BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

Huỳnh Ánh Quốc

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÖC CỦA PECTIN TỪ CỎ BIỂN ENHALUS ACOROIDES Ở KHÁNH HÕA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang – 2020 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

Huỳnh Ánh Quốc

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÖC CỦA PECTIN TỪ CỎ BIỂN ENHALUS ACOROIDES Ở KHÁNH HÕA

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Phạm Đức Thịnh Nha Trang – 2020 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đã đƣợc công bố trƣớc đó có nguồn gốc rõ ràng. Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tại đơn vị Trung tâm Kiểm soát bệnh tật nơi tôi đang công tác.

Nha Trang, tháng 12 năm 2020 Tác giả

Huỳnh Ánh Quốc LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến thầy TS. Phạm Đức Thịnh – Phó Viện trƣởng Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã luôn tận tâm, nhiệt tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và cho tôi nhiều góp ý trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng nhƣ các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận văn này. Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi cũng đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình để hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Ninh Thuận, đơn vị tôi đang công tác đã tạo kiện cho tôi thời gian thực hiện khóa luận. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, ngƣời thân và bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẽ khó khăn và động viên giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 12 năm 2020 Học viên

Huỳnh Ánh Quốc DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

As Arsen Asen

Albumin huyết thanh BSA Bovine Serum Albumin bò

Cd Cadmium Cadmi

Carbon-13 NMR 13C-NMR Phổ CHTHN Carbon 13 Spectroscopy

DE Degree of esterification Mức độ ester hóa

DMSO Dimethylsulfoxide Dimetylsulfoxide

DMSP Dimethylsulfoniopropionate Dimetylsulfopropionat

1,1-diphenyl-2- 1,1-diphenyl-2- DPPH picrylhyrazyl picrylhyrazyl

DW Dry weight Trọng lƣợng khô

EtOH Ethanol Etanol

Fuc Fucose Đƣờng fucose

Fucf Fucofuranose Fucofuranose

Fucp Fucopyranose Fucopyranose

Gal Galactose Đƣờng galactose

GalpA Galactosyluronic Galactosyluronic

GIT Gastrointestinal tract Đƣờng tiêu hóa GlcpA Glucoronosyl acid Acid glucoronosyl

Gluc Glucose Đƣờng glucose

GlucA Glucuronic acid Acid glucuronic

Gly Glycoside Glycoxit

Gel permeation GPC Sắc ký lọc gel chromatography

Lipoprotein có tỉ trọng HDL High Density Lipoprotein cao

HG Homogalacturonan Homogalacturonan

HM High Methoxyl Metoxyl hóa cao

Pectin có độ metoxyl HMP High Methoxyl Pectin hóa cao

High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng HPLC Chromatography cao

1H-NMR Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton

Dòng tế bào gây ung thƣ HT29 Colorectal cancer cell line ruột kết

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

Lipoprotein có tỉ trọng LDL Low Density Lipoprotein thấp

LM Low Methoxyl Metoxyl hóa thấp

LMP Low Methoxyl Pectin Pectin có độ metoxyl hóa thấp

Man Mannose Đƣờng mannose

MDR Multidrug resistant Đa kháng thuốc

MeOH Methanol Metanol

MI Methoxyl Index Chỉ số metoxyl

MT Metallothioneins Metallotionein

Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân NMR Resonance (CHTHN)

PC Phytochelatin Phytochelatin

RG-I Rhamnogalacturonan I Ramnogalacturonan

RG-II Rhamnogalacturonan II Ramnogalacturonan II

Rhap Rhamnosyl Ramnosyl

TFA Trifluoroacetic axid Acid trifluoroacetic

United Nations Chƣơng trình môi UNEP Environment Programme trƣờng Liên hiệp quốc

XGA Xylogalacturonan Xylogalacturonan

Xyl Xylose Đƣờng xylose

Xylp Xylosyl Gốc xylosyl

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Hàm lƣợng pectin trong các loại nguyên liệu khác nhau…………19

Bảng 3.1: Các giá trị mật độ quang mẫu chuẩn chuẩn xác định hàm lƣợng carbohydrate tổng bằng phƣơng pháp phenol – acid sulfuric…….….……...55

Bảng 3.2: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng uronic acid bằng phƣơng pháp Carbazole……………………..…………….……...56

Bảng 3.3: Thành phần hóa học của pectin từ E. acoroides ……….…..…….57

Bảng 3.4: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng sulfate bằng phƣơng pháp K2SO4………………………………….….……..58

Bảng 3.5: Thành phần monosaccharide của pectin từ các loài khác nhau…………………………………………………………….….…….…..61

Bảng 3.6: Các chỉ số đặc trƣng của pectin từ phần rễ, thân và lá của cỏ biển E.acoroides…………………………………………………………………..65 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Hình thái chung của cỏ biển………………………………………..9 Hình 1.2: Cỏ biển Enhalus acoroides ……….……….……………………..11 Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của pectin……………………..………………..20 Hình 1.4: Pectin trong cấu tạo của thành tế bào thực vật…………………....21 Hình 1.5: Các dạng cấu trúc hóa học của pectin…………………………….22 Hình 1.6: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa cao…….…………..23 Hình 1.7: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa thấp……………….23 Hình 1.8: Cấu trúc chính của homogalacturonan……………………………24 Hình 1.9: Mô hình đặc điểm cấu trúc của Rhamnogalacturonan-I…………..25 Hình 2.1: Các bộ phận của cỏ biển Enhalus acoroides.…………………….40 Hình 2.2: Sơ đồ khối về nội dung nghiên cứu của đề tài.…………………...43 Hình 2.3: Sơ đồ chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển ………...………...44 Hình 3.1: Sự phân bố hàm lƣợng pectin trong cỏ biển E.acoroides………...52 Hình 3.2: Các giai đoạn xử lý cỏ biển……………………………………….52 Hình 3.3: Dịch chiết pectin…………………………………………………..53 Hình 3.4: Chế phẩm pectin thô sau khi sấy khô……………………………..53 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng carbohydrate ………………...55 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng uronic acid …………………..56 Hình 3.7: Thành phần hóa học của 2 phân đoạn pectin từ E.acoroides ...... 57 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng sulfat………………….……...59 Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn…………………60 Hình 3.10: Sắc ký đồ HPLC mẫu pectin chiết tách từ cỏ biển E.acoroides…60 Hình 3.11: Phổ IR của phân đoạn F2 – rễ của cỏ biển E.acoroides ………...66 Hình 3.12: Phổ IR của phân đoạn F2 – thân của cỏ biển E.acoroides …..…..66 Hình 3.13: Phổ IR của phân đoạn F2 – lá của cỏ biển E.acoroides ………...67 1

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...... 5 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...... 8 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CỎ BIỂN ...... 8 1.1.1. Giới thiệu và sự phân bố cỏ biển ...... 8 1.1.1.1. Giới thiệu chung về cỏ biển ...... 8 1.1.1.2. Cỏ biển Enhalus acoroides ...... 11 1.1.1.3. Phân bố của hệ sinh thái cỏ biển ...... 12 1.1.2. Một số thành phần hóa học của cỏ biển ...... 14 1.1.2.1. Thành phần hóa học của cỏ biển ...... 14 1.1.2.2. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học ở cỏ biển...... 15 1.2.1. Giới thiệu chung về pectin...... 18 1.2.2. Đa dạng cấu trúc của pectin ...... 19 1.2.2.1. Cấu tạo chung ...... 19 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của pectin ở vách tế bào sơ cấp ...... 23 1.2.3. Tính chất của pectin ...... 26 1.2.3.1. Tính chất hóa học của pectin ...... 26 1.2.3.2. Tính chất vật lý của pectin...... 27 1.2.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin ...... 28 1.2.4.1. Hoạt tính sinh học ...... 28 1.2.4.2. Ứng dụng của pectin...... 30 1.3. TỔNG QUAN CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PECTIN ...... 32 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PECTIN ...... 34 1.4.1.1. Xác định thành phần đường đơn ...... 35 1.4.1.2. Xác định chỉ số methoxyl hóa và chỉ số ester hóa ...... 35 2

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PECTIN TỪ CỎ BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ...... 36 1.5.1. Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển trên thế giới ...... 36 1.5.2. Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển ở Việt Nam ...... 38 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 40 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...... 40 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...... 40 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất ...... 40 2.1.2.1. Dụng cụ ...... 40 2.1.2.2. Thiết bị ...... 41 2.1.2.3. Hóa chất ...... 41 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 41 2.2.1. Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu đề tài ...... 41 2.2.2. Chiết tách và thu nhận pectin ...... 44 2.2.3. Phƣơng pháp xác định tính chất lƣu biến gel của pectin ...... 45 2.2.4. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học của pectin ...... 45 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate ...... 45 2.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate ...... 45 2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid ...... 45 2.2.4.4. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide ...... 45 2.2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin ...... 45 2.2.6. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) ...... 46 2.3. THỰC NGHIỆM ...... 46 2.3.1. Chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển ...... 46 2.3.2. Xác định tính chất lƣu biến gel của pectin ...... 47 3

2.3.3. Xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate ...... 47 2.3.4. Xác định hàm lƣợng sulfate ...... 48 2.3.5. Xác định hàm lƣợng uronic acid ...... 48 2.3.6. Xác định thành phần monosaccharide ...... 48 2.3.7. Xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin ...... 49 2.3.7.1. Xác định trọng lượng tương đương ...... 49 2.3.7.2. Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid anhydro uronic tổng (AUA) ...... 50 2.3.7.3. Xác định mức độ ester hóa (DE) ...... 50 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...... 50 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...... 51 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN ...... 51 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA PECTIN ...... 53 3.2.1. Tính chất lƣu biến gel của pectin ...... 54 3.2.2. Thành phần hóa học của pectin ...... 54 3.2.2.1. Hàm lượng tổng carbohydrate và acid uronic ...... 54 3.2.2.2. Hàm lượng sulfate ...... 58 3.2.2.3. Thành phần đường đơn ...... 59 3.2.3. Các chỉ số đặc trƣng tính chất hóa lý của pectin ...... 62 3.2.3.1. Trọng lượng tương đương ...... 62 3.2.3.2. Hàm lượng AUA ...... 63 3.2.3.3. Hàm lượng methoxyl và ester hóa ...... 63 3.2.4. Đặc trƣng cấu trúc của pectin ...... 66 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...... 69 4.1. KẾT LUẬN ...... 69 4

4.2. KIẾN NGHỊ ...... 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 71

5

MỞ ĐẦU Việt Nam đƣợc quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nƣớc rộng hơn 1.000.000 km2 là một trong những vùng biển quan trọng của thế giới. Bên cạnh đó, vùng biển Việt Nam có hệ sinh thái rất đa dạng và phong phú, trong đó có cỏ biển. Cỏ biển (seagrass) là nhóm thực vật có hoa duy nhất sống trong môi trƣờng biển và nƣớc lợ. Tuy có số lƣợng loài tƣơng đối ít so với các nhóm sinh vật biển khác, nhƣng cỏ biển có vai trò sinh thái rất quan trọng không kém rạn san hô và rừng ngập mặn. Hội nghị quốc tế về cỏ biển lần thứ III họp tại Manila – Philipin tháng 4/1998 đã nhất trí thông qua ―Hiến chương cỏ biển‖ gửi Tổng thƣ ký Liên hợp quốc và các nƣớc có biển cần phải quan tâm tới việc bảo vệ và phát triển nguồn lợi cỏ biển [1]. Hệ sinh thái cỏ biển là một trong ba hệ sinh thái biển điển hình của vùng biển nhiệt đới (gồm rừng ngập mặn, cỏ biển, san hô). Hệ sinh thái cỏ biển đóng vai trò rất quan trọng, chúng tham gia chu trình dinh dƣỡng trong biển và đại dƣơng thế giới ƣớc tính khoảng 3,8 nghìn tỷ USD và giá trị trung bình đạt 212.000 USD/ha cỏ biển/năm. Ngoài giá trị sinh thái nhƣ điều chỉnh môi trƣờng, bãi đẻ của một số loài hải sản. Cỏ biển còn đƣợc sử dụng trực tiếp trong nhiều ngành kinh tế quốc dân (nhƣ làm giấy viết, hóa chất, chất cách âm cách nhiệt, thuốc chữa bệnh, thực phẩm, thủ công mỹ nghệ, phân bón, thức ăn gia súc,…) [1]. Hiện nay, có khoảng 14 loài cỏ biển đƣợc ghi nhận tại Việt Nam (Cymodocea rotundata, Cymodocea serrulata, Enhalus acoroides, Halodule pinifolia, Halodule uninervis, Halophila beccarii, Halophila decipiens, Halophila nhỏ, Halophila ovalis, Ruppia maritima, Syringgodium isoetifolium, Thalassia hemprichii, Ciliatum Thalassodendron và japonica), trong số này có loài cỏ lá dừa Enhalus acoroides là một trong 6

những loài cỏ biển có phân bố rộng rãi với trữ lƣợng lớn ở vùng biển Nha Trang. Cỏ biển từ lâu đã đƣợc sử dụng trong những bài thuốc dân gian để điều trị một số bệnh nhƣ: sốt, bệnh về da, đau cơ, bỏng, các vấn đề về dạ dày, thuốc giảm đau cho trẻ con,… Các công dụng trị bệnh của cỏ biển đƣợc cho là do trong thành phần của chúng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ polyphenol, flavonoid, terpenoid, pectin,… Trong đó, pectin là một trong 03 polysaccharide tự nhiên chủ yếu của thành tế bào thực vật, thuật ngữ pectin đƣợc sử dụng cho một nhóm các acidic heteropolysaccharide. Mạch polymer của pectin đƣợc tạo nên bởi các gốc acid D-galacturonic liên kết với nhau thông qua liên kết α(14)-, mạch nhánh có thể đƣợc tạo thành bởi các gốc đƣờng khác thông qua liên kết α(12)- với gốc acid galacturonic nhƣ: arabinose, galactose, rhamnose, galactopyranse, arabinofuranose, fucopyranose, apiose,… Tƣơng tự nhƣ các polysaccharide thực vật khác, cấu trúc và thành phần của pectin của cỏ biển thay đổi theo loài cũng nhƣ điều kiện môi trƣờng sống. Pectin chủ yếu đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm nhờ tính chất tạo gel của chúng. Ngoài ra, pectin cũng đƣợc sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng nhờ các hoạt tính sinh học quý nhƣ: chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, kháng ung thƣ, kháng viêm, liên kết mạnh với một số kim loại nặng nhƣ Hg, Pb, Cd, Ce,… Vùng biển Nha Trang với nguồn thảm cỏ biển dồi dào và đa dạng, nhƣng các nghiên cứu về cỏ biển ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu về sinh thái, sự phân bố, phân loại và bảo tồn. Trong khi đó các hợp chất có hoạt tính sinh học quý có trong cỏ biển chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu, trong đó có pectin. Vì vậy, việc “Xác định một số tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ biển Enhalus acoroides ở Khánh Hòa” là cần thiết nhằm đánh giá giá trị của cỏ biển về mặt dƣợc liệu và đồng thời tìm ra các hoạt tính sinh học mới từ cỏ biển.

7

Mục tiêu của luận văn:  Phân tích thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của pectin thu nhận đƣợc từ cỏ biển Enhalus acoroides. Để đạt đƣợc các mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:  Thu thập cỏ biển Enhalus acoroides tại vùng biển Cam Lâm (Khánh Hòa).  Tách chiết và phân đoạn pectin từ cỏ biển thu đƣợc.  Phân tích thành phần hóa học của pectin và các phân đoạn của chúng.  Xác định một số chỉ số đặc trƣng của pectin thu đƣợc.  Xác định đặc điểm cấu trúc của phân đoạn pectin thu đƣợc từ cỏ biển Enhalus acoroides. Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin về phƣơng pháp chiết tách, thu nhận và đặc điểm cấu trúc của pectin có trong cỏ biển Enhalus acoroides tại vùng biển Cam Lâm (Khánh Hòa). Từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về loại cỏ biển này và một số loài cỏ biển khác. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài sẽ góp phần đánh giá giá trị của cỏ biển nhƣ là nguồn hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đồng thời giúp định hƣớng nghiên cứu khai thác và sử dụng bền vững nguồn lợi từ cỏ biển nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị sử dụng cao trong lĩnh vực: thực phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dƣợc phẩm.

8

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CỎ BIỂN 1.1.1. Giới thiệu và sự phân bố cỏ biển 1.1.1.1. Giới thiệu chung về cỏ biển Cỏ biển (seagrasses) là nhóm thực vật có hoa duy nhất sống trong môi trƣờng biển và nƣớc lợ, thuộc ngành Anthophyta, lớp một lá mầm Monocotyledoneae, bộ Helobiae. Cũng giống nhƣ các loài thực vật bậc cao trên cạn, cỏ biển có rễ, thân bò, thân đứng, lá, bẹ lá, cuống lá, hoa, quả và hạt. Cỏ biển khác các cây trên cạn là có một số cấu trúc thích nghi với môi nƣớc biển ven bờ, ven đảo. Cùng với các loài sinh vật phù du, rong biển và cây ngập mặn, cỏ biển đã tạo nên nhóm những loài thực vật biển rất quan trọng đối với hệ sinh thái biển nói chung [2]. Thảm cỏ biển cùng với rạn san hô và rừng ngập mặn tạo thành ba hệ sinh thái quan trọng bậc nhất vùng bờ. Thảm cỏ biển đƣợc mệnh danh “rừng mƣa nhiệt đới dƣới biển” vì tính phức tạp về cấu trúc và tính đa dạng sinh học đi kèm, cũng nhƣ năng suất sinh học rất cao [2]. Hệ sinh thái cỏ biển là một trong những hệ sinh thái biển nhiệt đới điển hình, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và ổn định môi trƣờng của vùng nƣớc biển ven bờ, tạo nguồn thức ăn, nơi cƣ trú và sinh sản cho các loài thủy sản và là nguồn cung cấp vật chất hữu cơ. Cách đây 100 triệu năm, các nhà khoa học dựa vào kết quả nghiên cứu hóa thạch đã tìm ra loại cỏ biển đầu tiên, cho đến nay trên thế giới có khoảng 60 loài thuộc 4 họ [3]. Do đặc điểm sống trong môi trƣờng có độ muối cao, khả năng thẩm thấu mạnh nên cỏ biển có chứa một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác so với các thực vật sống ở nƣớc ngọt và ở trên cạn. Cỏ biển nói riêng và thực vật biển nói chung là nguồn tạo ra một lƣợng lớn và đa dạng về cấu trúc các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học cao nhƣ (polyphenol, flavonoid, terpenoid, polysaccharide, polysaccharide sulfat hóa…). Các hợp chất này có tiềm năng rất lớn để phát triển thành các sản phẩm hữu ích có giá trị cao trong các lĩnh vực nhƣ: thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm, dƣợc phẩm. Chính nhờ các hợp chất có hoạt tính 9

sinh học tốt mà cỏ biển từ xa xƣa cũng đã đƣợc sử dụng trong những bài thuốc dân gian để điều trị một số bệnh nhƣ: sốt, các bệnh về da, đau cơ, bỏng, các vấn đề về dạ dày, thuốc giảm đau cho trẻ con,… [4]. Khi nhắc đến cỏ biển, rong biển và tảo biển, thông thƣờng dễ bị nhầm lẫn các loài này với nhau. Tuy nhiên, chúng có rất nhiều điểm khác nhau nhƣ: cỏ biển thƣờng phát triển thành đồng cỏ rộng lớn nơi chúng mọc. Xét về tiến hóa thì cỏ biển tiến hóa cao hơn tảo; cỏ biển có hoa, quả và hạt, còn tảo thì chỉ có bào tử; tảo có rễ giả nhƣng cỏ biển thì có rễ, lá và thân ngầm; cỏ biển là thực vật có mạch, hệ thống các mạch có nhiêm vụ dẫn truyền các chất đến khắp nơi nuôi dƣỡng cơ thể, còn tảo chỉ có các quản bào nên khả năng dẫn truyền kém [4]. Về đặc điểm hình thái, các loài cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối đầy đủ. Hầu hết cỏ biển có hình thái ngoài khá giống nhau, bao gồm thân bò phân đốt, thân đứng, rễ, chồi mang lá, hoa và quả tùy thuộc vào từng thời điểm sinh trƣởng [5, 6] (Hình 1.1).

Hình 1.1: Hình thái chung của cỏ biển. (Nguồn: www.seagrasswatch.org) + Rễ (root): Rễ thƣờng mọc ra từ các đốt ở phần dƣới của thân bò, hệ thống rễ phát triển mạnh, rễ của mỗi loài đều có đặc điểm riêng, phân nhánh nhƣ ở chi Cymodoceae hoặc ít phát triển, không phân nhánh kèm theo nhiều 10

lông mịn nhƣ ở chi Halophila. Số lƣợng rễ ở mỗi đốt có thể là một hay nhiều tùy vào mỗi loài. + Thân (rhizome): Thân gồm có phần thân bò hoặc thân ngầm và chồi đứng hoặc thân đứng (shoot). Thân thƣờng có dạng hình trụ tròn hoặc dẹp; chia nhánh theo kiểu đơn trục hay không có qui luật. Trên thân bò có nhiều đốt, khoảng cách giữa các đốt là lóng (gióng). Tùy loài mà thân bò mọc ngầm dƣới lớp bùn (cát) đáy hoặc bò lan trên mặt nền đáy. Từ đốt mọc lên một hay nhiều chồi đứng, chồi đứng thƣờng mang các lá. + Lá – phiến lá (leaf blade): Lá hình thành từ mô sinh trƣởng ở các mấu thân; có hình dải dài, ô van hay trụ tròn. Đây là chỉ tiêu hình thái quan trọng trong định loại cỏ. Đa phần các loài cỏ có lá không có cuống, ngoại trừ ở một số chi Halophila. Lá có cuống thƣờng có hình ô van, còn các lá không cuống có hình dải dài nhƣ ở chi Cymodoceae. Trên lá có các gân chạy song song hay gần hình lông chim, các gân song song đƣợc nối với nhau bằng cách vách ngăn. Chóp lá tròn nhẵn hay có gai nhọn. Lƣỡi (bìa) lá nhẵn hoặc có răng cƣa nhỏ. + Bẹ lá (sheath): Bẹ lá là phần cuống lá phình ra ôm lấy chồi đứng (thân đứng) và bọc lấy những lá non đang phát triển. Bẹ lá có dạng lƣỡi nhỏ, màu trắng do không có lục lạp nên không có chức năng quang hợp. + Sẹo lá (leaf scars): Khi các lá rụng đi sẽ để lại các sẹo trên thân đứng, sẹo lá mở (nhƣ ở loài Cymodoceae serrulata) hay sẹo lá đóng (nhƣ ở loài Cymodoceae rotundata) là tùy vào mỗi loài. Các sẹo lá là một kiểu biểu thị cách sắp xếp của lá. + Hoa, quả và hạt: Hoa, quả và hạt là cơ quan sinh sản hữu tính của thực vật hạt kín nói chung và của cỏ biển nói riêng. Ở cỏ biển, một số có hoa đực và hoa cái trên cùng một cây (đơn tính cùng gốc), số khác có hoa đực và hoa cái riêng biệt trên mỗi cây (đơn tính khác gốc). Quả đƣợc hình thành từ sự phát triển của bầu sau thụ tinh (giao phấn) và mang các hạt bên trong. Hạt đƣợc hình thành từ sự phát triển của noãn. Hoa, quả và hạt của mỗi loài tùy vào điều kiện sống mà chúng có cấu trúc và hình dạng khác nhau. 11

1.1.1.2. Cỏ biển Enhalus acoroides Cỏ biển Enhalus acoroides thuộc bộ Trạch tả (); họ Hydrocharitaceae (Hình 1.2).

Hình 1.2: Cỏ biển Enhalus acoroides E. acoroides là loài cỏ biển lớn nhất, đƣợc phân bố rộng rãi dọc theo bờ biển Bắc Úc, Đông Nam Á, Tây Nam Bộ, Nam Mỹ và Đông Phi [7]. Ở Thái Lan, loài này thƣờng đƣợc tìm thấy ở Vịnh Thái Lan và biển Andaman. E. acoroides đƣợc tìm thấy trong khu vực bãi triều và có sinh khối cao. Ở Thái Lan, nó đƣợc phát hiện ở các kênh nƣớc lợ xuống các vùng bãi triều, cát bùn và các rạn san hô ở độ sâu 0,5 - 1,0 m. Tại Indonesia, E. acoroides phát triển trong nhiều loại trầm tích khác nhau, từ cát đến cát thô, ở các khu vực có sự gia tăng sinh học cao. Ở Philippines, nó tập trung các vùng đồi yên tĩnh và cửa sông. Ở bán đảo Malaysia, nó phổ biến quanh bờ biển và các khu vực tiếp xúc khi triều thấp [7]. So với các nƣớc trong khu vực thì Việt Nam đứng thứ 3 về đa dạng loài cỏ biển chỉ sau Australia đứng thứ nhất (20 loài) và Philippines đứng thứ hai (16 loài) (UNEP, 2004). E. acoroides phân bố đặc trƣng ở Bắc, Trung, Nam tại các tỉnh Khánh Hòa, Bình Thuận, đảo Phú Quốc… Điều này không chỉ thể hiện ở thành phần loài, diện tích phân bố mà còn ở cả đặc trƣng sinh học của cỏ biển, là kết quả của sự tƣơng tác của các quần thể của từng loài với điều kiện môi trƣờng. 12

E. acoroides có đặc điểm: lá dạng dải băng rất dài từ 30 - 150 cm, lá có đầu cong vào trong, vỏ bọc cuống lá dày, có các rễ và lông dài màu đen, tìm thấy ở vùng nƣớc cạn, bãi cát vùng triều và những bãi bùn. Các cạnh của lá đƣợc cán nhỏ và có các kênh không khí trong đó. Lá dài phát triển để nắm bắt nhiều ánh sáng. Đây là loài duy nhất giải phóng hạt phấn lên bề mặt nƣớc trong sinh sản, hạn chế sự phân bố của nó tới vùng bãi triều cạn. Đây là loài đang phát triển chậm và sức đề kháng kém [7]. Hoa nâu rất nhỏ (1 cm) và khi chúng nổi trên bề mặt nƣớc, chúng trông giống nhƣ những miếng polystyrene trắng hoặc dạng xốp cách nhỏ. Các hoa đực đƣợc tạo ra từ một cụm hoa hình thành dƣới gốc cây. Hoa đực có một đầu không thấm nƣớc, còn đầu kia lại hấp dẫn nƣớc. Vì vậy, hoa sẽ đứng thẳng trên mặt nƣớc. Những bông hoa đực có xu hƣớng hình thành bè. Hoa cái lớn và đƣợc giữ trên một cuống dài. Nó có ba cánh hoa trắng gân (2-3 cm), thƣờng rơi rụng một ngày sau khi nở. Khi thủy triều xuống, những cánh hoa trải dài trên bề mặt nƣớc tiếp xúc với hoa đực nổi. Các cánh hoa dài của hoa cái là không thấm nƣớc, trừ phần trung tâm. Quả có hình tròn và có đƣờng kính lớn (đƣờng kính 4 - 6 cm) với lớp lông dày, có gân. Khi chín, trái cây tách ra nở 6 - 7 hạt trắng. Hạt giống trôi nổi chỉ khoảng 5 giờ trƣớc khi chúng bắt đầu chìm, do đó chúng không đi xa. Các rễ phát triển nhanh và hạt mọc nhanh. Giống nhƣ các loài cỏ biển khác, cỏ biển E. acoroides phát tán chủ yếu bằng sự sinh sản sinh dƣỡng. Ngoài ra hạt của cỏ biển E. acoroides đƣợc những ngƣời dân sống trên bờ biển của Úc và Philippines dùng làm thức ăn. Khi ăn sống hạt cỏ biển đƣợc coi là hƣơng vị giống nhƣ hạt dẻ nƣớc. Một chất xơ bền hữu ích và đƣợc ứng dụng làm lƣới đánh cá [8]. 1.1.1.3. Phân bố của hệ sinh thái cỏ biển Liên Hợp Quốc đã công bố bản đồ đầu tiên về sự phân bố cỏ biển trên toàn cầu và nhận thấy 15% đã biến mất trong 10 năm qua. Theo Trung tâm giám sát và bảo vệ môi trƣờng thế giới của Liên Hiệp Quốc tại Cambridge, đã xác định đƣợc diện tích phân bố của cỏ biển trên toàn cầu là 177.000 km2, 13

bằng 2/3 diện tích nƣớc Anh. Hiện có khoảng 60 loài cỏ biển khác nhau mọc thành những thảm cỏ lớn ở cả biển nhiệt đới và ôn đới [4]. Trong một vùng cỏ biển thƣờng chỉ có một hoặc vài loài chiếm ƣu thế nhƣng cũng có những khu vực lên đến trên 10 loài. Ở các vùng biển nhiệt đới, cỏ biển thƣờng đa dạng hơn vùng biển ôn đới. Các thảm cỏ biển tập trung ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dƣơng, vịnh Caribbe và vùng Thái Bình Dƣơng thuộc Trung Mỹ. Vùng Đông Á có hệ cỏ biển đa dạng nhất thế giới và có thể đây là trung tâm phát tán của cỏ biển. Chính vì vậy, chúng rất phong phú ở dải ven biển thuộc vùng này [9]. Vịnh Shark ở Nam Phi tuy không phong phú về số lƣợng loài (12 loài) nhƣng lại là một trong những nơi có thảm cỏ biển lớn nhất thế giới. Tại đây thảm cỏ biển có diện tích khoảng 4000 km2, trong đó loài chiếm 85% diện tích cỏ biển của khu vực này là Amphibolis Antarctica. Cỏ biển cũng nhƣ các sinh vật khác đều chịu nhiều tác động tổng hợp của các yếu tố môi trƣờng đặc biệt là ánh sáng, vì chúng cần ánh sáng để quang hợp, do đó cỏ biển chỉ mọc ở tầng nƣớc mà ánh sáng có thể chiếu tới đƣợc. Cỏ biển cũng không thể tồn tại đƣợc ở khu vực thủy triều quá thấp nơi chúng dễ bị đốt nóng bởi ánh sáng mặt trời. Cỏ biển đƣợc tìm thấy gần các rừng ngập mặn, cửa sông, vịnh, đầm, chúng phát triển mạnh ở các bờ biển cạn, mặc dù vậy có những nơi ngƣời ta tìm thấy chúng ở độ sâu 32 m tới 68m, đối với một số loài thuộc chi Halophila ở Đại Tây Dƣơng còn có thể gặp ở độ sâu lên tới 90m [4]. Hiện nay, Việt Nam có 14 loài cỏ biển. Theo thống kê chƣa đầy đủ, diện tích phân bố cỏ biển hiện nay ở Việt Nam khoảng trên 10.000 ha, vùng ven biển Việt Nam, nơi có nhiều đầm phá và vịnh rất phù hợp cho sự phát triển của các loài cỏ biển. Các loài cỏ biển ƣu thế là Enhalus acoroides, Thalassia hemprichii, Cymodocea serrulata, Halodule uninervis, Halophila ovalis và Zostera japonica, chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Trung và phía Nam, ven các đảo Phú Quý (Bình Thuận), Côn Sơn (Bà Rịa – Vũng Tàu), Phú Quốc (Kiên Giang): 10 loài. Trong số các loài thì cỏ biển lá dừa Enhalus 14

acoroides đƣợc phát hiện có phân bố rộng, mật độ dày trong vùng biển Khánh Hòa (Phụ lục 1) [4]. Ở nƣớc ta, cỏ biển thƣờng phát triển ở vùng thủy triều ven biển, ven đảo, các vùng cửa sông, rừng ngập mặn, đầm phá. Các loài cỏ biển phát triển hầu nhƣ quanh năm, nhƣng tốt nhất là vào mùa xuân và đầu hè, phát triển kém vào mùa mƣa bão. Chúng phân bố từ vùng thủy triều đến độ sâu 3 – 15m, thậm chí là 28 m (Đảo Bạch Long Vĩ) và thích nghi với độ muối từ 5 đến 34‰, chất đáy là bùn bột nhỏ, bùn cát, cát san hô, cát thô và sỏi (Phụ lục 1). Hầu nhƣ các nghiên cứu về cỏ biển ở Việt Nam tập trung chủ yếu về điều tra, phân loại và hệ sinh thái của chúng và chƣa có nghiên cứu nào về các hoạt chất sinh học đƣợc tìm thấy ở cỏ biển [4]. 1.1.2. Một số thành phần hóa học của cỏ biển 1.1.2.1. Thành phần hóa học của cỏ biển  Polysaccharide Glucose, galactose và mannose là các loại đƣờng hòa tan thƣờng có trong các polysaccharide ở cỏ biển. Hàm lƣợng các thành phần không hòa tan của polysaccharide là cao hơn nhiều so với các thành phần tan có trong polysaccharide. Dữ liệu cho thấy các thành phần chính của thành tế bào Posidonia là cellulose và lignin (lần lƣợt là 190 – 209 và 145 – 154 g kg-1). Carbohydrate ở cỏ biển tồn tại khác biệt với thực vật trên cạn. Trong chất inositols có thể có năm chất đƣợc biết là có trong thực vật nhƣ myo-, 1-chiro, muco- và O-methyl-muco inositol xuất hiện ở cỏ biển. Lá và thân rễ của một số loài cỏ biển, đặc biệt là , chứa một lƣợng tƣơng đối lớn myo- inositol, tối đa là 2,2% trọng lƣợng khô Zosteranoltii rhizomes [10].  Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Cỏ biển tự sinh ra dimethylsulfonioproponate nhƣ là một chất bảo vệ thực vật, phần lớn chúng bị phân hủy bởi vi khuẩn biển, đảm bảo vai trò quan trọng trong chu trình vòng lƣu huỳnh. Trong các loài cỏ biển, nồng độ DMSP khác nhau đƣợc tìm thấy: Halodule wrightii là 3,3mol g-1 trọng lƣợng tƣơi, 15

Syringodium filiforme là 0,1 mol g-1 trọng lƣợng tƣơi, Thalassia testudinum trong các lá tế bào biểu mô và ngoài tế bào biểu mô, nằm ở khoảng giữa 0,18 và 4,0 mol g-1 trọng lƣợng tƣơi và ở thân rễ thì hàm lƣợng thấp. Những kết quả này chỉ ra rằng mức độ giống nhau cũng nhƣ vai trò chính của cỏ biển với sự đóng góp tổng hàm lƣợng DMSP [10].  Protein và peptit Cỏ biển có khả năng hấp thụ kim loại nặng từ môi trƣờng xung quanh và để tích lũy chúng trong các mô với mức độ khác nhau. Sự hấp thụ và tích tụ của chúng qua trung gian protein và peptit. Các chuỗi peptit gắn kim loại có chứa glutathione thƣờng có cấu trúc –Gly (11) là các peptit tổng hợp enzym và đƣợc biết là có ảnh hƣởng đến các kim loại nặng, chủ yếu là Cd và As, đã đƣợc chứng minh trong thực vật, tảo và một số loại nấm men phát triển khi ở nồng độ cao. Cho đến nay, không có thành phần chính xác của phytochelatin (PC) trong cỏ biển hoặc enzym tổng hợp, khi PC đã đƣợc phân tích trên cỏ biển. Metallothionein (MT) là một nhóm với các protein có khối lƣợng phân tử thấp và hàm lƣợng cystein cao gắn kết các kim loại nặng và đƣợc cho là có vai trò trong quá trình trao đổi chất và giải độc. Các tiêu chí xác định protein hoặc peptit nhƣ MT là (i) trọng lƣợng phân tử thấp (<10 KDa) (ii) hàm lƣợng kim loại và lƣu huỳnh cao (>10%), (iii) các đặc tính quang phổ điển hình của liên kết M – S và (iv) không có hoặc ít các acid amine thơm. Tuy nhiên, khi tất cả các tiêu chí không đƣợc hoàn thành, các protein thƣờng đƣợc gọi là các protein giống nhƣ MT [10]. 1.1.2.2. Một số hợp chất có hoạt tính sinh học ở cỏ biển  Polyphenol Polyphenol là chất chống oxy hóa đặc biệt quan trọng, với tiềm năng chống oxy hóa cao, cho phép chúng hoạt động nhƣ các tác nhân khử. Cỏ biển chứa nhiều chất polyphenol nhƣ acid phenolic, flavonoid, anthocyanidin, lignin, tannin, catechin, epicatechin, epigallocatechin và acid gallic. Các hợp chất polyphenolic này đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khoẻ nhƣ chống oxy hoá, chống ung thƣ, thuốc kháng virus, chống viêm và 16

khả năng ức chế sự kết tập tiểu cầu ở ngƣời. Một số nghiên cứu cho thấy mối tƣơng quan giữa lƣợng chất chống oxy hoá tự nhiên tăng lên và giảm bệnh tim mạch, tử vong do ung thƣ và tuổi thọ kéo dài [11]. Hơn nữa, chúng có hoạt tính chống oxy hoá cao có thể đƣợc sử dụng thành công để ngăn ngừa nhiều rối loạn chức năng cơ quan do ion kim loại độc hại gây ra. Các báo cáo trƣớc đó cho thấy các polyphenol có thể tái tạo α-tocopherol thông qua việc giảm gốc tự do α-tocopheroxyl. Sự kết hợp chặt chẽ giữa hoạt động chống ung thƣ và hoạt động chống oxy hoá đã đƣợc báo cáo trong một hệ thống gây ung thƣ ở chuột với các polyphenol có trọng lƣợng phân tử thấp. Các hợp chất phenol đã đƣợc phân lập từ Zostera marina, loài cỏ biển thƣờng đƣợc gọi là thạch đỏ, và có một vai trò quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế là các chất đƣợc chiết xuất từ Z. marina đã đƣợc tìm thấy có khả năng ức chế sự gắn kết của các vi khuẩn biển, tảo và giun nhiều tơ trên bề mặt của các hợp chất phenolic từ Z. marina. Ít nhất 23 hợp chất phenolic đƣợc xác định trên cỏ biển [12].  Flavonoid Sự hiện diện của flavone sulfate đã đƣợc báo cáo ở các loài Halophila, Thalassia và Zostera, nhƣng chúng lại không có trong Syringodium spp. hoặc Posidonia oceanica. Flavonoid sulfate cũng đƣợc phát hiện trong Halophila ovalis và Thalassia testudinum. Bốn flavone nhƣ luteolin, apigenin, luteolin-3 glucoronide, và luteolin-4-O-glucoronide, có tiềm năng kháng khuẩn đã đƣợc xác định từ các chiết xuất bằng ethanol. Sau đó, họ đã tìm thấy sự hao hụt đáng kể của flavonoid khi phân tích lá khô đông lạnh và gần nhƣ ngƣợc lại với lá tƣơi và sấy khô của Posidonia oceanica. Bitam và cộng sự đã phân lập và xác định các chất dẫn xuất flavone glycosid malonylated từ Halophila stipulacea nhờ sử dụng HPLC và NMR. Heglmeier và Zidorn đã biên soạn và đánh giá dữ liệu về các chất chuyển hóa thứ sinh của Posidonia oceanica và tổng kết có 51 sản phẩm tự nhiên bao gồm phenol, phenylmethane, phenylethane, dẫn xuất phenylpropane và ester của chúng, chalkones và flavonoid. Lƣợng flavonoid cao hơn đáng kể đã đƣợc quan sát thấy ở các lá của Halophila johnsonii và lá của Halophila decipiens trong bãi triều [10]. 17

 Terpenoid Các phân tử đƣợc tìm thấy trong các loại thực vật trên cạn nhƣ acid caffeic, inositol, sucrose, monoglucoside quercetin, monoglucoside của isoramnetin, acid cichoric, cũng nhƣ các polyamines nhƣ putrescine, spermidine và spermine đã đƣợc báo cáo là thành phần có ở cỏ biển Cymodocea nodosa. Hơn nữa, 24α-etyl sterol và 24α-metyl sterol cùng với 24ꞵ-epimers, cymodiene và cymodienol, các diarylheptanoid đầu tiên đƣợc phân lập từ sinh vật biển, bao gồm tổng số chất chuyển hóa đƣợc phân lập từ C. nodosa cho đến nay. Gần đây, các hợp chất mới terpenoid từ lớp cấu trúc của các diarylheptanoid, meroterpenoid đầu tiên đƣợc phân lập từ cỏ biển. Tất cả các hợp chất mới phát hiện đã đƣợc thí nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn của chúng đối với các chủng vi khuẩn kháng thuốc (MDR) và kháng methicillin. Hoạt động từ yếu đến mạnh và do đó mở ra cánh cửa cho việc xây dựng các kháng sinh mới cần thiết một cách nhanh chóng do sự gia tăng các dòng kháng thuốc, đặc biệt là trong các bệnh viện. Có một số lƣợng lớn các hoạt chất với hoạt tính kháng sinh tiềm năng có thể đƣợc chiết xuất từ cỏ biển. Các nghiên cứu hóa học và sinh học của dịch chiết chloroform từ Posidonia oceanica, đã đƣợc phân lập và xác định chất mới: (E)-3, 7, 12- Trimethyltridec-2-en-1-ol có tên posidozinol với andsitosterol và bốn acid béo đã biết: palmitic, palmitoleic, oleic và acid linoleic. Terpenoid tách khỏi P. oceanica có hoạt tính kháng nấm tốt [10]. Nhƣ vậy, có rất ít nghiên cứu đã đƣợc thực hiện về hoạt tính sinh học của cỏ biển và ở một số loài nhƣ Thalassia testudinum, hoạt tính kháng nấm, thuốc kháng vi-rút [13], hoặc chống viêm [14], độc tính [15]. Thành phần hóa học của một số loài cỏ biển cũng đã đƣợc mô tả, bao gồm một kháng sinh flavone glycosid từ T. testudinum [16], đƣờng từ Ruppia maritima L. [17], các hợp chất phenol từ P. oceanica [18], steroid và acid béo từ Zostera japonica [14]. 18

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ PECTIN 1.2.1. Giới thiệu chung về pectin Pectin là chất phụ gia thực phẩm ngày nay thƣờng đƣợc dùng để tạo đông, tạo gel. Tiền thân của pectin là protopectin không tan trong nƣớc và có nhiều trong mô khi cây còn xanh, quá trình chín sẽ kèm theo sự thủy phân protopectin thành pectin. Sau đó kết hợp với sự demetyl hóa dƣới tác dụng của enzym và sự depolymer hóa của pectin thành pectate và cuối cùng là các loại đƣờng hòa tan và acid. Từ thời tiền sử chất pectin đã là thành phần trong khẩu phần ăn của con ngƣời. Nhƣng chỉ mới nửa thế kỷ trƣớc, ngành công nghệ thực phẩm mới nhận biết đƣợc vai trò quan trọng của phụ gia pectin trong việc đa dạng các sản phẩm thực phẩm. Pectin đƣợc xem nhƣ là thành phần thiết yếu của thành tế bào các thực vật nở hoa bậc cao [9, 19]. Hàm lƣợng trung bình của pectin trong thành tế bào thực vật có thể đạt 30%. Cùng với các thành phần khác, pectin tạo ra độ bền và khả năng giãn nở của các thành tế bào cũng nhƣ một số chức năng cần thiết duy trì cho sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Thêm nữa, pectin còn có chức năng tăng sức đề kháng của cây để chống lại dịch bệnh [20]. Pectin đƣợc chiết xuất ở qui mô công nghiệp từ các nguyên liệu nhƣ củ cải đƣờng, bã táo ép, vỏ cam và quýt [11]. Trong công nghiệp pectin thƣờng đƣợc sử dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm làm chất tạo gel, làm dày và chất ổn định cũng nhƣ chất nhũ hóa. Bên cạnh các thực vật trên cạn, pectin cũng có thể đƣợc thu nhận từ nguồn thực vật biển nhƣ cỏ biển thuộc họ Zosteraceae [21].  Nguồn nguyên liệu giàu pectin Trong thực vật pectin thƣờng đƣợc liên kết với cellulose ở vách tế bào. Pectin tồn tại với hàm lƣợng khác nhau trong củ, quả, thân của một số loài thực vật: bƣởi, táo, mận, cam, chanh, cà rốt… Bảng 1.1 sau đây sẽ thể hiện một số loại nguyên liệu chứa pectin. Pectin có nguồn gốc từ cỏ biển đƣợc biết hiện nay vẫn chƣa đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm mà chủ yếu dùng để làm thực phẩm chức năng. 19

Bảng 1.1: Hàm lƣợng pectin trong các loại nguyên liệu khác nhau [22]

Nguyên liệu Hàm lƣợng pectin

Bã táo 10 – 15%

Củ cải đƣờng 10 – 20%

Đài hoa hƣớng dƣơng 15 – 25%

Vỏ citrus 20 – 30%

1.2.2. Đa dạng cấu trúc của pectin 1.2.2.1. Cấu tạo chung Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật và nó có chứa ít nhất 65% acid galacturonic đƣợc liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glycoside, trong

đó một số gốc –COOH đƣợc methoxyl hóa thành –CH3O. Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là galactoronic và rƣợu metylic. Trọng lƣợng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC. Hàm lƣợng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60% đƣờng và điều chỉnh pH từ 3,1 - 3,4 sản phẩm sẽ tạo đông. 20

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của petin. (a) phân tử acid galacturonic, (b) cấu trúc của pectin homogalacturonan Pectin gồm có 3 loại polysaccharide: (1) dạng homopymer mạch thẳng là homogalacturonan (HG); (2) dạng polymer mạch nhánh là rhamnogalacturonan I (RG-I) và dạng (3) là rhanogalacturonan II (RG-II) với các gốc galacturonan ở mạch nhánh. Đây là dạng có phân bố rộng rãi nhất [25]. HG cấu tạo nên 57-69% pectin với các gốc acid α-D-galacturonic liên kết 1,4 trong đó 8-74% các nhóm cacboxyl đƣợc ester hóa bởi methanol. RG- I đƣợc tạo nên bởi các gốc galacturonan liên kết với nhau thông qua một hoặc hai gốc α-L-rhamnose bằng liên kết 1,2. Chiều dài đoạn mạch HG vẫn chƣa đƣợc biết nhƣng mức độ polymer hóa của nó nằm trong khoảng từ 30-200. RG-I chiếm từ 7-14% pectin, khoảng 20-80% rhamnose đƣợc chẻ nhánh bởi các gốc L-arainose, D-galactose, L-aranbinan, galactan, hoặc arabinogalactan, mạch nhánh gồm các kiểu liên kết khác nhau của các gốc arabinan liên kết α- 1,5; α-1,3 và các gốc galactan và arabinogatactan liên kết ꞵ-1,4 hoặc ꞵ-1,3 và ꞵ-1,6. Pectin cỏ biển đƣợc đặc trƣng bởi sự thể hiện của các mảnh apiogalacturonan trong đó các gốc D-apiose liên kết với gốc acid D- galacturonic bởi các liên kết 1,2- và 1,3- [26]. Khoảng 10-11% pectin đƣợc tạo nên RG-II bao gồm mạch chính là các gốc galacturonan với 4 kiểu mạch nhánh có cấu trúc phức tạp có thể cấu tạo bởi 12 loại đƣờng khác nhau, bao 21

gồm cả gốc đƣờng nhƣ 2-O-methylxylose, 2-O-methylfucose, apiose, v.v.. [27]. Những nghiên cứu mới về cấu trúc phân tử pectin cho thấy pectin có hai vùng cấu tạo chính là vùng suôn thẳng (smooth regions) chiếm khoảng 60 – 90% khối lƣợng và vùng rậm (vairy region) chiếm 10 – 40% khối lƣợng. Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận nhƣ quả, củ, thân. Trong màng tế bào, pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lƣợng cao nhất) và ở vách tế bào sơ cấp (Hình 1.4)

Hình 1.4: Pectin trong cấu tạo của thành tế bào thực vật Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dƣới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin. Protopectin: Là dạng không tan, chủ yếu ở thành tế bào. Pectin hòa tan: tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào. Phân tử lƣợng của các loại pectin tách từ các nguồn quả khác nhau thay đổi trong giới hạn rộng 25000 – 50000. Cấu trúc hóa học của pectin đƣợc thể hiện trong Hình 1.5 [24]. 22

Hình 1.5: Các dạng cấu trúc hóa học của pectin Cấu trúc của HG và RG-I biến đổi theo loài thực vật và các dạng tế bào khác nhau do sự khác biệt về kích thƣớc phân tử polymer, mô hình acetyl hóa, mức độ methoxyl hóa cũng nhƣ sự khác biệt về chiều dài và loại mạch nhánh của RG-I. Các pectin thƣơng mại thƣờng đƣợc thu nhận theo phƣơng pháp chiết acid, dẫn tới kết quả là sự phá vỡ hoặc làm mất nhóm pectin RG-II và một lƣợng nào đó nhóm RG-I. Trong một số trƣờng hợp pectin cũng đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chiết kiềm hoặc chiết ở nhiệt độ cao để thu nhận các phân mảnh hoặc các pectin bị biến đổi về cấu trúc. Do cấu trúc phức tạp và đa dạng nên pectin sở hữu nhiều hoạt tính sinh học khác nhau. Pectin đặc trƣng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lƣợng nhóm methoxyl –OCH3 có trong phân tử pectin và chỉ số DE thể hiện mức độ ester hóa của các phân tử acid galactoronic trong phân tử pectin. Dựa trên mức độ methoxyl hóa và ester hóa, trong thƣơng mại chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl thấp. Pectin methoxyl hóa cao (Hight Methoxyl Pectin – HMP) : DE > 50% hay MI >7% (Hình 1.6). Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin- LMP): DE<50% hay MI<7% (Hình 1.7) [28]. Pectin tự nhiên đƣợc đặc trƣng bởi mức độ methoxyl hóa trên 50% ngoại trừ pectin từ cỏ biển có mức độ methoxyl hóa chỉ từ 8-10%. Pectin methoxyl thấp có thể tạo đông trong không có đƣờng. Chúng thƣờng đƣợc dùng làm màng bao bọc các sản phẩm. 23

Hình 1.6: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa cao

Hình 1.7: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa thấp Tóm lại, các nghiên cứu trƣớc đây về chiết tách và xác định cấu trúc của pectin từ cỏ biển Zostera marina L (hợp chất Zosterin) lần đầu tiên đƣợc nghiên cứu bởi Miroshnikov và cộng sự, 1940 [29], tiếp sau đó đã có một số công trình nghiên cứu về sự chiết tách và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ biển thuộc họ Zosteraceae và từ loài Phyllospadix iwatensi [10, 30, 31]. Bên cạnh đó cũng có một số công trình nghiên cứu tách chiết pectin từ một số loài trên cạn nhƣ: vỏ chanh [32], vỏ cam [33], vỏ chanh dây [34], vỏ măng cụt Indonesia [35], … Tuy nhiên, cho tới nay so với các thực vật trên cạn thì các nghiên cứu về pectin từ cỏ biển vẫn còn rất ít. 1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của pectin ở vách tế bào sơ cấp Pectin là một nhóm các polysaccharide phức tạp chứa dƣ lƣợng acid α- D-galactosyluronic (GalpA) 1,4-liên kết. Ba polysaccharide pectic (homogalacturonan, rhamnogalacturonan-I, và galacturonans thay thế) đã đƣợc phân lập từ các thành tế bào sơ cấp và có đặc trƣng cấu trúc đa dạng [27]. Homogalacturonan (HG) là một chuỗi tuyến tính các acid α-D- galactopyranosyluronic liên kết 1,4 (GalpA), trong đó một số nhóm carboxyl 24

đƣợc methyl ester hóa (Hình 1.8). HGs, tùy thuộc vào nguồn thực vật, cũng có thể đƣợc O-acetyl hóa một phần ở C- 3 hoặc C-2 [36].

Hình 1.8: Cấu trúc chính của homogalacturonan Homogalacturonan là một polymer tuyến tính có chứa các α-D-GalpA. Rhamnogalacturonan-I (RG-I) là một họ polysaccharides pectic có chứa một phần của disaccharide lặp lại [-4)–α-D-GalpA- (1- 2) –α-D-Rhap- (1-) (Hình 1.8). Các dƣ lƣợng GalpA có thể đƣợc Oacetyl hóa trên C-2 và / hoặc C-3. Không có bằng chứng hóa học kết luận rằng dƣ lƣợng GalpA đƣợc methyl ester hóa, tuy nhiên, một phần RG-I đã đƣợc báo cáo là có chứa ester methyl [37]. Các dƣ lƣợng GalpA thƣờng không đƣợc thay thế bằng các dây chuyền mono oligosaccharide, mặc dù một nghiên cứu gần đây cho thấy một đơn dƣ ꞵ-D-GlcpA đƣợc liên kết với C-3- 2% GalpA trong xƣơng sống của củ cải đƣờng RG-I [11]. Ngƣợc lại, 20-80% dƣ lƣợng rhamnosyl (Rhap), tùy thuộc vào cây trồng, nguồn và phƣơng pháp cô lập, đƣợc thay thế ở C-4 với các chuỗi bên cạnh acid oligosaccharide trung tính và acid [27]. Các chuỗi bên chủ yếu có chứa α-L-arabinofuranosyl tuyến tính và phân nhánh, hoặc ꞵ-D- galactopyranosyl (Galp) (Hình 1.9), mặc dù tỷ lệ tƣơng đối và chiều dài chuỗi của chúng có thể khác nhau tùy thuộc vào nguồn thực vật [38]. Các dƣ lƣợng glycosyl α-L-fucosyl (Fucp), ꞵ-D-glucuronosyl (GlcpA), và 4-O-methyl ꞵ-D- 25

glucuronosyl (4-O-Me GlcpA) cũng có thể có mặt nhƣ acid ferulic và coumaric [27, 39].

Hình 1.9: Mô hình đặc điểm cấu trúc của Rhamnogalacturonan-I Các galacturonan đã đƣợc biến đổi là một nhóm đa dạng các polysaccharide có chứa một phần của các α-D-GalpA tuyến tính liên kết 1,4. Các galacturonan thay thế gọi là rhamnogalacturonan II (RG-II) hiện diện trong tất cả các vách tế bào chính thực vật bậc cao phân tích cho đến nay. RG- II, RG-II liên kết với các kim loại nặng, rƣợu vang và các loại nƣớc ép trái cây khác có hàm lƣợng tƣơng đối cao (20-150 mg/l) và RG-II có các hoạt động miễn dịch đã dẫn tới sự quan tâm lớn hơn đến cấu trúc của RG- II và vai trò của polysaccharide pectic trong dinh dƣỡng và sức khoẻ con ngƣời [27, 40]. RG-II không liên quan đến cấu trúc với RG-I vì nó bao gồm các đoạn dƣ thừa α-D-GalpA liên kết với 1,4; chứ không phải là disaccharide lặp đi lặp lại [- 4) –α-D-GalpA- (1- 2) –α-L-Rhap- (1). Một nonasaccharide và một octasaccharide đƣợc gắn với C-2 ở một phần GalA còn lại và hai disaccharides có cấu trúc khác nhau. Các chuỗi C và D đƣợc gắn vào C-3 của tế bào [27]. Các galacturonan thay thế khác đã đƣợc mô tả có mặt trong các tế bào có số lƣợng hạn chế ở thực vật. Ví dụ, xylogalacturonan (XGA), chứa dƣ 26

lƣợng ꞵ-D-xylosyl (Xylp) gắn với C-3 của xƣơng sống, có mặt trong các mô ở mô sinh sản (ví dụ: táo, cà rốt, bông và thông). Apiogalacturonan, có trong các tế bào của một số loài động vật đơn giá thuỷ sinh, chứa dƣ lƣợng ꞵ- dapiofuranosyl gắn với C-2 và C-3 [41]. 1.2.3. Tính chất của pectin 1.2.3.1. Tính chất hóa học của pectin Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan. Dƣới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin. Mức độ hòa tan trong nƣớc của pectin tỉ lệ nghịch với kích thƣớc phân tử và tỷ lệ thuận với mức độ methoxyl hóa, ngoài ra mức độ tan trong nƣớc của pectin còn chịu ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ nồng độ chất tan, độ pH và nhiệt độ của dung dịch, mức độ methoxyl hóa càng cao thì khả năng tạo đông càng cao. Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin vào nƣớc, khi pectin hút đủ nƣớc thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến. Các pectin đều là những chất keo háo nƣớc có khả năng hydrate hóa cao nhờ sự gắn các phân tử nƣớc vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl galacturonic. Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng có khả năng đẩy lẫn nhau làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của dung dịch. Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích lại gần nhau và tƣơng tác với nhau tạo nên một mạng lƣới ba chiều rắn chứa pha lỏng ở bên trong. Sự tƣơng tác giữa protein và peptide với pectin dẫn đến sự hình thành các phức hòa tan và không hòa tan mà cấu trúc của chúng phụ thuộc vào tỷ lệ của các biopolymer và pH. Trong quá trình này, các liên kết cộng hóa trị giữa các dƣ lƣợng tyrosine của protein và nhóm carboxyl acid uronic của pectin đƣợc hình thành, có thể dẫn đến sự hình thành của một mạng lƣới pectin. Có một giả thuyết khác, theo đó các protein tạo thành các phức hợp ion với pectin. 27

Các protein hình cầu, nhƣ albumin huyết thanh ở bò (BSA) và β- lactoglobulin, hình thành gel, và sự pha trộn của các gel với LM pectin dẫn đến sự hình thành các loại gel hỗn hợp. Trong quá trình hình thành gel, sẽ có sự cạnh tranh động học giữa sự hình thành gel và quá trình tách pha. Việc kiểm soát tỷ lệ tƣơng đối của các quá trình này bởi các yếu tố bên ngoài, chẳng hạn nhƣ điều kiện môi trƣờng, dẫn đến một phổ rộng các cấu trúc vi mô. Sự hình thành của gel trong quá trình tƣơng tác giữa polysaccharides và protein hình cầu ở pectin đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi. Một loạt các cấu trúc và tính chất lƣu biến của các gel kết quả đã đƣợc mô tả khác nhau tùy thuộc vào tính chất của biopolyme và điều kiện tạo gel. Ngƣời ta thấy rằng sự hiện diện của cation Na+ và Ca2+ và tỷ lệ của chúng đóng một vai trò quyết định trong sự hình thành gel của hỗn hợp các protein hình cầu với pectin. Tăng lƣợng pectin và nồng độ canxi làm cho hỗn hợp gel cứng hơn. Trong quá trình hình thành và dự trữ gel, phản ứng giữa pectin và protein hoặc peptide có thể xảy ra sự hydroxyl của các nhóm ester trong pectin, decarboxyl, hoặc hydroxyl của glycoside do sự hiện diện của pectinase trong hỗn hợp. Các quá trình này nên đƣợc xem xét trong quá trình sản xuất gel pectin - protein. 1.2.3.2. Tính chất vật lý của pectin Pectin tan trong nƣớc và tạo thành dung dịch có độ nhớt rất cao. Khi tiếp xúc với nƣớc, pectin nhanh chóng hấp thu nƣớc và trƣơng nở gấp nhiều lần so với kích thƣớc ban đầu, sau đó các phân tử pectin bắt đầu tách rời khỏi hạt pectin từ ngoài vào trong cho đến khi biến mất. Nếu các hạt pectin dính nhau khi tiếp xúc với nƣớc thì tất cả chúng sẽ trƣơng lên, dính nhau và hợp lại thành một viên to và hoà tan rất lâu. Ngƣợc lại, nếu các hạt pectin đƣợc tách rời nhau trƣớc khi tiếp xúc với nƣớc thì chúng sẽ có đủ chỗ trống để trƣơng nở mà không dính vào nhau. Nồng độ ion canxi ở gel cứng đƣợc hình thành tƣơng đối hẹp trong trƣờng hợp sự hình thành gel xảy ra khi không có muối khác hoặc chỉ sử dụng NaCl. Phạm vi này đƣợc mở rộng theo nồng độ Ca2+ cao hơn với sự hiện diện 28

của natri citrate, kali và natri tartrate [3]. Những muối này làm cho gel đàn hồi và dễ phục hồi nhiệt hơn, ngay cả trong quá trình hủy hoại cơ học. Việc điều chế pectin HM với pectin methylesterase dẫn đến sự hình thành các pectin LM có trong các dung dịch khác với hoạt động của pectin HM và phụ thuộc nhiều vào nồng độ cation đơn trị. Ngoài ra, trong quá trình sản xuất gel có hàm lƣợng sucrose thấp đƣợc quan sát trong hoạt động lƣu biến của các gel hỗn hợp, trong đó nồng độ HM pectin cao gấp 3 lần so với nồng độ của LM pectin. Trong trƣờng hợp này, một hỗn hợp gel có nồng độ sucrose thấp hơn có các thông số lƣu biến giống nhƣ HM pectin khi có sucrose có nồng độ cao hơn đáng kể [41]. 1.2.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin 1.2.4.1. Hoạt tính sinh học Một số đặc tính của pectin là tác dụng chống ung thƣ và chống huyết khối, đặc biệt là pectin chiết từ bã táo, đã đƣợc chứng minh bằng ví dụ về pectin chiết từ bã táo trong các mô hình thí nghiệm về sự hình thành ung thƣ ở ruột và di căn gan. Việc áp dụng chúng vào trong điều trị ung thƣ ruột đã đƣợc cấp bằng sáng chế tại Nhật Bản. Khả năng sinh học cao của pectin đã đƣợc sử dụng để có đƣợc một chế phẩm dƣợc phẩm dựa trên lactoferrin, một glycoprotein sữa tạo ra hoạt tính bactericide điều trị viêm mãn tính trong viêm miệng. Nó cho thấy rằng pectin HM thích hợp nhất để chế tạo các viên nén sinh học vì cùng với khả năng sinh học cao, chúng có đặc tính giải phóng chất hoạt hóa. Hơn nữa, quá trình này có thể đƣợc quy định bởi nồng độ ion canxi, phản ứng chéo với đoạn galacturonan của phân tử pectin và tạo điều kiện giải phóng lactoferrin. Giả thiết rằng trên bề mặt các tế bào ung thƣ, polysaccharide pectin liên kết các protein chịu trách nhiệm cho sự kết dính của tế bào khối u bằng các mô khỏe mạnh. Một chế phẩm thƣơng mại pectin từ cây cam quýt bị biến đổi để ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ và di căn. Nó đã đƣợc chỉ ra rằng làm tăng thời gian nhân đôi của kháng nguyên tuyến tiền liệt, ung thƣ biểu mô tuyến tiền liệt chủ yếu, ở nam giới khoảng 70%. 29

Nghiên cứu cho thấy thuốc chống lao trùng khớp với các chất pectin đã chỉ ra rằng các chế phẩm thu đƣợc có hoạt tính cao hơn isoniasid nguyên chất. Pectin có liên kết chéo, ít tan và ít bị phân hủy trong cơ thể, cũng nhƣ gel pectinat canxi có chứa NaHCO3 và có hiệu quả cho những mục đích này. Các gel này đƣợc đặc trƣng bởi độ rỗng cao và mật độ thích hợp [41]. Trong khía cạnh khác, hoạt động của pectin đối với đƣờng tiêu hóa, sự tƣơng tác với chất nhầy là chủ đề nghiên cứu chuyên sâu nhất. Do đó, nó đã đƣợc chỉ ra rằng pectin liên kết với mucin, thành phần chính của chất nhầy ở GIT, để tạo thành một mạng gel. Theo cách này, các polysaccharide pectin làm tăng tính chất bảo vệ của chất nhầy và do đó có thể đƣợc áp dụng để điều trị các tổn thƣơng của GIT và các bệnh truyền nhiễm. Bằng cách thay đổi các đặc tính phân tử của pectin, có thể thay đổi độ cứng của gel và mô hình phân phối pectin trong phức hợp pectin-mucin. Điều này cho phép điều chỉnh sự tƣơng tác giữa pectin với mucin để đáp ứng nhu cầu phân phối thuốc và điều trị lâm sàng [41]. Ngoài ra, nhờ khả năng liên kết tốt với các cation hóa trị 2 mà pectin đƣợc sử dụng nhƣ chất thải độc kim loại nặng khỏi dung dịch nƣớc cũng nhƣ khỏi cơ thể ngƣời. Khotimchenko và cộng sự đã nghiên cứu tính chất liên kết với các kim loại nặng nhƣ Hg, Pb, Cd… của pectin đƣợc phân lập từ cỏ biển Zostera marina [12], các nghiên cứu sau đó của nhóm tác giả này còn cho thấy các hoạt tính sinh học khác của pectin từ cỏ biển nhƣ tác dụng làm giảm nhanh chóng hàm lƣợng chì trong gan, làm giảm sự peroxyl hóa của lipid, giảm tổng cholesterol, triglyceride trong máu và gan [42]. Pectin còn thể hiện các hoạt tính kháng ung thƣ và tăng cƣờng hệ thống miễn dịch [41]. Nhu cầu gia tăng đối với nguyên liệu sinh học sử dụng trong bao gói thực phẩm đã khuyến khích sự phát triển của màng thực phẩm thân thiện môi trƣờng. Các thành phần chính của các loại tinh dầu thực vật mang đặc tính kháng khuẩn chống tác nhân gây bệnh có trong thực phẩm và có thể đƣợc giải phóng bởi màng thực phẩm tự nhiên để thay thế các chất bảo quản tổng hợp. Các hoạt tính kháng khuẩn của pectin đƣợc sử dụng làm màng bao thực phẩm trên cơ sở màng pectin ester hóa cao hoặc thấp và kết quả cho thấy, 30

cinnamaldehyde tạo từ pectin cung cấp đặc tính kháng khuẩn chống Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes và Staphylococus aureus. Sự ức chế vi khuẩn đƣợc cải thiện đáng kể khi có sự phân phối cao hơn các hợp chất có hoạt tính và có diện tích bề mặt tăng lên [43]. Một đặc tính quan trọng có ở pectin là khả năng chống oxy hóa. Chất oxy hóa là chất ức chế quá trình oxy hóa, thậm chí ở nồng độ tƣơng đối nhỏ và có vai trò khác nhau trong cơ thể. Hoạt động chống oxy hóa của pectin là hoạt động bắt gốc tự do và giúp chuyển đổi các gốc tự do. Hoạt tính chống oxy hóa của pectin đƣợc nhiều nhà khoa học nghiên cứu và công bố. Năm 2006, Kang và cộng sự đã công bố kết quả pectin oligosaccharide từ cam, quýt đƣợc xử lý bằng cách chiếu xạ thì có khả năng ức chế sự oxy hóa và sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ. Năm 2003, Khasina và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của pectin có ester hóa thấp từ cỏ biển Zostera marina. Năm 2010, Urias- Orona và cộng sự nghiên cứu về hoạt động bắt gốc tự do của pectin chiết từ vỏ Cicer aretinum L cho thấy, hoạt động bắt gốc tự do của pectin phụ thuộc vào liều lƣợng và đƣợc thể hiện bằng sự ức chế DPPH. Việc đánh giá các hoạt động chống oxy hóa cho rằng pectin có hoạt động bắt gốc DPPH triệt để sẽ đƣợc khám phá nhƣ là một chất chống oxy hóa mới. 1.2.4.2. Ứng dụng của pectin  Trong thực phẩm [8] Pectin đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là các chất tạo gel, chất ổn định các dung dịch, chất làm đặc, chất kết dính và chất nhũ hoá trong nhiều sản phẩm thực phẩm. Khả năng tạo gel của pectin đƣợc sử dụng trong những thực phẩm cần có sự ổn định nhiều pha. Pectin đƣợc sử dụng trong các loại thạch, bánh kẹo để cung cấp cho một cấu trúc gel tốt, sạch và để có hƣơng vị tốt. Pectin cũng có thể đƣợc sử dụng để ổn định đồ uống protein có tính acid, chẳng hạn nhƣ sữa chua uống, để cải thiện vị giác và sự ổn định trong nƣớc trái cây và là một 31

sự thay thế chất béo trong thực phẩm nƣớng. Hàm lƣợng của pectin thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một thực phẩm phụ gia là 0,5 đến 1,0% trong trái cây tƣơi. Tác dụng tạo gel của pectin đƣợc sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm mứt trái cây và mứt đông, tạo ra mùi thơm ngon cho sản phẩm và giảm sự phá vỡ cấu trúc. Trong một số trƣờng hợp, pectin còn đƣợc sử dụng với carageenan để tăng hiệu quả tạo gel.  Pectin đƣợc ứng dụng trong các sản phẩm chế biến sẵn: LMP giúp cải thiện một số tính chất lƣu biến của các sản phẩm từ cà chua (có nồng độ chất khô khoảng 10 - 46%) nhƣ sốt cà chua, tƣơng ớt. Các sản phẩm này phải rất bền nhiệt. Hàm lƣợng pectin sử dụng khoảng 0,3 - 1%. Pectin đƣợc dùng để giữ nƣớc bán thành phẩm bánh nƣớng tƣơi lâu hơn: các loại bán thành phẩm bánh nƣớng (bột nhào lạnh đông hoặc bánh chƣa nƣớng) rất dễ bị biến đổi sau vài tháng do hiện tƣợng thoái hóa tinh bột trong bán thành phẩm. Tinh bột đã trƣơng nở tái kết tinh làm giảm khả năng giữ nƣớc của bột nhào, sản phẩm sau khi nƣớng sẽ rất khô. Khi dùng pectin, chất lƣợng sản phẩm sẽ đƣợc cải thiện đáng kể, bánh ít khô hơn, tƣơi lâu hơn.  Trong y dƣợc [44] Pectin làm tăng độ nhớt và khối lƣợng phân tử do đó nó đƣợc sử dụng chống táo bón và tiêu chảy. Cho tới năm 2002, nó là một trong những thành phần chính đƣợc sử dụng trong Kaopectate một loại thuốc chống tiêu chảy, cùng với kaolinit. Pectin cũng đƣợc sử dụng nhƣ một thuốc giảm đau xƣơng khớp. Trong các sản phẩm mỹ phẩm, pectin đóng vai trò nhƣ chất ổn định. Pectin cũng đƣợc sử dụng trong các chế phẩm chữa lành vết thƣơng và băng dính y tế đặc biệt, chẳng hạn nhƣ thông ruột kết. Trong quá trình tiêu hóa của con ngƣời, pectin liên kết với cholesterol trong đƣờng tiêu hóa và làm chậm sự hấp thu glucose bằng carbohydrat. Nó không cung cấp năng lƣợng nhƣng có nhiều giá trị phòng, chữa bệnh.  Kéo dài thời gian tiêu hóa thức ăn trong ruột, có tác dụng tăng hấp thu dƣỡng chất có trong thức ăn, làm giảm béo phì. 32

 Giảm hấp thu lipid  Tiêu thụ của pectin đã chứng minh là làm giảm nồng độ cholesterol trong máu. Cơ chế xuất hiện là tăng độ nhớt trong đƣờng ruột, dẫn đến một sự hấp thu làm giảm cholesterol ở mật hoặc thực phẩm. Trong ruột già và ruột kết, vi sinh vật phân hủy pectin và giải phóng các acid béo chuỗi ngắn có ảnh hƣởng tích cực về sức khỏe (có hiệu lực prebiotic). LDL- loại cholesterol không có lợi cho tim mạch. Ngƣợc lại pectin làm tăng HDL- chất có lợi cho tim mạch.  Pectin là một phần tự nhiên của chế độ ăn uống của con ngƣời, nhƣng không đóng góp đáng kể đến dinh dƣỡng. Khống chế tăng cƣờng đƣờng huyết trƣớc và sau bữa ăn ở ngƣời bệnh tiểu đƣờng. Một trong những ứng dụng thực tế nhất của pectin từ cỏ biển là hợp chất Zosterin đƣợc phân lập từ cỏ biển Zostera asiatica bởi các nhà khoa học thuộc Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng, Phân viện Viễn Đông, Viện Hàn lâm Nga để sử dụng thuốc làm thuốc kháng ung thƣ và giải độc kim loại nặng. Pectin đã đƣợc ứng dụng hiệu quả trong việc khử chất phóng xạ 137Cs khỏi cơ thể trẻ em bị ảnh hƣởng trong vụ tai nạn nhà máy hạt nhân “Chernobyl”. Ngoài ra pectin còn đƣợc ứng dụng là làm thuốc cầm máu đƣờng ruột và là tác nhân nhũ hóa rất tốt khi kết hợp với arabic [12].  Tóm lại: Mặc dù hiện nay pectin rất phổ biến trong hầu hết các mô thực vật, tuy nhiên tổng số nguồn có thể đƣợc sử dụng để sản xuất pectin thƣơng mại là rất hạn chế bởi vì khả năng tạo gel của pectin phụ thuộc vào kích thƣớc phân tử và mức độ ester hóa (DE). Do đó pectin có nguồn gốc khác nhau thì có các tính chất khác nhau vì khả năng tạo gel của chúng cũng khác nhau củng do sự thay đổi ở các thông số này và theo các nghiên cứu hầu nhƣ pectin đƣợc thu nhận từ cỏ biển ít đƣợc ứng dụng trong thực phẩm. 1.3. TỔNG QUAN CÁC PHƢƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PECTIN Một số quy trình thu nhận pectin từ thực vật trên cạn đã đƣợc các nhà nghiên cứu khảo sát và tiến hành thực nghiệm. 33

Năm 2008, đề tài khảo sát các điều kiện chiết xuất và tinh sạch pectin từ lá dây hoàng thanh Cocculus sarmentosus (Lour) Diels đã đƣợc nghiên cứu. Bột lá dây hoàng thanh đƣợc xử lý với acetone 90% theo tỉ lệ 1:100 (w/v) thu đƣợc hai phần: phần rắn đem lọc, rửa, sấy khô để trích pectin, phần lỏng chứa sắc tố dùng để tách chlorophyll. Bột lá đã tách sắc tố đƣợc huyền phù trong trong dung dịch HCl ở các pH và nhiệt độ khác nhau để tách chiết pectin. Dung dịch pectin đƣợc làm nguội và lọc rút chân không 3 lần qua phễu Buchner có phủ một lớp Celit-Supercel với tỷ lệ mẫu: Celit-Supercel = 1:15 (w/w). Tủa pectin bằng ethanol 96% với tỷ lệ 1: 2 (v:v) ở 4oC, qua đêm. Lọc lấy tủa và ngâm tủa trong ethanol 80%, sau đó rửa lại bằng ethanol 96% - 3 lần để loại bỏ hoàn toàn ion Cl (kiểm tra bằng dung dịch AgNO3 1%). Tủa sau đó đƣợc đông khô. Nồng độ polyphenol trong dịch trích pectin đƣợc xác định một cách tƣơng đối bằng độ hấp thu ánh sáng của dung dịch ở bƣớc sóng 330 nm [11]. Năm 2009, pectin đƣợc nghiên cứu thu nhận từ vỏ cà phê với điều kiện trích ly tối ƣu theo các thông số: kích thƣớc của vỏ cà phê, loại acid làm dung môi, tỷ lệ dung môi/ vỏ, thời gian, nhiệt độ, pH trích ly. Điều kiện tối ƣu để trích ly pectin thu đƣợc là kích thƣớc vỏ cà phê nghiền nhỏ qua rây 0,7 x 0,7 mm, dung môi đƣợc chọn là H2SO4 với tỷ lệ dung môi/ vỏ là 19/1, nhiệt độ trích ly 100oC, ở pH là 1, thời gian trích ly là 1h. Lƣợng pectin thu đƣợc trong điều kiện tối ƣu đã khảo sát là 12,22%, tƣơng ứng với lƣợng pectin thô là 16,25% so với nguyên liệu [45]. Ngoài ra, còn một số phƣơng pháp tách chiết, thu nhận pectin nhƣ: - Chiết xuất bằng nƣớc: Một số pectin có sẵn trong thành tế bào thực vật là pectin tan trong nƣớc, loại pectin dễ dàng chiết xuất với nƣớc. Mặc dù chiết xuất pectin sử dụng nƣớc nóng là phƣơng pháp tiện lợi và dễ dàng nhất nhƣng không đƣợc sử dụng trong công nghiệp vì phải thực hiện trong thời gian dài và nhiệt độ cao. - Chiết xuất bằng acid: Qua các bƣớc này, một số pectin bị phân hủy thành pectin trọng lƣợng phân tử thấp, đây là quá trình không mong muốn 34

trong quá trình chiết xuất. Các nguyên tắc cơ bản của chiết xuất bằng acid là thủy phân protopectin. - Chiết xuất bằng enzyme: Tuy nhiên, trong phƣơng pháp này kéo dài thời gian xử lý nguyên liệu (khoảng 20 giờ) và pectin thu đƣợc có khả năng tạo gel thấp. Kết quả nghiên cứu của Tiến sĩ Oni Yuliarti (2011) cho thấy pectin thu nhận bằng enzyme có trọng lƣợng phân tử thấp hơn so với pectin thu nhận bằng phƣơng pháp acid. - Chiết xuất bằng dung dịch muối và kiềm: Việc sử dụng muối làm tác nhân chiết xuất chủ yếu để thay thế các ion kim loại hóa trị 2 hoặc 3 của pectin hòa tan hoặc muối của pectin. Việc sử dụng các dung dịch kiềm để chiết xuất pectin cũng là hƣớng đến việc thay thế các kim loại đa hóa trị để chiết protopectin. Nhƣ vậy, có thể thấy phƣơng pháp chiết có ảnh hƣởng rất lớn đến thành phần, cấu trúc cũng nhƣ hoạt tính sinh học của pectin. Hiện nay vẫn chƣa có phƣơng pháp chuẩn áp dụng để thu nhận pectin từ các nguyên liệu khác nhau. Hầu hết các phƣơng pháp thu nhận pectin hiện nay đều hƣớng đến mục tiêu bảo toàn cấu trúc tự nhiên vốn có của pectin, đồng thời hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của các thành phần không mong muốn. 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PECTIN Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và pectin nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đƣờng. Cấu trúc của pectin từ cỏ biển thƣờng hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề nhƣ thành phần các đƣờng đơn, các chỉ số đặc trƣng của chúng nhƣ chỉ số methoxyl hóa, mức độ ester hóa. Vì vậy, để xác định đƣợc cấu trúc của pectin cần phải phân tích, xác định đƣợc các thông số sau:  Thành phần đƣờng đơn  Các chỉ số đặc trƣng ở pectin  Phổ hồng ngoại (IR)

35

1.4.1. Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học của pectin 1.4.1.1. Xác định thành phần đường đơn Phân tích thành phần các đƣờng đơn của pectin là bƣớc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của pectin. Quy trình chung để xác định các đƣờng đơn là thủy phân pectin thành các monosaccharide và sau đó phân tích thành phần của từng monosaccharide bằng phƣơng pháp sắc ký. Phƣơng pháp sắc ký phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích thành phần các đƣờng đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [46]. 1.4.1.2. Xác định chỉ số methoxyl hóa và chỉ số ester hóa Pectin đặc trƣng bởi hai chỉ số methoxyl hóa (MI) và chỉ số ester hóa (DE): Chỉ số methoxyl hóa (MI): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là phần trăm khối lƣợng nhóm methoxyl [-OCH3] trên tổng khối lƣợng phân tử [47]. Chỉ số ester hóa (DE): thể hiện mức độ ester hóa của pectin, là phần trăm về số lƣợng của các gốc acid galacturonic đƣợc ester hóa trên tổng số lƣợng gốc acid galacturonic có trong phân tử [47]. Nguyên tắc xác định methoxyl hóa và ester hóa đƣợc dựa vào phƣơng pháp chuẩn độ với chất chỉ thị màu là phenolphtalein và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N [32, 47]. 1.4.2. Phƣơng pháp phân tích đặc điểm cấu trúc của pectin bằng phổ hồng ngoại IR Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10.000 đến 100 cm-1 và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự hấp thu ấy có định lƣợng nhƣng phổ hồng ngoại không biểu hiện thành đƣờng thẳng mà là các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau, bởi vì sự biến đổi năng lƣợng dao động luôn đi kèm với sự biến đổi của năng lƣợng quay. Nhƣ vậy, phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của 2 dạng năng lƣợng trong phân tử: năng lƣợng dao động và năng lƣợng quay. Dựa vào sự hấp thu này, có thể chia phổ hồng ngoại thành 3 vùng: Vùng sóng ngắn (4000 - 1300 cm-1) gọi là 36

vùng các nhóm chức vì các băng hấp thụ của các nhóm chức hữu cơ nhƣ OH, NH, CO... đều xuất hiện ở đây. Vùng sóng dài (909 - 605 cm-1) đặc trƣng cho các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và các hấp thụ biến dạng của CH ngoài mặt phẳng. Vùng sóng trung bình (1300 - 909 cm-1) đƣợc gọi là vùng chỉ vân tay vì nó đƣợc dùng để so sánh hình dạng các băng hấp thụ của các mẫu xem có đồng nhất hay không về phƣơng diện hóa học. Phƣơng pháp phân tích này cho ta xác định các nhóm chức, vòng benzen có trong phân tử. 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PECTIN TỪ CỎ BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.5.1. Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển trên thế giới Hiện nay, trên thế giới các nghiên cứu về pectin đƣợc thu nhận từ cỏ biển là rất ít. Năm 2003, Khasina và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của pectin ester hóa thấp từ cỏ biển Zostera marina. Các thí nghiệm trên chuột bạch đực bằng cách cho phản ứng với hoạt động của peroxy hóa chất béo bằng chì axetat, tetrachromethane, natri nitrit, hoặc SOVOL (một hỗn hợp của polychlorinated biphenyls). Sau đó, chuột đƣợc tiêm pectin ester hóa thấp phân lập từ cỏ biển Z. marina ở mức 100 mg/kg trong 2 tuần. Kết quả cho thấy rằng các pectin ester hóa thấp thƣờng có mức độ dialdehyde malonic và hoạt động của reductase glutathione và glutathione peroxidase trong gan [10]. Pectin cỏ biển chứa hợp chất Zosterin đƣợc phân lập từ cỏ biển Zostera asiatica bởi các nhà khoa học thuộc Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dƣơng, Phân viện Viễn Đông, Viện Hàn lâm Nga để sử dụng làm thuốc kháng ung thƣ và giải độc kim loại nặng. Năm 2016, pectin đƣợc phân lập từ cỏ biển Phyllospadix iwatensis bởi Khozhaenko và cộng sự dùng để loại bỏ các ion kim loại có trong nƣớc bằng phƣơng pháp phân tử nano cực nhỏ. Sự hấp thu kim loại của tất cả các hợp chất pectin cao nhất trong khoảng pH từ 4,0 đến 6,0. Mô hình hấp thụ Langmuir, Freundlich và BET đã đƣợc áp dụng để mô tả bằng đẳng nhiệt và hằng số. Kết quả cho thấy rằng pectin đƣợc phân lập từ cỏ biển trên có hoạt tính gắn kết chì và cadmium cao nhất [31]. 37

Các nhà khoa học đã khảo sát các thành phần hóa học và các hoạt động chống nấm, kháng khuẩn từ cỏ biển E. acoroides ở Biển Đông. Đã có 11 hợp chất thuần túy bao gồm 4 flavonoid và 5 steroid. Trong số các hợp chất này, ba flavonoid là chất chống nấm đối với ấu trùng Spodoptera litura, hai flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn biển, và một flavonoid cho thấy hoạt tính kháng rầy nâu tốt hơn đối với ấu trùng Bugula neritina. Đây là mô tả đầu tiên về sự cô lập và hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ sinh từ E. acoroides [48]. Ở Trung Quốc, E. acoroides là một trong những loài phổ biến nhất trong thảm cỏ biển và xảy ra tại các vị trí từ tầng lắng đọng từ thấp đến rất cao dọc theo bờ biển Nam Hải tại đảo Hải Nam. Năm 1994, Alam và cộng sự đã tiến hành sàng lọc sơ bộ các hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm của E. acoroides thu đƣợc từ Papua New Guinea. Năm 1984, Gillan và cộng sự cho thấy các thành phần sterol và acid béo chủ yếu của lá tƣơi cỏ biển E. acoroides là sitosterol, stigmasterol, acidpalmitic, acid linoleic, và acid linolenic. Tuy nhiên, không có thêm báo cáo về sự cô lập và hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp khác từ E. acoroides [48]. Polysaccharide giàu chất pectic đã đƣợc chiết xuất và tinh chế từ cỏ biển Z. marina. Các nghiên cứu cấu trúc đƣợc thực hiện bằng sắc ký khí và quang phổ NMR đã cho thấy cấu trúc apiogalacturonan điển hình bao gồm một α-1,4-D-galactopyranosyluronan đƣợc thay thế bởi các oligosaccharides apiofuranoze liên kết 1,2 và các dƣ đơn phôi tạo một phần zosterin đã đƣợc tinh chế (AGU). Khối lƣợng phân tử trung bình của AGU ƣớc tính khoảng 4100 Da với độ đạm thấp. AGU ức chế sự gia tăng các tế bào ung thƣ biểu mô tế bào biểu mô A431 ở ngƣời với giá trị IC khoảng 50 μg/ml (0,7µM). Ngoài ra, còn có một số nghiên cứu về tách chiết pectin từ một số thực vật trên cạn nhƣ năm 2014, Shan và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất pectin từ vỏ chanh dây. Hàm lƣợng pectin và mức độ ester hóa (DE) của pectin chiết xuất dao động tƣơng ứng 2,25 - 14,60% và 41,67 - 67,31%. Năm 2010, Urias - Orona và cộng sự nghiên cứu về hoạt động bắt gốc tự do của pectin chiết từ vỏ Cicer aretinum L cho thấy, pectin thể hiện hoạt 38

động bắt gốc tự do phụ thuộc vào liều, đƣợc thể hiện bằng sự ức chế DPPH triệt để của nó. Tại 1,0 mg/ml pectin thể hiện tỷ lệ bắt gốc tự do trên các gốc DPPH là 29%. Năm 2012, Norazelina và cộng sự đã nghiên cứu thành công chiết xuất pectin từ vỏ thanh long ở ba điều kiện khác nhau đƣợc xác định là nguồn thay thế pectin thƣơng mại. Kết quả cho thấy sản lƣợng pectin (14,96% - 20,14% so với trọng lƣợng khô), hàm lƣợng methoxyl (2,98% - 4,34%), acid anhydrouronic (45,25% - 52,45%) và mức độ ester hóa (31,05% - 46,96%). Pectin chiết với amonium oxalate đã cho hàm lƣợng pectin cao nhất với độ tinh khiết cao. Năm 2003, Goycoolea và Cardenas đã chiết tách đƣợc pectin từ loài xƣơng rồng Opuntia cladodes và nghiên cứu tính chất hóa học và tính chất lƣu biến của chúng. Năm 2008, Adriana và cộng sự đã thành công trong việc phân lập pectin dƣới dạng muối natri từ cây xƣơng rồng Opuntia ficus indica. Thành phần hóa học của pectin chiết xuất từ xƣơng rồng là: 85,45% acid uronic; 7% galactose; 6% arabinose và số lƣợng nhỏ của rhamnose và xylose [11]. 1.5.2. Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển ở Việt Nam Ở nƣớc ta các nghiên cứu về chiết tách và đặc điểm pectin không nhiều, chỉ có vài nghiên cứu về qui trình tách chiết pectin từ một số đối tƣợng trên cạn nhƣ: năm 2008, công trình nghiên cứu chiết tách pectin từ lá dây Hoàng Thanh và điều chế dẫn xuất với Chlorophyl tan trong nƣớc với hiệu suất pectin thu đƣợc cao nhất là 9,63% trong điều kiện tách chiết là dung môi nƣớc có pH = 3 ở 85oC. Sản phẩm nhận đƣợc có hàm lƣợng pectin khoảng 78,51%, với tỷ lệ ester hóa là 77,51% [9]. Năm 2012, pectin thu nhận đƣợc từ bột thạch từ lá sƣơng sâm đƣợc xác định thành phần pectin bằng phổ hồng ngoại. Pectin thu nhận đƣợc là pectin thuộc nhóm pectin methoxyl hóa thấp với chỉ số DE của pectin thô lá khô là 39,18% và chỉ số DE của pectin thô lá tƣơi là 39,92% [19] và đã tiến hành nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ cà phê [45]. Tác giả chỉ ra điều kiện chiết pectin từ vỏ cà phê là: tỷ lệ DM : NL là 19/1, nhiệt độ 100oC, pH = 1 và thời gian chiết là 1h, lƣợng pectin thu đƣợc trong 39

điều kiện tối ƣu là 12,2% tƣơng ứng với lƣợng pectin thô là 16,25% so với nguyên liệu [45]. Theo các tài liệu tham khảo vẫn chƣa có nghiên cứu nào về pectin từ nguồn cỏ biển nƣớc ta, chỉ tập trung một số ít ở các loài thực vật trên cạn. Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên cỏ biển đa dạng và phong phú, tuy nhiên vẫn chƣa có nghiên cứu về các tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ biển Enhalus acoroides ở Việt Nam. Do vậy, tôi chọn đề tài “Xác định một số tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ biển Enhalus acoroides ở Khánh Hòa” với những nội dung nghiên cứu sau:  Nghiên cứu chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ lá dừa (Enhalus acoroides) ở vùng biển Khánh Hòa.  Phân tích thành phần hóa học của pectin thu nhận đƣợc từ cỏ biển nghiên cứu.  Đánh giá một số tính chất hóa lý đặc trƣng của pectin (tính chất lƣu biến gel, chỉ số methoxyl và ester hóa).  Phân tích đặc điểm cấu trúc hóa học của pectin thu nhận từ cỏ lá dừa. 40

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng sử dụng trong nghiên cứu này là loài cỏ biển E. acoroides (thuộc chi Enhalus) thu hoạch tại đầm Thủy Triều, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa, vào tháng 4 năm 2020. Mẫu sau khi thu đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển, chuyển về phòng thí nghiệm và đƣợc phân loại bởi TS. Nguyễn Xuân Vỵ chuyên gia phân loại mẫu thực vật biển, Viện Hải Dƣơng Học. Cỏ biển tƣơi đƣợc tiền xử lý bằng cách ngâm trong cồn 96 độ, ở nhiệt độ phòng khoảng 5-7 ngày để loại bỏ các hợp chất màu và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp. Sau đó, cỏ biển đƣợc lọc tách khỏi dịch chiết cồn và phơi khô trong không khí. Các phần khác nhau của cỏ biển đƣợc tách riêng (rễ, thân gốc và lá) (hình 2.1) cắt nhỏ, ngâm cồn, làm khô, sau đó xay thành bột và bảo quản trong túi nilon buộc kín để sử dụng làm nguyên liệu chiết tách pectin.

Thân gốc

Rễ

Lá

Hình 2.1: Các bộ phận của cỏ biển Enhalus acoroides 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất 2.1.2.1. Dụng cụ Một số dụng cụ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhƣ: ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, pipet, cuvet, ống ly tâm, lƣới lọc, giấy lọc… 41

2.1.2.2. Thiết bị Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:  Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – UV 1200 (Agilent, Mỹ)  Thiết bị ghi phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR SPECTROMETER.  Máy li tâm siêu tốc: eppendorf, Centrifuge 8504 R  Máy đo quang: HITACHI UV-VIS 2900U SPECTROMETER  Máy đo độ nhớt Brookfield DV-E Viscometer và một số các thiết bị cơ bản trong phòng thí nghiệm. 2.1.2.3. Hóa chất Các hóa chất tinh khiết sử dụng của hãng Sigma (USA) bao gồm: α- amylase, L-rhamnose monohydrate, D-xylose, D-glucose, D-glucuronic acid.

EDTA, NaHB4, NH4OH, Na2SO4, TCA (Tricloacetic acid), Gelatin, BaCl2, TFA (Trifluoroacetic acid). Các hóa chất tinh khiết sử dụng của hãng Fluka (France) bao gồm: D- galactose, D-mannose, D-arabinose, D-glucose, D-glucuronic acid. Các hóa chất tinh khiết sử dụng của hãng Merck (Germany) bao gồm:

HCl, K2SO4, NaCl, H2SO4, NaOH, Acetonitrile. Các hóa chất công nghiệp khác gồm: cồn công nghiệp 98 độ. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu đề tài Nghiên cứu chiết tách và cấu trúc của polysaccharide nói chung và của pectin nói riêng là hƣớng nghiên cứu tƣơng đối khó trên thế giới và còn mới ở Việt Nam, chỉ đƣợc quan tâm nghiên cứu khoảng hơn thập kỷ trở lại đây. Do vậy, hƣớng tiếp cận sẽ là thƣờng xuyên cập nhật các kết quả nghiên cứu mới trên thế giới, kế thừa các kết quả nghiên cứu của các chuyên gia trong nƣớc và nƣớc ngoài về nghiên cứu polysaccharide biển nói chung và của pectin nói 42

riêng. Sử dụng các phƣơng pháp nghiên cứu hiện đại ứng dụng phù hợp vào điều kiện khoa học kỹ thuật thực tiễn ở nƣớc ta để tiến hành triển khai có hiệu quả các nội dung nghiên cứu của đề tài. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu của đề tài đƣợc trình bày (Hình 2.2). Cỏ biển sau khi thu hoạch đƣợc tiến hành xử lý sơ bộ (ngâm trong ethanol 98 độ, phơi khô). Mẫu cỏ biển sau khi xử lý đƣợc tiến hành tách chiết pectin bằng dung dịch amonium oxalate (theo các phƣơng pháp nghiên cứu trƣớc đây). Tiếp theo, các chỉ tiêu chất lƣợng và thành phần pectin đƣợc xác định bao gồm: thành phần hóa học của pectin: hàm lƣợng tổng carbohydrate; hàm lƣợng sulfate; hàm lƣợng acid uronic; các chỉ số đặc trƣng: trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl (MI), mức độ ester hóa (DE), hàm lƣợng acid anhydro uronic tổng (AUA), tính chất lƣu biến gel (độ nhớt) và đặc điểm cấu trúc của pectin: thành phần đƣờng đơn và phổ IR từ cỏ biển lá dừa Enhalus acoroides.

43

Cỏ biển (Enhalus acoroides)

Xử lý – loại bỏ chất màu

Phơi khô

Cắt nhỏ

Chiết trong Amonium oxalate

1. Xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate 2. Xác định hàm lƣợng sulfate 3. Xác định hàm lƣợng acid uronic 4. Xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng 5. Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lƣợng acid anhydro uronic tổng (AUA) Hợp chất pectin 6. Xác định mức độ ester hóa (DE) 7. Đánh giá tính chất lƣu biến gel 8. Xác định thành phần đƣờng đơn 9. Phân tích đặc điểm cấu trúc của pectin

Hình 2.2: Sơ đồ khối về nội dung nghiên cứu của đề tài 44

2.2.2. Chiết tách và thu nhận pectin Kế thừa các tài liệu đã công bố về chiết xuất pectin từ cỏ biển cũng nhƣ các loài thực vật khác [42]; chiết tách pectin từ cỏ biển E.acoroides trong nghiên cứu này thực hiện theo theo phƣơng pháp đƣợc mô tả bởi Youjing [49].

Hình 2.3: Sơ đồ chiết tách và thu nhận Pectin từ cỏ biển 45

2.2.3. Phƣơng pháp xác định tính chất lƣu biến gel của pectin Để xác định tính chất lƣu biến gel của pectin có thể dựa vào phƣơng pháp xác định độ nhớt của pectin bằng nhớt kế Engle dựa vào thời gian rơi của chất lỏng hoặc sử dụng máy đo độ nhớt Brookfield và đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang. 2.2.4. Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học của pectin 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate: Hàm lƣợng đƣờng tổng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phenol-acid sulfuric [50]. 2.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate Hàm lƣợng sulfate đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đo độ đục với

BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [52]. 2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid Hàm lƣợng acid uronic đƣợc xác định sử dụng phƣơng pháp carbazole, sử dụng acid D-gluconic làm chất chuẩn [53]. 2.2.4.4. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide Thành phần đƣờng đơn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC, sau khi mẫu pectin đƣợc thủy phân trong môi trƣờng acid về các dạng các monomer. Các chuẩn đƣờng đơn đƣợc sử dụng: glucose; galactose; rhamnose; mannose; xylose và arabinose [51]. 2.2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin 2.2.5.1. Phương pháp xác định trọng lượng tương đương Trọng lƣợng tƣơng đƣơng đƣợc sử dụng để tính hàm lƣợng AUA tổng và chỉ số ester hóa, đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng phenolphtalein làm chất chỉ thị màu [54]. 2.2.5.2. Phương pháp xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid anhydro uronic tổng (AUA) 46

Xác định MI đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp của Ranganna và cộng sự (1995). Từ đó tính đƣợc tổng số AUA của pectin thu đƣợc [54]. 2.2.5.3. Xác định mức độ ester hóa (DE) Mức độ ester hóa của pectin đƣợc tính dựa trên cơ sở hàm lƣợng methoxyl và AUA [54]. 2.2.6. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) Các mẫu polysaccharide đƣợc tạo viên nén với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr và đo phổ hồng ngoại trên thiết bị FT-IR Bruker tại Viện Công nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. THỰC NGHIỆM 2.3.1. Chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển Mẫu cỏ biển E.acoroides sau khi thu thập, đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển. Sau đó mẫu đƣợc tiến hành xử lý loại màu, các hợp chất polyphenol và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp với ethanol 98% theo tỉ lệ 1/10 w/v trong thời gian 7 ngày ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp đƣợc lọc tách và cỏ biển đƣợc phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. 100 (g) mẫu cỏ biển sau khi đã loại bỏ chất béo và các hợp chất màu đƣợc xử lý trong HCl 0,5% theo tỷ lệ 1/10 w/v ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 3 giờ để phá vỡ thành tế bào và giải phóng polysaccharide khỏi các liên kết trong thành tế bào. Dịch xử lý đƣợc lọc tách thô qua vải lọc, phần nguyên liệu cỏ biển sau xử lý đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy để loại bỏ acid trƣớc khi tiến hành chiết tách thu nhận pectin. Phần dịch xử lý acid đƣợc trung hòa bằng dung dịch NaOH 0,5% và thu nhận polysaccharide trong phân đoạn này bằng kết tủa ở nồng độ cồn 70% (F1). Cỏ biển sau khi đƣợc xử lý với HCl 0,5% đƣợc đem chiết với dung dịch amonium oxalate 2% ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 3 giờ (lặp lại 2 lần với các điều kiện tƣơng tự). Dịch chiết của 2 lần chiết đƣợc gộp lại, lọc tách thô qua vải lọc, sau đó lọc lại bằng giấy lọc. Dịch chiết sau đó đƣợc acid hóa bằng dung dịch HCl 1N đến pH = 1-2 thu đƣợc kết tủa dạng keo là các pectin 47

dạng acid và để lắng qua đêm. Tiếp theo, gạn bỏ phần dịch trong, kết tủa đem ly tâm ở 7.000 vòng/phút trong 10 phút. Tách phần kết tủa keo đem hòa tan lại trong dung dịch Amonium oxalate 2% và điều chỉnh về pH = 7, pectin trong dung dịch đƣợc kết tủa bằng cồn 98% theo tỷ lệ v/v = 1/4, để lắng 1–2 giờ. Thu kết tủa bằng ly tâm và rửa sạch bằng cồn 75% (2-3 lần rửa) và rửa lại bằng cồn 98%. Sau đó đem sấy khô qua đêm ở nhiệt độ 50oC và thu đƣợc sản phẩm polysaccharide dạng thô có chứa pectin (F2). Hàm lƣợng % pectin (phân đoạn F2) đƣợc tính theo công thức sau [54]: Wt %pectin  100 Ws Trong đó: Wt: khối lƣợng pectin sau khi chiết (g) Ws: khối lƣợng mẫu cỏ biển ban đầu (g) 2.3.2. Xác định tính chất lƣu biến gel của pectin Hòa tan 10g mẫu pectin thô vào 250mL nƣớc cất, khuấy tan mẫu và sử dụng máy đo độ nhớt Brookfield DV-E Viscometer với kim S62, đƣợc thực hiện ở các vòng quay từ 30 – 100rpm (vòng/phút). Kết quả đƣợc hiển thị trên màn hình của máy. 2.3.3. Xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate Tổng carbohydrate đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu với thuốc thử phenol/sulfuric acid [50]: cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hòa tan hoàn toàn, ly tâm, lấy dịch. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng đƣờng tổng. Lấy 500 µl dung dịch cần xác định, thêm vào 500 µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Tiếp theo, thêm tiếp 2 ml acid sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 10-15 phút, lấy ra để nguội, phức chất có màu vàng và đƣợc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm. Sử dụng D-glusose làm chất chuẩn [50]. 48

2.3.4. Xác định hàm lƣợng sulfate Hàm lƣợng sulfate đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo độ đục với

BaCl2/gelatin [52], cụ thể nhƣ sau: cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hòa tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng sulfate. Lấy 500 μl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 1,5mL TCA 4% (acid trichlorua acetic) và

1,5mL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều, phức chất có màu trắng đục và đƣợc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ= 360 nm. Hàm lƣợng sulfate

đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 50 – 250µg/ml [52]. 2.3.5. Xác định hàm lƣợng uronic acid Hàm lƣợng uronic acid đƣợc xác định bằng phƣơng pháp carbazole [53]. Cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hòa tan hoàn toàn. Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng acid uronic. Lấy 500 μl dung dịch mẫu đã đƣợc chuẩn bị ở trên cho vào ống nghiệm. Tiếp theo, thêm vào 3 ml dung dịch A (0,9 g

NaBH4 hòa tan trong 10 ml nƣớc cất + 90 ml dung dịch acid sulfuric 98%). Phản ứng đƣợc tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm lạnh nhanh trong nƣớc đá. Sau đó, thêm tiếp 200μl dung dịch B (100 mg carbazole đƣợc hòa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối) vào hỗn hợp và tiến hành lắc đều để thực hiện phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút. Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng, phức chất có màu hồng tƣơi và tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 530 nm. Sử dụng D – glucuronic acid làm chất chuẩn với khoảng nồng độ từ 20 – 200 µg/ml [53]. 2.3.6. Xác định thành phần monosaccharide Phân tích thành phần các đƣờng đơn của pectin là bƣớc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của pectin. Quy trình chung để xác định các đƣờng đơn là thủy phân pectin thành các monosacaride và sau đó phân tích thành phần của từng monosacaride bằng phƣơng pháp sắc ký. Phƣơng pháp 49

sắc ký phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích thành phần các đƣờng đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [50]. Mẫu pectin (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5 ml, thêm 1 ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dƣ. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nƣớc khử ion, dung dịch này đƣợc dùng để phân tích thành phần

đƣờng đơn bằng HPLC – UV (Agilent, USA), sử dụng cột C18 Zorbax Eclipse XBD (150mm x 4,6mm; 3,5µm), pha động là amonium acetate 20mmol/L (A) và acetonitrile (B) với tốc độ dòng 1ml/phút để rửa giải theo tỷ lệ: 0-1 phút: 13 – 15% (B); 1-40 phút: 16% (B) và đƣợc đo ở bƣớc sóng λ = 245nm [55]. Các đƣờng đơn: glucose; galactose; rhamnose; mannose; xylose và arabinose đƣợc sử dụng là chất chuẩn. Hàm lƣợng các thành phần đƣờng đơn đƣợc tính theo %w/w dựa vào các chất chuẩn trên. 2.3.7. Xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin 2.3.7.1. Xác định trọng lượng tương đương Cân 0,5 g mẫu pectin cho vào bình tam giác. Tiếp theo cho thêm 5 ml ethanol 98% và 100 ml NaCl 1%. Cuối cùng, thêm 6 giọt dung dịch phenolphtalein 1% vào hỗn hợp và chuẩn độ với NaOH 0,1N đến khi màu hồng xuất hiện thì ngừng, ghi lại thể tích NaOH đã dùng [54]. Từ đó tính đƣợc trọng lƣợng tƣơng đƣơng nhƣ sau: W 1000 EW  VCNaOH NaOH Trong đó: EW: trọng lƣợng tƣơng đƣơng W: khối lƣợng mẫu

VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn

CNaOH: nồng độ NaOH 0,1N Dung dịch thu đƣợc sau khi trung hòa đƣợc giữ lại để tiếp tục xác định chỉ số methoxyl. 50

2.3.7.2. Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid anhydro uronic tổng (AUA) Sử dụng dung dịch đã đƣợc trung hòa ở thí nghiệm trên và thêm 25 ml sodium hydroxide 0,25N, khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phòng 30 phút. Sau đó, thêm 25 ml HCl 0,25N và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Ghi lại thể tích NaOH tiêu tốn [54].  Chỉ số MI đƣợc tính theo công thức:

VCNaOH NaOH 3.1 %MI  W  Hàm lƣợng AUA đƣợc tính theo công thức [54]: 176 0.1zy  100 176  0.1  100 %AUA  WW1000 1000 Trong đó: 1 đơn vị AUA = 176g

z: VNaOH từ xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng

y: VNaOH tiêu tốn xác định chỉ số MI W: khối lƣợng mẫu phân tích 2.3.7.3. Xác định mức độ ester hóa (DE) Dựa trên số liệu thu đƣợc từ chỉ số methoxyl và AUA tổng, mức độ ester hóa (DE) đƣợc xác định theo công thức sau [54]: 176 %MI %DE  100 31 %AUA 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Tất cả các thí nghiệm đƣợc tiến hành 2 lần độc lập, kết quả đƣợc thể hiện là giá trị trung bình. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 để tính toán số liệu và vẽ đồ thị. 51

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN Pectin từ cỏ biển E. acoroides đƣợc chiết tách và thu nhận phân đoạn theo các dung dịch chiết khác nhau, phân đoạn F1 đƣợc chiết trong dung dịch acid HCl loãng và phân đoạn F2 đƣợc chiết trong dung dịch amonium oxalat. Trong nghiên cứu này pectin đƣợc thu nhận từ các phần gồm: rễ, gốc và lá của cỏ biển nhằm đánh giá sự phân bố của pectin trong mỗi bộ phận khác nhau của cỏ biển. Kết quả chỉ ra hàm lƣợng pectin có sự khác biệt rất lớn giữa phân đoạn F1 và F2 trong cả rễ, gốc và lá (Hình 3.1). Phân đoạn F1 dao động từ 1,8 - 3,6%, thấp nhất ở bộ phận gốc (1,8%) và cao nhất trong bộ phận lá (3,6%). Trong khi đó, phân đoạn F2 có hàm lƣợng pectin cao hơn nhiều so với phân đoạn F1, trong khoảng từ 10,5% đến 24,2%. Nhƣ vậy, có thể thấy cả 02 phân đoạn pectin có phân bố nhiều nhất trong lá (3,6% F1 và 24,2% F2), phân đoạn F2 phân bố ở rễ và gốc khác nhau không nhiều lần lƣợt là 10,5% và 10,9%. Hàm lƣợng pectin phân đoạn (F2) phân bố trong rễ và gốc cỏ biển E. acoroides tƣơng đƣơng với hàm lƣợng pectin ở một số loài cỏ biển khác trên thế giới nhƣ: cỏ Zostera caespitosa Miki (10,8%) [56]; Zostera marina (10-11%), Zostera pacifica (12%) [12, 29], và cao hơn so với hàm lƣợng pectin từ cỏ Phyllospadix iwatensis (6,91%) [31]. So với pectin có nguồn gốc từ thực vật trên cạn, hàm lƣợng pectin cũng có sự khác biệt đáng kể nhƣ: hàm lƣợng pectin từ vỏ chanh (10,3-13,13%) [32], vỏ chanh dây (2,25-14,6%) [34], vỏ măng cụt Indonesia (1,16%) [35], vỏ cam (7,3-16,0%) [33]. Nhƣ vậy, có thể thấy hàm lƣợng pectin biến đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm loại nguyên liệu, nguồn gốc địa lý, thời kỳ thu hoạch, phƣơng pháp chiết và điều kiện chiết [32, 33,56]. Sự biến đổi về hàm lƣợng polysaccharide giữa các loài có thể đƣợc giải thích là do sự khác biệt cấu trúc thành tế bào, cũng nhƣ điều kiện môi trƣờng sống của mỗi loài cỏ biển khác nhau. Ngoài ra, các kỹ thuật 52

chiết tách cũng ảnh hƣởng đến việc thu nhận polysaccharide, do vậy sử dụng các phƣơng pháp chiết tách khác nhau dẫn đến việc thu đƣợc các hàm lƣợng polysaccharide khác nhau. Nhìn chung, polysaccharide ở mỗi loài cỏ biển không chỉ khác nhau về hàm lƣợng mà thành phần hóa học và các đặc trƣng cấu trúc cũng rất khác nhau và tạo nên sự đa dạng rất lớn về cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học [57].

Hình 3.1: Sự phân bố hàm lƣợng pectin trong cỏ biển E.acoroides

Hình 3.2: Các giai đoạn xử lý cỏ biển. a) Mẫu cỏ biển sau khi loại bỏ chất màu và polyphenol; b) Xử lý bằng HCl; c) Bã còn lại sau xử lý acid 53

a) b)

Hình 3.3: Dịch chiết pectin. a) Dịch keo pectin chiết từ cỏ biển; b) Dịch chiết pectin tủa trong cồn

Hình 3.4: Chế phẩm pectin thô sau khi sấy khô 3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA PECTIN

Chất lƣợng pectin thu nhận từ các nguồn nguyên liệu khác nhau thông thƣờng đƣợc đánh giá thông qua các thông số: một số thành phần hóa học của pectin (tổng carbohydrate, acid uronic, thành phần đƣờng đơn, sulfate), một 54

số chỉ số đặc trƣng của pectin (trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl hóa (MI), acid anhydro uronic tổng (AUA) và mức độ ester hóa (DE)). Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, đã xác định đƣợc một số thành phần đặc trƣng sau: hàm lƣợng tổng carbohydrate, hàm lƣợng acid uronic, hàm lƣợng sunfate, thành phần đƣờng đơn và các chỉ số đặc trƣng của pectin nhƣ: trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl hóa (MI), acid anhydro uronic tổng (AUA) và mức độ ester hóa.

3.2.1. Tính chất lƣu biến gel của pectin

Petin là một hợp chất tạo gel khá quan trọng đƣợc sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm, khả năng tạo gel dựa vào đƣờng và acid có trong thành phần của sản phẩm. Trong nội dung nghiên cứu này của luận văn do hàm lƣợng pectin có nhiều nhất trong phần lá, nên pectin từ phần lá đƣợc lựa chọn làm đại diện cho đánh giá tính chất lƣu biến gel. Kết quả xác định giá trị độ nhớt thu đƣợc là 4 - 5Cps (Centipoise-đơn vị độ nhớt). Kết quả này chỉ ra giá trị khối lƣợng phân tử trung bình của pectin từ E. acoroides là thấp hơn nhiều so với khối lƣợng phân tử của pectin từ cỏ biển Zostera caespitosa Miki [56].

3.2.2. Thành phần hóa học của pectin

3.2.2.1. Hàm lượng tổng carbohydrate và acid uronic

Pectin là một polysaccharide có thành phần hóa học phức tạp, thành phần chính thƣờng là galacturonic acid, cùng với nhiều gốc đƣờng khác nhƣ rhamnose, xylose, arabinose, glucose,... [50, 53]. Vì vậy, xác định thành phần hóa học của pectin, đầu tiên các mẫu pectin đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate và hàm lƣợng acid uronic có trong pectin. Kết quả phân tích thành phần carbohydrate và acid uronic đƣợc trình bày (hình 3.5 và 3.6) và đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn của glucose và acid D-glucuronic 55

(Bảng 3.1 và bảng 3.2). Hàm lƣợng tổng carbohydrate dao động trong khoảng từ 24,87% (F2-Gốc) đến 39,81% (F1-Rễ) (Bảng 3.3). Hàm lƣợng tổng carbohydrate của các phân đoạn F1 cao hơn F2 và trong cùng phân đoạn thì hàm lƣợng tổng carbohydrate đƣợc phân lập từ rễ cao hơn so gốc và lá.

Bảng 3.1: Các giá trị mật độ quang mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng carbohydrate tổng bằng phƣơng pháp phenol – acid sulfuric

Nồng độ λ = 490nm carbohydrate (µg/ml) A1 A2 Atb

50 0,5077 0,5078 0,5078

100 1,0155 1,0155 1,0155

150 1,5460 1,5462 1,5461

200 1,8294 1,8300 1,8297

Hình 3.5: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng carbohydrate 56

Bảng 3.2: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng uronic acid bằng phƣơng pháp Carbazole

Nồng độ uronic λ = 525nm acid (µg/ml) A1 A2 Atb

20 0,0979 0,0979 0,0979

50 0,2149 0,2149 0,2149

100 0,3911 0,3907 0,3909

150 0,5904 0,5914 0,5909

200 0,7894 0,7885 0,7890

Hình 3.6: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng uronic acid Theo các nghiên cứu trƣớc đây về pectin có trong cỏ biển, pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides tại biển Khánh Hòa có hàm lƣợng tổng carbohydate và acid uronic thấp hơn so với pectin đƣợc chiết xuất từ cỏ biển Z. marina với hàm lƣợng tổng carbohydrate chiếm 38,8%; acid uronic chiếm 38% [12] và loài Phyllospadix tƣơng ứng là 39,45% (carbohydrate) và 40% (acid uronic) [31]. Hầu hết các nghiên cứu trƣớc đây chỉ ra rằng, pectin chiết từ cỏ biển có 57

độ tinh sạch cao thì hàm lƣợng carbohydrate, acid uronic phải đạt 30% trở lên. Trong đề tài nghiên cứu này, pectin thu từ cỏ biển E. acoroides có hàm lƣợng carbohydrate tổng xấp xỉ 30%. Tuy nhiên, điều này có thể đƣợc giải thích do sự khác biệt về chủng loài cỏ biển và đặc trƣng cấu trúc của pectin từ các loài khác nhau, bên cạnh đó các kỹ thuật tách chiết, tinh chế cũng ảnh hƣởng tới thành phần hóa học sản phẩm pectin đƣợc thu nhận.

Bảng 3.3: Thành phần hóa học của pectin từ E. acoroides

F1 F2 Thành phần Rễ Gốc Lá Rễ Gốc Lá

Tổng carbohydrate % 39,81 34,61 37,41 28,30 24,87 27,41

Sulfate % - 37,7 27,9 - - -

Uronic acid % 4,13 9,38 5,73 7,14 7,88 6,19

Hình 3.7: Thành phần hóa học của 2 phân đoạn pectin từ E.acoroides 58

3.2.2.2. Hàm lượng sulfate

Polysaccharide cỏ biển ngoài thành phần pectin (pectic polysaccharide) còn có các thành phần polysaccharide khác bao gồm cả polysaccharide sulfate. Do dó, việc xác định sự có mặt của sulfate nhằm đánh giá phân đoạn chiết tách pectin có lẫn thành phần polysaccharide này hay không. Hàm lƣợng sulfate đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp đo độ đục với chất chuẩn là

K2SO4. Kết quả xác định hàm lƣợng sulfate của các mẫu polysaccharide đƣợc đƣa ra trong bảng 3.3.

Bảng 3.4: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng sulfate

Nồng độ sulfate λ = 360nm (µg/ml) A1 A2 Atb

50 0,2649 0,2647 0,2648

100 0,3933 0,3930 0,3932

150 0,5071 0,5072 0,5071

200 0,6086 0,6086 0,6086

250 0,6876 0,6868 0,6872

59

Hình 3.8: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng Sulfate

Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy sulfate chỉ đƣợc phát hiện trong 02 phân đoạn F1 ở gốc và lá với hàm lƣợng tƣơng ứng là 37,7% và 27,9%; các phân đoạn F2 và F1ở bộ phận rễ không phát hiện thấy sự có mặt của nhóm sulfate (Bảng 3.3). Các mẫu pectin (phân đoạn F2) không phát hiện thấy sự có mặt của nhóm sulfate, chứng tỏ trong các phân đoạn này không có lẫn polysaccharide sulfate. Kết quả này có thể thể giải thích là trong quá trình xử lý acid, toàn bộ polysaccharide sulfate đã đƣợc tách ra trong phân đoạn chiết này. Nhƣ vậy, mẫu pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroides đã đƣợc phân lập một cách trọn lọc khi đƣợc xử lý trong dung dịch acid loãng trƣớc khi phân lập dƣới dạng pectic polysaccharide hòa tan khi đƣợc chiết bằng dung dịch amonium oxalate, kết quả này cho thấy sự phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây [58].

3.2.2.3. Thành phần đường đơn

Phân tích xác định thành phần của các monosaccharide là việc quan trọng đầu tiên trong việc nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharide nói chung và của pectin nói riêng. Pectin là một polymer dị thể có thành phần hóa 60

học phức tạp, ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng còn chứa các đƣờng đơn khác nhƣ galactose, mannose, xylose, glucose, rhamnose... và uronic acid. Vì vậy, để xác định thành phần hóa học của pectin, mẫu sẽ đƣợc thủy phân thành các monomer trong môi trƣờng acid. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đƣờng đơn của pectin trên thực tế rất khó xảy ra, do đó tôi tiến hành xác định tỉ lệ phần trăm về khối lƣợng giữa các gốc đƣờng đã đƣợc thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đƣờng đơn trong mẫu pectin. Sắc ký đồ của các mẫu đƣờng chuẩn và mẫu pectin trong phân đoạn F2 ở bộ phận lá đƣợc trình bày trên hình 3.9 và hình 3.10.

Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn

Hình 3.10: Sắc ký đồ HPLC mẫu pectin chiết tách từ cỏ biển E.acoroides 61

Trong nghiên cứu này, các kết quả đánh giá ở trên cho thấy pectin có phân bố chủ yếu trong thành phần lá nên phân đoạn pectin từ lá đƣợc lựa chọn đại diện cho đánh giá thành phần đƣờng đơn cũng nhƣ đánh giá một số đặc trƣng cấu trúc của pectin từ cỏ E. acoroides. Kết quả phân tích thành phần monosaccharide của mẫu pectin (F2-lá) đƣợc thể hiện trong bảng 3.5.

Bảng 3.5: Thành phần monosaccharide của pectin từ các loài khác nhau

Thành phần monosacchride của pectin (%w/w) Mẫu Mannose Rhamnose Glucose Xylose Galactose Arabinose

Cỏ biển E.acoroides 0,86 1,01 23,23 0,65 2,02 0,75 (F2 - lá)

Cỏ biển Zostera 4,20 11,80 - 4,40 6,00 4,30 caespitosa Miki

Bã chanh 4,13 9,64 4,12 0,03 3,54 3,54

Kết quả trong bảng 3.5 cho thấy mẫu pectin (F2-lá) có thành phần chính là glucose (23,23%) và có một số thành phần đƣờng khác với hàm lƣợng nhỏ hơn gồm: galactose (2,02%); rhamnose (1,01%); mannose (0,86%); arabinose (0,75%) và xylose (0,65%). Kết quả này chỉ ra sự đa dạng cao về thành phần đƣờng đơn, và dự đoán sự đa dạng về cấu trúc của pectin cỏ E. acoroides.

Theo Youjing và cộng sự, mẫu pectin từ cỏ biển Zostera caespitosa Miki [49] có chứa các gốc đƣờng nhƣ rhamnose (11,8%); galactose (6,0%); xylose (4,4%); arabinose (4,3%); mannose (4,2%) và không có thành phần 62

glucose trong mẫu. Mặc khác, Azad và cộng sự cũng xác định đƣợc thành phần đƣờng đơn có trong pectin đƣợc chiết từ bã chanh [32] nhƣ rhamnose (9,64%); mannose và glucose (4,13% và 4,12%); galactose và arabinose (3,54%) và một lƣợng nhỏ không đáng kể xylose (0,03%). Nhƣ vậy, chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng giữa các loài cỏ biển khác nhau thì không giống nhau và đặc biệt theo nhóm tác giả này, thành phần đƣờng của pectin trong cỏ biển Z. caespitosa Miki lại không có gốc đƣờng glucose, trong khi đó thành phần chính của đƣờng đơn từ mẫu pectin của cỏ biển E.acoroides là gốc đƣờng glucose. Nhƣ vậy, hàm lƣợng các gốc đƣờng này biến đổi theo từng chi và từng loài cỏ biển. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trƣớc đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của pectin. Kết quả phân tích thành phần đƣờng chỉ ra rằng pectin của các loài cỏ biển thuộc các chi khác nhau là khác nhau về thành phần và tỉ lệ phần trăm giữa các gốc đƣờng đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng nhƣ hoạt tính sinh học của pectin, nhƣng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của pectin trở nên vô cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hoàn chỉnh của pectin, nhƣng chƣa có một công bố nào đƣa ra đƣợc mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc pectin với các loài cỏ biển.

Sự khác nhau này có thể đƣợc giải thích do sự khác nhau về vị trí, thời gian thu mẫu và điều kiện môi trƣờng sống. Điều này cho thấy thành phần cũng nhƣ đặc điểm cấu trúc của pectin vô cùng phức tạp.

3.2.3. Các chỉ số đặc trƣng tính chất hóa lý của pectin

3.2.3.1. Trọng lượng tương đương

Trọng lƣợng tƣơng đƣơng của pectin đƣợc chiết xuất từ rễ, thân và lá của cỏ biển E. acoroides từ 2300 – 2500 g/mol (phân đoạn F1) và từ 1500 – 1900 g/mol (đối với phân đoạn F2) (Bảng 3.6). Trong nghiên cứu này, trọng 63

lƣợng tƣơng đƣơng của pectin thu đƣợc từ cỏ biển E.acoroides cao hơn một số loài thực vật trên cạn khác nhƣ: 1632 g/mol [32]; 1666 g/mol [59]; 645 g/mol [60] nhƣng trong măng cụt Indonesia khá cao 6330 g/mol [35]. Trọng lƣợng tƣơng đƣơng của pectin là một chỉ số khác về khả năng tạo gel của nó, với pectin có trọng lƣợng phân tử cao có khả năng tạo gel tốt hơn [61]. Tuy nhiên, trọng lƣợng tƣơng đƣơng thu đƣợc thấp có thể là do sự suy giảm một phần của pectin trong điều kiện chiết tách khác nhau. Trọng lƣợng tƣơng đƣơng tăng hay giảm cũng phụ thuộc vào lƣợng acid tự do có trong phân tử pectin [60].

3.2.3.2. Hàm lượng AUA

Hàm lƣợng AUA là chỉ số đánh giá độ tinh khiết của pectin chiết xuất từ nguồn nguyên liệu tự nhiên và sản phẩm pectin có độ tinh khiết cao thì chỉ số AUA tổng phải lớn hơn 65% [49]. Trong nghiên cứu này, hàm lƣợng AUA có trong phần rễ, thân và lá tƣơng ứng từ 25 – 34% đối với phân đoạn F1 và từ 27 – 41% (Bảng 3.6). Nhƣ vậy, so với tiêu chuẩn về hàm lƣợng AUA, thì mẫu pectin thu đƣợc từ cỏ biển E. acoroides thấp hơn so với yêu cầu về độ tinh khiết. Điều này có thể giải thích đƣợc trong quá trình tách chiết thu mẫu pectin có thể do một số yếu tố khách quan nhƣ dụng cụ, môi trƣờng và kỹ thuật chiết chƣa đƣợc tối ƣu nên dẫn đến hàm lƣợng thu đƣợc không cao.

3.2.3.3. Hàm lượng methoxyl và ester hóa

Hai chỉ số methoxyl (MI) và ester hóa (DE) đƣợc sử dụng phổ biến để đánh giá tính chất đặc trƣng của pectin. Và trong nghiên cứu này, hai chỉ số MI và DE của pectin thu nhận từ phần rễ, thân gốc và lá của cỏ biển E. acoroides đƣợc xác định dựa trên trọng lƣợng tƣơng đƣơng đã đề cập ở phần trên. 64

Kết quả xác định hai chỉ số là methoxyl (MI) và ester hóa (DE) đƣợc thể hiện trong bảng 3.6. Chỉ số MI của phần rễ, thân và lá từ 3 – 5% ở cả 2 phân đoạn; trong khi đó, chỉ số DE ở phần thân đạt 76 – 78% ở phân đoạn F1 và F2 cao hơn so với rễ và lá lần lƣợt là 64 – 67% (F2).

Nhƣ vậy, qua kết quả nghiên cứu cũng cho thấy chỉ số MI xấp xỉ 7% và chỉ số DE lớn hơn 50%. Căn cứ vào tiêu chuẩn chất lƣợng của pectin dựa trên hai chỉ số ME và DE, pectin thu đƣợc từ cỏ biển E. acoroides thuộc loại pectin có ester hóa cao.

Theo các kết quả nghiên cứu trƣớc đây, pectin thu nhận từ hai loài cỏ biển Z. marina và Phyllospadix iwatensis có chỉ số DE lần lƣợt là 7,9% và 10,2% [12, 31]; những giá trị này thấp hơn nhiều so với pectin thu từ cỏ biển E. acoroide (64-67%). Nhƣ vậy, pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroide trong nghiên cứu hiện tại có chỉ số DE khá cao so với các loài cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc công bố trƣớc đó. Có thể nói cỏ biển thu nhận tại vùng biển Khánh Hòa có những tính chất đặc trƣng khác so với những loài cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu trên thế giới. Sự khác nhau này có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides đƣợc thu nhận tại biển Khánh Hòa của Việt Nam, là vùng biển nhiệt đới khác hoàn toàn so với pectin từ Z. marina và Phyllospadix iwatensis thu tại vùng biển ôn đới của Nga. Sự khác nhau về vị trí địa lý, môi trƣờng sống và giống loài có thể là nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về tính chất của pectin thu nhận đƣợc, trong đó có chỉ số DE. Cho đến nay, quá trình tách chiết pectin chủ yếu đƣợc thực hiện trên các đối tƣợng thực vật trên cạn; chỉ số DE của pectin thu nhận từ các loài thực vật trên cạn ở mức khá cao. Ví dụ, chỉ số DE của pectin thu từ vỏ cam, quýt đạt mức khoảng 76% [62]; 33-79% [32]; 52% [59] và trong thanh long là từ 31- 52% [63]. 65

Hàm lƣợng methoxyl là một yếu tố quan trọng trong việc kiểm soát thời gian và khả năng tạo gel của pectin [64]. Kết quả nghiên cứu hiện tại cho thấy pectin thu nhận từ phần rễ, thân và lá của cỏ biển E. acoroide có giá trị MI tƣơng ứng chỉ từ 3-5% ở cả 02 phân đoạn; giá trị thu đƣợc này thấp hơn so với pectin thu nhận từ các nguồn thực vật nhƣng không đáng kể nhƣ: vỏ xoài (7,33%), chuối (7,03%), vỏ bƣởi (8,57%) và chanh nhỏ (9,92%) [65]; 6,21% [59] nhƣng cao hơn trong thanh long là 2,98-4% [63] và trong măng cụt Indonesia là 2,86% [35]. Các pectin thƣơng mại thƣờng có hàm lƣợng methoxyl nằm trong khoảng từ 8-11%. Đối với những pectin có hàm lƣợng MI thấp hơn 7% đƣợc coi là pectin có chỉ số methoxyl thấp. Hàm lƣợng methoxyl ảnh hƣởng đến quá trình tạo gel của pectin và khả năng phân tán pectin trong nƣớc; pectin với hàm lƣợng methoxyl cao có khả năng phân tán trong nƣớc tốt hơn pectin có hàm lƣợng methoxyl thấp [66]. Trong nghiên cứu này, pectin đƣợc thu nhận từ cả phần rễ, thân và lá của cỏ biển có hàm lƣợng methoxyl thấp hơn 7%. Nhƣ vậy, pectin thu nhận từ cỏ biển đạt yêu cầu về chất lƣợng của pectin có chỉ số methoxyl thấp.

Bảng 3.6: Các chỉ số đặc trƣng của pectin từ phần rễ, thân và lá của cỏ biển E.acoroides

Rễ Thân Lá Thành phần F1 F2 F1 F2 F1 F2

AUA (%) 25,81 33,15 34,91 41,65 25,52 27,57

DE (%) 71,59 64,60 78,15 76,06 72,41 67,02

MI (%) 3,26 3,77 4,81 5,58 3,26 3,26

EW (g/mol) 2400 1500 2307,7 1764,7 2500 1935,5 66

3.2.4. Đặc trƣng cấu trúc của pectin

Phổ IR đƣợc sử dụng để đánh giá sự có mặt của các nhóm chức trong cấu trúc phân tử của pectin. Các mẫu phân đoạn F2 (pectin) đƣợc phân lập từ các bộ phận rễ, thân gốc và lá của cỏ E. acoroides đƣợc tiến hành đo phổ IR để xác định sự có mặt và đặc trƣng của các nhóm chức của các phân đoạn pectin này. Kết quả đo phổ IR của các mẫu pectin đƣợc thể hiện trên các hình 3.11-3.13.

C-O-C

C-O-S CH

S=O OH - C=O COO

Hình 3.11: Phổ IR của phân đoạn F2 – rễ của cỏ biển E.acoroides

C-O-C

S=O CH C-O-S - OH C=O COO

Hình 3.12: Phổ IR của phân đoạn F2 - thân của cỏ biển E. acoroides 67

C-O-C CH OH

C=O - COO

Hình 3.13: Phổ IR của phân đoạn F2 – lá của cỏ biển E.acoroides

Qua kết quả phổ FT-IR của phân đoạn polysaccharide F2-rễ; F2-lá và F2-thân rễ đƣợc trình bày tƣơng ứng với các hình 3.11 - hình 3.13, có thể thấy rõ vùng tín hiệu hấp thụ ở số sóng 3122 cm-1 (F2-rễ); 3415 cm-1 (F2-thân) và 3127 cm-1 (F2-lá) lần lƣợt thuộc về dao động của nhóm OH và bên cạnh đó tƣơng ứng vùng tín hiệu sóng hấp thụ là 2864 cm-1; 3205 cm-1 và 2864 cm-1 cũng cho biết có chứa nhóm CH [35]. Sự có mặt của các nhóm carbonyl (C=O) trong phân đoạn polysaccharide của rễ, thân và lá đƣợc chỉ ra tƣơng ứng bởi các tín hiệu hấp thụ ở số sóng 1598 cm-1; 1658 cm-1 và 1642 cm-1. Trong khi đó, nhóm cacboxylic acid (COO-) đối với rễ; thân và lá đƣợc xác nhận thông qua các tín hiệu dao động ở bƣớc sóng là 1402,59 cm-1 (hình 3.11); 1402,10 cm-1 (hình 3.12) và 1403 cm-1 (hình 3.13) [35].

Bên cạnh đó, nhóm C-O-S đƣợc xác định ở vùng tín hiệu hấp thụ số sóng lần lƣợt là 803,93 cm-1 và 802,27 cm-1 đối với rễ và thân của phân đoạn F2-E.acoroides [67]. Vùng tín hiệu hấp thụ ở số sóng 1103 cm-1 (F2-rễ); 1101 cm-1 (F2-thân) và 1102 cm-1 (F2-lá) cũng cho biết thêm thông tin vể sự có mặt 68

của nhóm C-O-C có trong cấu trúc phân tử polysaccharide. Các kết quả tƣơng tự cũng đƣợc chỉ ra trong nghiên cứu về polysaccharide sulfate từ cỏ xoan H. ovalis ở Ấn Độ [67]. Trên phổ IR của 02 phân đoạn F2-rễ và F2-thân gốc đều cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử polysaccharide, mặc dù kết quả phân tích hàm lƣợng sulfate không phát hiện thấy trong 02 phân đoạn này. Điều này có thể đƣợc giải thích do giới hạn phát hiện của phƣơng pháp phân tích độ đục thấp, và hàm lƣợng sulfate thực tế trong các phân đoạn này không cao nên dẫn tới kết quả không phát hiện thấy sự có mặt của nhóm sulfate. Kết quả này cũng cho thấy, khả năng hai phân đoạn pectin từ rễ và từ thân gốc có lẫn một phần nhóm polysaccharide sulfate.

Nhƣ vậy, mẫu pectin trong phân đoạn F2 ở bộ phận lá cho kết quả phù hợp với kết quả phân tích hàm lƣợng sulfate bằng phƣơng pháp hóa học và trong phân đoạn này xác nhận sự có mặt của các nhóm acetyl (COO-) và nhóm carboxyl (C=O) thông qua phổ IR. 69

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu các kết quả chính của đề tài đạt đƣợc nhƣ sau:

1. Pectin từ loài cỏ biển Enhalus acoroides đƣợc thu thập ở vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa đã đƣợc tách chiết và thu nhận. Hàm lƣợng pectin (F2) thu nhận đƣợc có phân bố nhiều nhất là 24,2% trong lá; 10,5% và 10,9% lần lƣợt trong rễ và thân của cỏ biển. Giá trị độ nhớt của pectin thu đƣợc từ loài cỏ biển này đạt 4 – 5Cps (Centipose – đơn vị độ nhớt), cho thấy khối lƣợng phân tử trung bình của pectin không cao.

2. Thành phần hóa học chính của pectin (phân đoạn F2) phân bố trong rễ, thân gốc và lá đã đƣợc xác định bao gồm: hàm lƣợng tổng carbohydrate dao động trong khoảng (24,87 – 28,30%) và hàm lƣợng uronic acid trong khoảng (6,19 - 7,88%). Thành phần monosaccharide của pectin (lá cỏ) đƣợc xác định có chứa đồng thời nhiều gốc đƣờng khác nhau, trong đó thành phần gốc đƣờng chính là glucose (23,23%); cùng với một lƣợng nhỏ các gốc đƣờng khác nhƣ: galactose (2,02%); rhamnose (1,01%); mannose (0,86%); arabinose (0,75%) và xylose (0,65%).

3. Một số tính chất đặc trƣng của pectin cũng đã đƣợc xác định nhƣ: chỉ số methoxyl hóa (MI) dao động trong khoảng 3,26% (lá) – 5,58% (thân) và chỉ số ester hóa (DE) của pectin từ 64,60% (rễ) – 76,06% (thân). Nhƣ vậy, có thể thấy pectin thu nhận đƣợc từ cỏ E. acoroides thuộc loại pectin có chỉ số ester hóa cao.

4. Kết quả phân tích phổ IR của các mẫu pectin cho thấy sự có mặt của các nhóm acetyl và nhóm carboxyl trong phân tử petin. Đồng thời còn xác nhận sự có mặt hay không của nhóm sulfate. Phân đoạn F2 đƣợc chiết từ lá 70

của cỏ E. acoroides không chứa nhóm sulfate nhƣng ở bộ phận rễ và thân gốc lại cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate.

4.2. KIẾN NGHỊ

Với các kết quả đạt đƣợc trong nghiên cứu này chúng tôi có một số kiến nghị nhƣ sau:

1. Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá chi tiết về một số tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học của pectin từ cỏ E. acoroides (khả năng tạo gel và tăng sức đông của pectin nhƣ là thành phần bổ sung trong một số sản phẩm thực phẩm, khả năng hấp thu kim loại hóa trị II, và một số hoạt tính sinh học khác,...), từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn cỏ biển phong phú ở Việt Nam.

2. Xác định cấu trúc hóa học, một số chuyển hóa cấu trúc của pectin nhằm làm tăng hoạt tính sinh học của pectin, phục vụ cho nghiên cứu về mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính sinh học của pectin để làm tăng giá trị sử dụng của pectin từ cỏ biển E.acoroides. 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Tiến, Lê Thanh Bình, Nguyễn Hữu Đại, Trần Hồng Hà, Từ Thị Lan Hƣơng, Đỗ Nam, Đàm Đức Tiến, 2004. Tiến tới quản lý hệ sinh thái cỏ biển Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Tiến, Đặng Ngọc Thanh và Nguyễn Hữu Đại, 2002. Cỏ biển Việt Nam; Thành phần loài, phân bố, sinh thái – sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, pp 164. 3. Bharathi N. Pushpa, Amudha. P, and Vanitha, 2016. V. Sea Grasses - Novel Marine Nutraceuticals. Int J Pharm Bio Sci, 7(4): (B), 567 – 573. 4. Nguyễn Văn Tiến, 2013. Nguồn lợi thảm cỏ biển Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội. 5. C. den Hartog, J. Kuo, 2006. Chapter 1. and Biogeography of Seagrasses. In: A.W.D. Larkum, R.J. Orth, C.M. Duarte. Seagrasses: Biology, Ecology and Conservation. Springer, pp 1-21. 6. R.C. Phillips, E.G. Menez, 1988. Seagrasses. Publications of the Smithsonan Institution, Washington D.C, pp 105. 7. Ed P. Green và Frederick T. Short, 2003. World Atlas of Seagrasses. University of California Press, Berkeley, USA, pp 324. 8. Nguyễn Thị Thùy Duyên, 2017. Nghiên cứu thu nhận và xác định thành phần của pectin từ cỏ biển Enhalus acoroides. Luận văn tốt nghiệp đại học, Trƣờng Đại học Nha Trang. 9. Tạ Duy Tiên, Dƣơng Thị Hƣơng Giang và Phan Thị Bích Trâm, 2008. Tách chiết, tinh sạch pectin và điều chế dẫn xuất chlorophyllin tan trong nước từ lá dây hoàng thanh Cocculus sarmentosus (lour) diels. Tạp chí Khoa học, pp118-125. 10. Ovodova, R. G.; Vas’Kovskii, V. E.; Ovodov, Y. S, 1968. The pectic substances of Zosteraceae. Carbohydrate Research. 6, pp 328–332. 11. Renard, C.M.G.C.; Crepeau, M.J.; Thibault, J.F, 1995. Structure of repeating units in the rhamnogalacturonic backbone of apple, beet and citrus 72

pectins. Carbohydrate Research., pp 275, 155–165. 12. Khotimchenko M. Yu, Lenskaya K. V., Petrakova M. Yu., Khotimchenko Yu. S., and Kovalev, 2006. The Mercury Binding Activity of Pectin Isolated from the Seagrass Zostera marina. Russian Journal of Marine Biology, Vol 32, No. 5, pp. 312-315. 13. Mariappan Premanathan, K. Chandra, S. K. Bajpai, Kathiresan Kandasamy, 1992. A Survey of Some Indian Marine for Antiviral Activity. Botanica Marina vol 35, pp 321 – 324. 14. Huang L, Massa L, Karle J, 2006. The Kernel Energy method: application to a tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 103(5): pp 1233-1237. 15. Archana Devi; Manoranjan Kalia; Gupta, V. K. ; Katoch, B. S., 1997. Effect of feeding different levels of khesari (Lathyrus sativus) and vetch (Vicia sativa) proteins on the performance of starter chicks. The Indian Journal of Nutrition and Dietetics, vol 34 (2): pp 49-58. 16. Jensen, E.J., A.S. Ackerman, D.E. Stevens, O.B. Toon, and P. Minnis, 1998. Spreading and growth of contrails in a sheared environment. Journal of Geophysical Research., vol 103, pp 31557-31568. 17. D'Aquino KE, Monje-Casas F, Paulson J, Reiser V, Charles GM, Lai L, Shokat KM, Amon A . The protein kinase Kin4 inhibits exit from mitosis in response to spindle position defects. Mol Cell 19 (2): pp 223-234. 18. Paul Bushmann, M. Stephen Ailstock, 2006. Antibacterial compounds in estuarine submersed aquatic plants. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 331 (1): pp 41-50. 19. Trình Liên Vy, 2012. Nghiên cứu pectin và xây dựng quy trình sản xuất bột thạch từ lá sương sâm. Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật, Trƣờng Đại học Đà Nẵng. 20. Kerry Hosmer Caffall, Debra Mohnen, 2009. The structure, function, and biosynthesis of cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate 73

Research 344(14): pp 1879-1900. 21. Loyenko, Y.N.; Artyukov, A.A.; Kozlovskaya, E.P.; Miroshnichenko, V.A.; Elyakov, G.B, 1997. Zosterin. Dal’nauka: Vladivostok, Russia; p 212. 22. Pornsak Sriamornsak, 2003. Chemistry of pectin and its pharmaceutical uses: A review. Silpakorn University International Journal. 23. Perez, S.; Rodriguez-Carvajal, M.A.; Doco, 2003. A complex plant cell wall polysaccharide. Rhamnogalacturonan II. A structure in quest of a function. Biochimie, vol 85, pp 109–121. 24. Khotimchenko. Yu. S, 2010. The Antitumor Properties of Nonstarch Polysaccharides: Carrageenans, Alginates, and Pectins. Russian Journal of Marine Biology, Vol. 36, No. 6, pp. 401-412. 25. Ridley, B.L., O’Neill, M.A., and Mohnen, D , 2001. Pectins: Structure, Biosynthesis, and Oligogalacturonide-Related Signaling. Phytochemistry, vol. 57, pp 929–967. 26. Ovodov, Yu.S, 2009. Modern Ideas about Pectin Substances, Bioorgan. Khimiya, vol. 35, no. 3, pp. 293–310. 27. O’Neill, M.A., Ishii, T., Albersheim, P., and Darvill, A.G, 2004. Rhamnogalacturonan II: Structure and Function of a Borate Cross-Linked Cell Wall Pectic Polysaccharide. Annual Reviews. Plant Biol, vol. 55, pp. 109–139. 28. Food Chemical Codex, 1996. IV monographs. Washington DC: National Academy Press, P.283. 29. V.I Shibaeva, L.A Elyakova, Yu.S Ovodov, 1970. Pectic substances of zosteraceae—III zosterinase activity of some invertebrates. Institute of Biologically Active Substances, Academy of Sciences of the U.S.S.R., Vladivostok-22, U.S.S.R. 30. Vincent Gloaguen,Ve´ronique Brudieux, Brigitte Closs,‡ Aline Barbat, Pierre Krausz, Odile Sainte-Catherine, Michel Kraemer, Emmanuel Maes, and Yann Guerardel, 2010. Structural Characterization and Cytotoxic 74

Properties of an Apiose-Rich Pectic Polysaccharide Obtained from the Cell Wall of the Marine Phanerogam Zostera marina. Journal of Natural Products, vol 73, pp 1087-1092. 31. Khozhaenko, E., Kovalev, V., Podkorytova, E., Khotimchenko, M, 2016. Removal of the metal ions from aqueous solutions by nanoscaled low molecular pectin isolated from seagrass Phyllospadix iwatensis. Science of the Total Environment, 565, pp. 913-921. 32. Azad, A. K. M., Ali, M. A., Akter, M. S., Rahman, M. J., Ahmed, M, 2014. Isolation and characterization of pectin extracted from lemon pomace during ripening. Journal of Food and Nutrition Sciences, 2(2), pp. 30-35. 33. Ivan Ivanov, Nadezhda Petkova, Panteley Denev, 2017. Physicochemical characterization of pectin from orange peels obtained after different extracting conditions. Industrial Technologies, Vol. IV (1), 21-25. 34. Shan Qin Liew, Nyuk Ling Chin, Yus Aniza Yusof, 2014. Extraction and characterization of pectin from Passion fruit peels. Agriculture and Agricultural Science Procedia 2, pp 231 – 236. 35. Nasrul Wathoni, Chu Yuan Shan, Wong Yi Shan, Tina Rostinawati, Bayu Indradi, Rimadani Pratiwi, Muchtaridi Muchtaridi, 2019. Characterization and antioxidant activity of pectin from Indonesian mangosteen (Garcinia mangostana L.) rind. Heliyon. 36. Ishii N, Yamamoto M, Lahm HW, Iizumi S, Yoshihara F, Nakayama H, Arisawa M, Aoki Y, 1997. A DNA-binding protein from Candida albicans that binds to the RPG box of Saccharomyces cerevisiae and the telomeric repeat sequence of C. albicans. Microbiology 143 ( Pt 2): pp 417-427. 37. Christophe Rihouey, Claudine Morvan, Irina Borissova, Alain Jauneau, Maurice Demarty, MichaelJarvis, 1995. Structural features of CDTA-soluble pectins from flax hypocotyls. Carbohydrate Polymers Volume 28, Issue 2, pp 159-166. 38. Patrice Lerouge, Marion Cabanes - Macheteau, Catherine Rayon, Anne - Catherine Fischette - Lainé, Véronique Gomord, Loïc Faye, 1998. N- 75

Glycoprotein biosynthesis in plants: recent developments and future trends. Plant Molecular Biology volume 38, pp 31–48. 39. Luc Saulnier, Jean‐François Thibault, 1999. Ferulic acid and diferulic acids as components of sugar‐beet pectins and maize bran heteroxylans. Society of Chemical Industry. 40. Taheri N, Köhler T, Braus GH, Mösch HU, 2000. Asymmetrically localized Bud8p and Bud9p proteins control yeast cell polarity and development. EMBO J 19(24): pp 6686-6696. 41. Marounek, M.; Volek, Z.; Synytsya, A.; Čopíková, J, 2007. Effect of pectin and amidated pectin on cholesterol homeostasis and cecal metabolism in rats fed a high-cholesterol diet. Physiological Research., 56, pp 433–442. 42. Sonina L. N. and Khotimchenko M. Yu, 2007. Effectiveness of Pectin Extracted from the Eelgrass Zostera marina for Alleviating Lead-Induced Liver Injury. Russian Journal of Marine Biology, Vol. 33, No. 3, pp. 204–206. 43. Anna C Ciao, Katie Loth, Dianne Neumark-Sztainer, 2014. Preventing Eating Disorder Pathology: Common and Unique Features of Successful Eating Disorders Prevention Programs. Current Psychiatry Reports 16(7): pp 453. 44. Pranati Srivastava, Rishabha Malviya, 2011. Sources of pectin, extraction and its applications in pharmaceutical industry. Indian Journal of Natural Products and Resources, pp 10 -18. 45. Bùi Anh Võ, Nguyễn Đức Lƣợng, 2009. Nghiên cứu thu nhận pectin từ vỏ cà phê. Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ - Vol. 13, No. 2K. 46. Vishchuk, O. S., Ermakova, S. P., Zvyagintseva, T. N, 2011. Sulfated polysaccharides from brown seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics, and antitumor activity. Carbohydrate research, 346(17), pp. 2769-2776. 47. G. Mesbahi, Jalal Jamalian, A. Farahnaky, 2005. A comparative study on functional properties of beet and citrus pectins in food systems. Food 76

Hydrocolloids 19(4): pp 731-738. 48. Qi, S. H., Zhang, S., Qian, P. Y., Wang, B. G, 2008. Antifeedant, antibacterial, and antilarval compounds from the south china sea seagrass Enhalus acoroides. Botanica marina, 51(5), pp 441-447. 49. Youjing Lv, Xindi Shan, Xia Zhao, Chao Cai, Xiaoliang Zhao, Yinzhi Lang, He Zhu and Guangli Yu, 2015. Extraction, Isolation, Structural Characterization and Anti - Tumor Properties of an Apigalacturonan - Rich Polysaccharide from the Sea Grass Zostera caespitosa Miki. Marine Drugs, 13, pp 3710-3731. 50. Dubois. M, Gilles K. A, Hamilton J. K, Rebers P. A and Smith F, 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 28, 350–354. 51. Pham Duc Thinh, Roza V. Menshova, Svetlana P. Ermakova, Stanislav D. Anastyuk, Bui Minh Ly and Tatiana N. Zvyagintseva, 2013. Structural Characteristics and Anticancer Activity of Fucoidan from the Brown Alga Sargassum mcclurei. Marine Drugs, ISSN 1660-3397, 11, pp 1456-1476. 52. Dodgson , K.S; Price, R.G, 1962. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides. Biochemical Journal, 84(1), pp. 106-110. 53. Bitter, T., Muir, H. M, 1962. A modified uronic acid carbazole reaction. Analytical Biochemistry, 4(4), pp 330-334. 54. S. Rangana, 1995. “Hand Book of Analysis and Quality Control for Fruit and Vegetable Products”. Tata McGraw-Hills Publishing Company Limited, New Delhi. 55. J. Guan, S.P. Li, 2010. Discrimination of polysaccharides from traditional Chinese medicines using saccharide mapping—Enzymatic digestion followed by chromatographic analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 51, pp 590–598. 56. Lv, Y., Shan, X., Zhao, X., Cai, C., Zhao, X., Lang, Y., Yu, G, 2015. 77

Extraction, isolation, structural characterization and anti-tumor properties of an apigalacturonan-rich polysaccharide from the sea grass Zostera caespitosa Miki. Marine drugs, 13(6), pp 3710-3731. 57. Fernanda Aline de Moura, Fernanda Teixeira Macagnan, Luccie´lli Rodrigues dos Santos, Marilia Bizzani, Carmen Lu´cia de Oliveira Petkowicz, Leila Picolli da Silva, 2017. Characterization and physicochemical properties of pectins extracted from agroindustrial by-products. Journal of Food Science and Technology, 54(10), pp 3111-3117. 58. J. Kuo, C. den Hartog, 2001. Seagrass taxonomy and identification key. In: F.T. Short, R.G. Coles (eds.). Global Seagrass Research Methods. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier, pp 31-58. 59. Amit Kumar, Ghanshyam S. Chauhan, 2010. Extraction and characterization of pectin from apple pomace and its evaluation as lipase (steapsin) inhibitor. Carbohydrate Polymers 82, pp 454–459. 60. Ramli N; Asmawati, 2011. “Effect of ammonium oxalate and acetic acid at several extraction time and pH on some physicochemical properties of pectin from cocoa husks (Theobroma cacao)”. African Journal of Food Science, 5 (15). pp 790-798. 61. Vickie A. Vaclavik, Elizabeth W. Christian, 2008. Book: ―Essentials of Food Science‖. 62. Uthai Sotanaphun, Amornrut Chaidedgumjorn, Nudchanart Kitcharoen, Malai Satiraphan, 2012. Preparation of Pectin from Fruit Peel of Citrus maxima. Silpakorn University Science and Technology Journal vol (1). pp 42-48. 63. Norazelina Sah Mohd Ismail, Nazaruddin Ramli, Norziah Mohd Hani, Zainudin Meon, 2012. Extraction and Characterization of Pectin from Dragon Fruit (Hylocereus polyrhizus) using Various Extraction Conditions. Sains Malaysiana 41(1): pp 41-45. 64. Diana Constenla, Jorge E. Lozano, 2003. Kinetic model of pectin demethylation. Latin American applied research, vol 33, pp 91-96. 78

65. Madhav, A., and Pushpalatha P.B. (2002). ―Characterization of pectin extracted from different fruit wastes‖. Journal of Tropical Agriculture, 40 (1- 2). pp 53-55. 66. A. H. ROUSE, C. D. ATKINS, E. L. MOORE, 2006. Seasonal Changes Occurring in the Pectinesterase Activity and Pectic Constituents of the Component Parts of Citrus Fruits. Journal of Food Science 27(5): pp 419 – 425. 67. Neelakandan Yuvaraj and Venkatesan Arul, 2018. Sulfated polysaccharides of seagrass Halophila ovalis suppresses tumor necrosis factor-α-induced chemokine interleukin-8 secretion in HT-29 cell line. Indian J Pharmacol, 50(6), 336-343. 68. Nguyễn Xuân Hòa, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Nhật Nhƣ Thủy, 2013. Hiện trạng hệ sinh thái rừng ngập mặn và thảm cỏ biển ở khu vực đầm thủy triều tỉnh Khánh Hòa. Báo cáo Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5. Hà Nội. 69. Nguyễn Xuân Hoa, 2009. Điều tra, thống kê diện tích, thành phần loài, đánh giá hiện trạng phân bố hệ sinh thái rừng ngập mặn, thảm cỏ biển và vai trò cua chúng đối với kinh tế xã hội, môi trường ở vùng biển ven bờ tỉnh Khánh Hòa - Đề xuất giải pháp quản lí và sử dụng bền vững. Sở tài nguyên và môi trƣờng Khánh Hòa. 70. C. den Hartog, 1970. The seagrass of the world. North Holland. Publ. Co., Amsterdam, pp 265. 71. Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M, 1993. Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Stephania erecta. Journal of Natural Products, 56, pp 30-38. 72. John A. Brown and Stephen C. Fry, 1993. Novel O-D-Galacturonoyl Esters in the Pectic Polysaccharides of Suspension-Cultured Plant Cells. Plant Physiology, Vol. 103, pp. 993-999. 73. Prieto, P., Pineda, M., Aguilar, M., 1999. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum 79

complex: specific application to the determination of vitamin E. Analytical Biochemistry. 269, pp 337–341. 74. Vos, A.P.; Haarman, M.; van Ginkel, J.-W.H.; Knol, J.; Garssen, J.; Stahl, B.; Boehm, G.; M’Rabet, L, 2007. Dietary supplementation of neutral and acidic oligosaccharides enhances Th1-dependent vaccination responses in mice. Pediatric Allergy and Immunology, 18, pp 304-312. 75. Yen GC, Chen HY, 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, pp 27–37. 76. Zhu, Q.Y., Hackman, R.M., Ensunsa, J.L., Holt, R.R., Keen, C.L., 2002. Antioxidative activities of olong tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, pp 6929–6934.

80

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Diện tích phân bố hệ sinh thái cỏ biển ở nƣớc ta.

Bãi cỏ biển Diện tích (ha)

Vịnh Hà Cối (Quãng Ninh) 150

Vịnh Đầm Hà (Quãng Ninh) 80

Bãi triều Quân Lạn (Quãng Ninh) 100

Quần đảo Trƣờng Sa (Khánh Hòa) nd

Bạch Long Vỹ nd

Đầm Nhà Mạc (Quãng Ninh) 500

Đinh Vũ (Hải Phòng) 120

Tràng Cát (Hải Phòng) 60

Cát Hải (Hải Phòng) 100

Đông Long (Thái Bình) 150

Cồn Ngan (Nam Định) 30

Kim Trung (Ninh Bình) 120

Thanh Long (Thanh Hóa) 80

Xuân Hội (Hà Tĩnh) 50

Cửa Gianh (Quãng Bình) 500

Nhật Lệ (Quãng Bình) 200

Đầm Phá Tam Giang- Cầu Hai (Thừa Thiên Huế) 1000

Đầm Phá Lăng Cô (Thừa Thiên Huế) 120

Sông Hàn (Đà Nẵng) 300 81

Sông Thu Bồn (Quãng Nam ) 50

Đầm Thị Nại (Bình Định) 200

Cù Mông (Phú Yên) 250

Ô Loan (Phú Yên) 20

Vân Phong (Khánh Hòa) 200

Vịnh Hòn Khói (Khánh Hòa) 100

Đảo Nam Yết 30

Mỹ Giang (Khánh Hòa) 80

Đầm Nha Phú (Khánh Hòa) 30

Vịnh Nha Trang 50

Đầm Thủy Triều 800

Bãi Triều Mỹ Lƣơng (Ninh Thuận) 15

Bãi Triều Mỹ Hảo (Bình Thuận) 15

Đảo Phú Quý (Bình Thuận) 300

Côn Đảo (Bà Rịa – Vũng Tàu) 200

Đảo Phú Quốc 3650

Tổng số 9650 ha

82

Phụ lục 2: Thành phần loài và phân bố cỏ biển ở Việt Nam.

Tên khoa học Phân bố

C. rotundata QNg, PY, KH, NT, BT, BR-VT, KG

Cymodocea serrulata KH, BR-VT, KG

Enhalus acoroides PY, KH, BR-VT, NT, KG

QN, HP, TB, NĐ, TH, QB, TT-H, ĐN, QNa, H. beccarii KH

H. minor QNg, KH, BT, BR-VT, PQ

QN, TT-H, BĐ, QNg, PY, KH, BT, BR-VT, H. ovalis KG

H. uninervis BĐ, QNg, PY, KH, NT, BT, BR-VT, KG

Halodule pinifolia TT-H, QNg, BR-VT, KG

Halophila decipiens HP, BR-VT

QN, HP, TB, NĐ, NB, TH, QB, HT, TT-H, Ruppia maritima ĐN, QNa, PY, KH

Syringodium isoetifolium BT, BR-VT, KG

Thalassia hemprichii TT-H, QNg, KH, PY, NT, BT, BR-VT, KG

Thalassodendron ciliatum BR-VT

Zostera japonica QN, HP,QB, TT-H, QNa, BĐ

83

Phụ lục 3: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn.

84

Phụ lục 4: Sắc ký đồ HPLC thành phần đƣờng đơn mẫu pectin.

85

Phụ lục 5: Kết quả phân tích thành phần đƣờng đơn mẫu pectin.