In vivo und in silico Untersuchungen in Saccharothrix espanaensis, Streptomyces albus und Aspergillus nidulans
Doktorarbeit
zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Vorgelegt von
Suzan Samra aus Khaskovo
Freiburg 2016
Dekan: Prof. Dr. Manfred Jung
Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber
Referent: Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent: Prof. Dr. Rolf Schubert
Drittprüfer: Prof. Dr. Stefan Günther
Tag der Promotion: 12.12.2016
Syrien…gewidmet
“Everything gets better in the end. If it's not better, it's not quite the end.” -Paulo Coelho-
Wissenschaftliche Publikationen Suzan Samra, Bogdan Tokovenko, Monika Kaszubowska, Roman Makitrynskyy, Tanja Heitzler, Yvonne-Isolde Schmidt-Bohli, Elisabeth Welle, Sandra Gross, Thomas Paululat, Andriy Luzhetskyy and Andreas Bechthold (2016) “Insight into Saccharothrix espanaensis grown in different media: Transcriptome and natural product analysis” eingereicht
Songya Zhang, Jing Zhu, Tao Liu, Suzan Samra, Huaqi Pan, Jiao Bai, Huiming Hua and Andreas Bechthold (2016) “Myrothecoside, A Novel Glycosylated Polyketide From the Terrestrial Fungus Myrothecium sp. GS-17” Helvetica Chimica Acta 2016, 99, 215-219
Yvonne-Isolde Schmidt-Bohli, Fabienne Gutacker, Milena Schäffer, Tina Strobel, Suzan Samra, Denise Deubel, Thomas Paululat and Andreas Bechthold “An N-glycosyltransferase from Saccharopolyspora erythraea is able to catalyse the formation of α- and β-glycosidic bonds” in Vorbereitung
Suzan Samra, Bogdan Tokovenko, Andriy Lutzhetskyy and Andreas Bechthold “Transcriptome analysis of Saccharothrix espanaensis- a strain with biotransformation activity” in Vorbereitung.
Suzan Samra, Philipp Schwarzer, Chijian Zuo, Olya Tsypik, Xiaohui Yan, Tanja Heitzler, Jana Derochefort, Julia Wunsch-Palasis, Thomas Paululat and Andreas Bechthold “Insights into the early steps of Rishirilide B biosynthesis” in Vorbereitung
Chijian Zuo, Lin Zhang, Suzan Samra, Tanja Heitzler, Philipp Schwarzer, Jana Derochefort, Julia Wunsch-Palasis, Thomas Paululat, Oliver Einsle, Andreas Bechthold “Evidence that the monooxygenase RslO4 prevents quinone formation” in Vorbereitung
Vorträge
“Identification of a fucosyltransferase from Saccharothrix espanaensis”. Doktorandenseminar, Freiburg i. Br., 03. April 2014
Poster
S. Samra and A. Bechthold. “Production of new antibiotics from Actinomycetes”. Exzellenzinitiative Freiburg-Albert-Ludwigs Universität, Freiburg i. Br., 10.01.2012.
T. Strobel, S. Samra, M. Berner and A. Bechthold. “Elucidating the biosynthetic pathway of the saccharomicins – New antibiotics from Saccharothrix espanaensis”. International Congress on Natural Products Research, New York, 28. Juli - 01. August 2012. S. Samra, T. Strobel, M. Berner and A. Bechthold.”Identification of an exceptional fucosyltransferase from the saccharomicin gene cluster”. Actinobacteria within soil, Münster, 25.-28. Oktober 2012.
S. Samra, M. Kaszubowska, T. Strobel, B. Moore, T. Paululat and A. Bechthold “Identification of new secondary metabolites produced by Saccharothrix espanaensis”. VAAM Workshop “Biology of Bacteria Producing Natural Products”, Frankfurt am Main, 22. - 25. September 2013.
S. Samra, Y.I Schmidt, M. Kaszubowska, T. Strobel, T. Paululat, and A. Bechthold. “Saccharothrix espanaensis - a promising strain for production and biotransformation of natural products”. DPhG Jahrestagung 2013 “Drug Discovery inspired by Nature”, Freiburg i. Br., 09.-11. Oktober 2013.
S. Samra, M. Kaszubowska, E. Welle, T. Paululat, B. Tokovenko and A. Bechthold. “Ability of Saccharothrix espanaensis to catabolize amino acids to antimicrobial compounds”. Tag der Forschung der Fakultät für Chemie und Pharmazie, Freiburg i. Br., 04. Juli 2014.
J. Derochefort, S. Samra and A. Bechthold. “Rishirilide: Discovery of Intermediates in various Mutants“. Tag der Forschung, Freiburg i. Br., 03.07.2015.
P. Schwarzer, S. Samra, C. Zuo, T. Paululat and A. Bechthold. “Characterization of enzymes involved in the early steps of the Biosynthesis of Rishirilide B”. Tag der Forschung der Fakultät für Chemie und Pharmazie, Freiburg i. Br., 08. Juli 2016.
F. Gutacker, YI. Schmidt-Bohli, S. Samra, T. Paululat and A. Bechthold. “Identification of an N- glycosyltransferase from Saccharopolyspora erythraea which catalyzes the formation of glycosidic bonds”. Tag der Forschung der Fakultät für Chemie und Pharmazie, Freiburg i. Br., 08.07.2016.
P. Schwarzer, S. Samra, C. Zuo, O. Tsypik, J. Derochefort, T. Heitzler, X. Yan, J. Wunsch-Palasis, T. Paululat and A. Bechthold. “Rishirilide B – a PKS type II derivative with a unique biosynthetic pathway”. VAAM Workshop “Biology of Bacteria Producing Natural Products”, Freiburg i. Br. 28. - 30. September 2016.
F. Gutacker, Y.I. Schmidt-Bohli, S. Samra, D. Deubel, T. Strobel, M.P. Schäffer, T. Paululat and A. Bechthold. „Identification of a N-glycosyltransferase from Saccharopolyspora erythraea that catalyzes the formation of α- and β- glycosidic bonds“. VAAM Workshop “Biology of Bacteria Producing Natural Products”, Freiburg i. Br. 28. - 30. September 2016.
I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ...... 1
2 Einleitung ...... 3
Naturstoffe aus Actinomyceten ...... 4
2.1.1 Glycosylierte Naturstoffe aus Actinomyceten ...... 5
Der Actinomycetenstamm Saccharothrix espanaensis ...... 6
2.2.1 Sequenzanalyse des Genoms von Saccharothrix espanaensis ...... 6
2.2.2 Saccharothrix espanaensis als Naturstoff-Produzent und als Biotransformationswirt ... 6
2.2.3 Die Saccharomicine A und B ...... 7
Vorkommen, Einfluss und Biosynthese von L-Fucose ...... 12
Der OSMAC-Ansatz (One Strain Many Compounds) ...... 12
Aromatische Aminosäuren in Mikroorganismen ...... 14
2.5.1 Tryptophan ...... 14
2.5.2 Phenylalanin ...... 17
RNA-Sequenzierung ...... 17
Rishirilid B ...... 18
Untersuchung der Kollagenstabilisierungsaktivität durch die Prolyl-4-Hydroxylase in Aspergillus nidulans ...... 20
2.8.1 Aspergillus nidulans ...... 20
2.8.2 Kollagen und Prolyl-4-Hydroxylase ...... 20
Zielsetzung dieser Arbeit ...... 22
3 Material und Methoden ...... 23
Laborgeräte ...... 24
Chemikalien und andere Verbrauchsmaterial ...... 25
3.2.1 Chemikalien und Medienbestandteile ...... 25
3.2.2 Organische Lösungsmittel ...... 28
3.2.3 Verbrauchsmaterial...... 28
3.2.4 Enzyme und Kits ...... 29
Puffer und Lösungen ...... 29
I
II
3.3.1 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen ...... 31
3.3.2 Puffer und Lösungen zur quantitativen Messung der Gus-Aktivität ...... 31
3.3.3 Lösungen für die Blau-Weiß-Screening ...... 31
3.3.4 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen ...... 32
3.3.5 Puffer und Lösungen zur Durchführung einer SDS-PAGE ...... 32
3.3.6 Puffer und Lösungen zur Herstellung und Transformation von Protoplasten von Aspergillus nidulans ...... 33
3.3.7 Antibiotika- und Antimykotika-Lösung ...... 33
Nährmedien ...... 34
Verwendete Stämme ...... 35
Verwendete Vektoren und Plasmide ...... 36
3.6.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide ...... 36
3.6.2 In dieser Arbeit erstellte Plasmide ...... 37
Software, Datenbanken und Internetservices ...... 38
Mikrobiologische Methoden ...... 39
3.8.1 Kultivierung und Herstellung von E. coli-Dauerkulturen ...... 39
3.8.2 Kultivierung und Herstellung der Dauerkulturen von Actinomyceten-Stämme ...... 40
3.8.3 Kultivierung der für den Agardiffusionstest verwendeten Stämme ...... 41
3.8.4 Kultivierung und Herstellung einer Sporensuspension von Aspergillus nidulans ...... 41
3.8.5 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen...... 42
3.8.6 Transformation von E. coli ...... 42
3.8.7 Blau-Weiß-Screening in E. coli ...... 43
3.8.8 Intergenerische Konjugation ...... 43
3.8.9 In vivo Kaffeesäure-Glycosylierungsexperimente ...... 44
3.8.10 Herstellung von Aspergillus nidulans Protoplasten ...... 44
3.8.11 Transformation von Aspergillus nidulans ...... 45
Molekularbiologische Methoden ...... 45
3.9.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...... 45
3.9.2 Restriktion von DNA durch Restriktionsenzyme ...... 51
3.9.3 Ligation und Dephosphorylierung ...... 52 II
III
3.9.4 Plasmidisolierung aus E. coli ...... 52
3.9.5 Isolierung genomischer DNA aus Actinomyceten-Stämme ...... 53
3.9.6 Analyse und Isolierung von DNA über Agarose-Gelelektrophorese ...... 53
3.9.7 Isolierung Gesamt-RNA aus Aspergillus nidulans ...... 53
3.9.8 cDNA-Synthese ...... 54
3.9.9 DNA-Sequenzierung ...... 54
3.9.10 RNA-Sequenzierung...... 54
3.9.11 Konstruktion von Plasmiden ...... 55
Klonierung des wcaGa ...... 55
Optimierung des Gens wcaGa in Streptomyces albus ...... 55
Isolierung und Analytik von Naturstoffen ...... 59
3.10.1 Isolierung von Naturstoffen ...... 59
3.10.2 Analytik von Naturstoffen ...... 63
Agardiffusionstest ...... 66
Analyse von Reportergen-Testsystem GUS ...... 67
3.12.1 X-Gluc-Test zur qualitativen Analyse der GUS-Aktivität auf Agarplatten ...... 67
3.12.2 GUS-Assay zur quantitativen Analyse der GUS-Aktivität ...... 67
Proteinpräparation und Analytik ...... 68
3.13.1 Heterologe Proteinsynthese in E. coli...... 68
3.13.2 Zellaufschluss für Proteinreinigung...... 68
3.13.3 Ni2+-Affinitätschromatographie ...... 68
3.13.4 Proteinanalytik ...... 69
4 Ergebnisse ...... 71
Identifizierung eines Fucosyltransferase-Gens im Saccharomicin-Gencluster ...... 72
4.1.1 Heterologe Expression von D-Fucose-Biosynthesegenen ...... 72
4.1.2 Heterologe Expression von L-Fucose-Biosynthesegenen ...... 73
4.1.3 Expression der Glycosyltransferase-Gene in den verschiedenen Streptomyces albus Mutanten ...... 74
4.1.4 Aktivitätsanalyse der Saccharomicin-Glycosyltransferasegene ...... 74
Untersuchung der Einwirkung von L-Fucose auf Streptomyces albus...... 81 III
IV
Untersuchung der Saccharomicin-Produktion von Saccharothrix espanaensis-Wildtyp mittels Imaging Mass-Spektrometer ...... 83
Der OSMAC-Ansatz in Saccharothrix espanaensis ...... 84
4.4.1 Heterologe Expression des bldA-Gens in Saccharothrix espanaensis ...... 85
4.4.2 Produktionsanalyse von Saccharothrix espanaensis in verschiedenen Medien ...... 86
4.4.3 In silico Untersuchung zur Biosynthese von Anthranilsäure, Indol-3-Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure ...... 92
4.4.4 Inaktivierung der Gene BN6_01860, BN6_75400, BN6_67950, BN6_77230 und BN6_79710 ...... 100
Untersuchung der Genexpression in Saccharothrix espanaensis ...... 104
4.5.1 Untersuchung der Transkription der gesamten Gene aus Saccharothrix espanaensis mithilfe von RNA-Sequenzierung ...... 104
4.5.2 Untersuchung der Transkription verschiedener Gene aus Saccharothrix espanaensis durch Reportergensysteme ...... 109
4.5.3 Quantitative Messung der Aktivität von den Promotoren P01860, P68840, P78320 und PSam5-6 ...... 110
Saccharothrix espanaensis als Biotransformationswirt von Alizarin ...... 111
4.6.1 RNA-Sequenzierung der Gesamt-RNA von Saccharothrix espanaensis mit und ohne Zugabe von Alizarin ...... 111
Untersuchung zur Biosynthese von Rishirilid B ...... 116
4.7.1 Die NADPH:Chinonreduktase RslO8 ...... 116
4.7.2 Die C9-Ketoreduktase RslO10 ...... 119
4.7.3 Produktionsanalyse der Mutante Streptomyces albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H-SD- rslO10 ...... 121
Untersuchung der Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität in Aspergillus nidulans ...... 123
4.8.1 Die Putative Prolyl-4-Hydroxylasen in Aspergillus nidulans ...... 123
4.8.2 Inaktivierung des putativen Prolyl-4-Hydroxylase-Gens ANID_02851 ...... 123
4.8.3 Inaktivierung des putativen Prolyl-4-Hydroxylase-Gens ANID_07554 ...... 124
4.8.4 Heterologe Expression von ANID_02851 und ANID_07554 in E. coli ...... 124
5 Diskussion und Ausblick ...... 125
Untersuchung der Biosynthese der Saccharomicine ...... 126
IV
V
5.1.1 Heterologe Expression von D-Fucose-Biosynthesesgenen in Streptomyces albus ..... 126
5.1.2 Identifizierung der für die Fucosylieirung des Saccharomicin-Aglykons verantwortliche Glycosyltransferase...... 127
Wirkung von L-Fucose auf das Wachstum von Streptomyces albus ...... 128
Aktivierung stiller Cluster in Saccharothrix espanaensis mittels OSMAC-Ansatz ...... 129
5.3.1 Expression des bldA-Gens in Saccharothrix espanaensis ...... 130
5.3.2 Produktionsanalyse von Saccharothrix espanaensis in SPY-Medium ...... 131
Untersuchungen zur Biosynthese von Anthranilsäure, Indol-3-Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure ...... 132
5.4.1 Eigenschaften und hypothetischer Biosyntheseweg von Anthranilsäure ...... 132
5.4.2 Eigenschaften und hypothetischer Biosyntheseweg von Indol-3-Carbonsäure ...... 133
5.4.3 Eigenschaften und hypothetische Biosynthese von Phenylessigsäure ...... 135
5.4.4 Eigenschaften und hypothetische Biosynthese von Benzoesäure (BA) ...... 136
RNA-Sequenzierung ...... 138
5.5.1 Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene von Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium ...... 138
5.5.2 Transkriptomanalyse der putativen Sekundärmetabolit-Gencluster aus Saccharothrix espanaensis ...... 139
5.5.3 Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene von Saccharothrix espanaensis mit und ohne Zugabe von Alizarin ...... 140
Untersuchung zur Biosynthese von Rishirilid B ...... 142
5.6.1 Analyse der Funktion der NADPH:Chinonoxidoreduktase RslO8 ...... 142
5.6.2 Untersuchung der katalytischen Tetrade von RslO10 ...... 143
Untersuchung der Prolyl-4-Hydroxylase Aktivität in Aspergillus nidulans ...... 144
6 Literaturverzeichnis ...... 147
7 Anhang ...... 173
Plasmidkarte von pTOS-wcaGa ...... 173
Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2 ...... 173
Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2-sam21; pTESa x fuc1,2-sam22 und pTESa x fuc1,2- fcd ...... 174
Plasmidkarte von pUWL-H-GTs...... 175 V
VI
Plasmidkarte von pGUS ...... 175
Plasmidkarte von pGUS x Promotoren (PSam5-6 X, P78320, P07730, P01860, P68440) ...... 176
Plasmidkarte von pKC1132 x KO01860, pKC1132 x KO75400, pKC1132 x KO67950, pKC1132 x KO79710, pKC1132 x KO03090 und pKC1132 x KO77230 ...... 176
Plasmidkarte von pUWL-H x SD-rslO10 ...... 177
Ergebnisse der Transkriptionsanalyse der 26 Biosynthesegenclusters aus Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in GYM- und in SPY-Medium ...... 177
8 Abkürzungen ...... 179
Aminosäuren ...... 179
Mikroorganismen Stämme ...... 179
Einheiten ...... 180
Nukleotide ...... 180
Physikalische Größen ...... 180
Vorsilben ...... 181
Sonstige Abkürzungen ...... 181
9 Danksagung ...... 187
10 Lebenslauf ...... 190
VI
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung Der Actinomycetenstamm Saccharothrix espanaensis produziert die Saccharomicine A und B, die sowohl in vitro als auch in vivo antibiotische Aktivität gegen multiresistente Staphylococcus aureus- Stämme und Vancomycin-resistente Enterokokken zeigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese von Saccharomicin A und B untersucht, insbesondere die Glycosyltransferase, die die Fucosylierung des Aglykons katalysiert. Mithilfe eines heterologen Testsystems wurde das Gen BN6_58780 (sam17) als Kandidat für diese Funktion bestimmt. Die Analyse der S. espanaensis- Genomsequenz zeigte, dass der Stamm potentiell in der Lage ist, eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten zu produzieren. Trotz der Überexpression von verschiedenen Regulatorgene, konnte unter Laborbedingungen keine Sekundärmetabolit-Produktion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit sollte die Produktion bioaktiver Substanzen, durch die Kultivierung von Saccharothrix espanaensis unter verschiedenen Bedingungen, wieder aktiviert werden. Nach der Kultivierung in SPY-Medium zeigte das organische Extrakt antibakterielle und ausgeprägte antimykotische Aktivität. Hier konnten vier Produkte isoliert und deren Strukturen mittels NMR aufgeklärt werden. Dabei handelt es sich um Anthranilsäure, Indol-3-Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure. Um den Einfluss des SPY- Mediums auf die Genexpression in Saccharothrix espanaensis zu untersuchen wurde nach der Kultivierung des Stamms in SPY- und in GYM-Medium das Transkriptom sequenziert. Durch die RNA- Seq-Analyse wurde bewiesen, dass Medienbestandteile einen Einfluss auf die Expression verschiedener Gene hat. Weiterhin konnten die Gene, die mit hoher Wahrscheinlichkeit an der Biosynthese von Anthranilsäure, Indol-3-Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure beteiligt sind, identifiziert werden. Des Weiteren wurde durch Inaktivierungsversuche bewiesen, dass BN6_01860 und BN6_67950 an der Biosynthese von Indol-3-Carbonsäure, Phenylessigsäure bzw. Benzoesäure beteiligt sind. Zusammen mit weiteren bioinformatischen Analysen führte das zu der Hypothese, dass die isolierten Substanzen Abbauprodukte von Aminosäuren sind.
Saccharothrix espanaensis besitzt diverse Biotransformationsaktivitäten. BN6_60310 kodiert für die Glycosyltransferase Ses60310, welche in diesem Stamm für die Rhamnosylierung von gefütterten
Alizarin verantwortlich ist. Um die Expression von BN6_60310 zu untersuchen, wurde Saccharothrix espanaensis in HA-Medium mit und ohne Alizarin kultiviert. Hiervon wurde ebenfalls RNA isoliert und sequenziert. Die Transkriptomanalyse ergab, dass die meisten Gen nach der Zugabe von Alizarin herunterreguliert sind, darunter auch BN6_60310. Weiterhin zeigte die RNA-Seq-Analyse, dass Alizarin die Expression von Genen, die unter oxidativen Stress Bedingungen exprimiert werden, hochreguliert.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses von L-Fucose auf das Wachstum von Streptomyces albus. Hierzu wurde das Gen wcaG in Streptomyces albus eingebracht, um L-Fucose zu produzieren. Dadurch konnte bestätigt werden, dass L-Fucose das Wachstum von Streptomyces albus deutlich steigern kann.
1
Zusammenfassung
Im Rahmen der Untersuchung zur Biosynthese der Rishirilide wurde in dieser Arbeit das Intermediat JW-1 aus der Mutante S. albus x cos4ΔrslO8 isoliert und dessen Struktur aufgeklärt. Des Weiteren wurde eine Punktmutation in dem C9-Ketoreduktasegen rslO10 des Rishirilid-Biosynthesegenclusters generiert. Hierfür wurde die konservierte Aminosäure Serin an Position 154 im katalytischen Zentrum durch ein Alanin ausgetaucht. Das mutierte Gen wurde in pUWL-H kloniert und in S. albus x cos4ΔrslO10 eingebracht. In S. albus x cos4ΔrslO10 und S. albus x cos4ΔrslO10 x pUWL- H-SD-rslO10 konnten die gleichen Intermediate detektiert wurden.
In dieser Arbeit wurde weiterhin die Kollagenstabilisierungsaktivität durch Prolyl-4-Hydroxylasen in Pilzen untersucht. Hierzu wurden Gene, die für putative Prolyl-4-Hydroxylasen kodieren, in Aspergillus nidulans identifiziert. Eins davon wurde erfolgreich inaktiviert und dessen Funktion weiteruntersucht.
2
Einleitung
2 Einleitung
3
Einleitung
Naturstoffe aus Actinomyceten Naturstoffe und davon abgebildete Derivate bleiben die wichtigste Quelle für neue Arzneistoffe. Die Synthese von Naturstoffen findet vor allem in höheren Pflanzen und Mikroorganismen statt [1], [2]. Unter den Mikroorganismen sind neben Pilzen hauptsächlich Vertreter der Ordnung Actinomycetales eine gute Quelle für neue Naturstoffe [3]. Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales sind Gram- positive Bakterien mit einem hohen GC-Gehalt [4]. Sie kommen vorwiegend im Boden vor und leben bis auf wenige Ausnahmen aerob. Zum Teil wurden auch Actinomyceten von Meeressedimenten und marinen Schwämmen isoliert [5], [6]. Neben dem für das Wachstum und die Entwicklung essentiellen Primärstoffwechsel können Actinomyceten viele bioaktive Sekundärstoffe produzieren, welche für sie nicht unmittelbar lebensnotwendig sind. Sekundärmetabolite dienen ihren Produzenten als Sexualhormone, Ionophore, Mittel zur Abwehr von anderen Bakterien, Pilzen, Amöben, Insekten und Pflanzen oder Effektoren der Differenzierung [7]. Unter den bioaktiven Sekundärstoffen, die von Actinomyceten produziert werden, sind Antibiotika wie zum Beispiel Vancomycin (Amycolatopsis orientalis), Erythromycin (Saccharopolyspora erythraea), Gentamicin (Micromonospora sp.), Kanamycin (Streptomyces kanamyceticus), Streptomycin (Streptomyces griseus) und Rifamycin (Amycolatopsis mediterranei) [8]. Nicht nur Antibiotika sind für Actinomyceten typische Sekundärmetabolite, sondern auch Pigmente (z. B. Melanin, Actinorhodin), Zytostatika (Actinomycin D), Immunsuppressiva (Rapamycin) oder Geruchsstoffe wie die für den erdigen Geruch von Waldboden verantwortliche Substanz Geosmin [9].
Abbildung 2.1 Strukturformel von Naturstoffen aus Actinomyceten. Rifamycin B (Amycolatopsis mediterranei) [10] und Geosmin [11].
Weiterhin besitzen Actinomyceten auch die Fähigkeit Biopolymere wie Cellulose oder Chitin abzubauen [12], [13].
Häufig sind Gene, die an einem Biosyntheseweg eines Naturstoffs beteiligt sind, am gleichen Ort in einem so genannten "Gencluster" auf dem Bakterienchromosom angeordnet [14]. Aufgrund dieser Eigenschaft kann durch Identifizierung eines Gens oft, alle für die Biosynthese des korrespondieren Naturstoffs benötigte Gene aufgefunden werden [15]. 4
Einleitung
2.1.1 Glycosylierte Naturstoffe aus Actinomyceten Viele Naturstoffe liegen glycosyliert vor und die meisten davon bestehen aus einem Aglykon, das mit einem oder mehreren Zuckereinheiten verknüpft ist. Die Zuckerbausteine sind in vielen Naturstoffen für ihre Bioaktivität essentiell [16]. Ein Beispiel dafür ist das Antibiotikum Erythromycin, welches von Saccharopolyspora erythraea produziert wird. Hier sind die beiden Zucker-Einheiten für dessen in vivo Aktivität notwendig. Weiterhin zeigt Megalomycin, welches durch Hinzufügen des Zuckers L- Megosamin aus Erythromycin gebildet wird (Abbildung 2.2), auch eine antiparasitäre und antivirale Aktivität [17]. Ein weiteres Beispiel ist das Zytostatikum Daunorubicin, bei dem der Daunosamin- Zucker die Interkalation mit dem DNA-Strang ermöglicht [16]. Durch fehlende Glycosylierung nimmt ebenfalls die antimykotische Wirkung von Nystatin und Amphotericin B drastisch ab [18], [19]. Des Weiteren kann die Variation der an ein Aglykon gebundenen Zuckersubstituenten zu einer Veränderung der pharmakodynamischen und pharmakinetischen Eigenschaften, als auch des Aktivitätsspektrums des Wirkstoffes führen. Das wurde im Fall der Antibiotika Vancomycin und Balhimycin, die dasselbe Aglykon aber unterschiedliche Zucker-Einheiten besitzen, nachgewiesen. Balhimycin zeigt im Vergleich zu Vancomycin eine stärkere antibiotische Aktivität gegen anaeroben Bakterien [20], [21]. Aus diesem Grund haben glycosylierte Naturstoffe eine große Bedeutung in der Naturstoffforschung [22].
Abbildung 2.2 Strukturformeln glycosylierter Naturstoffe aus Actinomyceten. Erythromycin, Megalomycin, Balhimycin und Vancomycin.
5
Einleitung
Der Actinomycetenstamm Saccharothrix espanaensis Der Stamm Saccharothrix espanaensis (S. espanaensis) gehört zu den Gram-positiven Bakterien der Familie Pseudonocardiaceae und zur Ordnung Actinomycetales. S. espanaensis wurde aus einer in Spanien gesammelten Bodenprobe isoliert und von Labeda et al. beschrieben [23]. Der Stamm produziert die Oligosaccharid-Antibiotika Saccharomicin A und B, welche in vitro und in vivo antibiotische Aktivität gegen multiresistente Staphylococcus aureus-Stämme und Vancomycin- resistente Enterokokken zeigen [24], [25]. Bislang konnten in diesem Stamm keine weiteren Sekundärmetabolite detektiert werden. S. espanaensis bildet, im Gegensatz zu vielen anderen Vertretern dieser Ordnung, keine Sporen. Abbildung 2.4 zeigt Aufnahmen von S. espanaensis-Einzelkolonien auf verschiedenen Agarmedien sowie eine mikroskopische Aufnahme einer Flüssigkultur.
A B C
Abbildung 2.3 Aufnahmen von S. espanaensis-Einzelkolonien auf A. auf MS-Medium, B. auf TSB-Medium. C. Mikroskopische Aufnahme einer Flüßigkultur. 2.2.1 Sequenzanalyse des Genoms von Saccharothrix espanaensis Das Genom von S. espanaensis wurde vollständig sequenziert und von T. Strobel im Laufe ihrer Dissertation analysiert und annotiert. T. Strobel zeigte, dass das zirkuläre Chromosom von S. espanaensis aus 9.360.653 bp besteht und 8.427 CDS (Coding DNA Sequence), die möglicherweise für Proteine kodieren, enthält. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Genom 26 Gencluster, die potentiell zur Bildung von Sekundärmetaboliten führen, besitzt [26]. Die Cluster wurden nach den putativ produzierten Produkten folgendermaßen eingeteilt: sieben Terpen-Cluster (tcp), zwei Lantibiotikum- Cluster (lan), ein Melanin-Cluster (mel), ein Aminocyclitol-Cluster, 14 Polyketid-, nichtribosomal gebildete Peptid-Cluster und Hybride-Cluster (PKS (Polyketid Synthase), NRPS (Nicht Ribosomale Peptide Synthetasen) und PKS/NRPS Hybride) und das Saccharomicin-Cluster (sam-Cluster).
2.2.2 Saccharothrix espanaensis als Naturstoff-Produzent und als Biotransformationswirt Aufgrund der von T. Strobel durchgeführten Sequenzanalyse wurde angenommen, dass S. espanaensis prinzipiell in der Lage ist, zahlreiche Sekundärmetaboliten zu produzieren. Die identifizierten Gencluster, insbesondere die PKS, NRPS und PKS/NRPS-Hybride-Cluster, wurden genau untersucht
6
Einleitung und mit ähnlichen bekannten Clustern aus anderen Mikroorganismen, welche für die Produktion bereits charakterisierter Sekundärmetaboliten verantwortlich sind, verglichen. Produktionskulturen von S. espanaensis wurden mithilfe dieser Informationen intensiv auf das Vorhandsein strukturell verwandter Substanzen untersucht. Es konnte aber bislang keine weitere Naturstoff-Produktion außer der von Saccharomicine A und B in S. espanaensis detektiert werden. Unter Laborbedingungen werden jedoch auch die Saccharomicine A und B nicht produziert. M. Kaszubowska hat im Rahmen ihrer Diplomarbeit die Regulatorgene sam1 und sam3, die für putative Transkriptionsregulatoren kodieren, und sam4, das für einen putativen positiven Regulator mit Ähnlichkeit zu NovE aus Frankia alni kodiert [27], aus dem sam-Cluster in S. espanaensis überexprimiert. Sie konnte jedoch keine antibiotische Aktivität des Kulturextrakts detektieren. Daraus wurde gefolgert, dass weder die Saccharomicine A und B noch andere antibiotisch aktive Metaboliten produziert wurden [28]. Weiterhin hat T. Heitzler in ihrer Doktorarbeit versucht, verschiedene Cluster aus S. espanaensis durch Überexpression von SARP- und LuxR Regulatoren zu aktivieren. Sie konnte ebenfalls keine Produktion neuer Substanzen nachweisen [29].
S. espanaensis besitzt neben der Fähigkeit zur möglichen Produktion von Sekundärmetaboliten auch eine diverse Biotransformationsaktivitäten. A. Linnenbrink konnte im Laufe seiner Arbeit beweisen, dass S. espanaensis Anthrachinone wie Alizarin und Emodin aufnimmt und mit α-L-Rhamnose glycosylieren kann. Die Glycosyltransferase, die für die Rhamnosylierungsreaktion verantwortlich ist, konnte von T. Strobel identifiziert werden [30]. Es wurde zudem über die Strukturaufklärung der Biotransformationsprodukte gezeigt, dass dieser Stamm neben der Glykosylierungs- auch eine Hydroxylierungsaktivität besitzt [31]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte eine Transkriptomanalyse durchgeführt werden, um den Einfluss von Anthrachinonen auf die Transkription der identifizierten Glycosyltransferase, sowie die Transkription aller anderen Gene, zu untersuchen.
2.2.3 Die Saccharomicine A und B Es wurde bereits beschrieben, dass S. espanaensis in der Lage ist, eine antibiotisch wirksame Substanz, die zunächst als LL-C19004 bezeichnet wurde, zu produzieren [24]. Kong et al. zeigten, dass es sich bei LL-C19004 um einen Komplex aus Saccharomicine A und B handelt und konnten die Strukturen der beiden Antibiotika aufklären [24]. Die Saccharomicine A und B besitzen eine besondere Struktur. Sie bestehen aus 17 O-glycosidisch miteinander verknüpften Desoxyhexose-Einheiten, darunter eine sulfonierte Fucose, und dem einzigartigen Aglykon N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-Taurin, einem Derivat der trans-Kaffeesäure. In Abbildung 2.4 sind die Strukturformeln der Saccharomicine A und B dargestellt. Die Saccharomicine zeigen in vitro potente antimikrobielle Aktivität mit 0,12-16 µg/mL (MIC) gegen multiresistente Staphylococcus aureus-Stämme und Vancomycin-resistente Enterokokken, 0,25-128 µg/mL (MIC) gegen E. coli und >128 µg/mL (MIC) gegen Candida albicans [24], [25]. Die Aktivität der Saccharomicine wurde auch in vivo untersucht und deren antibiotische Wirkung gegenüber pathogenen Keimen bestätigt [24], [25]. Wegen der geringen therapeutischen Breite
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Einleitung der Saccharomicine wurde die Entwicklung dieser Substanzen für die systemische Anwendung nicht weiter vorangetrieben. Andererseits wurde aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit der beiden Antibiotika in Betracht gezogen, dass sie für topische Anwendungen in Frage kommen könnten [25].
Bei den 17 Monosaccharid-Einheiten handelt es sich um die Desoxyhexosen Fucose, Saccharosamin, Rhamnose, 4-epi-Vancosamin und Digitoxose. Die Saccharomicine A und B unterscheiden sich aufgrund des Monosaccharids an Position 10, bei welchem es sich in Saccharomicin A um Rhamnose handelt, in Saccharomicin B jedoch um eine Digitoxose (Abbildung 2.4). Es wurde bewiesen, dass die Fucose- und Saccharosamin-Einheiten eine D-Konfiguration besitzen [24], [32], [33]. Die absolute Konfiguration der weiteren Desoxyhexose-Einheiten wurde experimentell bislang nicht bestimmt, sondern so dargestellt, wie sie in der Natur am häufigsten vorkommen.
Abbildung 2.4 Strukturformeln der Oligosaccharid-Antibiotika Saccharomicin A (A; Mr = 2795) und Saccharomicin B (B; Mr = 2779). Fuc: D-Fucose; Sac: D-Saccharosamin; Rha: L-Rhamnose; Eva: L-4-epi- Vancosamin; Dig: L-Digitoxose. Die Konfigurationen der Monosaccharide-Einheiten wurden so dargestellt, wie sie in der Natur am häufigsten vorkommen [25], mit Ausnahme der Konfigurationen von Fucose und Saccharosamin, die experimentell ermittelt wurden [24], [32], [33].
Es wurde gezeigt, dass die Sulfonsäuregruppen des Aglykons und der an das Aglykon gebundenen Fucose deprotoniert vorliegen. Weiterhin liegen die Aminogruppen der beiden 4-epi-Vancosamin- Einheiten an der Enden der verzweigten Zuckerkette protoniert vor [24]. Deshalb wird angenommen, dass die Saccharomicin-Moleküle als vierfach geladene Zwitterionen existieren. Demzufolge könnten die Moleküle in zwei „Schleifen“ vorliegen und durch Interaktion mit der bakteriellen Membran zur Lyse der Zellen führen. Diese Theorie wurde von Singh et al. durch mikroskopische Untersuchung unterstützt. Darüber hinaus zeigten Singh et al., dass Saccharomicin A zu einer unspezifischen Hemmung von DNA-, RNA- und Proteinsynthese in B. subtilis führt [25].
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Einleitung
Untersuchung der Biosynthese der Saccharomicine Durch Screening einer Cosmid-Bibliothek aus S. espanaensis-Genom, die von K. Welzel von der Combinature Biopharm AG erstellt wurde, konnte M. Berner im Rahmen seiner Doktorarbeit das Saccharomicin-Biosynthesegencluster identifizieren [34]. Er zeigte, dass dieses Cluster aus 38 Genen, die insgesamt ca. 47 kb groß sind, besteht, und auf den beiden Cosmiden cos17 und cos35 lokalisiert ist. Die erhaltenen Informationen über das sam-Cluster konnten von T. Strobel durch eine Sequenzanalyse des S. espanaensis-Genoms bestätigt werden [35]. In Abbildung 2.5 ist die Organisation der Gene des sam-Clusters dargestellt.
Abbildung 2.5 Organisation der Gene des Saccharomicin-Clusters aus S. espanaensis [26].
M. Berner konnte nachweisen, dass die heterologe Expression von sam5 und sam8 aus dem sam-Cluster in Streptomyces fradiae XKS zur Bildung von Kaffeesäure führt. Kaffeesäure ist ein Teil des Saccharomicin-Aglykons und wird mit D-Fucose, der erste Zucker der Zuckerkette, verknüpft. Damit konnte er bestätigen, dass dieses Cluster für die Biosynthese von Saccharomicin verantwortlich ist.
Das sam-Cluster enthält zehn Gene, die für Glycosyltransferasen (GTs) kodieren [34]. Diese Gene sollten insgesamt 17 Desoxyhexose-Einheiten übertragen und die Glycosylierungsreaktionen bei der Saccharomicin-Biosynthese katalysieren. Die Betrachtung der Struktur der Saccharomicine A und B legt nahe, dass zehn Glycosylierungsschritte am Biosyntheseweg des Saccharomicins A und zwölf Glycosylierungsschritte am Biosyntheseweg des Saccharomicins B stadtfinden sollen (siehe Tabelle 2.1). Dabei müssten ein oder zwei der GTs für die Übertragung mehrerer Zucker verantwortlich sein. Es könnte auch sein, dass GTs außerhalb des sam-Clusters Glycosylierungsreaktionen katalysieren.
Tabelle 2.1 Die katalysierten Reaktionen der Glycosyltransferasen (GTs), die an der Biosynthese der Saccharomicine A und B beteiligt sind.
GTs für Saccharomicin A-Biosynthese GTs für Saccharomicin B-Biosynthese
Übertragener Zucker Akzeptor Übertragener Zucker Akzeptor
D-Fucose trans-Kaffeesäure D-Fucose trans-Kaffeesäure
D-Saccharosamin D-Fucose D-Saccharosamin D-Fucose
D-Fucose D-Saccharosamin D-Fucose D-Saccharosamin
L-Rhamnose D-Fucose L-Rhamnose D-Fucose
D-Saccharosamin L-Rhamnose D-Saccharosamin L-Rhamnose
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L-4-epi-Vancosamin D-Fucose L-4-epi-Vancosamin D-Fucose
L-Digitoxose D-Fucose L-Digitoxose D-Fucose
L-4-epi-Vancosamin L-Digitoxose L-4-epi-Vancosamin L-Digitoxose
L-Digitoxose L-4-epi-Vancosamin L-Digitoxose L-4-epi-Vancosamin
L-4-epi-Vancosamin L-4-epi-Vancosamin L-4-epi-Vancosamin L-4-epi-Vancosamin
D-Saccharosamin L-Digitoxose
L-Digitoxose D-Fucose
Vorkommen, Biosynthese und Übertragung von D-Fucose Das Desoxyhexose Monosaccharid D-Fucose ist ein Bestandteil von Saccharomicine A und B [33]. Dieser Zucker kommt selten in Bakterien vor, konnte aber in einigen Bakterien als Komponente von Polysacchariden identifiziert werden [36], [37]. In bakteriellen Sekundärmetaboliten wurde D-Fucose als Bestandteil der Avilamycine und Everninomicine, die aus Streptomyces viridochromogenes Tü57 bzw. Micromonospora carbonaceae isoliert wurden, nachgewiesen [38]–[40]. Weiterhin ist D-Fucose auch Baustein von Chartreusin, einem von Streptomyces chartreusis produzierten Naturstoff mit antibakterieller und zytostatische Aktivität (siehe Abbildung 2.6) [41].
Abbildung 2.6 Strukturformel von Chartreusin aus Streptomyces chartreusis. D-Fucose (rot) ist, wie bei Saccharomicin A und B, O-glycosidisch mit dem Aglykon verknüpft [41].
Die Biosynthese von D-Fucose wurde in dem Stamm Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Y4 (A. actinomycetemcomitans Y4) genau untersucht und die für die Biosynthese benötigten Gene identifiziert [37]. Es konnte gezeigt werden, dass D-Fucose aus D- Glucose-1-phosphat als Ausgangssubstrat über drei Reaktionsschritte synthetisiert wird. Die beiden Enzyme Glucose-1-phosphat-Thymidylyltransferase (RmlA) und dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase
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(RmlB) katalysieren die ersten beiden Reaktionen der Biosynthese von dTDP-D-Fucose und auch von dTDP-L-Rhamnose. Zuletzt wird D-Fucose mittels der dTDP-4-keto-6-deoxy-D-Glucose-Reduktase (Fcd) gebildet (siehe Abbildung 2.7). Für Streptomyces chartreusis wurde aufgrund einer Sequenzvergleich-Analyse mit den Genen aus A. actinomycetemcomitans Y4 postuliert, dass die Gene chaS1, chaS2, chaS3 und chaS4 an der Biosynthese von D-Fucose beteiligt sind, wobei entweder chaS3 oder chaS4 die Funktion von Fcd übernehmen könnte [41].
Abbildung 2.7 Biosyntheseweg von D-Fucose und L-Rhamnose in A. actinomycetemcomitans Y4. RmlA ist eine Glucose-1-phosphat-Thymidylyltransferase, RmlB ist eine dTDP-D-Glucose-4,6-Dehydratase, Fcd ist eine dTDP- 4-keto-6-deoxy-D-Glucose-Reduktase, RmlC ist eine dTDP-4-Keto-6-deoxy-D-Glucose-3,5-Epimerase und RmlD ist eine dTDP-4-Keto-L-Rhamnose-Reduktase [37].
Die Übertragung von D-Fucose auf den entsprechenden Akzeptor während der Biosynthese der verschiedenen Naturstoffe, die D-Fucose in ihrer Struktur enthalten, wurde jedoch in keinem Stamm experimentell untersucht. In Chartreusin ist die D-Fucose mit dem Bislakton-Aglykon, einem aromatischen Polyketid, verknüpft (siehe Abbildung 2.6). Das Cluster von Chartreusin enthält zwei Gene, chaGT1 und chaGT2, die möglicherweise für GTs kodieren. Es wurde postuliert, dass chaGT1 für die Fucosylierung des Aglykons verantwortlich ist, während chaGT2 die Übertragung von Digitalose katalysiert [41]. Weiterhin wurde für Streptomyces viridochromogenes Tü57 postuliert, dass während der Biosynthese von Avilamycine die GTs AviGT3 und AviGT4 L-Rhamnose- und D-Mannose- Einheiten übertragen, und dass entweder AviGT1 oder AviGT2 eine Fucosyltransferase darstellt [42]. In S. espanaensis wurden ebenfalls nur in silico Untersuchungen durchgeführt, um die an der Saccharomicin-Biosynthese beteiligten Glycosyltransferasegene zu identifizieren. Die Untersuchungsergebnisse zeigten, dass zehn Gene aus dem sam-Cluster möglicherweise für Glycosyltransferasen kodieren. Darunter sollte auch ein Genprodukt die Übertragung der D-Fucose, bzw. die Fucosylierung des Aglykons katalysieren [34], [35].
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Vorkommen, Einfluss und Biosynthese von L-Fucose L-Fucose ist eine Desoxyhexose und kommt sowohl in prokaryotischen als auch eukaryotischen Lebenswesen vor. Sie ist am Primärstoffwechsel, sowie an der posttranslationalen Modifikation von Proteinen beteiligt [43]. In Darmbakterien wurden das Vorkommen und der Einfluss von L-Fucose untersucht. Es wurde bewiesen, dass L-Fucose eine wichtige Rolle für das Wachstum und bei der Kolonisierung von pathogenen Darmbakterien spielt [44]. L-Fucose ist ein Bestandteil der Polysaccharide des Mucins (z. B. Darmschleimhaut) und wird durch das Enzym Fucosidase abgespalten, wodurch es als Nährstoffquelle für Darmbakterien dienen kann [45]. Alle untersuchten Bakterien besitzen in ihrem Genom ein Gen, welches für eine Fucose-Permease kodiert. Über diesen Transporter wird L-Fucose aufgenommen und in den Bakterien über verschiedene enzymatische Reaktionen abgebaut. Pyruvat und Laktat sind Abbauprodukte von L-Fucose, die zum Wachstum und zur Kolonisierung verwendet werden [46]. L-Fucose kann nicht nur aus dem Medium aufgenommen werden, sondern auch in den Zellen de novo synthetisiert werden. Zur Biosynthese von L-Fucose gibt es Untersuchungen in Bakterien, Pflanzen und Säugerzellen [47], [48]. In diesen wurde gezeigt, dass die aktive Form, GDP-L-Fucose, ausgehend von GDP-L-Mannose über drei Reaktionsschritte synthetisiert wird. Dabei sind zwei Enzyme beteiligt, die GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) und das bifuntionelle Enzym GDP-4-keto-6-Deoxymannose-3,5-Epimerase-4-Reduktase (WcaG). . GDP-Mannose wird ausgehend von Glucose-6-Phosphat über fünf Reaktionsschritte synthetisiert. Dies geschieht unter Katalyse der Enzyme Phosphomannose-Isomerase, Mannose-6-Phosphat-Isomerase (ManA), Phosphomannomutase (ManB), Mannose-1-phosphatguanyltransferase (ManC) und GDP- Mannose-Pyrophosphorylase.
In Actinomyceten gibt es bislang keine Studien über den Einfluss von L-Fucose auf das Wachstum. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Stamm Streptomyces albus (S. albus) gewählt, um den Effekt von L-Fucose zu untersuchen.
Der OSMAC-Ansatz (One Strain Many Compounds) Der OSMAC-Ansatz (One Strain Many Compounds) ist eine einfache und kostengünstige Methode, um die Produktion vieler Naturstoffe in Mikroorganismen zu aktivieren und wurde erstmals von Höfs et al. beschrieben [49]. Die Anwendung des OSMAC-Ansatzes erwies sich bei der Suche nach neuen Naturstoffen aus Actinomyceten als sehr effizient. Die Analyse der durch Genomsequenzierung zahlreicher Actinomycetenstämme erhaltenen Daten zeigt, dass jeder Stamm eine Vielzahl an Genclustern im Genom enthält, welche an der Produktion neuer Sekundärmetaboliten beteiligt sind [50]. Unter den in silico identifizierten Biosynthesegenclustern sind viele als kryptische Cluster bezeichnet, da sie unter Laborbedingungen nicht in der Lage sind, die entsprechenden Produkte zu bilden [51].
Der OSMAC-Ansatz beinhaltet das Variieren von Kultivierungsparametern wie Medienzusammensetzung, Belüftung, Temperatur, Kulturgefäße oder Zugabe von Enzym-
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Hemmstoffen, wodurch die Produktion von Sekundärmetaboliten eines Stamms gesteigert werden kann [49], [52]. In Aspergillus ochraceus konnte so 15 neuen Metaboliten und in Sphaeropsidales sp. F-24707 acht neuen Produkten detektiert werden [52]. In Streptomyces sp. G16 wurde die Zahl der produzierten Naturstoffe nach Variation des Kultivierungsmediums deutlich erhöht [53]. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Zusatz von Signalstoffen oder organischen Lösungsmitteln zur Erhöhung der chemischen Diversität führen kann [54], [55]. Beispielsweise wurde der Einfluss von Scandium (Sc), welches zu den seltensten Elementen der Erde zählt, auf Streptomyceten untersucht. Die Zugabe von ScCl3 in einer Konzentration von 10-100 µM zu Kulturen von Streptomyces coelicolor A3(2) (S. coelicolor), Streptomyces antibioticus und Streptomyces griseus konnte die jeweilige Antibiotika-Produktion um das zwei- bis 25 fach verstärken [56]. Des Weiteren konnte in Streptomyces lividans der Zusatz von
ScCl3 die Actinorhodin-Produktion induzieren [56]. Diese Wirkung wurde auf die erhöhte Transkription der positiven Regulatoren wie actII-ORF4 in S. coelicolor zurückgeführt [56]. Das S. espanaensis- Genom hat 26 putative Sekundärmetabolit-Gencluster. Bislang wurden außer den Saccharomicine A und B keine Produkte aus diesem Stamm aufgereinigt. Die hohe Anzahl der kryptischen Cluster macht diesen Stamm zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Aktivierung dieser Cluster. S. espanaensis wurde bereits unter verschiedenen Bedingungen kultiviert, um die Produktion neuer Substanzen zu aktivieren. Der Stamm konnte in bestimmten Medien antibiotisch aktive Substanzen produzieren. Die Metabolite wurden aber nicht weiter charakterisiert [57]. In den letzten Jahren war es in unserem Labor nicht möglich Saccharomicine A und B zu detektieren. Aus diesem Grund wurde der Stamm im Rahmen dieser Arbeit unter verschiedenen Bedingungen kultiviert und die Produktion mittels unterschiedlicher Methoden untersucht.
Durch die Überxpression von Regulatoren konnten in viele Fällen kryptische Gencluster zur Produktion neuer Sekundärmetaboliten aktiviert werden [58], [59]. Ein besonders gut untersuchtes Beispiel ist der Einfluss von bldA auf die Aktivierung verschiedener Gencluster in Actinomyceten, sowie auf die Morphologie der untersuchten Stämme [60], [61]. bldA kodiert für die einzige tRNA des seltenen UUA- Codons, welches eines der sechs Leucin-Codons ist [62]. Das UUA-Codon kommt in Actinomyceten- Genom wegen des hohen GC-Gehalts sehr selten vor. Es wurde bereits gezeigt, dass das Genom von S. coelicolor nur 145 Gene mit einem TTA-Codon besitzt [63]. Weiterhin führte die Inaktivierung des bldA-Gens in S. coelicolor zu einer Veränderung der Morphologie sowie zu einem anderen Metabolitenprofil [64]. Kalan et al. konnten zeigen, dass die konstitutive Expression von bldA aus S. coelicolor in Streptomyces calvus, welcher eine Mutation im eigenen bldA-Gen hat, zur Produktion neuer Sekundärmetaboliten sowie zur Luftmyzelbildung und Sporulation des Stamms führte [65].
Weitere Beispiele für Regulatoren, die Gencluster in Actinomyceten aufwecken können, sind Proteine aus der Gruppe der SARP- und LuxR-Regulatoren. Die Überexpression solcher Regulatorgenen, sowie von transkriptionellen Regulatoren aus dem sam-Cluster in S. espanaensis führte zu keinen neuen
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Naturstoffen [28], [29]. In dieser Arbeit wurde das Gen bldA in S. espanaensis heterolog exprimiert und dessen Wirkung auf den Stamm untersucht.
Aromatische Aminosäuren in Mikroorganismen
2.5.1 Tryptophan
Die Tryptophan-Biosynthese Tryptophan (Trp) ist eine aromatische Aminosäure und gehört zu den Aminosäuren, die für die Bildung von Peptiden und Proteinen essentiell sind. Da sie im menschlichen Körper nicht hergestellt werden kann, muss sie mit der Nahrung zugeführt werden. Am häufigsten liegt Tryptophan in der L- Konfiguration vor. In Mikroorganismen wird Tryptophan wie auch andere Aminosäuren nicht nur als Proteinbaustein, sondern auch als Vorstufe bei der Nukleotid- und Zellwand-Biosynthese verwendet. Tryptophan kommt im Vergleich zu den anderen Aminosäuren am seltensten in Proteinen vor. Die Biosynthese von Tryptophan ist biologisch aufwendig und kompliziert [66]. Sie wurde in zahlreichen Mikroorganismen und Pflanzen untersucht und die dafür benötigten Gene wurden identifiziert [66]– [69]. Sieben Gene katalysieren die Biosynthese von L-Tryptophan aus Chorismat, welches aus dem Shikimisäureweg abgeleitet wird. Im ersten Schritt wird Chorismat über die Anthranilat-Synthase TrpG und TrpE in Anthranilat umgewandelt. Anschließend überträgt die Anthranilat- Phosphoribosyltransferase (TrpD) ein Phosphoribosyl von Phosphoribosylpyrophospht (PRPP) auf Anthranilat und es entsteht N-(5-Phosphoribosyl)-Anthranilat. Die Phosphoribosylanthranilat- Isomerase (TrpF) katalysiert die Umlagerung des Riboseanteils und führt zur Bildung von 1-(O- Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose-5-phosphat. Dieses wird weiterhin durch die Indol-3- Glycerolphosphat-Synthase (TrpC) in Indol-3-Glycerolphosphat umgesetzt. Durch den Tryptophan- Synthase-Polypeptidkomplex TrpA und TrpB wird Indol abgespaltet und nach Kondensation mit L- Serin wird L-Tryptophan gebildet (siehe Abbildung 2.8) [66]. Die an der Biosynthese von Tryptophan beteiligten Enzyme sind in allen Tryptophan-produzierenden Mikroorganismen konserviert [66], [70].
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Abbildung 2.8 Biosyntheseweg von L-Tryptophan [66]. Tryptophan als Baustein in Sekundärmetaboliten Tryptophan ist nicht nur am Primärmetabolismus beteiligt, sondern auch an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten. Viele Tryptophanhaltigen Sekundärmetabolite haben unterschiedliche biologische Aktivitäten und werden als Antibiotika, Antikrebsstoffe, Antiphlogistika, Herbizide und Immunsuppressiva verwendet [71], [72]. Ein Beispiel dafür sind die über NRPS produzierten Naturstoffe Cyclomarazin A und B, sowie Cyclomarin A-D aus Salinospora arenicola CNS-205 [73]. Die Chromopyrrolinsäure aus dem Pilz Lycogala epidendrum wird durch oxidative Dimerisierung von L-Tryptophan gebildet [74]. Chromopyrrolinsäure dient als Intermediat bei der Biosynthese von bioaktiven Tryptophan-Dimeren (TDs) wie z. B. Hydroxysporin und Reductasporin. Beide Substanzen besitzen wie auch andere TDs eine antibakterielle bzw. antimykotische Aktivität [75]. Weiterhin wurde bewiesen, dass L-Tryptophan ein essentieller Baustein bei der Biosynthese von dem Indol-Alkaloid Bisindole ist [76].
S. coelicolor produziert das Lipopeptid Calcium-abhängiges Antibiotikum CDA, welches in seine Peptidkern L- sowie D-Tryptophan enthält [77], [78]. In Abbildung 2.9 sind die Strukturen von Tryptophanhaltigen-Antibiotika dargestellt.
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Abbildung 2.9 Beispiele von Tryptophanhaltigen Antibiotika. Cyclomarazin A [73], Reductasporin [75] und CDA [78]. Regulierung der Tryptophan Biosynthese- und Abbaugene Die Regulierung der Tryptophan-Biosynthese wurde in verschiedenen Bakterien untersucht und verschiedene Regulationsmechanismen wurden beschrieben [68]. In E. coli wurde gezeigt, dass die Tryptophan-Biosynthese durch die Genprodukte von trpR und trpL, welche für einen Tryptophan- Repressor und ein Tryptophan-reiches Leiter-Peptid kodieren, reguliert wird. Weiterhin beeinflusst Tryptophan, auch in E. coli, durch eine allosterische Feedback-Inhibierung die Anthranilat-Synthase [79]–[81]. In Bacillus subtilis wurde ein anderer regulatorischer Mechanismus beschrieben. Hier regulieren die Genprodukte von mtrB und rtpA die Expression der Trp-Biosynthesegene, welche für ein RNA-bindendes Attenuierungsprotein (TRAP) bzw. für ein anti-TRAP kodieren. Tryptophan hat hier ebenfalls einen inhibitorischen Einfluss auf die Anthranilat-Synthase [80], [82], [83]. Palazzotto et al. haben nachgewiesen, dass in S. coelicolor, im Gegensatz zu den bislang identifizierten Mechanismen, Tryptophan keinen negativen Einfluss auf die Expression der Biosynthesegene hat. Das könnte an der Beteiligung von Tryptophan an der Sekundärmetabolit-Biosynthese liegen. Weiterhin zeigten Palazzotto et al., dass Tryptophan eine stimulierende Wirkung auf die Produktion von Antibiotika, sowie auf die morphologische Entwicklungen in diesem Actinomycetenstamm besitzt [84].
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2.5.2 Phenylalanin Phenylalanin ist eine aromatische Aminosäure, die in Bakterien und Pflanzen gebildet wird. Sie dient als Baustein in Proteinen und als Vorstufe in der Biosynthese von aromatischen Produkten [85]. Bislang wurde zwei Biosynthesewege ausgehend von Chorismat beschrieben, die als Phenylpyruvatweg und Arogenatweg bezeichnet wurden [86]–[88]. In dem Actinomyceten Amycolatopsis methanolica konnte die Umsetzung von Chorismat zu Phenylalanin nur über den Phenylpyruvatweg nachgewiesen werden. Hier katalysiert die Chorismatmutase die Umlagerung von Chorismat in Prephenat, welches anschließend über die Prephenatdehydratase in Phenylpyruvat umgesetzt wird. Die Phenylpyruvat- Transaminase bildet daraufhin Phenylalanin aus Phenylpyruvat [89], [90]. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Enzyme, die an der Biosynthese von L-Phenylalanin beteiligt sind, einer Feedback-Inhibierung durch Phenylalanin-unterliegen [90].
Der weitere Metabolismus von Phenylalanin ist in Pflanzen und Mikroorganismen gut untersucht und verschiedenen Abbauwege wurden aufgeklärt [91], [92]. Der Abbau von Phenylalanin erfolgt über die Intermediate Phenylpyruvat, Phenylethylamin oder Zimtsäure. Dabei entsteht verschiedene Derivate, welche entweder Endprodukte sind oder als Vorstufe in der Biosynthese anderer Metaboliten dienen [93], [94].
RNA-Sequenzierung Als Transkriptom wird die Gesamtheit aller RNA-Moleküle, einschließlich mRNA, rRNA, tRNA und nichtkodierender RNAs, einer Zelle bezeichnet. Die Transkriptomanalyse spielt eine entscheidene Rolle bei der Interpretation funktioneller Elemente eines Genoms. Durch Transkriptomik oder Genexpressionsanlaysen kann die Transkription eines Gens sowie die Änderungen in dessen Expression bei unterschiedlichen Bedingungen ermittelt werden.
Verschiedene Technologien wie Northern Blot [95], SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) [96], Microarray [97], quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und RNA-Sequenzierung wurden entwickelt, um die Genexpression zu untersuchen. Microarray ist eine relativ preiswerte Hochdurchsatzmethode, die auf Hybridisierung zwischen Sonden und RNA basiert. Jedoch hat diese Methode auch einige Nachteile, wie bespielsweise ein hohes Hintergrundrauschen und eine geringe Auflösung [98], [99].
Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine moderne Methode zur Untersuchung des gesamten Transkriptoms einer Zelle. Diese Methode basiert auf Next-Generation Sequencing, wodurch cDNA- Sequenzen unmittelbar bestimmt werden können. Dadurch bietet die Methode klare Vorteile gegenüber anderer Techniken. Sie ermöglicht die Untersuchung komplexer Transkriptome, die Erforschung der Transkriptome von Organismen mit unbekannter Genomsequenz und zeigt dabei nur geringes Hintergrundrauschen, hohe Auflösung und gute Reproduktionsraten [100], [101]. Dieses Verfahren ist allerdings im Vergleich zu den anderen deutlich kostspieliger. Es werden verschiedene Hochdurchsatzgeräte wie Illumina, 454 Life Sciences (Roche), Helicos BioSciences und Life 17
Einleitung
Technologies bei der RNA-Seq verwendet [102]. RNA-Seq wurde erstmals 2008 eingesetzt, um Transkriptomanalysen von Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Arabidopsis thaliana, Mauszellen und menschlichen Zellen durchzuführen [103]–[107]. In der Actinomyceten- Forschung wird heutzutage die RNA-Seq häufig verwendet, vor allem, um die Genexpression unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen [108], [109]. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Genexpression von S. espanaensis bei verschiedenen Kultivierungsbedingungen verglichen werden.
Rishirilid B Die Rishirilide A und B sind aromatische Polyketide und wurden erstmals 1984 aus Streptomyces rishiriensis ORF1056 isoliert [110]. M. Arnold konnte Rishirilid A aus Streptomyces bottropensis
(früher Streptomyces species Gö C4/4) isolieren [111]. Die Rishirilide besitzen eine α2-Makroglobulin-
Inhibitor-Aktivität mit einem IC50 von 100 µg/mL für Rishirilid A und 35 µg/mL für Rishirilid B. Des Weiteren zeigt Rishirilid B eine hemmende Wirkung gegen die Glutathion-S-Transferase, welches eines der wichtigsten Drug-Entgiftungsenzyme ist [112]. Bei vielen Chemotherapeutika wie beispielsweise alkylierende Wirkstoffe entwickeln Krebszelln eine Resistenz durch eine erhöhte Glutathion-S- Transferase-Konzentration. Aus diesem Grund könnte Rishirilid B als Adjuvans bei der Chemotherapie verwendet werden. Die Strukturen von Rishirilide A und B sind in Abbildung 2.10 dargestellt.
Abbildung 2.10 Strukturformel von Rishirilid A und B aus Streptomyces bottropensis.
M. Arnold zeigte, dass das Genom von Streptomyces bottropensis das Biosynthesegencluster der Rishirilide trägt [111]. In Zusammenarbeit mit Combinature Biopharm wurde eine Cosmidbank von Streptomyces bottropensis erstellt [113]. Danach konnte A. Linnenbrink durch Screening dieser Cosmidbank drei Polyketid-Biosynthesegencluster vom Typ II identifizieren. Eins davon ist auf Cosmid 4 lokalisiert und für die Produktion eines zu diesem Zeitpunkt unbekannten aromatischen Polyketids verantwortlich [31]. Yan et al. konnten Rishirilid B nach heterologer Expression des Cosmids cos4 aus dem Kulturüberstand des Wirtstamms S. albus isolieren. Dadurch konnte er feststellen, dass das cos4 das Biosynthesegencluster von Rishirilid, welches als rsl-Cluster bezeichnet wurde, enthält [114]. Das identifizierte rsl-Cluster besteht aus 28 Genen, von denen sollten 20 Gene an der Biosynthese
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Einleitung von Rishirilid beteiligt sein. Dazu konnten vier Regulatorgene (rslR1-R4), sowie vier Transportergene (rslT-T4) identifiziert werden. In Abbildung 2.11 ist das rsl-Biosynthesegencluster dargestellt
Abbildung 2.11 Organisation der Gene des rsl-Biosynthesegenclusters von Rishirild A und B.
Um die Biosynthese von Rishirilid B aufzuklären wurden von X. Yan [115], J. Wunsch-Palasis [116], T. Heitzler [29], J. Derochefort [117] und C. Zuo [118] im Laufe ihrer Doktorarbeiten Geninaktivierungsexperimente mithilfe der RedET®- Technologie, sowie Genexpressionsversuche durchgeführt. Hierbei wurde von X. Yan postuliert, dass die Startereinheit der Polyketid-Biosynthese Isobutyryl-CoA ist. J. Wunsch-Palasis konnte durch 13C-Fütterungsexperimente zeigen, dass die dreier Kohlenstoff-Seitenkette aus neun intakten Acetateinheiten aufgebaut wird. Danach sollte eine Bayer- Villinger-Umlagerungsreaktion der Polyketidkette stattfinden. Weiterhin ergaben die Fütterungsexperimente, dass die Methylgruppe an C17 als C2-Baustein aus einer intakten Acetateinheit stammt. Durch eine anschließende Decarboxylierungsreaktion könnte die Biosynthese abgeschlossen werden [115], [116]. T. Heitzler hat durch Inaktivierung der Gene rslO4 und rslO10 sowie Untersuchung der produzierten Intermediate weitere Aussagen über die Zwischenschritte des Biosynthesewegs von Rishirilid B postuliert [29]. Durch J. Derochefort wurden die Gene rslO3, rslO5, rslO7 und rslO9 inaktiviert, sowie die Strukturen von drei produzierten Intermediaten postuliert. Weiterhin wurden biochemische Untersuchungen zur Bestimmung der Funktion von RslO1, RslO2, RslO4 und RslO6 von J. Derochefort und C. Zuo durchgeführt. Es konnte aufgrund dieser Ergebnisse ein hypothetischer Biosyntheseweg von Rishirilid B postuliert werden [117].
J. Wunsch-Palasis konnte durch Sequenzvergleiche die katalytische Tetrade des Enzyms RslO10 identifizieren. Diese besteht analog zur Actinorhodin-Ketoreduktase ActKR aus den Aminosäuren Asn124, Ser154, Tyr167 und Lys171, welche den Aminosäuren Asn114, Ser144, Tyr157 und Lys161 aus ActKR entsprechen. Korman et al. konnten nach Kristallisierung von ActKR einen Mechanismus für die Katalyse der Reduktionsreaktion aufstellen. Sie zeigten, dass für die Katalyse neben dem
NADPH-Cofaktor noch vier H2O-Moleküle, sowie die katalytische Tetrade Asn114-Ser144-Tyr157-
19
Einleitung
Lys161 essentiell sind [119]. Durch eine Punktmutation in einer Aminosäure des aktiven Zentrums von ORF7 aus dem Simocyclinon-Gencluster haben Bylik et al. gezeigt, dass die Mutante in der Lage ist Derivate von Simocyclinon 9D zu bilden, während die vollständige Inaktivierung von ORF7 zu keiner Produktion von Simocyclinon 9D führte. Dadurch konnte die Funktion von ORF7 aufgeklärt werden [120].
Um die Beteiligung der vier identifizierten Aminosäuren im katalytischen Zentrum von RslO10 zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Punktmutation in der Aminosäure Ser154 durchgeführt und die Sekundärmetabolit-Produktion aus der erhaltenen Mutante durch HPLC/ESI-MS (high performance liquid chromatography electrospray ionization-mass spectrometry) untersucht.
Untersuchung der Kollagenstabilisierungsaktivität durch die Prolyl- 4-Hydroxylase in Aspergillus nidulans
2.8.1 Aspergillus nidulans Der filamentöse Euascomycet Aspergillus nidulans (A. nidulans), der auch als Emericella nidulans bezeichnet wird, gehört zu der Gattung Aspergillus und zur Familie der Trichocomaceae. Viele Stämme der Gattung Aspergillus wurden zur Herstellung von Nahrungsmitteln und biopharmazeutischen Produkten eingesetzt und haben eine große Bedeutung in der Biotechnologie. Bekannte Vertreter der Gattung Aspergillus sind u. a. Aspergillus niger (Zitronensäure, Tastuzumab [121], [122]), Aspergillus oryzae (Resveratol, Pektinasen, Takaamylase [123], [124]) und Aspergillus awamori (Chymosin, Lactoferrin [125], [126]). Neben den anderen Aspergillus-Arten hat A. nidulans große Bedeutung für Medizin und Industrie. Da er Mykotoxine wie Sterigmatocystin produziert. Auch für Aspergillosen, die vor allem bei immunsupprimierten Patienten häufig auftretende Erkrankungen sind, ist A. nidulans verantwortlich [127], [128].
A. nidulans wird wegen seiner leichten Kultivierbarkeit, kurzen Generationszeit und der Bildung haploider Sporen als Modellorganismus für die biologische und genetische Forschung verwendet. Der Stamm wurde in den 40er Jahren in der eukaryotische Zellbiologieforschung von G. Pontecorvo eingeführt [129]. Zudem wurde das Genom von A. nidulans vor einigen Jahren vollständig sequenziert und molekularbiologische Arbeiten dadurch sehr vereinfacht [130]. Der Pilz passt sich schnell an veränderete Nährstoffbedingungen an und kann eine Vielzahl organischer Substanzen wie Cellulose, Chitin, Zucker, Aminosäuren und Polymere verstoffwechseln.
2.8.2 Kollagen und Prolyl-4-Hydroxylase Kollagen ist der Hauptbestandteil des Bindegewebes und das am meisten verbreitete Protein bei Tieren und Menschen. Prokaryotisches Kollagen wurde auch in Bakterien und Phagen nachgewiesen [131]. Es besitzt eine charakteristische Tripelhelix Struktur, die aus drei ineinander gewundenen Polypeptidketten aufgebaut ist. Jede Polypeptidkette besteht aus sich vielfach wiederholten (Gly-X1-X2)-Einheiten, in 20
Einleitung
denen X1 häufig Prolin und X2 4-Hydroxyprolin (Hyp) darstellen [132]. Hyp ist durch den stereoelektrischen Einfluss des Hydroxylsauerstoffs wichtig für die Stabilisierung des Kollagens [133],
[134]. Die Hydroxylierung von Prolin an der X2-Position erfolgt über Prolyl-4-Hydroxylase (P4H). P4H sind 2-Oxoglutarat Oxygenasen, die die posttranslationale Hydroxylierung von Peptidylprolin zu (2S, 4R)-4-Hydroxyprolin (Hyp) katalysieren [135] (siehe Abbildung 2.12). Neben ihrer wichtigen Rolle in der Stabilisierung der Kollagenstruktur haben P4H in Vertebrate auch einen Einfluss auf die Genexpression bei hypoxiden Bedingungen [136], [137]. Weiterhin sind P4H in Pflanzen durch die Bildung von Hydroxyprolin-reichen Glycoproteinen an der Stabilisierung der Zellwand beteiligt [138], [139].
Abbildung 2.12 Die von Prolyl-4-Hydroxylase (P4H) katalysierte Reaktion. P4H hydroxyliert Peptidylprolin in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff, 2-Oxoglutarat und Fe(II) zu 4-Hydroxyprolin. Gleichzeitig entstehen Succinat und CO2 [135].
Kollagen hat eine große Bedeutung u.a. in der Ernährungs-, Kosmetik und Pharmaindustrie und werden hauptsächlich aus tierischen Geweben extrahiert. Darüber hinaus wird Kollagen heterolog in verschiedenen Wirten produziert. Hierzu wurden transfizierte Säugerzellen [140]–[142], Insektenzellen [143], transgene Tabakpflanzen [144], Mäuse [145], E. coli [146] und Hefe [147], [148] für die Herstellung von rekombinantem Kollagen genutzt. Mit Ausnahme der Säugerzellen und des Hefestamms Hansenula polymorpha muss neben den Biosynthesegenenen auch ein P4H-Gen koexprimiert werden [148].
In Pilzen wurde Kollagen als Bestandteil der Fimbrien in Microbortyum violaceum nachgewiesen. Weiterhin wurde ein Kollagenähnliches Protein in Metrhizium anisolpiae identifiziert und charakterisiert [149], [150]. In verschiedenen Aspergillus-Arten konnten neun Kollagenähnliche Proteine identifiziert werden [151]. Bislang wurden allerdings keine Studien über P4H-Enzyme in Pilzen durchgeführt. Da die Pilze der Gattung Aspergillus in der Biotechnologie eine große Bedeutung
21
Einleitung besitzen, werden in dieser Arbeit Genprodukte aus Aspergillus nidulans (A. nidulans) mit putativer P4H- Aktivität untersucht.
Zielsetzung dieser Arbeit Saccharomicine A und B werden von S. espanaensis produziert und bestehen aus 17 O-glykosidisch miteinander verknüpften Desoxyhexose-Einheiten und dem Aglykon N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)- Taurin. In dieser Arbeit sollte die Glycosyltransferase, die für die Fucosylierung des Saccharomicin- Aglykons verantwortlich ist, identifiziert werden. Dazu sollte ein heterologes Testsystem verwendet werden. Hierbei wird die Fucose-Biosynthesekassette und jeweils eine putative Glycosyltransferase aus dem Saccharomicin-Gencluster in dem heterologen Wirt S. albus exprimiert. Die Mutanten sollten mit Kaffeesäure gefüttert und dessen mögliche Fucosylierung mittels HPLC/MS untersucht werden. Zusätzlich sollte der Einfluss von L-Fucose auf das Wachstum von S. albus ermittelt werden.
Der Stamm S. espanaensis produziert unter gegebenen Laborbedingungen keine Saccharomicine mehr. Durch Veränderung der Kultivierungsbedingungen sowie Expression von positiven Regulatoren sollte die Produktion von den Saccharomicine und anderen bioaktive Naturstoffe in S. espanaensis aktiviert werden. Die produzierten Naturstoffe sollten aufgereinigt, deren Struktur aufgeklärt, ihre Aktivität gegen Pilze und Bakterein untersucht, und die Biosynthesewege mittels Transkriptom-Untersuchung und Geninaktivierung identifiziert werden.
Des Weiteren sollte das Transkriptom von S. espanaensis nach Kultivierung in verschiedenen Medien analysiert werden. Dabei lag ein Schwerpunkt auf der Transkription der verschiedenen Sekundärmetabolit-Gencluster.
Der Stamm S. espanaensis ist in der Lage gefüttertes Alizarin durch Rhamnosylierung zu biotransformieren. Durch Transkriptomanalyse sollte die Expression des Glycosyltransferase- kodierenden Gens BN6_60310, das für die Biotransformation verantwortlich ist, untersucht werden.
Im Rahmen der Untersuchung der Rishirilid-Biosynthese sollte die genaue Funktion der putativen Monooxygenase RslO8 herausgefunden werden. Zusätzlich sollte das aktive Zentrum der RslO10- Monooxygenase identifiziert werden.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit lag auf die Untersuchung der Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität in dem Pilzstamm A. nidulans.
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Material und Methoden
3 Material und Methoden
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Material und Methoden
Laborgeräte Tabelle 3.1 Verwendete Labor- und Analysegeräte sowie deren Hersteller.
Bezeichnung Hersteller
Agarose-Gelelektrophoresekammer und Zubehör GE Healthcare Life Sciences (Freiburg, DE)
Autoklav Systec 5075 ELV Tuttnauer Europe B.V. (Breda, NL)
Brutschränke Binder GmbH (Tuttlingen, DE)
E. coli Pulser TM BioRad Laboratories GmbH (München, DE)
Sartorius analytic, Altmann Analytik GmbH & Co. Feinwaage KG (München, DE)
Festphasenextraktion-Säule Oasis HLB 35cc (6 g) Waters GmbH (Eschborn, DE) Extraction Cartridge
French Pressure Cell Press Thermo Spectronic (Rochester, USA)
Gefriertrocknungsanlage: Alpha 2-4 LSC Martin Christ (Osterode, DE)
Holton Laminair Thermo Scientific (Bremen, DE)
HPLC analytisch: 717 plus Autosampler, 2 Pumpen Waters 515, Säulenofen Jetstream 2, Waters 2996 Waters (Milford, USA) Photodioden Array Detector
HPLC/ESI-MS analytisch und präparativ: Agilent 1100 Serie, automatischer Probengeber G1313A, Säulenofen G1316A, Degasser G1322A, Quaternäre Agilent Technologies (Waldbronn, DE) Pumpe G1311A, Quadrupol Massendetektor G1946D, Diodenarray G1315B)
PCR Maschinen:
Mastercycler® ep Gradient Eppendorf (Hamburg, DE)
GeneAmp® PCR System 9700 Applied Biosystems (Foster City, US)
pH-Meter Schott Instruments GmbH (Mainz, DE)
Pipetten Gilson International (Limburg, DE)
Protein-Elektrophorese-Kammer Mini PROTEAN 3 Biorad Laboratories GmbH (München, DE) mit Zubehör und Spannungsgeber Power Pac 300
Rotationsverdampfer:
CVC2 Vacuubrand GmbH & Co. KG (Wertheim, DE)
Laborota 4000 efficient Heidolph Instruments GmbH & Co. KG (Schwabach, DE)
SCC950 KNF Neuberger GmbH (Freiburg, DE)
Waterbath B-480 Büchi Labortechnik GmbH (Essen, DE)
Schüttelinkubator Multitron Infors (Bottmingen, CH)
Speed Vac: H. Sauer Laborbedarf (Reutlingen, DE)
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Material und Methoden
Vacuum-Concentrator BA-VC-300H
Spektrophotometer:
NanoDROP 2000 Thermo Scientific
Ultrospec 2100 pro GE Healthcare Life Sciences
UV-Transilluminator Image Master VDS zur GE Healthcare Life Sciences Geldokumentation (312 nm)
Zentrifugen:
Avanti J-20XP (bis 500 mL Gefäße) Beckman Coulter (Krefeld, DE)
Rotina 35R (15 mL bis 50 mL Gefäße) Andreas Hettich GmbH & Co. KG (Tuttlingen, DE)
5417R (1,5 bis 2 mL Gefäße) Eppendorf (Hamburg, DE)
Heidolph Instrument GmbH & Co. KG (Schwabach, Vortex Reax top DE)
Chemikalien und andere Verbrauchsmaterial
3.2.1 Chemikalien und Medienbestandteile Tabelle 3.2 Medien- und Pufferbestandteile
Bezeichnung Hersteller
New England Biolabs (NEB) (Frankfurt, DE), 1 kb-DNA-Leiter Promega (Mannheim, DE)
Acrylamid/Bisacrylamid Carl Roth (Karlsruhe, DE)
Agar-Agar Carl Roth
Agarose Carl Roth
Alizarin Fluka (Taufkirchen, DE)
Ampicillin Natriumsalz Sigma-Aldrich (Seelze, DE)
Apramycinsulfat AppliChem (Darmstadt, DE)
Bovine serum Albumin (BSA) NEB
Blue/Orange 6X Loading PDYE Promega
Bromphenolblau Natriumsalz Carl Roth
CaCl2 x H2O Carl Roth
CaCO3 Carl Roth
CASO Bouillon Carl Roth
Carbenicillin Dinatriumsalz AppliChem
Chloramphenicol Sigma-Aldrich
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Material und Methoden
Bezeichnung Hersteller
CuSO4 x 5H2O Merck (Darmstadt, DE)
Dextrin Carl Roth
1,4-Dithiothreit (DTT) Carl Roth D-Mannitol Carl Roth
Promega und PEQLab Biotechnologie GmbH, dNTPs (Desoxyribonucleosidtriphsphate) (Erlangen, DE)
Essigsäure Carl Roth
Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz Carl Roth Dihydrat (EDTA)
Ethidiumbromid Carl Roth
FeSO4 x 7H2O Merck
Glucose Carl Roth
Glycerol Carl Roth
HCl Carl Roth
Hefeextrakt Carl Roth
Hygromycin B Carl Roth
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Carl Roth
Kaffeesäure Fluka
Kaffeesäurephenethylester Carl Roth
Trans-Kaffeesäureethylester PhytoLab GmbH & Co. KG (Vestenbergsgreuth, DE)
Kaliumacetat Carl Roth
Kanamycinsulfat Carl Roth
Kartoffel-Glucose Carl Roth
Lab Lemco Fleischextrakt Oxoid Ltd. (Basingstoke Hampshire, GB)
LB-Trockenpulver Carl Roth
Lösliche Stärke (Difco ™ Soluble Starch) Difco (Lawrence, KS, USA)
MgSO4 x7H2O Merck
Malzextrakt Becton Dickenson (Heidelberg, DE)
MnSO4 x 4H2O Merck
NaCl Carl Roth di-Natriumhydrogenphosphat (pro Analysis), Merck Na2HPO4 Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat, NaH2PO4 Carl Roth x H2O 26
Material und Methoden
Bezeichnung Hersteller
NaOH Carl Roth
Na2SO4 Carl Roth p-Nitrophenyl-β-D-glucuronid (ELC No. 2337530) Glycosynth Limited (Warrington, GB)
Pfu-Puffer, 10x Im Institut selbst hergestellt
Phosphomycin Dinatriumsalz Sigma-Aldrich Polypepton Carl Roth
Pyridoxin Sigma-Aldrcih
Saccharose Fluka, Taufkirchen
Scandium Chlorid ScCl3 x 6H2O Sigma- Aldrich
Sodiumdodecylsulfat (SDS) Roth
Sojamehl, Hensel Voll-Soja W. Schoenenberger GmbH & Co KG (Magstadt, DE
Soytone Bectors, Dickinson & Company (Sparkus, USA)
Spectinomycin Dihydrochlorid Pentahydrat AppliChem
Taq-Puffer, 10x Im Institut selbst hergestellt Tetracyclin Sigma-Aldrich
TRIS (hydroxymethyl)-aminomethan Carl Roth
TRIS-HCl Carl Roth
Triton-X-100, C33H60O10 Carl Roth
Trypton / Pepton aus Casein Cral Roth
Uracil Sigma-Aldrich
Uridin Sigma-Aldrich
5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-Galactopyranosid (X- Carl Roth Gal) 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-Glucuronsäure (X- Carl Roth Gluc) Merck ZnSO4 x 4H2O
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Material und Methoden
3.2.2 Organische Lösungsmittel Tabelle 3.3 verwendete organische Lösungsmittel
Bezeichnung Hersteller
Acetonitril Carl Roth
Dichlormethan Carl Roth
Dimethylformamid (DMF) Carl Roth
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth
Essigsäureethylester Carl Roth
Ethanol Carl Roth
Isopropanol Carl Roth
Methanol Carl Roth
3.2.3 Verbrauchsmaterial Tabelle 3.4 verwendete Verbrauchsmaterialien und deren Hersteller.
Bezeichnung Hersteller
Filterpapierplättchen (MN 827 ATD, Ø = 6 mm) Macherey & Nagel (Düren, DE)
Filterpapier (MN 615, Ø = 185 mm) Macherey & Nagel
Injekt ® Einmalspritzen Braun (Melsungen, DE)
Kieselgelplatten ADAMANT UV 254 Carl Roth
Oasis ® HLB 20 35 cc (6 g) Waters (Eschborn, DE)
Rotilabo ® Petrischalen, Durchmesser 10 mm Carl Roth
Rotilabo ® Spritzenfilter, PVDF, steril Carl Roth Porendurchmesser 0,22 µL
Rotilabo ® Spritzenfilter, PVDF, steril Carl Roth Porendurchmesser 0,45 µL
Sephadex TM LH20 Säulenmaterial GE Healthcare Life Sciences
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Material und Methoden
3.2.4 Enzyme und Kits
Verwendete Enzyme und deren Hersteller Tabelle 3.5 verwendete Enzyme und deren Hersteller
Bezeichnung des Enzyms Hersteller / Bezugsquelle
Antarctic Phosphatase (AnP M0289) NEB
DNA-Restiktionsendonukleasen Promega / NEB
Lysozym aus Hühnereiweiß Carl Roth
Lysierenden Enzymen aus Trichoderma Harzianum Sigma-Aldrich (Hamburg, DE)
Phusion-DNA-Polymerase Im Institut selbst hergestellt durch S. Maier
Pfu-DNA-Polymerase Im Institut selbst hergestellt durch P. Schneider
Proteinase K Promega
RNase A Qiagen (Hilden, DE)
T4-DNA-Ligase Promega
Taq–DNA-Polymerase Im Institut selbst hergestellt durch P. Schneider
Verwendete Kits und deren Hersteller Tabelle 3.6 verwendete Kits und deren Hersteller
Bezeichnung des Kits Hersteller / Bezugsquelle
innuPREP Plasmid Mini Kit Analytik Jena (Jena, DE) PureYieldTM Plasmid Midiprep System Kit Promega
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche AG (Basel, CH)
Ready-To-Go T-Primed First-Strand Kit GE Healthcare Life Sciences
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen
Wizard®Plus SV Minipreps Kit Promega
Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kit Promega
Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden, soweit nicht anders angegeben, mit bidestiliertem Wasser (H2Obidest) hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert. NaOH (1 M) oder HCl (1 M) wurden zur pH-Wert- Einstellung verwendet.
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Material und Methoden
Lösungen zur DNA-Isolierung
Puffer zur Plasmid-Isolierung aus E. coli Zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mittels alkalischer Lyse wurden nachstehende Puffer und Lösungen verwendet.
Tabelle 3.7 Puffer zur DNA-Isolierung aus E. coli (Alkalische Lyse)
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkungen auf pH 8,0 einstellen, jeweils Tris-HCl 30 mM P1-Lösung 10 mL mit 100 μg/mL RNase EDTA 3 mM versetzen und bei 4 °C lagern NaOH 200 mM P2-Lösung bei RT lagern SDS 1 % (m/V) mit Essigsäure auf pH 5,2 P3-Lösung Kaliumacetat (wasserfrei) 3 M einstellen und bei 4 °C lagern
Puffer und Lösungen zur Isolierung genomischer DNA aus Actinomyceten Tabelle 3.8 Lösungen und Puffer zur Isolierung genomischer DNA aus Actinomyceten
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkung NaCl 75 mM EDTA-Lösung mit Essigsäure SET-Puffer EDTA 25 mM auf pH 8 einstellen. Tris-HCl Tris-HCl 20 mM mit HCl auf pH 7,5 einstellen Lysozym-Lösung Lysozym 50 mg/ mL bei -20 °C lagern
SDS-Lösung SDS 10 % (m/V) bei RT lagern
Proteinase K-Lösung Proteinase K 20 mg/ mL bei -20 °C lagern
NaCl-Lösung NaCl 5 M bei RT lagern
Puffer und Lösungen zur DNA–Agarose-Gelelektrophorese Zur gelelektrophoretischen Auftrennung von DNA wurden die nachstehenden Puffer und Lösungen benutzt.
Tabelle 3.9 Lösungen und Puffer zur DNA-Agarose-Gelelektrophorese
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkungen in 50x TAE-Puffer durch Agarose-Lösung Agarose 0,7 % (m/V) Aufkochen lösen und bei 60 °C lagern Tris 2 M mit Essigsäure auf pH 8,0 TAE-Puffer 50x EDTA 0,05 M einstellen Tris 40 mM mit Essigsäure auf pH 8,0 TAE-Puffer 1x EDTA 1,0 mM einstellen 10 kb, 8 kb, 6, kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,5 kb, jeweils 4 μl wurden pro 1 kb DNA Ladder (NEB) 0,1 μg/μl 1 kb, 0,5 kb DNA- Gelbande verwendet Fragmente 30
Material und Methoden
Bromphenolblau 0,25 % (m/V) in TE-Puffer pH 7,6 lösen, zur Ladepuffer 1 Saccharose 40 % (m/V) Detektion von Banden < 3,0 kb Xylencyanol 0,25 % (m/V) in TE-Puffer pH 7,6 lösen, zur Ladepuffer 2 Saccharose 40 % (m/V) Detektion von Banden > 3,0 kb Färbebad für Ethidiumbromid 1,0 μg/mL Agarosegele Tris-HCl (pH 7,6) 10 mM TE Puffer EDTA (pH 8,0) 1 mM
3.3.1 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen Tabelle 3.10 Lösungen zur Herstellung kompetenter Zellen
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkungen
MgCl2-Lösung MgCl2 0,1 M Autoklaviert
CaCl2-Lösung CaCl2 0,1 M Autoklaviert CaCl -Lösung mit CaCl 0,1 M 2 2 Autoklaviert Glycerol Glycerol 15 % Glycerol-Lösung Glycerol 10 % Autoklaviert
3.3.2 Puffer und Lösungen zur quantitativen Messung der Gus-Aktivität Tabelle 3.11 Puffer und Lösungen zur quantitativen Messung der GusA-Aktivität
Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkung
p-Nitrophenyl-β-D- p-Nitrophenyl-β-D- 0,063 g
Glucuronid-Lösung Glucuronid DMSO 1 mL NaH2PO4 x H2O 3 g Na HPO 4,1 g pH 7,0; DTT wird kurz 2 4 vor dem Gebrauch Puffer 1 Triton X-100 1 g zugegeben H2O 1000 mL DTT 0,771 g Puffer 2 Puffer 1 100 mL Lysozym 100 mg Puffer 1 1 mL Puffer 3 p-Nitrophenyl-β-D- 10 µL Glucuronid-Lösung
3.3.3 Lösungen für die Blau-Weiß-Screening
Lösungen für Blau-Weiß-Screening in E. coli Tabelle 3.12 Lösungen für die Blau-Weiß-Screening in E. coli
Lösung Konzentration Herstellung
IPTG 1 M In H2Obidest. lösen und steril filtrieren.
In DMF lösen, autosteril. Lichtgeschützt bei – X-Gal 100 mg/mL 20 °C lagern.
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Material und Methoden
Lösung für die Blau-Weiß-Selektion in Saccharothrix espanaensis Tabelle 3.13 Lösung für die Blau-Weiß-Selektion in S. espanaensis
Lösung Konzentration Herstellung
In DMF lösen, autosteril. Lichtgeschützt bei - X-Gluc 0,1 mM 20 °C lagern.
3.3.4 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen Tabelle 3.14 Lösungen zur Herstellung von Dauerkulturen
Bezeichnung Bestandteile Konzentration
Glycerol-Lösung Glycerol 15 % (m/w)
Saccharose-Lösung Saccharose 25 % (m/w)
3.3.5 Puffer und Lösungen zur Durchführung einer SDS-PAGE Tabelle 3.15 Puffer und Lösungen zur Durchführung einer SDS-PAGE
Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkung
H2Obidest 2,68 mL TRIS-HCl-Lösung (1,5 M; pH 8,8) 2 mL Die angegebene Reihenfolge der Trenngel 12 % SDS 10 % (m/V) 80 µL Bestandteile ist zu Rotiphorese Gel 30 % (m/V) 3,2 mL APS 10 % (m/V) 40 µL beachten. TEMED 4 µL H2Obidest 3,66 mL TRIS-HCl-Lösung (0,5 M; pH 6,8) 1,5 mL Die angegebene Reihenfolge der Sammelgel 4 % SDS 10 % (m/V) 60 μL Bestandteile ist zu Rotiphorese Gel 30 % (m/V) 0,798 mL APS 10 % (m/V) 30 μL beachten TEMED 6 μL SDS 10 g pH 8,3; vor der 10 x SDS-PAGE TRIS-HCl 30,3 g Durchführung der Elektrophorese um den Laufpuffer Glycin 144,2 g Wasser ad 1 L Faktor 10 verdünnen TRIS-HCl-Lösung (0,5 M; pH 6,8) 1,8 mL Glycerol 2,0 g mit der Probe 1:1 mischen 2 x SDS-PAGE SDS 10 % (m/V) 2,0 mL und in die Probentaschen Ladepuffer Bromphenolblau 1 % (m/V) 0,2 mL geben DTT 0,154 g H2Obidest ad 10 mL Brilliant Blue R-250 2,5 g Coomassieblau- Ethanol 450 mL Färbelösung Essigsäure 100 mL H2Obidest ad 1 L Ethanol 450 mL Entfärbelösung Essigsäure 100 mL H2Obidest ad 1 L Proteinstandard (PR) Roti®-Mark Standard 8 µL pro Gel auftragen
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Material und Methoden
3.3.6 Puffer und Lösungen zur Herstellung und Transformation von Protoplasten von Aspergillus nidulans Tabelle 3.16 Puffer und Lösungen zur Herstellung und Transformation von Protoplasten von A. nidulans
Bezeichnung Bestandteile Menge Anmerkung
Sorbitol 1,33 M SMC Auf pH 5,8 einstellen CaCl2 x 2H2O 50 mM Morpholinoethansulfonsäure 20 mM Sorbitol 1,33 M STC Auf pH 7,5 einstellen CaCl2 x 2H2O 50 mM Tris-HCl 10 mM Polyethylenglycol 3350 40 % STCP Sorbitol 1 M Auf pH 8 einstellen CaCl2 50 mM Tris-HCl 50 mM Lysierenden Enzymen aus 200 mg Protoplastierlösung Trichoderma Harzianum 10 mL SMC-Puffer Pyridoxin Pyridoxin 0,5 mg/mL
Uracil Uracil 2,44 mg/mL
Uridin Uridin 1 mg/mL
3.3.7 Antibiotika- und Antimykotika-Lösung Die Substanzen wurden in Wasser, Ethanol oder Methanol gelöst und bei -20 °C gelagert. Die Lösungen wurden durch einen „Rotilabo® Spritzenfilter steril“ der Firma Roth (Tabelle 3.17) mit einem maximalen Porendurchmesser von 0,22 μm steril filtriert.
Tabelle 3.17 Verwendete Antibiotika
Konzentration der Übliche Endkonzentration im Bezeichnung [Abk.] Lösungsmittel Stocklösung Medium
Ampicillin [Amp] 50 mg/mL H2Obidet 50 µg/mL
50µg/mL für E. coli und 100 µg/mL Apramycin [Apra] 100 mg/mL H O 2 bidet für Actinomyceten
Carbencillin [Carb] 50 mg/mL H2Obidet 50 µg/mL
Chloramphenicol [Cam] 30 mg/mL Ethanol 30 μg/mL
Phosphomycin [Phos] 200 mg/mL H2Obidet 400 μg/mL
Kanamycin [Kana] 30 mg/mL H2Obidet 30 μg/mL
Nystatin [Nys] 5 mg/mL Methanol 75 µg/mL
Spectinomycin [Spec] 50 mg/mL H2Obidet 50 μg/mL
Tetracyclin [Tet] 5 mg/mL Ethanol 70% 10 µg/mL
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Material und Methoden
Nährmedien Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Nährmedien sind in der Tabelle 3.18 zusammengefasst. Alle Medien wurden autoklaviert. Für die Herstellung von Festmedien wurden den Medien vor dem Autoklavieren jeweils 20 g/L Agar zugesetzt. Hitzeempfindliche Substanzen, wie Antibiotika, wurden nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen zugesetzt. Alle Medien wurden, wenn nicht anders beschrieben, in Leitungswasser gelöst.
Tabelle 3.18 Verwendete Nährmedien
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Anmerkung Dextrin 20,0 g/L Soytone 20,0 g/L DNPM auf pH 6,8 einstellen Bäckerhefe 5,0 g/L MOPS 21,0 g/L Glucose 4,0 g/L Hefeextrakt 4,0 g/L Malzextrakt 10,0 g/L GYM auf pH 7,2 einstellen MOPS 11,2 g/L Pepton aus Soja 1,0 g/L NaCl 2,0 g/L Glucose 4,0 g/L HA Hefeextrakt 4,0 g/L auf pH 7,2 einstellen Malzextrakt 10,0 g/L LB LB-Medium Trockenpulver 20,0 g/L auf pH 7,2 einstellen
MH Müller Hilton Trockenpulver 21,0 g/L auf pH 7,4 einstellen. Glucose 10,0 g/L Hirsemehl 20,0 g/L MPG PHARMAMEDIA 20,0 g/L MOPS 20,0 g/L D-Mannitol 20,0 g/L MS Sojamehl 20,0 g/L Lab Lemco Fleischextrakt 15,0 g/L NL111 Malzextrakt 75,0 g 75,0 g/L auf pH 7,2 einstellen CaCO3 7,5 g/L PGA Kartoffel-Glucose 26,5 g/L Maismehl 4,0 g/L Glucose 10,0 g/L RAM2 Maltose 15,0 g/L auf pH 7,0 einstellen. PHARMAMEDIA® 7,5 g/L Bäckerhefe 5,0 g/L Glucose 20,0 g/L Pepton 10,0 g/L SG CaCO3 2,0 g/L CoCl2 1,0 mg/L Lösliche Stärke 30,0 g/L Trypton/Pepton 26,0 g/L Polypepton 4,0 g/L Hefeextrakt 2,0 g/L MgSO x 7H O 15,0 g/L SPY 4 2 auf pH 7,0 einstellen CaCl2 x 2H2O 50,0 mg/L ZnSO4 x 7H2O 35,0 mg/L FeSO4 x 5H2O 12,0 mg/L CuSO4 x 5H2O 16,0 mg/L MnSO4 x 4H2O 12,0 mg/L 34
Material und Methoden
Sorbitol 218,64 g/L NaNO3 6,00 g/I Kh2PO4 0,82 g/L Top Agar K2HPO4 1,05 g/L KCl 0,05 g/L α-D-Glucose 10,00 g/L Agar 6,00 g/L TSB Trypton Soja Broth 30,0 g/L Hefeextrakt 3,0 g/L Malzextrakt 3,0 g/L YM Pepton aus Soja 5,0 g/L Glucose 10,0 g/L
Verwendete Stämme Tabelle 3.19 verwendete Stämme
Stamm Genotyp Referenz
FGSC (Fungi Aspergillus nidulans FGSC A4 Wildtyp Genome Stock Center), [129]
Aspergillus nidulans GR5 pyrG89; wA3; pyroA4; veA1 FGSC, [152]
Bacillus subtilis PY79 Prototrophes Derivat von Bacillus subtilis 168: trpC2 [153]
Asexueller, diploider, pathogener Hefepilz, Einstufung Candida parapsilosis DSM 5784 [154] in Risikogruppe 1
- - - R Novagen E. coli BL21 (DE3) x pLys F ompT, hsdSB(rB mB ), gal dcm (DE3) pLysS (Cam ) F-, dam-13::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR, zij-202 ::Tn10, E. coli DH5α recF143, galK2, GalT22, ara-14, lacY1, xyl-5, leuB6, [155] thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78, mtl-1, glnV44 F-, dam-13::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR, zij-202 ::Tn10, E. coli ET12567/pUZ8002 recF143, galK2, GalT22, ara-14, lacY1, xyl-5, leuB6, [156] thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4, tsx-78, mtl-1, glnV44 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac E. coli XL1-Blue Stratagene [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)] F-, proA+B+ lacIq ΔlacZM15/ fhuA2 Δ(lac-proAB) NEB Turbo E. coli glnV gal R(zgb-210::Tn10)TetS endA1 thi-1 Δ(hsdS- NEB mcrB)5 Fusarium verticillioides DSM Schimmelpilz, Einstufung in Risikogruppe 1 [157] 62264 Saccharothrix espanaensis DSM Wild-Typ, produziert Saccharomicin A und B, besitzt [158] 44229 in vivo Rhamnosylierungsaktivität Streptomyces albus J1074 Wirt zur heterologen Expression [159] Wirt zur heterologen Expression. Produziert Streptomyces albus x cos4 [115] Rishirilide B Streptomyces coelicolor M145 SCP1-, SCP2- [160]
Streptomyces lividans TK24 Str -6, SLP2-, SLP3- [160]
35
Material und Methoden
Verwendete Vektoren und Plasmide
3.6.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide Tabelle 3.20 in dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide
Bezeichnung Größe Resistenzgen Beschreibung Referenz
Cos4 56 kb aac(3)IV Cosmid enthält das Rishirilid- [31], [115] Biosynthesegencluster; basierend auf pOJ436 Cos17 45,7 kb aac(3)IV Cosmid, trägt die Gene sam9 bis sam38 des [34] Saccharomicin-Genclusters; basiert auf pOJ436 Cosmid, trägt die Gene sam1 bis sam8 des Cos 35 20,9 kb aac(3)IV [34] Saccharomicin-Genclusters; basiert auf pOJ436
pBlueskript 2,9 kb bla Klonierungsvektor in E. coli Stratagene SK(-)
Expressionvektor für rekombinante Proteine in pET22b(+) 5,5 kb bla Novagen E. coli
aac(3)IV, Integratives Plasmid (ФC31) für die pGUS 9,7 kb [161] aadA Transkriptionsfusionsanalyse mittels des GusA- Systems; basiert auf dem Vektor pSET152 pKC1132 3,4 kb aac(3)IV Shuttlevektor, Integrationsvektor in [162] Streptomyceten enthält die dTDP-Rhamnose-Biosynthesegene- pTOS-Rham 9,8 kb aac(3)IV Gene oleL, oleS, oleE und oleU unter Kontrolle [35] des ermE* Promotors
basiert auf dem integrativen Vektor pSET152 pTESa 5,9 kb aac(3)IV [163] (ФC31)
Integrativer Vektor (ФC31) mit bldA-Gen aus pTESa-bldA 6,4 kb aac(3)IV S. coelicolor unter Kontrolle des konstitutiven [65] rpsL-Promotors
pUWL-Dre 8,4 kb bla; tsr Replikatives Expressionsplasmid, trägt das Dre- [163] Rekombinasegen basiert auf pUWL-oriT Replikatives Multicopy-Plasmid mit ermE up pUWL-A 7,6 kb aac(3)IV [164], [165] Promotor.
pUWL-oriT mit der Glycosyltransferasegen pUWL-7665 8,9 kb aac(3)IV [35] Ses60130 (Ses7665)
pUWL-H-tnp 9,2 kb hph, bla pUWL-oriT mit tnp(a), hph anstelle thior [166]
pUZ8002 6,1 kb aphII, tcr Fertilitätsplasmid zur Konjugation mit oriT. [162], [167]
36
Material und Methoden
3.6.2 In dieser Arbeit erstellte Plasmide Tabelle 3.21 In dieser Arbeit erstellte Plasmide
Fragment(e) Bezeichnung Größe Ursprungsvektor Beschreibung kloniert über
pBSK- x SDMut- 3,8 kb pBlueskript SK(-) Trägt das mutierte rslO10 Gen HindIII, BglII rslO10
pET22b(+) x Trägt das Gen ANID_07554 aus 7,4 kb pET22b(+) NdeI, SalI ANID_07554 Aspergillus nidulans A4
pET22b(+) x Trägt das Gen ANID_02851 aus 6,2 kb pET22b(+) NdeI, SalI ANID_02851 Aspergillus nidulans A4
pGUS x PSam5-6 10,2 kb pGUS Trägt die Promotorregion von XbaI, KpnI BN6_58670 (sam6) pGUS x P78320 10,3 kb pGUS Trägt die Promotorregion von XbaI, KpnI BN6_78320 pGUS x P07730 10,3 kb pGUS Trägt die Promotorregion von XbaI, KpnI BN6_07730 pGUS x P01860 10,3 kb pGUS Trägt die Promotorregion von XbaI, KpnI BN6_01860 pGUS x P68440 10,3 kb pGUS Trägt die Promotorregion von XbaI, KpnI BN6_68440 pKC1132 x 4,2 kb pKC1132 Trägt ein internes Fragment aus dem XbaI, BamHI KO01860 Gen BN6_01860 pKC1132 x 4,2 kb pKC1132 Trägt ein internes Fragment aus dem XbaI, BamHI KO77230 Gen BN6_77230 pKC1132 x 5,1 kb pKC1132 Trägt ein internes Fragment aus dem XbaI, BamHI KO67950 Gen BN6_67950 pKC1132 x 4,6 kb pKC1132 Trägt ein internes Fragment aus dem XbaI, BamHI KO75400 Gen BN6_75400 pKC1132 x 4,4 kb pKC1132 Trägt ein internes Fragment aus dem XbaI, BamHI KO79710 Gen BN6_79710 Trägt das GDP-4-keto-6- pTOS-wcaGa 6,7 kb pTOS-Rham* deoxymannose-3,5-epimerase-4- MunI, NsiI reduktase Gen (WcaGa) Trägt die Gene oleS (fuc1) und oleE pTESa x D-fuc1,2 8,1 kb pTESa XbaI, EcoRV (fuc2)
pTESa x D- Trägt das NDP-4-Keto-6-Deoxyhexose EcoRV, 9,4 kb pTESa x D-fuc1,2 fuc1,2 x sam21 4-Ketoreduktase Gen sam21 EcoRI
pTESa x D- Trägt das Aldo/Ketoreduktase Gen EcoRV, 9,4 kb pTESa x D-fuc1,2 fuc1,2 x sam22 sam22 EcoRI
pTESa x D- EcoRV, 9,4 kb pTESa x D-fuc1,2 Trägt die Gene sam22 und sam21 fuc1,2 x sam22 EcoRI
pTESa x D- Trägt das dTDP-4-keto-6-deoxy-D- 8,5 kb pTESa x D-fuc1,2 EcoRI fuc1,2 x fcd Glucose-Reduktase Gen fcd
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam11 9,1 kb pUWL-H-tnp HindIII, XbaI sam11
37
Material und Methoden
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam12 9,2 kb pUWL-H-tnp HindIII, XbaI sam12
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam13 9,3 kb pUWL-H-tnp HindIII, XbaI sam13
Trägt das Glycosyltransferase Gen HindIII, pUWL-A-sam14 9,0 kb pUWL-oriT sam14 EcoRI
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam14 9,1 kb pUWL-H-tnp ClaI, SpeI sam14
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam15 9,1 kb pUWL-H-tnp BamHI, XbaI sam15
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam16 9,1 kb pUWL-H-tnp BamHI, XbaI sam16
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam17 9,1 kb pUWL-H-tnp BamHI, XbaI sam17
Trägt das Glycosyltransferase Gen HindIII, pUWL-A-sam18 9,0 kb pUWL-oriT sam18 EcoRI
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam18 9,1 kb pUWL-H-tnp ClaI, SpeI sam18
Trägt das Glycosyltransferase Gen HindIII, pUWL-A-sam19 9,0 kb pUWL-oriT sam19 EcoRI
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam19 9,1 kb pUWL-H-tnp BamHI, XbaI sam19
Trägt das Glycosyltransferase Gen HindIII, pUWL-A-sam20 9,0 kb pUWL-oriT sam20 EcoRI
Trägt das Glycosyltransferase Gen pUWL-H-sam20 9,1 kb pUWL-H-tnp BamHI, XbaI sam20
pUWL- 9,2 kb pUWL-H-tnp Trägt das mutierte rslO10 Gen HindIII,BglII H x SDMut-rslO10
Software, Datenbanken und Internetservices Tabelle 3.22 Software, Datenbanken und Internetservice
Bezeichnung Hersteller/Anbieter Refernz
ArrayQualityMetrics http://www.bioconductor.org/ [168]
Aspergillus Genetic http://www.fgsc.net/Aspergillus/asperghome.html Information
BLAST National Center for Biotechnology Information, National [169]
(Basic Local Alignment Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Search Tool) USA: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
38
Material und Methoden
ChemStation Rev. A Agilent Technologies (Waldbronn, DE) 09.03
Clone Manager 7 Scientific and Educational Software (Cary, USA)
Clustal X 2.0 Conway Institute UCD Dublin, IRL [170] http://www.clustal.org/clustal2/ EDASeq R package http://www.bioconductor.org/ [171]
GenDB Center for Biotechnology (CeBiTec), Universität Bielefeld. [172] http://www.cebitec.uni- bielefeld.de/groups/brf/software/gendb_info/index.html NEBioCalculator http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation NEB (Ligation Calculator)
PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
TreeView Roderic D. M. Page, Division of Environmental and [173] Evolutionary Biology, Institute of Biomedical and Life Sciences, University of Glasgow, GB http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
Mikrobiologische Methoden
3.8.1 Kultivierung und Herstellung von E. coli-Dauerkulturen
Allgemeine Kultivierungsbedingungen Zum Inokulieren einer E. coli Flüssigkultur wurde eine autoklavierte Pipettenspitze oder ein steriler Zahnstocher benutzt. Eine Kolonie wurde von einer Platte gepickt und in flüssiges LB- Medium (Tabelle 3.18) mit den entsprechenden Antibiotika eingebracht. Die Inkubation erfolgte für 16 h bei 37 °C in einem Schüttelturm bei 180 rpm.
Zum Beimpfen von LB-Agarplatten wurde entweder eine einzelne Kolonie steril überpickt oder eine kleine Menge Flüssigkultur (100-200 μL) auf die Platte pipettiert und mit einem Drigalski- Spatel ausplattiert. Die Inkubation erfolgte in der Regel für 14-16 h bei 37 °C in einem Brutschrank. Zur Selektion wurden den Nährmedien Selektionsantibiotika in entsprechender Konzentration zugesetzt (Tabelle 3.17).
Herstellung von Dauerkulturen Zur Herstellung einer E. coli-Dauerkultur wurde der gewünschte Stamm für 16 h bei 37 °C in 100 mL LB-Medium unter Zugabe von entsprechenden Selektionsantibiotika kultiviert. Anschließend wurde die Kultur abzentrifugiert (5000 rpm, 4 °C, 5 min) und die Zellen in 15 %-iger Glycerin-Lösung resuspendiert (Tabelle 3.14). Die Dauerkultur wurde bei -20 °C gelagert.
39
Material und Methoden
3.8.2 Kultivierung und Herstellung der Dauerkulturen von Actinomyceten-Stämme
Allgemeine Kultivierungsbedingungen Die Standardkultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Actinomyceten-Stämme erfolgte in 40 mL TSB-Medium (Tabelle 3.18) in 100 mL-Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale. Hierfür wurden 200 μL einer Saccharose-Dauerkultur oder eine Einzelkolonie bzw. ein 1 cm2-großes, dichtbewachsenem Agarstück zum Inokulieren verwendet. Phosphomycin und Selektionsantibiotika wurden in entsprechender Konzentration zugegeben. Die Kulturen wurden anschließend für 48 h bei 28 °C, 180 rpm inkubiert.
Zur Kultivierung der Stämme auf Festmedium wurden TSB-Agarplatten verwendet, die die entsprechenden Selektionsantibiotika enthielt. Hierzu wurde eine einzelne Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher gepickt und auf der Agarplatte ausgestrichen. Anschließend wurden die Platten im Brutschrank bei 28 °C für 4-7 Tage inkubiert.
Kultivierung von Streptomyces albus-Mutanten zur Untersuchung der Fucosyltransferase-Aktivität Zur Herstellung einer Produktionskultur von den S. albus-Mutanten, die unter 4.1.3 beschrieben sind, wurden 2 mL einer Vorkultur (siehe 3.8.2.1) des entsprechenden Stamms jeweils in 100 mL HA- und NL111-Medium, versetzt mit Apramycin, Hygromycin und Phosphomycin (Tabelle 3.17), in einen 300 mL Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale gegeben. Die Inkubation erfolgte bei 28 °C, 180 rpm für 4 Tage. Anschließend wurde eine Extraktion (siehe 3.10.1.1) durchgeführt.
Kultivierung von Saccharothrix espanaensis x pGUS x PSam5-6 Zur Herstellung einer Produktionskultur von S. espanaensis (4.4.1.1) wurden 2 mL einer Vorkultur (siehe 3.8.2.1) in 100 mL TSB-Medium, versetzt mit Apramycin, Spectinomycin und Phosphomycin (Tabelle 3.17), in einen 300 mL Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale zugegeben. Anschließend wurden die Kulturen für GUS-Assay vorbereitet
Kultivierung von Saccharothrix espanaensis x pTESa-bldA Zur Herstellung einer Produktionskultur von S. espanaensis x pTESa-bldA (4.4.1.1) wurden 2 mL einer Vorkultur (siehe 3.8.2.1) in 50 mL Produktionsmedium, versetzt mit Apramycin und Phosphomycin (Tabelle 3.17), in einen 300 mL Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale gegeben. Hierzu wurden DNPM-, HA-, MH-, MPG-, NL111-, RAM2- und SG-Medium verwendet. Die Inkubation erfolgte bei 28 °C, 180 rpm für 4 Tage. Anschließend wurden die Kulturen geteilt. Eine Hälfte wurde extrahiert (siehe 3.10.1.1) und die andere Hälfte wurde lyophilisiert (siehe 3.10.1.2). Danach wurden ein Hemmhoftest (siehe 3.11) und eine HPLC/MS-Analyse (siehe 3.10.2.2) durchgeführt.
40
Material und Methoden
Kultivierung des Saccharothrix espanaensis-Wildtyps zur Untersuchung der Naturstoff-Produktion Zur Herstellung einer Produktionskultur des S. espanaensis-Wildtyps wurden 2 mL einer Vorkultur (siehe 3.8.2.1) in 50 bis 230 mL Produktionsmedium in einen 300 bzw. 500 mL Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale gegeben. Hierzu wurden GYM-, HA-, NL111- und SPY-
Medium, einmal mit und einmal ohne Zugabe von ScCl3 x 6H2O, verwendet. Die Inkubation erfolgte bei 28 °C, 180 rpm für 4 Tage. Nach anschließender Extraktion (siehe 3.10.1.1) wurden ein Hemmhoftest (siehe 3.11) und eine HPLC/ MS-Analyse (siehe 3.10.2.2) durchgeführt.
Herstellung von Dauerkulturen Zur Herstellung einer Dauerkultur wurde der entsprechende Stamm in 50 mL TSB-Medium unter Zusatz von Phosphomycin und entsprechender Selektionsantibiotika für 48 h bei 28 °C kultiviert. Anschließend wurde die Kultur zentrifugiert (5000 rpm, 4 °C, 5 min), mit 7 mL 25 %-iger Saccharose gewaschen und in 5 mL Saccharose-Lösung 25 % (m/V) resuspendiert. Die Dauerkulturen wurden bei –20 °C gelagert.
3.8.3 Kultivierung der für den Agardiffusionstest verwendeten Stämme Zur Anzucht von Bacillus subtilis (Tabelle 3.19) wurde LB-Medium (Tabelle 3.18) verwendet. Hierzu wurden 200 µL der Sporensuspension in 10 mL LB-Medium eingebracht und für 16 h bei 37 °C, 180 rpm inkubiert.
Die Anzucht von Candida parapsilosis (Tabelle 3.19) erfolgte in YM-Medium (Tabelle 3.18). Dabei wurden 200 µL der Saccharose-Dauerkultur in 10 mL YM-Medium gegeben und für 16 h bei 37 °C, 180 rpm inkubiert.
10 mL von PGA-Medium (Tabelle 3.18) wurde für die Anzucht von Fusarium verticillioides (Tabelle 3.19) eingesetzt. Die Kultivierung von Fusarium verticillioides erfolgte für 48 h bei 28 °C, 180 rpm. E. coli Turbo und S. albus J1070 wurden auch für den Agardiffusionstest verwendet. Die Kultivierung der beiden Stämme erfolgte jeweils wie unter 3.8.1.1 und 3.8.2.1 beschrieben. Abschließend wurde 1 mL der jeweiligen Kulturen auf eine Agarplatte ausplattiert und zum Agardiffusionstest verwendet.
3.8.4 Kultivierung und Herstellung einer Sporensuspension von Aspergillus nidulans Zur Kultivierung von A. nidulans (Tabelle 3.19) wurde PGA-Medium verwendet (Tabelle 3.18). Hierzu wurden entweder 200 µL der Sporensuspension oder 1 cm2-großes, mit A. nidulans bewachsenem Agarstück in 100 mL PGA Medium inokulieren. Die Kultivierung erfolgte bei 37 °C für 1-2 Tage.
Um eine Sporensuspension von A. nidulans herzustellen wurden Konidien von bewachsenen Agarplatten geerntet. Hierzu wurden die Oberflächen der konidienbildenenden Zellen mit einer sterilen Impföse abgekratzt, in sterilem Wasser suspendiert und bei 4 °C oder in 20 % Glycerol bei -20 °C oder -80 °C gelagert. 41
Material und Methoden
3.8.5 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen
Die Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen wurde in Anlehnung an die Methode von Sambrook et al. durchgeführt [174].
Zunächst wurden 5 mL LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum mit einer einzelnen E. coli Kolonie beimpft und 16 h bei 37 °C und 180 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurde 1 mL entnommen, in mehrere Kolben mit je 100 mL LB-Flüssigmedium überimpft und unter den angegebenen Bedingungen bis zu einer OD600 von 0,5-0,7 angezogen. Der Inhalt der Kolben wurde auf mehrere Falcon-Tubes verteilt und bei 5000 rpm, 10 min, 4 °C zentrifugiert. Alle folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt: Die Zell-Pellets wurden vorsichtig in je 30 mL einer eisgekühlten 0,1 M
MgCl2-Lösung resuspendiert und erneut bei 5000 rpm, 10 min, 4 °C abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zell-Pellets vorsichtig in je 30 mL eisgekühlter 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und 20 min auf Eis inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei 5000 rpm, 10 min, 4 °C wurden die Pellets vorsichtig in je 3-5 mL eisgekühlter 0,1 M CaCl2-Lösung mit 15 % Glycerin (m/V) resuspendiert und in Aliquots von 120 μL bei –80 °C gelagert.
Herstellung elektrokompetenter Zellen Die Herstellung der elektrokompetenten Zellen wurde ebenfalls in Anlehnung an das Protokoll von Sambrook et al. [174] durchgeführt.
Mit 1 mL einer Vorkultur (siehe 3.8.1.1) des gewünschten E. coli-Stamms wurden 100 mL LB- Flüssigmedium (Tabelle 3.2) mit dem entsprechenden Antibiotikum beimpft. Die Hauptkultur wurde bis zu einer OD600 von 0,5-0,6 angezogen und bei 3200 rpm, 10 min, 4 °C abzentrifugiert. Alle folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt: Das Zellpellet wurde vorsichtig in 30 mL 10 % igen Glycerol gewaschen und erneut bei 3200 rpm, 10 min, 4 °C abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde mit 15 mL 10 % igen Glycerol wiederholt. Das Pellet wurde im Anschluss in 10 % igen Glycerol suspendiert und in 120 µL Aliquots aufgeteilt, die bei -80 °C gelagert oder direkt zum Weiterarbeiten verwendet wurden.
3.8.6 Transformation von E. coli
Hitzeschock ermittelte Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen
Die Hitzeschock-Methode wurde zum Einbringen von Ligationsansätzen oder Plasmide in CaCl2- kompetenten E. coli-Zellen verwendet. Dazu wurde zunächst 120 μL CaCl2-kompetente E. coli-Zellen (3.8.5.1) mit 2-20 μL der zu transferierenden DNA pro Transformationsansatz versetzt und 25 min auf Eis inkubiert. Der Hitzeschock wurde für 90 s bei 42 °C im Wasserbad durchgeführt und die Zellen anschließend sofort wieder für 10 min auf Eis gestellt. Zur Regeneration wurde 1 mL LB-Medium steril zum Ansatz gegeben und 1-1,5 h bei 37 °C inkubiert. Nach einminütiger Zentrifugation des 42
Material und Methoden
Transformationsansatzes bei 14000 rpm wurde das Pellet in einem Tropfen Überstand resuspendiert und auf einer LB-Agarplatte mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert. Die Inkubation erfolgte für 14-16 h bei 37 °C.
Elektroporation ermittelte Transformation E. coli ET12567 x pUZ8002-Zellen wurden durch Elektroporation mit Plasmid-DNA transformiert. Hierzu wurde die zu transferierende DNA-Lösung mit 200 μL elektrokompetenter Zellen (3.8.5.2) gemischt und in vorgekühlte sterile Elektroporationsküvetten mit einem Elektrodenabstand von 0,1 cm pipettiert. Die Transformation erfolgte durch die Anlegung einer Spannung von 1,8 kV für 5 ms mit dem E. coli PulserTM der Firma BioRad. Anschließend wurde innerhalb der nächsten 10 s 1 mL LB- Medium (Tabelle 3.18) zugegeben, die Zellen vorsichtig suspendiert und 1-1,5 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Die Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und 12-16 h bei 37 °C inkubiert.
3.8.7 Blau-Weiß-Screening in E. coli Durch die Blau-Weiß-Screening in E. coli kann der Erfolg eines Klonierungsexperiments anhand der Koloniefarbe nachgewiesen werden. Dafür werden Vektoren eingesetzt, welche das lacZ-Gen in der MSC (multiple cloning site) tragen. Das intakte lacZ-Gen kann eine β-Galactosidase exprimieren, die durch ihre enzymatische Aktivität das Substrat X-Gal spaltet, wodurch ein blauer Farbstoff entsteht und die Kolonien färben sich blau. Durch die Klonierung des Inserts wurde das lacZ-Gen auf dem Vektor zerstört. Demnach steht das lacZ-Gen nicht mehr zur Komplementierung der durch das Wirtsgenom (E. coli) kodierten β-Galactosidase zur Verfügung. Dadurch kann X-Gal nicht mehr gespalten werden und die Kolonien zeigen keine blaue Färbung. Dadurch werden sie von den blauen Zellen unterschieden, die keinen Vektor oder den leeren Vektor aufgenommen haben.
Zur Durchführung der Blau-Weiß-Screening wurde die LB-Agarplatte mit den entsprechenden Selektionsantibiotika versetzt und mit einer Mischung aus 25 µL IPTG-Lösung und 25 µL X-Gal-
Lösung (Tabelle 3.12) in 100 µL H2Obidest überschichtet. Nach Durchführung der Transformation (siehe 3.8.6.1) wurden die Transformationsansätze ausplattiert und 14-16 h bei 37 °C inkubiert.
3.8.8 Intergenerische Konjugation Um DNA in Actinomyceten einzubringen, wurde die intergenerische Konjugation angewandt. Dabei wurde DNA ausgehend von dem Donorstamm E. coli ET12567 x pUZ8002 auf einen Actinomyceten Rezipientenstamm über einen Sex-Pilus übertragen. E. coli ET12567 x pUZ8002 (Tabelle 3.19) ist methylierungsdefizient, sodass die DNA-Restriktion durch den Rezepientenstamm verhindert wird. Dieser Stamm enthält außerdem das nicht transferierbare RP4-Derivat pUZ8002 (Tabelle 3.20), das für die Konjugation benötigt ist. Weiterhin muss das zu übertragende Plasmid einen RP4-Ursprung (oriT) zum Transfer des Plasmids besitzt, an dem die Konjugation eingeleitet werden kann.
43
Material und Methoden
CaCl2- bzw. Elektroporation-kompetente E. coli ET12567 x pUZ8002-Zellen wurden wie unter 3.8.6 beschrieben mit dem zu übertragenden Plasmid transformiert. Die Selektion auf pUZ8002 erfolgte mit Kanamycin (30 µg/mL). Ein zweites Antibiotikum wurde entsprechend der Resistenz auf dem zu übertragenden Plasmid zugefügt. Die Transformationsplatte wurde für 14-16 h bei 37°C inkubiert. Durch erneutes großflächiges Ausstreichen auf neue LB-Agarplatte mit den entsprechenden Antibiotika und erneuter Inkubation bei 37 °C über Nacht wurde ein dichtes Bakterienwachstum erhalten. Der gewünschte Rezipient wurde mit 200-300 µL einer Dauerkultur in 30 mL TSB- Medium für 24-48 h bei 28 °C und 180 rpm inkubiert. Pro Konjugationsansatz wurden jeweils 2 mL Kultur abzentrifugiert (7000 rpm, 3 min) und anschließend mit 800 µL TSB-Medium versetzt.
Mithilfe einer Impföse wurde der Donorstamm aufgenommen und mit dem Rezipienten sorgfältig gemischt. Danach wurde das Gemisch auf MS-Platte ausgestrichen und bei 28 °C für 6-12 h (Abhängig vom Stamm) inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit 400 mg/mL Phosphomycin, um das Wachstum von E. coli zu verhindern, und den entsprechenden Selektionsantibiotika des zu konjugierenden Plasmids überschichtet. Dazu wurden die Antibiotika in 1 mL H2Obidest bzw. TSB- Medium gelöst und auf der MS-Agarplatte flächendeckend verteilt. Die getrocknete Platte wurde bei 28 °C für 4-7 Tage inkubiert, bis die Exkonjuganden zu sehen sind. Die Exkonjuganden wurden gepickt und auf antibiotikahaltigen TSB-Agarplatten ausgestrichen und über Verdünnungsreihe vereinzelt.
3.8.9 In vivo Kaffeesäure-Glycosylierungsexperimente Zur Untersuchung der Fucosyltransferase-Aktivität der Glycosyltransferasegene des Saccharomicin- Genclusters wurden in vivo Glycosylierungsexperimente durchgeführt. Hierzu wurden 2 mL einer Vorkultur des gewünschten Bakterienstamm oder dessen Mutante in 100 mL NL111- bzw. HA-Medium in einem 300 mL-Erlenmeyerkolben mit einer Schikane und einer Metallspirale beimpft. Bei Bedarf wurden entsprechende Selektionsantibiotika zugegeben. Nach 24 h Inkubation bei 28 °C und 180 rpm wurden die Kulturen jeweils zwei Tage lang zweimal im Abstand von 12 h mit je 20 µL Kaffeesäure (25 mg/mL in DMSO gelöst) gefüttert. Im Anschluss an die letzte Fütterung wurden die Kulturen weiter drei Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert und anschließend extrahiert. Die Untersuchung auf die fucosylierte Kaffeesäure wurde mittels HPLC/ MS durchgeführt.
3.8.10 Herstellung von Aspergillus nidulans Protoplasten Zur Herstellung von Protoplasten von A. nidulans wurden 100 mL YG-Medium mit der Sporensuspension des A. nidulans-Stamms angeimpft und bei 37 °C, 180 rpm für 18 h inkubiert. Das gebildete Myzel wurde über einen Miracloth Filter gesammelt und mit 100 mL SMC Puffer (Tabelle 3.16) gewaschen. Ein Myzelpellet mit ca. 5 mm Durchmesser wurde in Protoplastierungslösung (Tabelle 3.16) überführt, und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Der Fortschritt der Protoplastierung wurde lichtmikroskopisch verfolgt. Wenn im Sehfeld bei 40 fach Vergrößerung ca. 10 Protoplasten identifiziert werden konnten, wurde die Protoplastensuspension über Miracloth in ein
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Material und Methoden
50 mL Falcon filtriert und mit 4 °C kaltem STC Puffer (Tabelle 3.16) durch Zentrifugation (3000 rpm, 10 min, 4 °C) zweimal gewaschen. Anschließend wurden die Protoplasten vorsichtig in 1 mL 4 °C kaltem STC Puffer (Tabelle 3.16) resuspendiert und in ein 1.5 mL Eppendorfgefäß überführt. Nach Zentrifugation (3000 rpm, 1 min, 4 °C) wurde das Pellet abgetrennt, in 500 µL STC Puffer resuspendiert und bei -80 °C gelagert.
3.8.11 Transformation von Aspergillus nidulans Für jeden Transformationsansatz wurden 100 µL Protoplasten (siehe 3.8.10), 25 µL DNA (m = 2-10 µg) und 25 µL PEG Puffer (Tabelle 3.16) vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 1 mL PEG (Tabelle 3.16) wurde die Mischung für weitere 5 min auf Eis inkubiert und mit 2 mL STC Puffer (Tabelle 3.16) gemischt. Anschließend wurde der Transformationsansatz mit 55 °C warmem Top Agar vermischt und auf eine mit Pyridoxin versetzte PDA-Platte verteilt. Für die Negativkontrolle wurde ein Transformationsansatz, mit der zu transferierenden DNA-Kassette, auf eine mit Pyridoxin versetzte PDA-Platte verteilt. Für die Positivkontrolle wurden 100 µL Protoplasten ohne DNA wie oben beschrieben behandelt und auf eine PDA-Platte, versetzt mit Uracil, Uridin und Pyridoxin, ausplattiert.
Molekularbiologische Methoden
3.9.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR: polymerase chain reaction) ist ein Verfahren zur Amplifizierung eines DNA Fragments. Die Reaktion läuft zyklisch ab. Jeweils drei aufeinanderfolgende Schritte setzen sich zu einem Zyklus zusammen, der bis zu 35-mal wiederholt wird. Im ersten Schritt wird die DNA zunächst durch Hitze in Einzelstränge denaturiert (94 °C), im zweiten Schritt lagern sich die Primer an (Annealing) und im dritten Schritt wird die DNA durch eine DNA-Polymerase amplifiziert (Elongation). Die Zahl der synthetisierten DNA Fragmente steigt mit jedem Zyklus exponentiell. Die Anlagerungtemperatur und die Elongationszeit sind variable und müssen auf die Schmelztemperatur der Primer, die Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments, sowie auf das verwendete Polymerase bestimmt werden. Als Polymerase wurden in dieser Arbeit die Taq-Polymerase, die Pfu-Polymerase und die Phusion-Polymerase verwendet. Die Taq-Polymerase synthetisiert ungefähr 1000 bp pro min. Die Pfu-Polymerase synthetisiert nur 500 bp pro min, weil sie im Gegenteil zu Taq-Polymerase eine Korrekturlesefunktion aufgrund ihrer 3‘ 5‘ Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Phusion-Polymerase synthetisiert 5000 bp pro min und besitzt wie Pfu-Polymerase eine 3‘ 5‘ Exonuklease-Aktivität. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Methode zur Amplifizierung von DNA-Fragmenten, die zur Klonierung weiterverwendet werden sollten, zum Nachweis von erfolgten Klonierung, oder zum gezielten Einfügen von Mutationen in ein Gen angewandt. Im Folgenden ist die Zusammensetzung eines PCR-Standardansatzes (Tabelle 3.23) sowie die Bedingungen eines PCR-Standardprogramms (Tabelle 3.24) tabellarisch dargestellt.
45
Material und Methoden
Tabelle 3.23 PCR-Standard-Reaktionsansatz
Komponente Volumen Stoffmenge/Units*
DNA-Matrize 1 μL
Pfu-Puffer, 10x 10 μL
Forward-Primer, 10 M 4 μL 20 pmol
Reverse-Primer, 10 M 4 μL 20 pmol
DMSO 10 μL
dNTP-Mix, 10 mM 2 μL je Nukleotid 20 nmol
H2Obidest. ad 49 μL
Pfu-Polymerase 1 μL 5 Units
In der Tabelle 3.24 ist das PCR-Standard-Programm dargestellt. Die Anlagerungstemperatur (X) wurde an die Schmelztemperatur der Primer, die mit dem Programm „Clone Manager“ berechnet wurde, angepasst. Die Elongationsdauer (Y) ist abhängig von der Länge des zu amplifizierenden Gens sowie von der verwendeten Polymerase.
Tabelle 3.24 PCR-Standardprogramm
PCR Schritt Dauer Temperatur Cyclenzahl
Initiation 2:00 min 94 °C 1
Denaturierung 0:30 min 94 °C
Annealing 0:30 min X °C 25-35
Elongation Y min 72 °C
Termination 10:00 min 72 °C 1
Stepdown-PCR Die Stepdown-PCR-Methode wurde durchgeführt, um die Ausbeute an gewünschten PCR-Produkten zu erhöhen. Hierfür wurde nach der Denaturierung die Anlagerungstemperatur in jedem Zyklus um 1 °C gesenkt. Die Absenkung der Anlagerungstemperatur erstreckte sich dabei immer über 10 Zyklen. Für die darauffolgenden 20 Zyklen wurde dann eine bestimmte Anlagerungstemperatur gewählt.
Kolonie-PCR Mit der Kolonie-PCR wurden einzelne bakterielle Kolonien untersucht, ob ein Insert in den Vektor eingebaut wurde. Dazu wurde einzelne Kolonien mit sterilen Zahnstochern ausgepickt und auf neue LB- Agarplatte mit den entsprechenden Antibiotika ausgestrichen und anschließend in ein 1,5 mL-
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Material und Methoden
Eppendorfgefäß mit 50 µL steriles H2Obidest getaucht. Das Eppendorfgefäß wurde 5 min bei 95 °C im Heizblock inkubiert und anschließend für 1 min bei 14000 rpm abzentrifugiert. 1 µL des Überstands wurde als Template für die PCR verwendet. Die LB-Agarplatten wurden bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und wurde für die spätere Plasmidisolierung angewandt.
Zielgerichtete (Site-Directed) Mutagenese durch PCR Zielgerichtete (Site-Directed) Mutagenese ist ein Verfahren zur Einführung von Mutationen in doppelsträngige DNA. Hierbei handelt es sich um eine Punktmutation, einen Aminosäureaustausch, eine Insertion oder Deletion von einigen Aminosäuren. Das Ziel der Mutagenese im Rahmen dieser Arbeit war der Austausch der Aminosäure Serin 154 durch Alanin in dem Gen rslO10 des Rishirilidgenclusters. Die Primer mit der gewünschten Mutation (Mutationsprimer) enthielten mindestens 15 bp vor und hinter der Mutation, um eine hohe Bindungsaffinität zur spezifischen Stelle sicherzustellen. Zur Durchführung dieser Methode wurde das „Site-specific overlap extension mutagenesis“-Protokoll [174] verwendet. Hierbei wurde zunächst das Gen in zwei Fragmenten unter Verwendung einer abgewandelten Stepdown- PCR-Methode mit insgesamt 18 Zyklen amplifiziert. Bei den ersten 14 Zyklen wurde die Anlagerungstemperatur in jedem zweiten Zyklus um 2 °C gesenkt. Für die darauffolgenden 4 Zyklen wurde eine bestimmte Anlagerungstemperatur gewählt. Anschließend wurden die beiden entstandenen PCR-Produkte als Template für die vollständige Amplifizierung des zu mutierenden Zielgens verwendet. Hierzu wurde eine Standard-PCR-Methode verwendet (Tabelle 3.24).
In dieser Arbeit verwendete Primer Alle Primer, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, sind von Eurofins MWG Operon bezogen und in Tabelle 3.25 aufgelistet. Die PCR-Bedingungen für die verwendete Primer sind in Tabelle 3.26 aufgeführt.
Tabelle 3.25 Verwendete Primer. Die Sequenzen der Restriktionsschnittstellen sind dunkelgrau unterlegt.
Restriktions- Primername Sequenz schnittstelle
AN07554NdeI CGCATATGAAGCGCAAGACCAACAGCAG NdeI
AN07554SalI CCGCGTCGACCTCCTCATCCTCATCCATATC SalI
AN2851-F CGCATATGCCCTTGAACATCTCC NdeI
AN2851-R GCGTCGACCCGCCATCTCCCTTTC SalI
BN6_01860-f GGTGAACGGCAGTCAACGTGAGC
BN6_01860-r TATCGATCGGTCGCGGGTCAGC
BN6_67950-f GACGAGAAGGTCAACGTCAAC
BN6_67950-r AACGTCCACATCGGACAGTTC
BN6_77230-f ATTGTTCCGGTTCGGCGCTTCGAC
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Material und Methoden
BN6_77230-r GCCCGATGTAGAGCTTGTACGTCTTC
BN6_79710-f TTCCGGAGTCGAAGCATACG
BN6_79710-r GGTTGGAGGTGCCTTTCGAATG
Fcd-f AGATCTGATATCGCACTAGTAGC
Fcd-r CAGGTGAATTCCGCTTATTAC
Fuc2-fcd-seq AGAGGCAGCGGCCCATGAG
KO-01860-f TATATCTAGACGCGGCTG GGCGACAAG XbaI
KO-01860-r TATAGGATCCAGGCAGT GCTCGTTGAAC BamHI
KO-03090-f TATATCTAGAGCTGGTCG GAGGGCTGG XbaI
KO-03090-r TAATGGATCCTCGACCAG GCCGCGGAAG BamHI
KO-75400-f TATATCTAGAACGCCTGGCCACGGCCGAG XbaI
KO-75400-r TATAGGATCCACGGCCTTGCGCAGCTTG BamHI
KO-77230-f TAATTCTAGATGCCCGGC TCCGAGCG XbaI
KO-77230-r TATAGGTACCGGCGTGC GGAAGGTCAG KpnI
KO-67950-f TAATTCTAGATCGCGCTGGCCTGCCAC XbaI
KO-67950-r TATAGGATCCAGGCACCGCACGGTCTC BamHI
KO-79710-f TATATCTAGACGCGATCGTCGCCGCTG XbaI
KO-79710-r TATAGGATCCAGGATCAGCGCCGCCAG BamHI oleS,E-xy-f GATCTAGACCCGGCATCCTG XbaI oleS,E-xy-r GCGATATCCCGGCCCAGCATTC EcoRV
P-01860-f TATATCTAGACGAAGGCGACGTCCG XbaI
P-01860-r TCTAGGTACCGAGCTGGACGTTATC KpnI
P-07730-f TCGATCTAGAGTGAGTACAGCCACCG XbaI
P-07730-r TATCGGTACCTTTGTTTCGCCGCAACG KpnI
P-68440-f TATATCTAGAGCAGCGCGGCCTTGGTG XbaI
P-68440-r TAGAGGTACCGCTTCGACACACCAC KpnI
P-75400/10-f TAGATCTAGAGGTAGGCCGAACCGAG XbaI
P-75400/10-r TATAGGTACCACAACGTCGGCAACGG KpnI
P-78320-f TACATCTAGAACCGGCGTGCTCGAC XbaI
P-78320-r TATCGGTACCTCGACTCTGGCTGGTG KpnI
PSam5-6-f GTCAGTCTAGATTCGCTGCTTCTCCGTC XbaI
PSam5-6-r TATAGGTACCGGACCGACCCGTTCGTTG KpnI
48
Material und Methoden
SDMut-RslO10-f CATCATCAACATCGCCGCCACCGGCGGCAAGCAGGG
SDMut-RslO10-r CCCTGCTTGCCGCCGGTGGCGGCGATGTTGATGATG
RslO10-HindIII-f TATAAAGCTTCGGCCCGCGCACTGAAC HindIII
RslO10-BglII-r TACTGAGATCTGACCGCGCCCAGGATG BglII
SS5-6-f TATATCTAGAGGCCGATCTCCGCCC XbaI
SS5-6-r TATAGGTACCCGCGCAGGATTGCCG KpnI wcaGa-f GCTTATTAGCCCCGGAAGC - wcaGa-r GCTAGGTACCGACGCGGTCCAC - oleS,E-xy-f GATCTAGACCCGGCATCCTG XbaI oleS,E-xy-r GCGATATCCCGGCCCAGCATTC EcoRV
Sam11-f GATAAGCTTCGTGGCGCAGCTGGAAGAG HindIII
Sam11-r GGCTCTAGACTGAGCACGACGAACTTGAC XbaI
Sam12-f TATAAGCTTCCGGGACGGGGCGAAC HindIII
Sam12-r GCTCTAGATGGTCTTCTCCGGGTTGACG XbaI
Sam13-f TAATAAGCTTGTGGACCGGCAGGCG HindIII
Sam13-r TATCTAGACTCTCAGGTCAGGCGTGACCG XbaI
Sam14-f2 GCCAAGCTTCTGCGGCAGGAG HindIII
Sam14-r GATGAATTCCGCCCGGTCAC XbaI
Sam15-f-HindIII ATAAGCTTGCCGAGCCCTCGTTCAC HindIII
Sam15-r-xbai GCTCTAGACGAACAGGATCCGCATCGAC XbaI
Sam16-f HindIII CTAAGCTTTGACCGCCAAGTTCC HindIII
Sam16-r XbaI CTTCTAGAGGTAGGTGGCGAACAGC XbaI
Sam17-f TATAAGCTTGGCGGAGCCGGGGTTC HindIII
Sam17-r GCTCTAGACGTGGCAGGTGAAGAGGAC XbaI
Sam18-f GCTAAGCTTGTGCCCCGGCTC HindIII
Sam18-r ATATGAATTCGCGGCGAACAGGAC EcoRI
Sam19-f TATAAGCTTGTGCCCGTCC HindIII
Sam19-r CGATGAATTCTCCGGATAGGTC EcoRI
Sam20-f ATTCAAGCTTACCGCCTTCGCCCGGGACTC HindIII
Sam20-r-XbaI TGCTGAATTCCGAGCAGGACACGCATC EcoRI
Sam21-neu-f GTGATATCGGACGCTGTTCG EcoRV
Sam21-neu-r CAGAATTCGCACGGGTCGTC EcoRI
49
Material und Methoden
Sam22-ss-f CAAGATATCCCGGAGAGCAGCC EcoRV
Sam22-ss-r GAGAATTCGGCGTCGGTGC EcoRI
Tabelle 3.26 PCR-Bedingungen für die verwendeten Primer. Anlagerungstemperatur (AT), Dauer der Elongationsphase (E), Stepdown-Methode x °C y °C (-1 °C pro Zyklus) (ATStepdown).
Primerpaar Polymerase PCR-Bedingungen Fragmentgröße (bp)
KO-01860-f/-r Taq-Polymerase AT 65 °C; E 1 min 20 s 786
AT 73 °C63 °C; KO-03090-f/-r Phusion Polymerase step down 765 AT 62 °C; E 15 s
KO-67950-f/-r Pfu-Polymerase AT 61 °C; E 3 min 1521
AT 73 °C63 °C; KO-77320-f/-r Phusion Polymerase step down 993 AT 62 °C; E 15 s
KO-79710-f/-r Phusion Polymerase AT 70 °C; E 15 s 941
AT 72 °C62 °C; P-01860-f/-r Pfu-Polymerase step down 404 AT 57 °C; E 1 min 20 s
AT 68 °C59 °C; P-07730-f/-r Phusion Polymerase step down 311 AT 60 °C; E 20 s
AT 72 °C62 °C; P-14890-f/-r Pfu-Polymerase step down 290 AT 57 °C; E 1 min
AT 72 °C62 °C; P-68440-f/-r Pfu-Polymerase step down 441 AT 57 °C; E 1 min 20 s
AT 68 °C59 °C; P-75400/10-f/-r Phusion Polymerase step down 357 AT 60 °C; E 20 s
AT 68 °C59 °C; P-78320-f/-r Phusion-Polymerase step down 343 AT 60 °C; E 20 s
AN01676-F/R Pfu-Polymerase AT 56 °C; E 1 min 40 s 840
AN07554NdeI, Pfu-Polymerase AT 50 °C; E 4 min 2004 AN07554SalI
AN2851-F/-R Pfu-Polymerase AT 63 °C; E 1 min 50 s 903
AN4986-F/-R Pfu-Polymerase AT 56 °C; E 1 min 30 s 760
AT 65 °C55 °C; Fcd-f/-r Pfu-Polymerase step down 451 AT 56 °C; E 55 s
AT 65 °C55 °C; oleS,E-xy-f/-r Taq-Polymerase step down 2203 AT 57 °C; E 4 min 20 s
AT 72 °C62 °C; PSam5-6-f/-r Pfu-Polymerase step down 596 AT 61 °C; E 1 min
AT 70 °C85 °C; rslO10-HindIII-f, SD- step down Pfu-Polymerase AT 64 °C; E 2 min. 550 MutrslO10-r (siehe 0)
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Material und Methoden
AT 70 °C85 °C; rslO10-BglII-r, SD- step down Pfu-Polymerase AT 64 °C; E 2 min 427 MutrslO10-f (siehe 0)
rslO10-HindIII-f, rslO10- Pfu-Polymerase AT 64 °C; E 2 min 975 BglII-r
AT 73 °C62 °C; SS5-6-f/-r Pfu-Polymerase step down 550 AT 67 °C; E 1 min 10 s.
AT 70 °C62 °C; Sam11-f/-r Pfu-Polymerase step down 1408 AT 65 °C; E 2 min 48 s
AT 70 °C62 °C; Sam12-f/-r Pfu-Polymerase step down 1498 AT 65 °C; E 2 min 48 s
Sam13-f/-r Pfu-Polymerase AT 63 °C; E 4 min 1544
AT 68 °C58 °C; Sam14-f2/-r Pfu-Polymerase step down 1371 AT 57 °C; E 2 min 45 s
Sam15-f-HindIII/-r-xbai Pfu-Polymerase AT 71 °C; E 2 min 51 s 1425
Sam16-f-HindIII/-r-XbaI Pfu-Polymerase AT 66 °C; E 2 min 45 s 1370
AT 70 °C62 °C; Sam17-f/-r Pfu-Polymerase step down 1458 AT 65 °C; E 2 min 48 s
AT 65 °C55 °C; Sam18-f/-r Pfu-Polymerase step down 1376 AT 57 °C; E 2 min 40 s
AT 68 °C58 °C; Sam19-f/-r Pfu-Polymerase step down 1404 AT 57 °C; E 2 min 48 s
AT 67 °C57 °C; Sam20-f, Sam20-r-XbaI Pfu-Polymerase step down 1368 AT 63 °C; E 2 min 40 s
AT 68 °C58 °C; Sam21-neu-f/-r Pfu-Polymerase step down 1094 AT 61 °C; E 2 min 12 s
AT 68 °C58 °C; Sam22-ss-f/-r Pfu-Polymerase step down 1210 AT 61 °C; E 2 min 48 s
Sam22-ss-f/sam21-neu-r Taq-Polymerase AT 55 °C; E 6 min 2389
3.9.2 Restriktion von DNA durch Restriktionsenzyme Zur Restriktion von DNA wurden Endonukleasen der Klasse II von NEB und Promega (Tabelle 3.5) verwendet. Die Restriktionsendonukleasen wurden gemäß der Herstellerangaben mit dem jeweils mitgelieferten Puffer durchgeführt. Die optimale Inkubationstemperatur liegt in der Regel bei 37 °C über einen Zeitraum von 30 bis 90 min in einem Gesamtvolumen von 10 μL bei einem analytischen Ansatz und 70 μL bei einem präparativen Ansatz.
51
Material und Methoden
3.9.3 Ligation und Dephosphorylierung Zur Durchführung der Ligation wurde T4-DNA-Ligase (Tabelle 3.5) nach Anweisung des Herstellers verwendet. Die T4-Ligase katalysiert, unter ATP-Verbrauch, die Ausbildung von Phosphodiesterbindung zweier DNA-Stränge. Dadurch wird die 5´-Phosphatgruppe eines DNA- Stranges mit der freien 3´-OH-Gruppe eines anderen DNA-Stranges verknüpft. Die Reaktion erfolgte in einem Volumen von 10-20 µL in ATP-haltigem Ligase-Puffer mit 3 Einheiten T4-Ligase. Bezogen auf die Konzentration des Inserts und des Vektors wurde das Verhältnis von Insert/Vektor in dem Ligationsanstaz berechnet. Die Ligationsansätze wurden wahlweise über Nacht bei 4 °C oder 2 h bei 16 °C inkubiert und anschließend direkt für die Transformation in E. coli verwendet.
Zur Vermeidung der Religation des geschnittenen Vektors wurde eine Dephosphorylierung an den 5´-Enden des Vektors durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde entweder das Kit „Rapid DNA Ligation“ oder die Antarctic Phosphatase von NEB (Tabelle 3.5) mit dem entsprechenden Puffer gemäß Herstellerangaben verwendet.
3.9.4 Plasmidisolierung aus E. coli Je nach benötigten Konzentration und Reinheit des Plasmids wurden verschiedene Methoden für die Plasmidisolierung aus E. coli verwendet.
Plasmidisolierung mittels alkalische Lyse Alle verwendeten Puffer sind in der Tabelle 3.7 aufgeführt.
Einzelne E. coli-Kolonien wurden für 16 h bei 37 °C und 180 rpm in 5 mL LB-Medium (Tabelle 3.18) mit den entsprechenden Antibiotika inkubiert. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (14000 rpm, 4 min) geerntet und das Zellpellet in 200 µL P1-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden 200 µL P2-Puffer hinzugefügt, durch Invertieren gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 200 µL P3-Puffer zugegeben, durch mehrfach Invertieren gemischt, für 5min auf Eis inkubiert. Durch Zentrifugation (14000 rpm, 15 min, 4 °C) wurden die Proteinen und genomische DNA abgetrennt. Der klare Überstand wurde in einem neues Eppendorfgefäß überführt. Die DNA-Fällung erfolgte durch Zugabe von 700 µL eiskaltem Isopropanol und anschließender Zentrifugation (14000 rpm, 15 min 4 °C). Das nicht sichtbare Plasmid-DNA Pellet wurde mit 500 μL 70 % Ethanol durch Invertieren gewaschen und erneut zentrifugiert (14000 rpm, 10 min 4 °C). Nach dem Trocknen des Pellets wurde die Plasmid-DNA in 30 µL H2Obidest gelöst und bei -20 °C gelagert.
Plasmidisolierung mittels Kit Größere Plasmidmengen mit hohem Reinheitsgrad wurden durch Aufreinigung der Plasmid-DNA mit Hilfe des Kits „ Wizard ® Plus SV Minipreps“ oder „ Pure YieldTM Plasmid Midiprep System“ (Tabelle 3.6) von der Firma Promega oder des Kits „innuPREP Plasmid Mini Kit“ (Tabelle 3.6) von der Firma Analytik Jena AG verwendet. Hierzu wurden 5 mL für den kleinen Maßstab bzw. 100 mL für den
52
Material und Methoden großen Maßstab LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit der E. coli Kolonie überführt und bei 37 °C und 180 rpm über Nacht inkubiert. Die DNA-Isolierung erfolgte entsprechend den Herstellerangaben.
3.9.5 Isolierung genomischer DNA aus Actinomyceten-Stämme Die Isolierung genomischer DNA aus S. espanaensis, S. albus und deren Mutanten erfolgte nach einem Protokoll von Kieser et al.[160]. Die verwendeten Puffer und Lösungen sind in Tabelle 3.8 angegeben.
10 mL TSB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika wurden mit einer Actinomyceten-Kolonie beimpft und bei 28 °C, 180 rpm für 48 h inkubiert. 2 mL dieser frischen Kultur wurden zentrifugiert (14000 rpm, 2 min). Das Pellet wurde in 500 µL SET-Puffer resuspendiert, mit 10 µL Lyzosym-Lösung versetzt, mehrmals invertiert und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Nach Zugabe von 14 µL Proteinase K- Lösung und 50 µL SDS-Lösung wurde vorsichtig invertiert und bei 55 °C für 1 h inkubiert, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Anschließend wurden 200 µL NaCl-Lösung und 500 µL Chloroform zugegeben und 2 min kräftig geschüttelt. Durch Zentrifugation (14000 rpm, 10 min, 4 °C) wurden die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die genomische DNA durch Zugabe von 500 µL eiskaltem 100 % Isopropanol gefällt. Nach Zentrifugation (14000 rpm, 10 min, 4 °C) wurde das Pellet zweimal mit 500 µL 70 % (V/V) Ethanol gewaschen, für 15 min bei
60 °C getrocknet und in 150 µL H2Obidest gelöst.
3.9.6 Analyse und Isolierung von DNA über Agarose-Gelelektrophorese Zur Bestimmung der DNA-Fragmentgrößen im Anschluss einer PCR oder eines Restriktionsverdaus und zur Aufreinigung der gewünschten DNA-Fragmente wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Hierbei wurde die DNA-Lösung mit Ladepuffer gemischt und in eine Tasche eines 0,7 %igen (m/V) Agarosegels (Tabelle 3.9) pipettiert. Zur Größenabschätzung wurde eine 1 kb-DNA- Leiter von Promega oder NEB in eine weitere Tasche aufgetragen. Die Trennung erfolgte bei 75-100 V in 1x TAE-Puffer. Die Gele wurden anschließend für 10-15 min in einem Ethidiumbromid- bzw. Gelred-Färbebad gefärbt und mittels UV-Transilluminator und einer CCD-Kamera dokumentiert. Die zu isolierenden DNA-Fragmenten wurden unter UV-Licht mit Hilfe eines Skalpells ausgeschnitten und mittels des Kits „Wizard ® SV Gel“ und „PCR Clean-up System“ (Tabelle 3.6) von Promega aufgereinigt.
3.9.7 Isolierung Gesamt-RNA aus Aspergillus nidulans Zur Isolierung gesamter RNA aus A. nidulans A4 wurde das Kit „RNeasy Plant Mini Kit“ (Tabelle 3.6) verwendet. Hierfür wurde 50 mL A. nidulans-Malzextrakt-Kultur, die für 48 h, 200 rpm bei 37 °C kultiviert wurde, verwendet. Die Kultur wurde in Filterpapier auf einen Sieb mit Hilfe des Vakuums getrocknet. Das erhaltene Myzel wurde trockengepresst, in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser pulverisiert. Anschließend wurde das Myzel in sechs 2 mL-Eppendorfgefäße verteilt, jeweils mit 600 µL RLT-Puffer, welcher 10 µL/mL β-Mercaptoethanol enthält, versetzt und auf einem 53
Material und Methoden
Vortex gemischt. Das Lysat wurde auf eine QIAshredder-Spinsäule (im Kit enthalten) überführt und zentrifugiert (14000 rpm, 2 min, RT). Die Überstände wurden jeweils vorsichtig, ohne den oberen Rand zu benetzen, in ein frisches Eppendorfgefäß überführt und mit 95 % Ethanol (1:0,5 (V/V)) gemischt. Die Mischung wurde auf eine im Kit erhaltene RNeasy-Spinsäule (in einem 2 mL-Collection-Tube) gegeben. Das Gefäß wurde verschlossen und erneut zentrifugiert (14000 rpm, 1 min, RT). Anschließend wurde die RNeasy-Spinsäule in ein sauberes 2-mL-Collection-Tube setzen und das benutzte Collection- Tube mitsamt Filtrat entsorgen. Anschließend wurde 80 µL zuvor vorbereiteten DNase-Lösung bestehend aus 10 µL DNase I und 70 µL DNase Puffer zur Spinsäule zugegeben und bei RT für 15 min inkubiert. Nach Zugabe von 350 µL RW1-Puffer (im Kit enthalten) zu der RNeasy-Spinsäule wurde zentrifugiert (14000 rpm, 1 min, RT) und der Durchfluss wurde verworfen. Im Anschluss folgten zwei weitere Waschschritten mit jeweils 500 µL RPE Puffer (im Kit enthalten). Der Durchfluss wurde nach der Zentrifugation bei 14000 rpm für 15 s beim ersten Schritt und für 2 min beim zweiten Schritt jeweils verworfen. Zum Schluss wurde die RNA mit 50 µL RNase-freiem Wasser eluiert. Die Lagerung der RNA erfolgte bei -20 °C.
3.9.8 cDNA-Synthese Um cDNA von A. nidulans zu erhalten, wurde mit der vorher isolierten Gesamt-RNA (siehe 3.9.7) eine Reverse-Transkriptase-Reaktion mit Hilfe des Kits “Ready-To-Go T-Primed First-Strand” (Tabelle 3.6) durchgeführt. Hierfür wurden 1 µg RNA mit 28 µL DEPC-behandeltes H2Obidest für 10 min bei 65 °C inkubiert. Anschließend wurde auf Eis für 2 min inkubiert. Die RNA-Lösung wurde zu der First- Standard-Reaction Mix (im Kit erhalten) zugegeben und auf einem Vortex gut gemischt. Nach über Nacht-Inkubation bei 37 °C wurde die erhaltene cDNA als Template für PCR-Amplifizierung verwendet.
3.9.9 DNA-Sequenzierung Die Richtigkeit, der im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Plasmide, wurde durch Sequenzierung überprüft. Hierzu wurden die Plasmid-DNA, die mit Hilfe des WIzard®Plus SV Miniprep Kits (3.9.4.2) aufgereinigt sind, von der Firma 4base Lab GmbH in Reutlingen bzw. GATC-Biotech in Konstanz sequenziert. Zur Sequenzierung wurden entweder die Standardprimer des Vektors oder die genspezifischen Primer verwendet. Die Konzentration der Plasmid-DNA wurde über UV-Absorption oder mittels NanoDROP 1000 (Tabelle 3.1). Die Proben wurden gemäß den Angaben der Sequenzirungsfirma verdünnt und zur Sequenzierung verschickt. Die Auswertung der Sequenzierungsdaten erfolgte mit dem Clone Manager 7 (Tabelle 3.22).
3.9.10 RNA-Sequenzierung RNA-Sequenzierung (RNA-Seq), auch „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“ ist ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren der RNA. Dadurch werden Informationen über Genexpression erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine RNA-Seq von S. espanaensis-Wildtyp
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Material und Methoden kultiviert in verschiedenen Medien bzw. gefüttert mit Alizarin durchgeführt. Hierzu wurde eine Vorkultur von S. espanaensis-Wildtyp (siehe 3.8.2.1) hergestellt, davon wurden 3 mL in je 100 mL Hauptkultur (siehe 3.8.2.5) angeimpft. Die Hauptkulturen wurden nach 36 h im Fall der Fütterung mit Alizarin bzw. 96 h im Fall der Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium (siehe 3.8.2.5) Inkubation bei 28 °C, 180 rpm durch Zentrifugieren (5000 rpm, 10 min, 4 °C) geerntet und die Pellets bei -80 °C gelagert. Die Pellets wurden auf Trockeneis zur RNA-Sequenzierung an die Firma Vertis Biotechnologie AG (Freising) verschickt. Zunächst wurde die gesamte RNA isoliert. Die Entfernung von rRNA erfolgte mit Hilfe des Ribo-Zero Bacteria Kits (Epicentre, Madison, USA). Nach der Fragmentierung der mRNA mit Hilfe der RNaseIII und anschließenden Einfügen von Poly(A)-Enden wurden die entstandenen Fragmente mit einem Adaptor ligiert und in cDNA mittels eines oligo(dT)- adaptor-Primer und der M-MLV reversen Transkriptase übersetzt. Die cDNA-Fragmente wurden mittels ein Illumina HiSeq 2000 System sequenziert und die 100-250 bp erhalten Sequenzen (Reads) konnten in silico am Gesamtengenom ausgerichtet und analysiert werden. Die in silico Analyse der erhaltenen Daten wurde von Dr. Bogdan Tokovenko vom Helmholzinstitute in Saarbrücken durchgeführt und in .xlsx Tabellen beschrieben. Verschiedene Computerprogrammen und Softwares wie Novoalign V3.00.04, EDASeq R package [171] und ArrayQualtiyMetrics [168] wurden zur Zusammenfassung der erhaltenen Sequenzdaten verwendet. Bei mehrfach passende Reads erfolgte eine zufällige Verteilung auf die passenden Sequenzen. Die RPKM (Reads pro Kilobase pro Millionen) Werte wurden wie bei Mortazavie et al. 2008 beschrieben berechnet [175]. Die Normalisierung der Werte erfolgte auf die „Gesamtanzahl der insgesamt ausgerichteten nicht-rRNA Reads pro Experiment“ und nicht auf „Gesamtanzahl der Reads in einem Experiment“.
3.9.11 Konstruktion von Plasmiden
Klonierung des wcaGa-Gens
Optimierung des Gens wcaGa in Streptomyces albus Die DNA-Sequenz des Gens wcaG aus E. coli K12 wurde von der Firma Genscript® für Streptomyceten optimiert, in wcaGa umbenannt und mit Hilfe der Restriktionsenzyme MunI und NsiI in das Plasmid pUC57 kloniert.
Konstruktion des Plasmids pTOS-wcaGa Das Konstrukt, das zur Übertragung des Gens wcaGa in S. albus benutzt wurde, ist unter Verwendung eines integrativen Plasmids unter Kontrolle des ermE* Promotors kloniert worden
Durch einen Doppelverdau des Plasmids pTOS-Rham (Tabelle 3.20) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NsiI wurden die Gene oleL, oleS, oleE und oleU von dem Plasmid pTOS-Rham ausgeschnitten. Das Insert wcaGa wurde mit den Restriktionsenzymen MunI und NsiI verdaut. Anschließend wurde das Gen wcaGa durch Ligation in den Vektor eingebracht und für die
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Material und Methoden
Transformation mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) von E. coli Turbo verwendet. Die Richtigkeit des Konstrukts wurde mittels Sequenzierung unter Verwendung der Primer wcaGa-f und wcaGa-r verifiziert. Die Plasmidkarte des Plasmids pTOS-wcaGa ist in Abbildung 7.1 dargestellt.
Klonierung von D-Fucose-Biosynthesegenen
Konstruktion des Plasmids pTESa x fuc1,2 Die Gene rmlA (oleS) und rmlB (oleE) wurden im Rahmen dieser Arbeit als fuc1 und fuc2 bezeichnet. Die beiden Gene wurden gemeinsam mittels PCR amplifiziert. Als Template diente das Plasmid pTOS- Rham (Tabelle 3.20). Die Primer oleS,E-xy-f und oleS,E-xy-r wurden zur Amplifizierung der Gene fuc-1 und fuc-2 verwendet. Die Sequenz der verwendeten Primer sowie die PCR-Methode sind in Tabelle 3.25 und Tabelle 3.26 aufgeführt. Durch einen Doppelverdau des Plasmids pTESa und des PCR- Produkts fuc1,2, welches die Gene fuc1 und fuc2 enthält, mit den Restriktionsenzymen XbaI und EcoRV und anschließender Ligation wurde die Klonierung durchgeführt. Das erhaltene Plasmid wurde mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) in E. coli Turbo eingebracht. Die Richtigkeit des Plasmids pTESa x fuc1,2 wurde über Kolonie-PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt. Die Plasmidkarte des Plasmids pTESa x fuc1,2 ist in Abbildung 7.2 dargestellt.
Konstruktion der Plasmide pTESa x fuc1,2-sam21 und pTESa x fuc1,2-sam22, Die Gene sam21 und sam22 sollten jeweils einzeln sowie gemeinsam in dem Vektor pTESa x fuc1,2 kloniert werden. Die Primer Sam21-neu-f und Sam21-neu-r sowie Sam22-ss-f und Sam22-ss-r wurden zur Amplifizierung der einzelnen Gene sam21 und sam22 eingesetzt. Als Template diente das Cosmid cos17 (Tabelle 3.20). Die PCR-Methoden zur Amplifizierung der obengenannten Gene sind in Tabelle 3.26 aufgeführt. Sowohl das Plasmid pTESa x fuc1,2 als auch die Gene sam21 und sam22 wurden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRV verdaut, miteinanderligiert und für die Transformation von E. coli Turbo mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) verwendet. Die Richtigkeit der Konstrukte, pTESa x fuc1,2-sam21 und pTESa x fuc1,2-sam22 wurde über Kolonie-PCR, Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt. Die Plasmidkarten der Plasmide pTESa x fuc1,2- sam21 und pTESa x fuc1,2-sam22 sind in Abbildung 7.3 dargestellt.
Konstruktion des Plasmids pTESa x fuc1,2-fcd
Optimierung des Gens fcd in Streptomyces albus Die DNA-Sequenz des Gens fcd aus A. actinomycetemcomitans Y4 wurde von der Firma Eurofins® für Streptomyceten optimiert, synthetisiert und mit Hilfe des Restriktionsenzyms EcoRI in das Plasmid pEX kloniert.
Konstruktion des Plasmids pTESa x fuc1,2-fcd Das Gen fcd wurde über EcoRI aus dem Plasmid pEX-fcd ausgeschnitten, in das EcoRI-geöffnete Plasmid pTESa x fuc1,2, ligiert und anschließend mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) in E. coli Turbo
56
Material und Methoden eingebracht. Mittels Restriktionsverdau konnte zwischen den resultierenden Plasmiden pTESa x fuc1,2-fcd und pTESa x fuc1,2-fcd-inv, bei dem das Insert in der umgekehrten Richtung ligiert wurde, unterschieden werden (Abbildung 3.1). Durch Sequenzierung mit Hilfe der Primer fcd-seq-f und fcd-r wurde die Richtigkeit des Konstrukts verifiziert. Die Plasmidkarte des Konstrukts pTESa x fuc1,2-fcd ist in Abbildung 7.4 dargestellt.
A B
1 2 3 4 5 6
Abbildung 3.1 Kontrollverdau von pTESa-fuc1,2-fcd und pTESa-fuc1,2-fcd-inv. A pTESa x fuc1,2-fcd verdaut mit 1. XbaI und EcoRI: 0,4 kb; 2,2 kb; 5,8 kb; 2. PvuI; 2,9b; 5,5 kb; 3. NotI, SpeI: 2 kb; 6,5 kb. B pTESa-fuc1,2- fcd-inv verdaut mit 4. NotI und SpeI: 2,5 kb; 6 kb; 5. PvuI; 2,8b; 5,7 kb; 6. XbaI, EcoRI: 0,4 kb; 2,2 kb; 5,8 kb.
Konstruktion der Plasmide pUWL-H-GTs Die Glycosyltransferasegene des Saccharomicin-Genclusters sollten einzeln unter der Kontrolle des Promotors ermE Up in einen replikativen Vektor kloniert werden. Hierzu wurde das Gen tnp aus dem Plasmid pUWL-H durch die einzelnen GT-Gene ersetzt.
Die Gene sam11, sam12, sam13, sam14, sam15, sam16, sam17, sam18, sam19 und sam20 wurden mit Hilfe der entsprechenden Primer (Tabelle 3.25) amplifiziert. Als Template diente das Cosmid cos 17 (Tabelle 3.20). Die verwendeten PCR-Methoden zur Amplifizierung der einzelnen Glycosyltranseferasegene sind in Tabelle 3.26 dargestellt.
Die Gene sam11, sam12, sam13, sam14, sam15, sam16 und sam17 wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI verdaut, in das über HindIII und XbaI geschnittenen Plasmid pUWL-H ligiert und für die Transformation mittels Hitzeschock von E. coli Turbo verwendet. Die Gene sam18, sam19 und sam20 wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI geschnitten, in das über HindIII und EcoRI geöffneten Plasmid pUWL-A-oriT ligiert und mittels Hitzeschock in E. coli Turbo eingebracht. Durch einen Doppelverdau mit HindIII und XbaI wurden die Gene sam18, sam19 und sam20 aus pUWL-A-oriT ausgeschnitten, in das über HindIII und SpeI geschnittenen Plasmid pUWL-H ligiert und für die Transformation mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) von E. coli 57
Material und Methoden
Turbo verwendet. Die Plasmide pUWL-H-sam11, pUWL-H-sam12, pUWL-H-sam13, pUWL-H- sam14, pUWL-H-sam15, pUWL-H-sam16, pUWL-H-sam17, pUWL-H-sam18, pUWL-H-sam19 und pUWL-H-sam20 wurden nachfolgend unter pUWL-H-GTs zusammengefasst. Die Plasmidkarte von pUWL-H-GTs is in Abbildung 7.5 dargestellt.
Klonierung von pGUS x PSam5-6, pGUS x P78320, pGUS x P07730, pGUS x P01860 und pGUS x P68440 Der Promotorbereich der jeweiligen Gene BN6_58670 (sam6) BN6_78320, BN6_07730, BN6_01860 und BN6_68440 aus dem Genom des S. espanaensis-Stamms wurde unter Verwendung der entsprechenden Primer (PSam5-6: PSam5-6-f/-r (Promotorbereich mit RBS) bzw. SS5-6-f und SS5-6-r (Promotorbereich ohne RBS); P78320: P78320-f/-r; P07730: P07730-f/-r; P01860: P01860-f/-r P68440: P68440-f/-r) (siehe Tabelle 3.25) mittels PCR amplifiziert. Als Template diente das Cosmid cos35 (Psam5-6) (Tabelle 3.20) bzw. die genomische DNA von S. espanaensis (P78320, P07730, P01860 und P68440). Die jeweiligen verwendeten PCR-Methoden sind in Tabelle 3.26 dargestellt.
Die Konstrukte, die zur Transkriptionsfusion verwendet wurden, sind unter Verwendung des Plasmids pGUS (Tabelle 3.20) kloniert worden. Durch einen Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen XbaI und KpnI wurden das Plasmid und die jeweiligen Inserts restrigriert. Nach der anschließenden Ligation wurde die resultierenden Plasmide für die Transformation mittels Hitzeschock (siehe 3.8.6.1) von E. coli Turbo verwendet. Die Plasmidkarte des Plasmids pGUS x PSam5-6 ist in Abbildung 7.7 dargestellt
Klonierung von pUWL-H x SD-rslO10 Zur Einführung einer Punktmutation in das Gen rslO10, wobei die Aminosäure Serin 154 durch Alanin ausgetaucht wurde, wurde das „Site specific overlap extension mutagensis“-Protokoll eingesetzt (siehe 3.9.1.3) [174]. Hierzu wurde das Primerpaar rslO10-HindIII-f, SD-MutrslO10-r zur Amplifizierung eines Teils des rslO10-Gens eingesetzt. Das Primerpaar SD-MutrslO10-f, rslO10-BglII- r wurde zur Amplifizierung des zweiten Teils des Gens rslO10 verwendet. Der Primer SD-MutrslO10- r, sowie der Primer SD-MutrslO10-f enthalten die gewünschte Punktmutation. Als Template diente das Cosmid cos4 (Tabelle 3.20). Die beiden entstandenen PCR-Produkte wurden gemeinsam als Template für die vollständige Amplifizierung des mutierten Gens rslO10 (SD-rslO10) verwendet. Die Amplifizierung erfolgte durch die Primer rslO10-HindIII-f und rslO10-BglII-r. Die PCR-Bedingungen der jeweiligen verwendeten Primerpaare sind in Tabelle 3.26 gezeigt. Im Anschluss an die PCR wurde das PCR-Produkt (SD-rslO10) mit HindIII und BglII verdaut und in das mit HindIII und BamHI geschnittenen pUWL-H-Plasmid ligiert. Anschließend wurde das entstandene Plasmid für die Transformation mittels Elektroporation (siehe 3.8.6.2) von E. coli XL1-Blue verwendet. Durch Sequenzierung mit Hilfe der rslO10-HindIII-f und rslO10-BglII-r wurde die Richtigkeit des Konstrukts verifiziert. Die Plasmidkarte des Konstrukts pUWL-H x SD-rslO10 ist in Abbildung 7.9 dargestellt.
58
Material und Methoden
Konstruktion der Plasmide pKC1132 x KO01860; pKC1132 x KO77230; pKC1132 x KO75400, pKC1132 x KO67950 und pKC1132 x KO79710 Zur Inaktivierung der Gene BN6_01860, BN6_77230, BN6_67950 und BN6_79710 wurden interne Fragmente aus dem jewiligen oben benannten Gene in dem suiziden Vektor pKC1132 kloniert. Hierfür wurden die internen Fragmente jeweils mit den entsprechenden Primer (KO01860-f/-r, KO77230-f/-r, KO67950-f/-r, KO79710-f/-r) über PCR amplifiziert. Als Template diente die genomische DNA des S. espanaensis. Sowohl der Vektor als auch die jeweiligen entstandenen PCR-Produkte wurden mit XbaI und BamHI verdaut und anschließend ligiert. Die erhaltenen Plasmide wurden jeweils für die Transformation von E. coli XL1-Blue verwendet. Mittels Restriktionsverdau wurde die Richtigkeit der resultierenden Plasmide überprüft. Die Primersequenzen sowie die verwendete PCR-Methode sind in Tabelle 3.25 und Tabelle 3.26 gezeigt.
Konstruktion der Plasmide pET22b(+)-AN2851 und pET22 b(+)-AN07554; Zur Expression von ANID_2851 und ANID_07754 wurden die Gene jeweils in den Proteinexpressionsvektor pET22b(+) kloniert. Hierfür wurden die Primerpaare 2851-f/-r und 07554-f/-r verwendet (siehe Tabelle 3.25) und mit dem A. nidulans A4 cDNA-Template über PCR amplifiziert. Sowohl der Vektor als auch die jeweiligen PCR-Produkte wurden mit NdeI und SalI verdaut. Nach anschließender Ligation der jeweiligen PCR-Produkte mit geschnittenem Vektor wurden zwei Plasmide erhalten: pET22b(+)-AN02851 und pET22 b(+)-AN07554. Diese wurden jeweils für die Transformation in E. coli XL1-Blue verwendet. Nach Überprüfung auf Richtigkeit der erhaltenen Plasmide mittels Restriktionsverdau und Sequenzierung wurden die Plasmide für die Transformation von E. coli BL21 (DE3) x pLys (Tabelle 3.19) verwendet.
Isolierung und Analytik von Naturstoffen
3.10.1 Isolierung von Naturstoffen
Gewinnung von Rohextrakten durch Extraktion Die über vier bis neun Tage angezogenen Kulturen wurden zentrifugiert (5000 rpm, 10 min, RT), um das Myzel vom Überstand zu trennen. Für Kulturen bis 100 mL wurde die Rotina-Zentrifuge (5000 rpm, 10 min, RT) und für größere Ansätze die Beckmann-Zentrifuge (8000 rpm 15 min, RT) verwendet. Nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 4,0 bzw. pH 7,0 wurde der Überstand im Scheidetrichter einmal mit dem gleichen Volumen Essigsäureethylester für 15 min bei 180 rpm geschüttelt. Nach erfolgter
Phasentrennung wurden die organischen phasen mit wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, über einen Cellulosefilter filtriert und mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bis zur Trockne eingedampft. Anschließend wurden die so gewonnenen Rohextrakte in 800 μL Methanol aufgenommen und zur Analyse mittels HPLC/ESI-MS sowie in einem Agardiffusionstest eingesetzt. Die Lagerung der getrockneten Rohextrakte erfolgte bei -20 °C.
59
Material und Methoden
Gewinnung von Rohextrakten durch Gefriertrocknung (Lyophilisation) Die Lyophilisation ist ein Verfahren zur schonenden Entfernung des Wassers von wasserhaltigem Material bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts, insbesondere bei thermolabilen Stoffen. Die Lyophilisation umfasst drei aufeinanderfolgende Schritte: Das Einfrieren der Lösung, das Entfernen des Wassers aus der gefrorenen Lösung unter Vakuum (Haupttrocknung) und das Trocknen. Das Endprodukt der Gefriertrocknung ist ein stabiles, trockenes Pulver, das in Sekundenschnelle rekonstruierbar ist. Um den Überstand der Produktionskulturen zu lyophilisieren, wurden die gewachsenen Kulturen durch Zentrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 °C) geerntet und der Überstand der jeweiligen Kulturen wurde bei -80 °C für 4 h gelagert und anschließend für 48 h lyophilisiert. Danach wurde die Lyophilisat in Methanol aufgelöst und für ein Hemmhoftest verwendet.
Festphasenextraktion Die Fraktionierung eines Rohextrakts bzw. die Aufkonzentrierung eines gewünschten Produkts erfolgte durch Festphasenextraktion (solid phase extraction SPE). Als Säulenmaterial wurde die Oasis ® HLB 20 35 cc (6 g) Cartidge verwendet. Die Säule wurde zunächst mit einer stufenweise absteigenden Konzentration von Methanol konditioniert, bis eine Konzentration von 40 % (V/V) Methanol erreicht war. Anschließend wurde der getrocknete Rohextrakt in 10 mL 40 % (V/V) Methanol suspendiert. Die Suspension wurde zentrifugiert (10 min, 5000 rpm, RT) und nur der Überstand auf die Säule aufgebracht. Mit 100 mL 40%-igem Methanol wurde diese Fraktion von der Säule eluiert. Der Rückstand wurde nochmal in der gleichen Menge 50 %-igem Methanol suspendiert und erneut zentrifugiert (10 min, 5000 rpm, RT). Dieses Vorgehen wurde mit 60 % -, 70 %-, 80 %-, 90 % -, und 100 %-igem Methanol wiederholt, bis sich der gesamten organische Extrakt gelöst hatte. Nachdem den gesamten Extrakt eluiert wurde, wurde die Säule mit 50 mL einer 1 %-igem Essigsäure-gesäuerte Mischung von Dichlormethan und Methanol (9:1 (V/V)) gewaschen. Anschließend wurde die Säule noch mit 100 mL 100 %-igem Methanol gewaschen. Die Fraktionen wurden getrennt aufgefangen und jeweils bis zur Trockne eingedampft und mittels HPLC/MS analysiert.
Präparative Dünnschichtchromatographie (DC) Eine weitere Aufreinigungsmethode der Naturstoffe ist die präparative Dünnschichtchromatographie. Dazu wurden die Proben in Methanol gelöst und mithilfe von gelben Spitzen auf Kieselgelplatten ADAMANT UV 254 (Tabelle 3.1) aufgetragen. Als Laufmittel wurde ein Gemisch aus Dichlormethan und Methanol (9:1 (V/V), 0,1 % Essigsäure) verwendet. Nach der vollständigen Verdampfung der aufgetragenen Proben wurden die Platten in den gesättigten DC-Kammern gestellt und über 12 cm Trennstrecke entwickelt. Nach abgeschlossener Entwicklung wurde der Fließmittel vollständig entfernt. Farbige Substanzen wurden visuell als Banden erfasst, während nicht farbige Substanzen unter UV- Lampe durch Floreszenz oder Fluoreszenzlöschung detektiert wurden. Die gewünschte Bande wurde mithilfe eines Skalpells aus den DC-Platten ausgekratzt und zwei- bis dreimal mit 5 mL Methanol
60
Material und Methoden extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde durch ein 0,45 µm-Filter filtriert und mittels HPLC/MS analysiert.
Präparative HPLC Um die für Strukturaufklärung benötigte Reinheit des Naturstoffs zu gewinnen, wurden die durch SPE und DC vorgereinigten Substanzen über die präparative HPLC aufgereinigt. Dazu wurde der aufzureinigende Extrakt in Methanol gelöst und über einen Rotilabo®-Spritzenfilter (0,45 µm, PVDF) filtriert, um große Partikel zu entfernen. Zur Aufreinigung wurde eine HPLC/MS-Anlage der Firma Agilent (siehe Tabelle 3.1) verwendet. Die Auftrennung der Naturstoffe erfolgte über ein Agilent Zorbax-C18-System bestehend aus einer Vorsäule (50 mm x 9,4 mm; Partikelgröße: 5 µm) und einer Hauptsäule (150 x 9,4 mm; Partikelgröße: 5 µm). Als Laufmittel wurden Acetonitril (Laufmittel A) und
H2Obidest (Laufmittel B), die jeweils mit 0,5 % Essigsäure versetzt wurden, verwendet. Zur Detektion wurde ein Diodenarray-Detektor eingesetzt. Die aufzureinigende Substanz wurde manuell aufgefangen und mithilfe eines Rotationsverdampfers bei einem sehr niedrigen Druck zur Trockene einrotiert. Im Folgenden sind die verwendeten Methoden zur Aufreinigung der Naturstoffe in tabellarischer Form beschrieben.
Aufreinigung von Susa-1 und Susa-2 Zur Aufreinigung von den Produkten Susa-1 und Susa-2 wurde die HPLC-Gradient-Methode Suzan3 verwendet. Die Verbindungen Susa-1 und Susa-2 wurden bei 14 min bzw. 12,3 min eluiert.
Tabelle 3.27 Isokratischer Gradient der HPLC-Methode Suzan3. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 30 70
9.00 30 70
9.10 95 5
14.00 95 5
14.10 30 70
20.00 30 70
Fluss: 2 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion: 274 nm (Benzoesäure) und 340 nm (Anthranilsäure)
61
Material und Methoden
Aufreinigung von 50-9-3 Zur Aufreinigung von 50-9-3 wurde die Methode Suzan5 verwendet. Die Verbindung Susa-3 wurde bei 12,5 min eluiert.
Tabelle 3.28 Isokratischer Gradient der HPLC-Methode Suzan5. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 25 75
15.00 25 75
15.10 95 5
17.00 95 5
17.10 25 75
23.00 25 75
Fluss: 2 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion: 254 und 280 nm
Aufreinigung von MK-1 Zur Aufreinigung von MK-1 wurde die Methode monika2 verwendet. Die Verbindung MK-1 Wurde bei 10,3 min eluiert
Tabelle 3.29 Isokratischer Gradient der HPLC-Methode monika2. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 25 75
13.00 25 75
Fluss: 2,5 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion: 254 und 279 nm
Sephadex-LH20-Säulenchromatographie Als abschließender Reinigungsschritt wurde die Sephadex LH20-Säulenchromatographie eingesetzt. Als Sorbens wurde SephadexTM LH 20 und als Elutionsmittel reines Methanol in HPLC-Qualität verwendet. Der aufzureinigende Extrakt wurde im 800 µL gelöst und möglichst konzentriert auf die Säule aufgetragen. Die Säule haben einen Innendurchmesser von 1,3 cm, eine Länge von 33 cm und ein Totvolumen von 13 mL, das zuvor mit Dextranblau ermittelt wurde. Die erhaltenen Fraktionen wurden gesammelt, anschließend spektrophotometrisch bei einem Wellenlängebereich von 200 bis 500 nm vermessen und vereinigt. Zuletzt wurde mittels HPLC/MS auf die Reinheit der aufgereinigten Substanz überprüft.
62
Material und Methoden
3.10.2 Analytik von Naturstoffen
Analytische HPLC Um die Zusammensetzung eines Rohextrakts mittels HPLC zu untersuchen, wurde eine HPLC-Anlage der Firma Waters (Tabelle 3.1) eingesetzt. Die präparartive HPLC-Anlage wurde mit einem Säulensystem bestehend aus ein XBridgeTM C18-Säule (3,9 x 20 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) als Vorsäule und eine XBridgeTM C18-Säule (4,6 x 100 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) als Hauptsäule betrieben. Die Bedienung des Systems und die Datenauswertung erfolgten über die Software „Empower® 2002 Waters Coporation“.
Der HPLC-Gradient sowie weitere Parameter der Methode H_Meth, die zur Analyse von Rohextrakten aus S. espanaensis-Wildtypverwendet wurde, sind in Tabelle 3.30 beschrieben
Tabelle 3.30 HPLC-Gradient der Methode H_Meth. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 20 80
3.00 20 80
20.00 95 5
23.00 95 5
25.10 20 80
30.00 20 80
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 30 °C; Detektion: 254 mn
Analytische HPLC/ESI-MS Zur Analyse von Naturstoffen mittels HPLC/ESI-MS wurde das Agilent 1100 System verwendet. Zur Auftrennung von Naturstoffen wurde ein Säulensystem bestehend aus einer XBridge TM C18- Vorsäule (20 mm x 4,6 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) und eine XBridge TM C18-Säule (100 mm x 4,6 mm; 3,5 µm) als Hauptsäule eingesetzt. Zur Untersuchung der Fucosyltransferase-Aktivität der verschiedenen Glycosyltransferasegene des Saccharomicin-Genclusters wurde eine Zorbax Eclipse XDB-C8 Säule (150 mm x 4,6 mm; Partikelgröße 5 µm) mit einer Zorbax XDB-C8 Vorsäule (12,5 mm x 4,6 mm; Partikelgröße) verwendet. Die Detektion erfolgte mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) und einem Quadropol Massendetektor (MSD). Die Analyten wurden mittels einer ESI-Quelle (Elektro-Spray Ionization) ionisiert. Die Parameter der Ionisationsquelle sind in Tabelle 3.31 aufgeführt. Die Steuerung der Anlage und die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe der Software LC/MSD ChemStation Rev. A.09.03. Zur Analyse von Fucosylierungsaktivität der verschiedenen Glycosyltransferasegene des sam-Genclusters wurden die Methoden sam1 (Tabelle 3.33) und Tina3 (Tabelle 3.35) eingesetzt. Die
63
Material und Methoden
Methode Tanja7 (Tabelle 3.34) wurde zur Analyse von Extrakten aus S. espanaensis-Wildtyp verwendet. Die Methode Tanja7 wurde auch zur Analyse von Extrakten aus S. espanaensis x pTESa- bldA eingesetzt. Zur Analyse von Rishirilide B und dessen Derivate wurde die Methode MENSO4R verwendet (Tabelle 3.33).
Tabelle 3.31 Parameter der ESI-Ionisationsquelle.
Parameter Einstellung
Drying gas flow 12 L/min
Drying gas temperature 350 °C
Nebulizer 50 psig
Cappillary voltage (Vcap positive) 3000 V
Cappillary voltage (Vcap negative) 3000 V
Methode MENSO4R
Tabelle 3.32 HPLC/ESI-MS-Gradient der Methode MENSO4R. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 20 80
6.00 20 80
7.00 30 70
25.00 95 5
28.10 95 5
30.00 20 80
35.00 20 80
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion: 254 (Ref. 400) und 400 nm (Ref. 600)
Methode sam1
Tabelle 3.33 HPLC/ESI-MS-Gradient der Methode sam1. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 10 90
3.00 10 90
9.00 30 70
12.00 50 50
18.00 95 5
64
Material und Methoden
20.00 95 5
22.00 10 90
32.00 10 90
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 28 °C; Detektion: 345 nm (Ref. 600 nm), 310 nm (Ref. 500), 279 nm (Ref. 500 nm), 250 nm (Ref. 400 nm)
Methode Tanja7
Tabelle 3.34 HPLC/ESI-MS-Gradient der Methode Tanja7. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0.00 5 95
3.00 5 95
27.00 95 5
32.00 95 5
32.10 5 95
38.00 5 95
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 27 °C; Detektion: 340 nm (Ref. 500 nm), 310 nm (Ref. 500), 400 nm (Ref. 600), 279 nm (Ref. 500 nm), 254 nm (Ref. 400 nm)
Methode Tina3
Tabelle 3.35 HPLC/ESI-MS-Gradient der Methode Tina3. A ist Acitonitril und B ist H2O.
Zeit [min] Laufmittel A [%] Laufmittel B [%]
0 80 20
9 67 33
16 50 50
20 30 70
24 5 95
29 5 95
30 80 20
35 80 20 Detektion: 254 nm (Ref. 360 nm), 480 nm (Ref. 800), 360 nm (Ref. 580 nm), 430 nm (Ref. 600 nm), 550 nm (Ref. 700 nm)
65
Material und Methoden
Strukturaufklärung mittels NMR Zur Sturkturaufklärung der im Rahmen dieser Arbeit aufgereinigten Substanzen wurde NMR-Analyse (nuclear magnetic resonance) von Dr. Thomas Paululat an der Universität Siegen durchgeführt. Die Spektren wurden mit einer Bruker AV 400 bzw. Varian VNMR-S600 MHz Spektrometer gemessen. Neben 1D-NMR-Experimenten wie 1H- und 13C-NMR wurden auch die folgenden 2D-NMR- Experimente durchgeführt: 1H/1H-COSY (correlation spectroscopy), 1H/13C-HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) und ROESY (rotating frame nuclear Overhauser effect spectroscopy). Zur Strukturaufklärung des Sekundärmetabolits JW-1 wurden zusätzlich eine hochauflösende Massenanalyse (Orbitrap) in Saarbrücken und ein Wasserstoff-Deuterium-Austausch durchgeführt. Die NMR-Experimente, die zur Strukturaufklärung der verschiedenen aufgereinigten Produkte durchgeführt wurden, sind in Tabelle 3.36 angegeben. Chemische Verschiebungen wurden auf das verwendete Lösungsmittel bezogen.
Tabelle 3.36 durchgeführte NMR-Experimente.
Naturstoff Lösungsmittel NMR-Experimente
1H, 13C, 1H/1H-COSY, Anthranilsäure CD OD 3 1H/13C-HMBC
1 13 1 13 Benzoesäure CD3OD H, C, H/ C-HMBC
1H, 13C, 1H/1H-COSY, Phenylessigsäure DMSO-d 6 1H/13C-HMBC
1H, 13C, 1H/1H-COSY, Indole-3-Carbonsäure Aceton-d 6 1H/13C-HMBC
1H, 13C, 1H/1H-COSY, JW1 DMSO-d 6 1H/13C-HMBC, ROESY
Agardiffusionstest Das Prinzip des Agardiffusionstest-Verfahrens beruht auf der Diffusion einer antimikrobiell wirksamen Substanz aus einem Filterpapierplättchen in einen festen Nährboden, der mit einer Keimsuspension beimpft ist. Die Auswertung erfolgt durch die Entstehung einer sichtbaren Inhibitionszone (Hemmhof) des Keimwachstums. Zur Durchführung des Tests wurden 2 x 15 µL einer zu untersuchenden Substanz, die in Methanol gelöst ist, unter sterilen Bedingungen auf 6 mm Filterpapierplättchen (Tabelle 3.4) aufgetragen, getrocknet und mit Hilfe einer abgeflammten Pinzette auf eine Agarplatte gelegt, die mit Testkeim überschichtet (siehe 3.8.3). Als Positivkontrolle wurden 5 µL Apramycin [100 mg/mL] (für antibakterielle Aktivität) bzw. 15 µL Nystatin [5 mg/mL] (für antimykotische Aktivität) eingesetzt. Als Negativkontrolle diente reines Methanol. Die Inkubationsdauer sowie die Temperatur wurden an den jeweiligen verwendeten Testkeimen angepasst (siehe 3.8.3). Die Hemmhöfe wurden visuell erfasst und ausgemessen.
66
Material und Methoden
Analyse von Reportergen-Testsystem GUS Das Prinzip dieses Reportergen-Testsystems beruht auf der Fusion eines Promotorbereichs mit dem Reportergen gusA in einen Testvektor. Das Gen gusA kodiert für das Enzym β-D-Glucuronidase und wurde ursprünglich aus dem E. coli Stamm K-12 isoliert. β-Glucuronidase ist in der Lage verschiedene β-Glucuronide zu hydrolysieren, wodurch es als Reportergen verwendet wurde. X-Gluc (Cyclohexylammoniumsalz der 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronsäure) und p-Nitrophenyl-β- D-Glucuronid wurden als GUS-Substraten für die qualitative bzw. quantitative Analyse verwendet.
3.12.1 X-Gluc-Test zur qualitativen Analyse der GUS-Aktivität auf Agarplatten Die von dem Reportergen gusA kodierte β-D-Glucuronidase hydrolysiert das Substrat X-Gluc zu 5- Brom-4-chlor-indoxyl, welches nach der Oxidation an der Luft und der Dimerisierung den tiefblauen Indigo-Farbstoff 5,5-dibrom-4,4-dichlor-Indigo bildet. Aufgrund der Entstehung eines blauen Farbstoffs wurde diese Reaktion für eine qualitative Analyse der GUS-Aktivität in Actinomyceten auf Agarplatten verwendet. Hierzu wurden die zu testenden Kolonien auf TSB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika aufgetragen und für 48 h bei 28 °C inkubiert. Anschließend wurden 60 µL von X-Gluc (100 mM in DMF) mit 1 mL sterilem H2Obidest gemischt, auf die Platten aufgetragen und erneut bei 28 °C für 6 h inkubiert. Die Entwicklung der Blaufärbung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten beurteilt.
3.12.2 GUS-Assay zur quantitativen Analyse der GUS-Aktivität Für die quantitative Messung der GusA-Aktivität wurde p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronid als GUS- Substrat eingesetzt. Hierfür wurden 50 mL Antibiotikahaltige-TSB, GYM oder SPY-Flüssigmedium mit 1 mL Vorkultur (3.8.2.1) angeimpft und bei 28 °C, 180 rpm für 42 h inkubiert. Anschließend wurden von den 50 mL-Kulturen 10 mL in vorgewogene 15 mL-Zentrifugenfalkons überführt und abzentrifugiert. Das Pellet wurde im 60 °C-Schrank für 48 h getrocknet und die Trockenmasse bestimmt. Weiterhin wurden 30 mL-Kultur abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, RT) und das Pellet wurde in 10 mL Wasser gewaschen. Nach Zugabe von 10 mL GUS-Assay Puffer 1 (Insgesamt 45 mL Lysat) wurde viermal invertiert und anschließend abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, 4 °C). Danach wird ein Aufschluss der Zellen mit Hilfe der French Press durchgeführt. Nach dem Zentrifugation wurde 1 mL vom Überstand in ein Eppendorfgefäß übergeführt und auf Eis gelagert. 500 µL von diesem Lysat mit 500 µL GUS-Assay Puffer 3 wurden in einer Einmalküvette gemischt und sofort im Spektrophotometer für 30 min mit einem Intervall von einer Minute vermessen. Als Referenz wurden 0,5 mL der Probe mit 0,5 mL des Puffers 1 verwendet. Die Promotoraktivität wurde über die Enzymaktivität des Reporterproteins ermittelt. Die gemessenen Absorptionswerte wurden notiert und folgendermaßen ausgewertet. Die Promotorstärke wurde aus der erhaltenen Kurve berechnet, wenn der Kurvenverlauf sigmoidal war. Dazu wurde aus Steigungswerten in der linearen Phase (pro Minute) ein Durchschnitt gebildet, der die Absorptionsveränderung in einer Minute der linearen Phase angegeben hat (A415/min). Die Aktivität von β-D-Glucuronidase-Enzym wurde in Units (U) gemessen. Eine Unit ist die Menge an 67
Material und Methoden
Enzym, die ein µmol Substrat pro Minute konvertieren kann und wird wie bei T. Siegel in ihrer Dissertation gezeigt berechnet [176]. Die folgende Gleichung wurde in dieser Arbeit vewendet.
20 x A415/min U/g = 14 x 3 x W10 ml
W10 mL ist die Trockenmasse (in g).
Proteinpräparation und Analytik
3.13.1 Heterologe Proteinsynthese in E. coli Die Synthese der Proteine AN2851 und AN6818 erfolgte im Stamm E. coli BL21 (DE3) x pLys mit den Expressionskonstrukte pET22b(+) x AN07554 und pET22b(+) x AN2851. Es wurde eine Vorkultur in 10 mL LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/mL) und Glucose (0,2 % (m/V)) mit 300 µL einer Dauerkultur angeimpft. Nach der Kultivierung für 16 h bei 37 °C im Schüttelturm bei 180 rpm wurden je 2 mL einer Hauptkultur zum Beimpfen verwendet. Für die Hauptkultur wurden je 100 mL LB- Medium mit Ampicillin (50 mg/mL) in einem 300 mL-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen wurden bis zu einer OD600 von 0,6 bei 28 °C im Schüttelturm bei 180 rpm (ca. 2-2,5 h) inkubiert. Nach der Zugabe von unterschiedlicher IPTG-Konzentrationen (0,1-1,0 mM) wurden die Kulturen für 6 h bei 28 °C, 140 rpm inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (7000 rpm, 10 min, 4 °C) geerntet. Das Pellet wurde zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
3.13.2 Zellaufschluss für Proteinreinigung Das tiefgefrorene Zellpellet wurde auf Eis aufgetaut, in der vierfachen Menge Lysepuffer resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in einer eisgekühlten French Press mit einem Volumen von 35 mL dreimal bei einem Druck von maximal 900 psi aufgeschlossen, bis zu einer homogenen Konsistenz. 10 μL DNase wurden zu der Suspension zugegeben. Nach 20-minütiger- Inkubation wurden die unlösliche Zellbestandteile durch zweimalige Zentrifugation (10000 rpm, 30 min, 4 °C) abgetrennt. Der Überstand wurde in ein neues Zentrifugationsfalkon übergeführt und bei 4 °C für unmittelbare weitere Verwendung oder bei -20 °C (in 20 % Glycerol) für spätere Verwendung gelagert.
3.13.3 Ni2+-Affinitätschromatographie Das Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie-System besteht aus Ni2+-Nitrilotriessigsäure (NTA) und Polyhistidinen. NTA, welches an Agarose fixiert ist, bildet mit mehrwertigen Metallionen wie beispielsweise Ni2+ einen stabilen Komplex und dient als stationäre Phase der Affinitätschromatographie [177]. Ein Protein mit C- oder N-Terminal angehängten Hexahistidinen kann an die Ni2+-Ionen binden und so auf der Säule zurückgehalten werden [178]. Hierdurch findet eine Abtrennung unerwünschter Proteine statt. Durch Zugabe von Imidazol in niedriger Konzentration zum Lysepuffer sowie mehrstufige Erhöhung der Imidazolkonzentration in den Waschpuffern können schwächer gebundene 68
Material und Methoden
Verunreinigungen entfernt werden. Abschließend wird das mit größter Affinität gebundene Protein durch eine hohe Imidazolkonzentration von üblicherweise 150-300 mM eluiert.
Hierfür wurde das Zellpellet von 100-300 mL Kultur in 8 mL Puffer A (10 mM Imidazol) gewaschen, auf vier Eppendorfgefäße verteilt und zentrifugiert (14000 rpm, 10 min, 4 °C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in Puffer A resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden vereinigt, mit Lysozym versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert (siehe 3.13.2). Anschließend wurde das Zelllysat wieder auf vier Eppendorfgefäße verteilt und zentrifugiert (14000 rpm, 15 min 4 °C). Der Überstand wurde mit 1 mL Ni2+-NTA-Harz versetzt und für 60 min auf Eis gerührt. Nach der Inkubation wurde die Suspension in eine PD-10-Leersäule mit Fritte gegeben und nach dem Absetzen des Säulenmaterials wurde der Durchfluss (DF) gesammelt. Es wurde zweimal mit je 4 mL Waschpuffer (40 mM Imidazol) gewaschen (W1 und W2) und das Protein abschließend viermal mit je 0,5 mL Elutionspuffer (250 mM Imidazol) eluiert (E1 - E4). Alle Fraktionen wurden separat gesammelt. Jeweils 8 μL wurden mit derselben Menge an SDS-Ladepuffer gemischt und per SDS-PAGE (siehe 3.13.4.1) analysiert. Das Ni2+-NTA-Harz wurde im Anschluss für 30 min mit 0,5 M NaOH-Lösung gewaschen und in 1 mL 30 %-igem Ethanol aufgenommen. Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis mit vorgekühlten Lösungen und Geräten durchgeführt.
3.13.4 Proteinanalytik
Diskontinuierliche Sodiumdodecyl-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) von Proteinen Die SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) wird zur Auftrennung von Proteinen im elektrischen Feld nach ihrer Molekülgröße verwendet [179]. Die Zusammensetzung des Gels sowie der verwendeten Puffer und Lösungen ist in Tabelle 3.15 aufgeführt. Zur Durchführung der Analyse wurden die Proben 1:1 mit 2 x SDS-Ladepuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C gekocht. 12- 20 µL der Proben wurden in die Probenkammern der SDS-PAGE aufgetragen und durch Anlegen einer Spannung von 150 V, bis das Bromphenolblau des Ladepuffers den unteren Rand des Gels erreicht hatte. Die Gele wurden anschließend mit heißen Coomassieblau-Färbelösung für 60 min im RT gefärbt. Mit Hilfe der Entfärbelösung wurde die überschüssige Farbe entfernt.
69
Material und Methoden
70
Ergebnisse
4 Ergebnisse
71
Ergebnisse
Identifizierung eines Fucosyltransferase-Gens im Saccharomicin- Gencluster Die Saccharomicine A und B wurden aus Kulturen von S. espanaensis isoliert und die Strukturen von Kong et al. aufgeklärt [24]. Die beiden Heptadecaglykosid-Antibiotika besitzen eine einzigartige Struktur, welche aus 17 O-glycosidisch miteinander verknüpften Desoxyhexose-Einheiten und einem N-(m,p-Dihydroxycinnamoyl)-Taurin-Aglykon zusammengesetzt ist. Die Zuckerkette enthält fünf verschiedene Zucker-Einheiten, die mehrmals in der Struktur vorkommen (siehe Abbildung 2.4). Darunter D-Fucose, die fünfmal vorkommt und in sulfonierter Form als erster Baustein der Zuckerkette mit dem Aglykon verknüpft ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um die Fucosyltransferase, die die Verknüpfung zwischen sulfonierter D-Fucose und dem Aglykon katalysiert, zu identifizieren. Das sam-Cluster enthält zehn Gene, die für putative GTs kodieren. Mehrere GTs aus diesem Cluster könnten die Übertragung der D-Fucose-Einheiten auf die verschiedenen Akzeptoren während der Saccharomicin-Biosynthese katalysieren (siehe Tabelle 2.1). Eine GT sollte für die Fucosylierung des Kaffeesäure-Aglykons verantwortlich sein. Da die Saccharomicine nicht mehr unter Laborbedingungen produziert wurden, erfolgte die Identifizierung des Fucosyltransferasegens durch heterologen Expressionsexperimente und nicht durch Inaktivierungsexperimente. Das heterologe Testsystem zur Charakterisierung von Saccharomicin-Biosynthesegenen, wurde von M. Berner und T. Strobel etabliert, die die Biosynthese des Aglykons untersucht haben. M. Berner stellte einen hypothetischen Biosyntheseweg des Aglykons auf und konnte durch heterologe Expression in Streptomyces fradiae XKS die Kaffeesäure-Biosynthesegene identifizieren [180]. T. Strobel konnte durch Genom-Sequenzanalyse und heterologe Expressionsexperimente in S. albus den von M. Berner postulierten Syntheseweg bestätigen [35]. In dieser Arbeit wurde der Stamm S. albus als heterologer Wirtstamm eingesetzt. Da S. albus nicht in der Lage ist, sowohl D- als auch L- Fucose zu produzieren, wurden putative Fucose-Biosynthesegene in einen integrativen Vektor kloniert und mittels intergenerischer Konjugation in S. albus eingebracht. Des Weiteren wurden gleichzeitig die einzelnen GT-Gene aus dem sam-Cluster in dem Wirt S. albus heterolog exprimiert. Die erhaltenen Mutanten wurden jeweils mit Kaffeesäure gefüttert, für sieben Tage kultiviert und anschließend extrahiert. Kaffeesäure wurde zur Fütterung verwendet, weil sie ein Teil des Aglykons und mit D-Fucose verknüpft ist. Eine mögliche Fucosylierung der Kaffeesäure wurde mittels HPLC/MS anhand der UV- und MS- Spektren untersucht. Im Folgenden ist eine genaue Beschreibung des Ablaufs der Expressionsexperimente dargestellt.
4.1.1 Heterologe Expression von D-Fucose-Biosynthesegenen Fucose ist eine Desoxyhexose und in ihrer D-Konfiguration ein Bestandteil der Saccharomicine. In A. actinomycetemcomitans Y4 wurde die D-Fucose-Biosynthese bereits untersucht und gezeigt, dass die D-Fucose mithilfe dreier Enzyme aus D-Glucose-1-Phosphat synthetisiert wird [37]. Diese Enzyme werden von den Genen rmlA, rmlB und fcd kodiert. Die Gene oleS und oleE aus Streptomyces
72
Ergebnisse antibioticus, die im Rahmen dieser Arbeit als fuc1 und fuc2 bzw. fuc1,2 bezeichnet werden, kodieren für die ersten beiden Enzyme der D-Fucose-Biosynthese. Sie wurden aus der L-Rhamnose-Biosynthese- Kassette des Plasmids pTOS-Rham gewonnen. Da bisher in keinem anderen Organismus ein Gen identifiziert werden konnte, welches für ein Protein kodiert, das eine Sequenzhomologie zu Fcd aus A. actinomycetemcomitans Y4 aufweist, wurde die Sequenz des fcd von der Firma Eurofins® für S. albus optimiert, umgeschrieben und synthetisiert. Das fcd Gen wurde wie unter 3.9.11.4.3 beschrieben zusammen mit den Genen fuc1 und fuc2 in den integrativen Vektor pTESa ligiert.
Die Sequenzanalyse des sam-Clusters zeigte, dass die Gene sam21 und sam22 für Ketoreduktasen kodieren könnten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eines dieser Gene die letzte Reaktion der D-Fucose-Biosynthese katalysieren könnte. Die beiden Gene wurden jeweils mit den Genen fuc1 und fuc2 wie unter 3.9.11.4.2 beschrieben ebenfalls in den integrativen Vektor pTESa ligiert. Anschließend wurden die drei verschiedenen Konstrukte mit den putativen D-Fucose-Biosynthesegenen jeweils mittels intergenerischer Konjugation in den Wirt S. albus eingebracht. Da das Plasmid pTESa ein Apramycinresistenzgen trägt, erfolgte die Selektion der Exkonjuganden auf apramycinhaltigen Agarplatten. Die Exkonjuganden wurden nach fünftägiger Inkubation bei 28 °C erhalten. Mittels PCR wurde die erfolgreiche Integration der einzelnen Plasmide in den Wirtstamm überprüft. Hierzu wurde die aus den Exkonjuganden isolierte genomische DNA als Template verwendet. Weiterhin wurden dieselben Primer und PCR-Bedingungen die zur Amplifizierung von fcd, sam21, und sam22 verwendet wurden, eingesetzt. Bei allen überprüften Exkonjuganden konnte eine erfolgreiche Integration des Plasmids bestätigt werden. Die Expressionsmutanten wurden als S. albus x pTESa x fuc1,2-fcd, S. albus x pTESa x fuc1,2-sam21, und S. albus x pTESa x fuc1,2-sam22 bezeichnet. Diese Mutanten wurden dann weiter für die Expression der GTs-Gene aus dem sam-Cluster verwendet.
4.1.2 Heterologe Expression von L-Fucose-Biosynthesegenen Zusätzlich zur Untersuchung der GTs hinsichtlich ihrer Aktivität D-Fucose zu übertragen, wurde auch deren Fähigkeit, L-Fucose als Substrat zu verwenden, überprüft. Die Biosynthese von L-Fucose wurde für verschiedene Mikroorganismen beschrieben. Die daran beteiligten Gene sind bereits identifiziert. Für Bakterien, Mammalia und Pflanzen wurde gezeigt, dass GDP-L-Mannose ein Substrat zur Biosynthese von L-Fucose ist, wobei die beiden Enzyme Gmd und WcaG für die Katalyse der entsprechenden Reaktionen verantwortlich sind [47], [48], [181]. Weiterhin wird GDP-Mannose aus Glucose-6-Phosphat über fünf Reaktionsschritte synthetisiert. Daran beteiligt sind die Enzyme ManA, ManB, ManC und GDP-Mannose-Pyrophosphorylase. Eine BLASTp-Analyse erbrachte, dass S. albus alle Gene besitzt, die für die Produktion von L-Fucose nötig sind, mit Ausnahme des letzten Gens wcaG. Ein Sequenzvergleich von WcaG mit Genomen von bereits sequenzierten Actinomyceten-Stämmen ergab, dass WcaG eine sehr geringe Homologie nur zu Enzymen aus Streptomyces hygroscopicus aufweist. Deshalb wurde das Gen wcaG aus E. coli K12 von der Firma Genscript® für Streptomyceten optimiert, synthetisiert und als wcaGa bezeichnet. Nach der Klonierung des Gens wcaGa unter
73
Ergebnisse
Kontrolle des ermE*-Promotors in den integrativen Vektor pTOS, welcher ein Apramycinresistenzgen trägt (siehe 3.9.11.3), wurde das erhaltene Konstrukt pTOS-wcaGa über intergenerische Konjugation (3.8.8) in den Wirtstamm S. albus eingebracht. Durch PCR konnte bestätigt werden, dass die apramycinresistenten erhaltenen Exkonjuganden das Gen wcaGa enthalten. Da das Plasmid pTOS auf dem VWB-Phagenintegrationssystem basiert, wurde bei den Exkonjuganden S. albus x pTOS-wcaGa das gesamte Plasmid ins Genom integriert. Des Weiteren besitzt das Plasmid pTOS zwei rox-sites, die als Erkennungssequenz für die Dre-Rekombinase dienen. Dadurch ist es möglich, das Plasmidbackbone aus dem Genom wieder zu entfernen. Hierzu wurde die Mutante S. albus x pTOS-wcaGa (S. albus L- fuc) mit dem Plasmid pUWL-Dre, das das Gen für die Dre-Rekombinase trägt, konjugiert. Im Genom bleiben lediglich eine Rekombinase-Erkennungssequenz und das Gen wcaGa unter Kontrolle des ermE*-Promotors zurück. Mittels PCR konnte nachgewiesen werden, dass das Gen wcaGa im Genom vorhanden, das Apramycinresistenzgen aber nicht mehr zu detektieren ist. Die erhaltene Expressionsmutante, die nicht mehr Apramycinresistent ist, wurde S. albus-wcaGa genannt und sollte in der Lage sein, L-Fucose zu produzieren. Die zehn GT-Gene aus dem sam-Cluster wurden schließlich jeweils in diesem Stamm exprimiert.
4.1.3 Expression der Glycosyltransferase-Gene in den verschiedenen Streptomyces albus Mutanten Das Saccharomicin-Gencluster enthält zehn putative GT-Gene, sam11, sam12, sam13, sam14, sam15, sam16, sam17, sam18, sam19 und sam20, die wahrscheinlich für die Übertragung von insgesamt 17 Desoxyhexose-Einheiten verantwortlich sind. Die Übertragung der D-Fucose auf das Aglykon sollte also durch eine dieser zehn Glycosyltransferasen katalysiert werden. Um diese Fucosyltransferase zu identifizieren, wurden alle zehn G GT-Gene aus dem sam-Cluster auf ihre Fucosyltransferase-Aktivität untersucht. Dafür wurden die Glycosyltransferasegene einzeln in den replikativen Vektor pUWL-H unter Kontrolle des ermE up-Promotors kloniert (siehe 3.9.11.5). Anschließend wurden die erhaltenen Plasmide jeweils in die unter 4.1.1 und 4.1.2 beschriebenen S. albus Mutanten, die die Fucose- Biosynthesekasette enthalten, durch intergenerische Konjugation eingebracht. Da das Plasmid pUWL- H ein Hygromycinresistenzgen enthält, erfolgte die Selektion der Exkonjuganden auf apramycin- und hygromycinhaltigen, bzw. nur hygromycinhaltigen Agarplatten (siehe 3.9.11.3 und 4.1.2). Insgesamt wurden 40 verschiedene Expressionsmutanten erhalten.
4.1.4 Aktivitätsanalyse der Saccharomicin-Glycosyltransferasegene 40 Mutanten wurden untersucht. Jede Mutante enthält die Biosynthesegene für D-Fucose bzw. L-Fucose und zusätzlich eine der Saccharomicin GTs. Die Mutanten wurden jeweils in 100 mL HA und/oder in 100 mL NL111-Medium bei 28 °C kultiviert. Jede Kultur wurde in den ersten beiden Inkubationstagen zweimal täglich mit je 25 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) gefüttert. Nach siebentägiger Kultivierung wurden die Kulturen jeweils aufgeteilt. Je eine Hälfte wurde mit 1 N HCl auf pH 3,5 eingestellt, die andere auf pH 7. Daraufhin wurden die Kulturen wie unter 3.10.1.1 beschrieben 74
Ergebnisse extrahiert und mittels HPLC/MS mit der Methoden sam1 und Tina3 (siehe 3.10.2.2.2) analysiert. Als Negativkontrolle wurden die entsprechenden S. albus Mutanten, die kein GT-Gen enthalten, verwendet. Als Referenz wurde reine Kaffeesäure, welche im HPLC-Chromatogramm bei einer Retentionszeit von 10,5 min erscheint, verwendet. Das UV-Spektrum von Kaffeesäure (siehe Abbildung 4.1-A) zeigt hauptsächlich drei isosbestische Punkte bei 225, 294 und 319 nm, welche von der Konzentration der Kaffeesäure sowie dem verwendeten Lösungsmittel abhängig sind [182]. Die Molmasse der Kaffeesäure beträgt 180 g/mol. Im Massenspektrum sind im negativen Modus die typischen zwei Signale zu erkennen, eines bei m/z=179 (entspricht der deprotonierten Kaffeesäure) und eines bei m/z=135 m/z (entspricht Kaffeesäure nach Abspaltung von Kohlendioxid) (siehe Abbildung 4.1-B) [183].
Abbildung 4.1 Das UV-Spektrum (A), sowie das MS-Spektrum im negativen Modus (B) von Kaffeesäure. Im MS- Spektrum sind die typischen Signale der Kaffeesäure bei 135,2 und 179,2 zu erkennen.
Wird Kaffeesäure mit D-Fucose verknüpft, sollte dies sowohl die Retentionszeit als auch das UV- Spektrum der Kaffeesäure beeinflussen. Bei der HPLC-Analyse der Kaffeesäure wurde ein Fließmittelgradient mit abnehmender Wasseranteil verwendet, weshalb hydrophilere Substanzen früher detektiert werden sollten. Aus diesem Grund wurde erwartet, dass fucosylierte Kaffeesäure eine kürzere Retentionszeit besitzt als reine Kaffeesäure. Weiterhin besitzt Fucose eine molare Masse von 164 g/mol, sodass im Fall der Fucosylierung der Kaffeesäure ein Signal bei m/z=326, gemessen im negativen Modus, auftreten sollte.
Nachfolgend sind die Ergebnisse der HPLC/MS-Analyse der Fütterungsexperimente der verschiedenen Expressionsmutanten aufgeführt.
Produktionsanalyse der Rohextrakte von Streptomyces albus x pTESa x fuc1,2- fcd x pUWL-H-GTs Die Produktionsanalyse aller Mutanten erfolgte mittels HPCL/MS. In die Mutante S. albus x pTESa x fuc1,2-fcd, welche in der Lage sein soll, D-Fucose zu synthetisieren, wurden die zehn GT-Gene sam11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 aus dem sam-Cluster erfolgreich eingebracht. Die dadurch erhaltenen Mutanten wurden wie oben beschrieben in HA- und in NL111-Medium kultiviert und mit Kaffeesäure gefüttert. Die Extraktion der jeweiligen Kulturen erfolgte bei zwei
75
Ergebnisse verschiedenen pH-Werten. Es wurden insgesamt 40 verschiedene Rohextrakten, die über HPLC/MS analysiert.
In den HPLC-Chromatogrammen der Extrakte bei pH 7 wurden keine neuen Peaks detektiert. Die Peaks in den Chromatogrammen der Extrakte bei pH 4 sind bei Verwendung des NL111-Mediums besser zu erkennen als bei Verwendung des HA-Mediums, aufgrund des Mediumsrauschens. Deshalb werden nur die Ergebnisse der Analyse der NL111-Kulturen nach Extraktion bei pH 4 gezeigt. In Abbildung 4.2 sind die erhaltenen Chromatogramme der Extrakte aller 10 Mutanten dargestellt. Hier wurde die Methode sam1 verwendet. Als Negativkontrolle wurde der Extrakt von S. albus x pTESa x fuc1,2-fcd verwendet. Bei Betrachtung dieser Chromatogramme fällt ein neuer Peak bei 8,6 min bei der Mutante S. albus x pTESa x fuc1,2-fcd x pUWL-H-sam17 auf. Das UV-Spektrum des neuen Peaks ähnelt der von Kaffeesäure. Das entsprechende Massenspektrum zeigt im negativen Modus unter anderem ein Signal mit m/z von 326 [M-H]-. In Abbildung 4.3 sind die zu diesem Peak gehörenden UV- und MS- Spektren dargestellt. Der Peak bei 10,4 min, der bei allen Extrakten auftritt, entspricht Kaffeesäure.
Abbildung 4.2 HPLC-Chromatogramme (λ = 310 nm) der Extrakte von (a) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd (Negativkontrolle) (b) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam11, (c) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam12, (d) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam13, (e) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam14, (f) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam15, (g) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam16, (h) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam17, (i) S. albus x pTESa-fuc1,2- fcd x sam18, (j) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam19 und (k) S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam20. Alle Mutanten wurden in NL111-Medium kultiviert und mit 100 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) gefüttert. Der Peak bei 10,4 min entspricht Kaffeesäure (hellrot). Hellgrün markiert ist der neue Peak bei 8,6 min in der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam17 (h).
76
Ergebnisse
Das Auftreten des neuen Peaks bei 8,6 min konnte durch dreimalige Wiederholung mit zwei verschiedenen Exkonjuganden der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam17 reproduziert werden. Eine Reproduktion des Peaks nach Kultivierung der Mutante in großem Maßstab, im Sinne von Aufreinigung und Strukturaufklärung der neu gebildeten Substanz, warallerdings nicht mehr möglich. Verschieden Exkonjuganden der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam17 wurden auch gescreent auf die Produktion des neuen Peaks, waren jedoch alle Versuche nicht erfolgreich. Folglich konnten keine endgültigen Nachweise der Fucosyltransferase-Aktivität von Sam17 erbracht werden.
Abbildung 4.3 UV-Spektrum (a) und das MS-Spektrum im negativen Modus (B) des Peaks bei 8,8 min aus Extrakten der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x sam17.
Produktionsanalyse der Rohextrakte von Streptomyces albus x pTESa x fuc1,2- sam21 x pUWL-H-GTs Nach Erstellung von S. albus x pTESa x fuc1,2-sam21 wurden alle zehn GT-Gene einzeln aus dem sam- Cluster in dieser Mutante eingebracht. Die resultierenden 10 Mutanten sowie der S. albus x pTESa x fuc1,2-sam21-Stamm wurden in NL111-Medium kultiviert und mit 100 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) gefüttert. Die Produktionsanalyse erfolgte nach Extraktion bei pH 4 mittels HPLC/MS. Hier wurde die Methode sam1 verwendet. In Abbildung 4.4 sind die erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Die Analyse der Chromatogramme erbrachte, dass in den Extrakten der untersuchten Mutanten keine zusätzlichen Produkte detektiert wurden. Nur der Peak von Kaffeesäure bei 10,4 min ist in allen Chromatogrammen zu erkennen. Da die Fucosylierung der Kaffeesäure zu einer Erhöhung der Hydrophilie führen sollte, wurden die kleinen Peaks, die vor dem Kaffeesäure-Peak auftreten, mit Hilfe von UV-und MS-Spektren genau analysiert. Es wurde bestätigt, dass alle diese Peaks auch bei der Negativkontrolle zu finden sind. Dasselbe gilt für die Peaks, die bei einer Retentionszeit >10,4 min auftreten.
77
Ergebnisse
Abbildung 4.4 HPLC-Chromatogramme (λ = 310 nm) der Rohextrakte von (a) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21, (b) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam11, (c) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21x pUWL-H-sam12; (d) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam13, (e) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam14, (f) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam15, (g) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam16, (h) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam21 x pUWL-H-sam17, (i) S. albus fuc-sam21 x pUWL-H-sam18; (j) S. albus fuc- sam21 x pUWL-H-sam19; (k) S. albus fuc-sam21 x pUWL-H-sam20. Alle Mutanten wurden in NL111-Medium kultiviert und mit 100 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) gefüttert. Der Peak bei 10,4 min entspricht Kaffeesäure (hellrot). Im Vergleich zur Negativkontrolle sind keine neuen Peaks in den Mutanten zu erkennen.
Produktionsanalyse der Rohextrakte von Streptomyces albus x pTESa x fuc1,2- sam22 x pUWL-H-GTs Das Genprodukt von sam22 zeigt Homologie zu Aldo/Keto-Reduktasen aus anderen Actinomyceten [35]. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die mögliche Beteiligung dieses Gens am letzten Schritt der Biosynthese der D-Fucose untersucht, indem das Gen zusammen mit fuc1 und fuc2 in den pTESa-Vektor ligiert und in S. albus eingebracht wurde. Mittels intergenerischer Konjugation konnten alle zehn GT- Gene aus dem sam-Cluster in S. albus x pTESa x fuc1,2-sam22 erfolgreich eingebracht werden. Die erhaltenen 10 Mutanten wurden in NL111-Medium kultiviert und mit Kaffeesäure gefüttert. Die Produktionsanalyse der bei pH 4 erhaltenen Extrakte wurde mittels HPLC/MS durchgeführt. Hier wurde die Methode sam1 verwendet. Als Negativkontrolle wurde der Rohextrakt von S. albus x pTESa x fuc1,2-sam22 verwendet. In Abbildung 4.5 sind die HPLC-Chromatogramme dargestellt. Neben dem Peak von Kaffeesäure bei 10,4 min ist ein neuer Peak bei 8,8 min in der Mutante 78
Ergebnisse
S. albus x pTESa x fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam17 (Chromatogramm (h)) zu erkennen. Das UV- Spektrum dieses Peaks ist ähnlich dem von Kaffeesäure. Im negativen Modus des Massenspektrums sind zusätzlich zum Kaffeesäure-Signal ein Signal mit m/z von 326,3, sowie weitere Signale zu detektieren (siehe Abbildung 4.6).
Abbildung 4.5 HPLC-Chromatogramme (λ = 310 nm) der der Rohextrakte von (a) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22, (b) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam11, (c) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22x pUWL-H-sam12; (d) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam13, (e) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam14, (f) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam15, (g) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam16, (h) S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam17, (i) S. albus fuc-sam22 x pUWL-H-sam18; (j) S. albus fuc- sam22 x pUWL-H-sam19; (k) S. albus fuc-sam22 x pUWL-H-sam20. Alle Mutanten wurden in NL111-Medium kultiviert und mit 100 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) gefüttert. Der Peak bei 10,4 min entspricht Kaffeesäure (hellrot). Hellgrau hinterlegt ist ein neuer Peak, der nur bei der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x sam17 auftritt. Die UV- und MS-Spektren von diesem neuen Peak sind in Abbildung 4.6 dargestellt
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Ergebnisse
Abbildung 4.6 UV-Spektrum des Peaks bei 8,8 min, neuen Peak in der Mutante S. albus x pTESa-fuc1,2- sam22 x sam17 (blau) im Vergleich zu dem UV-Spektrum von Kaffeesäure (rot) (A). Vergleich zwischen den Massenspektren von Kaffeesäure (B) und des Peaks bei 8,8 min(c).
Die Masse von D-Fucose liegt bei 164 g/mol und die Masse von Kaffeesäure beträgt 180 g/mol. Deshalb könnte das Signal mit m/z=326 die fucosylierten Kaffeesäure sein, indem ein H2O-Molekül bei der Fucosylierung abgespalten wurde. Die Ergebnisse der Produktionsanalyse dieser Mutante waren bei Wiederholung reproduzierbar. Deshalb wurde postuliert, dass Sam17 für die Fucosylierung der Kaffeesäure während der Saccharomicin-Biosynthese verantwortlich und Sam22 an der Synthese von D-Fucose beteiligt ist. Um diese Aussage zu bestätigen, sollte eine Aufreinigung des neuen Peaks und eine Struktur-Analyse durchgeführt werden. Die Reproduktion dieses Peaks bei Anzucht der Mutante in großem Maßstab war jedoch nicht möglich.
Neben Kaffeesäure wurden als weitere Substrate Kaffeesäureethylester und Kaffeesäurephenethylester zur Fütterung der Expressionsmutanten S. albus x pTESa-fuc1,2-sam22 x pUWL-H-sam17 und S. albus x pTESa-fuc1,2-fcd x pUWL-H-sam17 verwendet. Die Produktionsanalyse erfolgte wie im Fall der Fütterung mit Kaffeesäure. Die Analyse der HPLC-Chromatogramme zeigte jedoch auch keine neuen Peaks. Deshalb wird angenommen, dass weder Kaffeesäureethylester noch Kaffeesäurephenethylester als Substrat von Sam17 dient.
Produktionsanalyse der Rohextrakte von Streptomyces albus-wcaGa x pUWL-H- GTs Die Mutante S. albus-wcaGa sollte in der Lage sein, L-Fucose zu produzieren. Die zehn GTs aus dem sam-Cluster wurden erfolgreich in diese Mutante eingebracht. Insgesamt wurden zehn Expressionsmutanten erhalten. Die Produktionsanalyse der Mutanten erfolgte nach Kultivierung in NL111-Medium und Fütterung mit 100 µL Kaffeesäure (25 mg/mL DMSO) mittels HPLC/MS. Hier wurde die Methode sam1 verwendet. Als Negativkontrolle wurde der Extrakt von S. albus-wcaGa verwendet. Alle Kulturen wurden bei pH 4 extrahiert. Die Analyse der HPLC-Chromatogramme zeigte,
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Ergebnisse wie im Fall der Mutante S. albus x pTESa x fuc1,2-sam21, kein Auftreten von neuen Peaks (Chromatogramme nicht gezeigt).
Untersuchung der Einwirkung von L-Fucose auf Streptomyces albus Nach Erstellung der Mutante S. albus-wcaGa, die L-Fucose produzieren sollte (siehe 4.1.2), wurde festgestellt, dass die Wachstumsrate dieser Mutante im Vergleich zur Wildtyp bei 28 °C erhöht ist. Dasselbe Phänomen tritt bei 37 °C auf. In das Genom dieser Mutante wurde nur das Gen wcaGa integriert und das Plasmidbackbone durch Dre-Rekombinase wieder ausgeschnitten (siehe 4.1.2). Aus diesem Grund wurde postuliert, dass das Gen wcaGa durch die Synthese von L-Fucose die Wachstumsrate von S. albus erhöht.
In der Literatur wurde bewiesen, dass L-Fucose die Wachstumsrate verschiedener Bakterien erhöhen kann [46]. Hier wird L-Fucose als Kohlenstoff-Quelle verwendet.
Um den Einfluss des wcaGa-Gens auf das Wachstum von S. albus genauer zu untersuchen, wurde der S. albus-Wildtyp und die Mutante S. albus–wcaGa in 40 mL TSB-Medium bei 28 °C und bei 37 °C kultiviert. Die Wachstumsrate wurde durch die Bestimmung der Biomasse zu 10 verschiedenen Zeitpunkten ermittelt. Hierzu wurde jede Kultur nach vier Stunden und darauffolgend jede Stunde in ein gewogenes 50 mL Falcontube überführt, abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, RT) und für 48 Stunden bei 64 °C getrocknet. Anschließend wurden die Falkontubes gewogen und die Trockenmasse berechnet. In Abbildung 4.7 sind die erhaltenen Ergebnisse dargestellt. In den Diagrammen wurde das Wachstum von S. albus-Wildtyp mit dem Wachstum von der Mutante S. albus-wcaGa jeweils bei 28 °C und 37 °C verglichen. Sie zeigen ein wesentlich besseres Wachstum der Mutante verglichen zum Wildtyp, das bei 37 °C noch schneller ist. Die wird auf die Anwesenheit von L-Fucose zurückgeführt.
Abbildung 4.7 Einfluss des Gens wcaGa auf das Wachstum von S. albus. A. Die Biomasse von S. albus Wildtyp (blau) und S. albus-wcaGa (rot) nach Kultivierung bei 28 °C. B. Die Biomasse von S. albus Wildtyp (blau) und S. albus-wcaGa (rot) nach Kultivierung bei 37 °C. Für die Bestimmung der Biomasse wurden stündlich Proben über einen Zeitraum von 10 Stunden genommen, wobei die erste Probe nach 4 Stunden genommen wurde.
Weiterhin wurde untersucht, ob das Vorhandsein des Gens wcaGa Einfluss auf die Produktion der Sekundärmetaboliten von Streptomyceten hat. Hierzu wurde das Cosmid cos4, welches das Gencluster
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Ergebnisse von Rishirilid B und ein Apramycinresistenzgen trägt, in die S. albus-wcaGa-Mutante mittels intergenerischer Konjugation eingebracht. Die Exkonjuganden wurden auf apramycinhaltigen MS- und TSB-Agarplatten selektiert. Durch die Produktion von Rishirilid B wurde die erfolgreiche Integration des cos4 in S. albus nachgewiesen. Um die Produktion von S. albus x cos4 und S. albus-wcaGa x cos4 zu vergleichen, wurden Vorkulturen von beiden Mutanten hergestellt. Anschließend wurden jeweils 7 x 30 mL HA-Kulturen beimpft und bei 28 °C angezogen. Nach einem Tag und darauffolgend jeden Tag für insgesamt sieben Tage wurden Kulturen von beiden Mutanten abzentrifugiert. Der Überstand wurde bei pH 4 wie unter 3.10.1.1 beschrieben extrahiert und mithilfe der HPLC/MS Methode MENSO4R analysiert. Die nach Zentrifugation erhaltenen Pellets wurden bei 64 °C für 48 h getrocknet und anschließend gewogen, um die Biomasse der jeweiligen Kulturen zu bestimmen. Die Rishirilidmenge, sowie die Menge einer seiner Derivate wurden durch die sogenannte Fläche unter der Kurve AUC (Area Under the Curve) bestimmt. Um ein unterschiedliches Wachstum der beiden Mutanten und damit verbunden eine unterschiedliche Produktion auszuschließen, wurden die erhaltenen Ergebnisse auf die Biomasse bezogen. In Abbildung 4.8 sind die Ergebnisse der quantitativen Analyse dargestellt. Die Analyse zeigt, dass die Produktion von Rishirilid B (rot) sowie von einer seiner Derivate (blau) im Durchschnitt geringer ausfällt, wenn wcaGa exprimiert wird.
450
400
350
300
250
200
AUC/Biomasse 150
100
50
0 S. albus x cos4 S. albus-wcaGa x cos4
Abbildung 4.8 Quantitative Auswertung der Naturstoffproduktion der Mutante S. albus x cos4 im Vergleich zu S. albus-wcaGa x cos4 über die Bestimmung der Peakfläche (AUC) bezogen auf die Biomasse in g. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Durchschnitt der Produktion von Rishirilid B (rot) und einer der Rishirildderivate (blau) dar.
82
Ergebnisse
Untersuchung der Saccharomicin-Produktion von Saccharothrix espanaensis-Wildtyp mittels Imaging Mass-Spektrometer Da die Saccharomicine A und B unter Laborbedingungen nicht mehr detektierbar sind und wegen der aufwendigen Isolierung dieser zwei Metaboliten [24], [184] wurde eine MALDI-Imaging Mass- Spektrometer-Analyse von einer S. espanaensis-Kolonie durchgeführt, um die Saccharomicin- Produktion zu untersuchen [185], [186]. Dieses Experiment wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Bradley Moore an der Universität Kalifornien durchgeführt. Hierfür haben Roland Kersten und Andrew Willeford S. espanaensis mit Bacillus subtilis PY79 auf HA-Agarplatten für 9 Tage bei 28 °C ko-kultiviert. Zusätzlich wurden beide Stämme einzeln unter denselben Bedingungen kultiviert. Anschließend wurden die drei Ansätze für die MALDI-Imaging MS-Analyse wie bereits bei Yang et al. beschrieben vorbereitet [187]. Die Analyse erfolgte durch einen Bruker Microflex Mass Spektrometer im positiven Reflektron-Modus. Es wurde gezielt nach der Massen von Saccharomicin A (2794,3 Da) und B (2778,3 Da) gesucht. Die detektierten Substanzen wurden in verschiedener Farben dargestellt. Insgesamt wurden 17 Substanzen mit Massen zwischen 993 und 1246 g/mol in S. espanaensis Wildtyp detektiert. Die Ko-Kultivierung führte zu keiner erkennbaren Hemmung von Bacillus subtilis PY79. Ein Massen-Signal, welches zur Saccharomicin B-Masse von 2782 g/mol korrespondiert, konnte am Rand der S. espanaensis-Kolonie in der Ko-Kultur, jedoch nicht bei der einzelnen S. espanaensis-Kolonie detektiert werden.
In Abbildung 4.9 sind die von Prof. Dr. Bradley Moore durch IMS erhaltenen Ergebnisse gezeigt. Durch MALDI-IMS wurden hauptsächlich große Massen zwischen 1000 und 4000 m/z detektiert.
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Ergebnisse
Abbildung 4.9 MALDI-IMS-Analyse von S. espanaensis Wildtyp-Kolonien. Die Analyse erfolgte nach Ko- Kultivierung von S. espanaensis mit B. subtilis PY79 (A). Als Kontrolle diente B. subtilis PY79 (B) und S. espanaensis Wildtyp (C). Die detektierten Substanzen wurden in verschiedener Farben markiert und die zugehörigen Massen in (m/z) jeweils über den Bildern gezeigt. Das Produkt mit dem Signal von 2782 m/z entspricht eventuell Saccharomicin B. Surfactin und Plipastatin, welche aus B. subtilis produzierbar sind, zeigen Signale bei 1047 bzw. 1584. Der OSMAC-Ansatz in Saccharothrix espanaensis Die Analyse der Imaging-MS-Ergebnisse, sowie die Genomsequenzanalyse zeigen, dass S. espanaensis in der Lage ist, zahlreiche Naturstoffe zu produzieren. Da der Stamm unter Laborbedingungen keine Metaboliten produziert, wurden verschiedene Methoden des OSMAC-Prinzips angewendet. Zur Durchführung des OSMAC-Ansatzes wurde das Gen bldA aus S. coelicolor welches für die seltene UUA-tRNA kodiert und eine regulatorische Funktion besitzt (siehe 2.4), in S. espanaensis heterolog exprimiert. Weiterhin wurden sowohl S. espanaensis Wildtyp als auch S. espanaensis x pTESa-bldA in unterschiedlichen Produktionsmedien kultiviert und das Medium zu verschiedenen Zeitpunkten mit
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Ergebnisse unterschiedlichen pH-Werten extrahiert. Die erhaltenen Extrakte wurden durch Agardiffusionstest auf die Produktion antibiotisch aktiver Substanzen untersucht und weiter mittels HPLC/MS analysiert. Des
Weiteren wurde ScCl3 x 6H2O in einer Konzentration von 70 µM zum Kultivierungsmedium zugegeben. Durch die Variation des Mediums konnte die Produktion neuer Substanzen durch HPLC und Agardiffusionstest nachgewiesen werden.
4.4.1 Heterologe Expression des bldA-Gens in Saccharothrix espanaensis S. espanaensis ist nicht in der Lage Sporen zu bilden und unter Laborbedingungen sind alle seinen 26 Genclustern kryptisch. Um einen möglichen Einfluss von bldA zu untersuchen, sollte das Gen in S. espanaensis konstitutiv exprimiert werden.
Erstellung der Expressionsmutante Saccharothrix espanaensis x pTESa-bldA Zur Erstellung der Expressionsmutante S. espanaensis x pTESa-bldA wurde das integrative Plasmid pTESa-bldA, welches das Gen bldA unter Kontrolle des konstitutiven rpsL-Promotor trägt (siehe Tabelle 3.20), mittels intergenerischer Konjugation in den S. espanaensis-Wildtyp-Stamm eingebracht (siehe 3.8.8). Anschließend wurden ein apramycinresistenter Exkonjugand, sowie der Wildtyp, in HA-, SG-, NL111-, MPG-, RAM2-, MH-, DNPM-, PGA-und SPY-Medium für vier, fünf, sechs und neun Tage bei 28 °C kultiviert. Die Produktionsanalyse erfolgte mittels HPLC/MS und Agardiffusionstest.
Produktionsanalyse von Saccharothrix espanaensis x pTESa-bldA Die Kulturen von S. espanaensis und von der Mutante S. espanaensis x pTESa-bldA in den oben benannten Medien wurden nach vier, fünf, sechs oder neun Produktionstagen abzentrifugiert. Ein Teil der Überstände wurde, wie unter 3.10.1.1 beschrieben, extrahiert und mittels HPLC/MS mit der Methode Tanja7 (siehe Tabelle 3.34) analysiert. Der andere Teil wurde bei -80 °C für 6 h gelagert und anschließen für 48 h lyophilisiert (siehe 3.10.1.2).
Die durch Extraktion und durch Lyophilisation erhaltenen Extrakte wurden mittels Hemmhoftest auf das Vorhandsein antibiotisch aktiver Substanzen untersucht (siehe 3.11). Die Extrakte von Wildtyp und bldA-Mutante aus dem SPY-Medium zeigten eine starke antibiotische Aktivität gegen Pilze und Bakterien, welche in 4.4.2.2 genauer beschrieben wurde. Das Lyophilisat und der Extrakt der SG-Kultur der bldA-Mutante führten zu einem 10 mm großen Hemmhof gegen B. subtilis. Die Lyophylisate und die Extrakte des Wildtyps und der Mutante aus den anderen Medien zeigten keine hemmende Wirkung gegen die untersuchten Stämme.
Die Betrachtung der erhaltenen HPLC/MS-Chromatogramme der HA-, NL111-, MPG, PGA-, DNPM-, SG-, RAM2 und MH-Extrakte erbrachte sowohl beim Wildtyp, als auch bei der Mutante, kein Auftreten von Peaks. In den Extrakten von Wildtyp und Mutante nach Kultivierung in SPY-Medium sind nach HPLC-Analyse zahlreiche identische optisch aktive Substanzen zu sehen. In Abbildung 4.10 sind die
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Ergebnisse erhaltenen Chromatogramme der Extrakte nach Kultivierung in SPY-, SG-, HA- und NL111 Medium dargestellt.
Abbildung 4.10 HPLC-Chromatogramm bei λ = 254 nm der Rohextrakte von (a) S. espanaensis in SG-Medium; (b) S. espanaensis x pTESa-bldA in SG-Medium; (c) S. espanaensis in SPY-Medium; (d) S. espanaensis x pTESa- bldA in SPY-Medium; (e) S. espanaensis in HA-Medium; (f) S. espanaensis x pTESa-bldA in HA-Medium; (g) S. espanaensis in NL111-Medium; (h) S. espanaensis x pTESa-bldA in NL111-Medium.
Mittels Imaging-MS wurde S. espanaensis x pTESa-bldA nach Kultivierung auf TSB- und SG-Agar- Platten auf die Produktion von Saccharomicin B untersucht (siehe 4.3). Es konnten aber keine anderen Signale detektiert werden.
4.4.2 Produktionsanalyse von Saccharothrix espanaensis in verschiedenen Medien Die durch Extraktion erhaltenen Rohextrakte aus S. espanaensis, kultiviert in HA-, NL111-, GYM- und SPY-Medium, wurden mittels Agardiffusionstest untersucht, um eine antibakterielle bzw. antimykotische Aktivität festzustellent. Der Extrakt von S. espanaensis, kultiviert in SPY-Medium, zeigte antimykotische Wirkung gegen F. verticillioides, C. parapsilosis und Saccharomyces cerevisiae, sowie antibakterielle Aktivität gegen E. coli, S. albus und Bacillus subtilis (siehe 4.4.2.2). Die Extrakte nach Kultivierung in den anderen Medien zeigten keine Aktivität. Des Weiteren wurden die Rohextrakte mittels HPLC/MS mit der Methode Tanja7 (siehe 3.10.2.2.3) analysiert. Die Analyse erbrachte, dass eine Produktion neuer Substanzen in allen Medien den angesäurten Extrakten nach vier, fünf, sechs und neun Tagen detektierbar ist. Dabei ist die Produktion während den drei Produktionstagen vergleichbar ähnlich. In Abbildung 4.11 sind die erhaltenen HPLC-Chromatogramme der nach vier Tagen extrahierten Kulturen dargestellt. Die Chromatogramme der Extrakte nach Kultivierung in SPY- Medium zeigen zahlreiche neue Peaks, während im GYM-Medium neben den vergleichbar kleinen Peaks nur zwei neue Peaks zu detektieren waren. Im HPLC-Chromatogramm der Extrakten nach Kultivierung in NL111-Medium wurden nur kleine Peaks gemessen, die dieselbe Retentionszeiten wie 86
Ergebnisse die Peaks aus dem SPY-Medium-Chromatogramm hatten. In Extrakten aus HA-Medium-Kulturen waren nach HPLC-Analyse keine Peaks. Das reine Medium wurde zum selben Zeitpunkt extrahiert und als Kontrolle bei der HPLC-Analyse verwendet. Diese Extrakte enthielten nach HPLC-Analyse, bis auf der Extrakt des SPY-Mediums, keine Peaks zu erkennen. Das Chromatogramm des reinen SPY- Mediums ist als Kontrolle in Abbildung 4.11 (e) gezeigt.
Abbildung 4.11 HPLC-Chromatogramm bei 254 nm der Rohextrakte von S. espanaensis nach viertägiger Kultivierung in (a) NL111-Medium, (b) HA-Medium, (c) GYM-Medium, (d) SPY-Medium. Als Kontrolle wurde der Extrakt des reinen SPY-Mediums (e) verwendet. Allen Medien wurden mit 70 µM ScCl3 x 6H2O versetzt. Die Chromatogramme zeigen die Produktion verschiedener Metabolite nach Kultivierung in unterschiedlichen Medien. Die Kultivierung in SPY-Medium führt zur Produktion zahlreicher Substanzen, während die Kultivierung in den anderen Medien nur geringe oder keine Produktion neuer Substanzen zeigt. Die Substanzen der Peaks bei 14,1 min (blau), 13,7 min (gelb) und 12,3 min (rot) wurden aufgereinigt und deren Strukturen mittels NMR aufgeklärt.
Im Fall des Chromatogramms der Produktion in SPY-Medium wurden die UV- und Massenspektren der verschiedenen Peaks betrachtet und mit den aufgetretenen Peaks der anderen Medien verglichen. Die Analyse der UV- und MS-Spektren des Peaks bei 14,1 min, der in Abbildung 4.11 blau markiert ist, ergab, dass es sich um mehr als eine Substanz handelt. Weiterhin zeigt der in gelb markierte Peak bei 13,7 min dasselbe UV- und Massenspektrum wie der Peak bei 13,7 min im NL111-Chromatogramm, welcher im NL111-Chromatogramm aber deutlich kleiner ist. Die weiteren Peaks des SPY-Mediums treten nur in diesem Medium auf. Um genauere Informationen über die im SPY-Medium produzierten Substanzen zu bekommen, wurden die in Abbildung 4.11 markierten Peaks aufgereinigt und die Strukturen der Substanzen mittels NMR aufgeklärt.
87
Ergebnisse
Isolierung von Susa-1, Susa-2, Susa-3, Susa-4 und Mk-1 aus Saccharothrix espanaensis kultiviert in SPY-Medium Um herauszufinden welche Metabolite von S. espanaensis produziert werden und antibiotisch aktiv sind, wurden anhand des UV-Spektrums und der Bioaktivität verschiedene Substanzen aufgereinigt. Insgesamt wurden fünf Produkte aus den Extraktem der SPY-Medium-Kulturen isoliert, wovon mittels NMR vier Strukturen aufgeklärt werden konnten. Bei dem Produkt mit der Retentionszeit von 14,1 min (siehe Abbildung 4.12) handelt es sich um mehrere Substanzen, von denen die Metaboliten Susa-1, Susa-3 und Susa-4 mit der Massen von 120, 137 bzw. 437 g/mol isoliert wurden. Bei den Produkten mit den Retentionzeiten von 12,3 min und 13,7 min handelt es sich jeweils um eine Substanz. Diese wurden als Susa-2 (136 g/mol) und MK-1 (160 g/mol) bezeichnet und erfolgreich aufgereinigt.
Um die Metaboliten Susa-1, Susa-2, Susa-3, Susa-4 und MK-1 aufzureinigen und deren Strukturen aufzuklären, wurden 10 L einer SPY Produktionskultur angezogen (siehe 3.8.2.5). Nach viertägiger Inkubation wurden die Kulturen wie unter 3.10.1.1 beschrieben extrahiert. Mittels Festphasenextraktion wurde der erhaltene Rohextrakt fraktioniert (siehe 3.10.1.3). Die Metaboliten Susa-1 und MK-1 wurden in der 60 % und 65 % Methanol-Fraktion von einer Oasis® HLB Säule eluiert. Die Susa-2-, Susa-3 und Susa-4-Produkte wurden in der 50 % Methanol-Fraktion von der Säule gewaschen. Anschließend wurden die Metaboliten mittels Dünnschichtchromatographie weiter aufgetrennt (siehe 3.10.1.4).
Hierbei wurden die gewünschten Banden (Rf-Werte: Susa-1: 0,56; Susa-2: 0,65; Susa-3: 0,7; MK-1: 0,56) von der DC-Platte gekratzt und die Substanzen mit Methanol extrahiert. Weiterhin wurden Susa-1, Susa-2, Susa-3, Susa-4 und MK-1 jeweils mittels einer präparativen Säule über die HPLC aufgereinigt (siehe 3.10.1.5). Hierfür wurden die Methoden Suzan3, Suzan5 und Monika2 verwendet (siehe 3.10.1.5). Als letzten Aufreinigungsschritt wurde eine Sephadex-LH20 Säulenchromatographie (siehe 3.10.1.6) durchgeführt. Während der Aufreinigung erfolgte die Kontrolle des Vorhandenseins der jeweiligen aufzureinigenden Substanzen sowie die Analyse des Reinheitsgrades mittels analytischer HPLC/MS (siehe 3.10.2.2.3). Es konnten insgesamt 5,2 mg Susa-1; 4,4 mg Susa-2; 3 mg Susa-3, 2 mg Susa-4 und 4,5 mg MK-1 zur Strukturaufklärung aufgereinigt werden. Abbildung 4.12 zeigt die analytischen HPLC-Chromatogramme der einzelnen Substanzen nach allen Aufreinigungsschritten.
88
Ergebnisse
Abbildung 4.12 A. HPLC-Chromatogramme (λ=254 nm) der isolierten Substanzen aus S. espanaensis-Rohextrakt. (a) Susa-3, (b) Susa-1, (c) MK-1, (d) Susa-2, (e) Rohextrakt von S. espanaensis Wildtyp, (f) Extrakt des reinen SPY-Mediums als Kontrolle. B. UV-Spektren der einzelnen aufgereinigten Substanzen (a) Susa-3, (b) Susa-1, (c) MK-1, (d) Susa-2. Strukturaufklärung von Susa-1, Susa-2, Susa-3 und MK-1 Um die Strukturen der aufgereinigten Substanzen Susa-1, Susa-2, Susa-3, Susa-4 und MK-1 aufzuklären, wurde NMR-Messungen durchgeführt. Diese wurde von Dr. Thomas Paululat an der Universität Siegen ausgeführt und ausgewertet (siehe 3.10.2.3). Hierfür wurden die Substanzen wie in Tabelle 3.36 beschrieben gelöst. Es wurden 1H- und 13C-und 2D-NMR Experimente (1H/1H-COSY, 1H/13C-HMBC) vermessen. Die Strukturen von Susa-1,-2,-3 und MK-1 konnten aufgeklärt werden. Bei Susa-4 waren die Signale aufgrund einer zu geringen Menge zu schwach für die Strukturaufklärung. Bei Susa-1 handelt es sich um Benzoesäure (BA), bei Verbindung Susa-2 um Anthranilsäure (AA), bei Verbindung Susa-3 um Phenylessigsäure (PAA) und bei MK-1 um Indol-3-Carbonsäure (ICA). Die NMR-Daten sind in Tabelle 4.1, Tabelle 4.2, Tabelle 4.3 und Tabelle 4.4 angegeben. In der Abbildung 4.13 sind die Strukturen der einzelnen Verbindungen dargestellt.
89
Ergebnisse
Susa-1 Susa-2 Susa-3 MK-1
Abbildung 4.13 NMR-Strukturen von Susa-1, Susa-2, Susa-3 und MK-1. Es handelt es sich bei Susa-1 um Benzoesäure, bei Susa-2 um Anthranilsäure, bei Susa-3 um Phenylessigsäure und bei MK-1 um Indol-3- Carbonsäure.
Tabelle 4.1 NMR-Daten von Susa-1 gelöst in CD3OD. δH: 600 MHz, δc: 150 MHz Temperatur = 25° C. Schwache Signale sind in Klammern gesetzt.
Pos. δC δH (J Hz) HMBC
1 170.7 3-H, 4-H, 6-H
2 134.2 -
3, 6 130.6 7.98 dd (8.2, 1.4) 5-H
4 129.2 7.42 dd (8.2, 7.3) 3-H, 6-H
5, 7 133.3 7.52 td (7.3, 1.4) 3-H, 4-H, 6-H, 7-H
Tabelle 4.2 NMR-Daten von Susa-2 gelöst in CD3OD. δH: 600 MHz, δc: 150 MHz Temperatur = 25° C. Schwache Signale sind in Klammern gesetzt.
Pos. δC δH (J Hz) COSY HMBC
1 152.6 3-H, 5-H, (4-H)
2 112.8 4-H, 6-H
3 132.7 7.79 dd (8.0, 1.6) 4-H 4-H, 5-H 6.55 ddd (8.0, 4 116.6 3-H, 5-H 6-H 6.8,1.2) 7.20 ddd (8.4, 6.8, 5 134.7 4-H, 6-H 3-H, 4-H 1.6) 6 117.7 6.71 dd (8.4, 1.2) 5-H (3-H), 4-H, (5-H)
COOH 172.1 3-H, (6-H)
Tabelle 4.3 NMR-Daten von Susa-3, gelöst in DMSO-d6. δH: 600 MHz, δc: 150 MHz, Temperatur = 35 °C.
Pos. δC δH (J Hz) COSY HMBC
1 175.8 2-H2
2 42.1 3.59
3 136.2 2-H2, 4-H, 8-H
4 129.4 7.29 5-H 4-H, 7-H
5 130.3 7.27 4-H, 6-H 4-H, 6-H
90
Ergebnisse
6 127.8 7.21 5-H, 7-H 5-H, 7-H
7 130.3 7.27 6-H, 8-H 6-H, 8-H
8 129.4 7.29 7-H 5-H
Tabelle 4.4 NMR-Daten von MK-1 gelöst in CD3OD. δH: 400 MHz, δc: 100 MHz Temperatur = 22° C. Schwache Signale sind in Klammern gesetzt.
Pos. δC δH (J Hz) HMBC
1 170.7 3-H, 4-H, 6-H
2 134.2 -
3, 6 130.6 7.98 dd (8.2, 1.4) 5-H
4 129.2 7.42 dd (8.2, 7.3) 3-H, 6-H
5, 7 133.3 7.52 td (7.3, 1.4) 3-H, 4-H, 6-H, 7-H
Bioaktivität der isolierten Substanzen aus Saccharothrix espanaensis kultiviert in SPY-Medium Die Bioaktivität der aufgereinigten Substanzen wurde nach den einzelnen Aufreinigungsschritten mittels Agardiffusionstest untersucht. Hierbei wurde die antibiotische Aktivität der durch Extraktion, SPE, DC und Sephadex erhaltenen Extrakte wie unter 3.11 beschrieben getestet. Die Extrakte wurden jeweils gegen die folgenden Bakterien: E. coli, S. albus und Bacillus subtilis sowie gegen die Pilzstämme und Hefen F. verticillioides, C. parapsilosis und Saccharomyces cerevisiae eingesetzt. Die Analyse zeigte eine antibiotische Aktivität bei allen untersuchten Extrakten bis auf die nach Sephadex erhaltenen Extrakte, bei denen es sich jeweils um die aufgereinigte Produkte handelte. Alle anderen konnten das Wachstum aller eingesetzten Testkeime hemmen. Anhand der Größe des Hemmhofs konnte die Wirksamkeit der Extrakte festgestellt werden. Die Wirkung des Rohextrakt war mit einem Hemmhofdurchmesser von 34 mm gegen F. verticillioides besonders hoch (siehe Abbildung 4.14).
Abbildung 4.14 Ergebnisse des Bioaktivitätstests des Rohextrakts aus in SPY-Medium kultivierten S. espanaensis gegen (a) Bacillus subtilis, (b) S. albus, (c) E. coli und (d) F. verticillioides. Als Positivkontrolle wurden 500 µg Apramycin bei (a), (b), und (c) und 75 µg Nystatin bei (d) eingesetzt. Eine starke antimykotische Wirkung gegen F. verticillioides ist deutlich zu erkennen.
91
Ergebnisse
In Tabelle 4.5 sind die Hemmhofgrößen des Rohextrakts sowie der SPE-Extrakte aus S. espanaensis- SPY-Kulturen dargestellt. Aus der 50 %-SPE-Fraktion wurde die Verbindung Susa-3 und Susa-4 isoliert. Die Metaboliten Susa-1 und Susa-2 befinden sich in der 60 %-SPE-Fraktion. Susa-2 konnte ebenfalls in der 50 %-Fraktion detektiert werden.
Tabelle 4.5 Ergebnisse des Bioaktivitätstests mit S. espanaensis-Extrakt und SPE-Fraktionen. Der Hemmhofdurchmesser wird in mm angegeben. Als Positivkontrolle wurden 500 µg Apramycin bei Bakterienstämmen und 75 µg Nystatin bei Pilzstämmen eingesetzt
Testkeime Rohextrakt 50 %-SPE 60 %-SPE Positivkontrolle
F. verticillioides 34 28 28 13
C. parapsilosis 12 8 8 10
E. coli 10 7 6 21
B. subtilis 12 8 8 24
S. albus 12 8 8 24
4.4.3 In silico Untersuchung zur Biosynthese von Anthranilsäure, Indol-3-Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure Um den Einfluss des SPY-Mediums auf das Metabolitenprofil von S. espanaensis genauer zu untersuchen, wurden durch RNA-Seq die Gene, die in SPY- und in GYM-Medium unterschiedlich exprimiert sind, identifiziert. Die Analyse der RNA-Seq-Daten wird unter 4.5.1.1 genau beschrieben. Durch diese Ergebnisse konnten weitere Informationen über die Biosynthesewege der isolierten Substanzen gewonnen werden.
Untersuchungen zur Biosynthese von Anthranilsäure (AA) In Streptomyceten und anderen Mikroorganismen wurde die Biosynthese von AA aus Tryptophan bereits beschrieben [188], [189]. Anhand des sogenannten „Tryptophan zu Anthranilat“-Weg wurde gezeigt, dass die drei Enzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase, Kynureninforamidase und Kynureninase für die Produktion von AA verantwortlich sind. Das erste Enzym Tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO) oxidiert L-Tryptophan zu N-Formyl-L-Kynurenin, welches anschließend durch die Kynureninforamidase (KFA) zu Kynurenin umgewandelt wird. Durch die Kynureninase (KYN) wird Kynurenin hydrolysiert, wodurch L-Alanin abgespalten wird und AA entsteht. In S. coelicolor wurde bestätigt, dass die drei Gene SCO3644, SCO3646 und SCO3465 für die Enzyme TDO, KFA und KYN kodieren [188]. Mittels BLASTp-Analyse konnte gezeigt werden, dass die Genprodukte von BN6_03090, BN6_03100 und BN6_14890 aus S. espanaensis hohe Homologien mit diesen Enzymen aufweisen (siehe Tabelle 4.6). Die RNA-Seq-Analyse zeigt, dass die oben genannten Gene aus S. espanaensis im SPY-Medium überexprimiert sind.
92
Ergebnisse
Tabelle 4.6 Ergebnisse der BLASTp-Analyse der Genprodukte aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu den Enzyme des „Tryptophan zu Anthranilat“–Wegs aus S. coelicolor (CAB95894.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Putative Gen ID in Gene ID in Funktion des A B C D S. espanaensis S. coelicolor Genprodukts Tryptophan 2,3- BN6_03100 SCO3646 61/71 395 2364 5,9 Dioxygenase Kynureninforma BN6_14890 SCO3644 35/41 23 378 16,4 midase BN6_03090 Kynureninase SCO3645 63/69 140 1286 9,2
Andererseits ist AA auch ein Endprodukt der Tryptophanbiosynthese. Hier katalysiert das Enzym Anthranilat-Synthase die Bildung von Anthranilat aus Chorisminsäure, wobei Glutamin unter Abgabe von Ammoniak zu Glutamat umgewandelt und Pyruvat abgespaltet wird. Das Enzym Anthranilat- Synthase setzt sich aus zwei Untereinheiten zusammen, die von zwei Gene kodiert werden. In S. espanaensis kodieren die Gene BN6_68440 und BN6_00210 für zwei Proteine, die Homologien zu TrpE und TrpG aus S. coelicolor zeigen, welche die zwei Untereinheiten der Anthranilat-Synthase bilden. Beide Gene werden im SPY-Medium hochreguliert (Tabelle 4.7).
Tabelle 4.7 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu TrpE und TrpG aus S. coelicolor (CAB95894.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Putative Gen ID Anzahl Funktion des A B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
Anthranilat- 36/56 (zu TrpE, BN6_68440 610 Synthase kodiert von 1554 2321 1,5 Komponente I SCO2043) Anthranilat- 55/69 (zu TrpG, BN6_00210 214 Ssynthase kodiert von 1491 6659 4,5 Komponente II SCO3213)
Untersuchungen zur Biosynthese von Indol-3-Carbonsäure (ICA) Das Indol-Derivat ICA ist eine antibakteriell und antimykotisch wirkende Substanz und wurde erstmals in Chromobacterium violaceum identifiziert [190]. Später konnte ICA auch in anderen Mikroorganismen nachgewiesen werden, wie z. B. Azotobacter chroococcum, Streptomyces sp. TK- VL_333 und Botryocladia leptopoda [191]–[193]. Die ICA-Biosynthese ist bislang noch nicht vollständig aufgeklärt. Bei Chromobacterium violaceum wurde beschrieben, dass ICA nur während der Kultivierung des Stamms in L-Tryptophan-haltigen Medium detektierbar ist. Die Durchführung von Fütterungsexperimenten mit unterschiedlichen Indol-Derivaten ergab, dass ICA ein Abbauprodukt von L-Tryptophan ist. Des Weiteren wurde postuliert, dass Indol-3-Essigsäure (IAA) durch ein
93
Ergebnisse
Oxidase/Peroxidase-Enzym-System über Indole-3-Carbaldehyd (IAld) zu ICA umgewandelt wird und folgende Reaktion abläuft:
L-Tryptophan→Indol-3-Essigsäure→ Indole-3-Carbaldehyd→Indol-3-Carbonsäure [190]
Die Biosynthese des Phytohormons IAA ausgehend von L-Tryptophan ist in mehreren Mikroorganismen beschrieben [194], [195]. Die Tryptophan-Aminotransferase setzt L-Tryptophan zu Indol-3-Pyruvat um, welches im nächsten Schritt durch eine Indol-3-Pyruvatdecarboxylase zu Indol-3- Acetaldehyd decarboxyliert wird. Daraufhin wird Indol-3-Acetaldehyd durch eine Indole-3- Acetaldehyddehydrogenase zu IAA oxidiert. Die weiteren Enzyme, die an der Umsetzung von IAA zu ICA beteiligt sind, sind noch nicht untersucht. Um den Biosyntheseweg von ICA in S. espanaensis in silico zu untersuchen, wurde ein Datenbankabgleich mittels des Programms BLASTp durchgeführt. Hierbei wurden die Proteinsequenzen der biochemisch charakterisierten Enzyme, die an der Biosynthese von IAA und ICA beteiligt sind, mit der Genomsequenz von S. espanaensis verglichen.
Die Gene hisC1 und hisC2 aus Azospirillum brasilense kodieren für zwei Tryptophan- Aminotransferasen (ATT1, ATT2) [196]–[198]. Der BLASTp-Vergleich ergab, dass zwei Proteine, kodiert von BN6_01860 und BN6_68610, aus S. espanaensis homolog zu AAT1 und AAT2 sind. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass beide Gene im SPY-Medium hochreguliert sind (siehe Tabelle 4.8).
Tabelle 4.8 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukte aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu AAT1 und AAT2 aus Azospirillum brasilense (AKE79094.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY- Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in % (A1 zu AAT1; A2 zu AAT2). B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl der Putative Funktion des A1 A2 B C D S. espanaensis AS Genprodukts
355 Histidinolphosphat- BN6_01860 30/46 35/53 575 3011 5,2 Aminotransferase
367 Histidinolphosphat- BN6_68610 32/48 31/47 2704 3721 1,4 Aminotransferase
Weiterhin wurde bewiesen, dass das Gen ipdC aus Azospirillum brasilense sowohl für eine Indol-3- pyruvatdecarboxylase (IPDC) als auch für eine Phenylpyruvatdecarboxylase kodiert [199]. Die Gene aus S. espanaensis, die in ihrer Aminosäuresequenz eine Homologie zu IPDC aufweisen, sind unter 4.4.3.3 und in der Tabelle 4.12 beschrieben.
Es wurde postuliert, dass im Pilz Ustilago maydis IAA von L-Tryptophan über den Tryptamin-Weg synthetisiert wird. Hierbei wird L-Tryptophan durch eine Tryptophan-Decarboxylase zu Tryptamin umgesetzt, darauffolgend wandelt eine Aminooxidase Tryptamin zu Indol-3-Acetaldehyd um. Im letzten Schritt wird Indol-3-Acetaldehyd über eine Indol-3-Acetaldehyddehydrogenase zu IAA oxidiert. In Ustilago maydis wurde nur das letzte Enzym dieser Biosynthesewegs charakterisiert, 94
Ergebnisse welches von iad1 kodiert ist [194]. Die BLASTp-Analyse ergab, dass neun Gene aus S. espanaensis in ihrer Aminosäuresequenz Homologien mit Iad1 teilen. Fünf Gene davon sind im SPY-Medium überexprimiert (siehe Tabelle 4.9). Die weiteren Gene, die an dem Abbau von IAA zu ICA beteiligt sind, sind bislang nicht identifiziert.
Tabelle 4.9 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu Iad1 aus Ustilago maydis (AAC49575.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl Putative Funktion des A B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
BN6_13450 451 Aldehyddehydrogenase 40/55 315 1879 5,9
BN6_77230 475 Aldehyddehydrogenase 45/61 1333 5240 3,9
BN6_34260 474 Aldehyddehydrogenase 43/63 56 116 2,07
BN6_30230 452 Aldehyddehydrogenase 40/58 133 217 1,6 Gamma- BN6_44670 474 Aminobutyraldehyddeh 37/54 16 25 1,6 ydrogenase 5-carboxymethyl-2- BN6_34200 500 hydroxymuconate 41/60 204 266 1,3 semialdehyddehydroge nase BN6_48470 494 Aldehyddehydrogenase 45/60 2 2 1 Gamma- BN6_10730 489 Aminobutyraldehyddeh 39/58 62 48 0,8 ydrogenase BN6_12930 507 Aldehyddehydrogenase 42/58 52 25 0,5
Untersuchung zur Biosynthese von Phenylessigsäure (PAA) Die Produktion von PAA aus Phenylalanin wurde bereits in mehreren Mikroorganismen beschrieben [91], [200]. In dem denitrifizierenden Bakterium Thauera aromatica wurde gezeigt, dass drei Enzyme dafür verantwortlich sind: Im ersten Schritt wird durch eine Pyridoxal-phosphatabhängige Aminotransferase Phenylpyruvat aus Phenylalanin gebildet. Im Anschluss daran wandelt die Phenylpyruvatdecarboxylase Phenylpyruvat zu Phenylethanal um. Im letzten Schritt wird Phenylethanal durch eine NAD-abhängige Aldehyddehydrogenase zu PAA oxidiert [201].
Zur Identifizierung der Gene aus S. espanaensis, die wahrscheinlich für die Enzyme der PAA- Biosynthese kodieren, wurde das Genom auf Phenylalanin-abbauende Gene untersucht. Mittels BLASTp-Analyse konnten sieben Aminosäure-Aminotransferase-Gene identifiziert werden (siehe Tabelle 4.10).
95
Ergebnisse
In Thermococcus litoralis wurde gezeigt, dass das Enzym ArAT-II die Deaminierung der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan katalysiert [202]. Die BLASTp-Analyse ergab, dass in S. espanaensis sieben Aminotransferasen kodierende Gene in ihrer Aminosäuresequenz Homologien zu ArAT-II aufweisen. Die RNA-Seq-Analyse zeigt, dass im SPY-Medium fünf der sieben identifizierten Aminotransferase Gene hochreguliert sind (siehe Tabelle 4.10).
Tabelle 4.10 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukte aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu ArAT-II aus Thermococcus litoralis (WP_004067152.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl der Putative Funktion des A B C D S. espanaensis AS Genprodukts
BN6_79710 414 Aspartat-Aminotransferase 20/41 1416 9609 6,8 Histidinol-phosphat- BN6_01860 355 28/44 574 3011 5,2 Aminotransferase
BN6_08560 360 N-Succinyldiaminopimelat- 21/41 782 2057 2,6 Aminotransferase BN6_82750 381 Aspartat-Aminotransferase 22/41 416 910 2,2 BN6_68610 367 Histidinolphosphat- 29/50 2704 3721 1,4 Aminotransferase BN6_09630 367 Nicht charakterizierte 27/44 749 498 0,7 Aminotransferase BN6_52820 411 Aspartat-Aminotransferase 22/41 26 15 0,6
In Saccharomyces cerevisiae wurde nachgewiesen, dass das Enzym ARO10 eine Thiamin-abhängige Phenylpyruvatdecarboxylase-Funktion besitzt [203]. In Azospirillum brasilense wurde ebenfalls gezeigt, dass das Gen ipdC für eine Phenylpyruvatdecarboxylase kodiert [204]. Weiterhin haben Spaepen et al. das Enzym PPDC, das eine Indol-3-Pyruvatdecarboxylase-Aktiviät besitzt, als eine Phenylpyruvatdecarboxylase neu zugeordnet [204]. In S. espanaensis wurden die homologe Gene zu YDR380w/ARO10 und ipdC gesucht. Die Analyse ergab, dass fünf der Gene aus S. espanaensis in ihrer Aminosäuresequenz homolog zu ARO10 und PPDC sind. Drei davon sind im SPY-Medium signifikant hochreguliert (siehe Tabelle 4.11).
Tabelle 4.11 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu ARO10 aus Saccharomyces cerevisiae (NP_010668.3) und IpdC aus Azospirillum brasilense (AKE79068.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in % (A1 zu ARO10¸A2 zu PPDC). B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl Putative Funktion des A1 A2 B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
BN6_70290 612 Acetolactat-Synthase 20/38 25/40 175 824 4,7
BN6_50800 596 Pyruvatdehydrogenase 21/38 24/38 350 1086 3,1
96
Ergebnisse
BN6_37290 522 Benzoylformatdecarboxylase 24/39 23/39 55 88 1,6
551 Acetolactat-Synthase I/II/III BN6_67160 21/36 27/41 216 275 1,3 große Untereinheit
538 Thiaminpyrophosphat- BN6_46450 21/38 23/39 103 50 0,5 notwendiges Protein
In E. coli wurde beschrieben, dass das Gen padA für eine Phenylacetaldehyddehydrogenase kodiert [205]. Der Sequenzvergleich ergab, dass die Genprodukte von sechs Genen aus S. espanaensis Homologien zu PadA aufweisen. Vier der Gene sind im SPY-Medium hochreguliert (siehe Tabelle 4.12).
Tabelle 4.12 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukte aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu PadA aus E. coli K12 (NP_415903.4), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl Putative Funktion des A B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
BN6_77230 475 Aldehyddehydrogenase 36/56 1333 5241 3,9
BN6_34260 474 Aldehyddehydrogenase 42/58 55 116 2,1
BN6_30230 452 Aldehyddehydrogenase 41/58 133 216 1,6
5-Carboxymethyl-2- BN6_34200 500 hydroxymuconatsemial 36/57 204 266 1,3 dehyddehydrogenase
BN6_48740 494 Aldehyddehydrogease 43/61 2 2 1
BN6_12930 507 Aldehyddehydrogenase 37/54 51 24 0,5
Untersuchungen zur Biosynthese von Benzoesäure (BA) In Pflanzen und Mikroorganismen wurde nachgewiesen, dass BA ein Abbauprodukt von L-Phenylalanin ist [206], [207]. Die Biosynthese von BA, welche die Startereinheit des PKS-Antibiotikums Enterocin ist, wurde genauer in Streptomyces maritimus untersucht [94], [208]. Hierbei wurde gezeigt, dass die L- Phenylalanin-Ammonia-Lyase, kodiert durch das Gen encP, L-Phenylalanin zu Zimtsäure umwandelt. Die Funktion dieses Proteins wurde ebenfalls in Pflanzen bestätigt [209]. Die BLASTp-Analyse ergab, dass fünf Gene aus S. espanaensis Sequenzhomologien zum EncP-Protein aufweisen (siehe Tabelle 4.13). Davon ist nur das Gen BN6_75400 im SPY-Medium stark hochreguliert (16,6 fach).
97
Ergebnisse
Tabelle 4.13 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu EncP aus Streptomyces maritimus (AAF81735.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in %. B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl Putative Funktion des A B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
BN6_75400 522 Histidin-Ammonia-Lyase 36/56 85 1405 16,5
BN6_58690 510 Tyrosin-Ammonia-Lyase 29/44 66 76 1,2
BN6_51160 552 Histidin-Ammonia-Lyase 37/51 24 16 0,7
BN6_56620 505 Histidin Ammonia-Lyase 30/51 57 35 0,6
BN6_22470 510 Histidin-Ammonia-Lyase 30/49 3 8 2,7
Im zweiten Schritt der BA-Biosynthese wird Zimtsäure durch eine Cinnamat-CoA-Ligase zu Cinnamoyl-CoA aktiviert. Die Proteine EncH aus Streptomyces maritimus [94] und ScCCl aus S. coelicolor [210] besitzen eine CoA-Ligase-Funktion und akzeptieren Zimtsäure als Substrateinheit. Die BLASTp-Analyse ergab, dass sieben Gene aus S. espanaensis in ihrer Aminosäuresequenz Homologien zu EncH bzw. ScCCL aufweisen. Die RNA-Seq-Analyse zeigte, dass drei der acht Gene transkribiert werden, wobei nur das Gen BN6_31010 hochreguliert ist (siehe Tabelle 4.14). Das Gen BN6_31010 teilt 33 % identische und 50 % ähnliche Aminosäure mit PhcnL aus Petunia hybrida, welche ebenfalls eine Cinnamat-CoA Ligase Aktivität besitzt.
Tabelle 4.14 Ergebnisse der BLASTp-Analyse der00 Genprodukte aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu ScCCL aus S. coelicolor (CAB95894.1) und EncH aus Streptomyces maritimus (AAF81735.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in % (A1 zu ScCCL¸A2 zu EncH). B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl der Putative Funktion des A1 A2 B C D S. espanaensis AS Genprodukts
509 AMP-abhängige Synthase und BN6_31010 31/44 31/46 227 291 1,3 Ligase
BN6_64350 554 Acyl-CoA-Ligase 32/48 33/46 72 88 1,2
BN6_50250 504 Fettsäure-CoA Ligase 34/49 30/45 5 6 1,2
489 AMP-abhängige Synthase und BN6_80900 35/48 29/40 821 777 0,9 Ligase
BN6_81150 520 4-Coumarat-CoA-Ligase 53/68 28/43 1437 168 0,1
BN6_21300 508 Fettsäuren-CoA-Ligase 36/50 29/47 7 2 0,3
BN6_39980 497 Fettsäure-CoA Ligase 35/49 30/47 13 8 0,6
BN6_48510 528 Acyl-CoA Ligase 35/47 30/45 0 2 -
98
Ergebnisse
Im nächsten Schritt der Biosynthese von BA in Streptomyces maritimus wird β-Hydroxypropionyl-CoA durch die Cinnamoyl-CoA-Hydratase, welche durch das Gen encI kodiert gebildet wird. Die Analyse ergab, dass das Gen BN6_72690 aus S. espanaensis 31 % identische und 50 % ähnliche Aminosäuren mit EncI teilt. Das Gen wird nach RNA-Seq-Analyse im SPY-Medium hochreguliert (870 RPKM in GYM und 1746 RPKM in SPY-Medium). Darauffolgend katalysiert eine β-Hydroxypropionyl-CoA- Dehydrogenase (EncM) die Bildung von β-Ketoacyl-propionyl-CoA. Die Gene BN6_14910 und BN6_41350 sind homolog zu EncM. Beide Gene werden im SPY-Medium nicht transkribiert. In Petunia hybrida wird Cinnamoyl-CoA zu β-Ketoacyl propionyl-CoA durch ein Cinnamoyl-CoA Hydratase/Dehydrogenase (PhCHD) in einem Schritt umgesetzt [211]. Nach BLASTp-Analyse zeigen die zwei Gene BN6_18530 (mit 29 % identischen und 46 % ähnlichen Aminosäuren) und BN6_67950 (mit 28 % identischen und 45 %ähnlichen Aminosäuren) eine Homologie zu PhCHD. Beide Gene sind im SPY-Medium überexprimiert (BN6_18530: 1,2 fach; BN6_67950: 3 fach). Die Umwandlung von β-Ketoacylpropionyl-CoA zu Benzaldehyd-CoA wird durch eine Ketoacylthiolase katalysiert. EncJ aus Streptomyces maritimus und PhKAT1 aus Petunia hybrida katalysieren die oben genannte Reaktion. Die BLASTp-Analyse zeigte, dass fünf Gene aus S. espanaensis in ihrer Aminosäuresequenz eine Homologie zu den beiden Gene zeigen. Vier der fünf Gene sind im SPY-Medium hochreguliert (siehe Tabelle 4.15).
Tabelle 4.15 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu PhKAT1 aus Petunia hybrida (ACV70032.1) und EncJ aus Streptomyces maritimus (AAF81735.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in % (A1 zu PhKAT1; A2 zu EncJ). B ist PRKM in GYM-Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl der Putative Funktion des A1 A2 B C D S. espanaensis AS Genprodukts
401 Acyl-CoA BN6_73090 40/56 25/41 1108 9679 8,7 Acetyltransferase
BN6_67940 412 Acyltransferase 36/52 28/43 315 852 2,7
406 3- Ketoadipyl-CoA BN6_07730 37/51 29/44 1942 2242 1,2 Thiolase
406 3-Ketoadipyl-CoA BN6_18540 34/52 27/41 814 946 1,2 Thiolase
391 β-Ketoadipyl-CoA BN6_27580 37/53 30/43 28 78 2,8 Thiolase
Im letzten Schritt wird Benzaldehyd Co-A zu BA umgewandelt. Das Genom von S. espanaensis enthält zehn Gene, die Sequenzhomologien zu der Benzaldehyddehydrogenase II aus Acinetobacter calcoaceticus und der BALDH aus Antirrhinum majus aufweisen [212], [213]. Davon sind die Gene BN6_13450, BN6_78480, BN6_77230, BN6_34260, BN6_61630, BN6_30230 und BN6_34200 im SPY- Medium hochreguliert (siehe Tabelle 4.16). 99
Ergebnisse
Tabelle 4.16 Ergebnisse der BLASTp-Analyse von Genprodukten aus S. espanaensis und deren Ähnlichkeit zu Benzaldehyddehydrogenase II (BLDH-II) aus Acinetobacter calcoaceticus (AAC32670.1) und BALDH aus Antirrhinum majus (ACM89738.1), sowie deren Expression in GYM- und SPY-Medium. A ist Anteil identischer Amino-säuren/Anteil ähnlicher Aminosäuren in % (A1 zu BALDH-II¸A2 zu BALDH). B ist PRKM in GYM- Medium. C ist PRKM in SPY-Medium. D ist Hochregulierungsfaktor.
Gen ID Anzahl Putative Funktion des A1 A2 B C D S. espanaensis der AS Genprodukts
BN6_13450 451 Aldehyddehydrogenase 34/52 40/56 315 1879 6
BN6_78480 481 Aldehyddhydrogenase 35/53 34/50 591 3340 5,7
BN6_77230 475 Aldehyddehydrogenase 34/53 46/62 1333 5241 3,9
BN6_34260 474 Aldehyddehydrogenase 31/51 41/59 56 116 2,1
BN6_61630 475 Aldehyddehydrogenase 34/49 33/50 764 1523 2
BN6_30230 452 Aldehyddehydrogenase 36/55 3/54 133 217 1,6
500 5-Carboxymethyl, 2- BN6_34200 Hydroxymuconatsemialdehyd 31/50 42/58 204 266 1,3 dehydrogenase
474 Gamma- BN6_44670 Aminobutyraldehyddehydroge 31/50 37/52 15 25 1,7 nase
BN6_48470 494 Aldehyddehydrogenase 35/52 44/59 2 2 1
BN6_43980 486 Salicylaldehyddehydrogenase 42/59 32/50 4 0 0
4.4.4 Inaktivierung der Gene BN6_01860, BN6_75400, BN6_67950, BN6_77230 und BN6_79710
Erstellung der Saccharothrix espanaensis-Inaktivierungsmutanten Zur Inaktivierung der Gene BN6_01860, BN6_75400; BN6_67950, BN6_77230 und BN6_79710 wurden die Inaktivierungskonstrukte pKC1132 x KO01860, pKC1132 x KO75400, pKC1132 x KO67950, pKC1132 x KO77230 und pKC1132 x KO79710, wie unter 3.9.11.8 beschrieben, erstellt und mittels intergenerische Konjugation in S. espanaensis eingebracht. Die zehn bis zwölf Tage angewachsenen Exkonjuganden wurden auf apramycinhaltigen Agarplatten selektiert. Um die erfolgreiche Inaktivierung der vier Gene nachzuweisen, wurde die genomische DNA der Singlecrossover-Mutanten isoliert und diente als Matrize für PCRs. Als Primer wurden BN6_0186-f/-r, BN6_67950-f/-r, BN6_77230-f/-r und BN6_79710-f/-r (siehe Tabelle 3.25) entsprechend für die Mutanten S. espanaensis ΔBN6_01860, S. espanaensis ΔBN6_67950, S. espanaensis ΔBN6_77230 und S. espanaensis ΔBN6_79710 eingesetzt. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Inaktivierung des jeweiligen Gens erfolgreich war. Die erhaltenen Mutanten und der S. espanaensis-Wildtyp wurden in SPY-Medium für 4 Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Anschließend wurden die Kulturen, wie unter 3.10.1.1 beschrieben, extrahiert. 100
Ergebnisse
Produktionsanalyse der Mutante Saccharothrix espanaensis ΔBN6_01860 Das Gen BN6_01860 ist homolog zu den Enzymen AAT1 aus Azospirillum brasilense und ArAT-II aus Thermococcus litoralis, die beide eine aromatische Aminotransferase-Funktion besitzen. In S. espanaensis sollte dieses Genprodukt den ersten Schritt der Indole-3-Carbonsäure-Biosynthese katalysieren. Es könnte ebenfalls an der Biosynthese von PAA beteiligt sein (siehe 4.4.3.2 und 4.4.3.3).
Die nach Extraktion erhaltenen Rohextrakte der Mutante S. espanaensis ΔBN6_01860 und des Wildtyp- Stamm wurden mittels HPLC/MS mit der Methode Tanja7 analysiert. In der Mutante wird anscheinbar kein ICA mehrgebildet. Weiterhin ist in dem HPLC-Chromatogramm der Mutanten der Peak bei 18,5 min kleiner. Dabei handelt es sich um BA und PAA. Die HPLC-Chromatogramme sind nachfolgend in Abbildung 4.15 dargestellt. Die Peaks treten im Vergleich zu dem in Abbildung 4.11 gezeigten Chromatogramm ca. 4,3 min später auf. Die Verschiebung der Retentionszeiten könnte auf die Wartung des HPLC/MS-Geräts und eine Änderung der Fluss-Rate zurückgeführt werden.
Abbildung 4.15 HPLC-Chromatogramm (λ= 254 nm) des Rohextrakts von S. espanaensis ΔBN6_01860 (a) im Vergleich zu dem Rohextrakt von S. espanaensis-Wildtyp nach Kultivierung in SPY/ScCl3 für 4 Tage. Die Chromatogramme zeigen, dass der Peak bei 18,5 min (blau), welcher sich beim Wildtyp um BA und PAA handelt, in der Mutante kleiner ist. Bei dem Peak bei 18 min (gelb) handelt es sich bei dem Wildtyp um ICA und ist ebenfalls in der Mutante als im Wildtyp kleiner geworden.
Produktionsanalyse der Mutante Saccharothrix espanaensis ΔBN6_67950 Der Datenbankvergleich zeigt, dass das Gen BN6_67950 homolog zu Cinnamoyl-CoA- Hydratase/Dehydrogenase (PhCHD) von Petunia hybrida ist. Die Cinnamoyl-CoA- Hydratase/Dehydrogenase katalysiert die Umsetzung von Cinnamoyl-CoA zu β-Ketoacyl-Propionyl- CoA während der BA-Biosynthese. Das Gen BN6_67950 wird bei Kultivierung im SPY-Medium, in dem BA detektierbar ist, hochreguliert. Um die Beteiligung dieses Gens an der BA-Biosynthese zu bestätigen, wurde die Mutante S. espanaensis ΔBN6_67950 wie unter 4.4.4.1 beschrieben generiert. Die
101
Ergebnisse
Produktionsanalyse der Rohextrakte der Mutante und des Wildtyps erfolgte durch HPLC/MS. In Abbildung 4.16 sind die erhaltenen Chromatogramme dargestellt. Die Chromatogramme zeigen, dass der Peak bei 18,5 min in der Mutante kleiner ist als im Wildtyp. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass BN6_67950 in der Biosynthese von BA involviert ist.
Abbildung 4.16 HPLC-Chromatogramm (λ= 254 nm) des Rohextrakts von S. espanaensis ΔBN6_67950 (a) und (b) im Vergleich zu dem Rohextrakt von S. espanaensis-Wildtyp nach Kultivierung in SPY/ScCl3 für 4 Tage (c). Die Chromatogramme zeigen, dass der Peak bei 18,5 min (blau), bei welchem es sich um Wildtyp um BA und PAA handelt, ist in der Mutante kleiner ist.
Produktionsanalyse der Mutante Saccharothrix espanaensis ΔBN6_77230 und Saccharothrix espanaensis ΔBN6_75400 Durch BLASTp- und Transkriptomanalysen wurde gezeigt, dass das Produkt des Gens BN6_77230 eines von sieben Genprodukten ist, die wahrscheinlich die Umsetzung von Benzaldehyd-CoA zu BA katalysieren. Das Genprodukt von BN6_77230 weist eine Homologie zu der Benzaldehyddehydrogenase II aus Acinetobacter calcoaceticus und zu BALDH aus Antirrhinum majus auf, welche an der BA-Biosynthese in beiden erwähnten Stämmen beteiligt sind. Weiterhin teilt BN6_77230 Homologie mit PadA aus E. coli, welches eine Phenylacetaldehyddehydrogenase Aktivität besitzt und an der Biosynthese von PAA beteiligt ist. Das Gen BN6_77230 ist im SPY-Medium hochreguliert. Die Inaktivierung dieses Gens wurde wie unter 4.4.4.1 beschrieben durchgeführt und die Mutante S. espanaensis ΔBN6_77230 wurde erhalten. Die Produktionsanlyse der Mutante erfolgte mittels HPLC/MS, durch Vergleich der Rohextrakte der Mutante und des Wildtyps. Die erhaltenen Chromatogramme sind identisch und es ist kein Unterschied in dem Peak bei 18,5 min, bei welchem es sich um BA und PAA handelt, zu erkennen (siehe Abbildung 4.17). Da die Funktion von BN6_77230 von anderem Enzym übernommen werden könnte, kann die Beteiligung von BN6_77230 an der Biosynthese der BA nicht ausgeschlossen werden. Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten nach der
102
Ergebnisse
Inaktivierung von BN6_75400, welches für eine Histidin-Ammonia-Lyase kodiert und an der Biosynthese von BA beteiligt sein könnte. Da es kein Unterschied in der HPLC-Chromatogramme zu finden ist, konnte die Bildung von BA festgelegen werden. Das könnte über die Übernahme von BN6_75400-Aktivitä von einem anderen Enzym geklärt werden. Deshalb könnte wie bei BN6_77230 die Beteiligung von BN6_75400 an der Biosynthese von BA ausgeschlossen werden.
Abbildung 4.17 HPLC-Chromatogramm (λ= 254 nm) des Rohextrakts von S. espanaensis ΔBN6_77230 (a) und (b) im Vergleich zu dem Rohextrakt von S. espanaensis-Wildtyp nach Kultivierung in SPY/ScCl3 für 4 Tage. Die Chromatogramme sind identisch.
Produktionsanalyse der Mutante Saccharothrix espanaensis ΔBN6_79710 Das Gen BN6_79710 zeigt in seiner Aminosäuresequenz eine Homologie zu ArAT-II aus Thermococcus litoralis, welches für die Deaminierung der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan verantwortlich ist. Da das Gen BN6_79710 im SPY-Medium hochreguliert ist, wurde angenommen, dass dieses Gen während der Biosynthese der PAA L-Phenylalanin zu Phenylacetaldehyd umsetzen kann. Um die Beteiligung des Gens BN6_79710 an der PAA-Biosynthese zu untersuchen, wurde das Gen wie unter 4.4.4.1 beschrieben inaktiviert. Die generierte Mutante S. espanaensis ΔBN6_79710 wurde mittels HPLC/MS analysiert. In Abbildung 4.18 sind die erhaltenen Chromatogramme dargestellt, wobei kein Unterschied zwischen dem Rohextrakt der Mutante und den Rohextrakt des Wildtyps zu erkennen ist. Demzufolge konnte die Beteiligung von BN6_79710 an dem Abbau von L- Phenylalanin während der PAA-Biosynthese nicht nachgewiesen werden.
103
Ergebnisse
Abbildung 4.18 HPLC-Chromatogramm (λ= 254 nm) des Rohextrakts von S. espanaensis ΔBN6_79710 (a) und (b) im Vergleich zu dem Rohextrakt von S. espanaensis-Wildtyp nach Kultivierung in SPY/ScCl3 für 4 Tage. Die Chromatogramme sind identisch.
Untersuchung der Genexpression in Saccharothrix espanaensis
4.5.1 Untersuchung der Transkription der gesamten Gene aus Saccharothrix espanaensis mithilfe von RNA-Sequenzierung
RNA-Sequenzierung der Gesamt-RNA von Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in SPY- und GYM-Medium Die Kultivierung von S. espanaensis in SPY-Medium führte zur Produktion neuer Substanzen, die in GYM-Medium, sowie in anderen Medien nicht, oder nur in einer geringen Konzentration, produzierbar sind. Um den Einfluss des SPY-Mediums auf das Metabolitenprofil des Stamms genauer zu untersuchen, sollten die Gene, die in beiden Medien wesentlich unterschiedlich transkribiert sind, identifiziert werden. Hierfür wurde eine RNA-Sequenzierung von S. espanaensis nach Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium durchgeführt. Die RNA-Isolierung, sowie die Sequenzierung wurden von der Firma Vertis Biotechnologie AG (siehe 3.9.10) durchgeführt. Die erhaltenen 100-250 bp langen cDNA-Sequenzen (Reads) wurden von Dr. Bogdan Tokovenko mithilfe verschiedener bioinformatischer Programme analysiert. Diese Ergebnisse von Mapping und statistischer Quantifizierung sind in Tabelle 4.17 aufgelistet. Die RNA-Sequenzierung ergab nach Filtrierung 24783787 Reads nach Kultivierung in GYM-Medium bzw. 22436284 Reads in SPY-Medium. 96,2 % (GYM-Medium) bzw. 94,51 % (SPY-Medium) der Reads konnten dem Genom von S. espanaensis zugeordnet werden (Mapped to reference). Hiervon wurden 20,21 % bzw. 16,23 % als rDNA Abschnitte nach Kultivierung in GYM- bzw. SPY-Medium identifiziert (Mapped to rDNA). Von den 8427 Genen des Genoms wurden insgesamt 8211 (GYM-Medium) bzw. 8049 (SPY-Medium) Gene kartiert (Non- zero read genes).
104
Ergebnisse
Tabelle 4.17 RNA-Seq Read-Mapping und statistische Quantifizierung. Die RNA-Seq S. espanaensis-Wildtyp wurde ncah Kultivierung in SPY- und nach Kultivierung in GYM-Medium durchgeführt.
Analyse GYM-Medium SPY-Medium
Reads nach Filtrierung 24783787 224362840
Zugeordnete Reads (mapped to 23841984 (96,2 %) 21203492 (94,51 %) reference)
Nicht zuzuordnende Reads (failed to 941803 (3,8 %) 1232792 (5,49 %) map)
Zugeordnet zu rDNA (mapped to 5007848 (20,21 %) 3640709 (16,23 %) rDNA)
Zugeordnet insgesamt (Total mapped, 18834136 (75,99 %) 17562783 (78,28 %) w/o rDNA)
Gene mit mindestens ein Read (Non- 8211 8049 zero read genes (of 8427))
Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene von Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium Die durch RNA-Seq erhaltenen Sequenzen wurden mit den 8427 Genen des Genoms von S. espanaensis abgeglichen und die Expressionsrate der Gene ermittelt. Die Gene wurden anhand der möglichen Funktionen der entsprechenden Proteine den COG (Cluster of orthologous group) zugeordnet. Diese beschreiben verschiedene Prozesse der Bakterienzelle z. B. Stoffwechsel und Transport, Informationsspeicherung und –Verarbeitung, zelluläre Prozesse und Signalverarbeitung. In Abbildung 4.19 sind die Ergebnisse der COG-Verteilung der Gene dargestellt, die im SPY-Medium im Vergleich zum GYM-Medium unterschiedlich reguliert sind. Hierzu wurden nur die Gene, die mehr als zweifach hoch- oder herunterreguliert sind, in die Analyse einbezogen. Ein hoher Prozentsatz der Gene, die zu den COG Kategorien „Coenzym-Transport und Stoffwechsel“, „Energieproduktion und Umsetzung“, „Nukleotid-Transport und Stoffwechsel“ und „Translation, ribosomale Struktur und Biogenese“ gehören, sind hochreguliert, während vor allem Gene der Kategorien „Signal- Transduktionsmechanismus“ und „Abwehrmechanismus“ herunterreguliert sind. Weiterhin ist eine hohe Prozentzahl der Gene, die zur Sekundärmetabolit-Biosynthese-Gruppe gehören, herunterreguliert.
105
Ergebnisse
Abbildung 4.19 COG-Verteilung der Gene aus S. espanaensis, die im SPY-Medium im Vergleich zum GYM- Medium unterschiedlich reguliert sind. Der Anteil der Gene einer COG-Gruppe wird als Prozent der Gesamtzahl der differentiell regulierten Gene gezeigt. Graue Balken zeigen die runterregulierten Gene, die schwarzen Balken zeigen die hochregulierten Gene. i ist der Anteil der regulierte Gene, die zur Informationsspeicherungs-Kategorie gehören. ii ist der Anteil der regulierten Gene, die zu zellulären Prozesse und zur Signalverarbeitung gehören. iii ist der Anteil der Gene, die schwach charakterisiert sind. iv ist der Anteil der Gene, die zum Transport und Stoffwechsel gehören.
Die Transkriptomanalyse zeigte, dass 99 Gene mehr als 100 fach im GYM-Medium hochexprimiert sind, während nur 10 Gene im SPY-Medium eine Hochregulierungsfaktor von über 100 haben. Weiterhin wurden insgesamt 8301 Gene zumindest in einem der Medien nicht transkribiert und 3596 Gene sind in beiden Medien weniger als 2 fach hoch- oder herunterreguliert. 873 Gene im GYM- Medium und 558 Gene im SPY Medium wurden 5-100 fach überexprimiert.
Tabelle 4.18 Transkriptionsanalyse der Gene von S. espanaensis nach Kultivierung in zwei verschiedenen Medien.
Zahl der überexprimierten Gene Zahl der überexprimierten Gene Überexpressionsfaktor im GYM-Medium im SPY-Medium
99 10 > 100
442 182 < 100 to > 10
431 376 < 10 to > 5
1324 1499 < 5 to > 2
3596 < 2 to > 2
Gene, die nur in einem Medium 252 90 transkribiert sind
106
Ergebnisse
Unter den im GYM-Medium stark hochregulierten Genen sind acht Proteasen/Peptidasen, sechs Chitinase/Chitin-Bindungsdomänen, vier Sekretionsproteine und neun für Transporter kodierende Gene.
Unter den im SPY-Medium überexprimierten Genen kodieren zwei für Ribonukleosiddiphosphat- Reduktasen und je eines für eine Superoxiddismutase, eine Epoxid-Hydrolase, einen Exporter einen Lysin-Exporter und eine Sulfid-Quinon-Reduktase. In der Tabelle 4.19 sind die 10 meist überexprimierten Gene in jedem Medium mit der putativen Funktion deren Proteine und deren Überexpressionsfaktor (Fold change) aufgelistet.
Tabelle 4.19 Die meist überexprimierte Gene aus S. espanaensis nach Kultivierung in GYM- oder in SPY-Medium
Überexprimierte Gene im GYM-Medium Überexprimierte Gene im SPY medium
Putative Funktion des Fold Putative Funktion des Fold Gene ID Gene ID kodierten Protein change kodierten Protein change
Mn-abhängige BN6_60890 Sekretion Protein 2046 BN6_05370 702 Superoxid-Dismutase,
Mikrosomale Epoxid- BN6_64430 Chitin-Bindungsdomäne 1718 BN6_28080 403 Hydrolase
BN6_60880 Sekretionsprotein 1589 BN6_28110 Transposase 338
Elongationsfactor BN6_30060 Hypothetisches Protein 1562 BN6_28100 331 GreAB
α/β-Hydrolase-Falten FAD-abhängige BN6_46130 1497 BN6_28120 307 enthaltenes Protein Oxidoreductase
Peptidase S8/S53, Ribonukleosid- BN6_31430 1328 BN6_49230 218 Subtisilin/Kexin Sedolisin diphosphat-Reduktase
MFS-Transporter Arabinose- Sulfid-Quinon- BN6_43590 1306 BN6_26530 191 Efflux Permease Reduktase
Hydroxymethylglutaryl-CoA- NADPH-abhängige BN6_46200 1060 BN6_33060 140 Synthase FMN-Reduktase
BN6_68630 Zn-Carboxypeptidase 1048 BN6_68170 Lysin-Exporter-Protein 134
Ribonucleosid- BN6_60900 Ferredoxin 1013 BN6_49240 127 diphosphat-Reduktase
Transkriptomanalyse der putativen Biosynthesegencluster aus Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in GYM- und in SPY-Medium Das Genom von S. espanaensis wurde bereits vollständig sequenziert und von T. Strobel im Laufe ihrer Dissertation analysiert. Die Analyse ergab, dass das Genom neben dem Saccharomicin-Gencluster noch 25 weitere putative Sekundärmetabolit-Biosynthesegencluster trägt. Davon sind sieben tpc-Cluster, zwei lan-Cluster, ein mel-Cluster, eine Aminocyclitol-Cluster und 14 PKS-, NRPS- und PKS/NRPS- 107
Ergebnisse
Hybrid-Cluster [35]. Unter verschiedene Laborbedingungen ist S. espanaensis nicht in der Lage, die Metaboliten dieser Cluster zu produzieren. Mithilfe der durch RNA-Seq-Analyse erhaltenen Daten wurde die Transkription der einzelnen Gene der 26 Gencluster in beiden Medien untersucht. Dabei wurden die Gene mit einem RPKM-Wert unter 100 als nicht transkribiert bewertet.
Die Transkriptionsanalyse des Saccharomicin-Genclusters ergab, dass im SPY-Medium nur sieben der 38 Gene transkribiert werden, während im GYM-Medium sogar nur vier Gene transkribiert vorliegen (siehe Tabelle 7.1). Dies zeigt, dass die Saccharomicine in diesen zwei Medien nicht produziert werden. Die weitere Analyse der anderen Cluster ergab, dass acht Cluster in GYM-Medium (lan1-Cluster, mel- Cluster, Aminocyclitol-Cluster, Cluster1, Cluster4, tcp1, tcp4 und tcp6) und acht Cluster in SPY- Medium (lan1-Cluster, mel-Cluster, Aminocyclitol-Cluster, Cluster1, Cluster 12, tcp1, tcp4, tcp6 und tcp7) überhaupt nicht transkribiert werden. Weiterhin gibt es in jedem Gencluster mindestens ein Gen in einem der beiden Medien, das nicht transkribiert wird.
Während 31 der 41 Gene aus dem PKS/NRPS Cluster8 im GYM-Medium transkribiert und signifikant hochreguliert werden, sind davon nur fünf Gene im SPY-Medium mit einer RPKM über 100 transkribiert. Im GYM-Medium haben weitere 10 Gene einen RPKM-Wert zwischen 11 und 94, während im SPY-Medium 29 Gene eine RPKM von 1 bis 25 besitzen und neun Gene wurden „0“ transkribiert. Das Gen BN6_46130, welches für ein putatives α/β-Hydrolase-Falten enthaltenes Protein kodiert, wurde ca. 1500 fach hochreguliert und hat eine RPKM-Wert von 173739 im GYM-Medium (nur ein Teil des Balkens ist in Abbildung 4.20 gezeigt) im Vergleich zu 116 im SPY-Medium. Das Gen BN6_46080, welches für eine Aminotransferase kodieren soll, ist ebenfalls im GYM-Medium 810 fach häufiger exprimiert. In Abbildung 4.20 ist der Unterschied zwischen der Transkription dieses Clusters in den beiden Medien dargestellt.
Die Transkriptionsanalyse der weiteren Gencluster in den beiden Medien ist in Tabelle 7.1 gezeigt.
108
Ergebnisse
8000 7000 6000 5000 4000
RPKM 3000 2000 1000
0
BN6_46000 BN6_46100 BN6_45860 BN6_45870 BN6_45880 BN6_45890 BN6_45910 BN6_45920 BN6_45930 BN6_45940 BN6_45950 BN6_45960 BN6_45970 BN6_45980 BN6_45990 BN6_46010 BN6_46020 BN6_46030 BN6_46040 BN6_46050 BN6_46060 BN6_46070 BN6_46070 BN6_46080 BN6_46090 BN6_46110 BN6_46120 BN6_46130 BN6_46140 BN6_46150 BN6_46160 BN6_46170 BN6_46180 BN6_46190 BN6_46200 BN6_46210 BN6_46220 BN6_46240 BN6_46250 BN6_46260 GYM SPY
Abbildung 4.20 Die Transkription der einzelnen Gene von Cluster 8 aus S. espanaensis nach Kultivierung im GYM-Medium (grau) und im SPY-Medium (schwarz).
4.5.2 Untersuchung der Transkription verschiedener Gene aus Saccharothrix espanaensis durch Reportergensysteme
Erstellung von S. espanaensis x pGUS x PSam5-6, S. espanaensis x pGUS x P78320, S. espanaensis x pGUS x P07730, S. espanaensis x pGUS x P01860 und S. espanaensis x pGUS x P68440 Der jeweilige Promotorbereich der Gene BN6_58670 (sam6), BN6_78320, BN6_07730, BN6_01860 und BN6_68440 aus dem Genom von S. espanaensis wurde wie unter 3.9.11.6 beschrieben kloniert. Die einzelnen erhaltenen Plasmide, sowie das Plasmid pGUS, wurden mittels intergenerischer Konjugation in S. espanaensis-Wildtyp eingebracht (siehe 3.8.8). Die Plasmide sollten in das Genom von S. espanaensis integriert werden. Da das Plasmid pGUS Apramycin- und Spectinomycinresistenzgene enthält, wurden die Exkonjuganden auf apramycin- und spectinomycinhaltigen Platten selektiert. Anschließend wurden die resultierenden Mutanten bis zur stationären Phase in TSB-, SPY- bzw. GYM- Medium angezogen und sowohl mit dem X-Gluc Test als auch mit dem Gus-Assay vermessen.
Überprüfung der Aktivität des Promotors PSam5-6 mittels X-Gluc-Test Die wie unter 4.5.2.1 beschrieben erhaltenen S. espanaensis x pGUS x Psam5-6 und S. espanaensis x pGUS-Exkonjuganden wurden auf apramycinhaltigen TSB-Agarplatten gepickt und für 48 h bei 28 °C inkubiert. Anschließend wurde die X-Gluc-Lösung wie unter 3.12.1 beschrieben auf die Platte gegeben. Sowohl die Kolonien der S. espanaensis x pGUS x PSam5-6-Mutante als auch die Kolonien der S. espanaensis x pGUS Mutante färbten sich nach 6 stündiger Inkubation bei 28 °C blau. Damit ist die blaue Farbe des X-Gluc-Tests alleine kein Indikator dafür, dass der Promotor PSam5-6 aktiv ist.
109
Ergebnisse
4.5.3 Quantitative Messung der Aktivität von den Promotoren P01860, P68840, P78320 und PSam5-6 Um die Ergebnisse der RNA-Seq-Analyse über die Transkriptionsunterschiede der Gene aus S. espanaensis im GYM- und SPY-Medium zu bestätigen, wurde die Aktivität der Promotoren verschiedener Gene durch das GUS-Reportergensystem gemessen. Das Gen BN6_58670 liegt in dem sam-Gencluster und wurde von M. Berner sam6 benannt [34]. Dessen Promtor wurde in dieser Arbeit als PSam5-6 gezeichnet. Die Gene BN6_01860, BN6_68440 und BN6_78320, deren Genprodukte an der Biosynthese von ICA, PAA, BA bzw. AA beteiligt sein könnten, wurden ausgewählt um deren Transkription im GYM- und im SPY-Medium zu untersuchen. Hierfür wurden die Promotorbereiche der oben genannten Gene wie unter 4.5.2.1 beschrieben in das pGUS-Plasmid, welches das Gen gusA ohne Promotor enthält, kloniert und über intergenerische Konjugation in S. espanaensis eingebracht. Die erhaltenen Mutanten wurden jeweils in SPY- und in GYM-Medium für 4 Tage kultiviert. Die Pellets von 30 mL Kulturen wurden durch die Frenchpress aufgeschlossen und für das GUS-Assay, wie unter 3.12.2 beschrieben, vorbereitet. Die Zellpellets von 10 mL Kultur wurde verwendet, um die Trockenmasse zu bestimmen. Die Aktivität der Promotoren wurde über die Enzymaktivität des GUS- Proteins ermittelt, wobei die Absorption des gespaltenen p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronid-Substrats bei
415 nm photometrisch gemessen wurde (siehe 3.12.2). Die Promotorstärke wurde in U/g über die folgende Gleichung berechnet.
20 x A415/min U/g = 14 x 3 x W40ml
Die GUS-Assay Ergebnisse sind zusammen mit den Transkriptomanalyse-Ergebnissen in der Tabelle 4.20 aufgelistet.
Tabelle 4.20 Die Ergebnisse des GUS-Assays von vier Promotoren von S. espanaensis. Aufgelistet sind die Mittelwerte der GUS-Aktivität in U/g dreier Messungen.
Promotor GUS-Aktivität GUS-Aktivität RPKM in GYM- RPKM in SPY- in GYM in SPY Medium Medium
RPSam5-6 0,005 0,025 33 43
P78320 0,300 2,614355 377 6757
P01860 1,902767 2,971333 575 3011
P68440 1,933333 3,128667 1554 3231
PGUS 0,0177 0,0178 - -
Diese Analyse ergab, dass die Transkriptionsrate der drei Gene BN6_01860, BN6_68440 und BN6_78320, wie bei der RNA-Seq-Analyse, im SPY-Medium höher ist als im GYM-Medium. Das Gen
110
Ergebnisse
BN6_58670 (sam6) wird weder im GYM- noch im SPY-Medium transkribiert. In Abbildung 4.21 sind die erhaltenen Ergebnisse als Chromatogramme dargestellt.
4
3
2
1 GUS activity in U/g in activity GUS
0 PSam5-6 P78320 P01860 P68440 PGUS
GUS-Aktivität in GYM GUS-Aktivität in SPY
Abbildung 4.21 Grafische Darstellung der Promotorstärken in S. espanaensis. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen dreier unabhängigen Messungen.
Saccharothrix espanaensis als Biotransformationswirt von Alizarin A. Linnenbrink hat im Laufe seiner Doktorarbeit bewiesen, dass S. espanaensis eine Biotransformationsaktivität besitzt. Durch Fütterungsexperimente konnte gezeigt werden, dass dieser Stamm Xenobiotika wie Alizarin und Emodin aufnehmen und O-glycosidisch mit L-Rahmnose verknüpfen kann [31]. Weiterhin haben Strobel et al. bewiesen, dass die Glycosyltransferase Ses60310, welche durch das Gen BN6_60310 kodiert wird, für die Rhamnosylierung verantwortlich ist [30]. Um die Expression dieses Glycosyltransferasegens nach Zugabe von Alizarin zu untersuchen, wurde ein RNA-Seq von dem Genom des Wildtyps sowie des mit Alizarin gefütterten S. espanaensis-Stamms durchgeführt. Hierzu wurden 2 mL einer Vorkultur von S. espanaensis Wildtyp verwendet um 150 mL HA-Medium in einem 500 mL-Erlenmyerkolben mit Schikane und Metallspirale zu beimpfen. Nach 24 h Inkubation bei 28 °C wurden 20 µL einer Alizarinlösung (25 mg/mL in DMSO) zugegeben. Nach 12 Stunden wurde diese Zugabe wiederholt und die Kulturen weiter inkubiert. Anschließend wurden die Kulturen abzentrifugiert (5000 rpm, 10 min, RT) und das Pellet bei -80 °C gelagert (siehe 3.9.10). Mithilfe von HPLC/MS wurde die Biotransformationsaktivität erfasst, um den Zeitpunkt der RNA- Isolierung zu bestimmen.
4.6.1 RNA-Sequenzierung der Gesamt-RNA von Saccharothrix espanaensis mit und ohne Zugabe von Alizarin Um den Einfluss von Alizarin auf die Expression des Glycosyltransferasegens BN6_60310, sowie auf die Expression der gesamten Gene zu untersuchen, wurde eine RNA-Seq durchgeführt. Die RNA- Isolierung und die RNA-Sequenzierung wurden von der Firma Vertis Biotechnologie AG (siehe 3.9.10)
111
Ergebnisse ausgeführt. Dr. Bogdan Tokovenko hat die erhaltenen cDNA-Sequenzen (Reads) mithilfe verschiedener Computerprogramme mit der Genomsequenz von S. espanaensis abgeglichen und eine detaillierte Tabelle über die Transkription der 8427 Gene von S. espanaensis, gegeben in RPKM, erstellt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 4.21 aufgelistet. Die RNA-Sequenzierung ergab nach Filtrierung 9785074 Reads ohne Zugabe von Alizarin bzw. 787657 Reads nach Zugabe von Alizarin. 94,94 % (ohne Alizarin) bzw. 95,30 % (mit Alizarin) der Reads konnten dem Genom von S. espanaensis zugeordnet werden (Mapped to reference). Davon sind 0,23 % bzw. 0,26 % rRNA-Abschnitte (rRNA reads).
Tabelle 4.21 RNA-Seq Read-Mapping und Quantifizierung. Die RNA-Seq des S. espanaensis-Wildtyps ohne und mit Zufütterung von Alizarin.
Analyse Wildtyp Wildtyp mit Alizarin Gesamte Reads 10331843 8286716 Zugeordnete Reads 9808904 (94,94 %) 7897296 (95,30 %) (Mapped to reference) Nicht zuzuordnende Reads 522939 (5,06 %) 389420 (4,70 %) (Failed to map) rRNA Reads 23830 (0,23 %) 21639 (0,26 %) Genau zugeordnet (True mapped) 9785074 (94,71 %) 7875657 (95,04 %)
Die RNA-Seq-Analyse zeigt, dass das Gen BN6_60310, welches für die Ses60310-Glycosytransferase kodiert und für die Biotransformationsaktivität verantwortlich ist, nach Zugabe von Alizarin leicht herunterreguliert wird (RPKM-Werte mit und ohne Zugabe von Alizarin betragen 177 bzw. 212).
Die 8427 Gene des S. espanaensis-Genoms wurden nach der möglichen Funktion der entsprechenden Proteine den verschiedenen COG-Kategorien zugeordnet. Damit konnte gezeigt werden, wie die unterschiedlich exprimierten Gene in den verschiedenen Prozessen der Bakterienzelle involviert sind. In Abbildung 4.22 sind die Ergebnisse der COG-Verteilung der Gene dargestellt, die nach Zugabe von Alizarin unterschiedlich reguliert sind. Es wurden nur die Gene, die mehr als zweifach hoch- oder herunterreguliert sind, in die Analyse einbezogen.
112
Ergebnisse
Abbildung 4.22 COG-Verteilung der Gene aus S. espanaensis, die nach Zugabe von Alizarin unterschiedlich reguliert sind. Der Anteil von Genen einer COG-Gruppe wird als Prozent der Gesamtzahl von differentiell regulierten Gene gezeigt. Graue Balken zeigen die runterregulierten Genen, die schwarzen Balken zeigen die hochregulierten Gene. i ist der Anteil der regulierte Gene, die zur Informationsspeicherung-Kategorie gehören. ii ist der Anteil der regulierten Gen, die zur zelluläre Prozesse und Signalverarbeitung gehören. iii ist der Anteil der Gene, die keiner anderen Kategorie zugeordnet werden konnte. iv ist der Anteil der Gene, die zum Transport und Stoffwechsel gehören.
Die Transkriptionsanalyse zeigte, dass nach Zugabe von Alizarin mehr Gene herunterreguliert werden. Davon sind 29 Gene mehr als 10 fach herunterreguliert, während nur drei Gene mehr als 10 fach hochreguliert werden. Weiterhin werden 37 Gene mit einem Faktor von 5-10 hochreguliert und 60 Gene herunterreguliert. Die Anzahl der unterschiedlich regulierten Gene nach Zugabe von Alizarin sind in Tabelle 4.22 dargestellt
Tabelle 4.22 Anzahl hoch bzw. herrunterregulierter Gene von S. espanaensis nach Zugabe von Alizarin.
Anzahl der hochregulierten Anzahl der runterregulierten Expressionsfaktor Gene Gene
3 29 > 10
37 60 < 10 bis > 5
431 651 < 5 bis > 2
113
Ergebnisse
Unter den signifikant hochregulierten Genen sind neben den Genen, die für hypothetische Proteine kodieren, Gene, die für eine Uricase, zwei Chaperonine, zwei Isopropylmalat-Hydratasen, eine Malat- Synthase und eine Allantoinase kodieren.
Table 4.1 Die signifikant hochregulierten Gene aus S. espanaensis nach Zugabe von Alizarin.
RPKM ohne RPKM nach Putative Funktion des Gen-ID Zugabe von Zugabe von Faktor kodierten Proteins Alizarin Alizarin
BN6_71160 Uricase 428 4736 11
BN6_04740 60 kDa Chaperonin1 5490 55234 10
3-Isopropylmalat-dehydratase BN6_71880 280 2681 10 kleine Untereinheit
BN6_77110 NmrA-Familie Protein 16 148 9
BN6_71120 Allantoicase 255 2312 9
Transkriptionsregulator, IcIR- BN6_71230 84 619 7 Familie
BN6_71220 Malat-Synthase 442 3218 7
BN6_71130 Allantoinase 338 2101 6
3-Isopropylmalat-dehydratase BN6_71890 456 3020 große Untereinheit
Unter den signifikant herunterregulierten Genen sind Gene, die für Proteine kodieren, die u. a. an dem Stickstoff-Metabolismus beteiligt sind wie z. B. ein Ammoniak-Kanal, ein Stickstoff-Regulatorprotein p-II, eine Amidase, eine Uridyltransferase. In Tabelle 4.23 sind die nach Zugabe von Alizarin signifikant herunterregulierten Gene mit den putativen Funktionen, deren Transkriptionsrate, sowie der Faktor der Herrunterreglierungsfaktor dargestellt.
Tabelle 4.23 Die signifikant runterregulierten Gene in S. espanaensis nach Zugabe von Alizarin.
RPKM ohne RPKM nach Putaive Funktion des kodierten Gen-ID Zugabe von Zugabe von Faktor Proteins Alizarin Alizarin
BN6_71100 Ammoniak-Kanal 37833 817 46
BN6_71090 Stickstoff-Regulatorprotein p-II 17846 415 43
BN6_71080 Uridylyltransferase 12444 24234 37
BN6_10060 Glutamin-Synthase 1 60124 6451 9
BN6_10790 Kurzkettig Dehydrogenase/Reduktase 111 3 33
BN6_10780 Hypothetisches Protein 185 17 11
114
Ergebnisse
BN6_10770 Hypothetisches Protein 299 18 17
BN6_10760 Amidase 203 9 23
Adenosylmethionine-8-Amino-7- BN6_10750 1780 133 13 oxononanoatetransaminase
Gamma-Aminobutyraldehyde BN6_10730 1022 79 13 dehydrogenase
BN6_15160 Carbonat-Transporter 525 29 18
Die Transkriptionsanalyse der Gene der putativen Sekundärmetabilolit-Biosynthesecluster mit und ohne Zugabe von Alizarin zeigte, dass es in allen Genclustern außer in den Terpenclustern tcp1, 2, und 3 Gene gibt, die nicht transkribiert werden. Dadurch wird angenommen, dass die Cluster unter den untersuchten Bedingungen nicht transkribiert werden.
115
Ergebnisse
Untersuchung zur Biosynthese von Rishirilid B Die Rishirilide A und B sind Polyketide und werden über eine Polyketidsynthase Typ II synthetisiert. Sie wurden erstmals aus Streptomyces rishiriensis isoliert [110]. M. Arnold konnte im Rahmen seiner Doktorarbeit zeigen, dass auch das Genom des Stamms Streptomyces bottropensis Gö C4/4 das Biosynthesegencluster der Rishirilide enthält [111]. Durch Untersuchung der erstellten Cosmidbank aus Streptomyces bottropensis konnte A. Linnenbrink das Biosynthesegencluster der Rishirilide auf dem Cosmid 4 identifizieren [31]. X. Yan konnte durch heterologe Expression des Cosmids cos4 im Wirtstamm S. albus Rishirilid B detektieren. Dadurch konnte er bestätigen, dass das cos4 das Biosynthesegencluster von Rishirilid trägt [114]. Durch Geninaktivierungsexperimente, die von X. Yan und J. Wunsch-Palasis durchgeführt wurden, konnte bereits eine Biosynthese von Rishirilid B postuliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Intermediat JW-1, welches von der Mutante S. albus x cos4ΔrslO8 produziert wurde, isoliert und dessen Struktur aufgeklärt. Die erhaltene Struktur wurde von T. Heitzler, C. Zuo und J. Derochefort [29], [117], [118] verwendet, um weitere Aussagen über den Biosyntheseweg zu treffen.
4.7.1 Die NADPH:Chinonreduktase RslO8
Analyse der Aminosäuresequenz der NADPH:Chinonreduktase RslO8 J. Wunsch-Palasis konnte mittels BLASTp-Analyse zeigen, dass RslO8 Homologie zu Grho7 aus dem Griseorhodin-Gencluster [214] und zu ActVI-Orf2 aus dem Actinorhodin-Gencluster [215] aufweist. Diese Enzyme besitzen eine NADPH:Chinonreduktase-Aktivität. In der Biosynthese von Actinorhodin wurde bewiesen, dass ActVI-Orf2 zusammen mit ActVI-Orf4 eine stereospezifische 1,4-Reduktion an C15 katalysiert. Dies wurde durch die Inaktivierung von actVI-Orf2, welche zur Produktion von 4- Dihydro-9-hydroxy-1-methyl-10-oxo-3-H-naptho-[2,3-c]-pyran-3-S-Essigsäure ((S)-DNPA) führte, bestätigt [215], [216]. Weiterhin teilt RslO8 Homologie mit der NADPH:Chinonreduktase MsnO9 aus dem Mensacarcin-Gencluster, die bei der Bestimmung der einzubauenden Acetateinheiten, und bei der Faltung der Polyketidkette beteiligt ist [217]. Um die genaue Funktion von RslO8 in der Biosynthese von Rishirilid B zu untersuchen, wurde das Gen rslO8 inaktiviert und die Struktur des produzierten Intermediates ermittelt.
Inaktivierung von rslO8 Um die genaue Funktion von RslO8 bei der Biosynthese von Rishirilid B zu untersuchen, wurde das Gen rslO8 ausgeschaltet. Im Laufe ihrer Doktorarbeit hat J. Wunsch-Palasis die Inaktivierung des Gens rslO8 auf dem Cosmid cos4 mittels RedET®-Technologie durchgeführt und somit die Mutante S. albus x cos4 ΔrslO8 erstellt. Anschließend wurden die drei Regulatorgene rslR1, rslR2 und rslR3 aus dem Rishirilid-Gencluster in der erhaltenen Mutante exprimiert. Dadurch wurde die Ausbeute des detektierten Intermediats deutlich erhöht [116].
116
Ergebnisse
Produktionsanalyse der Mutante Streptomyces albus x cos4 ΔrslO8 x pUWL-H- R1R2R3 Die Produktionsanalyse der Mutante S. albus x cos4 ΔrslO8 x pUWL-H-R1R2R3 ergab das Auftreten eines neuen Peaks, welcher als JW-1 bezeichnet wurde. Im negativen Modus konnte die Masse von m/z = 407,1 detektiert werden. Diese Masse wurde mittels hochauflösender MS-Analyse (Orbitrap, Saarbrücken), die von Dr. Thomas Paululat durchgeführt wurde, bestätigt. 3,8 mg von JW-1 wurden von J. Wunsch-Palasis aufgereinigt. Mit dieser Konzentration konnte aber die Struktur von JW-1 nicht geklärt werden, weshalb im Rahmen dieser Arbeit weitere Aufreinigungsexperimente durchgeführt wurden. Hierzu wurde die Mutante S. albus x cos4 ΔrslO8 x pUWL-H-R1R2R3 für fünf Tage in HA- Medium angezogen (siehe 2.8.2.1). Anschließend wurden die Kulturen, wie unter 3.10.1.1 beschrieben, mit 1N HCl auf pH 4 eingestellt, extrahiert und mittels HPLC/MS mit der Methode MENSO4R analysiert. Die Abbildung 4.23 zeigt die erhaltenen HPLC-Chromatogramme. Die Peaks von JW-1 und Rishirilid B treten ca. 2 min früher als bei der von J. Wunsch-Palasis erhaltenen Chromatogramme auf. Dies kann auf die Wartung der HPLC-Anlage und Änderung in der Flussrate zurückgeführt werden.
Abbildung 4.23 A. HPLC-Chromatogramme (λ=254 nm) der Rohextrakte der Mutanten (a) S. albus x pOJ436, (b) S. albus x cos4, (c) S. albus x cos4 ΔrslO8 x pUWL-H-R1R2R3. Die Mutante S. albus x cos4 ΔrslO8 x pUWL- H-R1R2R3 produziert kein Rishirilid mehr. Stattdessen wurde der neue Metabolit JW-1 als Peak bei 18,9 min detektiert. B. UV-Spektrum von JW-1 im Vergleich zum UV-Spektrum von Rishirilid B. C. MS-Spektrum im negativen Modus von JW-1. 117
Ergebnisse
Isolierung und Strukturaufklärung von JW-1 Um die Verbindung JW-1 aufzureinigen, wurden 3 L HA-Produktionskultur für fünf Tage bei 28 °C angezogen. Anschließend wurde die Kultur, wie unter 3.10.1.1 beschrieben, mit 1N HCl auf pH 4 eingestellt und extrahiert. Mittels SPE wurde der Rohextrakt fraktioniert (siehe 3.10.1.3). Aus den 90 %- und 100 %-SPE-Fraktionen wurde die Substanz JW-1 mittels Dünnschichtchromatographie weiter aufgereinigt (siehe 3.10.1.4). Da die Substanz JW-1 eine gelbe Farbe zeigt, wurde die entsprechende gelbe Bande aus der DC-Platte abgekratzt und viermal mit Methanol extrahiert (siehe 3.10.1.4). Der abschließende Reinigungsschritt wurde mithilfe der Sephadex-LH20-Säulenchromatographie durchgeführt. JW-1 weist hier allerdings keine gelbe sondern dunkelrote Farbe auf. Die dunkelrote Fraktion wurde mit einer Flussrate von durchschnittlich 0,4 mL/min eluiert (siehe 3.10.1.6). Auf diese Weise konnten ca. 15 mg JW-1 gewonnen werden. Die Kontrolle auf Vorhandensein der Substanz JW-1, sowie die Analyse des Reinheitsgrades erfolgten mittels analytischer HPLC/MS (siehe 3.10.2.2.1). Daraus ergab sich, dass JW-1 ein m/z-Wert von 407,1 [M-H]- im negativen Detektionsmodus. Die Strukturaufklärung von JW-1 wurde von Dr. Thomas Paululat an der Universität Siegen durchgeführt und ausgewertet (siehe 3.10.2.3). Hierfür wurden die Substanzen wie in Tabelle 3.36 beschrieben gelöst und vermessen. Es wurden 1H- und 13C-und 2D-NMR Experimente (1H/1H-COSY, 1H/13C-HMBC, ROESY) durchgeführt. Die Auswertung der NMR-Daten führte zu der in Abbildung 4.24 dargestellten Struktur. Die gemessenen NMR-Daten sind in Tabelle 4.24 angegeben.
Abbildung 4.24 Die durch NMR-Analyse erhaltene Struktur von JW-1, die von der Mutante S. albus x cos4ΔrslO8 x pUWL-H-R1R2R3 produziert wurde.
Tabelle 4.24 NMR-Daten von JW-1 gelöst in DMSO-d6. δH: 600 MHz, δc: 150 MHz Temperatur = 35° C. Schwache Signale sind in Klammern gesetzt.
1 13 a Pos δC [ppm] δH (J Hz) [ppm] COSY H, C-HMBC ROESY
1 159.4 4-H
1-OH 12.59 s
2 126.3 1-OH,12-H, 16-H
3 156.5 4-H, 16-H, 17-H3, 18-H3
118
Ergebnisse
4 115.8 7.72 s 16-H 16-H, 17-H3, 18-H3
4a 134.0 4-H
5 109.3 7.22 d (2.4) 7-H 7-H 7-H
6 166.0 5-H, 7-H
7 108.1 6.72 d (2.4) 5-H 5-H, 8-OH 5-H
8 164.4 7-H, 8-OH
8-OH 11.93 s
8a 108.9 5-H, 7-H, 8-OH
9 189.2 (4-H, 5-H)
9a 113.8 1-OH, 4-H
10 181.0 4-H, 5-H
10a 135.0 5-Hb
11 156.0 4-H, 12-H
12 105.0 6.42 d (2.1) 14-H 14-H 16-H, 17-H3, 18-H3
13 170.0 12-H, 14-H
14 89.1 5.54 d (2.1) 12-H 12-H
15 163.5 14-H
16 31.0 2.96 hept (6.7) 17-H3, 18-H3 4-H, 17-H3, 18-H3 4-H, 12-H, 17-H3, 18-H3
17 23.0 1.25 d (6.7) 16-H 16-H, 18-H3 4-H, 12-H, 16-H
18 23.0 1.25 d (6.7) 16-H 16-H, 17-H3
4.7.2 Die C9-Ketoreduktase RslO10
Analyse der Aminosäuresequenz der C9-Ketoreduktase Die Sequenzanalyse mittels BLASTp-Programm zeigt, dass RslO10 Homologie zu den C9- Ketoreduktasen AknA aus dem Aclacinomycin-Gencluster [218], ActKR aus Actinorhodin-Gencluster [119], HedKR aus dem Hedamycin-Gencluster [219] und SnoaD aus dem Nogalamycin-Gencluster [220] aufweist. Weiterhin besitzt RslO10 Homologie zu MsnO11 aus dem Mensacarcin-Gencluster, das eine essentielle Rolle bei der Biosynthese von Mensacarcin spielt. Die Inaktivierung von MsnO11 führte zu keiner Produktion von Mensacarcin [217].
Die Ketoreduktasen vom Typ II katalysieren die Reduktionsreaktion des Carbonyl-Sauerstoffs während der Biosynthese von aromatischen Polyketiden des Typs II. Die Carbonyl-Gruppe an C9 ist sehr häufig durch diese Reaktionen betroffen. Das Fehlen der Ketoreduktase z. B. durch Inaktivierungsexperimente
119
Ergebnisse führt zur Fehlfaltung der Polyketidkette und zur Bildung eines Polyketides mit völlig anderer Struktur. Weiterhin enthalten die Ketoreduktasen Typ II eine kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase Faltung- Domäne, welche durch die konservierten Sequenz-Motive des Cofactor-Bindstellen-Motivs, sowie die katalytische Tetrade des aktiven Zentrums, charakterisiert sind. Korman et al. konnten die katalytische Tetrade Asn114, Ser144, Tyr157 und Lys161 in ActKR identifizieren [112], [119]. In HedKR wurde ebenfalls die Katalytische Tetrade Asn112, Ser142, Tyr155 und Lys 159 von Javidpour charakterisiert [219]. Durch Sequenzanalyse mit ActKR, HedKR, AcnK und MsnO11 konnte J. Wunsch-Palasis die konservierte katalytische Tetrade Asn124, Ser154, Tyr167 und Lys171 in RslO10 identifizieren [116].
Die Durchführung einer Punkmutation im aktiven Zentrum der Ketoreduktase ORF7 des Simocyclinon- Genclusters aus Kitasatospora sp., das Simocyclinon produziert, führt zu keiner Produktion von Simocyclinon D9. Stattdessen konnten Derivate von Simocyclinon D, sowie Angucycline detektiert werden. Durch die Analyse der erhaltenen Produkte konnte die Ketoreduktase-Funktion von ORF7 bestätigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Inaktivierung des aktiven Zentrums des Proteins, das mit anderen Proteinen einen Komplex bilden sollte, ein inaktives Protein erzeugt, wobei die Funktionen der anderen Proteinen des Komplexes nicht beeinflusst werden [120].
Um das aktive Zentrum sowie die genaue Funktion von RslO10 experimentell zu bestimmen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Punktmutation in der Aminosäure Serin 144 des aktiven Zentrums von RslO10 eingeführt und die Sekundärmetaboliten-Produktion aus der erhaltenen Mutante mittels HPLC/MS untersucht.
Durchführung einer Punktmutation im aktiven Zentrum von RslO10 T. Heitzler hat im Laufe ihrer Doktorarbeit das Gen rslO10 mittels RedET®-Technologie inaktiviert. Die Analyse der Inaktivierungsmutante zeigte das Auftreten von zwei neuen Peaks, welche als Rsl-TH1 und Rsl-TH2 bezeichnet wurden, während Rishirilid B nicht mehr produziert wurde. Die Analyse der UV- und MS-Spektren zeigten, dass es sich bei Rsl-TH2 um JW-1 handelt, das ebenfalls nach der Inaktivierung von rslO8 produziert wurde. Nach Analyse der UV- und MS-Spektren wurde postuliert, dass Rsl-TH1 ein Analog des Shunt-Produkts SEK15 ist, wlches nach der Expression der minimalen PKS des Tetracenomycin-Gencluster produziert wird [29]. Durch die erhaltenen Shunt-Produkte konnte jedoch keine genaue Aussage über die Rolle von RslO10 bei der Biosynthese von Rishirilid B gemacht werden. Deswegen wurde, wie bei der Untersuchung der Funktion von ORF7 bei der Simocyclinon- Biosynthese, eine Punktmutation im aktiven Zentrum von RslO10 eingeführt.
Erstellung der Mutante Streptomyces albus x cos4 x ΔrslO10 x pUWL-H-SD-rslO10 Nach dem Einfügen einer Punktmutation in das Gen rslO10, in dem das Triplett ACC für Serin154 durch GCC, das für Alanin kodiert, ersetzt wurde, wurde das Plasmid pUWL-H-SD-rslO10 konstruiert (siehe 3.9.11.7). Das resultierende Plasmid wurde anschließend mittels intergenerischer Konjugation in
120
Ergebnisse den Stamm S. albus x cos4ΔrslO10 eingebracht. Die nach 5 Tagen erhaltenen Exkonjuganden wurden auf apramycin- und hygromycinhaltigen-TSB-Agarplatten kultiviert.
4.7.3 Produktionsanalyse der Mutante Streptomyces albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H- SD-rslO10 Die erhaltene S. albus x cos4 xΔrslO10 x pUWL-H-SD-rslO10-Mutante wurde, wie unter 3.8.2.1 beschrieben, kultiviert und anschließend in HA-Medium für 5 Tage bei 28 °C inkubiert. Ebenfalls wurden die Stämme S. albus x cos4 und S. albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H-R1R2R3 kultiviert und dienten als Kontrolle. Um polare Effekte auszuschließen, wurde eine Komplementierung mit dem nativen Gen durchgeführt, wobei das Gen rslO10 in die Mutante S. albus x cos4 ΔrslO10 eingebracht wurde. Im Anschluss wurden die Kulturen mit Essigsäureethylester extrahiert (siehe 3.10.1.1). Die Produktionsanalyse erfolgte mittels HPLC/MS, mit der MENSO4R-Methode verwendet wurde (siehe 3.10.2.2.1). In Abbildung 4.25 sind die erhaltenen HPLC-Chromatogramme dargestellt. Die Betrachtung der Chromatogramme erbrachte das Auftreten von zwei Peaks bei 17,1 min und 20,8 min bei der Mutante S. albus x cos4 x pUWL-H-SD-rslO10, die als Rsl-SS1 bzw. Rsl-SS2 bezeichnet wurden. Die gleiche zwei Peaks sind auch in der Mutante S. albus x cos4 ΔrslO10 x pUWL-H-R1R2R3 detektierbar sind. Dabei handelt es sich um Rsl-TH1 und Rsl-TH2 (bzw. JW-1) bezeichnet. Ihre UV- Absorption und MS-Spektren im negativen Modus sind in Abbildung 4.25 dargestellt. Die Strukturaufklärung von Rsl-TH1 wurde von P. Schwarzer im Rahmen seiner Doktorarbeit durchgeführt. Rsl-TH1 und JW-1 können Analoga der Shunt-Produkte SEK15 bzw. SEK15b sein, welche nach Expression der minimalen PKS des Tetracenomycin-Biosynthesegenclusters gebildet werden.
Das MS-Spektrum des Peaks Rsl-SS2 zeigt neben der Masse von JW-1 (m/z 407) ein Signal von 371 [M-H]-, welches der Masse von Rishirilid B entspricht. Die genaue Analyse des UV-Spektrums dieses Peaks zeigt, dass es sich von dem UV-Spektrum von Rishirilid B durch ein zusätzliches Maximum bei 400 nm unterscheidet. Aus diesem Grund wurde angenommen, dass die Mutante S. albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H- SD-rslO10 kein Rishirilid B mehr produzieren kann.
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Ergebnisse
Abbildung 4.25 A. HPLC-Chromatogramme (λ=254 nm) der Rohextrakte der Mutanten (a) S. albus x pOJ436, (b) S. albus x cos4, (c) S. albus x cos4 ΔrslO10 x pUWL-H-R1R2R3, (d) S. albus x cos4 ΔrslO10 x pUWL-H-rslO10- SD und (e) der Komplementierungs-Mutante S. albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H-rslO10. Die Mutante S. albus x cos4 ΔrslO10-SD produziert die zwei Metaboliten Rsl-SS1 und Rsl-SS-2, die die gleiche Retentionszeiten, sowie identische UV- und Massespektren zu denen von Rsl-TH1 und Rsl-TH2, die in der Mutante S. albus x cos4 ΔrslO10 detektierbar sind, zeigen. B UV-Spektrum des Sekundärmetaboliten Rsl-SS1 im Vergleich zum UV-Spektrum von Rishirilid B. C. MS-Spektrum im negativen Modus von Rsl-SS-1. D. UV- Spektrum des Sekundärmetaboliten Rsl-SS-2 im Vergleich zum UV-Spektrum von Rishirilid B. E. MS-Spektrum im negativen Modus von Rsl-SS-2.
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Ergebnisse
Untersuchung der Prolyl-4-Hydroxylase-Aktivität in Aspergillus nidulans
4.8.1 Die Putative Prolyl-4-Hydroxylasen in Aspergillus nidulans P4H-Enzyme katalysieren die Hydroxylierung von Peptidylprolin-Einheiten und bilden 4-Hydroxyprolin, die für die thermische Stabilisierung der Kollagenstruktur wichtig sind. Diese Enzyme wurden in verschiedenen Organismen charakterisiert und deren Funktion identifiziert. Bislang wurden sie allerdings noch nicht in Pilzen untersucht.
Genomsequenzanalysen zeigen, dass verschiedene Aspergillus-Stämme putative P4H kodierende Gene in ihrer Genome besitzen. Ein Sequenzvergleich mittels BLASTp zur führte Identifizierung den putativen P4H-kodierenden Gene ANID_02851, ANID_07554 und ANID_6818. Um diese Aktivität nachzuweisen, wurden die Gene ANID_02851 und ANID_07554 inaktiviert
4.8.2 Inaktivierung des putativen Prolyl-4-Hydroxylase-Gens ANID_02851 Die BLASTp-Analyse zeigt, dass ANID_02851 in seiner Proteinsequenz homolog zu P4H aus Säugerzellen (27 % identische und 41 % ähnliche Aminosäuren zu P4H aus Erinaceus europaeus) und Pflanzen (29 % identische und 45 % ähnliche Aminosäuren zu P4H aus Arabidopsis thaliana) zeigt.
Für die Inaktivierung des Gens ANID_02851 wurde die Deletionskassette ANID_02851.1 von FGSC verwendet. Diese Kassette, sowie weitere 9851 Deletionskassetten von Genen aus A. nidulans wurden in der „Dartmouth Medical School“ konstruiert und dem FGSC zur Verfügung gestellt. Die Kassetten sind zur Transformation und Amplifizierung geeignet und stehen auch anderen Forschungsgruppen zur Verfügung (http://www.fgsc.net/aspergillus/KO_Cassettes.htm) [221].
Das Prinzip dieser Inaktivierungsmethode beruhrt darauf, das Zielgen mit dem pyrGaf-Gen zu ersetzen. PyrGaf aus Aspergillus fumigatus kodiert für eine Orotidine-59-Phosphat-Carboxylase, sodass die Aspergillus nidulans pyrG89- oder ΔpyrG-Mutanten anschließend auf Uracil und Uridin wachsen und so selektiert werden können. In die Deletionskassette erstellt wurden homologe Bereiche der 5‘- und 3‘- Region des Zielgens (hier ANID_02851) sowie die pyrG-Sequenz ebenfalls am 5‘-und 3‘-Enden flankieren. Der Stamm Aspergillus nidulans GR5 ΔpyrG wurde zur Durchführung der Inaktivierung verwendet. Der Ablauf der Transformation und Herstellung der Protoplasten wurde unter 3.8.11 bzw. 3.8.10 beschrieben. Die Transformationsplatten wurden für drei Tage bei 37 °C inkubiert. Zahlreiche Transformanten waren gewachsen. Sie zeigen allerdings weder auf der Platte noch unter dem Mikroskop (40 fach vergrößert) morphologische Unterschiede gegenüber dem Wildtyp.
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Ergebnisse
4.8.3 Inaktivierung des putativen Prolyl-4-Hydroxylase-Gens ANID_07554 Beim Genprodukt ANID_07554 handelt es sich um eine putative P4H und teilt Homologien mit humanem P4H (33 % identische und 47 % ähnliche Aminosäuren). Allerdings war die Inaktivierung des Gens ANID_07554 in dieser Arbeit nicht erfolgreich. Es sind keine Transformanten gewachsen.
4.8.4 Heterologe Expression von ANID_02851 und ANID_07554 in E. coli In dieser Arbeit wurden die Gene ANID_02851 und ANID_07554 in E. coli BL21 (DE3) x pLys, wie unter 3.13.1 beschrieben, exprimiert. Beide Proteine (34 bzw. 75,14 kDa) wurden nach Induktion mit 0,5 M IPTG und Inkubation für 4 h bei 28 °C im Zellpellet detektiert. Das Ni2+-NTA- Affinitätschromatographiesystem wurde für die Proteinaufreinigung verwendet (siehe 3.13.3), um anschließend einen in vitro-Assay durchführen zu können. Die Aufreinigung der Proteine war allerdings nicht erfolgreich.
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Diskussion und Ausblick
5 Diskussion und Ausblick
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Diskussion und Ausblick
Untersuchung der Biosynthese der Saccharomicine Die Saccharomicine A und B sind Oligosaccharid-Antibiotika aus S. espanaensis. Sie besitzen eine einzigartige Struktur, welche aus 17 Zuckereinheiten verknüpft mit einem N-(m,p- Dihydroxycinnamoyl)-Taurin-Aglykon, besteht [24], [25]. Die Zuckerkette enthält die fünf Desoxyhexose-Bausteine Fucose, Saccharosamin, Rhamnose, 4-epi-Vancosamin und Digitoxose, die jeweils mehrmals in der Struktur vorkommen (siehe 2.2.1 und Abbildung 2.4). Das von M. Berner und T. Strobel identifizierte Saccharomicin-Gencluster enthält 38 Gene, darunter zehn Gene, welche möglicherweise für Glycosyltransferasen kodieren [26], [34]. Bislang konnte nur die konkrete Funktion von Sam5 und Sam8, kodiert von BN6_58660 (sam5) bzw. BN6_58690 (sam8), experimentell nachgewiesen werden. Beide Genprodukte sind für die Biosynthese von Kaffeesäure ausgehend von L-Tyrosin verantwortlich und dadurch sind sie in der Biosynthese des Aglykons involviert. Weitere Versuche wurden von M. Berner, T. Strobel und Y. I. Schmidt-Bohli zur Aufklärung der Biosynthese des Aglykons durchgeführt, es konnte allerdings keine klare Aussage über den genauen Biosyntheseweg getroffen werden. M. Berner hat weiterhin durch Sequenzvergleich die Biosynthese der einzelnen Desoxyhexosen der Heptadekasaccharid-Kette postulieret. Dadurch wurde gezeigt, dass sowohl Gene aus dem sam-Cluster als auch Gene außerhalb des Clusters in der Bildung von den fünf Desoxyhexosen der Saccharomicine involviert sind [34]. In der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls durch BLASTp die Biosynthese von diesen fünf Desoxyhexosen erneut untersucht und werden die von M. Berner vorgeschlagenen Wege bestätigt. Darüber hinaus sollen die zehn Glycosyltransferasen aus dem sam- Cluster, welche als sam11-20 bezeichnet wurden, die Übertragung der 17 Zuckereinheiten katalysieren, wobei als Substrat entweder ein Zucker oder die Kaffeesäure dient. Die Aufklärung der exakten Funktion dieser Glycosyltransferasegene könnte deren Verwendung bei der Erzeugung neuer Naturstoffe mit verbesserter Bioaktivität ermöglichen. Für diesen Zweck wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Versuche durchgeführt, um die Fucosyltransferase zu identifizieren, die für die Verknüpfung der ersten D-Fucose der Zuckerkette mit dem Aglykon verantwortlich ist. Da die Saccharomicine A und B unter Laborbedingungen nicht mehr produziert bzw. detektiert werden konnten, konnten keine Inaktivierungsexperimente durchgeführt werden. Stattdessen wurde der Stamm S. albus als heterologer Wirtsstamm verwendet, in welchem die Biosynthesegene für die Bildung von D- bzw. L-Fucose zusammen mit den einzelnen GT-Genen eingebracht wurden. Als Substrat für die untersuchten GTs wurden Kaffeesäure und zwei ihrer Derivate zu dem Stamm gefüttert.
5.1.1 Heterologe Expression von D-Fucose-Biosynthesesgenen in Streptomyces albus Die Biosynthese von D-Fucose wurde von Yoshida et al. in A. actinomycetemcomitans Y4 experimentell untersucht. Sie konnten die drei Biosynthesegene rmlA, rmlB und fcd charakterisieren und zeigen, dass rmlA und rmlB auch an der Biosynthese von L-Rhamnose beteiligt sind [37]. Bezogen auf diese Ergebnisse haben Zhongli et al. mittels Sequenzvergleich postuliert, dass die Gene chaS1, chaS2 und entweder chaS3 oder chaS4 aus Streptomyces chartreusis für die Biosynthese von D-Fucose als
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Diskussion und Ausblick
Bestandteil von Chartreusin verantwortlich sind [41]. Mittels Sequenzvergleich konnten weder in S. espanaensis noch in S. albus homologe Gene zu fcd identifiziert werden. Daraus wurde gefolgert, dass der Stamm S. albus nicht in der Lage ist, D-Fucose zu synthetisieren.
T. Strobel hat im Rahmen ihrer Doktorarbeit die Mutante S. albus-Rham generiert, die L-Rhamnose synthetisieren kann. Dafür hat sie die L-Rhamnose-Biosynthesegene oleL, oleS, oleE und oleU aus dem Oleandomycin-Gencluster unter der Kontrolle des ermE*-Promotors in den integrativen Vektor pTOS kloniert und in S. albus eingebracht [35], [222]. Da L-Rhamnose über dieses Plasmid in S. albus produzierbar war, wurden die beiden Gene oleS und oleE, die deren Genprodukte die gleiche Aktivität wie rmlA bze. rmlB besitzen, zur Produktion von D-Fucose verwendet.
Die Sequenzanalyse des sam-Clusters zeigte, dass die beiden Gene sam21 und sam22 potentiell für Ketoreduktasen kodieren und an der Zuckerbiosynthese beteiligt sind. Die Gene wurden jeweils einzeln zusammen mit oleS und oleE kloniert, um eine putative D-Fucose-Biosynthesekassette zu erstellen. Weiterhin wurde die Sequenz von fcd für Streptomyceten optimieret und synthetisiert. Das synthetisierte fcd wurde ebenfalls zusammen mit oleS und oleE kloniert. Alle drei Konstrukte wurden jeweils in S. albus eingebracht. Mindestens eine der drei erhaltenen Mutanten sollte D-Fucose produzieren können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Produktion von D-Fucose nur über die Fucosyltransferase- Aktivität ermittelt. Hierzu wurden die zehn Gene sam11 bis sam20 einzeln in den drei Mutanten exprimiert. Des Weiteren wurden die sam-GT-Gene ebenfalls in der Mutante S. albus-wcaGa, welche L-Fucose produziert, exprimiert. Insgesamt wurden 40 Mutanten generiert.
5.1.2 Identifizierung der für die Fucosylieirung des Saccharomicin-Aglykons verantwortliche Glycosyltransferase Nach Fütterung mit Kaffeesäure als Bestandteil des Saccharomicin-Aglykons wurden die Extrakte der Kulturen dieser 40 Mutanten mittels HPLC/MS analysiert. Diese Analyse zeigte, dass nur in zwei Mutanten eine Umsetzung von Kaffeesäure stattgefunden hat. Die zwei Mutanten sind S. albus x pTESa x fuc1,2-fcd x pUWL-H-sam17 und S. albus x pTESa x fuc1,2-sam22 x pUWL-H- sam17. Demzufolge wird angenommen, dass das Gen sam17 für die Fucosylierung des Aglykons bei der Biosynthese von Saccharomicin verantwortlich ist. Außerdem konnte dadurch auch gezeigt werden, dass das Genprodukt von sam22 die Funktion von Fcd in S. espanaensis übernehmen kann und somit an der Biosynthese von D-Fucose beteiligt ist. Durch Strukturaufklärung der neu produzierten Substanzen könnte die Funktion der beiden Gene sam17 und sam22 bestätigt werden. Allerdings war das im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich, weil die aufgetretenen neuen Peaks nicht mehr reproduzierbar waren.
Die Mutanten, die das Gen sam21 zur Komplementierung des D-Fucose-Biosynthesewegs enthalten, zeigten keine Umsetzung von Kaffeesäure. Ein Grund dafür könnte sein, dass D-Fucose nicht produziert worden ist. In diesem Fall könnte die Beteiligung von sam21 an der Biosynthese von D-Fucose 127
Diskussion und Ausblick ausgeschlossen werden. Ein weiterer Grund dafür könnte die Verhinderung der Aufnahme von Kaffeesäure durch die Zellwand des Stamms sein. Das wurde jedoch durch die erhaltenen Ergebnisse mit den anderen Mutanten ausgeschlossen. Um eine Produktion von D-Fucose zu untersuchen, könnte man, wie bei der Detektion anderer Zucker, eine NMR-Analyse durchgeführen [223].
Die HPLC-Chromatogramme der Mutanten, die L-Fucose produzieren, zeigten kein Auftreten von neuen Peaks. Daraus wurde gefolgert, dass die Saccharomicin-Glycosyltransferase nur Fucose in der D- Konfiguration übertragen kann.
Um zu bestätigen, dass das Gen sam17 für die gesuchte Fucosyltransferase kodiert, könnte das Aglykon von Saccharomicin als Substrat verwendet werden. Dafür müsste das Aglykon synthetisiert und zu einer S. albus-Mutante, welche das Gen sam17 und D-Fucose-Biosynthesegene enthält, gefüttert werden [32]. Dadurch könnte die Verwendung des richtigen Substrats bestätigt werden. Des Weiteren könnte durch Proteinaufreinigung und mit Hilfe eines in vitro-Assays eine Kaffeesäure-Fucosylierung die konkrete Funktion von Sam17 bestimmt werden.
Wirkung von L-Fucose auf das Wachstum von Streptomyces albus Es wurde bereits beschrieben, dass L-Fucose als Kohlenstoffquelle von verschiedenen Bakterien verwendet wird wie z. B. von Bacteroides thetaiotaomicron, E. coli, Xanthomonas campestris pv. campestris und Campylobacter jejuni [45], [224]–[226]. Für Campylobacter jejuni wurde gezeigt, dass L-Fucose sowohl die Wachstumsrate als auch die Kolonisierungsrate der Pathogenen erhöhen kann [46], [225]. Das Genom dieses Stamms enthält das Gen cj0486, welches für eine L-Fucose Permease FucP kodiert, die die Aufnahme von L-Fucose aus Mucin-Polysacchariden reguliert. In E. coli und Xanthomonas campestris wurde gezeigt, dass L-Fucose über mehrere Enzyme zu Pyruvat und Laktat abgebaut wird, die von den Stämmen für das Wachstum verwendet werden [227], [228]. Für E. coli wurde nachgewiesen, dass fünf Enzyme, nämlich ein Regulator (FucR), eine Permease (FucP), eine Isomerase (FucI), eine Kinase (FucK), eine Aldolase (FucA) und eine Laktatdehydrogenase (Ald), die Umsetzung von L-Fucose zu Laktat und Pyruvat katalysieren [227]. In Xanthomonas campestris wird L-Fucose zuerst durch eine L-Fucose-Dehydrogenase zu L-Fuconolakton umgesetzt. Danach wird durch eine L-Fuconolaktonase L-Fuconat gebildet. Die darauffolgenden benötigten Reaktionen, um Laktat und Pyruvat zu synthetisieren, werden durch einen alternativen Weg katalysiert [228]. Das bifunktionelle Enzym Fucokinase/L-Fucose-1-P-Guanylyltransferase (FKP) katalysiert die Umsetzung von aufgenommener L-Fucose zu GDP-Fucose, welche ein Bestandteil der Membran-Glycoproteine in Bacteriodes sp. ist [229].
In S. albus sollte die Expression des Gens wcaGa, zur Produktion von L-Fucose führen. Während der Kultivierung von S. albus-wcaGa bei 28 °C wurde bemerkt, dass diese Mutante im Vergleich zum Wildtyp deutlich schneller wächst. Das wurde auch nach Kultivierung bei 37 °C deutlich. Eine genaue Betrachtung der Wachstumskurve bezogen auf die Biomasse von beiden Stämmen bei 28 °C und 37 °C 128
Diskussion und Ausblick konnte die erhöhte Wachstumsrate bestätigen. Um den möglichen Abbauweg von L-Fucose in S. albus genauer zu charakterisieren, wurden mit Hilfe des BLASTp-Programms Homologien zu Proteinen gesucht, welche bekanntermaßen an der Metabolisierung von L-Fucose beteiligt sind. Die Analyse erbrachte, dass keines der Genprodukte des S. albus-Genoms Homologien zu FucR, FucP, FucI oder FucK aufweist. Die L-Fucose-Dehydrogenase und L-Fuconolaktonase aus Xanthomonas campestris zeigten ebenfalls keine Homologien zu Genprodukten aus S. albus. Nur die Fuconase-Phosphat- Aldolase (FucA), und die Lactaldehyddehyrogenase (Ald), aus Xanthomonas campestris zeigen große Homologien zu verschiedenen Genprodukten aus S. albus.
In den bereits untersuchten Stämmen konnte ausnahmslos das Fucose-Permease-Enzym (FucP) identifiziert werden. S. albus enthält kein FucP und kann somit L-Fucose nicht aus dem Medium, aufnehmen. Aufgrund der veränderten Wachstumrate in S.albus x wcaGa scheint nun L-Fucose produziert zu werden. Es kann jedoch keine genaue Aussage darüber getroffen werden, welchen Einfluss die heterologe Expression des Gens wcaGa in S. albus hat.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin der Einfluss von wcaGa auf die Produktion von Sekundärmetaboliten in Actinomyceten untersucht. Hierfür wurde das Cosmid cos4, welches das Rishirilid-Gencluster enthält, in S. albus-wcaGa konjugiert. Die Mutante S. albus x cos4, welche Rishirilid B produziert, wurde als Referenz-Stamm verwendet. Die Produktionsanalyse von Rishirilid B, sowie von einer uncharakterisierten Substanz zeigte, dass die Expression des Gens wcaGa zur Abnahme der Produktion von beiden untersuchten Metaboliten führt. Ein Grund dafür könnte eine negative regulatorische Wirkung von wcaGa bzw. L-Fucose auf die Expression von Biosynthesegene sein.
Aktivierung stiller Cluster in Saccharothrix espanaensis mittels OSMAC-Ansatz Die Sequenzanalyse des S. espanaensis-Genoms zeigte, dass der Stamm potentiell in der Lage ist eine Vielzahl von Naturstoffen zu produzieren [26]. Das Genom besitzt neben dem Saccharomicin- Gencluster 25 weitere Biosynthesegencluster, welche bisher unter Laborbedingungen keine Metaboliten synthetisiert haben und somit als kryptische Cluster bezeichnet wurden. Weiterhin konnte mittels Imaging MS gezeigt werden, dass S. espanaensis in der Lage ist zahlreiche Naturstoffe zu produzieren. Nach Höfe et al. und Bode et al. konnte durch Variation der Art und der Zusammensetzung des Nährmediums, sowie Änderungen weiterer Kultivierungsparameter die Produktion von Metaboliten in Bakterien und Pilze induziert werden [49], [52]. In der Literatur gibt es viele Beispiele über die erfolgreiche Aktivierung stiller Gencluster und Gewinnung von neuen Sekundärmetaboliten durch das OSMAC-Prinzip [56], [230]–[232].
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Diskussion und Ausblick
5.3.1 Expression des bldA-Gens in Saccharothrix espanaensis Nachdem Leskiw et al. den Einfluss von bldA auf die Morphologie und das Metabolitenprofil von S. coelicolor identifiziert haben, wurde das Gen bldA in verschiedenen Streptomyceten exprimiert und dessen regulatorischer Mechanismus untersucht [62], [233], [234]. Kalan et al. konnten Streptomyces calvus, welcher ein mutiertes bldA–Gen besitzt und somit keine intakte UUA-tRNA bilden kann, durch konstitutive Expression von bldA aus S. coelicolor zur Bildung von Sporen und zur Aktivierung kryptischer Gencluster anregen [65]. Weiterhin hat die Expression von bldA in Streptomyces albovinaceus und Streptomyces glomeroauranticus zur Produktion neuer Sekundärmetabolite geführt [235]. Auf der anderen Seite hat T. Heitzler im Rahmen ihrer Doktorarbeit gezeigt, dass die Expression von bldA zu keiner Veränderung des Metabolitenprofils in zehn von zwölf verschiedenen Actinomyceten-Stämmen führte [29].
Da S. espanaensis keine Sporen bilden kann, nicht mehr in der Lage ist, die Saccharomicine zu produzieren und weitere 25 kryptische Gencluster enthält, wurde bldA in diesem Stamm konstitutiv exprimiert und die erhaltene Mutante in verschiedenen Medien kultiviert. Jedoch konnte keine morphologische Veränderungen oder Sporenbildung nach der Expression von bldA detektiert werden. Die Produktionsanalyse der Expressionsmutante erfolgte mittels HPLC/MS und Agardiffusionstest. Die HPLC/MS-Analyse zeigte, dass keine neuen Metabolite aus S. espanaensis nach der Expression von bldA produziert wurden. Weiterhin zeigte die Imaging MS-Analyse, dass ein putatives Signal von Saccharomicin B in einer S. espanaensis-Kolonie zu erkennen ist, aber nicht in der S. espanaensis x pTESa-bldA-Kolonie. Ein Grund dafür könnte sein, dass bldA keinen Einfluss auf diesen Stamm hat, und dass die Sekundärstoffproduktion nicht durch einen bldA abhängigen Mechanismus reguliert wird. Von Dr. Bogdan Tokovenko wurden 395 Gene im Genom von S. espanaensis identifiziert, die ein TTA-Codon enthalten. Davon sind 79 % als hypothetische Proteine, 6 % als Membranproteine und 4 % als Sekretionsproteine annotiert. Zusätzlich gibt es 18 Gene mit TTA-Codon, welche für putative Transkriptionsregulatoren kodieren. Die Transkriptomanalyse von S. espanaensis Wildtyp erbrachte, dass ca. 60 % der identifizierten Gene im GYM-Medium verglichen mit ca. 45 % im SPY-Medium transkribiert sind. Des Weiteren sind zwei Gene BN6_46130 und BN6_18590, welche für eine putative α/β Hydrolase bzw. einen Transkriptionsregulator kodieren, im GYM-Medium mit einem RPKM von 173739 bzw. 118404 stark exprimiert. Neben diesen zwei Genen sind weitere 25 Gene mindestens in einem Medium stark transkribiert. Diese Ergebnisse wurden im S. espanaensis-Wildtyp ohne die Expression der funktionsfähigen bldA-Kopie aus S. coelicolor erhalten. Weiterhin konnte durch BLAST-Search eine UUA-tRNA im Genom von S. espanaensis identifiziert werden. Dies besagt aber nicht, dass tatsächlich eine Expression der Gene stattfindet. Da die Expression von bldA keinen erkennbaren Effekt zeigte, könnte angenommen werden, dass entweder die native UUA-tRNA von S. espanaensis funktionsfähig ist, aber wahrscheinlich keinen Einfluss auf die Produktion der Sekundärmetaboliten sowie auf die Morphologie hat, oder dass bldA aus S. coelicolor das eventuell fehlerhafte bldA aus S. espanaensis nicht komplementieren kann. 130
Diskussion und Ausblick
5.3.2 Produktionsanalyse von Saccharothrix espanaensis in SPY-Medium In dieser Arbeit wurde durch die Variation der Medienzusammensetzung das Metabolitenprofil von S. espanaensis verändert (siehe 4.3). Eine Produktion neuer Metabolite konnte nach Kultivierung in SPY-Medium erzielt werden. Mittels HPLC/MS-Analyse wurde gezeigt, dass die in SPY-Medium produzierten Substanzen in geringer Konzentration auch nach Kultivierung des Stamms in anderen
Medien produziert werden. Die Zugabe von 70 µM ScCl3 x 6H2O führte nur in SPY-Medium zur verstärkten Produktion der Metabolite, während in den anderen Medien kein Einfluss zu erkennen war. Aus SPY-Medium-Kulturen konnten vier antibiotisch-wirksame Metabolite isoliert und deren Struktur aufgeklärt werden. Dabei handelte es sich um AA, ICA, BA und PAA.
SPY-Medium enthält neben Stärke einen Überschuss von Aminosäuren sowie verschiedene
Spurenelemente (siehe Tabelle 3.18). Das SPY/ScCl3-Medium besteht zu 30 % aus Trypton/Pepton, welches Tryptophan, Phenylalanin sowie andere Aminosäuren enthält. Die genaue Betrachtung der Strukturen und der Biosynthese der aufgereinigten Substanzen erbrachte, dass diese Substanzen Abbauprodukte aromatischer Aminosäuren sind (siehe 5.4). M. Kazubowska hat im Rahmen ihrer Diplomarbeit die gleiche Menge Trypton/Pepton, die in SPY-Medium verwendet wurde, zu HA-
Medium zugegeben und festgestellt, dass die Indol-3-Carbonsäure-Ausbeute in SPY/ScCl3-Medium viermal höher war als in HA/ScCl3-Medium supplementiert mit Trypton/. Das könnte an dem hohen
Anteil an Aminosäuren im SPY/ScCl3-Medium liegen. Weiterhin konnte der Stamm bei Kultivierung ohne Trypton/Pepton keine oder nur sehr geringe Mengen der vier Stoffe produzieren [28]. Das deutet darauf hin, dass die Aminosäuren im SPY-Medium die Ausgangsprodukte von AA, ICA, BAund PAA sind.
Als Spurenelemente sind in SPY-Medium u. a. Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, und Zinksulfat vorhanden. Die Bakterien benötigen Mineralstoffe, um effizient arbeiten zu können. Spurenelemente steigern die Zellaktivität sowie die Wachstumseffizienz. Beispielsweise benötigen Methan-produzierende Bakterien zur Produktion des Biogases Spurenelemente wie Zink, Kupfer, Eisen und Nickel, die als Coenzyme an der Biosynthese beteiligt sind [236]. In Streptomyces griseus konnte durch Zugabe von 10 g/l MgSO4 zum Medium die Produktion von Streptomycin stimuliert werden [237]. Auch in S. espanaensis könnten die Mineralstoffe aus dem SPY-Medium an den enzymatischen Reaktionen der Biosynthese von AA, ICA, BA und PAA beteiligt sein.
Trotz der Variierung der Kultivierungsbedingungen wie Medienzusammensetzung, Inkubationszeit, pH und Zugabe von Scandium konnte weder das Saccharomicin-Gencluster noch ein anderes der 25 Sekundärmetabolit-Cluster aktiviert werden.
131
Diskussion und Ausblick
Untersuchungen zur Biosynthese von Anthranilsäure, Indol-3- Carbonsäure, Benzoesäure und Phenylessigsäure
5.4.1 Eigenschaften und hypothetischer Biosyntheseweg von Anthranilsäure Anthranilsäure, die aus Tryptophan biosynthetisiert wird, hat eine große Bedeutung in der Synthese bioaktiver Substanzen wie Antibiotika, Zytostatika und Arzneimittel für Stoffwechselerkrankungen [238]–[240]. Da AA chemisch aus erdölbasierenden Vorstufen synthetisiert wird und dabei toxische Nebenprodukte entstehen, werden viele Versuche unternommen, um diese biologisch zu produzieren [241], [242]. In Bakterien und anderen Mikroorganismen wird AA ebenfalls beim Abbau von Tryptophan gebildet. Hierbei wurden N-Formylkynurenin und Kynurenin als Zwischenprodukte nachgewiesen nachgewiesen [189]. Der von Tryptophan zu Anthranilat führende Biosyntheseweg benötigt drei Reaktionsschritte. In Streptomyces coelicolor wurden diese Schritten von den drei Enzymen Tryptophan-2,3-Dioxygenase (TDO), Kynureninformamidase (KFA) und Kynureninase (KYN), die von SCO3644, SCO3646 bzw. SCO3645 kodiert werden, katalysiert [188]. Aufgrund BLASTp-Analyse konnte angenommen werden, dass in S. espanaensis die Gene BN6_03100, BN6_14890 und BN6_03090 für die Enzyme TDO, KFA und KYN kodieren und somit für die Biosynthese von AA verantwortlich sind. Die Hochregulierung dieser Gene im SPY-Medium könnte ein weiterer Hinweis für deren Beteiligung an der AA-Biosynthese sein. Der putative Biosyntheseweg der AA ausgehend von L-Tryptophan in S. espanaensis ist in Abbildung 5.1 gezeigt.
BN6_03100 BN6_14890 BN6_03090
L-Tryptophan N-Formylkynurenin L-Kynurenin Anthranilsäure
Abbildung 5.1 Putativer Biosyntheseweg der Anthranilsäure ausgehend von L-Tryptophan in S. espanaensis.
Durch Inaktivierung der oben benannten Gene ist es möglich, deren Funktion genauer zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Gens BN6_03090 inaktiviert werden (siehe 3.9.11.8), jedoch waren trotz mehrerer Versuche keine Exkonjuganden angewachsen.
AA kann auch durch die Anthranilat-Synthase aus Chorisminsäure gebildet werden [243]. Diese Reaktion ist der erste Schritt der Biosynthese von Tryptophan. Die Gene BN6_68440 und BN6_00210 kodieren in S. espanaensis für Proteine, die homolog zu TrpE bzw. TrpG sind. TrpE und TrpG bilden die zwei Untereinheiten der Anthranilat-Synthase. Da das SPY-Medium einen Überschuss an Tryptophan enthält, wurde angenommen, dass das Enzym Anthranilat-Synthase gehemmt wird [244], sodass die Expression von BN6_68440 und BN6_00210 im SPY-Medium im Vergleich zu GYM-
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Diskussion und Ausblick
Medium herrunterreguliert sein sollte. Entgegen der Erwartung sind diese zwei Gene allerdings, wie auch die anderen putativen Tryptophan-Biosynthesegene, laut der RNA-Seq-Analyse im SPY-Medium hochreguliert. Die Transkription des Gens BN6_68440 wurde weiterhin durch das GUS-Reportergen- Testsystem in GYM- und in SPY-Medium untersucht. Dadurch konnte bestätigt werden, dass das Gen BN6_68440 im SPY-Medium höher exprimiert wird. Die Transkriptomanalyse sowie die GUS-Assay- Ergebnisse ergaben, dass in S. espanaensis nach Kultivierung in SPY-Medium AA zusätzlich zum Kynureninweg auch ausgehend von Chorismat synthetisiert wird. Des Weiteren scheint die Biosynthese von Tryptophan nicht negativ beeinflusst zu werden, wenn ein Überschuss an Tryptophan im Medium vorhanden ist. In S. coelicolor wurde ebenfalls gezeigt, dass Tryptophan einen positiven regulatorischen Einfluss auf die Expression dessen Biosynthesegene hat. Hierbei wurde angenommen, dass Tryptophan für die Bildung von Sekundärmetaboliten benötigt wird [84]. Aus S. espanaensis konnten keine Metabolite, die Tryptophan oder eines seiner Derivate enthalten, isoliert werden. Es könnte jedoch sein, dass es sich bei einer oder mehrerer der nicht aufgereinigten Substanzen, die im SPY-Medium produziert werden, um ein Tryptophan-Derivat handelt. Dies könnte die Hochregulierung der Tryptophan- Biosynthesegene im SPY-Medium erklären. Um diese Hypothese zu bestätigen, wäre es erforderlich, weitere Verbindungen aus im SPY-Medium kultivierten S. espanaensis aufzureinigen und deren Strukturen aufzuklären.
5.4.2 Eigenschaften und hypothetischer Biosyntheseweg von Indol-3-Carbonsäure Der Metabolit ICA konnte bereits in Bakterien (Azotobacter chroococcum und Chromobacterium violaccum [190], [191]), Rotalgen (Botryocladia leptopoda [193]) und Pflanzen (Arabidopsis thaliana [245]) nachgewiesen werden. Die antimikrobielle Eigenschaft von ICA wurde zum Teil untersucht. Kavitha et al. haben gezeigt, dass ICA gegen zahlreiche Stämme eine antimykotische und antibakterielle Aktivität mit einer MIC von 10-45 µg/mL besitzt [192]. Im Rahmen der Diplomarbeit von Monika Kaszubowska wurde ICA in S. espanaensis WT nach Kultivierung in SPY-Medium aufgereinigt [28]. Es konnte jedoch keine antimikrobielle Aktivität gezeigt werden, wahrscheinlich aufgrund unzureichender Konzentration. Eine antibiotische Aktivität gegen F. verticillioides, E. coli und S. albus konnte nachgewiesen werden, als die ICA-haltigen SPE-Fraktionen auf ihre Aktivität getestet wurden. Hierbei könnten sowohl die Konzentration, als auch der wahrscheinlich synergetische Effekt mit anderen Verbindungen, die zusammen mit ICA in einer SPE-Fraktion vorkommen, die Hemmwirkung wesentlich beeinflussen. M. Kaszubowka konnte durch HPLC/MS-Analysen zeigen, dass ICA auch in S. coelicolor nach Kultivierung in SPY-Medium nachweisbar ist, aber nicht in S. albus J1074 und S. lividans TK24. Eine mögliche Erklärung dafür ist das Fehlen der für die Biosynthese benötigten Gene in S. albus und S. lividans und/oder die nicht passenden Kultivierungsbedingungen für diese Stämme.
Die genaue Biosynthese von ICA in den bekannten Naturstoffproduzenten ist bislang nicht aufgeklärt. Davis et al. konnte nach Durchführung von Fütterungsexperimenten mit verschiedenen Indolderivaten beweisen, dass ICA aus L-Tryptophan über IAA und IALd synthetisiert wird [190]. Die Biosynthese
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Diskussion und Ausblick von IAA während des Abbaus von L-Tryptophan wurde in verschiedenen Stämmen untersucht. In Azospirillum brasilense wurde festgestellt, dass das Gen hisC1 sowie das Gen hisC2 die Deamimierung von Tryptophan katalysieren können [197], [198]. W. Zimmer et al. haben weiterhin bewiesen, dass in Azospirillum brasilense das Gen ipdC für die Decarboxylierung von Indol-3-Pyruvat verantwortlich ist [199]. Der entstehende Indol-3-Acetaldehyd wird durch die Indole-3-Acetaldehyddehydrogenase zu Indol-3-Essigsäure oxidiert. In Azospirillum brasilense gibt es dafür keine charakterisierte Proteine. In dem IAA-produzierenden Fungus Ustilago maydis wurde gezeigt, dass das Gen iad1 für die Indole-3- Acetaldehydehydrogenase kodiert [194]. Die Umwandlung von IAA in ICA ist bislang nicht untersucht worden und die dafür benötigten Gene sind nicht identifiziert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden in silico sowie experimentell Untersuchungen zur Aufklärung der Biosynthese von ICA in S. espanaensis (siehe 4.4.3.2) durchgeführt. Es wurde untersucht, ob der Stamm das Zwischenprodukt IAA bilden kann. Mithilfe der BLASTp-Analyse wurden die Sequenzen der an der Biosynthese von benannten Proteine mit den Genprodukten aus S. espanaensis verglichen. Hierbei wurde angenommen, dass in S. espanaensis eines der Gene BN6_01860, BN6_68610, oder auch beide Gene, für die Umwandlung von L-Tryptophan zu Indol-3-Pyruvat zuständig sind. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass beide Gene im SPY-Medium, in welchem ICA produziert wird, hochreguliert sind. Weiterhin konnte mittels GUS-Reportergen-Assay bestätigt werden, dass BN6_01860 im SPY-Medium überexprimiert ist (siehe 4.5.3). Um die genaue Funktion von BN6_01860 zu untersuchen, wurde dieses Gen mittels Singlecrossover inaktiviert. Hierbei wurde die Mutante S. espanaensis ΔBN6_01860 generiert. Diese Mutante zeigte nach HPLC/MS-Analyse des Rohextrakts, dass sie nicht in der Lage ist ICA zu produzieren. Demzufolge wurde bestätigt, dass BN6_01860 an der ICA-Biosynthese beteiligt ist und die Bildung von Indol-3-pyruvat katalysiert. Ein Inaktivierungsexperiment des Gens BN6_68610 könnte durchgeführt werden, um die Beteiligung dieses Gens an der Biosynthese von ICA nachzuweisen oder auszuschließen.
Des Weiteren konnten mittels BLASTp- und Transkriptomanalyse insgesamt acht Gene identifiziert werden, die an den weiteren Schritten der Biosynthese beteiligt sind (siehe 4.4.3.2). Um die konkreten Funktionen dieser Gene zu bestimmen, sollte man eine Inaktivierung der einzelne Gene durchführen. Weiterhin könnte die Aufreinigung der entsprechenden Proteine und die Etablierung eines in vitro Assays Aufschluss über die genaue Funktion dieser Proteine geben.
Bislang ist die Umsetzung von IAA zu ICA noch nicht genau aufgeklärt. Durch Fütterungsexperimente mit 13C-markierter IAA könnte man die Zwischenprodukte dieser Umwandlung in S. espanaensis nachweisen werden. Hierbei könnte man [1`-13C] IAA und [2`-13C] IAA zu den Kultivierungsmedien von S. espanaensis hinzugeben werden. Bei einer Umwandlung von IAA zu ICA könnten mithilfe von HPLC-Radiocounting radioaktive Metaboliten in der Probe mit [2`-13C]IAA detektiert werden. Eine fehlende Radioaktivität in der Probe mit [1`-13C]IAA wäre auf eine Decarboxylierung von IAA
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Diskussion und Ausblick zurückzuführen [246]. Die Detektion von ICA anhand des 13C-markierten Indolrings würde beweisen, dass ICA ausgehend von L-Tryptophan über IAA synthetisiert wird.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass S. espanaensis in der Lage ist, IAA zu synthetisieren, welches nachfolgend zu ICA umgesetzt werden könnte. Des Weiteren wurde mittels eines Inaktivierungsexperiments nachgewiesen, dass BN6_01860 an dem Abbau von L-Tryptophan beteiligt ist. BN6_01860 kodiert für eine Aminotransferase und sollte den ersten Schritt von der ICA-, sowie von der PAA-Biosynthese katalysieren. In der Abbildung 5.2 wurde der postulierte Biosyntheseweg von IAA und ICA in S. espanaensis dargestellt.
A B C
Abbildung 5.2 Putativer Biosyntheseweg von IAA und ICA in S. espanaensis. A. Tryptophan-Aminotransferase; B. Indol-3-Pyruvatdecarboxylase, C. Indol-3-Acetaldehyddehydrogenase. BN6_01860 sollte den ersten Schritt katalysieren. 5.4.3 Eigenschaften und hypothetische Biosynthese von Phenylessigsäure Phenylessigsäure wurde bereits in Bakterien (wie Thauera aromatica und Streptomyces humidus [201], [247]), Hefen [203], Pflanzen [248] und Blattschneider-Ameisen [249] nachgewiesen. PAA wird in der Literatur als antimykotisch und antibakteriell wirksame Substanz, Antityrosinase-Mittel und natürlicher Aromastoff beschrieben [91], [247], [250], [251]. Hwang et al. haben die antimykotische Aktivität der PAA gegen zahlreiche Pilzstämme untersucht und zeigten, dass PAA mit einer MIC von 10-50 µg/mL das Wachstum der verschiedenen Teststämme vollständig inhibieren kann [247]. Kim et al. konnten PAA von Bacillus licheniformis-Kulturen isolieren und gegen Bakterien und Hefen testen. Sie haben bewiesen, dass PAA neben seiner antimykotischen Aktivität auch ein antibakterielle Wirkung gegen Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Pseudomonas aeroginosa und andere Bakterienstämme besitzt [75]. Weiter haben Cueva et al. nachgewiesen, dass PAA auch antibakteriell gegen Darmbakterien wie E. coli, Lactobacilli planatarum und weitere pathogene Stämme wirkt [93].
Im Rahmen dieser Arbeit konnte in S. espanaesnis nach Kultivierung in SPY-Medium PAA nachgewiesen werden. Die antimykotische Wirkung von PAA gegen F. verticillioides, S. cerevisiae und C. parapsilosis wurde untersucht. Eine deutliche Aktivität gegen F. verticillioides wurde bewiesen, als die Extrakte aus der SPE-Fraktion, sowie der DC-Bande, in der sich PAA zusammen mit BA befindet, getestet wurden. Ebenfalls wurde eine antibakterielle Aktivität gegen E. coli und B. subtilis nachgewiesen, als PAA nicht vollständig aufgereinigt war. Die aufgereinigte PAA zeigte eine schwache antibakterielle Aktivität, möglicherweise aufgrund der unzureichenden Konzentration. Eine weitere Erklärung wäre der Zerfall von PAA während der Aufreinigung.
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Diskussion und Ausblick
Es wurde bereits beschrieben, dass PAA während des Abbaus von L-Phenylalanin über den Ehrlich- Weg entsteht [252], [253]. Hierbei katalysieren eine L-Phenylalanin-Transaminase, eine Phenylpyruvatdecarboxylase und eine Phenylacetaldehyddehydrogenase die Bildung von PAA.
Mittels BLASTp- und RNA-Seq-Analysen konnten in S. espanaensis Gene, die an der Biosynthese von PAA ausgehend von L-Phenylalanin beteiligt sein sollten, identifiziert werden (siehe 4.4.3.3).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Gen BN6_01860 inaktiviert. welches den ersten Schritt von der PAA-Biosynthese katalysieren sollte. Die Produktion von PAA in der generierten Mutante S. espanaensis ΔBN6_01860 im Vergleich zum Wildtyp war geringer. Dadurch wurde bewiesen, dass das Gen BN6_01860 an der Biosynthese von PAA beteiligt, aber nicht essentiell ist. Ein anderes Genprodukt übernimmt bei der Inaktivierung dessen Aufgabe, jedoch kann es den Ausfall nicht vollständig komplementieren.
Um die genaue Funktion der weiteren identifizierten Gene nachzuweisen, könnte man die Proteine aufreinigen und mittels eines in vitro-Assays eine Substratumsetzung überprüfen. Weiterhin könnte durch Inaktivierung der einzelne Gene deren Beteiligung an der Biosynthese von PAA bestätigt werden.
Durch die in silico und in vivo erhaltenen Ergebnisse wurde ein hypothetischer Biosyntheseweg von PAA in S. espanaensis postuliert und in Abbildung 5.3 zusammengefasst.
A B C
Abbildung 5.3 Putativer Biosyntheseweg von PAA in S. espanaensis. A. L-Phenylalanin-Transaminase, B. Phenylpyruvatdecarboxylase; C. Phenylacetaldehyddeydrogenase. BN6_01860 sollte den ersten Schritt katalysieren. 5.4.4 Eigenschaften und hypothetische Biosynthese von Benzoesäure (BA) Die Produktion von BA wurde in verschiedenen Pflanzenarten (Hypericum androsaemum [206] und Petunia hybrida [209], [254]), sowie in Bakterien (Streptomyces maritimus [94] und Thauera aromatica [201]), nachgewiesen. BA wird wegen seiner antibiotischen Wirkung als Konservierungsmittel eingesetzt gegen verschiedene Bakterien, Hefen und Pilze wie z. B. E. coli, Listeria moncytogenes, Aspergillus sp. und Penicillium sp.[255], [256]. Kim et al. und Cueva et al. haben gezeigt, dass BA mit einer MIC von 500-1000 µg/mL antibiotische Aktivität gegen E. coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans und zahlreiche Lactobacillus-Stämme [93], [250] besitzt.
In der Literatur wurde beschrieben, dass BA durch den Abbau von L-Phenylalanin über mehrere Wege mit Zimtsäure als Zwischenprodukt gebildet werden kann [206]–[208], [257]–[259]. Diese Wege sind
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Diskussion und Ausblick als CoA-abhängigen β-oxidativen Weg, CoA-abhängigen nichtoxidativen Weg und CoA-unabhängigen nichtoxidativen Weg beschrieben [260].
Der β-oxidative Biosyntheseweg wurde in Petunia hybrida nachgewiesen. Hierbei wurden die Funktionen der Enzyme PhCNL, PhCHD und PhKAT1 als Cinnamat-CoA-Ligase, Cinnamoyl-CoA- Hydratase/Dehydrogenase bzw. 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase bestimmt [211], [261], [262]. Ebenfalls wurde in Streptomyces maritimus die Produktion von BA, welche die Startereinheit in der Bildung des Antibiotikums Enterocin ist, über den β-oxidativen Weg beschrieben. Durch Inaktivierungsexperimente und in vitro Assays der aufgereinigten Proteine wurde festgestellt, dass die Gene encP, encH, encI und encJ für die Enzyme Phenylalanin-Ammoniak-Lyase, Cinnamat-CoA-Ligase, Cinnamoyl-CoA- Hydratase bzw. β-Oxophenylpropionyl-CoA-Thiolase kodieren und an der Biosynthese der BA ausgehend von L-Phenylalanin beteiligt sind [208], [263], [264].
Abd El-Mawla et al. haben bewiesen, dass in Hypericum androsaemum BA aus Zimtsäure über einen CoA-abhängigen nichtoxidativen Weg synthetisiert wird. Sie konnten zeigen, dass die drei Enzyme Cinnamat-CoA-Ligase, Cinnamoyl-CoA-Hydratase/Lyase und Benzaldehyddehydrogenase an der Bildung von BA beteiligt sind [206].
Der CoA-unabhängige nichtoxidative Weg wurde in Antirrhinum majus untersucht. Hierfür ist eine Aldehyddehydrogenase, welche die Konvertierung von Benzaldehyd in BA katalysiert, nötig. Long et al. konnten bestätigen, dass das Gen BALDH für eine Benzaldehyddehydrogenase (BALDH) kodiert [213].
Mittels BLASTp- und der RNA-Seq-Analyse wurden in S. espanaensis die Gene, die an der Biosynthese von PAA ausgehend von L-Phenylalanin beteiligt sein sollten, identifiziert. Unter den identifizierten Gene sind BN6_75400, BN6_67950 und BN6_77230, die für eine Histidin-Ammonia-Lyase, eine 3- Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase bzw. Aldehyddehydrogenase kodieren. Diese Gene wurden jeweils über einen Singlcrossover inaktiviert (siehe 4.4.4). Die Produktionsanalyse der Mutante S. espanaensis ΔBN6_67950 ergab, dass die Inaktivierung von BN6_67950 nicht zum Abbruch der Biosynthese, sondern zur niedrigeren Produktion von BA führte. Dies weist darauf hin, dass das Gen BN6_67950 an der Biosynthese von BA beteiligt, aber nicht essentiell ist.
Auch in den Mutanten und S. espanaensis ΔBN6_77230 und S. espanaensis ΔBN6_75400 wurde BA immer noch in großen Mengen produziert, vergleicherweise zum Wildtyp. Dies weist wiederum darauf hin, dass entweder keiner der beiden Genenfür die Biosynthese nötig ist, oder dass sie sich gegenseitig komplementieren.
Abschließend konnte die Biosynthese von BA aus L-Phenylalanin über den β-oxidativen Weg in S. espanaensis postuliert und in Abbildung 5.4 zusammengefasst werden.
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Diskussion und Ausblick
A B C D F
Abbildung 5.4 Putativen Biosyntheseweg von Benzoesäure (BA) über des Abbaus von L-Phenylalanin in S. espanaensis. A. Phenylalanin-Ammoniaklyase; B. Cinnamate-CoA-Ligase; C. Cinnamoyl-CoA- Hydratase/Lyase; D. Ketoacylthiolase; F. Benzaldehyddehydrogenase. RNA-Sequenzierung
5.5.1 Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene von Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium Durch RNA-Seq wurden Informationen über die Transkription der gesamten Gene in S. espanaensis nach Kultivierung in SPY- und in GYM-Medium erhalten. Interessanterweise lies die Analyse der RNA- Seq-Daten darauf schließen, dass die Zahl der überexprimierten Gene im GYM-Medium im Vergleich zum SPY-Medium viel höher ist. Unter den im GYM-Medium hochexprimierten Gene befinden sich jene, die für Protein-Transporter-Enzyme und für Proteasen/Peptidasen kodieren. Dies könnte an dem hohen Gehalt von nicht verdauten Proteine im GYM-Medium liegen. Proteasen/Peptidasen sind Enzyme, die die Peptidbindung in Proteinen oder Peptiden durch Hydrolyse spalten können [265]. Diese Enzyme können die Proteine des Mediums spalten und Peptide bzw. Aminosäuren freisetzen, die von dem Stamm zum Wachstum oder zur Biosynthese von Naturstoffen gebraucht werden. Da mehr Produkte im SPY-Medium synthetisiert werden, wurde die Transkription der Gene in diesem Medium genauer betrachtet. Hier zeigte die Transkriptomanalyse der verschiedenen COG-Gruppen (siehe 4.5.1.2), dass mehr Gene aus der Gruppe „Aminosäure-Transport und Stoffwechsel“ deutlich überexprimiert sind. Darunter befinden sich sieben Gene, die für folgenden Aminosäure-Abbau-Enzyme kodieren: D-Aminosäure-Hydrogenase, Methionin Gamma-Lyase, NAD-spezifische Glutamat Dehydrogenase, Prolin-Dehydrogenase, Glycin-Dehydrogenase und Argenin-Deaminase. Dies kann auf einen Überschuss an Aminosäuren im Medium zurückgeführt werden. Weiterhin sind die Gene der Gruppen „Nukleotid-Transport und Stoffwechsel“ ebenfalls größtenteils überexprimiert. Dies lässt sich zum Teil durch die wichtige Rolle der Aminosäuren in der Synthese von Nukleotiden erklären. Eine genauere Analyse der einzelnen Gene zeigte, dass ein Gen, welches für eine Epoxid-Hydrolase kodiert, im SPY-Medium hochreguliert ist. Epoxid-Hydrolase setzt Epoxide um, die als Zwischenprodukte während des Abbaus aromatischer Produkte entstehen, zu Transdihydrodiole. Transdihydrodiole dienen nachfolgend als Substrat für Enzyme bei weiteren Abbau-Reaktionen. Unter den hochregulierten Genen ist auch ein Gen, welches für ein Superoxiddismutase kodiert. Dieses Enzym ist wichtig zum Schutz der Zellen vor oxidativem Stress, ausgelöst durch von ROS [266]. Der Abbauprozess aromatischer Produkte ist Auslöser des oxidativen Stresses in der Zelle. Aus diesem Grund kommt es zur Überexpression der Superoxiddismutase.
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Diskussion und Ausblick
5.5.2 Transkriptomanalyse der putativen Sekundärmetabolit-Gencluster aus Saccharothrix espanaensis Das Genom von S. espanaensis wurde vollständig sequenziert und von T. Strobel im Laufe ihrer Doktorarbeit annotiert [35]. Die Sequenzanalyse zeigte, dass das Genom 26 Gencluster enthält, die potentiell Sekundärmetabolite produzieren können. Der Stamm konnte bislang allerdings nur Saccharomicin A und B produzieren [24], welche unter Laborbedingungen nicht mehr reproduzierbar sind. Das Gencluster der Saccharomicine wurde in silico und teilweise experimentell identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Stamm nach Variieren der Kultivierungsbedingungen antibiotisch aktive Substanzen produzieren. Die Strukturaufklärung von vier dieser Substanzen zeigt, dass keines davon durch die identifizierten Genclustern synthetisiert wird (siehe 4.4.2.2).
Durch RNA-Seq wurden Informationen über die Transkription der Gencluster in den beiden Medien GYM und SPY erhalten. Die Analyse zeigte, dass keines der 26 Cluster in diesen Medien vollständig transkribiert wurde. Hierzu wurde in jedem Cluster mindestens ein Gen mit einem RPKM-Wert von null gefunden. Weiterhin gibt es sieben Cluster im GYM-Medium und acht Cluster in SPY-Medium, die überhaupt nicht transkribiert werden.
Von 38 Genen des Saccharomicin-Clusters werden nur sieben Gene im SPY-Medium transkribiert. Dadurch konnte ausgeschlossen werden, dass die Saccharomicine an der detektierten antibiotischen Aktivität beteiligt sind. Weiterhin sind nur vier Gene aus diesem Cluster im GYM-Medium transkribiert. Durch GUS-Assay wurde auch gezeigt, dass das Gen sam6 von sam-Cluster nicht transkribiert wurde. Zusammen können diese Ergebnisse zeigen, dass die Saccharomicine wirklich nicht mehr produziert werden.
Im GYM-Medium werden 31 von 41 Genen des PKS/NRPS-Clusters 8 transkribiert und im Vergleich zur Trankriptionsrate im SPY-Medium stark überexprimiert. Die weiteen zehn Genen habenim GYM- Medium einen RPKM-Wert zwischen 11 und 94. Weiterhin besitzen 29 Gene ein RPKM von 1 bis 25 im SPY-Medium. Die Betrachtung der Funktion der überexprimierten Gene zeigt, dass ein α/β- Hydrolase-Faltung-Protein, eine Aminotransferase, eine Halogenase, ABC-Transporter-Enzyme und eine Polyketidsynthase am stärksten hochreguliert sind. BLASTp-Analyse mittels der ESTHERS- Datenbank zeigte, dass das Genprodukt von BN6_46130 eine Homologie von 38 % identische und 53 % ähnliche Aminosäuren zu einer Thioesterase aus Pseudomonas syringae zeigt [267]. Es konnte jedoch keine genaue Erklärung über den Einfluss von GYM-Medium-Komponenten auf die Thioesterase oder auf andere Gene dieses Cluster gegeben werden.
Um die kryptischen Gencluster zu aktivieren, sollten Transkriptionsregulatoren in S. espanaensis exprimiert werden. Neben der Expression des bldA-Gens (siehe 4.4.1) hat M. Kazsubowska im Laufe ihrer Diplomarbeit die drei Transkriptionsregulatoren sam1, sam3 und sam4 aus dem sam-Cluster überexprimiert [28]. Weiterhin hat T. Heitzler im Rahmen ihrer Doktorarbeit SARP-Regulatoren aus 139
Diskussion und Ausblick verschiedenen Sekundärmetaboli-Gencluster ebenfalls überexprimiert. Alle Versuche, um die Gencluster von S. espanaensis zu aktivieren, konnten bislang kein Erfolg erzielen [29]. Dies könnte auf mehrere Gründe zurückgeführt werden. Darunter die Expression von globalen negativen Regulatorgene wie z. B. BldD. Durch RNA-Seq-Analyse konnte gezeigt werden, dass das Gen BN6_63210, welches in seiner Proteinsequenz hohe Homologie zum BldD aus S. coelicolor aufweist, sowohl in GYM- als auch in SPY-Medium mit einem RPKM von ca. 1300 bzw. 1890 stark transkribiert wird. Hengst et al. konnten den genauen Mechanismus von BldD aufklären [268]. Sie zeigten, dass BldD eine inhibitorische Wirkung auf die Sporulierung, Luftmyzelbildung und die antibiotische Produktion von S. coelicolor besitzt. Die hohe Expression von BN6_63210 könnte demnoch der Grund sein, warum der Stamm keine Sekundärmetabolite produzieret und nicht sporuliert. Das Gen BN6_63210, sollte inaktiviert werden, um dessen regulatorischen Effekt auf S. espanaensis zu untersuchen.
5.5.3 Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene von Saccharothrix espanaensis mit und ohne Zugabe von Alizarin Die Biotransformationsaktivität von S. espanaensis wurde durch Rhamnosylierung von exogenem Alizarin von A. Linnebrink nachgewiesen und die dafür verantwortliche GT Ses60310 konnte von T. Strobel identifiziert werden. Diese GT gehört zur CAZy-Familie 1 und ist homolog zu UDP- Glucuronosyltransferasen. Zu dieser Familie zählen alle GTs, die im bakteriellen Sekundärstoffwechsel an der Glycosylierung von niedermolekularen Substanzen beteiligt sind. Das Gen BN6_60130, welches für Ses60310 kodiert, befindet sich jedoch außerhalb der in silico identifizierten Sekundärmetabolit- Gencluster. In S. espanaensis ist die native Funktion des Enzyms allerdings nicht bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Transkriptomanalyse von S. espanaensis mit und ohne Zugabe von Alizarin durchgeführt, um die Transkription des Genes BN6_60310, sowie den Einfluss von Alizarin auf die Transkription der gesamten Gene zu untersuchen. Erstaunlicherweise zeigt das Transkriptomergebnis, dass das Gen BN6_60310 in Anwesenheit von Alizarin leicht herunterreguliert wird. Dies könnte auf eine negative Feedback-Regulierung des rhamnosylierten Alizarins zurückgeführt werden.
Allgemein sind nach der Alizarin-Fütterung mehr Gene herrunter- wie hochreguliert. Darunter sind auch viele Gene der Sekundärmetabolit-Biosynthese. Dabei gibt es, wie bei der Kultivierung von S. espanaensis in GYM- und SPY-Medium, in jedem Cluster Gene, die nicht transkribiert werden. Das könnte der Grund dafür sein, dass in diesem Stamm keine Sekundärmetabolite gebildet werden.
Die hohe Anzahl herunterregulierter Gene deutet darauf hin, dass Alizarin Stress in der Bakterienzelle verursacht. Dies könnte u.a. auf oxidativen Stress zurückgeführt werden. Alizarin gehört zu den 9,10-Anthrachinonen, die von Mikroorganismen abgebaut werden können [269]. Die Betrachtung der hochregulierten Gene in Anwesenheit von Alizarin ergab, dass ein Gen, das für einen IclR-Regulator kodiert, signifikant hochreguliert ist. Zu dieser Familie gehören Regulatoren, die einen Einfluss auf katabolische Wege von aromatischen Produkten wie Catechol besitzen [270]. Der IclR-Regulator könnte zur vermehrten Expression von Genen für den Alizarin-Abbau führen. Durch den Alizarin- 140
Diskussion und Ausblick
Abbau könnten infolgedessen reaktive Sauerstoffspezies erzeugt werden, die zu oxidativen Stress in der Zelle führen. Das würde auch die erhöhte Transkription der Superoxiddismutase und Chaperone erklären, die entstehende Superoxide zu Wasserstoffperoxid umwandeln und denaturierte Proteine erneut falten könnten. Weiterhin wird die Isocitrat-Dehydrogenase des Zitronensäure-Zyklus signifikant hochreguliert, sodass mehr α-Ketoglutarat und NADPH + H+ produziert wird. Dabei können auch Elektronen von Superoxiden auf NADP+ übertragen werden [271], [271]. Die Generierung von ROS während des Alizarin-Abbaus könnte auch der Grund dafür sein, dass sich die Zelle in einem allgemeinen Stresszustand befindet und darum viele metabolische Wege herrunterreguliert werden.
Weiterhin werden die Gene, die für eine Uricase, eine Hydroxyisourat-Hydrolase, eine Allantoicase und eine Allantoinase kodieren, stark hochreguliert. Diese Enzyme sind in dem Adenosinmonophosphat (AMP)-Katabolismus involviert. Als Nebenprodukte entstehen mehrfach Wasserstoffperoxide und Ammoniak. Wasserstoffperoxide können leicht zu ROS zerfallen, was den oxidativen Stress abermals erhöht. Die darauffolgende Zunahme des Ammoniakgehalts in der Zelle führt zu einer Repression der Ammoniak-Transporter Amt (BN6_71100) und GlnK (BN6_71090), sowie weitere Stickstoffmetabolisierungsenzyme (BN6_71080) und (BN6_10060).
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Diskussion und Ausblick
Untersuchung zur Biosynthese von Rishirilid B Um die Biosynthese von Rishirilid B zu untersuchen wurden Inaktivierungsexperimente der zehn für Oxidoreduktase kodierenden Gene auf dem cos4 mittels RedET®-Technologie durchgeführt. Hierfür haben X. Yan die Gene rslO1 und rslO6, J. Wunsch-Palasis die Gene rslO4 und rslO8, T. Heitzler das Gen rslO10 und J. Derochefort die Gene rslO2,rslO3, rslO4, rslO5, rslO7 und rslO9 im Laufe ihrer Doktorarbeiten inaktiviert. Die nach Inaktivierung von rslO1, rslO4, rslO5, rslO6 und rslO10 erhaltenen Intermediate wurden genauer untersucht. Die Struktur von rishi2a, das nach der Inaktivierung von rslO1, sowie nach der Inaktivierung von rslO10 detektierbar war, wurde von X. Yan aufgeklärt und von T. Heitzler durch erneute Aufreinigung bestätigt. Die Strukturen der Verbindungen JD-2d und JD-14, welche nach Inaktivierung von rslO6 zu erkennen sind, wurden von J. Derochefort isoliert und aufgeklärt. Weiterhin hat C. Zuo heterologe Expressionsexperimente der minimalen PKS-Genen und Zyklasengenen im Stamm S. albus durchgeführt und die Sekundärmetabolit-Produktion mittels HPLC/MS untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Intermediat JW-1, das nach Inaktivierung von rslO8 auftritt und neben anderen Produkten auch nach der Inaktivierung von rslO10, sowie nach der Expression der minimalen PKS-Gene zu erkennen ist, isoliert und dessen Struktur aufgeklärt. Aufgrund dieser Ergebnisse postulierte J. Derochefort und C. Zuo in ihrer Dissertation eine Hypothese für den Biosyntheseweg von Rishirilid B [118]. In der vorliegenden Arbeit wird eine Analyse der NADPH: Chinonoxidoreduktase RslO8 bezogen auf die Struktur von JW-1 durchgeführt. Des Weiteren konnte im Zuge dieser Arbeit eine Aminosäure der katalytischen Tetrade des RslO10-Enzyms durch ein Mutagenese-Experiment identifiziert werden.
5.6.1 Analyse der Funktion der NADPH:Chinonoxidoreduktase RslO8 Die Sequenzanalyse von RslO8 ergab, dass es sich um eine putative Chinonoxidoreduktase handelt, da sie homolog zu der NADPH:Chinonreduktasen GrhO7 aus dem Griseorhodin-Gencluster in Streptomyces sp. JP95 [214], ActVI-Orf2 aus dem Actinorhodin-Gencluster in S. coelicolor [215] und mit MsnO9 aus dem Mensacarcin-Gencluster ist. Bei der Biosynthese von Griseorhodin katalysiert GrhO7 zusammen mit GrhO3 die Einführung einer Epoxidgruppe [214], während ActVI-Orf2 zusammen mit ActVI-Orf4 für die stereospezifische 1,4-Reduktion an C15 bei der Biosynthese von Actinorhodin verantwortlich sind [215]. Bei der Biosynthese von Mensacarcin wurde postuliert, dass MsnO9 an der Bestimmung der Länge der Polyketidkette beteiligt ist. Da es in der Struktur von Rishirilid B keine Epoxidgruppe gibt, wurde angenommen, dass RslO8 eine ähnliche Funktion wie die von ActVI-Orf2 besitzt.
Nach der Inaktivierung des Gens rslO8 wurde kein Rishirilid B mehr produziert. Stattdessen wurde die Produktion von JW-1 und die eines anderen Nebenprodukts detektiert. Da das UV-Spektrum des Nebenprodukts dem von Rishirilid nicht ähnlich ist, wurde nur JW-1 weiter analysiert. Die Analyse von JW-1 ergab, dass die Struktur 22 Kohlenstoffatome und acht Sauerstoffatome enthält, während Rishirilid B nur aus 21 Kohlenstoffatome und sechs Sauerstoffatome aufgebaut ist. 142
Diskussion und Ausblick
Da der Metabolit JW-1 auch nach der Inaktivierung von rslO10 identifizierbar war, hat T. Heitzler während der Untersuchung der Funktion von RslO10 eine Analyse der Struktur von JW-1 durchgeführt. Diese Analyse zeigte, dass JW-1 eine ähnliche Struktur wie SEK15b aufweist. SEK15b wurde nach der Expression der minimalen PKS des Tetracenomycin-Genclusters identifiziert, mit dem Unterschied in der Position des substituierten 4-Pyrons (siehe Abbildung 5.5) [272]. Des Weiteren ist die Methylgruppe an C3 von SEK15b durch einen Isopropylrest in JW-1 ersetzt.
Abbildung 5.5 Struktur von JW-1 und SEK15b. Die beiden Strukturen unterscheiden sich in der Positionierung des substituierten 4-Pyrons und in der Länge der Seitenkette an C3.
C. Zuo konnte in Zusammenarbeit mit P. Schwarzer beweisen, dass JW-1 ebenfalls nach der Expression der minimalen PKS-Gene rslK1-K3 zusammen mit rslK4 und rslA in S. albus produziert wurde. Das gleiche Ergebnis wurde erzielt, wenn zu den zuvor genannten Genen zusätzlich die Zyklasen rslC1, rslC2 und rslC3 aus dem rsl-Cluster kloniert wurden (zu diesem Zeitpunkt nicht publiziert). Dadurch wurde bewiesen, dass RslO8 eine essentielle Funktion in der Umsetzung der gebildeten Polyketidkette besitzt. Weitere Vorschläge für den Funktionsmechanismus von RslO8 bei der Biosynthese von Rishirilid wurden von J. Derochefort und C. Zuo gemacht [117], [118].
5.6.2 Untersuchung der katalytischen Tetrade von RslO10 Durch Sequenzvergleich wurde RslO10 als Ketoreduktase Typ II zugeordnet. Diese Enzyme sind für die Reduktion von Carbonylgruppen, am häufigsten an C9, während der Polyketidsynthese verantwortlich. Zu dieser Gruppe gehören ActKR, HedKR, AknA und MsnO11, die an der Biosynthese bekannter Polyketide vom Typ II beteiligt sind [31], [218], [219], [273]. Korman et al. und Javidpour et al. haben die katalytische Tetrade der ActKR bzw. HedKR identifiziert [119], [273]. Das Genprodukt von ORF7 aus dem Simocyclinon-Gencluster katalysiert die Reduktion einer C1-Carbonylgruppe. Die Inaktivierung von ORF7 führte zu keiner Produktion von Simocyclinon 9D oder eines Derivates,
143
Diskussion und Ausblick während die gezielte Inaktivierung des aktiven Zentrums zur Bildung von Derivaten von Simocyclinon 9D führte. Dadurch konnte die Funktion von ORF7 aufgeklärt werden [120].
Durch Sequenzanalyse konnte die katalytische Tetrade Asn124-Ser154-Tyr167-Lys171 in RslO10 identifiziert werden. Durch Einführung einer Punktmutation in Ser154 von rslO10 und Komplementierung der Mutante S. albus x cos4ΔrslO10 mit dem mutierten rslO10 Gen konnten weder Rishirilid B noch neue Intermediate detektiert werden. Nur die zwei Metabolite, die ebenfalls von der Mutante S. albus x cos4ΔrslO10 x pUWL-H-R1R2R3 produziert wurden, wurden detektiert. Dadurch konnte bestätigt werden, dass durch diese Mutation das aktive Zentrum von RslO10 betroffen ist und dass die durch Sequenzanalyse identifizierte katalytische Tetrade richtig ist. Es konnte jedoch keine weitere Aussage über die genaue Funktion von RslO10, zusätzlich zu den von T. Heitzler in ihrer Dissertation postulierten, ermittelt werden [29].
Untersuchung der Prolyl-4-Hydroxylase Aktivität in Aspergillus nidulans Prolyl-4-Hydroxylasen sind Dioxygenasen, die α-Ketoglutarat, Eisen (II) und molekularen Sauerstoff für ihre Aktivität benötigen [135]. Als Substrat dienen Peptidylprolin-Einheiten. Solche Einheiten befinden sich in Pflanzen in Extensinen, in prolinreichen Proteinen und in Arabinogalactanproteinen. Hier führen P4H zur Bildung von hydroxyprolinreichen Proteine, die für die Stabilisierung der pflanzlichen Zellwand wichtig sind [138], [139]. In Vertebraten befinden sich Peptidylproline hauptsächlich in der Tripelhelix-Domäne des Kollagens. Diese besteht aus drei ineinander gewickelten
Polypeptidketten, die häufig aus (Gly-Pro-Pro)n-Wiederholungen aufgebaut sind. P4H ist hier für die Hydroxylierung des Prolins an der letzten Position dieses Tripletts zuständig. Dadurch entsteht 4- Hydroxyprolin (Hyp), das für die Stabilisierung der Kollagenstruktur essentiell ist [134].
P4H wurden in Tieren, Pflanzen, Hefen und Bakterien untersucht und in zahlreichen Organismen identifiziert. Neben Säugerzellen konnte die Aktivität von P4H bei der Stabilisierung der Kollagenstruktur nur in dem Hefestamm Hansenula polymorpha nachgewiesen werden [148]. In Pilzen wurde, trotz Identifizierung verschiedener Kollagenähnlichen Proteine [149], [151], bislang keine P4H charakterisiert. Sequenzdaten zeigen, dass putative P4H in einigen Aspergillus-Stämmen vorkommen. Diese könnten durch Hydroxylierung des Kollagen-Prolins für die thermische Stabilisierung der Tripelhelix des Kollagens verantwortlich sein.
In dieser Arbeit wurde die Aktivität von P4H in A. nidulans untersucht. Dafür wurde das Gen ANID_02851, das für eine putative P4H kodiert, inaktiviert. Da P4H die Bildung von Hyp katalysiert, könnte das Fehlen von P4H zur morphologischen Veränderungen in A. nidulans führen. Die Mutante A. nidulans ΔANID_02851 zeigte allerdings keinen morphologischen Unterschied gegenüber dem Wildtyp. Die Expression von ANID_02851 zur Durchführung eines in vitro-Assays war allerdings nicht erfolgreich. Um die P4H-Funktion des ANID_02851-Genprodukts nachzuweisen oder auszuschließen, 144
Diskussion und Ausblick sollten die endogenen kollagenähnlichen Proteine isoliert werden und der Hydroxylierungsgrad des Prolins an der dritten Position im (Gly-Pro-Pro)-Triplett berechnet werden. Dieses Experiment wurde von de Bruin et al. im Hefestamm Hansenula polymorpha beschrieben [148]. Weiterhin könnten Kollagen-Proteine in A. nidulans heterolog exprimiert und ebenfalls Hydroxyprolin-Einheiten untersucht werden. Des Weiteren sollten weitere Gene aus A. nidulans die für putative P4H kodieren, untersucht werden. Die Identifizierung einer P4H in A. nidulans und die heterologe Produktion von Kollagen in Pilzen könnte für die Biotechnologie von großer Bedeutung sein
145
Diskussion und Ausblick
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172
Anhang
7 Anhang
Plasmidkarte von pTOS-wcaGa
Abbildung 7.1 Plasmidkarte von pTOS-wcaGa. Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2
Abbildung 7.2 Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2
173
Anhang
Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2-sam21; pTESa x fuc1,2-sam22 und pTESa x fuc1,2-fcd
Abbildung 7.3 pTESa x fuc1,2-sam21 und pTESa x fuc1,2-sam22.
Abbildung 7.4 Plasmidkarte von pTESa x fuc1,2-fcd.
174
Anhang
Plasmidkarte von pUWL-H-GTs
Abbildung 7.5 Plasmidkarte von pUWL-H-GTs.
Plasmidkarte von pGUS
Abbildung 7.6 Plasmidkarte von pGUS.
175
Anhang
Plasmidkarte von pGUS x Promotoren (PSam5-6 X, P78320, P07730, P01860, P68440)
Abbildung 7.7 Plasmidkarte von pGUS x Promotoren. Die Promotoren sind PSam5-6 X, P78320, P07730, P01860, P68440.
Plasmidkarte von pKC1132 x KO01860, pKC1132 x KO75400, pKC1132 x KO67950, pKC1132 x KO79710, pKC1132 x KO03090 und pKC1132 x KO77230
Abbildung 7.8 Plasmidkarte von pKC1132 x KO01860. Mit Ausnahme der Fragment-Größe sehen die Plasmidkarten von pKC1132 x KO75400, pKC1132 x KO79710, pKC1132 x KO03090, pKC1132 x KO77230 gleich aus.
176
Anhang
Plasmidkarte von pUWL-H x SD-rslO10
Abbildung 7.9 Plasmidkarte von pUWL-H x SD-rslO10
Ergebnisse der Transkriptionsanalyse der 26 Biosynthesegenclusters aus Saccharothrix espanaensis nach Kultivierung in GYM- und in SPY- Medium Tabelle 7.1 Ergebnisse der Transkriptionsanalyse der 26 Biosynthesegenclusters aus S. espanaensis nach Kultivierung in GYM- und in SPY-Medium
Cluster Anzahl Transkribierte Transkribierte Hochregulierte Hochregulierte der Gene im GYM Gene im SPY Gene im GYM Gene im SPY Gene
sam 38 4 7 1 7
Lan1 4 0 0 0 0
Lan2 31 5 10 4 6
mel 2 0 0 0 0
Aminocyclitol 8 0 0 0 0
Cluster1 15 0 0 0 0
Cluster2 16 2 4 0 4
177
Anhang
Cluster3 15 4 2 4 1
Cluster4 30 0 1 0 1
Cluster5 31 7 1 6 1
Cluster6 44 9 7 5 5
Cluster7 20 6 4 5 2
Cluster8 41 31 5 31 0
Cluster9 31 6 10 4 8
Cluster10 33 2 3 1 3
Cluster11 25 2 2 2 1
Cluster12 11 2 0 2 0
Cluster13 46 6 1 6 0
Cluster14 45 8 7 6 2
Tcp1 2 0 0 0 0
Tcp2 4 3 3 3 0
Tcp3 8 6 6 5 1
Tcp4 1 0 0 0 0
Tcp5 1 1 1 1 0
Tcp6 1 0 0 0 0
Tcp7 1 1 0 1 0
178
Abkürzung
8 Abkürzungen
Aminosäuren Alanin Ala A
Arginin Arg R
Asparagin Asn N
Asparaginsäure Asp D
Cystein Cys C
Glutamin Gln Q
Glutaminsäure Glu E
Glycin Gly G
Histidin His H
Isoleucin Ile I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosin Tyr Y
Valin Val V
Mikroorganismen Stämme A. actinomycetemcomitans Y4 Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitans Y4
A. nidulans Aspergillus nidulans FGS A4
B. subtilis Bacillus subtilis
C. parapsilosis Candida parapsilosis
E. coli Escherichia coli
F.verticillioides Fusarium verticillioides
S. albus Streptomyces albusJ1074
179
Abkürzung
S. coelicolor Streptomyces coelicolor A3(2)
S. espanaensis Saccharothrix espanaensis DSM 44229
Einheiten % Prozent
°C Grad Celcius
Au absorption units (Absorptionseinheiten bp Basenpaar h Stunde(n)
Da Dalton g Gramm h Stunde
Hz Herz
L Liter m Meter
M molar min Minute(n) mol Einheit der Stoffmenge
V Volt ppm parts per million rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
Pa Paskal psig pound-force per square inch gauge (relativer Druck) u unit (Enzymmenge, die ein µmol Substrat pro Minute umsetzt)
Nukleotide A Adenin
T Thymin
C Cytosin
G Guanin
Physikalische Größen A Absorption
J Kopplungskonstante m Masse m/z Masse/Ladungs-Verhältnis 180
Abkürzung
Mr Molare Masse
OD600 optische Dichte bei λ = 600 nm
Rf Retentionsfaktor
RT retention time (Retentionszeit) t Zeit
V Volumen
W Trockenmasse
δ chemische Verschiebung
λ Wellenlänge
Vorsilben M Mega 106 k kilo 103 c zenti 10-2 m mili 10-3
µ micro 10-6 n nano 10-9 p pico 10-12
Sonstige Abkürzungen 1D eindimesional
2D zweidimensional
∆ Kennzeichnung einer Geninaktivierung
AA Anthranilsäure
ACT Actinorhodin act Gen aus dem Actinorhodin-Biosynthesegencluster aphII Kanamycinresistenzgen
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Aminosäure
ATP Adenosintriphosphat
AUC area under the curve
BA Benzoesäure bidest bidestilliert
181
Abkürzung bla β-Lactamresistenzgen
BLAST basic local alignment search tool
BSA Bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise ca. circa
CAZy carbohydrate active enyzmes database
CD Circulardichroismus
CD3OD deuteriertes Methanol
CDA Calcium dependent antibiotic cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
CDS Coding DNA Sequence
CoA Coenzym A
COG cluster of othologous groups
Cos Cosmid
COSY correlation spectroscopy (homonukleare Korrelationsspektroskopie für 1H/1H)
CYP450 Cytochrom-P450 Oxygenasen
DAD Diodenarray-Detektor
DC Dünnschichtchromatographie
DDMM Didesmethylmensacarcin
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DMSO-d6 deuteriertes Dimethylsulfoxid
DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) dNTPs Desoxynukleotide
DSM Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen dTDP Desoxythymidindiphosphat
DTT Dithiothreithol dTTP Desoxythymidintriphosphat
EC Enzyme Commission
EDTA Dinatriummethylendiamintetraessigsäure
ESI Elektrospray-Ionisierung 182
Abkürzung et al. et alii (und andere)
EtOH Ethanol
FGSC Fungi Genome Stock Center
FKP Fucokinase/L-Fucose-1-P-Guanylyltransferase
FucP Fucose-Permease
Grh Gen aus dem Griseorhodin A-Biosynthesegencluster
GT(s) Glycosyltransferase(n)
GUS β-Glucuronidase
HCl Salzsäure
HPLC high performance liquid chromatography (Hochleistungsflüssigchromatograhie)
HTH Helix-Turn-Helix Motiv
Hyp 4-Hydroxyprolin
IAA Indol-3-Essigsäure
IALd Indol-3-Carbaldehyd
ICA Indol-3-Carbonsäure
IC50 mittlere inhibitorische Konzentration
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
KFA Kynureninformamidase
KYN Kynureninase lan Lantibiotikum mel Melanin
MeOH Methanol
MIC Minimale inhbirenden Konzentration
MOPS 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
MSD Quadrupol-Massendetektor msn Gen aus dem Mensacarcin-Biosynthesegencluster
NaCl Natriumchlorid
NAD(P)+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-(Phosphat), oxidierte Form
NAD(P)H Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-(Phosphat), reduzierte Form
NaOH Natriumhydroxid
NCBI National Center for Biotechnology Information 183
Abkürzung
NMR nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz)
NRPS Nichtribosomale Peptidsynthase
OD Optische Dichte
OH-Gruppe Hydroxylgruppe
ORF open reading frame (Offener Leserahmen) oriT origin of transfer
OSMAC one strain many compounds
P4H Prolyl-4-Hydroxylase
PAA Phenylessigsäure
PAL Phenylalanin-Ammonia-Lyase
(p)ppGpp Guanosintetra- und Guanosinpentaphosphat
PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PKS Polyketidsynthase
RedET Redirect Technologie
Ref. Referenz
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RNA-Seq RNA-Sequenzierung
RPKM Reads Per Kilobase per Million mapped reads rsl Gen aus dem Rishirilid-Biosynthesegencluster
RT Raumtemperatur sam Gen aus dem Saccharomicin-Biosynthesegencluster sam-Cluster Saccharomicin-Cluster
SARP streptomyces antibiotic regulatory protein
SDS Natriumdodecylsulfat sp(p). Species; Art(en)
SPE solid phase extraction (Festphasen-Extraktion) tcm Gen aus dem Tetracenomycin-Biosynthesegencluster tcp Terpencluster
TDO Tryptophan-2,3-Dioxygenase
TE Thioesterasen-Domäne
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin 184
Abkürzung
TOCSY total correlation spectroscopy
TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethan u. a. unter anderem
UV Ultraviolett
X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-α-D-Galactopyranosid
X-Gluc 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure z. B. zum Beispiel
185
Abkürzung
186
Danksagung
9 Danksagung Ich möchte mich hiermit bei allen bedanken, die maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Mein herzlicher Dank gilt:
Zuerst meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Möglichkeit in seinem Arbeitskreis die Masterarbeit und die Promotion anzufertigen, die wissenschaftliche Betreuung, die familiäre Arbeitsatmosphäre, die stetige Diskussionsbereitschaft und seine offene Tür bei Problemen und Fragen. Besonders bedanken möchte ich mich für die starke emotionale Unterstützung in allen Lebenslagen.
Herrn Prof. Dr. Rolf Schubert für die Unterstützung bei der Anmeldung an der Uni-Freiburg, für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens, die interessanten Diskussionen und seine große Menschlichkeit.
Herrn Prof. Dr. Stefan Günther für die Bereitschaft als Drittprüfer an meinem Rigorosum teilzunehmen.
Dr. Bogdan Tokovenko für die detalierte Auswertung der RNA-Seq- Daten, die wertvollen Diskussionen und die Erreichbarkeit bei jeder Zeit.
Dr. Thomas Paululat von der Universität Siegen für die Durchführung und Auswertung der NMR- Messungen und Strukturaufklärungen.
Herrn Prof. Dr. Bradley Moore von der Scripps Institution of Oceanography der University of California für die Imaging-MS Messungen.
Dr. Loubna Youssar für die Zusammenarbeit in dem Pilzprojekt und für ihre weisen Ratschläge.
Dem syrischen Ministerium für Hochschulbildung und der Albert-Ludwigs-Universität für die Finanzierung der Promotion in Deutschland.
Dr. Gabriele Weitnauer für ihre unermüdliche Hilfsbereitschaft und ihre wertvollen wissenschaftlichen, organisatorischen Ratschläge. Ganz Besonders möchte ich ihr danken für ihr stets offenes Ohr für meine Sorgen und mein Glück, für ihr Mitgefühl und für ihr großes Herz.
Dr. Tina Strobel für ihre geduldige Einweisung in die Molekularbiologie, ihre ausgezeichnete Betreuung während meiner Masterarbeit und ihre große Unterstützung während und nach ihrer Promotion. Für die schönste Zeit in der Denkzelle, für die tollen gemeinsamen Erlebnisse auch außerhalb der Arbeitzeit und für die lustigen Unterhaltungen möchte ich mich bei ihr herzlich bedanken. Danke vor allem, dass du mir dein Deutsch beigebracht hast.
187
Danksagung
Anja Greule, die unzählige Stunden ihrere freien Zeit geopfert hat, um mich beim Schreiben der Dissertation zu unterstützen. Herzlichen Dank auch für die große Bereitschaft zu jeder Uhrzeit für mich da zu sein und mein Jammern zu ertragen, die wunderbare gemeinsame Zeit im Labor und außerhalb des Instituts. Danke vor allem, dass du immer Leo ein Lächeln ins Gesicht zauberst und große Freude machst .
Dr. Jasmin Kröger, die tollste Nachbarin der Welt. Danke von Herzen für Alles. Dr. Yvonne-Isolde Schmidt-Boli für die schöne Zusammenarbeit und die uneingeschränkte Unterstützung im Labor und im privaten Leben während meiner Schwangerschaft und danach. Ich danke ihr und ihrer Familie für die große Liebe zu Leo.
Elisabeth Welle für ihre Hilfsbereitschaft bei Problemen aller Art, ihre kompetente Unterstützung bei der Naturstoffaufreinigung, vor allem während meiner Schwangerschaft, und ihre wertvollen Ratschläge.
Sandra Groß für die hervorragende Zusammenarbeit und ihre gute Ideen. Herzlichen Dank für die stets Hilfe aller Art bei und außerhalb der Arbeit.
Philipp Schwarzer und Denise Deubel für die gute Laune im Labor und in der Denkzelle und die Unterstützung beim Schreiben. Ich danke euch vielmals, weil ihr mich jeder Zeit zum Lachen bringen könnt. Fabienne Gutacker für die produktive und schöne Zeit im Labor und in der Denkzelle.
Dr. Roman Makitrynskyy und Olga Tsypik für die tolle Zusammenarbeit, die wertvolle Diskussionen und die produktive Schreibzeit in der Uni-Bibliothek.
Meinen Korrekturlesern Anja Greule, Gabriele Weitnauer, Denise Deubel, Philipp Schwarzer, Jasmin Kröger, Sandra Groß, Tina Strobel und Fabienne Gutacker, ohne deren unermüdliches Korrekturlesen und gute Ratschläge ich sicherlich nicht das geleistet hätte, was ich nun geschafft habe.
Frau Weber für die Zusammenarbeit, und die interessanten Unterhaltungen. Marcus Essing für seine Hilfe bei Computerproblemen. Sandra Cabrera für die schöne Zeit. Songya Zhang, Jing Zhu und Chijian Zuo für die Wochenend-Bereitschaft im Labor.
Allen aktuellen und ehemaligen lieben Kollegen für die unvergessliche Zeit und für die fachliche und nichtfachliche Diskussionen, vor allem Dr. Irene Santillana, Dr. Tanja Heitzler, Dr. Katharina Asmus, Stephanie Hackl, Astrid Erber, und Maxie Schmitt. Ich danke auch den Gastprofessoren Prof. Dr. Rup Lal und Prof. Zheng Ma für die freundliche Zusammenarbeit im Sommer 2013. Mein Dank geht auch an meine Masterstudentin Anna Perissinotti vor allem für ihre Gastfreundschaftlichkeit in Padua. Großer Dank gilt den Studenten, die ich betreut oder mitbetreut habe und mit ihnen eine tolle Zeit hatte, ob Wahlpflichtpraktikant, Bachelor, Master, Diplom oder freiwillig: Vor allem aber Monika Kazsubowska,
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Danksagung
Nils Gummerlich, Michael Keppler, Fabienne Gutacker, Andreas Welle, Emine Akkas, Sören Hammelmann, Moritz Haaf, Patrick Hörner und viele andere.
Meiner lieben Freundinnen, die immer für mich da sind, Reem und Razan.
Den drei, die mir besonders am Herzen liegen, meinen Eltern und meinem Bruder für ihre grenzlose Liebe und Unterstützung. Ihr habt es geschafft, mir Wurzeln und Flügel zu geben und habt mich zu dem Menschen gemacht, der ich jetzt bin.
Meinem Mann Rabie für seine große Liebe, die mich immer bekräftigt hat, für die unendliche Unterstützung auch in schwierigen Phasen, sein Verständnis und dafür, dass er immer für mich da ist.
Ward Leo, unsem kleinen Sonnenschein, da er mein Leben mit großer Freude erfüllt und mir enorme Kraft gibt.
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Lebenslauf
10 Lebenslauf
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