6.23 622.556 M-Hidr 0.1903 4.69 469.173

Fuente: Elaboración propia

Donde:

FD = Factor de dilución (FD = 50 mL/0.5 mL = 100) CH-EtOH = Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri M-EtOH = Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Hierba buena

En las Tablas 14 y 15 se muestra el análisis estadístico “t-student” para la comparación de lo fenoles totales en los extractos etanólicos de Chiri chiri y Hierba buena con los extractos hidroalcohólicos dio una probabilidad (p<0.05) lo cual indica que existe evidencia estadística para decir que en el caso de Chiri chiri el extracto hidroalcohólico presenta mayor concentración de fenoles que el extracto etanólico. Por otro parte, el extracto etanólico de Hierba buena presenta mayor concentración de fenoles totales que el extracto hidroalcohólico (p<0.05) al 95 % de confianza.

69

Tabla 14: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación del contenido de fenoles totales en los extractos de Chiri Chiri.

Prueba F para varianzas de dos muestras CH-Hidr CH-EtOH Media 190.980 157.394 Varianza 0.107 0.0524 Observaciones 3 3 Grados de libertad 2 2 F 2.040 P(F<=f) una cola 0.329 Valor crítico para F (una cola) 19

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales CH-EtOH CH-Hidr Media 157.394 190.981 Varianza 0.052 0.107 Observaciones 3 3 Varianza agrupada 0.080 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 4 Estadístico t -145.701 P(T<=t) una cola 6.6548E-09 Valor crítico de t (una cola) 2.132 Fuente: Elaboración propia

70

Tabla 15: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación del contenido de fenoles totales en los extractos de Hierba buena.

Prueba F para varianzas de dos muestras M-Hidr M-EtOH Media 469.173932 622.546391 Varianza 0.053131 0.051151 Observaciones 3 3 Grados de libertad 2 2 F 1.03870892 P(F<=f) una cola 0.49050651 Valor crítico para F (una cola) 19

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales

M-EtOH M-Hidr Media 622.546391 469.173932 Varianza 0.051151 0.053131 Observaciones 3 3 Varianza agrupada 0.052141 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 4 Estadístico t 822.627703 P(T<=t) una cola 6.5509E-12 Valor crítico de t (una cola) 2.13184679

Fuente: Elaboración propia

71

4.4. Determinación de la capacidad antioxidante de los extractos alcohólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena)

En la Tabla 16 se observan los resultados correspondientes al gráfico de calibración donde se observa las absorbancias correspondientes a concentraciones de Trólox de 0.005 a 0.030 mmol/L (n=6).

Tabla 16. Datos del gráfico de calibración para la cuantificación de capacidad antioxidante.

mmol Trólox/L Absorbancia 0.005 0.575 0.010 0.452 0.015 0.371 0.020 0.261 0.025 0.182 0.030 0.069

Fuente: Elaboración propia

Por otro lado, graficando los datos de la Tabla 16 se obtiene la Figura 20 donde se observa la ecuación de la recta y el coeficiente de determinación R2 el cual es de 0.9969.

Asimismo, la ecuación de la recta es la siguiente:

푦 = 19.714푥 + 0.6633

Donde “y” corresponde a la absorbancia y “x” a la capacidad antioxidante equivalente a Trólox en mg/L. Reemplazando se obtiene que:

72

퐴푏푠표푟푏푎푛푐푖푎 = 19.714[푇푟표푙표푥] + 0.6633

Absorbancia 0.7

0.6 y = -19.714x + 0.6633 0.5 R² = 0.9969 0.4

0.3 Axis Axis Title 0.2

0.1

0 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 Axis Title

Figura 20: Gráfico de calibración para cuantificar la capacidad antioxidante.

Fuente: Elaboración propia

Finalmente, despejando se obtiene la ecuación utilizada para cuantificar la capacidad antioxidante equivalentes a Trólox en mg/L.

퐴푏푠표푟푏푎푛푐푖푎 − 0.6633 퐶푎푝푎푐푖푑푎푑 푎푛푡푖표푥푖푑푎푛푡푒 (푚푔 푇푟ó푙표푥⁄퐿) = 19.714

En la Tabla 17 se observan las absorbancias determinadas en el análisis de 0.5 mL de extracto fluido que fueron diluidos hasta 50 mL. En la tabla se observa la capacidad antioxidante equivalentes a Trólox en mmol/L.

73

Tabla 17: Resultados de la cuantificación de la capacidad antioxidante.

Capacidad antioxidante Capacidad antioxidante X FD Muestras Absorbancia (mmol Trólox/L) (mmol Trólox/L)

CH-EtOH 0.821 0.008 0.841 CH-Hidr 0.427 0.012 1.165 M-EtOH 0.289 0.019 1.875 M-Hidr 0.151 0.026 2.606

Fuente: Elaboración propia

Donde:

FD = Factor de dilución (FD = 50 mL/0.5 mL = 100) CH-EtOH = Extracto etanólico de Chiri chiri CH-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Chiri chiri M-EtOH = Extracto etanólico de Hierba buena M-Hidr = Extracto hidroalcohólico de Hierba buena

En las tablas 18 y 19 se presenta el análisis estadístico “t-student” para la comparación de la capacidad antioxidante en los extractos etanólicos de Chiri chiri y Hierba buena con los extractos hidroalcohólicos dio una probabilidad (p<0.05) lo cual indica que existe evidencia estadística para decir que en el caso de Chiri chiri el extracto hidroalcohólico presenta mayor capacidad antioxidante que el extracto etanólico. El mismo resultado se obtuvo en los extractos fluidos de Hierba buena (p<0.05) al 95 % de confianza.

74

Tabla 18: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación de la capacidad antioxidante de los extractos de Chiri Chiri

Prueba F para varianzas de dos muestras CH-Hidr CH-EtOH Media 1.168 0.840 Varianza 0.000405 0.00038 Observaciones 3 3 Grados de libertad 2 2 F 1.066 P(F<=f) una cola 0.484 Valor crítico para F (una cola) 19

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales CH-EtOH CH-Hidr Media 0.840 1.168 Varianza 0.00038 0.000405 Observaciones 3 3 Varianza agrupada 0.00039 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 4 Estadístico t -20.246 P(T<=t) una cola 1.7568E-05 Valor crítico de t (una cola) 2.132 Fuente. Elaboración propia

75

Tabla 19: Prueba F para evaluación de varianzas y prueba t para comparación de muestras suponiendo varianzas iguales para la comparación de la capacidad antioxidante de los extractos de Hierba buena.

Prueba F para varianzas de dos muestras

M-EtOH M-Hidr Media 1.876 2.608 Varianza 0.000703 0.00058 Observaciones 3 3 Grados de libertad 2 2 F 1.214 P(F<=f) una cola 0.452 Valor crítico para F (una cola) 19

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales

M-EtOH M-Hidr Media 1.876 2.608 Varianza 0.0007 0.00058 Observaciones 3 3 Varianza agrupada 0.00064 Diferencia hipotética de las medias 0 Grados de libertad 4 Estadístico t -35.383 P(T<=t) una cola 1.9038E-06 Valor crítico de t (una cola) 2.132 Fuente. Elaboración propia

76

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN

Piçarra et al. en el 2019, indicaron que, los extractos de plantas son ricos en polifenoles, tienen un importante potencial antioxidante gracias a su capacidad para capturar radicales libres o proteger contra la oxidación de sustratos lipídicos, desempeñando un papel importante en la prevención de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, como las enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares (77). Por ello, en la presente investigación se buscó evaluar la concentración de fenoles totales y la capacidad antioxidante de extractos alcohólicos e hidroalcohólicos de hojas de Chiri chiri y Hierba buena.

Los extractos etanólicos e hidroalcohólicos obtenidos de las hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) Y Mentha spicata L. (Hierba buena) pudieron tener resultados diferentes si ambas especies hubieran sido recolectadas desde otra ubicación con el fin de estandarizas los resultados.

De acuerdo con la clasificación taxonómica obtenida en la Universidad Nacional de San Agustín se pudo comprobar que la descripción de las categorías coincide con la clasificación taxonómica realizada por Choquenaira et al. en el 2015.

En relación con los métodos de extracción, Bimakr, en su investigación obtuvo diferentes compuestos flavonoides bioactivos que incluyen catequina, epicatequina, rutina, miricetina, luteolina, apigenina y naringenina a partir de hojas de menta verde (Mentha spicata L.) mediante extracción convencional de soxhlet (CSE) y extracción de dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) en diferentes extracciones esquemas y parámetros. Se encontró que el extracto de dióxido de carbono supercrítico (condición óptima) tiene más compuestos flavonoides principales (siete flavonoides bioactivos) con alta concentración a diferencia de la extracción de Soxhlet con etanol al 70% (cinco flavonoides bioactivos) (14). En cambio, la extracción por Soxhlet también exhibió

77 resultados favorables por lo que en la presente investigación se optó por trabajar con el método por Soxhlet.

En las Tablas 10 y 11 se observa que los extractos etanólico e hidroalcohólico de Hierba buena y Chiri chiri presentan de alcaloides. En la Figura 16 se observa que los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies todas indican presencia de taninos. En las Tablas 10 y 11 se observan las interpretaciones, encontrando que, los extractos etanólico e hidroalcohólico de Hierba buena y el extracto etanólico de Chiri chiri presentan Taninos hidrolizables o gálicos. En la Figura 17 se observa que de los 4 extractos obtenidos (2 etanólicos y 2 hidroalcohólicos) de ambas especies sólo el extracto hidroalcohólico de Hierba buena presenta saponinas. En las Tablas 10 y 11 se observan las interpretaciones, encontrando que, el extracto etanólico e hidroalcohólico de Hierba buena indica presencia de flavonas. Por otro lado, el extracto etanólico de Chiri chiri presentan flavonas, pero el extracto hidroalcohólico del mismo presenta isoflavonas. Sin embargo, en estudios como el de Slawomira et al. (78). Muestran que los aceites esenciales de flores y hojas del género Grindelia poseen componentes como α-pineno (34.9%) y limoneno (13.1%), mientras que mirceno (16.9%), espatulenol (12.3%), β-eudesmol (11.9%) y limoneno (10.1%) (78). Estos estudios motivan a continuar con los estudios para la identificación de metabolitos en diversas especies vegetales como Chiri chiri y Hierba buena.

El extracto hidroalcohólico realizado del Chiri chiri presenta taninos condensados; en cambio, el estudio que realizó Vargas en el 2019, (79) analizó el material de estas plantas, colectados en diferentes localidades del Valle del Cusco, utilizando métodos habituales se logró identificar alcaloides, lípidos y carbohidratos.

En esta investigaciónn, respecto a la cuantificación de fenoles totales el extracto etanólico de Chiri chiri presentó una concentración de 157.393 Ác. Gálico en mg /L, el extracto hidroalcohólico de Chiri chiri de 190.977 Ác. Gálico en mg /L, el extracto etanólico de Hierba buena de 622.556 Ác. Gálico en mg /L, el extracto hidroalcohólico de Hierba buena de 469.173 Ác. Gálico en mg /L. Por otro lado, la capacidad

78 antioxidante del extracto etanólico de Chiri chiri fue de 0.841 mmol Trólox/L, el extracto hidroalcohólico de Chiri chiri 1.165 mmol Trólox/L, el extracto etanólico de Hierba buena de 1.875 mmol Trólox/L y el extracto hidroalcohólico de Hierba buena de 2.606 mmol Trólox/L. Por lo contrario, la capacidad antioxidante de los aceites esenciales de Mentha spicata L., Mentha x gentilis L., Mentha crispa L., Mentha piperita L. y Mentha x piperita L. según Vargas en el 2019, quien demostró que la especie M. x gentilis L. tuvo el mejor de los resultados (79). La capacidad antioxidante en menta (Mentha piperita L.) fue de 262.57 a 327.32 mm TEAC/g de PF (80).

Los resultados mostraron que principalmente las infusiones de agua de menta son buenas fuentes de actividad antioxidante con un porcentaje cercano al 100% y 80 mg EAG / g de compuestos fenólicos (81). Para Rosmarinus officinalis se evidenció un crecimiento en la cantidad de fenoles totales medidos e igualmente un aumento en la capacidad antioxidante de sus extractos al ser sometidos a los tratamientos de radiación–tiempo de adaptación (82). La elevada capacidad antioxidante encontrada en la presente investigación podría deberse a la radiación que presenta la ciudad de Arequipa. Con esto inducimos que los fenoles totales y la capacidad antioxidante están relacionados con el uso de plantas medicinales para el tratamiento de enfermedades desde hace muchos años. Hoy en día, esta tradición todavía está muy presente. Entre los tés que se encuentran fácilmente en el país se encuentran la menta (Mentha spicata L.), la manzanilla (Matricaria chamomilla) y la hierba de limón (Cymbopogon citratus).

El aceite esencial investigado de Menta spicata L. exhibió una buena actividad antioxidante según la evaluación de la capacidad de eliminación de radicales libres del DPPH (10), estudios similares como Hussain, se identificaron que los componentes principales fueron carvona (51.7%) y cis-carveol (24.3%), seguidos de limoneno (5.3%), 1.8 cineol (4.0%), cis-dihidrocarvona (2.2%), acetato de carvilo (2.1%) e hidrato de cis-sabineno (1.0%). Por otro lado, Snoussi, en su investigación relacionada a la composición química, antioxidante y anti-Vibrio spp. del aceite esencial aislado de las partes aéreas de Mentha spicata L. (Menta verde), se identificaron un total de 63

79 componentes químicos. Los componentes principales fueron carvona (40.8% ± 1.23%) y limoneno (20.8% ± 1.12%). Además, el aceite investigado exhibió una alta potencia antioxidante. La capacidad del aceite, que pertenece al quimiotipo de carvona, para inhibir o reducir Vibrio spp por lo que sugieren que se podría usar en la industria farmacéutica o alimentaria como antibiótico natural y conservante de mariscos contra la contaminación por Vibrio (11). Asimismo, Kannat, investigó la eficacia del extracto de hojas de menta (ME) que tuvo un buen contenido total de fenólicos y flavonoides. Mostró una excelente actividad antioxidante, medida por los ensayos de blanqueamiento de β-caroteno y 2,2-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) (12).

80

CONCLUSIONES

Primera: Se logró determinar que los extractos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) presentaron en su composición fenoles totales, así como, capacidad antioxidante por los métodos Folin-Ciocalteu y DPPH respectivamente.

Segunda: Se evidenció la presencia de componentes fitoquímicos en los extractos obtenidos. El extracto etanólico de hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) presentó taninos hidrolizables, flavonas y alcaloides, y el extracto hidroalcohólico presentó taninos condensados e isoflavonas. El extracto etanólico de Mentha spicata L. (Hierba buena) presentó taninos hidrolizables, saponinas y alcaloides, y el extracto hidroalcohólico presentó flavonas, saponinas y alcaloides.

Tercera: Se cuantificaron fenoles totales en los extractos estudiados con el método Folin-Ciocalteu. La concentración de fenoles totales en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) fue de 157.393 y 190.977 Ác. Gálico en mg /L respectivamente. La concentración de fenoles totales en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Mentha spicata L. (Hierba buena) fue de 622.556 y 469.173 Ác. Gálico en mg /L respectivamente.

Cuarta: Se encontró capacidad antioxidante en los extractos estudiados por el método DPPH. La capacidad antioxidante en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) fue de 0.841 y 1.165 mmol de Trólox/L respectivamente. La capacidad antioxidante en los extractos etanólicos e hidroalcohólicos de Mentha spicata L. (Hierba buena) fue de 1.875 y 2.606 mmol de Trólox/L.

81

RECOMENDACIONES

Primero: Se sugiere realizar estudios para correlacionar la composición química con sus propiedades biológicas de las hojas de Grindelia boliviana rusby (Chiri Chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

Segundo: Se sugiere incrementar los aportes científicos con relación a la capacidad antioxidante de la Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) utilizando otras partes de la planta (raíz, tallo, etc.).

Tercero: Se sugiere comparar la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante mediante diferentes métodos de extracción de los principios activos de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

Cuarto: Se recomienda realizar un análisis fitoquímico para aislar e identificar los metabolitos secundarios presentes en el extracto etanólico e hidroalcohólico de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena).

82

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91

ANEXOS

Anexo 1: Clasificación taxonómica de Chiri chiri

92

Anexo 2: Clasificación taxonómica de Hierba buena

93

Anexo 3: Peso de las hojas pulverizadas de Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba buena) en balanza analítica

94

Anexo 4: Obtención de los extractos etanólicos e hidroalcohólicos por el método de extracción por Soxhlet

95

Anexo 5: Diluciones y muestras según métodos

Figura 21: Método Folin-Ciocalteu

Fuente: Elaboración propia

Figura 22: Método DPPH

Fuente: Elaboración propia

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Anexo 7: Matriz Operacional

Planteamiento Título Hipótesis (Hi) Objetivos Variables Metodología del problema Indicadores

Hipótesis general Objetivo General: VARIABLE DEPENDIENTE Extractos Nivel: Experimental

- Dado que existen antecedentes de actividad obtenidos

Mentha Mentha - Determinar la concentración de fenoles usando etanol terapéutica de diversos extractos de hojas de

totales y capacidad antioxidante de los de 70° y 96° a spicata a

h Grindelia boliviana rusby (Chiri chiri) y Mentha extractos etanólicos e hidroalcohólicos Fenoles spicata L. (Hierba buena), es probable

Ment Totales de hojas de Grindelia boliviana rusby TIPO: Cuantitativo

(chiri chiri) y determinar la presencia de fenoles totales y su (Chiri chiri) y Mentha spicata L. (Hierba Capacidad capacidad antioxidante en las hojas de buena). antioxidante Grindelia boliviana rusby (Chiri Chiri) y Mentha determinada

2019”

por el método - spicata L. (Hierba buena).

de DPPH (CHIRI CHIRI) Y CHIRI) (CHIRI

Hipótesis secundarias Objetivos Específicos: NIVEL: boliviana boliviana rusby

Fenoles totales y - Es probable identificar los componentes - Identificar los componentes Experimental capacidad antioxidante Comparativo

fitoquímicos presentes en los extractos fitoquímicos presentes en los extractos

ndelia Transversal

Gri etanólicos, e hidroalcohólicos de hojas de etanólicos, e hidroacohólicos de hojas Prospectivo Grindelia boliviana rusby (chiri chiri) y Mentha de Grindelia boliviana rusby (chiri chiri) y MUESTRA. spicata L. (hierba buena) Mentha spicata (hierba buena) Gramos y mililitros de

- Es probable determinar la concentración de - Determinar la concentración de fenoles muestras FENOLES TOTALES Y CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE DE ANTIOXIDANTE FENOLES Y TOTALES CAPACIDAD Grindeliarusby boliviana fenoles totales Grindelia boliviana rusby (chiri totales Grindelia boliviana rusby (chiri

(HIERBA BUENA), AREQUIPA BUENA), (HIERBA DE chiri) y Mentha spicata L. (hierba buena) chiri) y Mentha spicata (hierba buena)

- Es probable evaluar la capacidad - Evaluar la capacidad antioxidante de antioxidante de extractos etanólicos, e extractos etanólicos, e hidroalcohólicos de hojas de Grindelia boliviana rusby (chiri chiri) VARIABLE hidroalcohólicos de hojas de Grindelia

la la concentración de fenoles totales y capacidad antioxidante de los extractos y Mentha spicata (hierba buena) determinada INDEPENDIENTE

boliviana rusby (chiri chiri) y Mentha spicata L.

(hierbabuena)?

es DETERMINACIÓN DE DE DETERMINACIÓN Extractos de Grindelia

DOS EXTRACTOS DOS por el método de DPPH

“ (hierba buena) determinada por el método de boliviana rusby (Chiri chiri) Gramos y mililitros

tanólicos e hidroalcohólicos de hojas de DPPH y Menta spicata (Hierba

e spicata ¿Cuál buena)

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