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DIVERSIDADE GENÉTICA DE Aechmea blanchetiana (Baker) L. B. Smith (BROMELIACEAE) EM ÁREAS DE RESTINGA NO NORTE DO ESTADO DO ESPÍRITO SANTO, BRASIL.
Izabela Ferreira Ribeiro
Dissertação de Mestrado em Biodiversidade Tropical
Mestrado em Biodiversidade Tropical
Universidade Federal do Espírito Santo São Mateus, Abril de 2017 II
III
Dados Internacionais de Catalogação na publicação (CIP) (Divisão de Biblioteca Setorial do CEUNES - BC, ES, Brasil)
Ribeiro, Izabela Ferreira, 1993- R484d Diversidade genética de Aechmea blanchetiana (Baker) L. B. Smith (Bromeliaceae) em áreas de restinga no Norte do Estado do Espírito Santo, Brasil / Izabela Ferreira Ribeiro. – 2017. 65 f. : il.
Orientador: Andreia Barcelos Passos Lima Gontijo. Coorientador: Fábio Demolinari de Miranda ; Gloria Matallana Tobón. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade Tropical) – Universidade Federal do Espírito Santo, Centro Universitário Norte do Espírito Santo.
1. Bromeliacea. 2. Unidades de conservação. 3. Diversidade biológica. I. Gontijo, Andreia Barcelos Passos Lima. II. Miranda, Fábio Demolinari de. III. Tobón, Gloria Matallana. IV. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro Universitário Norte do Espírito Santo. V. Título.
CDU: 502
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AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal do Espírito Santo (UFES/CEUNES/CCENS) por todo apoio logístico e financeiro. A FAPES e CAPES, pela oportunidade de realizar o trabalho. Ao IEMA e ao SISBIO pelas licenças concedidas. A Reserva Natural Vale, Reserva Biológica de Comboios e ao Parque Estadual de Itaúnas, por todo apoio. Aos professores e o Programa de Pós-graduação em Biodiversidade Tropical. A Deus e Nossa Senhora pelo dom da vida, por me guiarem sempre por caminhos mais corretos e me permitirem completar mais uma etapa da minha vida. A Andreia Barcelos, pela orientação durante esses dois anos. Obrigada por me apresentar essa linha de pesquisa tão maravilhosa e pela confiança. Acredito que cresci e aprendi muito. Sei que nossos encontros foram poucos, mas foram suficientes para conhecer a pessoa magnifica que você é. Ao meu coorientador Fabio por toda ajuda e auxilio durante minha passagem por Alegre. Obrigada pelas reuniões semanais, pelas visitas ao laboratório e por sempre estar disponível.... Querida, acho que é sua mão. Como não chorar e rir ao mesmo tempo ne??! A minha coorientadora Gloria Matallana. Minha primeira orientadora e grande amiga. Obrigada por todos os anos de incentivo, amizade e confiança. Agradeço por não desistir e sempre acreditar no meu trabalho. Ao Luis Fernando Tavares de Menezes pelo apoio, cobrança, confiança, brincadeiras e amizade. Obrigado por me acolher e me aturar no LERMA, durante tanto tempo. Me faltam palavras para dizer o quanto tu foi e é importante na minha formação acadêmica. Aos meus pais, José Carlos e Angela Maria, pelo apoio e incentivo. Sei que não mediram esforços para que eu chegasse até aqui, vocês foram meus maiores financiadores e companheiros. À minha irmã Grazieli por todos os momentos de confidência, amizade, compreensão e amor. Aos meus pequenos e lindinhos João Pedro e Isaac. Vocês fizeram meus dias mais felizes, e a toda minha família, que sempre me apoiou durante toda essa caminhada. V
Ao Vitor, pelo incentivo, amor e dedicação durante a graduação e o mestrado. Me acompanhou desde o primeiro dia de aula na graduação até o ultimo do mestrado, lhe agradeço por tudo. Obrigada pela confiança e por todo o apoio, sempre me ouvindo e ao final das minhas reclamações e choros você sempre repetia... você vai conseguir, vai dar certo. Pois é meu bem, num era que você estava certo. As minhas amigas: Natalia Nantet, Thais Regi e Rayssa Caliman. A distância só significa força para nossa amizade. Vocês foram e sempre serão essenciais para minha vida. As “Biogatas” Fabiane, Luena, Patricia, Natane, Debora e Livia por todos os momentos maravilhosos. Nos separamos pelas metades na graduação, cada um com um caminho e uma linha de pesquisa, mas continuamos juntas de alguma forma. Acredito que amizade igual a de vocês é para vida toda. Aos meus colegas de laboratório em Alegre: Lucimara, Adelson, Aléxia, Edilson, Rodrigo, Liliana, Fran, Kelmer, Cassio, Mariana, Carla e Ronald, não tenho palavras para agradecer pelo que fizeram durante minha curta passagem em Alegre. Só tenho a agradecer por toda ajuda e amizade. Em especial a Aléxia e a Lucimara que me incentivaram e me ajudaram de uma forma inexplicável. Obrigada por serem tão prestativas e amigas. Chegaram de madrugada e saíram de madrugada do labs devido a mim. Só tenho a agradecer e lhes desejar sucesso. As minhas queridas amigas da república ELAS: Debora, Leticia e Geyse fizeram meus dias mais alegres durante meu tempo longe de casa. Nunca vou esquecer das nossas conversas na cozinha, nossas gulodices na cozinha e nossos encontros na cozinha (o melhor local da república). Obrigado por me socorrerem sempre que precisei. Adorei estar com vocês neste tempo. Espero vocês para pegar uma praia!! Ao LERMA e aos companheiros do LERMA: Alana, Amanda (ajudante de campo mais linda, rainha da Allagoptera) Laiza, Cris, Herval, Cleber, Claudio, Bruno, Amanda, Rafael... Acho que sou a veterana, já vi gente chegando, indo embora, voltando e indo novamente. Obrigado a todos por terem deixado um pedacinho de vocês comigo. E se eu tenho uma certeza? Esses seis anos no LERMA, sem dúvida foi a minha melhor escolha. Ao Herval (Rei do Inselberg) e o Cleber (Rei da Mata Atlântica). Formamos um belo trio de campo em, há aliais, hoje saiu o resultado e o campo mais difícil vai para: VI
Herval, seguido do seu Cleber. Obrigada por toda ajuda durante esses dois anos de amizade e ajudas extras em campo. Ao Bruno, por toda ajuda. O herbário ficou mais feliz e organizado com você. Obrigada por toda ajuda, pelas conversas e incentivo, só tenho a lhe desejar todo sucesso do mundo menino paulistano. Enfim a todos que de alguma forma me ajudaram nesta curta e ao mesmo tempo longa caminhada. VII
BIOGRAFIA Izabela Ferreira Ribeiro, filha de José Carlos da Silva Ribeiro e Angela Maria Ferreira Ribeiro, nasceu em Montanha/ES em 26 de Setembro de 1993. Em 2011, ingressou como aluna de graduação no Centro Universitário Norte do Espírito Santo (CEUNES), em São Mateus-ES onde obteve o título de Bacharel em Ciências Biológicas em dezembro de 2014. Em março de 2015, ingressou no mestrado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical na Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), em São Mateus-ES atuando em atividades de pesquisa com ênfase em genética molecular de plantas realizando defesa de dissertação em Abril de 2017. VIII
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez” George Bernard Shaw. IX
RESUMO
Aechmea blanchetiana (Baker) L. B. Smith. é uma espécie endêmica dos estados do Espírito Santo e Bahia, tendo valor econômico devido a sua exuberância. É utilizada em ornamentação de jardins e interiores. Além do seu valor econômico, apresenta funções ecológicas chaves como reservatório de água, formação de micro-hábitats e manutenção de guildas de polinizadores. O presente estudo objetivou avaliar a diversidade genética em populações de A. blanchetiana, em áreas de restingas no Espírito Santo. Para este estudo foram amostrados 148 indivíduos georreferenciados entre seis áreas naturais, sendo três áreas dentro de unidades de conservação (UC's): Parque Estadual de Itaúnas, Reserva Natural Vale e Reserva Biológica de Comboios; e três áreas externas às unidades de conservação: Guriri, Linhares e Regência. Para avaliar a diversidade genética foram utilizados 11 marcadores Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) que geraram 102 bandas polimórficas (65,8%). A partir destes resultados foram calculados os índices de diversidade genética para cada área de estudo e para todas as populações juntas. As áreas que apresentaram menor e maior diversidade genética foram, respectivamente, Guriri (H’ = 0,2795 e I = 0,4140) e Linhares (H’ = 0,3389 e I = 0,5020), ambas externas às unidades de conservação. Dentro das unidades de conservação o menor valor de diversidade está presente no Parque Estadual de Itaúnas (H’ = 0,300 e I = 0,4452) e o maior na Reserva Natural Vale (H’ = 0,338 e I = 0,5020). Quando todos os indivíduos amostrados foram incluídos na análise, o índice de Nei e de Shannon foram, respectivamente, H’ = 0,402 e I = 0,580. A dissimilaridade genética entre indivíduos variou de 0,13 a 1,0, permitindo a formação de 19 agrupamentos genéticos. A partir da análise bayesiana foram formandos quatro grupos geneticamente distintos (K = 4) e os valores de ɸST (0,2081) e de GST (0,2063) indicaram a existência de uma alta estruturação genética entre as populações. A AMOVA foi realizada a fim de medir a diferenciação das populações acima (Parque Estadual de Itaúnas, Guriri, Reserva Natural Vale e Linhares – grupo 1) e abaixo (Regência e Reserva Biológica de Comboios – grupo 2) do rio Doce, com intuito de testá-lo como uma barreira genética para a espécie. Este índice apresentou valor de 79,1% dentro dos grupos, 1,18% entre os grupos e 19,6% entre as populações dentro dos grupos, indicando que a maior diversidade a ser explorada está dentro dos grupos e não entre os grupos. Este resultado somado ao de fluxo gênico (Nm = 1,924) refutam a hipótese do rio Doce atuar como barreira genética para a espécie. Com este estudo foi possível verificar que os marcadores ISSR foram eficientes para caracterizar a diversidade genética de A. blanchetiana, mostrando que a espécie apresenta alta diversidade genética no norte do Espírito Santo e que as UC's estão mantendo o seu papel de manutenção e conservação do material genético da espécie.
Palavras-chave: Bromélias, dissimilaridade genética, estruturação genética, marcadores ISSR, unidades de conservação.
X
ABSTRACT
Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith. is an endemic species of the states of Espírito Santo and Bahia, having economic value due to its exuberance. It is used in the ornamentation of gardens and interiors. In addition to its economic value, it presents key ecological functions such as water reservoir, the formation of microhabitats and maintenance of guilds of pollinators. The present study aimed to evaluate the genetic diversity of populations of A. blanchetiana in areas of restingas in Espirito Santo. For this study, 148 georeferenced individuals were sampled from six natural areas, three areas within conservation units (CU's): Itaúnas State Park, Vale Natural Reserve and Biological Reserve of Comboios; and three areas outside the protected areas: Guriri, Linhares and Regência. To evaluate the genetic diversity, 11 Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) markers were used, which generated 102 polymorphic bands (65.8%). The genetic diversity indexes were calculated for each study area and for all populations together. The areas with the lowest and highest genetic diversity were Guriri (H' = 0.2795 and I = 0.4140) and Linhares (H' = 0.3838 and I = 0.5020) respectively, both external to the conservation areas. Within the conservation units the lowest diversity value is present at the Itaúnas State Park population (H' = 0.300 and I = 0.4452) and the highest in Vale Natural Reserve (H' = 0.338 and I = 0.5020). When all sampled individuals were included in the analysis, the Nei and Shannon indexes were, H' = 0.402 and I = 0.580, respectively. The genetic dissimilarity between individuals ranged from 0.13 to 1.0, allowing the formation of 19 genetic clusters. From the Bayesian analysis, four genetically distinct groups (K = 4) were formed and the values of ɸST (0.2081) and GST (0.2063) indicated the existence of a high genetic structure among the populations. AMOVA was carried out in order to measure the differentiation of populations above (Itaúnas State Park, Guriri, Vale Natural Reserve and Linhares - group 1) and below (Regência and Biological Reserve of Comboios - group 2) of the Doce river, in order to test it as a barrier Genetics for the species. This index had a value of 79.1% within the groups, 1.18% among the groups and 19.6% among the populations within the groups, indicating that the greatest diversity to be explored is within the groups and not between the groups. This result added to the gene flow (Nm = 1,924) refutes the hypothesis of the Doce river acting as a genetic barrier for the species. With this study it was possible to verify that the ISSR markers were efficient to characterize the genetic diversity of A. blanchetiana, showing that the species presents high genetic diversity in the north of Espírito Santo and that the CU's are maintaining their role of maintenance and conservation of the material of the species.
Key words: Bromeliads, genetic dissimilarity, genetic structuring, ISSR marker, conservation units. XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Imagem da espécie A. blanchetiana na restinga no Espírito Santo, Brasil. Fonte: O autor...... 17 Figura 2 - Áreas de coletas da espécie A. blanchetiana no litoral norte do estado do Espírito Santo, Brasil. Ponto A- (PEI): Parque Estadual de Itaúnas; Ponto B- (GUR): Guriri; Ponto C- (RNV): Reserva Natural Vale; Ponto D- (LIN): Linhares; Ponto E- (REG): Regência e Ponto F- (RBC): Reserva Biológica de Comboios. Entre os pontos D e E encontrasse a foz do Rio Doce...... 24 Figura 3 - Perfil eletroforético produzido pelo marcador UBC 840 em 30 indivíduos de A. blanchetina – Marcador de peso molecular (Ladder 100pb)...... 31 Figura 4 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética entre os 148 indivíduos de A. blanchetiana, formando 19 grupos em toda a amostragem populacional...... 33 Figura 5 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética das 6 populações de A. blanchetiana. A- Parque Estadual de Itaúnas; B- Guriri; C- Reserva Natural Vale; D- Linhares; E- Regência e F- Reserva Biológica de Comboios. (Continua)...... 35 Figura 6 - Análise de agrupamento (UPGMA) estimada com base no índice de diferenciação genética entre os grupos (GST), Nei (1973), nas seis populações de A. blanchetiana no estado do Espírito Santo. Parque Estadual de Itaúnas (PEI); Guriri (GUR); Reserva Natural Vale (RNV); Linhares (LIN); Regência (REG) e Reserva Biológica de Comboios (RBC)...... 39 Figura 7 - Gráfico obtido a partir da análise Bayesiana realizado nas seis populações de A. blanchetiana indicando o valor de ΔK com maior significância (K= 4)...... 40 Figura 8 - Inferência bayesiana das populações de A. blanchetiana usando o software STRUCTURE quando K = 4. A- Os números na horizontal correspondem aos 148 indivíduos amostrados e os números entre parênteses as respectivas populações. B- Os números na horizontal correspondem as 6 populações amostradas, 1- (PEI) Parque Estadual de Itaúnas; 2- (GUR) Guriri; 3- (RNV) Reserva Natural Vale; 4- (LIN) Linhares; 5- (REG) Regência e 6- (RBC) Reserva Biológica de Comboios...... 41
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Marcadores ISSR testados em indivíduos de A. blanchetiana e suas respectivas sequências...... 26 Tabela 2 – Marcadores ISSR selecionados para A. blanchetiana incluindo a descrição do número total de bandas amplificadas (NTB), número total de bandas polimórficas (NTBP), porcentagem de bandas polimórficas (PBP) e tamanho (PM - máximo e mínimo) dos fragmentos amplificados...... 30 Tabela 3 - Valores do complemento do Índice de Jaccard e da Correção cofenética das seis populações de A. blanchetiana analisados em áreas de restingas no norte do Espírito Santo...... 34 Tabela 4 - Valores de diferenciação genética (AMOVA) entre os grupos G1 e G2, entre as populações dentro dos grupos e dentro das seis populações de A. blanchetiana...... 38
XIII
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...... 14
1.1 Mata Atlântica ...... 14 1.2 Família Bromeliaceae ...... 14 1.3 Espécie Alvo ...... 16 1.4 Unidades de Conservação ...... 17 1.5 Barreiras biogeográficas ...... 18 1.6 Marcadores Moleculares ISSR ...... 19 2 OBJETIVOS ...... 21
2.1 Objetivo Geral ...... 21 2.2 Objetivos Específicos ...... 21 3 MATERIAL E MÉTODOS ...... 22
3.1 Áreas de estudo ...... 22 3.2 Coleta de Material Botânico ...... 25 3.3 Análise Molecular ...... 25 3.3.1 Extração de DNA e quantificação ...... 25 3.3.2 Amplificações de ISSR ...... 26 3.4 Análise Estatística ...... 27 4 RESULTADOS ...... 30
5 DISCUSSÃO ...... 42
5.1 Amplificação de Marcadores Moleculares ...... 42 5.2 Diversidade genética intrapopulacional e interpopulacional ...... 43 5.3 Unidades de Conservação ...... 47 6 CONCLUSÃO ...... 48
7 REFERÊNCIAS ...... 49
APÊNDICE A ...... 58
APÊNDICE B ...... 59
APÊNDICE C ...... 60
APÊNDICE D ...... 61
APÊNDICE E ...... 62
APÊNDICE F ...... 63
APÊNDICE G...... 64 14
1 INTRODUÇÃO
1.1 Mata Atlântica A floresta Mata Atlântica está distribuída por 17 estados ao longo do litoral brasileiro, desde o Rio Grande do Norte ao Rio Grande do Sul e atingindo áreas da Argentina e Paraguai (INPE; FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA, 2016). Dos 35 hotspots existentes no planeta (WILLIAMS et al., 2011), o bioma Mata Atlântica é considerado um dos mais importantes devido ao seu alto grau de endemismo e rica diversidade biológica. Mesmo apresentando alto valor biológico, este bioma é considerado um dos mais ameaçado, por sofrer fortes pressões antrópicas ao longo dos anos (MYERS et al., 2000), sendo alterado desde meados de 1535 com a colonização na região do Espírito Santo (LACHINI, 2009), alterando diversos ecossistemas e reduzindo a biodiversidade local. Estudos recentes apontam o desmatamento de 18.433 ha de remanescentes florestais nos 17 estados no período entre 2014 e 2015 (INPE; FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA, 2016). Diante dessas ameaças, a vegetação do sudeste brasileiro vem sofrendo drásticas modificações (RAMBALDI; OLIVEIRA 2003; TABARELLI et al., 2005) e o estado do Espírito Santo é considerado um dos mais desmatados nos últimos anos (INPE; FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA, 2016). Neste estado, o bioma Mata Atlântica ocorre sobre três províncias geomorfológicas distintas: a região Serrana, que é formada por terras altas com ocorrência de rochas cristalinas, os Tabuleiros Terciários caracterizados por depósitos sedimentares terciários, superfície plana e suavemente inclinada com vales de fundo chato e colmatado e as Planícies Quaternárias, constituídas por sedimentos arenosos, terraços marinhos pleistocênicos e holocênicos (MARTINS; SUGUIO; FLEXOR, 1993). Nas planícies quaternárias a variação do nível do mar levou a formação de vastas planícies arenosas constituídas pela sucessão de cristais e cavas ao longo do litoral brasileiro (GOMES, 1995) chamadas de restingas (RIZZINI, 1997).
1.2 Família Bromeliaceae A família Bromeliaceae distribui-se nas Américas, desde o Sul dos Estados Unidos até o norte da Patagônia, com a única exceção da espécie Pitcarnia feliciana (A. Chevalier) Harms & Mildbraed. que ocorre na costa oeste da África (BENZING, 15
2000). É constituída por 3.140 espécies distribuídas em 58 gêneros (GIVNISH et al. 2011) e dividida em 3 subfamílias: Pitcairnioideae, Tilandsioideae e Bromelioideae a partir da observação de características dos frutos, sementes e hábito de vida (SMITH; DOWNS, 1974). Entretanto, Givnish et al. (2007, 2011) a partir de estudos e evidências moleculares, propõem a reorganização das subfamílias, incluindo outras cinco: Brocchinioideae, Hechtioideae, Lindmanioideae, Navioideae e Puyoideae levando a um suporte monofilético á família.
As espécies da família são consideradas elementos essenciais do bioma Mata Atlântica (REITZ, 1983; BENZING, 2000) por apresentarem importantes funções ecológicas, como reservatório de água do dossel e do solo (BENZING, 2000), micro- hábitats (e.g. algas, aracnídeos, anfíbios e répteis, entre outros) (REITZ, 1983; RODRIGUES et al., 2003), espécies chaves para diversos organismos e como fornecedoras de recursos (ex. néctar) para a manutenção de guildas de grupos biológicos como beija-flores, abelhas, morcegos (SIQUEIRA FILHO; MACHADO, 1998;2001;2006) e borboletas (HALLWACHS, 1983; VARASSIN; SAZIMA, 2000). Esta família apresenta um alto grau de endemismo no Brasil, principalmente na região sul e sudeste do país (REITZ, 1983), sendo o principal recurso para suprir as necessidades energéticas dos beija-flores, que apresentam adaptações fisiológicas, morfológicas e comportamentais para dieta nectarívora (BUZATO et al., 2000). Seus representantes apresentam flores bissexuadas e mecanismos de autocompatibilidade e autoincompatibilidade já foram relatados em alguns estudos (BENZING, 2000; MATALLANA et al., 2010).
No Brasil, a família é bem representada, devido a abundância e diversidade de espécies, existindo cerca de 44 gêneros e, aproximadamente, 1290 espécies (FORZZA et al., 2013) distribuídas em todos os ecossistemas, ocupando ambientes desde o nível do mar até campos de altitude, acima de 2000 metros (LEME; MARINGO, 1993), além de apresentar hábitos que variam de terrestre a epífito (RANKER et al., 1990).
A família se destaca por abrigar 36% das espécies ocorrentes nos ecossistemas brasileiros, obtendo diversos gêneros endêmicos, sendo alguns encontrados exclusivamente no Bioma Mata Atlântica (MARTINELLI, 1994). Coser (2013) em um estudo de diversidade da família no estado do Espírito Santo indicou que esta é representada por 303 espécies distribuídas em 25 gêneros, sendo 168 16
endêmicas do estado, merecendo destaque a subfamília Bromelioideae, com cerca de 65% de endemismo neste estado.
Dentro da subfamília Bromelioideae o gênero Aechmea Ruiz & Pav. se destaca por sua alta representatividade e distribuição dentro do bioma Mata Atlântica apresentando inflorescências vistosas e tendo muitas espécies consideradas ornamentais (SMITH; DOWNS, 1974).
Devido à destruição e fragmentação da Mata Atlântica (INPE; Fundação da Mata Atlântica, 2016) e a alta importância econômica da família pelo potencial ornamental (CARVALHO; MERCIER, 2005), as bromélias se tornaram alvo de extrativismo ilegal, levando espécies nativas a condições de ameaçadas à extinção (REITZ, 1983).
1.3 Espécie Alvo Aechmea blanchetiana (Baker) L. B. Smith. (Figura 1) é uma bromélia nativa do Brasil, endêmica do bioma Mata Atlântica e dos estados da Bahia e Espírito Santo (FORZZA et al., 2010). Apresenta hábito herbáceo ou epifítico, comuns nas restingas, formando grandes touceiras a pleno sol ou a meia-sombra em canteiros ricos em matéria orgânica. Os indivíduos apresentam folhagens com coloração verde clara, longas, rijas, laminares, verde-claras, côncavas, basais e em formato de roseta, sem espinhos nas margens formando tanque, e as hastes em tom amarelado, com altura de 60 a 90 cm de comprimento com inflorescências decorativas (LORENZI; SOUZA, 2001). Esta espécie apresenta alto valor econômico por ser considerada ornamental, tanto para interiores como jardins. Devido à grande importância ornamental as bromélias entre elas a espécie A. blanchetiana, estas se tornam alvo do extrativismo ilegal (CARVALHO; MERCIER, 2005). O extrativismo, associado à intensa fragmentação dos ecossistemas naturais levam muitas espécies nativas à condição de ameaçadas (REITZ, 1983), sendo as principais causas para a diminuição de indivíduos de uma população, deriva genética, aumento da endogamia, diminuição do fluxo gênico, levando a perda da diversidade genética (GALEUCHET; PERRET; FISCHER, 2005).
17
Figura 1 - Imagem da espécie A. blanchetiana na restinga no Espírito Santo, Brasil. Fonte: O autor.
1.4 Unidades de Conservação As Unidades de conservação (UC’s) são áreas que apresentam características relevantes com amostras significativas dos ecossistemas do território nacional e das 18
águas jurisdicionais, preservando o patrimônio biológico existente. As UC’s são compostas com um conjunto de unidades de conservação federais, estaduais, municipais e particuladas, com intuito de conservar recursos naturais (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2017).
O sistema de UC’s leva em consideração a conservação da diversidade biológica a longo prazo estabelecendo áreas naturais para conservação (MILANO et al., 1993). Nogueira-Neto (1997), cita que é necessário a implementação de UC's para cessar a perda de habitats e da biodiversidade. Estas áreas são criadas para proteger desde pequenos remanescentes florestais a grandes extensões de áreas naturais, tendo como objetivo a manutenção da diversidade biológica e dos seus recursos genéticos, podendo caracterizar essas áreas como bancos genéticos in situ.
No Espírito Santo existem diversas categorias de UC's administradas pelo IBAMA, IEMA, prefeituras e pessoas físicas ou jurídicas. O norte do estado apresenta diversas áreas de preservação: Reserva Biológica de Comboios, Reserva Natural Vale, Reserva Biológica de Sooretama, Reserva Biológica do Córrego do Veado, Flona do Rio Preto, Parque Estadual de Itaúnas e Reserva Biológica do Córrego Grande. A conservação in situ de espécies em UC's apresenta diversas vantagens, como permitir a continuidade de processos evolutivos de espécies, favorecer a proteção e manutenção da espécie no habitat, conservar polinizadores e dispersores e favorecer a troca de material genético entre os indivíduos. Desta forma, acredita-se que a criação dessas áreas pode garantir a conservação da variabilidade genética das espécies em espaço delimitado (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2017).
1.5 Barreiras biogeográficas Darwin (1859) supôs que as barreiras biogeográficas são um dos principais fatores que impedem a migração, reduzindo populações e podendo gerar novas espécies e confinamento de táxons. Wallace (1852) propôs pela primeira vez que a distribuição geográfica de espécies de primatas na Amazônia seria determinada pelos rios, levando a um endemismo para a fauna amazônica; o autor ressalta ainda que estas barreiras seriam efetivas não apenas para primatas. 19
A hipótese dos rios como barreira geográfica foi posteriormente testada e afirmada nos estudos de Ayres e Clutton-Brock (1992) e Capparella (1988). Ayres e Clutton-Brock (1992) testaram está hipótese levando em consideração as observações de Wallace. Em um estudo com primatas foi documentado a diminuição na similaridade destes indivíduos nas margens opostas do rios, levando em consideração a largura destes, e Capparella (1988) no estudo com aves de sub- bosque testou está hipótese se baseando em moleculares, e observou que o grau de divergência genética entre populações é dependente da largura dos rios. Os estudos de Darwin e Wallace indicaram as barreiras como responsáveis pela especiação. Porém, somente com os trabalhos de Croizat (1958) e Nelson e Platnick (1981) é que foi apresentado o termo Vicariância, e após anos, a partir do trabalho de Amorim e Pires (1996) é que se começou a ser entendido como um fator responsável por impedir o fluxo gênico entre indivíduos. Este estudo vem apresentando amplo suporte ao longo do tempo (ANTONELLI et al. 2010). Vários trabalhos têm testado os rios como barreiras genéticas (AYRES; CLUTTON-BROCK, 1992; COHN-HAFT, 2000; SIMÕES, 2010; RIBAS et al., 2011; KAEFER et al., 2013; HAYES; SEWLAL, 2004; POMARA; RUOKOLAINEN; YOUNG, 2013) sendo bem poucos realizados com plantas (MENICUCCI, 2007; DICK et al., 2007). Carnaval e Moritz (2008) em um estudo com modelagem paleoclimática indicaram a existência de refúgios florestais e que a formação do curso de rios poderia ter sido possibilitada por alguma alteração climática, podendo afetar a filogeografia de diversos grupos.
1.6 Marcadores Moleculares ISSR Os marcadores moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) estão presentes ao longo do genoma, indicando as variações genéticas existentes entre os organismos e tornando possível detectar a diferenciação entre indivíduos e entre populações (HILSDORF, 2011). Estes marcadores são primers oligonucleitídeos sintéticos, iniciadores da replicação de DNA, constituídos geralmente de 15 a 20 bases nitrogenadas em uma fita simples de DNA, que se baseia na amplificação de regiões entre sequências microssatélites adjacentes do DNA via PCR (Polymerase Chain Reaction) (GONZALÉZ et al., 2002). Na reação de PCR se utiliza somente um primer formado a partir de sequências microssatélites, que foram desenvolvidos pela necessidade de explorar repetições de 20
microssatélites sem a necessidade do conhecimento prévio da sequência alvo do DNA (ZIETJIEWICZ; RAFALSKI; LABUDA, 1994; GUPTA et al., 1994; WOLFE; LISTON, 1998). Os marcadores ISSR se destacam dos demais devido ao seu baixo custo, fácil utilização e grande reprodutibilidade (MATTHEWS et al., 1999). Embora sejam marcadores dominantes, apresentam a vantagem de analisar loci múltiplos em uma
única reação (GOULÃO; OLIVEIRA, 2001). Estes marcadores são considerados ferramentas importantes que têm sido utilizados em inúmeros estudos genéticos de plantas, como: caracterização genética, análises de similaridade intrapopulacional e interpopulacional, fluxo gênico e diversidade genética de populações, sendo confiáveis e informativos para trabalhos moleculares (FRANKHAM; BRISCOE; BALLOU, 2002). Diante de questionamentos sobre conservação e manutenção genética de espécies, estudos de diversidade genética suportados pelo emprego de marcadores moleculares, como os ISSR (GE et al., 2005; KUMAR et al., 2010; KUMAR; JENA; NAIR, 2010) podem auxiliar e avaliar o grau de variação genética existente em uma determinada espécie ao longo da sua ocorrência, permitindo o entendimento de como os indivíduos estão se mantendo em um habitat ao longo dos anos e podendo auxiliar na conservação, manutenção da variabilidade e estabelecimento de estratégias de conservação (ESTOPA et al., 2006).
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2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral Caracterizar a diversidade genética da espécie A. blanchetiana em remanescentes do bioma Mata Atlântica no norte do estado do Espírito Santo.
2.2 Objetivos Específicos Testar a competência de amplificação de marcadores moleculares ISSR em amostras de DNA de A. blanchetiana; Analisar e comparar a diversidade genética intrapopulacional e interpopulacional da espécie A. blanchetiana em unidades de conservação e em áreas externas de unidades de conservação, considerando a possibilidade de o Rio Doce funcionar como uma barreira genética; Verificar a capacidade das unidades de conservação de preservar a variabilidade genética da espécie A. blanchetiana. 22
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Áreas de estudo As coletas de A. blanchetiana foram realizadas no período de Janeiro a Março de 2015, em expedições que ocorreram em seis áreas de restinga no bioma Mata Atlântica no norte do estado do Espírito Santo. As áreas de coletas representadas na Figura 2 foram escolhidas com base em estudos prévios de levantamento da ocorrência da espécie. Três áreas se encontram dentro de UC's e três áreas externas a UC's. Em cada área foram coletadas amostras de 25 indivíduos, exceto no Parque Estadual de Itaúnas que foram coletadas amostras de 23 indivíduos. O ponto A (Figura 2) é o Parque Estadual de Itaúnas (PEI), situado no município de Conceição da Barra/ES no extremo norte do estado. O Parque é uma UC criada em 1991 e preserva cerca de 3.481 ha inserida entre as coordenadas geográficas 18° 23’ 8.70″ S / 39° 41’ 6.64″ W. Apresenta diversas formações, entre elas o ecossistema restinga, onde ocorre a presença da espécie em estudo (IEMA, 2004). As coletas foram realizadas ao longo da Trilha do buraco, uma trilha pouco explorada por turistas e pesquisadores. O ponto B (Figura 2) é Guriri (GUR) (18° 43’ 3.33″ S / 39° 44’ 5.82″ W), um fragmento de restinga localizado na cidade de São Mateus. Este fragmento vem sofrendo fortes pressões antrópicas ao longo dos anos, sendo considerado uma pequena faixa de vegetação rodeada por residências. O local possui relevo plano, constituído por vegetação arbórea baixa, herbácea e gramínea (BETHANIA et al., 2003). As coletas foram realizadas desde os arredores do projeto Tamar. A área apresenta características marcantes de interferência antrópica devido à presença de lixo, entulho e corte de vegetação recente. O ponto C (Figura 2) é a Reserva Natural VALE (RNV), localizada na Rodovia BR 101, km 121, na cidade de Linhares, inserida entre as coordenadas geográficas 19° 28’ 2.63″ S / 39° 53’ 9.78″ W. Compreende cerca de 23 mil ha de Mata Atlântica entre as fisionomias Restinga, Muçununga e Mata de Tabuleiro (RESERVA NATURAL VALE, 2016). As coletas foram realizadas no limite da reserva com um campo da Petrobras, em uma área de restinga pouco visitada por turistas e pesquisadores. 23
O ponto D (Figura 2) é Linhares (LIN) (19° 28’ 2.63″ S / 39° 47’ 1.12″ W), uma propriedade particular desta cidade. Nesta área se encontra uma faixa de vegetação de restinga. Segundo o proprietário, grande parte da vegetação foi desmatada afim de plantações, sendo mantida apenas uma pequena faixa intacta. O ponto E (Figura 2) é Regência (REG) (19° 39’ 0.05″ S / 39° 50’ 0.08″ W), localizada na cidade de Linhares, no povoado de Regência. É uma área localizada próxima ao oceano e casas residenciais. A vegetação é uma restinga de área aberta e vem sofrendo ao longo dos anos com fortes pressões antrópicas. O ponto F (Figura 2) é a Reserva Biológica de Comboios (RBC), criada em 1984 entre os municípios de Aracruz e Linhares, próximo ao povoado de Regência. A reserva compreende uma área de 784,63 ha de vegetação de restinga (IBAMA, 1997) e está inserida dentro das coordenadas geográficas 19° 40’ 0.98″ S e 39° 53’ 2.09″ W. As coletas foram realizadas em uma área aberta da reserva. 24
Figura 2 - Áreas de coletas da espécie A. blanchetiana no litoral norte do estado do Espírito Santo, Brasil. Ponto A- (PEI): Parque Estadual de Itaúnas; Ponto B- (GUR): Guriri; Ponto C- (RNV): Reserva Natural Vale; Ponto D- (LIN): Linhares; Ponto E- (REG): Regência e Ponto F- (RBC): Reserva Biológica de Comboios. Entre os pontos D e E encontrasse a foz do Rio Doce. 25
3.2 Coleta de Material Botânico Em todas as áreas foram coletadas folhas de indivíduos de A. blanchetiana mantendo como distância mínima cinco metros entre os indivíduos, com intuito de descartar coletas de indivíduos clones. Um total de 148 indivíduos foram coletados e georreferenciado utilizando GPS (Apêndices A, B, C, D, E, F). As amostras foram armazenadas individualmente em sacos de papel e lacrados dentro de sacos plásticos contendo sílica em gel a fim de minimizar a oxidação. No laboratório as amostras foliares foram cobertas por papel alumínio e armazenadas em freezer à -20 °C até a sua utilização.
3.3 Análise Molecular
3.3.1 Extração de DNA e quantificação O DNA genômico foi isolado e purificado utilizando a metodologia descrita por Doyle e Doyle (1990), com modificações. As folhas foram maceradas em almofariz de porcelana utilizando nitrogênio líquido. O pó obtido foi transferido para microtubos de 2 mL previamente identificados. Para cada amostra foi utilizado 900 uL de tampão de extração (2% w/v de CTAB; 1,4 mmol·L-1 de NaCl; 20 mmol·L-1 EDTA pH 8,0; 100 mmol·L-1 de Tris-HCl pH 8,0; 1% w/v de polivinilpirrolidona solido e 0,2% v / v β-mercaptoetanol) previamente aquecido a 65 °C. Posteriormente foram adicionados duas vezes o volume de clorofórmio-álcool isoamilico (24:1), os microtubos foram suavemente homogeneizados e centrifugados (modelo Pico 21 da Thermo Scientific, raio de 7,5 cm) por 12 minutos a 10.000 rpm e em seguida, a fase superior foi transferida para outros microtubos. Foi adicionado um volume de isopropanol gelado igual ao do sobrenadante e também acetato de amônio na proporção 1:3. Os microtubos foram suavemente agitados e incubados a - 20 °C por uma noite (12 horas). Após esta etapa, as amostras foram centrifugadas (modelo Pico 21 da Thermo Scientific, raio de 7,5 cm) por 20 minutos a 10.000 rpm, o sobrenadante foi removido e o precipitado foi lavado duas vezes com 250 µL de etanol 70%. O precipitado foi seco à temperatura ambiente e em seguida ressuspendido em 50 μL de TE (10 mmol·L-1 de Tris-HCl, 1 mmol·L-1 de EDTA a pH 8.0), contendo RNAse na 26 concentração final de 50 μg/mL. As amostras foram então incubadas em banho maria a 37 °C por 60 minutos, sendo que a cada 10 minutos os microtubos foram homogeneizados manualmente. A quantificação de DNA foi realizada no espectrofotômetro NanoDrop (Thermo Scientifc 2000C), sendo as amostras diluídas para 10 ng/mL e armazenadas no freezer à -20 °C.
3.3.2 Amplificações de ISSR Foram testados 28 marcadores ISSR da Universidade de British Columbia (Tabela 1) para a seleção dos mais informativos. Este teste foi realizado utilizando cinco amostras de DNA de cinco indivíduos distintos.
Tabela 1 – Marcadores ISSR testados em indivíduos de A. blanchetiana e suas respectivas sequências.
Marcadores Sequencias (5’-3’) UBC 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT UBC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG UBC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC UBC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA UBC 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT UBC 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA UBC 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG UBC 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT UBC 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA UBC 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT UBC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG UBC 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC UBC 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG UBC 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA UBC 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 27
UBC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG UBC 849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA TCC A UBC 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT UBC 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA UBC 861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC UBC 862 AGC AGC AGC AGC AGC AGC UBC 864 ATG ATG ATG ATG ATG ATG UBC 865 CCG CCG CCG CCG CCG CCG UBC 866 CTC CTC CTC CTC CTC CTC UBC 868 GAA GAA GAA GAA GAA GAA UBC 891 HVH TGT GTG TGT GTG TG
* A = Adenina; T = Timina; C = Citosina; G = Guanina; H = (A, T ou C); R = (A ou G); V = (A, C ou G) e Y = (C ou T).
As condições de amplificação foram padronizadas para um volume total de 20 uL contendo: tampão 1x (10 mM de Tris-HCl pH 8,5 e 50 mM de KCl), cloreto de magnésio 50 mmol·L-1, 0,25 mmol·L-1 de cada dNTP, 1 unidade de Taq DNA polimerase, 7,8 uL de água ultra pura, 50ng de DNA genômico e 0,2 umol·L-1 de primer. As amplificações foram realizadas em termociclador ( modelo Veriti da Applied Biosystems), com as seguintes etapas: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos nas condições: 1 minuto a 94 °C; 1 minuto a 52 °C e 1 minuto a 72 °C, com uma fase final de extensão de 7 minutos a 72 °C. Os fragmentos obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2,0% com tampão TBE 1X (Tris - 0,089 mol·L-1, Ácido bórico – 0,089 mol·L-1 e EDTA- 0,002 mol·L-1), com corrida a 100 Volts, por aproximadamente quatro horas. Posteriormente os géis foram corados por imersão em solução de brometo de etídio (0,50 μg/mL) durante 40 minutos, lavamos com água corrente e fotografados em sistema de fotodocumentação (ChemiDoc MP Imaging System – Bio Rad).
3.4 Análise Estatística Com base no padrão de amplificação, as análises foram realizadas a partir de bandas robustas e com boa nitidez. Bandas na mesma posição para todos os 28 indivíduos foram consideradas bandas monomórficas enquanto que bandas com posições distintas foram consideradas polimórficas. A contagem dos fragmentos permitiu a codificação em caracteres binários com a presença (1) e ausência (0) de bandas; e para os dados perdidos foram atribuídos valores distintos para cada programa estatístico utilizando. Posteriormente foi realizada uma análise descritiva dos dados, obtendo os valores do número total de bandas (NTB), número de bandas polimórficas (NBP), porcentagem de bandas polimórficas (PBP) por marcador e a faixa de variação de tamanho dos lócus amplificados (TPB), em pares de bases. A partir da matriz de dados foram realizadas análises estatísticas tanto em nível intrapopulacional quanto interpopulacional. Utilizando o software Popgene (Population Genetic Analysis) versão 1.31 (YEH et al., 1999) foram calculados o índice de Shannon (I) (LEWONTIN, 1972), índices de NEI (H´) (1973), índice de Diferenciação
Genética (GST) e o Fluxo gênico (Nm). O Índice de dissimilaridade de Jaccard entre indivíduos e a Correlação cofenética (ccc) foram calculados utilizando o programa GENES (CRUZ, 2013). Foi utilizado ainda o programa Structure 2.3.4 (PRITCHARD et al., 2000) para calcular a variação genética e o programa Arlequin 3.1 (EXCOFFIER et al., 1992) para o cálculo da análise de variância molecular (AMOVA) com três níveis hierárquicos e o valor de ɸST. Para a análise de Variância Molecular (AMOVA) as seis áreas foram separadas em dois grupos considerando a possibilidade ou não do Rio Doce atuar como barreira para a diversidade genética da espécie. Assim, as áreas PEI, GUR, RNV e LIN formaram o grupo 1 (G1) e as áreas REG e RBC formaram o grupo 2 (G2). Esta separação dos grupos levou em consideração a localização geográfica das áreas. A AMOVA foi realizada a fim de analisar a partição da diversidade genética através do grau de diferenciação entre indivíduos dentro das populações, entre as populações dentro dos grupos e entre os dois grupos de populações. A significância do índice de diferenciação ɸST foi testada com 1.000 permutações. O complemento do coeficiente de Jaccard entre pares de genótipos foi calculado para cada população estudada e entre todos os indivíduos, com intuito de estimar os coeficientes de dissimilaridade entre os genótipos. Estes valores foram utilizados na análise de agrupamento, por meio do método de agrupamento de médias aritméticas não ponderadas UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average) para obtenção dos dendrogramas. 29
O coeficiente de correlação cofenética (ccc) foi calculado para verificar a consistência dos agrupamentos realizados pelo método UPGMA. Os dados genotípicos das seis populações de A. blanchetiana também foram utilizados para produzir uma matriz de distância genética entre as populações a partir do estimador da diferenciação genética entre grupos GST de Nei (1973) e para calcular o fluxo gênico (Nm) de maneira indireta. Uma análise com abordagem Bayesiana foi realizada para estimar o número mais provável de grupos geneticamente distintos (K) pelo programa Structure 2.3.4
(PRITCHARD et al., 2000). 30
4 RESULTADOS
Dos 28 marcadores ISSR testados, 11 foram selecionados a partir do número de polimorfismo e nitidez de bandas (Tabela 2; Figura 3), possibilitando a obtenção de 155 fragmentos amplificados, dos quais 102 foram polimórficos (65,8%). Todos os marcadores apresentaram polimorfismo acima de 50% (média de 64,9%); e o número de bandas polimórficas variou de 7 a 17 bandas, com média de 9 bandas polimórficas por marcador e o tamanho dos fragmentos variou entre 2080 a 400 pares de bases.
Tabela 2 – Marcadores ISSR selecionados para A. blanchetiana incluindo a descrição do número total de bandas amplificadas (NTB), número total de bandas polimórficas (NTBP), porcentagem de bandas polimórficas (PBP) e tamanho (PM - máximo e mínimo) dos fragmentos amplificados.
NTB NTBP PBP PM (máx-min) Marcadores UBC 810 14 9 64,28% 2080-500 UBC 814 15 10 66,66% 2080-500 UBC 815 11 7 63,63% 2080-600 UBC 834 15 10 66,66% 2080-600 UBC 836 20 17 85,00% 2080-400 UBC 840 15 8 53,33% 2080-500 UBC 855 14 12 85,71% 2080-600 UBC 856 11 7 63,63% 2080-700 UBC 861 11 6 54,54% 2080-500 UBC 864 13 8 61,53% 2080-600 UBC 891 16 8 50,00% 2080-600 Total 155 102 64.99% - 31
Figura 3 - Perfil eletroforético produzido pelo marcador UBC 840 em 30 indivíduos de A. blanchetina – Marcador de peso molecular (Ladder 100pb). * Indivíduos V-1 ao V-25 referem-se aos indivíduos da Reserva Natural Vale e os indivíduos EV-1 ao EV-5 referem-se aos indivíduos da área de Linhares. 32
A dissimilaridade obtida por meio do complemento do coeficiente de Jaccard para todos os 148 indivíduos variou de 0,13 (entre os genótipos 13 e 14 da população PEI) a 1,0 (entre os genótipos 115 da população REG e 137 da população da RBC), com média de 0,379. O teste de correlação cofenética (ccc) apresentou concordância entre os valores de dissimilaridade genética com valor de 62%. A partir dos 148 indivíduos amostrados foram formados 19 grupos distintos (Figura 4), onde o maior grupo (3) é composto por 25 indivíduos de duas áreas de coletas, GUR com 23 indivíduos e REG com 2 indivíduos. Este dendrograma também mostra cinco pequenos agrupamentos compostos por dois indivíduos: Grupo 10 (137/138 - RBC), Grupo 13 (147/148 - RBC), Grupo 15 (72/73 - RNV), Grupo 17 (119/120 - REG), Grupo 18 (7- PEI /73- RNV) e o agrupamento 11 composto por um indivíduo (24 do PEI). Uma discriminação mais detalhada de cada agrupamento pode ser visualizada no apêndice G. Também foi estimada a dissimilaridade genética entre indivíduos para cada população, possibilitando identificar os genótipos geneticamente mais próximos e mais distintos dentro de cada área de estudo (Tabela 3). As populações PEI e GUR apresentaram 3 agrupamentos, as populações RNV e LIN apresentaram 3 agrupamentos genéticos cada, a população REG apresentou 4 grupos genéticos e a população RBC apresentou 5 agrupamentos cada, como pode ser visto nos dendrograma da Figura 5. A discriminação de cada agrupamento por população pode ser visualizada no apêndice G. Em cinco populações os indivíduos que apresentaram menores valores de dissimilaridade foram indivíduos coletados sequencialmente de coletas, geograficamente mais próximos. 33
Figura 4 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética entre os 148 indivíduos de A. blanchetiana, formando 19 grupos em toda a amostragem populacional. 34
Tabela 3 - Valores do complemento do Índice de Jaccard e da Correção cofenética das seis populações de A. blanchetiana analisados em áreas de restingas no norte do Espírito Santo.
Populações Jaccard (Min – Max) Correlação Cofenética PEI (0,13) 13-14 / (0,75) 7-4 77% GUR (0,18) 22-23 / (0,64) 1-4 71% RNV (0,28) 2-3 / (0,80) 22-25 75% LIN (0,23) 12-13 / (0,78) 15-16 75% REG (0,18) 17-18 / (0,83) 1-11 76% RBC (0,21) 11-12 / (0,75) 15-25 71%
* PEI: Parque Estadual de Itaúnas; GUR: Guriri; RNV = Reserva Natural Vale; LIN: Linhares; REG: Regência; RBC: Reserva Biológica de Comboios; Jaccard (Min – Máx) = Valores mínimos e máximos de dissimilaridade para cada população e seus respectivos indivíduos. 35
Figura 5 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética das 6 populações de A. blanchetiana. A- Parque Estadual de Itaúnas; B- Guriri; C- Reserva Natural Vale; D- Linhares; E- Regência e F- Reserva Biológica de Comboios. (Continua). 36
Figura 5 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética das 6 populações de A. blanchetiana. A- Parque Estadual de Itaúnas; B- Guriri; C- Reserva Natural Vale; D- Linhares; E- Regência e F- Reserva Biológica de Comboios. (Continua).
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Figura 5 - Dendrograma representativo da dissimilaridade genética das 6 populações de A. blanchetiana. A- Parque Estadual de Itaúnas; B- Guriri; C- Reserva Natural Vale; D- Linhares; E- Regência e F- Reserva Biológica de Comboios. (Conclusão).
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Analisando a diversidade genética entre todos os 148 indivíduos amostrados, o índice de Nei (H’) e o índice de Shannon (I) apresentaram os valores de 0,4028 e 0,5801 respectivamente. Para cada população amostrada, os valores de H’ e I foram, respectivamente: 0,3000 e 0,4452 para PEI; 0,2795 e 0,4140 para GUR; 0,3370 e 0,4948 para RNV; 0,3389 e 0,5020 para LIN; 0,3339 e 0,4849 para REG e 0,3299 e 0,4870 para RBC. A AMOVA indicou a existência de uma diversidade mais alta dentro das populações (79,1%) em relação aos valores entre os grupos (1,18%) e entre as populações dentro dos grupos (19,6%) (Tabela 4). O valor calculado de ɸST de 0,2081.
Tabela 4 - Valores de diferenciação genética (AMOVA) entre os grupos G1 e G2, entre as populações dentro dos grupos e dentro das seis populações de A. blanchetiana.
Fonte de Componentes Porcentagem Fonte de Variação quadrados de variância de variação
Entre os grupos 130,364 0,25388 1,18008 (G1 e G2) Entre as populações 460,894 4,22490 19,63821 dentro dos grupos Dentro das 2270,680 17,03488 79,18171 populações Total 2861,938 21,51366 - *G1= composto pelas áreas Parque Estadual de Itaúnas, Guriri, Reserva Natural Vale e Linhares e o G2 composto pelas áreas Regência e Reserva Biológica de Comboios.
A matriz gerada a partir do estimador da diferenciação genética entre os grupos
(GST) que apresentou valor de 0.2063 foi usada na produção de um dendograma de todas as populações para demonstrar a relação genética existente entre elas (Figura 6). As áreas mais próximas geneticamente foram REG e a RBC. A população mais distinta de todas foi a de GUR, em São Mateus. A análise de fluxo gênico entre as populações indicou valor de Nm= 1,9242. 39
Figura 6 - Análise de agrupamento (UPGMA) estimada com base no índice de diferenciação genética entre os grupos (GST), Nei (1973), nas seis populações de A. blanchetiana no estado do Espírito Santo. Parque Estadual de Itaúnas (PEI); Guriri (GUR); Reserva Natural Vale (RNV); Linhares (LIN); Regência (REG) e Reserva Biológica de Comboios (RBC). 40
A partição da variação genética das populações verificada pela abordagem Bayesiana indicou k=4 (Figura 7), mostrando uma indicando convergência para 4 grupos bayesianos (Figura 8). As populações de REG (5) e da RBC (6) apresentaram uma estruturação genética semelhante. Um mesmo padrão de similaridade genética também pode ser observado nas populações de RNV (3) e de LIN (4). A população do PEI (1) apresentou maior semelhança entre as populações de REG e da RBC do que com as outras, e a população de GUR (2) apresentou maior distinção, podendo ser observado pouco compartilhamento genético com as demais populações.
Figura 7 - Gráfico obtido a partir da análise Bayesiana realizado nas seis populações de A. blanchetiana indicando o valor de ΔK com maior significância (K= 4). 41
Figura 8 - Inferência bayesiana das populações de A. blanchetiana usando o software STRUCTURE quando K = 4. A- Os números na horizontal correspondem aos 148 indivíduos amostrados e os números entre parênteses as respectivas populações. B- Os números na horizontal correspondem as 6 populações amostradas, 1- (PEI) Parque Estadual de Itaúnas; 2- (GUR) Guriri; 3- (RNV) Reserva Natural Vale; 4- (LIN) Linhares; 5- (REG) Regência e 6- (RBC) Reserva Biológica de Comboios. 42
5 DISCUSSÃO
5.1 Amplificação de Marcadores Moleculares Os 11 marcadores ISSR selecionados para este estudo produziram um total de 155 bandas, das quais 65,8% foram polimórficas em nível de espécie. Desta forma, o uso deste tipo de marcador foi considerado eficiente como estimador de diversidade genética, sendo o número de marcadores selecionados suficiente para realizar análises intra e interpopulacional em A. blanchetiana em áreas naturais. Vários trabalhos da literatura foram realizados utilizando marcadores ISSR para caracterização de populações vegetais. Zhang et al. (2012) utilizaram 12 marcadores ISSR que geraram 342 bandas, sendo 287 (83,92%) polimórficas, apresentando média de 23 bandas polimórficas; este alto valor se deve ao fato do estudo ser realizado com diversas espécies da família Bromeliaceae. Almeida et al. (2012) em um estudo com Aechmea fulgens Brongn utilizaram oito marcadores ISSR que geraram 93 bandas das quais 84 (90,3%) polimórficas, apresentando média de 10 bandas polimórficas. Rossi et al. (2014) em um estudo em 3 populações naturais de Mauritia flexuosa L. f. selecionaram nove marcadores ISSR que produziram 97 bandas, das quais 76 (78,3%) polimórficas, com média de 8,4 bandas polimórficas. Lorenzoni et al. (2014) trabalhando com biribazeiro (Rollinia mucosa Baill) utilizaram 13 marcadores e obtiveram 118 bandas das quais 96 (81,3%) polimórficas, obtendo média de 9 bandas polimórficas. No trabalho de Lima et al. (2015), em um estudo com Malpighia emarginata D.C utilizando 20 marcadores obtiveram um total de 186 bandas, com 148 (79,57%) bandas polimórficas e média de 7,4 bandas polimórficas. Costa et al. (2015) em uma população natural de Hancornia speciosa Gomes utilizaram 6 marcadores que apresentaram 63 bandas, das quais 30 (47,62%) apresentaram polimorfismo, com média de 5 bandas polimórficas e Souza-Sobreira et al. (2015) com a espécie Pitcairnia flammea (L.) John selecionaram 18 marcadores que geraram 180 bandas das quais 159 (88%) foram polimórficas e média de 8,8 bandas polimórficas. De acordo com Murawski e Hamrick (1990), a proporção de polimorfismo para a maioria das monocotiledôneas é em torno de 40,3%, desta forma, o percentual de bandas polimórficas encontradas com os 11 marcadores ISSR usados para a espécie A. blanchetiana foi acima do esperado. 43
5.2 Diversidade genética intrapopulacional e interpopulacional O menor valor de dissimilaridade genética (0,13) dentro das populações de A. blanchetiana foi indicado entre indivíduos da população PEI (13 e 14) e o maior valor (1,0) entre dois indivíduos (115 e 137) de diferentes áreas, porém relativamente próximas, indicando serem indivíduos totalmente distintos geneticamente. O indivíduo 115 está presente em REG, área de restinga que vem sofrendo forte interferência antrópica, com alterações no habitat devido a construções de domicílios e delimitações de áreas; o indivíduo 135 está georreferenciado dentro da RBC em uma área de conservação, em uma trilha pouco explorada tanto por visitantes como por pesquisadores. Na análise de agrupamento (UPGMA), dos 19 agrupamentos gerados, seis se destacaram pela baixa quantidade de indivíduos (2 indivíduos em 5 agrupamentos e 1 indivíduo que não se agrupou a outros). A formação de grupos isolados indica que estes indivíduos são mais divergentes em relação aos outros grupos (VIEIRA et al., 2008). O maior agrupamento (25 indivíduos) apresentou 23 indivíduos de uma mesma população (GUR), indicando a similaridade entre os indivíduos desta área. Os valores de dissimilaridade genética estimados para cada população indicaram que dentro da área PEI foi encontrada a menor dissimilaridade, observada entre os indivíduos 13 e 14, caracterizando como mais semelhantes geneticamente. Mesmo com a padronização da distância mínima de 5 metros para coleta dos indivíduos, pode ter ocorrido coletas de amostras de indivíduos clones ou indivíduos com alta similaridade genetica. Diferentemente, na área de REG foram encontrados os indivíduos com maior dissimilaridade genética (1 e 11), sendo esta a área que apresentou o maior valor de dissimilaridade entre os indivíduos (0,83). Nas análises genéticas intrapopulacionais foram observados indivíduos que apresentaram tanto uma baixa quanto uma alta variabilidade genética. A PEI apresentou a menor variabilidade genética entre indivíduos 13 e 14 (0,13) como também uma alta variabilidade genética entre os indivíduos 4 e 7 (0,75). A espécie A. blanchetiana apresenta tanto a reprodução assexuada via estolão como a reprodução sexuada com sistemas mistos de reprodução, sendo a autopolinização e a polinização cruzada realizada por polinizadores (RIBEIRO, 2014). A alta similaridade entre os indivíduos da espécie pode ser explicada pelo tipo de reprodução assexuada e auto-fecundação. Matallana et al. (2010) citam que é comum 44 espécies de bromélias apresentarem a autocompatilidade como sistema de reprodução, mesmo essa podendo levar à perda de diversidade genética e consequentemente, reduzir o potencial adaptativo das espécies quando enfrentam condições adversas. Esta estratégia é favorecida em algumas bromélias pela seleção natural, em certas condições ecológicas. Em contrapartida a reprodução cruzada da espécie pode estar favorecendo introdução de novos alelos por fluxo gênico promovendo a variabilidade genética dentro das populações (VOGLER; KALISZ, 2001). No entanto, mesmo que a autopolinização seja uma das explicações para a baixa similaridade genética, esta, junto com a reprodução clonal (MURAWSKI; HAMRICK 1990; HMELJEVSKY 2007) e o isolamento geográfico podem favorecer a diferenciação entre as populações. Sebbenn e Seoane (2005) citam que o tipo de sistema reprodutivo de um indivíduo é essencial para a recombinação da variabilidade genética e manutenção desta no habitat. Desta forma, se torna essencial dados de sistemas reprodutivos de espécies para o entendimento de padrões de diversidade genética ao longo da distribuição dos indivíduos (MARTINS, 1987). Com base nos valores do índice de Shannon (I = 0,5801) e de Nei (H’ = 0,4028) apresentados para todos os indivíduos, existe uma moderada diversidade genética para A. blancheteana no norte do estado do Espírito Santo. Ao analisar cada uma das seis áreas amostradas, os valores de I são equivalentes a outros estudos com espécies da família Bromeliaceae utilizando marcadores ISSR. Os valores de I para A. blanchetiana variam entre 0,41 na população de GUR a 0,50 na população de LIN. Almeida et al. (2012) avaliaram a espécie A. fulgens e encontraram valores de I variam entre 0,51 a 0,56. Ribeiro et al. (2013), trabalhando com a espécie Vriesea cacuminis L.B.Sm apresentaram valores de I entre 0,29 a 0,31; Souza-Sobreira et al. (2015) com a espécie P. flammea apresentaram valores de I que variaram entre 0,34 a 0,46. A maior e a menor diversidade intrapopulacional foram encontradas em LIN e GUR, respectivamente, que são áreas externas as UC's. Embora as áreas protegidas sejam as principais áreas com estratégias para a conservação de recursos genéticos (KATI et al., 2004), normalmente elas não são capazes de proteger todas as espécies e habitats. As áreas escolhidas para se tornarem UC's muitas vezes estão localizadas em áreas com menor biodiversidade do que áreas externas as UC's (TERBORGH; VAN SCHAIK, 2002). Deve ser levado em consideração que conservar uma espécie 45 em um ou poucos locais da sua ocorrência geográfica, como nas UC's, não significa a conservação total da sua variabilidade genética (MINISTÉRIO DO MEIO AMBIENTE, 2017), podendo este ser o caso para a espécie A. blanchetiana. Os resultados da AMOVA sugerem que a maior diversidade genética (79,1%) a ser explorada está dentro das populações. A baixa diferenciação genética encontrada entre os grupos (1,18%) indica uma baixa estruturação genética e um alto fluxo gênico, demonstrando que as áreas PEI, GUR, RNV e LIN (pertencentes ao G1) e as áreas REG e RBC (pertencentes ao G2) são geneticamente muito similares. Como apresentado, o maior percentual de diversidade genética (79,1%) foi encontrado entre indivíduos dentro das populações e não entre os grupos, refutando assim a hipótese do rio Doce como barreira biogeográfica que impede as trocas alélicas e diferenciando as populações de A. blanchetiana separadas geograficamente por este rio. Menicucci (2007) em um trabalho com a espécie Pseudobombax munguba (Mart. & Zucc.) Dugand (Malvaceae) realizado em 34 áreas, também refuta hipótese do rio Doce como barreira geográfica e genética entre populações desta espécie. Giaretta, Menezes e Pereira (2013) sugerem que no norte do Espírito Santo a diferenciação florística entre áreas não depende do Rio Doce como barreira geográfica e sim de condições especificas do habitat, o que pode ser refletido também na diversidade genética das populações de plantas. Wright (1978) cita que a diferenciação genética entre populações é considerada alta quando FST assume valores entre 0,151 a 0,250. Desta forma mesmo os valores da AMOVA indicarem uma baixa diferenciação genética entre os grupos 1 e 2 de A. blanchetiana, refutando a hipótese do Rio como barreira genética, o valor de GST (0,2063) gerado sem a separação de grupos, indica que as populações apresentam uma alta diferenciação genética, podendo a deriva genética ocasionar a perda de diversidade genética pela perda e fixação de alelos.
A análise de diferenciação genética (GST) indicou que a população que mais se diferenciou das demais (GUR) é considerada a área mais fragmentada a partir de observações do autor. Young e Boyle (2000) citam que a ocorrência da modificação de um habitat gerado pela fragmentação leva ao isolamento espacial de populações em uma região, podendo acarretar a perda da variabilidade genética (MENGES, 1991a; YOUNG; BOYLE; BROWN, 1996; NASON et al., 1997) e até a limitação evolutiva da espécie (SOUZA; KAGEYAMA; SEBBENN, 2004). Butchart et al. (2010) 46 citam que cerca de 80% dos fragmentos remanescentes de Floresta Atlântica tem áreas menores de 0,5 km2, sendo a fragmentação uma das principais causas da perda da diversidade e redução de recursos genéticos. O valor de Nm (1,9242) pode confirmar a existência de um alto fluxo gênico entre as áreas de estudo. Este resultado corrobora com os autores Wright (1931), Slatkin (1981; 1985) e Govindaraju (1989) que citam que valores acima de 1 indicam à existência de fluxo gênico com compartilhamento alélico. Este valor de Nm para A. blanchetiana parece baixo quando comparado a outros estudos. Kaique (2015) em um trabalho com Eriotheca macrophylla (K. Schum.) A. Robyns apresentou valor de fluxo gênico de 4,06 e Rossi et al. (2014) trabalhando com a espécie M. flexuosa apresentaram valor de Nm= 3,02. Os valores altos de fluxo gênico levam em consideração a fragmentação dos habitats, indicando que a identidade observada entre as populações pode ser de períodos onde as áreas não eram fragmentadas e sim continuas, provavelmente com maior número de indivíduos e manutenção do fluxo gênico. Rossi et al. (2014) citam ainda que o tempo de fragmentação pode explicar os valores de fluxo gênico. As áreas do presente estudo vêm sofrendo fortes pressões antrópicas como a fragmentação desde meados do século XX (THOMAZI., et al 2013), podendo ser uma explicação para o valor de fluxo gênico mais baixo em A. blanchetiana. Porém, ao se comparar com estudos com outras bromélias, o valor gerado no presente trabalho é considerado alto. Hmeliewsky (2007) em um trabalho com Dyckia ibiramensis apresentou valor de Nm= 0,80; Murawski e Hamrick (1990) em um trabalho com Aechmea magdalenae apresentaram o valor de Nm= 0,45; Rogalski (2007) trabalhando com Dyckia brevifolia apresentou valor de Nm= 0,41; Sarthou et al. (2001) em estudo com Pitcairnia geyskesii apresentaram valor de Nm= 0,52; Cavallari et al. (2006) apresentaram valor de Nm= 1,47 para Encholirium subsecundum e Sgorbati et al. (2004) apresentaram o valor de Nm= 0,010 para Puya raimondii. Almeida et al. (2012) em um trabalho utilizando ISSR para analisar a diversidade genética de A. fulgens em três áreas de estudos apresentaram o valor de Nm= 2,5, sendo considerado um elevado valor, o que sugere que a fragmentação teve baixo impacto na diversidade genética da espécie, indicando a existência de fluxo gênico entre as áreas de estudo. No entanto, deve-se levar em consideração que o fluxo gênico avaliado é histórico e mesmo que as bromélias sejam polinizadas por 47 espécies com grande faixa de vôo como aves e morcegos, a maioria dessas apresenta propagação clonal (GALEUCHET; PERRET; FISCHER, 2005), indicando que ao longo dos anos a fragmentação pode reduzir o fluxo gênico existente. Pela análise bayesiana, mesmo com a formação de 4 grupos genéticos estes não são totalmente distintos, ocorrendo compartilhamento genético entre todos os grupos. As áreas de GUR e LIN apresentaram maior distinção genética, com pouco compartilhamento genético. Estas áreas são consideradas pequenas faixas de vegetação que segundo Thomazi et al. (2013) vem sofrendo fortes pressões antrópicas desde meados do século XX. A literatura mostra que processos de fragmentação de populações naturais podem levar ao seu isolamentos, diminuindo o fluxo gênico, podendo ocasionar a perda da diversidade genética e tornando populações mais distintas geneticamente de outras (YOUNG; BOYLE; BROWN, 1996).
5.3 Unidades de Conservação Como citado por Nogueira-Neto (1997), as UC’s são áreas criadas com intuito de preservação de remanescentes florestais, manutenção da diversidade biológica e de recursos genéticos de indivíduos e de populações das espécies existentes nas determinadas áreas. A partir desta definição, as áreas de conservação PEI, RNV e RBC estudadas no norte do estado do Espírito Santo estão cumprindo e mantendo seu papel de conservação de recursos genéticos in situ de indivíduos de A. blanchetiana, uma vez que apresentaram valores moderados de diversidade genética para as populações estudadas.
Coates e Atkins (2001) citam que estudos de diversidade genética de populações podem oferecer informações para subsidiar estratégias de manejo para recursos genéticos in situ e ex situ para espécies, definindo áreas prioritárias para exploração sustentável, pesquisa e conservação. Desta forma, o presente estudo por ser realizado em áreas dentro e fora das UC’s, pode auxiliar no levantamento e determinação de áreas prioritárias, criação de novas UC’s e formações de planos de manejo.
48
6 CONCLUSÃO
Com base nos resultados apresentados, pode-se concluir que: Os marcadores ISSR se mostraram eficientes para estudos de diversidade genética em A. blanchetiana; Com base nos valores dos índices de Shannon e de Nei apresentados, existe uma alta diversidade genética para a espécie A. blanchetiana no norte do estado do Espírito Santo; As áreas com maior e menor diversidade genética são, respectivamente, Linhares e Guriri, ambas externas à UC’s; As áreas incluídas em UC’s apresentaram moderados valores de diversidade genética, indicando que estas unidades mantêm a função de conservação de recursos genéticos in situ; A diferenciação genética entre os grupos de populações separadas pelo Rio Doce foi baixa, refutando a hipótese do Rio Doce como barreira genética para espécie A. blanchetiana;
Os elevados valores de ɸST e GST indicam que as populações estudadas apresentam uma forte estruturação e diferenciação genética entre si; A análise bayesiana para as seis populações estudadas indicam a formação de 4 grupos genéticos com diferenciação genética, porém com fluxo gênico entre elas. 49
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APÊNDICE A - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados no Parque Estadual de Itaúnas e suas respectivas coordenadas geográficas e pontos de coleta.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 S 18° 23.870' W 039° 41.664' Na parcela 1 - borda 2 S 18° 23.874' W 039° 41.659' Na parcela 2 - borda 3 S 18° 23.880' W 039° 41.663' Na parcela 3 - borda 4 S 18° 23.886' W 039° 41.662 Na parcela 4 - borda 5 S 18° 23.893' W 039° 41.667 Na parcela 5 - fundo 6 S 18° 23.896' W 039° 41.667 Na parcela 6 - borda 7 S 18° 23.899' W 039° 41.666 Na parcela 7 - borda 8 S 18° 23.912' W 039° 41.656 Na parcela 8 - fundo 9 S 18° 23.913' W 039° 41.675 Na parcela 9 -borda 10 S 18° 23.916' W 039° 41.672 Na parcela 10 - borda 11 S 18° 23.925' W 039° 41.678 Na parcela 11 - borda 12 S 18° 23.927' W 039° 41.676 Na parcela 12 - borda 13 S 18° 23.933' W 039° 41.680 Na parcela 13 - fundo 14 S 18° 23.940' W 039° 41.683 Na parcela 14 - fundo 15 S 18° 23.950' W 039° 41.689 Próx. Parcela 16 (lado oposto) 16 S 18° 23.959' W 039° 41.687 Próx. Parcela 18 - borda 17 S 18° 23.966' W 039° 41.684 Próx. Parcela 20 - borda 18 S 18° 23.975' W 039° 41.693 Borda 19 S 18° 23.991' W 039° 41.694 Fundo 20 S 18° 24.004' W 039° 41.702 Borda 21 S 18° 24.006' W 039° 41.698 Próximo a borda 22 S 18° 24.012' W 039° 41.703 Borda 23 S 18° 24.018' W 039° 41.708 Próximo a borda
59
APÊNDICE B - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados na área Guriri e suas respectivas coordenadas geográficas e pontos de coleta.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 S 18° 43.333' W 039° 44.582' Entrada da trilha 2 S 18° 43.336' W 039° 44.588' Atrás do projeto 3 S 18° 43.339' W 039° 44.584' Atrás do projeto 4 S 18° 43.347' W 039° 44.588' Atrás do projeto 5 S 18° 43.352' W 039° 44.592' Atrás do projeto 6 S 18° 43.358' W 039° 44.596' Atrás do projeto 7 S 18° 43.375' W 039° 44.593' Atrás do projeto 8 S 18° 43.391' W 039° 44.602' Atrás do projeto 9 S 18° 43.403' W 039° 44.590' Saída da trilha 10 S 18° 43.408' W 039° 44.588' Touceira aberta 11 S 18° 43.416' W 039° 44.587' Touceira aberta 12 S 18° 43.428' W 039° 44.590' Touceira aberta 13 S 18° 43.434' W 039° 44.579' Touceira aberta 14 S 18° 43.472' W 039° 44.592' Touceira aberta 15 S 18° 43.451' W 039° 44.548' - 16 S 18° 43.410' W 039° 44.632' - 17 S 18° 43.510' W 039° 44.648' - 18 S 18° 43.551' W 039° 44.658' - 19 S 18° 44.008' W 039° 44.715' - 20 S 18° 44.162' W 039° 44.240' - 21 S 18° 44.110' W 039° 44.730' Touceira aberta 22 S 18° 44.119' W 039° 44.782' Touceira aberta 23 S 18° 44.128' W 039° 44.790' Touceira aberta 24 S 18° 44.151' W 039° 44.785' Touceira aberta 25 S 18° 44.203' W 039° 44.801' Touceira aberta
60
APÊNDICE C - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados na Reserva Natural Vale e suas respectivas coordenadas geográficas e pontos de coleta.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 519°07.086 / W039°52.978 Final da trilha 2 519°07.155' / W039°52.982' Final da trilha 3 519°07.278" / W039°53.013' Final da trilha 4 S19°07.661' / W039°53.108' Final da trilha 5 S19°07.745 ' / W039°53.131' Final da trilha 6 S19°07. 810' / W039°53.148' Final da trilha 7 S19°07.851' / W039°53.158' Final da trilha 8 S19°07.908' / W039°53.173' Final da trilha 9 S19°07.946' / W039°53.183 Final da trilha 10 S19°08.007' / W039°53.215' Primeira parcela 11 S19°08.162' / W039° 53.236' Primeira parcela 12 S19°09.119' / W039° 55.782' Segunda parcela 13 S19°09.123' / W039° 55.766' Segunda parcela 14 S19°09.121' / W039° 55.770' Segunda parcela 15 S19°09.141' / W039° 55.790' Segunda parcela 16 S19°09.144' / W039° 55.790' Segunda parcela 17 S19°09.154' / W039° 55.800' Terceira parcela 18 S19°09.165' / W039° 55.808' Terceira parcela 19 S19°09.181' / W039° 55.816' Terceira parcela 20 S19°09.197' / W039° 55.823' Quarta parcela 21 S19°09.250' / W039° 55.854' Quinta parcela 22 S19°09.248' / W039° 55.876' Sexta parcela 23 S19°09.299' / W039° 55.873' Sétima parcela 24 S19°09.103' / W040° 04.239' Sétima parcela 25 S19°09.075' / W040° 04.226' Sétima parcela
61
APÊNDICE D - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados na área de Linhares e suas respectivas coordenadas geográficas.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 S 19° 28.263' W 039° 47.112' - 2 S 19° 28.267' W 039° 47.132 - 3 S 19° 28.270' W 039° 47.185' - 4 S 19° 28.275' W 039° 47.225' - 5 S 19° 28.457' W 039° 47.230' - 6 S 19° 28.460' W 039° 47.135' - 7 S 19° 28.465' W 039° 47.142' - 8 S 19° 28.468' W 039° 47.152' - 9 S 19° 28.447' W 039° 47.157' - 10 S 19° 28.480' W 039° 47.181' - 11 S 19° 28.474' W 039° 47.183' - 12 S 19° 28.489' W 039° 47.190' - 13 S 19° 28.580' W 039° 47.285' - 14 S 19° 28.566' W 039° 47.284' - 15 S 19° 28.569' W 039° 47.307' - 16 S 19° 28.577' W 039° 47.348' - 17 S 19° 28.584' W 039° 47.352' - 18 S 19° 28.654' W 039° 47.364' - 19 S 19° 28.646' W 039° 47.363' - 20 S 19° 28.632' W 039° 47.367' - 21 S 19° 28.647' W 039° 47.478' - 22 S 19° 28.642' W 039° 47.499' - 23 S 19° 28.661' W 039° 47.401' - 24 S 19° 28.686' W 039° 47.403' - 25 S 19° 28.698' W 039° 47.428' - 62
APÊNDICE E - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados na área de Regência e suas respectivas coordenadas geográficas.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 S 19° 39.000 W 039° 50.008 - 2 S 19° 39.002 W 039° 50.056 - 3 S 19° 39.004 W 039° 50.091 - 4 S 19° 39.004' W 039° 50.085' - 5 S 19° 39.004' W 039° 50.106' - 6 S 19° 39.005' W 039° 50.127' - 7 S 19° 39.006' W 039° 50.133' - 8 S 19° 38.871' W 039° 50.218' - 9 S 19° 38.877' W 039° 50.227' - 10 S 19° 38.880' W 039° 50.221' - 11 S 19° 38.874' W 039° 50.183' - 12 S 19° 38.879' W 039° 50.180' - 13 S 19° 38.880' W 039° 50.185' - 14 S 19° 38.866' W 039° 50.184' - 15 S 19° 38.859' W 039° 50.171' - 16 S 19° 38.857' W 039° 50.148' - 17 S 19° 38.854' W 039° 50.152' - 18 S 19° 38.854' W 039° 50.144' - 19 S 19° 38.846' W 039° 50.143' - 20 S 19° 38.832' W 039° 50.137' - 21 S 19° 38.847' W 039° 50.135' - 22 S 19° 38.842' W 039° 50.132' - 23 S 19° 38.861' W 039° 50.135' - 24 S 19° 38.886' W 039° 50.135' - 25 S 19° 38.898' W 039° 50.138' -
63
APÊNDICE F - Número de indivíduos de A. blanchetiana amostrados na Reserva Biológica de Comboios e suas respectivas coordenadas geográficas.
Nº indivíduo Coordenada (GPS) Observação 1 S 19°40.098' W 039°53.209' - 2 S 19°40.105' W 039°53.242' - 3 S 19°40.169' W 039°53.267' - 4 S 19°40.169' W 039°53.259' - 5 S 19°40.168' W 039°53.286' - 6 S 19°40.162' W 039°53.312' - 7 S 19°40.190' W 039°53.263' - 8 S 19°40.169' W 039°53.299' - 9 S 19°40.159' W 039°53.321' - 10 S 19°40.195' W 039°53.351' - 11 S 19°40.200' W 039°53.357' - 12 S 19°40.181' W 039°53.366' - 13 S 19°40.227' W 039°53.453' - 14 S 19°40.227' W 039°53.446' - 15 S 19°40.287' W 039°53.508' - 16 S 19°40.291' W 039°53.540' - 17 S 19°40.304' W 039°53.573' - 18 S 19°40.302' W 039°53.577' - 19 S 19°40.308' W 039°53.586' - 20 S 19°40.357' W 039°53.629' - 21 S 19°40.343' W 039°53.654' - 22 S 19°40.355' W 039°53.661' - 23 S 19°40.382' W 039°53.709' - 24 S 19°40.399' W 039°53.715' - 25 S 19°40.400' W 039°53.748' -
64
APÊNDICE G - Discriminação dos agrupamentos para todos os 148 indivíduos e para cada população de A. blanchetiana obtidos pelo complemento do coeficiente de dissimilaridade de Jaccard e pelo método de UPGMA.
Tabela 1 – Agrupamentos dos 148 indivíduos de A. blanchetiana.
Agrupamentos Indivíduos
Grupo 1 13, 14 12, 11, 16, 17, 4, 2, 3, 1, 15, 18, 19, 21, 22, 23 e 20 – P
Grupo 2 121, 123, 122, 115, 116, 114 e 113 – R
39-G, 40-G, 35-G, 117-R, 118-R, 26-G, 28-G,27-G,42-G,43-G,29-G, 30-G, 31-G, 32- Grupo 3 G, 36-G, 41-G, 45-G, 46-G, 47-G, 48-G, 44-G, 37-G, 38-G, 33-G e 34-G
Grupo 4 25-P, 87-L e 83-L
Grupo 5 139, 144, 141, 145, 1146 E 140 – C
134-C, 135-C, 136-C, 100-L, 101-R, 102-R, 103-R, 104-R, 111-R, 112-R, 110-R, 105- Grupo 6 R, 107-R, 106-R,108-R e 109-R
Grupo 7 69, 71, 63, 64, 57, 58, 66, 67, 65, 68 e 70 – V
Grupo 8 76-L, 77-L, 74-V, 75-V e 78-L
Grupo 9 94, 95, 96, 79, 80, 85, 86, 84, 81, 82, 88, 91, 92, 93, 97, 98, 89 e 90 – L
Grupo 10 137 e 138 – C
Grupo 11 24 – P
Grupo 12 142-C, 143-C e 99-L
Grupo 13 147 e 148 – C
Grupo 14 132-C, 133-C, 130-C, 131-C, 126-C, 129-C, 127-C, 128-C, 124-R e 125-R
Grupo 15 72 e 73 – V
Grupo 16 49-G, 53-V, 54-V, 55-V, 56-V, 50-G, 51-V, 52-V, 60-V, 61-V e 59-V
Grupo 17 119 e 120 – R
Grupo 18 7-P e 62-V
Grupo 19 8, 9, 5, 6 e 10 – P *Significado das letras. P- Parque Estadual de Itaúnas; G- Guriri; R- Reserva Natural Vale; L- Linhares; R- Regência e C- Reserva Biológica de Comboios.
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Tabela 2 - Agrupamentos dos indivíduos amostrados no Parque Estadual de Itaúnas.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 13, 14, 12, 11, 16, 17, 4, 2, 3 e 1 Grupo 2 15, 18, 19, 21, 22, 23 e 20 Grupo 3 8, 9, 5, 6 e 7 Grupo 4 19
Tabela 3 - Agrupamentos dos indivíduos amostrados em Guriri.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 22, 23, 24, 25, 21, 13, 18, 14, 15, 10, 11, 6, 7, 8, 9, 19, 20 Grupo 2 33, 5, 4, 2 Grupo 3 16, 17,12 Grupo 4 1
Tabela 4 - Agrupamentos dos indivíduos amostrados na Reserva Natural Vale.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 2, 3, 4, 12, 13, 11, 6, 7, 8, 1 e 5 Grupo 2 9, 10, 18, 19, 17, 20, 15, 16, 14, 21, 23 e 22 Grupo 3 24 e 25
Tabela 5 - Agrupamentos dos indivíduos amostrados em Linhares.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 12, 13, 11, 8, 9, 15, 18, 19, 20, 24 25, 67, 21, 23, 16, 17 e 14 Grupo 2 10 Grupo 3 3, 4, 1, 2 e 5
Tabela 6 – Agrupamentos dos indivíduos amostrados em Regência.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 17, 18, 16, 15, 19, 20, 23, 25 e 24 Grupo 2 2, 3, 4, 5, 6, 13, 14, 12, 7, 9, 8, 10 e 11 Grupo 3 1 Grupo 4 21 e 22
Tabela 7 - Agrupamentos dos indivíduos amostrados na Reserva Biológica de Comboios.
Agrupamentos Indivíduos Grupo 1 11, 12, 13, 16, 21, 18, 22, 23 e 17 Grupo 2 19 e 20 Grupo 3 14 e 15 Grupo 4 24 e 25 Grupo 5 9, 10, 7, 8, 3, 6, 4, 5, 1 e 2