Vytautas SABŪNAS ŠUNŲ UŽSIKRĖTIMAS VEKTORIŲ

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS

Vytautas SABŪNAS

ŠUNŲ UŽSIKRĖTIMAS VEKTORIŲ PERNEŠAMAIS PATOGENAIS

Mokslo daktaro disertacija Gamtos mokslai, biologija (N 010)

Kaunas, 2019

Mokslo daktaro disertacija rengta 2014–2018 metais Vytauto Didžiojo universitete pagal LR švietimo ir mokslo ministro 2017 m. liepos 17 d. įsakymu Nr. V-574 suteiktą doktorantūros teisę Vytauto Didžiojo universitetui su Gamtos tyrimų centru ir su Valstybiniu mokslinių tyrimų institutu Inovatyvios medicinos centru.

Mokslinis vadovas: Prof. dr. Jana Radzijevskaja (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biologija N 010)

Konsultantas: Prof. dr. (HP) Algimantas Paulauskas (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biologija N 010)

Disertacijos gynimo taryba:

Pirmininkas Dr. Dalius Butkauskas (Gamtos tyrimų centras, gamtos mokslai, biologija N 010)

Nariai: Prof. dr. Vaclovas Jurgelevičius (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biologija N 010) Prof. dr. Arūnas Stankevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Veterinarijos akademija, žemės ūkio mokslai, veterinarija A 002) Prof. dr. Natalija Škute (Daugpilio universitetas, gamtos mokslai, biologija N 010) Doc. dr. Vykintas Baublys (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biologija N 010)

Disertacija bus ginama viešame Biologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. lapkričio 8 d. 11 valandą, Vytauto Didžiojo universiteto Gamtos mokslų fakulteto, 101 auditorijoje. Adresas: Vileikos g. 8, 44404 Kaunas, Lietuva.

Disertaciją galima peržiūrėti Lietuvos nacionalinėje Martyno Mažvydo bibliotekoje bei Vytauto Didžiojo universiteto bibliotekose.

VYTAUTAS MAGNUS UNIVERSITY

Vytautas SABŪNAS

PREVALENCE OF VECTOR-BORNE PATHOGENS IN DOGS

Doctoral Dissertation Natural Sciences, Biology (N 010)

Kaunas, 2019

The doctoral dissertation has been prepared during the period 2014–2018 at Vytautas Magnus University. The right of doctoral studies was granted to Vytautas Magnus University jointly with Nature Research Centre and Centre for Innovative Medicine of State Research Institute, on 17 July, 2017, by the decision No. V–574 of the Government of the Republic of Lithuania.

Scientific Supervisor: Prof. dr. Jana Radzijevskaja (Vytautas Magnus University, Natural sciences, Biology N 010)

Consultant: Prof. dr. (HP) Algimantas Paulauskas (Vytautas Magnus University, Natural sciences, Biology N 010)

Council of defence of the doctoral dissertation:

Chairman: Dr. (HP) Dalius Butkauskas (Nature Research Centre, Natural sciences, Biology N 010).

Members: Prof. dr. Vaclovas Jurgelevičius (Vytautas Magnus University, Natural sciences, Biology N 010) Prof. dr. Arūnas Stankevičius (Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary A 002) Prof. dr. Natalija Škute (Daugavpils university, Natural sciences, Biology N 010) Assoc. prof. dr. Vykintas Baublys (Vytautas Magnus University, Natural sciences, Biology N 010)

The official defence of the dissertation will be held at 11 a.m. on 8th November, 2019 at the public session in the Faculty of Nature Sciences of Vytautas Magnus University, auditorium 101. Address: Vileikos str. 8, LT-44404 Kaunas, Lithuania.

The dissertation is available at Martynas Mažvydas National Library of Lithuania and the libraries of Vytautas Magnus University.

TURINYS

SANTRUMPOS ...... 7 ĮVADAS ...... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA...... 13 1.1. Vektorių pernešamos ligos ...... 13 1.2. Dirofiliariozė ...... 13 1.2.1. Filiarijų biologinė klasifikacija ...... 13 1.2.2. Dirofilaria spp. vektoriai ir paplitimas ...... 14 1.2.3. Suaugusių dirofiliarijų helmintų morfologija ...... 16 1.2.4. D. repens ir D. immitis vystymosi ciklas ...... 17 1.2.5. Šunų ir žmonių poodinė dirofiliariozė (D. repens) ...... 18 1.2.6. Šunų širdies kirminų liga (D. immitis) ...... 19 1.2.7. Dirofiliariozės diagnostikos metodai ...... 20 1.2.8. Dirofiliariozės gydymas ir prevencija ...... 21 1.2.9. Wolbachia endosimbiotinės bakterijos biologinė reikšmė dirofiliarijų vystymuisi ir patogenezei ...... 23 1.3. Šunų babeziozė ...... 24 1.3.1. Babezijų biologinė klasifikacija ...... 24 1.3.2. Babesia spp. vektoriai ir paplitimas ...... 24 1.3.3. B. canis vystymosi ciklas ...... 26 1.3.4. Babeziozės patogenezė ...... 27 1.3.5. Babeziozės diagnostikos metodai ...... 27 1.3.6. Babezijų genetinė įvairovė ir padermių nustatymas ...... 28 1.3.7. Babeziozės gydymas ir prevencija ...... 30 1.4. Anaplazmozė ...... 31 1.4.1. Anaplazmų biologinė klasifikacija ...... 31 1.4.2. Anaplasma spp.vektoriai ir paplitimas ...... 31 1.4.3. A. phagocytophilum vystymosi ciklas ir granuliocitinė anaplazmozė ...... 33 1.4.4. Granuliocitinės anaplazmozės diagnostika ...... 34 1.4.5. Anaplazmozės gydymas ir prevencija ...... 36 1.5. Ektoparazitų pernešamų patogenų sukeliamos koinfekcijos ...... 37 2. MEDŽIAGA IR METODAI ...... 38 2.1. Mėginių surinkimas ir laikymas ...... 38 2.2. Patogenų nustatymo metodai ...... 41 2.2.1. Serologiniai patogenų nustatymo metodai ...... 41 2.2.2. Citomorfologinis kraujo tyrimas ...... 41 2.2.3. Modifikuotas Knoto testas ...... 41 2.2.4. Suaugusių helmintų morfologinis identifikavimas ...... 41 2.3. Molekulinis patogenų rūšies identifikavimas ir genetinės įvairovės nustatymas ...... 42 2.3.1. DNR išskyrimas ...... 42 2.3.2. DNR pagausinimas PGR metodu ...... 42 2.3.3. B. canis genotipų nustatymas PGR – RFIP metodu ...... 45 2.3.4. PGR produktų vizualizavimas ...... 47 2.3.5. DNR fragmentų iškirpimas iš gelio, valymas ir sekoskaita ...... 47

2.3.6. Filogenetinė analizė ...... 48 2.4. Statistinė analizė ...... 48 2.5. Širdies kirminų ligos gydymo protokolas ...... 48 3. REZULTATAI ...... 50 3.1. Prieglaudų ir naminių šunų užsikrėtimas dirofiliarioze Lietuvoje ...... 50 3.2. Lietuvoje paplitusių dirofiliarijų rūšis remiantis suaugusių helmintų morfologiniu identifikavimu ...... 51 3.3. Lietuvoje paplitusių dirofiliarijų ITS-2 regiono ir COI geno sekų filogenetinė analizė ...... 52 3.4. Širdies kirminų (D. immitis) atvejo analizė ...... 55 3.5. Šunų sergančių dirofiliarioze užsikrėtimas Wolbachia endosimbiotine bakterija ir 16S rRNR geno fragmentų sekų analizė ...... 56 3.6. Žmonių poodinės dirofiliariozės (D. repens) atvejų Lietuvoje apžvalga ...... 57 3.7. Šunų užsikrėtimas vektorių pernešamų patogenų koinfekcijomis ...... 59 3.8. B. canis patogenų molekulinis nustatymas ...... 60 3.9. B. canis genotipų nustatymas pagal 18S rRNR geną, remiantis PGR-RFIP analize ...... 60 3.10. B. canis 18S rRNR geno sekų analizė ...... 61 3.11. B. canis genotipų nustatymas pagal Bc28.1 geną, remiantis PGR-RFIP analize ...... 63 3.12. B. canis Bc28.1 geno sekų ir filogenetinė analizės ...... 65 3.13. B. canis genotipų pagal 18S rRNR ir Bc28.1 genus paplitimas Lietuvoje ...... 68 4. REZULTATŲ APTARIMAS ...... 69 IŠVADOS ...... 78 LITERATŪROS SĄRAŠAS ...... 79 PUBLIKACIJŲ SARAŠAS ...... 107 SUMMARY OF DISSERTATION ...... 110 GYVENIMO APRAŠYMAS/CURRICULUM VITAE ...... 129 PADĖKA / ACKNOWLEDGMENT ...... 134 PRIEDAI ...... 136

SANTRUMPOS

Bc28.1 – Babesia canis merozoito paviršiaus baltymas bp – bazių pora COI – citochromo c oksidazės pirmas subvienetas ddH2O – du kartus distiliuotas vanduo DNR – deoksiribonukleorūgštis EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis GPI – glikozil-fosfatidilinozitolis ITS-2 – vidinis transkribuojamas tarpiklis 2 IFAT – imunofluorescensinis antikūnų tyrimas Y – citozino arba timino bazė grandinėje LPS – lipopolisacharidai msp4 – didysis paviršiaus baltymas mtDNR – mitochondrinė deoksiribonukleorūgštis NADP – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas PGR – polimerazės grandininė reakcija͒ rDNR – ribosominė deoksiribonukleorūgštis R – adenino arba guanino bazė grandinėje RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas TAE – DNR elektroforezės buferinis tirpalas (angl. Tris–Acetate–EDTA)͒ TBE – DNR elektroforezės buferinis tirpalas (angl. Tris-borate-EDTA) TE – DNR elektroforezės buferinis tirpalas (angl. Tris–EDTA)͒ UV – ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Vektorių pernešamos ligos – tai infekcijos, kurias platina nariuotakojai kraujasiurbiai, dažniausiai – erkės ir uodai (Beugnet and Marié, 2009). Vektoriai (pernešėjai) žmonėms, naminiams ar laukiniams gyvūnams perneša įvairius patogenus – virusus, bakterijas, parazitus. Dauguma šių patogenų turi zoonotinį potencialą (Parola et al., 2005). Dauguma vektorių pernešamų patogenų anksčiau buvo sutinkami tik Pietų Europos regionuose, tačiau pastaraisiais dešimtmečiai stebimas spartus jų plitimas į vėsesnio klimato zonas (Šiaurės rytų/vakarų Europą) (Shaw et al., 2001; Genchi et al., 2005, 2009; Simón et al., 2012). Pasaulinė klimato kaita, naminių gyvūnų ir žmonių keliavimo reglamentavimo supaprastinimas, stipriai išaugęs transportuojamų reprodukcijos ir naminių gyvūnų skaičius oro, vandens, žemės transporto priemonėmis – visi šie faktoriai, kurie stipriai susiję su antropogenine veikla, lemia vektorių pernešamų patogenų spartesnį plitimą į naujas teritorijas (Beugnet and Marié, 2009). Dirofiliarijos – tai apvaliosios kirmėlės (nematodai), kurių pagrindiniai vektoriai yra uodai (Simón et al., 2012). Skirtingos šių parazitų rūšys gali sukelti skirtingas ligas žmonėms ir gyvūnams. Labiausiai pasaulyje paplitusios dvi dirofiliarijų rūšys: Dirofilaria repens Railliet et Henry, 1911 – žmonių ir šunų (Canis familiaris) poodinės dirofiliariozės sukėlėjas, ir Dirofilaria immitis Leide, 1856 – šunų širdies kirminų ir žmonių plaučių dirofiliariozės sukėlėjas (McCall et al., 2008b). Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Veterinarijos akademijoje 2010 metais buvo nustatytas pirmasis dirofiliariozės atvejis šuniui (Jankauskaitė et al., 2011). Nuo to laiko veterinarijos klinikose dirbantys gydytojai vis dažniau aptinka šių helmintų lervines stadijas kraujo mikroskopijos metodais. Atliekant kraujo tyrimus greitaisiais nustatymo metodais (citomorfologinis kraujo tyrimas, Knoto testas) nustatyti filiarijų rūšį yra sudėtinga (Capelli et al., 2018). Tiksliam paplitusių filiarijų rūšių nustatymui dažniausiai pasitelkiami molekuliniai metodai. Nustačius šunų užsikrėtimą dirofiliarioze ir ligą sukeliančio parazito rūšį Lietuvoje, galima prognozuoti ligos plitimą, eigą, parazito zoonotinę reikšmę ir pritaikyti tinkamas prevencijos priemones bei gydymą. Šunų babeziozė viena iš labiausiai pasaulyje paplitusių erkių pernešamų ligų, kurios sukėlėjas yra viduląstelinis pirmuonis Babesia (Irwin, 2009). Lietuvoje paplitusi šunų babeziozės sukėlėjo rūšis – Babesia canis (Piana and Galli-Valerio, 1895), (Paulauskas et al., 2014). Į naujas geografines teritorijas plinta skirtingos B. canis padermės, kurios skiriasi savo patogeniškumu (Matijatko et al., 2012). Šunų sergamumas šia liga Lietuvoje sparčiai auga (Paulauskas et al., 2014), o patogeną pernešančios erkės Dermacentor reticulatus (Fabricius,

1794) aptinkamos visuose Lietuvos regionuose (Paulauskas et al., 2015). Ieškoma efektyvių būdų, kaip apsaugoti šunis nuo babeziozės. Prieš kelis dešimtmečius sukurta vakcina nuo babeziozės, kuri sumažina gyvūnų ligos sunkumą, tapo komerciškai prieinama žemyninėje Europoje (Schetters et al., 1994; Schetters et al., 1995). Prancūzijoje sukurtos vakcinos „Pirodog“ (Bourdoiseau, 2006; Freyburger et al., 2011) nėra naudojamos šunų imunizacijai Lietuvoje dėl mažo efektyvumo (Schetters et al., 1995). Atliekant eksperimentinius tyrimus su šunimis, buvo nustatyta, kad tarp B. canis padermių yra antigeninių skirtumų, kurie susiję su alelių pakitimais. Dėl to sukurta vakcina apsaugo nuo vienos padermės, tačiau neapsaugo nuo kitos B. canis patogeno padermės (Matijatko et al., 2012; Carcy et al., 2015). Atlikus B. canis genomo sekų analizę, buvo nustatyta, kad šunų babeziozės patogenezė priklauso nuo B. canis padermių (Schetters et al., 2009). Pastebėta, kad skirtingi B. canis 18S ribosominės RNR genotipai yra susiję su padermių virulentiškumu, kurie siejami su trombocitopenija – trombocitų skaičiaus sumažėjimu (Adaszek et al., 2009). Kitas B. canis genas Bc28.1 koduoja 28 kDa GPI (glikozil – fosfatidilinozitolio) baltymą, esantį merozoito paviršiuje, kuris turi įtakos pirmuonio patekimui į šuns eritrocitus (Yang et al., 2012). Šis genas yra naudojamas kaip genetinis žymuo analizuojant skirtingas B. canis padermes ir vakcinos efektyvumą. B. canis padermių genetinės įvairovės nustatymas Lietuvoje gali būti naudingas vakcinos kūrimui, vertinant jos panaudojimo potencialą šioje šalyje, o taip pat vertinant skirtingų B. canis padermių paplitimą ir pasiskirstymą Europoje, kuris yra susiję su parazitų pernešėjų – D. reticulatus erkių paplitimu. Genotipų nustatymo metodikos plėtojimas gali būti naudingas ateityje, siekiant iš anksto įvertinti, kokio sunkumo forma gyvūnas gali sirgti užsikrėtęs skirtingų padermių B. canis patogenais. Granuliocitinę šunų anaplazmozę sukelia Anaplasma phagocytophilum (Foggie, 1949) (Dumler et al., 2001) rūšies viduląstelinės, gramneigiamos bakterijos (Majláthová et al., 2011). A. phagocytophilum patogenai pavojingi ne tik šunims, tačiau gali sukelti infekciją ir arkliams, laukiniams atrajotojams ir žmonėms (Chen et al., 1994; de la Fuente et al., 2005). Šiuo metu anaplazmozės infekcijos registruojamos daugelyje Šiaurės Amerikos, Europos bei Rytų Azijos šalių (Beugnet and Marié, 2009). Europoje šių bakterijų pagrindinis vektorius yra Ixodes ricinus (Linnaeus, 1758) kraujasiurbės erkės (Jensen et al., 2007). Diagnozuoti šią ligą šunims naudojant įprastines diagnostikos metodikas (serologiją, mikroskopiją), naudojamas veterinarijos klinikose, yra sudėtinga dėl patogeno dauginimosi organizme subtilybių (Kohn et al., 2008). Šios ligos diagnostikoje dažni klaidingi rezultatai: nenustatomas patogenas arba klaidingai nustatomos kitos ligos, sukeliančios panašius simptomus (Majláthová et al., 2011). Lietuvoje granuliocitinės anaplazmozės sukėlėjai aptinkami I. ricinus erkėse, todėl yra didelė šunų užsikrėtimo tikimybė (Radzijevskaja et al., 2008; Paulauskas et al., 2009, 2012). Atsižvelgiant į tai, kad

A. phagocytophilum patogenai gali sukelti zoonotinius susirgimus, šunų užsikrėtimo tyrimai vaidina didelį vaidmenį žmonių medicinoje ir leidžia atkreipti specialistų dėmesį. Vienos rūšies vektoriai gali pernešti skirtingus patogenus vienu metu. Dažnai ant gyvūnų parazituoja skirtingų taksonominių grupių ektoparazitai, kurie gali pernešti su jais susijusius patogenus (Cardoso et al., 2010; Gaunt et al., 2010; De Tommasi et al., 2013). Skirtingų vektorių pernešamų patogenų koinfekcijos gali turėti įtakos ligos eigai, gydymo pasirinkimui ir prognozės įvertinimui, todėl yra svarbu įvertinti koinfekcijų paplitimą Lietuvos šunų populiacijoje. Šunų užsikrėtimo vektorių pernešamais patogenais tyrimai Lietuvoje taikant kompleksinius (taip pat ir molekulinius) tyrimo metodus iki šiol nebuvo atlikti.

Darbo tikslas: įvertinti šunų užsikrėtimą vektorių pernešamais patogenais Lietuvoje.

Uždaviniai: 1. Panaudojant mikroskopinius, morfologinius ir molekulinius tyrimo metodus identifikuoti Lietuvoje aptiktų filiarijų rūšį ir įvertinti užsikrėtimo lygį naminių ir prieglaudose laikomų šunų tarpe; 2. Apžvelgti žmonių dirofiliariozės susirgimus; 3. Nustatyti šunų, sergančių dirofiliarioze (Dirofilaria spp.), užsikrėtimą Wolbachia endosimbiotine bakterija; 4. Įvertinti šunų babeziozės sukėlėjo (Babesia canis) padermių genetinę įvairovę ir jų paplitimą Lietuvoje panaudojant molekulinius žymenis; 5. Įvertinti šunų užsikrėtimą skirtingų vektorių pernešamų patogenų sukeliamomis koinfekcijomis.

Ginamieji teiginiai: 1. Lietuvoje šunyse parazituojančių filiarijų rūšis – Dirofilaria repens; 2. Šunų širdies kirminų ligos sukėlėjai – Dirofilaria immitis rūšies parazitai – Lietuvoje nėra paplitę, bet galimi įvežtiniai atvejai iš endeminių šalių; 3. Lietuvoje žmonių dirofiliariozės infekcijos pasireiškia sporadiškai Vakarų, Rytų, Šiaurės ir Centrinės Lietuvos regionuose; 4. Lietuvoje 81,6 % šunų, sergančių dirofiliarioze, yra užsikrėtę dirofiliarijų endosimbiotine bakterija Wolbachia; 5. Lietuvoje paplitusios skirtingos babeziozės (Babesia canis) sukėlėjo padermės; 6. Lietuvoje šunims būdingos vektorių pernešamos Anaplasma phagocytophilum, Babesia canis, Dirofilaria repens patogenų koinfekcijos.

Mokslinio darbo naujumas. Naudojant skirtingus identifikavimo metodus, nustatyta Lietuvoje paplitusių dirofiliariozę šunims sukeliančių helmintų rūšis – Dirofilaria repens. Pirmą kartą Lietuvoje įvertintas prieglaudose ir namuose laikomų šunų užsikrėtimas uodų pernešamais D. repens rūšies parazitais. D. repens ir D. immitis ribosominės DNR ITS-2 regiono (n=2) ir D. repens mitochondrinės DNR COI geno fragmentų išskirtų iš šunų kraujo (n=1) ir suaugusių nematodų (n=2) sekos patalpintos į Genų banką (prieigos numeriai: MH469230; MH663471; MH469227; MH469228; MH469229 atitinkamai). Pirmą kartą Lietuvoje apibendrinta žmonių susirgimų dirofiliarioze informacija, kuri buvo publikuota recenzuojamame mokslo leidinyje. Žmonių susirgimai dirofiliarioze Lietuvoje yra susiję su šunų užsikrėtimu. Ši apžvalginė informacija gali padėti atkreipti visuomenės dėmesį į šią infekciją. Nustatytas pirmasis šunų širdies kirminų (D. immitis) atvejis Lietuvoje šuniui, atvežtam iš Ispanijos. Širdies kirminų liga infekuoti šunys, transportuojami iš endeminių šalių į Europos Šiaurės Rytų regionus, gali platinti infekciją vietinių uodų populiacijoms. Tokiu būdu šie patogenai gali plisti į naujas teritorijas ir kelti pavojų šunų ir žmonių sveikatingumui. Pirmą kartą Lietuvoje šunims, sergantiems dirofiliarioze, nustatytas užsikrėtimas Wolbachia endosimbiotine bakterija. Wolbachia 16S ribosominės RNR geno fragmento sekos (n=2) patalpintos į Genų banko duomenų bazę (prieigos numeriai: MK050782; MK050783). Pirmą kartą Lietuvoje taikant PGR-RFIP metodą ir sekoskaitą atliktas B. canis padermių genetinis charakterizavimas pagal 18S rRNR geną ir Bc28.1 geną. Bc28.1 genas naudojamas nustatant padermių antigeninę įvairovę. Darbe gauti rezultatai gali būti naudingi naujos kartos vakcinų nuo babeziozės kūrime. Taikant PGR-RFIP metodą ir išanalizavus Bc28.1 geno sekas, nustatytas B. canis 34.01 genotipas, kuris buvo aptiktas tik Prancūzijoje. Manoma, kad šio genotipo patogenai gali būti mažiau atsparūs sukurtai vakcinai, todėl darbe gauti rezultatai gali būti naudingi naujos kartos vakcinų nuo babeziozės kūrime. B. canis 18S rRNR (n=5) ir Bc28.1 (n=13) genų sekos patalpintos į Genų banko duomenų bazę. 18S rRNR geno sekų prieigos numeriai: A genotipas – MN078319; MN078322; B genotipas – MN078320; A/B genotipas – MN078321; MN078323. Bc28.1 geno sekų prieigos numeriai: 34.01 genotipas MN078324; MN078325; MN078326; MN078327; MN078328; B genotipas MN078329; MN078330; MN078331; MN078332; A genotipas MN078333; MN078334; 34/A genotipas MN078335; MN078336. A. phagocytophilum msp4 geno seka (n=1) patalpinta į Genų banko duomenų bazę (prieigos numeris: MN078318).

Pirmą kartą Lietuvoje įvertintas šunų užsikrėtimas koinfekcijomis tarp A. phagocytophilum, D. repens ir B. canis patogenų.

Disertacijos turinys ir apimtis. Disertaciją sudaro santrumpų paaiškinimas, įvadas, literatūros apžvalga, medžiaga ir metodai, rezultatai, rezultatų aptarimas, išvados, disertacijos tema išleistų publikacijų ir paskelbtų konferencijose tezių sąrašas, disertacijos santrauka, gyvenimo aprašymas padėka ir priedai.

Disertacijos apimtis – 137 puslapiai. Disertacijoje yra 27 paveikslai ir 12 lentelių. Literatūros sąraše yra 327 šaltiniai.

Darbo aprobavimas. Disertacijos tema išleistos trys publikacijos recenzuojamuose mokslo leidiniuose. Disertacijos tema pristatyti pranešimai 16 mokslinių konferencijų.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Vektorių pernešamos ligos

Terminas šunų vektorių pernešamos ligos (angl. canine vector-borne diseases (CVBD)) apibūdina labai plačią įvairovę parazitinių, bakterinių ir virusinių ligų, kurias perneša erkės, blusos, musės, uodai ir kiti kraujasiurbiai mašalai (Otranto et al., 2009). Šių infekcijų kontrolė yra svarbi ir žmonių populiacijai dėl patogenų zoonotinio potencialo (Dirofilaria spp. Anaplasma phagocytophilum, Bartonella spp., Borrelia burgdorferi Johnson, 1984, Leishmania infantum Nicolle, 1908, Thelazia callipaeda Railiet and Henry, 1910 ir kt.) (Day, 2011; Otranto et al., 2013). Klimato kaita ir žmonių veikla pastaraisiais dešimtmečiais lemia spartų šių patogenų plitimą iš pietinių regionų į vėsesnio klimato zonas (Rogers and Randolph, 2006; Genchi et al., 2009; Randolph, 2009). Vektorių pernešamų patogenų sukeliamos infekcijos pasižymi didele klinikinių simptomų įvairove, kurie dažniausiai nėra specifiniai atskirai patogenų rūšiai, todėl ligų diagnostika ir kontrolė tampa dideliu iššūkiu (Baneth et al., 2012). Lietuvoje plačiau aprašomi žmonių susirgimai visuomenėje gerai žinomomis Laimo ar erkinio encefalito ligomis (Motiejunas et al., 1994; Juceviciene, 2002; Mickienė et al., 2002; Asokliene, 2004; Han et al., 2005). Atlikta daug mokslinių tyrimų, tiriant erkių užsikrėtimą vektorių pernešamais patogenais (Ambrasiene et al., 2004; Radzijevskaja et al., 2008; Paulauskas et al., 2009). Aprašomi šunų užsikrėtimo babezioze (Babesia canis) atvejai (Paulauskas et al., 2014; Zamokas et al., 2014). Veterinarijos gydytojai susiduria su šunų dirofiliarioze, anaplazmoze ir vis dažniau fiksuojami komplikuoti babeziozės atvejai, tačiau publikacijų šiomis temomis Lietuvoje labai nedaug.

1.2. Dirofiliariozė

1.2.1. Filiarijų biologinė klasifikacija

Filiarijos – helmintai, priklausantys Filarioidea antšeimiui, Spirurida būriui, Secernentea klasei, apvaliųjų kirminų Nematoda tipui ir gyvūnų Animalia karalystei. Šiam antšeimiui priskiriama 10 skirtingų šeimų – Aproctidae, Creagrocercidae, Drilonematidae, Filariidae, Homungellidae, Mesidionematidae, Onchocercidae Scolecophilidae, Setariidae, Ungellidae. Labiausiai paplitusi Onchocercidae šeima. Šiai šeimai priklauso daugelis parazituojančių genčių, tokių kaip: Acanthocheilonema, Brugia, Dipetalonema, Dirofilaria, Loa, Onchocerca.

Plačiausias paplitimo ribas turi Dirofilaria genties nematodai, vadinami dirofiliarijomis (Rossi et al., 2015). Dirofilaria genčiai priskiriamos maždaug 27 skirtingos nematodų rūšys. Žinomiausios rūšys yra Dirofilaria repens, Dirofilaria immitis, Dirofilaria tenuis (Chandler, 1942) (Michalski et al., 2010). Dėl plataus geografinio paplitimo ir parazitavimo žmonėse ir gyvūnuose didelę svarbą turi D. repens ir D. immitis rūšys (Otranto et al., 2013). D. immitis rūšies helmintai sukelia širdies kirminų ligą šunims ir plaučių dirofiliariozę žmonėms. D. repens rūšies helmintai sukelia poodinę dirofiliariozę šunims ir žmonėms (Simón et al., 2012).

1.2.2. Dirofilaria spp. vektoriai ir paplitimas

Culicidae šeimos uodai perneša daug įvairių patogenų. Labiausiai žinomi yra Anophles genties uodai, kurie gali pernešti maliariją. Aedes genties uodai yra žinomi kaip svarbūs geltonosios karštligės, Dengės karštligės, įvairių encefalito virusų ir kitų arbovirusų vektoriai (Simón et al., 2005). Dirofiliarijas platina Culex, Aedes, Anophles, Mansonia genčių uodai (Kalaivani et al., 2012). Lietuvoje yra žinomos 37 uodų rūšys (Pakalniškis et al., 2000). Aedes vexans (Meigen, 1830), Culiseta annulata (Schrank, 1776), Culex pipiens (Linnaeus, 1758), Antistia maculipennis (Stal, 1876), Ochlerotatus caspius (Pallas, 1771) ir Ochlerotatus excrucians (Walker, 1865) rūšies uodai gali būti tinkami kaip vektoriai D. repens ir D. immitis rūšių patogenų vystymuisi ir platinimui Lietuvoje (Simón et al., 2012; Bocková et al., 2013; Rudolf et al., 2014; Zittra et al., 2015). Uodų užsikrėtimas dirofiliarijų lervinėmis stadijomis Lietuvoje nėra ištirtas. D. immitis rūšies parazitai yra plačiai paplitę Amerikos žemynuose, pietiniuose Europos, Azijos regionuose, Afrikoje ir Australijoje, tuo tarpu D. repens parazitai aptinkami tik Europos, Azijos ir Afrikos žemynuose (Simón et al., 2012). Europoje Dirofilaria genties nematodai laikomi sparčiai plintančios zoonozės sukėlėjais. Klimato kaita ir padidėjusi rezervuarinių šeimininkų (daugiausiai užsikrėtusių šunų) migracija iš endeminių vietovių į naujas teritorijas skatina dirofiliarijų plitimą iš pietinių regionų į rytinius ir šiaurinius regionus (Simón et al., 2012). Iki 2001 metų dirofiliariozė daugiausiai buvo aptinkama tik pietinėse Europos šalyse, tokiose kaip Italija, Ispanija, Prancūzija ir Portugalija (Genchi et al., 2011b; Sassnau et al., 2014). Iki 2012 metų dirofiliariozės paplitimo ribos Europoje stipriai padidėjo, endeminė sritis išsiplėtė į šiaurės rytus (Morchón et al., 2012; Otranto et al., 2013). D. repens ir D. immitis rūšių paplitimas Europoje 2015 metais pavaizduotas 1 paveiksle (ESCCAP, 2017).

1 pav. 2015 metų D. repens ir D. immitis rūšių paplitimo žemėlapis Europoje (ESCCAP, 2017) Fig. 1. Approximate distribution of D. immitis and D. repens in Europe (2015) (ESCCAP, 2017)

Per pastarąjį dešimtmetį širdies kirminų liga (D. immitis) tapo endeminė šalyse, kuriose seniau buvo fiksuojami tik įvežtiniai atvejai: Baltarusijoje, Čekijoje (Șuleșco et al., 2016), Vengrijoje (Jacsó et al., 2009; Tolnai et al., 2014), Lenkijoje (Swiatalska and Demiaszkiewicz, 2010) ir Slovakijoje (Miterpáková et al., 2008). Poodinės dirofiliariozės (D. repens) infekcijos žmonių ir šunų tarpe užfiksuotos Rytų ir Šiaurės Europos šalyse: Lenkijoje (Svobodova et al., 2005; Miterpáková et al., 2008), Latvijoje (Masny et al., 2011; Cielecka et al., 2012), Estijoje (Melbarde-Gorkusa et al., 2011; Linda et al., 2012) ir Suomijoje (Jokelainen et al., 2016). Pastebima, kad žmonių užsikrėtimo atvejai nustatyti tose teritorijose, kur anksčiau buvo nustatyta šunų dirofiliariozė (Capelli et al., 2018). Viduržemio jūros regione žmonių užsikrėtimas D. repens rūšies helmintais yra didžiausias, lyginant su kitais Europos regionais. Tačiau pastaruoju metu Ukrainoje, Rusijoje ir Baltarusijoje žmonių dirofiliariozė kelia didžiausia susirūpinimą. Skirtinguose šaltiniuose pateikti duomenys rodo, kad žmonių sergamumas dirofiliarioze šiose šalyse per pastaruosius dešimtmečius labai padidėjo (Kartashev et al., 2014, 2015). Nuo 1997 iki 2012 metų Ukrainoje fiksuojami 1465 žmonių susirgimo atvejai (Sałamatin et al., 2013), Rusijoje – 1192 atvejai. Nuo 1997 iki 2013 metų Baltarusijoje užregistruota 80 žmonių poodinės dirofiliariozės atvejų (Kartashev et al., 2015). Tikslus dirofiliariozės paplitimas Europoje nėra žinomas, ypač rytų ir šiaurės rytų regionuose. Pietinėse šalyse, kur liga endemiškai paplitusi jau daugelį metų, išleista daug

15 publikacijų, demonstruojančių paplitimą tame regione, tačiau rytų ir šiaurės rytų regionuose stebimos tik pavienės publikacijos, neatspindinčios realaus paplitimo šioje teritorijoje. Lietuvoje pirmą kartą dirofiliariozė (nežinoma rūšis), nustatyta šuniui Lietuvos Sveikatos Mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje 2010 metais (Jankauskaitė et al., 2011). Nuo to laiko veterinarijos gydytojai vis dažniau kraujo mikroskopijos metodu kraujyje aptinka cirkuliuojančias mikrofiliarijas, tačiau šių nematodų rūšis Lietuvoje nustatyta nebuvo.

1.2.3. Suaugusių dirofiliarijų helmintų morfologija

Suaugusioms dirofiliarijoms, kaip ir daugeliui apvaliųjų kirmėlių, būdinga pailga siūlo forma, išorę dengia verpstės formos kutikulė. D. immitis patelės yra nuo 250 iki 300 mm ilgo ir 1,0–1,3 mm pločio, patinėliai – 120–200 mm ilgio ir 0,7–0,9 mm pločio. Suaugusios patelės turi vulvą, kuri atsiveria 2,2–3,2 mm nuo žiočių, o patinėliai turi dvi spikules, kurių ilgis 310– 390 μm ir 150–190 μm atitinkamai. Mikrofiliarijos (lervinės stadijos) tiesios formos, smailėjančia uodega, apie 290–330 μm ilgio ir 5–7 μm diametro (Furtado et al., 2010; Nelson et al., 2014). Suaugusio D. immitis nematodo schematinis vaizdas pavaizduotas 2 paveiksle.

2 pav. D. immitis suaugusio nematodo schematinis vaizdas; 1 – patelės priekinė dalis, matomos žiotys (punktyrinė rodyklė), nervinis rezginys, stemplė, dalis žarnyno ir vulvos atsivėrimas (juoda rodyklė); 2 – patino užpakalinė dalis, papilės ir spikulės (juodos rodyklės) (pakeista pagal Furtado et al., 2010) Fig. 2. D. immitis by light microscopy; 1 – anterior end of female, showing the oral opening (dotted arrow), nerve ring, esophagus, first portion of intestine, and the vulvar opening (black arrow); 2 – lateral view of male posterior end, showing the large and small spicules (black arrow), and papillae (modified by Furtado et al., 2010)

D. repens yra mažesni už D. immitis. Suaugusios patelės siekia 100–170 mm ilgį ir 4,6– 6,3 mm plotį, patinėliai 50–70 mm ilgio ir 3,7–4,5 mm diametro. Suaugusios patelės turi vulvą, kuri atsiveria 1,1–1,9 mm nuo žiočių, o patinėliai turi dvi spikulės, kurių ilgis 430–590 μm ir 175–210 μm atitinkamai. Mikrofiliarijos turi smailėjančią, dažniausiai lenktos formos uodegą,

16 kuri siekia 300–370 μm ilgį ir 6,0–8,0 μm diametrą (Manfredi et al., 2007; Furtado et al., 2010; Magnis et al., 2013).

1.2.4. D. repens ir D. immitis vystymosi ciklas

Poodinės dirofiliariozės (D. repens) ir širdies kirminų (D. immitis) ligą sukeliantys parazitai geriausiai prisitaikę parazituoti laukiniuose mėsėdžiuose ir naminiuose šunyse. Šunys yra laikomi pagrindiniais rezervuariniais šeimininkais. Dėl specifinio kačių ir žmonių organizmo imuninio atsako prieš šios rūšies helmintus daugelyje atvejų helmintai yra sunaikinami ankstyvose vystymosi stadijose arba nepilnai subręsta galutiniame šeimininke. Katės ir žmonės yra laikomi atsitiktiniais šeimininkais (McCall et al., 2008b). Culicidae šeimos uodų patelės yra pagrindiniai D. repens ir D. immitis vektoriai (McCall et al., 2008b). Dirofiliarijų vystymosi ciklas pavaizduotas 3 paveiksle. Vystymasis vektoriuose. D. repens ir D. immitis parazitų vystymosi ciklas uoduose yra vienodas. Vystymasis vektoriuje itin priklauso nuo aplinkos temperatūros ir gali siekti nuo 8 iki 29 dienų. Mažesnėje negu 14 oC aplinkos temperatūroje lervų vystymasis nebevyksta (Webber and Hawking, 1955; Cancrini et al., 2007). Uodai, maitindamiesi infekuotų gyvūnų krauju, užsikrečia pirmos stadijos lervomis (mikrofiliarijomis). Praėjus 24 valandoms po užsikrėtimo lervos iš uodo virškinamojo trakto patenka į malpigijaus vamzdelį, kuriame 8–10 dienų po infekcijos (toliau tekste –d.p.i.) vystosi iki antros (L2) stadijos ir dar po 3 dienų tampa invazinės

(L3) stadijos lervomis. Trečios stadijos lervos (L3), patekusios į uodo galvos sritį, išbūna iki kito uodo maitinimosi (Manfredi et al., 2007).

3 pav. D. repens ir D. immitis vystymosi ciklas (pakeista pagal Simón et al., 2012) Fig. 3. Life cycle of D. immitis and D. repens (modified by Simón et al., 2012)

Vystymasis galutiniame šeimininke. D. immitis vystymosi ciklas palyginti su kitais nematodais yra ilgas ir trunka nuo 7 iki 9 mėnesių, o suaugę helmintai organizme gali išlikti iki dešimties metų. Maitinimosi metu ant potencialaus šeimininko uodai į žaizdą išskiria hemolimfą. Kartu su šiuo sekretu invazinės lervos (L3) patenka į šeimininko odą (Manfredi et al., 2007). Praėjus 3–12 d. p. i. lervutė pasiekia ketvirtą (L4), o po 50–70 d. p. i. penktą (L5) vystymosi stadijas. Penktos stadijos lervos po 70–85 d. p. i. hematogeniniu keliu keliauja į plaučių arteriją ir dešinį širdies skilvelį, kur po 120 d. p. i. lytiškai subręsta. Suaugusio nematodo patelės, praėjus 6–9 mėnesiams po infekcijos, pradeda išskirti mikrofiliarijas į kraujotaką. Per parą suaugusi patelė gali išskirti iki 5000 mikrofiliarijų (Cancrini et al., 2006). D. repens parazitų vystymasis nuo D. immitis skiriasi suaugusio helminto lokalizacija galutiniame šeimininke. Suaugę D. repens nematodai, praėjus 6–9 mėnesiams po infekcijos patekimo į organizmą, pasiekia savo lytinę brandą ir dažniausiai randami poodiniame audinyje (Webber and Hawking, 1955; Manfredi et al., 2007). Yra užfiksuota atvejų, kuomet helmintai randami tarp raumenų fascijų ir pilvo ertmėje (Tarello, 2002). Dirofiliarijos, patekusios į žmogaus organizmą, dažniausiai nepasiekia lytinės brandos, lervutės nėra išskiriamos į kraujotaką. Dėl šios priežasties žmogus tampa netinkamu infekcijos šaltiniu tolimesniam ligos plitimui (Manfredi et al., 2007; Genchi et al., 2011a). Nesubrendę D. repens nematodai dažniausiai aptinkami žmogaus akies junginėje arba poodiniuose audiniuose (Genchi et al., 2009; Damle et al., 2014). Nepilnai subrendę D. immitis helmintai pasiekia plaučių arteriją, kurioje sunaikinami uždegiminio atsako metu ir sudaro mazgelius plaučių audinyje (Muro et al., 1999; Sałamatin et al., 2013).

1.2.5. Šunų ir žmonių poodinė dirofiliariozė (D. repens)

Šunims poodinės dirofiliariozės liga dažniausiai nesukelia jokių simptomų, todėl užsikrėtusių gyvūnų populiacija gali būti gerokai didesnė, negu manoma. Simptominės ligos formai būdingas niežulys, vangumas, plaukų slinkimas, odos paraudimas ir odos mazgelių susidarymas (Bredal et al., 1998; Hargis et al., 2002). Šiuos simptomus dažniausiai sukelia mikrofiliarijos, sukeldamos šeimininko imuninį atsaką (Bredal et al., 1998; Hargis et al., 2002; Albanese et al., 2013). Suaugę helmintai dažniausiai nesukelia išorinių pakitimų. Jie dažniausiai atsitiktinai aptinkami poodiniuose audiniuose, įvairiose kūno vietose, chirurginių operacijų metu arba gaišenų skrodimo metu. Mirštantys ir degeneruojantys suaugę helmintai gali sukelti specifines organizmo imunines reakcijas, kuomet susidaro skausmingos granuliomos, kurios būna matomos ir juntamos išoriškai (Rocconi et al., 2012). Suaugę D. repens helmintai šuns

18 organizme gali išgyventi iki 10 metų (vidutiniškai 4 metus) ir visą gyvenimo laikotarpį patelės į kraujotaką išskiria mikrofiliarijas (Genchi and Kramer, 2017).

Žmonėms, kaip ir šunims, infekcinės stadijos lervos (L3) patenka į organizmą uodo įkandimo metu, tačiau dažniausiai jos miršta nepradėjusios vystytis (Pampiglione and Rivasi, 2000). Retais atvejais lervos pradeda vystytis, bet nepasiekia lytinės brandos. Tokio vystymosi priežastys nėra žinomos (Capelli et al., 2018). Nustatyti tik pavieniai atvejai, kuomet helmintai pasiekia lytinę vystymosi brandą ir produkuoja mikrofiliarijas (Petrocheilou et al., 1998; Pampiglione et al., 2001). Žmonėse besivystantis nematodas gali migruoti poodiniuose audiniuose nuo kelių savaičių iki kelių mėnesių, dažniausiai nesukeldamas ryškių simptomų. Retais atvejais sukelia niežulį ir odos sudirginimą (de Vries et al., 2003; Poppert et al., 2009; Popescu et al., 2012). Vystymosi eigoje nematodas gali migruoti į akies sritį ir po akies obuolio jungine sudaryti cistą (Sassi et al., 2006; Beden et al., 2007; Fallah Tafti et al., 2010; Otranto and Eberhard, 2011; Borkowski et al., 2015). Nematodai, kurie yra randami akies srityje, pašalinami chirurginiu būdu be didelių pažeidimų, tačiau retais atvejai tokio tipo infekcija gali sukelti glaukomą, uveitą, tinklainės atsidalijimą ir apakimą (Gorezis et al., 2006; Fodor et al., 2009; Kirillov et al., 2011; Ilyasov et al., 2015). Nustojęs migruoti helmintas sudaro apie centimetro diametro mazgelį odoje arba poodiniuose audiniuose įvairiose kūno vietose. Helmintai žmogaus organizme gali išgyventi nuo 12 iki 18 mėnesių (Logar et al., 2001; Pampiglione et al., 2001; Marušić et al., 2008; Tasić et al., 2011; Matějů et al., 2016).

1.2.6. Šunų širdies kirminų liga (D. immitis)

Šunų širdies kirminų liga (D. immitis), skirtingai negu poodinė dirofiliariozė, sukelia sunkius pažeidimus organizme. Tokie pažeidimai dažniausiai turi įtakos letaliai ligos baigčiai, jeigu nesuteikiamas tinkamas gydymas ankstyvose ligos stadijose (McCall et al., 2008b). Nepilnai subrendę 2,5–3,5 cm ilgio helmintai 90–120 d. p. i. migruoja į smulkiąsias plaučių arterijas ir besivystydami užauga iki 25–30 cm ilgio, patenka į stambesnes plaučių arterijas, dešinės pusės prieširdį ir skilvelį (4 pav.) (Rawlings, 1980). Patogenezė yra susijusi su helmintų invazijos dydžiu ir šuns veislės dydžiu.

4 pav. Suaugę D. immitis šuns dešiniajame širdies skilvelyje skrodimo metu (Simón et al., 2012) Fig. 4. Adult D. immitis in the right ventricle of a dog during necropsy (Simón et al., 2012)

Mažų veislių šunyse nedidelis kiekis nematodų (<5 helmintai) dažniausiai lokalizuojasi tik plaučių arterijose. Esant didesnei invazijai (>40 helmintų), nematodai, patekę į širdies dešinį prieširdį, skilvelį ir tuščiąją veną (vena cava), sukelia kraujagyslių emboliją. Tokia patogenezė gali sukelti tuščiosios venos sindromą (Ishihara et al., 1978; Nelson et al., 2014). Helmintai dirgindami kraujagysles sukelia endotelio pažeidimus (Kaiser et al., 1989; Simón et al., 2012). Kraujagyslės deformuojasi, susiaurėja jų diametras ir padidėja pralaidumas. Dėl šių veiksnių vystosi plaučių intersticiniai audinių pažeidimai, plaučių edema, širdies hipertrofinė arba diletacinė kardiomiopatija. Išsivysčius kardiovaskuliniam nepakankamumui gali vystytis dauginis organų nepakankamumas. Nesuteikus tinkamo gydymo ankstyvose ligos stadijose, ligos baigtis dažniausiai letali (Kaiser et al., 1989; Simón et al., 2012).

1.2.7. Dirofiliariozės diagnostikos metodai

Lietuvoje labiausiai paplitusių ektoparazitų platinamų patogenų sukeliamas ligas šunims (A. phagocytophilum, Dirofilaria spp., B. canis) (Radzijevskaja et al., 2008; Paulauskas et al., 2012, 2014) dauguma atvejų galima nustatyti kraujo mikroskopijos metodais. Dirofiliariozės nustatymui naudojami serologiniai, mikroskopiniai, morfologiniai ir molekuliniai tyrimo metodai. Modifikuotasis Knoto testas (angl. modified Knott’s test) lervinių stadijų nustatymui yra pakankamai jautrus, nes tyrimo metu mikrofiliarijos yra sukoncentruojamos sedimentacijos būdu ir nustatomos mikroskopu (Newton and Wright, 1956). Šis metodas labai populiarus dėl mažos savikainos, greito atlikimo būdo ir aukšto jautrumo. Dažnai veterinarijos gydytojų

20 praktikoje naudojamas citomorfologinis kraujo tyrimas, kuris yra mažiau jautrus už modifikuotą Knoto testą (Rosenblatt, 2009). Šiais metodais sudėtinga nustatyti patogeno rūšį, o tai labai svarbu norint pritaikyti tinkamą gydymą ir prognozuoti ligos eigą. Pastaruoju metu vis dažniau naudojamas rūgštinės fosfatazės lervučių dažymo metodas (histocheminis), padedantis lengviau nustatyti lervų rūšį, tačiau tyrimui atlikti reikalingas labiau apmokytas personalas ir užtrunka ilgesnį laiką. Mikrofiliarijų aptikimo kraujyje tikimybė yra priklausoma nuo aplinkos temperatūros, metų ir paros laiko, dėl specifiško mikrofiliarijų migravimo iš periferinės kraujotakos į centrinę ir atvirkščiai (Di Cesare et al., 2013; Ionică et al., 2017). Suaugusius helmintus galima identifikuoti pagal morfologinius požymius, ruošiant helmintų preparatus naudojant laktofenolį arba gliceriną (Seinhorst, 1959). Širdies kirminų ligos nustatymui yra sukurti komerciniai serologiniai rinkiniai, paremti ELISA principu (angl. Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Taikant šį metodą galima nustatyti D. immitis rūšies patelių išskiriamus antigenus (O’Connor, 2015). Metodas patogus ir greitai atliekamas (trukmė 45 minutės), tačiau dažnai pasitaiko kryžminės reakcijos (gaunami klaidingai teigiami rezultatai) (Schnyder and Deplazes, 2012). Molekuliniai metodai (pvz.: PGR) yra jautriausia diagnostikos priemonė, galinti aptikti patogeną esant mažai jo invazijai ir tiksliai identifikuoti patogeno rūšį. DNR galima išskirti iš suaugusių helmintų, užsikrėtusių šunų kraujyje esančių mikrofiliarijų ir uodų. Dirofiliariozės molekulinėje diagnostikoje ir dirofiliarijų rūšies identifikacijai dažniausiai naudojami mitochondrinės DNR (mtDNR) citochromo c oksidazės pirmojo subvieneto (COI), 12S ribosominės RNR (rRNR) ir ITS-2 regiono žymenys (Rishniw et al., 2006; Gioia et al., 2010; Traversa et al., 2010; Latrofa et al., 2012; Albonico et al., 2014). ITS-2 regiono žymenys buvo pritaikyti šešių rūšių filiarijų identifikavimui (D. repens, D. immitis, Acanthocheilonema reconditum (Grassi, 1890), Acanthocheilonema dracunculoides (Cobbold, 1870), Brugia pahangi (Buckley & Edeson, 1956) ir Brugia malayi (S.L. Brug, 1927)) (Rishniw et al., 2006). Plačiausiai paplitusiu D. repens ir D. immitis parazitų aptikimui naudojami rūšiai specifiniai mtDNR COI geno žymenys (Rishniw et al., 2006; Albonico et al., 2014). Molekuliniai metodai yra jautresni ir tikslesni, tačiau atlikimui reikalingas specializuotas personalas ir įranga. Žmonėms dirofiliariozė diagnozuojama aptikus helmintus poodiniuose audiniuose arba po akies jungine (D. repens) ir mazgeliuose, susidariusiuose plaučių audinyje (D. immitis) (Capelli et al., 2018).

1.2.8. Dirofiliariozės gydymas ir prevencija

Dauguma šunų poodinės dirofiliariozės (D. repens) gydymo protokolų naudojami remiantis širdies kirminų ligos gydymo patirtimi (Capelli et al., 2018). Atsižvelgiant į tai, kad

21 poodinės dirofiliariozės atveju suaugę helmintai nesukelia stiprių organizmo pažeidimų, veterinarijos gydytojai dažniau naudoja makrociklinius laktonus, kurie veikia mikrofiliarijas, bet neveikia suaugusių kirminų (Capelli et al., 2018). Atlikus eksperimentą su dirbtinai užkrėstais šunimis buvo pastebėta, kad antibiotikas doksiciklinas, naudojamas kartu su ivermektinu (makrociklinis laktonas), sustiprina mikrofiliarijas naikinantį poveikį. Toks poveikis gali būti paaiškinamas tuo, kad doksiciklinas veikia dirofiliarijų endosimbiotines bakterijas – Wolbachia, kurios yra susijusios su helmintų vystymusi (Giannelli et al., 2013). Vienintelis patvirtintas medikamentas, veikiantis visas D. repens vystymosi stadijas, yra moksidektino ir imidakloprido darinys, gaminamas tirštos konsistencijos tirpalo pagrindu ir lašinamas šunims ant odos kas mėnesį, šešis mėnesius iš eilės (Genchi et al., 2013). Šunų širdies kirminų (D. immitis) ligos, gydymo rekomendacijos plačiai aprašytos Amerikos Širdies Kirminų asociacijos sudarytose gairėse (angl. American Heartworm Society guideline) (Nelson et al., 2014). Šios ligos gydymas susideda iš kelių etapų. Pirmus du mėnesius naudojami medikamentai, mikrofiliarijų (makrocikliniai laktonai) ir Wolbachia endosimbiotinių bakterijų (doksiciklinas) sunaikinimui. Vėliau naudojamai medikamentai, kurie sunaikina suaugusį D. immitis nematodą (angl. adulticide). Dėl mirštančių lervinių stadijų gali išsivystyti imuninės reakcijos (anafilaksija), todėl papildomai naudojami steroidiniai vaistai (gliukokortikoidai) nuo uždegimo (Nelson et al., 2014). Esant didelei suaugusių helmintų invazijai ir pasireiškus tuščiosios venos sindromui (angl. vena cava syndrome), medikamentinis gydymas gali būti neefektyvus dėl mirštančių nematodų sukeliamų kraujagyslių embolijų ir organizmo imuninių reakcijų. Pasireiškus tuščiosios venos sindromui gyvūnas gali nugaišti per keletą dienų. Tokiu atveju suaugę nematodai šalinami taikant chirurginę techniką. Specialiais instrumentais per jungo veną (5 pav.) patenkama į širdies dešinį prieširdį ir skilvelį, nematodai suimami instrumentu ir pašalinami. Pašalinti visų helmintų šiuo metodu dažniausiai nepavyksta, todėl po chirurginės procedūros taikomas anksčiau aprašytas medikamentinis gydymas (Ishihara et al., 1988; Alho et al., 2016). Dirofiliariozės prevencijai populiariausi preparatai yra tokie, kurių sudėtyje yra makrocikliniai laktonai. Pastarąjį dešimtmetį sukurti universalūs preparatai, veikiantys daugelio ektoparazitų, žarnyno nematodų ir dirofiliarijų lervines stadijas (Abbate et al., 2018; Capelli et al., 2018).

5 pav. Suaugusių D. immitis nematodų šalinimas chirurginiu būdu per jungo veną (balta plonesnė rodyklė) specialiais instrumentais (balta rodyklė) (a); specialus instrumentas naudojamas sugriebti helmintams (b) (Lee et al., 2008) Fig. 5. Surgical removal of heartworm via jugular vein (white thin arrow) using removal devices (white arrow) (a); Endoscopic grasping forceps (b) (Lee et al., 2008)

1.2.9. Wolbachia endosimbiotinės bakterijos biologinė reikšmė dirofiliarijų vystymuisi ir patogenezei

Wolbachia genties bakterijos pirmą kartą buvo nustatytos D. immitis rūšies parazituose ir po kelių dešimtmečių buvo priskirtos Rickettsiales būriui. Šios bakterijos prisitaikiusios gyventi kitų organizmų ląstelėse ir sudaro simbiotinius ryšius. Wolbachia endosimbiotinės bakterijos aptinkamos ne tik helmintų, bet ir nariuotakojų ląstelėse (šešiakojų vabzdžių, vėžiagyvių) (Sironi et al., 1995; Casiraghi et al., 2001; Fenn and Blaxter, 2006). Nustatyta, kad šios bakterijos dalyvauja dirofiliarijų vystymosi cikle, mikrofiliarijų reprodukcijoje ir yra randamos visose helmintų vystymosi stadijose. Helmintų ląstelių išskiriamos aminorūgštys prisideda prie šių bakterijų dauginimosi (Bandi et al., 2001; Foster et al., 2005). Pastaraisiais dešimtmečiais atlikti tyrimai parodė, kad Wolbachia genties bakterijos turi įtakos dirofiliarijų patogenezei (Bouchery et al., 2013). Wolbachia paviršiaus baltymas sukelia galutinio šeimininko specifinių imunoglobulinų (IgG) produkciją. Toks imuninis atsakas turi įtakos uždegiminiams procesams inkstuose ir plaučių audiniuose (Kramer et al., 2005). Šios bakterijos yra jautrios antibiotikui doksiciklinui. Naudojant antibiotikus šunims, užsikrėtusiems dirofiliarioze, nustatytas ženklus mikrofiliarijų sumažėjimas gydymo laikotarpyje, o L4 ir L5 stadijų lervas antibiotikai visiškai sunaikina (Bazzocchi et al., 2008). Eksperimento metu dirbtinai užkrėstuose uoduose, taikant antibiotikus, lervos išsivystė iki infekcinės stadijos, tačiau jos, patekusios į galutinį šeimininką, nepasiekė lytinės brandos (McCall et al., 2008a, 2014).

Tikslus poodinės dirofiliariozės ir širdies kirminų paplitimas Europoje nėra žinomas, ypač rytų, šiaurės rytų regionuose, taip pat ir Lietuvoje. Skirtingos šių nematodų rūšys sukelia skirtingo patogeniškumo infekcijas žmonėms ir šunims. Paplitimo nustatymą ir rūšies

23 identifikavimą šiuose regionuose riboja visuomenės ir veterinarijos gydytojų kompetencijos stoka šių naujų ligų atžvilgiu. Lietuvoje dirofiliariozės ligą sukeliančių nematodų rūšis nėra žinoma, o rūšies nustatymas yra esminis faktorius, lemiantis tinkamą prevencijos ir gydymo strategijos pasirinkimą. Šių parazitų vystymosi ciklo išmanymas ir gebėjimas pritaikyti diagnostikos metodus yra esminiai faktoriai, galintys padėti įvertinti realų paplitimą Rytiniuose Europos regionuose ir Lietuvoje.

1.3. Šunų babeziozė

1.3.1. Babezijų biologinė klasifikacija

Babeziozę sukelia patogenai, kurie dauginasi eritrocituose ir yra priskiriami pirmuonių karalystei, Apicomplexa tipui, Aconoidasida klasei, Piroplasmidia būriui, Babesiidae šeimai, Babesia genčiai (Neitz, 1956; Uilenberg, 2006). Šiuo metu pasaulyje identifikuota daugybė skirtingų babezijų rūšių, kurios sukelia ligas skirtingiems organizmams: Babesia divergens (M'Fadyean & Stockman, 1911) ir Babesia bovis (Babes, 1888) – galvijams, Babesia ovis (Babes, 1888) – avims, B. divergens, Babesia microti (Franca, 1912) – žmonėms (Hunfeld et al., 2008; Krause, 2019). Šunų babeziozę dažniausiai sukelia dviejų tipų babezijų rūšys: B. canis didžiosios piroplazmos (3–5 μm) ir Babesia gibsoni (Paton, 1910) mažosios piroplazmos (1–3 μm) (Adaszek et al., 2011). Anksčiau buvo išskiriami trys B. canis porūšiai: Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi ir Babesia canis canis. Dabar šie porūšiai išskiriami į tris skirtingas rūšis – Babesia rossi, B. canis ir Babesia vogeli (Solano-Gallego and Baneth, 2011).

1.3.2. Babesia spp. vektoriai ir paplitimas

Babeziozės rūšių paplitimas yra priklausomas nuo tinkamo vektoriaus paplitimo (Solano- Gallego et al., 2016). D. reticulatus rūšies erkės yra pagrindinis B. canis patogenų vektorius, paplitęs visoje Lietuvos teritorijoje. Šios erkės prisitaikiusios išgyventi drėgnesnio ir vėsesnio klimato zonose (Mehlhorn et al., 1980; Petney et al., 2012). Gali išlikti teritorijose, kuriose būdingos šaltos žiemos, o didžiausias aktyvumas pasireiškia pavasario ir rudens laikotarpiu (Solano-Gallego et al., 2016). Lietuvoje paplitusios D. reticulatus erkės daro įtaką B. canis paplitimui šioje šalyje (Paulauskas et al., 2015). Rhipicephalus sanguineus (s.l.) (Latreille, 1806) erkės yra pagrindinis vektorius, platinantis B. vogeli rūšies patogenus Europoje (René et al., 2012). Šios erkės labiau prisitaikiusios gyventi šilto ir karšto klimato zonose, Viduržemio jūros regione ir centrinės Europos dalyse, tačiau yra aptinkamos ir Britų salyne (Hansford et al., 2014; Solano-Gallego et al., 2016). Manoma, kad šios erkės gali pernešti ir B. gibsoni rūšies patogenus, tačiau dauguma

24 publikacijų aprašo šios rūšies patogenų pernašą – įkandimo, kraujo transfuzijos metu ir transplacentiniu būdu (Stegeman et al., 2003; Fukumoto et al., 2005; Jefferies et al., 2007b). Šalyse, kuriose šunų kovos nėra uždraustos (Azijoje), ir šalyse, kuriose vyksta nelegalios šunų kovos, kovinių veislių šunų užsikrėtimas B. gibsoni patogenais yra gerokai didesnis (Birkenheuer et al., 2005; Jefferies et al., 2007b; Irwin, 2009; Yeagley et al., 2009). B. gibsoni rūšies patogenai plačiai paplitę ir Europoje (Hartelt et al., 2007; Trotta et al., 2009; Víchová et al., 2016). Skirtingų Babesia spp. rūšių paplitimas Europoje pavaizduotas 6 paveiksle.

6 pav. Skirtingų Babesia spp. (B. canis, B. vogeli, B. vulpes (syn. B. microti – like), B. gibsoni) rūšių patogenų paplitimas Europoje. Žemėlapis sudarytas remiantis publikacijomis, kuriose patogenai nustatyti taikant PGR metodus (Solano-Gallego and Baneth, 2011; Solano-Gallego et al., 2016) Fig. 6. The distribution of canine Babesia species in Europe based mainly on molecular analysis (Solano-Gallego and Baneth, 2011; Solano-Gallego et al., 2016)

Babesia microti – like (Theileria annae) pirmą kartą, daugiau nei prieš 10 metų, buvo nustatyta Ispanijoje (Camacho et al., 2001). Tikslus vektorius nėra žinomas, tačiau manoma, kad Ixodes genties erkės gali potencialiai pernešti šį patogeną (Camacho et al., 2003; Najm et al., 2014). Pietų Europoje, sparčiai kintant B. microti – like geografiniam paplitimui, patogenas vis dažniau sutinkamas naujuose regionuose (Beck et al., 2009; Falkenö et al., 2013; Gabrielli et al., 2015; Miró et al., 2015). Portugalijoje pirmą kartą patvirtintas dviejų šunų užsikrėtimo B. microti – like atvejis (Simes et al., 2011). Iš veterinarijos klinikų buvo gauta informacija apie galimus šunų užsikrėtimo B. gibsoni atvejus Lietuvoje (rasti maži intarpai eritrocituose būdingi rūšiai), tačiau ištyrus kraujo mėginius jautresniais metodais informacija nepasitvirtino (Paulauskas et al., 2014). Nustatyta, kad mūsų

šalyje dominuoja užsikrėtimas B. canis patogenais (Paulauskas et al., 2014; Radzijevskaja et al., 2018).

1.3.3. B. canis vystymosi ciklas

Babesia genties pirmuonys vystosi skirtinguose šeimininkuose. Bestuburiuose (erkėse) šie pirmuonys gali daugintis lytiniu ir nelytiniu būdu, o stuburiniuose žinduoliuose dauginasi nelytiniu būdu (Mehlhorn and Schein, 1985; Irwin, 2010). Gametogonija vyksta erkių žarnyne (lytinis dauginimasis), sporogonija vyksta seilių liaukose (nelytinis dauginimasis) ir merogonija žinduolių eritrocituose (nelytinis dauginimasis). Į žinduolių kraujotaką B. canis patenka su erkių išskiriamomis seilėmis maitinimosi krauju metu. Dažniausiai infekcija pernešama praėjus 46–70 valandų nuo įsisiurbimo pradžios (Piesman et al., 1987; Jalovecka et al., 2018). Į organizmą patekę sporozoitai endocitozės būdu prasiskverbia į eritrocitus arba limfocitus (priklausomai nuo rūšies). Sporozoitai virsta į merozoitus ir išsilaisvina iš ląstelės ją suardydami. Merozoitai patenka į kitus eritrocitus, kur virsta trofozoitais ir dalijasi į dvi, kartais į keturias dalis. Šioje dauginimosi stadijoje susidaro daug merozoitų, kurie suardo ląstelę (Mehlhorn and Schein, 1985; Irwin, 2010; Jalovecka et al., 2018). Ląstelės suirimo metu išsiskiria hemoglobinas, kuris šalinasi per inkstus ir šlapimą nudažo ruda spalva (hemoglobinurija) (Solano-Gallego et al., 2008). B. canis parazitai erkėse dauginasi nelytiniu (seilių liaukose) ir lytiniu būdu (žarnyne) (Mehlhorn and Schein, 1985; Jalovecka et al., 2018). Parazitai gali būti pernešami kitiems žinduoliams per erkių seiles įsisiurbimo ir maitinimosi metu. Erkėse Babesia pirmuonys gali būti perduodami transovariniu (nuo patelės lervoms) ir transtadiniu būdu (lervos-nimfos- suaugėliai). Toks vertikalus parazito perdavimo būdas lemia greitesnį ligos paplitimą (Boldbaatar et al., 2008, 2010). Pirmuonys erkės įsisiurbimo metu patenka į žarnyną, kuriame susiformuoja zigota. Zigotos viduje esančioje vakuolėje vystosi smailią formą turintys judrūs kūneliai (Strahlenkörper; angl. ray bodys) (Rudzinska et al., 1983b). Smailios formos dėka zigota patenka į žarnyno gleivinės ląsteles, per kurias nukeliauja į seilių liaukas (Rudzinska et al., 1983a). Seilių liaukose susidaro sporoblastai, kurie gali produkuoti nuo 5000 iki 10 000 sporozoitų (Karakashian et al., 1983). Tam, kad patogenų vystymasis nesustotų, erkės turi kelis kartus maitintis žinduolių krauju, todėl vystymosi laikas priklauso nuo erkės aktyvumo bei maitinimosi laiko ant skirtingų žinduolių (gali užtrukti nuo kelių dienų iki kelių mėnesių) (Jalovecka et al., 2018).

1.3.4. Babeziozės patogenezė

Babeziozės inkubacinis periodas gali trukti nuo kelių dienų iki kelių savaičių (Matijatko et al., 2012). Tai priklauso nuo patogenų rūšies ir padermės virulentiškumo, šuns amžiaus, imuninės sistemos bei bendros šuns sveikatos būklės (Imre et al., 2013). B. canis patogenų sukelta infekcija pasižymi ūmia ligos eiga ir pasireiškia per 1–2 savaites nuo erkės įsisiurbimo (Eichenberger, 2016). Išskiriamos komplikuota bei nekomplikuota šunų babeziozės formos (Matijatko et al., 2012). Atlikti tyrimai rodo, kad pasveikę gyvūnai gali likti babeziozės nešiotojais (Conrad et al., 1991; Jefferies et al., 2007c). Nekomplikuotos šunų babeziozės pagrindinis požymis – hemolizinė anemija (Murase and Maede, 1990; Jacobson, 2006; Matijatko et al., 2012). Tai procesas, kurio metu vyksta pirmuonių sukeltas eritrocitų ardymas – intravaskulinė hemolizė. Eritrocitai, paveikti pirmuonių, įgyja antigeninių savybių, todėl retikuloendotelinė sistema (blužnyje ir kepenyse) sukelia eritrofagocitozę – ekstravaskulinę hemolizę. Hemolizės metu į kraujotaką išsiskiria hemoglobinas ir nekonjuguotas bilirubinas. Nauji eritrocitai pasigamina lėčiau nei suardomi, todėl organizme stebimas eritrocitų skaičiaus mažėjimas (Solano-Gallego and Baneth, 2011). Manoma, kad ligos eiga ir mažakraujystės sunkumas nepriklauso nuo užkrėstų eritrocitų skaičiaus (Jacobson et al., 1996; Furlanello et al., 2005). Ligos sunkumas ir komplikacijų pasireiškimo rizika yra siejama su patogeno padermėmis ir organizmo uždegiminio atsako stiprumu (Bourdoiseau, 2006; Matijatko et al., 2007; Schetters et al., 2009). Pagrindiniai klinikiniai simptomai: karščiavimas, vangumas, apetito sumažėjimas, splenomegalija, tachikardija, hemoglobinurija (hemoglobinas šlapime), gleivinių blyškumas/gelta (dėl nekonjuguoto bilirubino) (Schoeman, 2009). Taikant gydymą dauguma šunų pasveiksta ir simptomai dingsta per 1–2 savaites nuo gydymo pradžios (Solano-Gallego et al., 2016). Neretai pasireiškia komplikacijos (1–20 %), kurių sukelti organizmo pažeidimai dažnai nulemia letalią ligos baigtį (Martinod et al., 1986; Cardoso et al., 2008). Pastebėta, kad komplikuotos babeziozės atveju vykstantys patologiniai procesai yra panašūs į sepsį; pasireiškia sisteminis uždegiminio atsako sindromas, sukeliantis dauginį organų nepakankamumą (Welzl et al., 2001; Schetters et al., 2009).

1.3.5. Babeziozės diagnostikos metodai

Šunų babeziozės diagnostikai yra naudojami mikroskopiniai, serologiniai ir molekuliniai tyrimo metodai. Citomorfologinis (mikroskopinis) kraujo tyrimas yra populiariausias veterinarinėje medicinoje dėl žemos savikainos, greito atlikimo ir aukšto jautrumo (Irwin, 2009). Stebint pro mikroskopą Gimzos – Romanovskio dažais nudažytą kraujo tepinėlį (angl. blood smear) matomi

27 rausvos spalvos eritrocitai, kuriuose įsiterpę melsvos spalvos merozoitai (Rosenblatt, 2009). Kraujo tepinėlio paruošimo kokybė, atliekančio asmens patirtis bei užkrėstų eritrocitų skaičius turi įtakos tyrimo tikslumui. Dažni klaidingai teigiami arba klaidingai neigiami tyrimo rezultatai (Irwin, 2009). Imunofluorescensinio antikūnų tyrimo (IFAT) metu galima diagnozuoti babeziozę dar nesant klinikiniams požymiams (Anderson et al., 1980; Levy et al., 1987). Metodas paremtas antikūno ir antigeno sąveika, kurios vizualizavimui naudojami fluorescensiniai žymenys (Kubelová et al., 2013). Vertinant tyrimo rezultatus dažnai pasitaiko kryžminės reakcijos ir sudėtinga nustatyti, ar pacientas sirgo, ar serga šiuo metu (Aboge et al., 2007; Irwin, 2009). Tobulėjant Babesia genties patogenų diagnostikai, pastaruoju metu vis dažniau taikomas polimerazės grandininės reakcijos metodas (PGR) (Adaszek and Winiarczyk, 2008). PGR metodas itin naudingas tuomet, kai stebima silpna parazitemija ir kraujo tepinėlio rezultatai neparodo užsikrėtimo Babesia genties patogenais. Molekulinių tyrimų dėka patogenai gali būti aptinkami kraujyje, nespėjus pasireikšti pirmiesiems klinikiniams babeziozės simptomams. Babeziozės diagnostikoje ir sukėlėjo rūšies identifikavimui dažniausiai naudojami branduolio ribosominės RNR (18S, 5.8S, 28S) ir du vidinio transkribuojamo tarpiklio regiono (ITS-1, ITS-2) molekuliniai žymenys (Zahler et al., 1998; Carret et al., 1999; Birkenheuer et al., 2003). Dažniausiai norint identifikuoti užsikrėtimą Babesia genties pirmuonimis, PGR metu yra gausinamas 18S rRNR geno fragmentas (Carret et al., 1999; Adaszek and Winiarczyk, 2008; Carcy et al., 2015). Vienas iš plačiai taikomų molekulinės diagnostikos metodų yra restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas (RFIP). Tai informatyvus ir patikimas metodas, kuris leidžia identifikuoti Babesia rūšis ir B. canis genotipus (Jefferies et al., 2007a). RFIP metodas vertinamas dėl atlikimo trukmės, rūšies ar genotipų identifikavimui sekoskaita nėra būtina (Solano–Gallego et al., 2008).

1.3.6. Babezijų genetinė įvairovė ir padermių nustatymas

B. canis rūšies ir genotipų identifikavimui dažnai naudojamas18S rRNR genas (Zahler et al., 1998; Birkenheuer et al., 2003; Adaszek and Winiarczyk, 2008; Solano-Gallego et al., 2008; Cardoso et al., 2010; Soares et al., 2011). 18S rRNR genas – vienas iš svarbiausių molekulinių žymenų, kuris naudojamas eukariotų sistematikoje. Šis genas pasižymi konservatyvumu tarp eukariotų taksonominių grupių, ir tai sudaro galimybę naudoti universalius pradmenis. Pasikartojantis konservatyvių regionų išsidėstymas rRNR suteikia itin didelius DNR kiekius, reikalingus PGR, net ir mažuose mikroorganizmuose (Meyer et al., 2010). Pritaikant polimerazinės grandininės reakcijos, restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmo metodą (PGR-RFIP) galima karpyti amplifikuotus fragmentus, naudojant restrikcijos fermentus ir tokiu

28 būdu identifikuoti Babesia rūšis ir padermes. Lenkijoje atliktas PGR-RFLP tyrimas išskyrė du B. canis genotipus pagal 18S rRNR geną (Adaszek and Winiarczyk, 2008). Sekoskaitos rezultatai patvirtino heterogeniškumą tarp A ir B genotipų pagal GA→AG nukleotidų inversiją 610-611 pozicijose (viso 18S rRNR geno) (Adaszek and Winiarczyk, 2008). Manoma, kad pagal 18S rRNR geną B. canis B genotipas yra virulentiškesnis nei A genotipas. B genotipo patogenais užsikrėtusiems šunims pasireiškė labiau išreikšta trombocitopenija (trombocitų kiekio sumažėjimas) (Adaszek et al., 2009). Analizuojant babezijų genetinę įvairovę buvo pastebėta, kad 18S rRNR genas nėra tinkamiausias nustatant rūšies genetinę įvairovę. 18S rRNR genas yra santykinai konservatyvus tarp skirtingų rūšies padermių (Jefferies et al., 2007a; Duarte et al., 2008). Pastarąjį dešimtmetį babezijų padermių genetiniuose tyrimuose naudojami Bc28 multigeninės šeimos genai (Carcy et al., 2006). Šie genai yra santykinai konservatyvūs, tačiau skirtingi 3' galuose, ir tai leidžia modeliuoti skirtingus pradmenis. Bc28.1 genas naudojamas kaip genetinis žymuo analizuojant babezijų padermių genetinę įvairovę bei atliekant vakcinos veiksmingumo nustatymo tyrimus (Carcy et al., 2015). Šis genas koduoja 28 kDa GPI (glikozil- fosfatidilinozitolis) baltymą, esantį merozoito paviršiuje, darantį įtaką patogeno patekimui į eritrocitus (Yang et al., 2012). Bc28 genų šeimai priskiriami mažiausiai du genai – Bc28.1 ir homologinis Bc28.2. Pagal Bc28.1 geną Europoje šiuo metu aptinkami keturi B. canis genotipai – A, B, 34.01 ir G. Genotipas A nuo genotipo B atsiskiria chromosomos dydžio polimorfizmu. Genotipai 34.01 ir G pagal chromosomos profilį yra identiški, tačiau skiriasi fenotipiškai. Pastebėta, kad genotipo G patogenai agliutinuoja eritrocitus in vitro, o genotipas 34.01 visiškai neagliutinuoja eritrocitų. Identifikuojant B. canis genotipus pagal Bc28.1 geną ištirti 178 šunų kraujo mėginiai iš skirtingų Europos šalių (Carcy et al., 2015). Rezultatai parodė, kad tam tikrų genotipų paplitimas yra skirtingas tarp įvairių Europos regionų. Šiaurės rytų regione mažiau virulentiškas A genotipas (72,1 %) dažniau sutinkamas nei virulentiškesnis B genotipas (27,9 %). Tuo metu pietvakarių Europoje B genotipas (89,7 %) yra dominuojantis lyginant su A genotipu (10,3 %). 34.01 genotipas buvo aptiktas tik Prancūzijoje 26,9 % atvejų (Carcy et al., 2015). Manoma, kad skirtingų B. canis genotipų paplitimas gali priklausyti ir nuo jų vektorių. Genetinis kintamumas aptiktas D. reticulatus mtDNR genuose ir mikrosatelituose parodė, kad egzistuoja genetiškai skirtingos D. reticulatus padermės tam tikruose geografiniuose regionuose, kurios gali būti atsakingos už skirtingų B. canis genotipų perdavimą (Carcy et al., 2015; Kloch et al., 2017; Paulauskas et al., 2018).

1.3.7. Babeziozės gydymas ir prevencija

Babeziozės gydymas susideda iš dviejų etapų: naudojami medikamentai, veikiantys patogenus, ir skiriama simptominė terapija, priklausomai nuo ligos formos ir pasireiškusių simptomų (Solano-Gallego and Baneth, 2011). Simptominio gydymo metu gali būti atliekamos parenterinės fiziologinių tirpalų infuzijos, kraujo transfuzijos, naudojami priešuždegiminiai vaistai (Ayoob et al., 2010). Pirmuonis veikiantys preparatai pasirenkami pagal patogeno rūšį. Didžiųjų piroplazmų (B. canis, B. vogeli, B. rossi) sukeltai infekcijai gydyti naudojamas imidokarbo diproprionatas (Vial and Gorenflot, 2006). Verta pažymėti, kad imidokarbo diproprionatas silpnai veikia mažąsias piroplazmas. Šio medikamento vienkartinė injekcija nuo babeziozės apsaugo iki aštuonių savaičių (Irwin, 2009). Taip pat naudojamas diminazeno aceturatas (diminazene aceturate), kuris veikia ir mažąsias ir didžiąsias piroplazmas, tačiau nėra populiarus dėl galimų šalutinių poveikių (Miller et al., 2012; Han et al., 2014). B. gibsoni rūšies patogenų sukeltai infekcijai gydyti plačiai naudojamas azitromicino ir atovakvono derinys, tačiau gydant šiais vaistais patogenai nėra pilnai sunaikinami ir ligos simptomai gali atsinaujinti, o šunys lieka infekcijos nešiotojais (Matsuu et al., 2004; Jefferies et al., 2007c; Sakuma et al., 2009). Babeziozės prevencijai dažniausiai naudojami akaricidiniai cheminiai junginiai, kurie naudojami išoriškai (permetrinas, amitrazė, fipronilis, imidaklopridas ir kt.) (Last et al., 2007; Berrada and Telford, 2009; Brianti et al., 2010). Komercinių farmacijos kompanijų preparatai gaminami įvairiomis formomis: lašinamų tirpalų, aerozolių, kramtomų tablečių, antkaklių pagrindu. Šie medikamentai pasižymi atbaidančiu ir erkes žudančiu poveikiu ir užkerta kelią patogeno patekimui į organizmą. Šunys babezioze gali užsikrėsti kraujo transfuzijos metu, todėl rekomenduojama atlikti vektorių pernešamų ligų diagnostiką prieš atliekant šią procedūrą (Wardrop et al., 2005). Yra sukurtos vakcinos, tačiau komerciškai jos yra prieinamos tik keliose Europos šalyse (Moreau et al., 1989; Schetters et al., 1995). Atlikti eksperimentai parodė, kad vakcina dalinai apsaugo šunis, užsikrėtusius A genotipo B. canis patogenais, bet neapsaugo nuo B genotipo patogenų (Schetters et al., 1995). Vakcinos sukurtos naudojant vienos arba dviejų patogeno padermių antigenus. Prancūzijoje, naudojant dvivalentę vakciną, efektyvumas buvo 24,6 %. Tai rodo, kad padermių, atsparių vakcinai, yra gerokai daugiau. Siūloma kurti polivalentes vakcinas, įtraukiant naujai aptiktus genotipus (Carcy et al., 2015).

Babeziozę pasaulyje ir Europoje sukelia skirtingų rūšių Babesia genties patogenai. Europoje ir Lietuvoje plačiai paplitę B. canis rūšies patogenai, kurie sukelia gyvybei pavojingą infekciją šunims. Komplikuota šios ligos forma (~ 20 % atvejų) yra sunkiai kontroliuojama,

30 dažniausiai baigiasi letaliai ir tampa rimtu iššūkiu veterinarijos gydytojams. Manoma, kad ligos eiga ir patogenezė priklauso nuo B. canis padermių, o skirtingų padermių antigeniniai skirtumai turi įtakos patogeno atsparumui sukurtai vakcinai. Patogeno genetinės įvairovės ir skirtingų padermių paplitimo nustatymas yra kelias į veiksmingos vakcinos sukūrimą ir komplikuotų susirgimų kontrolę.

1.4. Anaplazmozė

1.4.1. Anaplazmų biologinė klasifikacija

Anaplasma genties bakterijos priklauso Rickettsiales būriui, Anaplasmataceae šeimai (Dumler et al., 2001). Tai viduląstelinės, gramneigiamos bakterijos, dažniausiai parazituojančios gyvūnų ir žmonių kraujo ląstelėse (Dumler et al., 2001). Anaplasma phagocytophilum rūšies bakterijos aptinkamos skirtingose gyvūnų rūšyse. Ehrlichia phagocytophila ir Ehrlichia equi anksčiau buvo išskirtos kaip atskiros bakterijų rūšys, tačiau šiuo metų jos apjungtos į A. phagocytophilum rūšį. Anaplasma spp. bakterijos, aptiktos šunyse, 1982 metais buvo vadinamos E. equi (Sainz et al., 2015). Filogenetinių tyrimų analizė parodė, kad šios rūšys (E. phagocytophila, E. equi) genetiškai identiškos. A. phagocytophilum rūšies bakterijos buvo tapatinamos su Ehrlichia canis (Moshkovski, 1945), kurios parazituoja šunų monocituose. Genetiniai tyrimai parodė ryškius filogenetinius skirtumus ir šios bakterijos (A. phagocytophilum) buvo reklasifikuotos ir priskirtos Anaplasma genčiai (Dumler et al., 2001). Susirgimus šunims gali sukelti dvi Anaplasma genties rūšys: Anaplasma platys ir A. phagocytophilum. A. phagocytophilum rūšies patogenai parazituoja šunų neutrofiluose (granuliocituose) ir sukelia šunų granuliocitinę anaplazmozę (angl. canine granulocytic anaplasmosis), o A. platys (Harvey et al, 1978) parazituoja šunų trombocituose ir sukelia šunų trombocitotrofinę anaplazmozę (angl. canine thrombocytotrophic anaplasmosis). Granuliocitine anaplazmoze gali sirgti žmonės, avys, ožkos, karvės, arkliai, graužikai ir elniai (Groen et al., 2002; Nicholson et al., 2010). Trombocitotrofine anaplazmoze dažniausiai serga šunys, užregistruoti ir keli kačių užsikrėtimo atvejai (Lima et al., 2010; Qurollo et al., 2014).

1.4.2. Anaplasma spp.vektoriai ir paplitimas

Anaplasma spp. patogenų paplitimas yra susijęs su tinkamo vektoriaus patogeno vystymuisi paplitimu (Carrade et al., 2009; Sainz et al., 2015). A. phagocytophilum rūšies bakterijų pagrindinis vektorius yra Ixodes genties erkės: Europoje – Ixodes ricinus, Azijoje – Ixodes persulcatus (Schulze, 1930), Šiaurės Amerikoje – Ixodes scapularis (Say, 1821) ir Ixodes pacificus (Cooley & Kohls, 1943) (Richter et al., 1996; Telford et al., 1996; Cao et al., 2000;

Carrade et al., 2009). I. ricinus erkės yra prisitaikiusios išlikti žemoje temperatūroje ir gali vystytis bei daugintis esant aukštam aplinkos drėgnumui; tai daro įtaką šių erkių paplitimui visoje Europoje (7 pav.), daugiausia centrinėje, šiaurės ir šiaurės rytų dalyse (Jaenson et al., 2012; Sainz et al., 2015).

7 pav. Ixodes ricinus erkių paplitimas Europoje (pakeista pagal EEA, 2017) Fig. 7. Distribution of I. ricinus ticks in Europe (modified by EEA, 2017)

A. platys patogenus pernešantis vektorius Europoje nėra nustatytas, tačiau manoma, kad potencialus vektorius, tinkamas patogeno vystymuisi ir plitimui, yra Rhipicephalus sanguineus rūšies erkės. A. platys patogenų DNR aptinkama Rh. sanguineus erkėse (Sanogo et al., 2003), tačiau nėra duomenų, patvirtinančių, kad šios erkės gali pernešti patogeną (A. platys) kitiems organizmams (Simpson et al., 1991). Gyvūnai ir žmonės šiomis bakterijomis gali užsikrėsti kraujo perpylimo metu, todėl mokslininkai rekomenduoja atlikti diagnostinius tyrimus kraujo donorams prieš atliekant kraujo transfuziją recipientui. Patogenų pernešimas transfuzijos metu būdingas A. platys (Gaunt et al., 2010) ir A. phagocytophilum (Egenvall et al., 1998) patogenams. Granuliocitinė anaplazmozė žmogui pirmą kartą nustatyta ir patvirtinta Jungtinėse Amerikos Valstijose 1994 metais (Bakken et al., 1994). Europoje susirgimai pradėti registruoti nuo 1997 metų (pirmas atvejis Slovėnijoje); nuo to laiko susirgimai užregistruoti Italijoje, Prancūzijoje, Ispanijoje, Kroatijoje, Švedijoje, Norvegijoje, Austrijoje ir Lenkijoje (Parola et al., 2005).

I. ricinus erkės aptinkamos visuose Lietuvos regionuose (Radzijevskaja et al., 2005; Paulauskas et al., 2006, 2009a). A. phagocytophilum DNR buvo nustatyta Lietuvoje I. ricinus (2,9 %; 8/277) ir D. reticulatus (8,0 %; 7/87) erkėse, surinktose skirtinguose Lietuvos regionuose (Paulauskas et al., 2012). Kito tyrimo metu I. ricinus erkių užsikrėtimas A. phagocytophilum rūšies bakterijomis siekė 3,0 % (4/140) (Radzijevskaja et al., 2008). Anaplasma DNR buvo aptikta skirtingų vystymosi stadijų (lervos, nimfos) I. ricinus erkėse, surinktose nuo skirtingų rūšių paukščių Ventės rago ornitologinėje stotyje (Paulauskas et al., 2009b).

1.4.3. A. phagocytophilum vystymosi ciklas ir granuliocitinė anaplazmozė

Skirtingai negu B. canis rūšies pirmuonys Anaplasma genties bakterijos nėra perduodamos skirtingoms erkių vystymosi stadijoms (lervoms ir nimfoms), tačiau erkės lervos ir nimfos stadijose gali užsikrėsti patogenais maitinimosi stuburinių žinduolių krauju metu (Rikihisa, 2011). Erkės turi maitintis krauju ne trumpiau negu 36 – 48 valandas, kad patogenas patektų į žinduolio organizmą (Levin and Fish, 2000). Patogenai, patekę į organizmą, prisijungia prie kraujotakoje cirkuliuojančių neutrofilų (granuliocitų) sienelės per LPS (lipopolisacharidų) receptorius ir į ląstelę patenka fagocitozės būdu (Herron et al., 2000). Susidarius endosomoms, bakterijos išskiria medžiagas, kurios apsaugo endosomas nuo lizės. Bakterijos slopina neutrofilų superoksidazės aniono produkciją ir NADP (nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas) kompleksų susidarymą (Carlyon and Fikrig, 2006). Įprastai neutrofilai kraujotakoje išbūna 10–12 dienų ir keliauja į audinius, tačiau infekuotų neutrofilų sugebėjimas prisijungti (adhezija) prie kraujagyslių endotelio sutrinka (Choi et al., 2003). Tokiu būdų infekuotuose neutrofiluose susidaro morulės, o leukocitai kraujotakoje išlieka ilgiau ir lengviau patenka į erkių organizmą maitinimosi metu (Choi et al., 2003). A. phagocytophilum tiesiogiai nesukelia organizmo audinių pažeidimo, bet gali pažeisti leukocitus, todėl dažnai stebimas neutrofilų kiekio kraujyje sumažėjimas (neutropenija) (Kohn et al., 2008). Dėl leukocitų sumažėjimo gali išsivystyti oportunistinės infekcijos (Staphylococcus aureus, Pasteurella spp., Listeria monocytogenes), kurios gali sukelti letalią ligos baigtį (Foggie, 1956; Overås et al., 1993). Audinių pažeidimus sukelia organizmo uždegiminio atsako į patogeną metu vykstantys procesai (Dumler et al., 2007). Užsikrėtus granuliocitine anaplazmoze, pirmieji simptomai pasireiškia praėjus 1–2 savaitėms, tačiau galimos skirtingos ligos formos, todėl ne visais atvejais pasireiškia klinikinė ligos forma (Egenvall et al., 1998). Pastebimas labai didelis serologiškai teigiamų šunų skaičius, kuriems nepasireiškia jokie klinikiniai simptomai (Jensen et al., 2007). Manoma, kad šunys gali savaime pasveikti arba patogenai gali persistuoti užkrėsto organizmo audiniuose (Egenvall et al., 2000).

Granuliocitinės anaplazmozės klinikiniai simptomai nėra specifiški, būdingi daugumai infekcijų ir labai panašūs į šunų babeziozės metu pasireiškiančius simptomus (Eberts et al., 2011; Sainz et al., 2015). Klasikiniai ligos simptomai yra vangumas, apetito stoka, karščiavimas, splenomegalija (blužnies padidėjimas). Šie simptomai dažniausiai pasireiškia ūmiai (Kohn et al., 2008; Granick et al., 2009). Taip pat aprašomi atvejai, kuomet pasireiškia virškinimo sutrikimai (vėmimas, viduriavimas), limfadenopatija, paviršinis kraujavimas (petechijos, melena, kraujavimas iš nosies) ir šlubavimas (Granick et al., 2009; Mazepa et al., 2014). Spontaniškai pasireiškiančio kraujavimo priežastis yra patogenų sukeliama imuninės kilmės trombocitopenija (antrinė), o šlubavimą gali sukelti patogenų sukeliamas imuninės kilmės neutrofilinis poliartritas (antrinis). Yra užregistruoti pavieniai atvejai, kuomet granuliocitine anaplazmoze sergantiems šunims pasireiškė neurologiniai simptomai (Maretzki et al., 1994; Jäderlund et al., 2009). Klasikinis laboratorinių tyrimų rezultatų vaizdas sergant šia liga yra lengva neregeneruojanti anemija, leukopenija ir žymi trombocitopenija. A. phagocytophilum gali sukelti granuliocitinę anaplazmozę žmonėms, tačiau susirgimai diagnozuojami rečiau negu šunims (Bakken et al., 1994). Praėjus 1–2 savaitėms po užsikrėtimo gali pasireikšti karščiavimas, galvos, nugaros, raumenų skausmai, virškinimo sutrikimai (Parola et al., 2005; Sainz et al., 2015). Naminiai gyvūnai, užsikrėtę I. ricinus erkėmis, gali turėti įtakos žmonių užsikrėtimui. Užkrėstos erkės, esančios naminių gyvūnų kailyje, patenka ant žmogaus odos ir pradeda maitintis, tokiu būdu gali pernešti patogeną (Parola et al., 2005; Sainz et al., 2015).

1.4.4. Granuliocitinės anaplazmozės diagnostika

Granuliocitinę anaplazmozę (A. phagocytophilum) galima nustatyti naudojant serologinius, mikroskopinius ir molekulinius diagnostikos metodus, tačiau šių metodų tikslumas ir jautrumas skiriasi (Carrade et al., 2009; Sainz et al., 2015). Atliekant citomorfologinį kraujo tyrimą, mikroskopu galima nustatyti patogenų morules neutrofilų citoplazmoje. Tikimybė aptikti patogenus mikroskopu klinikine ligos forma sergančių šunų kraujo neutrofiluose siekia ~ 60 % (Kohn et al., 2008). Eksperimento metu dirbtinai užkrėstiems šunims morulės pastebėtos 4 dieną nuo infekcijos ir buvo stebimos 4–8 dienas (Egenvall et al., 2000). A. phagocytophilum parazituoja kraujo neutrofiluose, E. canis – kraujo monocituose, o A. platys – kraujo trombocituose. Mokėjimas atpažinti ląsteles pagal morfologinius požymius gali padėti atpažinti, kokios rūšies patogenais gyvūnas yra užsikrėtęs. Naudojant citomorfologinį kraujo tyrimą galimi klaidingai teigiami rezultatai dėl artefaktų, atsirandančių mėginio paruošimo metu. Tiksliam rūšies identifikavimui rekomenduojama

34 naudoti PGR metodą (Egenvall et al., 2000). Mikroskopinis E. canis ir A. platys morulių vaizdas pavaizduotas 8 paveiksle.

8 pav. E. canis morulė (juoda rodyklė) šuns kraujo monocite (a); A. platys morulė (juoda rodyklė) šunų kraujo trombocite (b) (1000x imersinis padidinimas); Neužkrėstas trombocitas pažymėtas punktyrine rodykle (pakeista pagal Sainz et al., 2015) Fig. 8. Light micosopy view of dogs blood: (a) morula of E. canis in monocyte (black arrow); (b) morula of A. platys in platelet (black arrow) (1000x magnification [oil immersion]); Non-infected platelet marked with dotted arrow (modified by Sainz et al., 2015)

Granuliocitinę anaplazmozę galima nustatyti taikant imunofluorescensinį IFA ir imunofermentinį ELISA metodus (Harrus et al., 2002; Little, 2010). Referentinėse laboratorijose atliekami imunocheminiai tyrimai (serologiniai) gali parodyti specifinių antikūnų kiekį. Pagal šį rodiklį galima įtarti, ar gyvūnas persirgo šia liga, ar šiuo metu serga. ELISA pagrindu sukurti komerciniai greitieji testai, kuriems atlikti nereikalinga specializuota įranga ar personalas (Sainz et al., 2015). Šiuo tyrimu galima aptikti daugelio labiausiai paplitusių vektorių platinamų ligų metu susidariusius specifinius antikūnus (B. burgdorferi, E. canis, A. phagocytophilum ir A. platys) (Goldstein et al., 2014). Greitieji testai gali parodyti tik teigiamą arba neigiamą rezultatą, tačiau nenurodo antikūnų kiekio. Gyvūnų, sirgusių anaplazmoze, antikūnai gali cirkuliuoti keletą mėnesių ar metų, todėl teigiamo antikūnų titro atveju negalima nustatyti, ar gyvūnas infekuotas ir serga ūmia forma, ar persirgo, ar infekcija persistuoja audiniuose (Harrus et al., 1998; Gaunt et al., 2010). Eksperimentų metu nustatyta, kad specifiniai šiai ligai antikūnai susidaro praėjus 8 dienoms ir fiksuojami 2–5 dienos po morulių atsiradimo neutrofiluose, todėl galimi klaidingai neigiami rezultatai (Egenvall et al., 2000). Tyrimų rezultatų interpretaciją taip pat gali apsunkinti kryžminės reakcijos tarp A. phagocytophilum ir A. platys, atliekant imunocheminius tyrimus (Solano-Gallego et al., 2006; Gaunt et al., 2010). Molekulinė granuliocitinės anaplazmozės diagnostika turi daugiau pranašumų lyginant su anksčiau išvardintais metodais (Carrade et al., 2009; Gaunt et al., 2010; Sainz et al., 2015).

Galima nustatyti, ar gyvūnas serga aktyvia infekcija. Tyrimas jautresnis esant mažam kiekiui patogenų ir tais atvejais, kai mikroskopu morulių aptikti neįmanoma. Atlikus tyrimą PGR metodu, visada galima atlikti fragmentų sekoskaitą, kurios metu galima nustatyti tikslią patogeno rūšį (Baneth et al., 2009; Sainz et al., 2015). Taikant lizdinės PGR arba realaus laiko PGR metodus galima aptikti A. phagocytophilum iš kraujo, blužnies ir kaulų čiulpų mėginių (Baneth et al., 2009; Sainz et al., 2015). Anaplasma genties patogenų nustatymui dažnai naudojamas 16S rRNR genas (Egenvall et al., 2000), tačiau jis nėra specifiškas identifikuojant anaplazmų rūšį (Carrade et al., 2009). A. phagocytophilum rūšies patogenų nustatymui įprastai naudojami paviršiaus baltymo msp2 ir msp4 genai (Massung and Slater, 2003; de la Fuente et al., 2008). Naudojant msp2 geną buvo nustatytas sveikų šunų užsikrėtimas A. phagocytophilum patogenais (3,0 %; 7/222) ir šunų, turinčių klinikinius simptomus (37,0 %; 19/51) (Beall et al., 2008). Pakartojus tyrimus po gydymo antibiotikais (doksiciklinu) tuo pačiu metodu, visi mėginiai buvo neigiami (Beall et al., 2008). Dirbtinai užkrėstų šunų Anaplasma genties patogenų DNR PGR metodu buvo aptikta 6–8 dieną iki morulių atsiradimo ir praėjus 3 dienoms po morulių aptikimo kraujyje (Egenvall et al., 1998).

1.4.5. Anaplazmozės gydymas ir prevencija

Šunų granuliocitinė anaplazmozė gydoma antibiotikais, dažniausiai skiriamas 2–3 savaičių doksiciklino gydymo kursas (Sainz et al., 2015). Taip pat nustatytas rifampino ir levofloksacino efektyvumas in vitro prieš A. phagocytophilum rūšies bakterijas (Maurin et al., 2003). Tetraciklinas šunims iki 6 mėnesių amžiaus gali kauptis kaip pigmentas dantyse ir pakeisti jų spalvą, todėl jauniems šunims rekomenduojama naudoti chloramfenikolį (Greene, 2012). Papildomai taikomas simptominis gydymas priklausomai nuo dehidratacijos, anemijos lygio ir kitų parametrų nukrypimų nuo normos (Little, 2010). Karščiavimui slopinti naudojami antipiretiniai medikamentai, o steroidiniai vaistai nuo uždegimo naudojami tais atvejais, kuomet patogenai sukelia imuninės kilmės komplikacijas (artritą, trombocitopeniją). Gyvūno būklės pagerėjimas dažniausiai stebimas po 1–2 parų nuo gydymo pradžios, o ligos prognozė taikant gydymą yra gera, jeigu išlaikomas numatytas gydymo antibiotikais kursas (Kohn et al., 2008; Sainz et al., 2015). Vakcinos nuo šunų granuliocitinės anaplazmozės nėra sukurtos, todėl priemonės, naudojamos apsisaugojimui nuo erkių, aprašytos 1.21 skyriuje, yra efektyviausias būdas užkirsti kelią infekcijos plitimui.

1.5. Ektoparazitų pernešamų patogenų sukeliamos koinfekcijos

Įvairių rūšių vektorių pernešamų patogenų koinfekcijos vis dažniau nustatomos ir aprašomos. Vienas vektorius (dažniausiai – erkės) gali platinti kelių rūšių patogenus, todėl maitinimosi ant šeimininko metu gali perduoti du ar keletą patogenų rūšių vienu metu. Ehrlichia ir Anaplasma patogenų koinfekcijos (Gaunt et al., 2010) yra dažnai nustatomos dėl to, kad šios bakterijos yra pernešamos tais pačiais vektoriais (Sainz et al., 2015). Pastaruoju metu vis daugėja publikacijų apie erkių, uodų ir smėlio musių (angl. sand fly) pernešamų patogenų koinfekcijų atvejus (Cardoso et al., 2010). Keli patogenai viename organizme gali sustiprinti vienas kito patogeniškumą (Grab et al., 2007). Dauguma vektorių pernešamų patogenų sukeliamų ligų sukelia panašius arba vienodus simptomus ir laboratorinių parametrų nukrypimus nuo normos (Sainz et al., 2015), todėl nustatomas vienos rūšies patogenas, o kitas užmaskuojamas pirmojo patogeno klinikinių simptomų. Šie faktoriai komplikuoja susirgimų kontrolę, todėl nustačius vieną infekciją rekomenduojama atlikti kitų galimų infekcijų diagnostiką (Gaunt et al., 2010).

A. phagocytophilum rūšies bakterijos paplitę I. ricinus ir D. reticulatus erkėse, aptinkamose Lietuvos teritorijoje. Atsižvelgiant į publikacijose pateiktus duomenis, akivaizdu, kad žmonių ir šunų anaplazmozės susirgimai Lietuvoje yra galimi. Šunų ir žmonių užsikėtimas šios rūšies bakterijomis Lietuvoje nėra patvirtintas ir aprašytas. Tokie duomenys yra labai svarbūs Lietuvos visuomenės sveikatos atžvilgiu ir reikalingi gydytojams infektologams diferencinėje diagnostikoje. Atsižvelgiant į tai, kad ant šunų parazituoja D. reticulatus erkės, kurios yra B. canis patogenų pernešėjos, ir I. ricinus erkės – A. phagocytophilum pernešėjos, reikalinga įvertinti šunų užsikrėtimą mišriomis infekcijomis tarp šių patogenų.

2. MEDŽIAGA IR METODAI

2.1. Mėginių surinkimas ir laikymas

Kraujo mėginių surinkimo metodika. Kraujo surinkimui buvo naudojamos sterilios vienkartinės priemonės (adatos, švirkštai, pirštinės, mėgintuvėliai). Kraujo paėmimui pasirenkamos geriausiai matomos ir juntamos venos (vena cephalica, vena jugularis arba vena saphena). Iš šunų paimtas kraujas sušvirkščiamas į vakuuminius kraujo surinkimui skirtus mėgintuvėlius (BD Vacutainer) su antikoaguliantu (EDTA). Surinkti kraujo mėginiai transportuojami į laboratoriją ir laikomi 4 °C temperatūroje iki DNR išskyrimo arba saugomi – 20 °C temperatūroje iki tyrimo atlikimo. Šunų kraujo mėginiai buvo surinkti bendradarbiaujant su veterinarijos klinikomis ir gyvūnų prieglaudomis nuo 2013 iki 2018 metų.

Mėginių surinkimas dirofiliariozės tyrimams. Filiarijų rūšies nustatymui ir šunų užsikrėtimo dirofiliariozės sukėlėjais įvertinimui kraujo mėginiai buvo surenkami šiltuoju metų laikotarpiu (pavasarį, vasarą ir rudenį). Mėginiai buvo surinkti iš trijų skirtingų veterinarijos klinikų ir dviejų gyvūnų globos prieglaudų Kaune ir Vilniuje. 2015 metais iš gyvūnų prieglaudose laikomų atsitiktinai parinktų šunų (toliau tekste – prieglaudų šunys) buvo surinkta 100 kraujo mėginių. 2013–2015 metais iš veterinarijos klinikose apsilankiusių atsitiktinai parinktų šunų (toliau tekste – naminiai šunys) buvo surinkta 2180 kraujo mėginių. Mėginių surinkimo žurnale buvo registruojami prieglaudų šunų klinikiniai duomenys (amžius, lytis ir svoris). Filiarijų lervinių stadijų aptikimui kraujyje buvo naudojami mikroskopiniai (citomorfologinis tyrimas ir Knoto testas) ir/ar molekuliniai tyrimo metodai. Filiarijų rūšies identifikavimui buvo atlikta pagausintų fragmentų sekų analizė. 2013–2015 metais buvo surinkti 6 suaugę nematodai. Visi mėginiai surinkti Kaune (veterinarijos klinikoje “Siaurio Šnauceris”). Filiarijų rūšiniam identifikavimui suaugę helmintai buvo surenkami iš šunų poodinių audinių chirurginių operacijų (9 pav.) arba gaišenų skrodimo metu. Pašalinti iš organizmo nematodai buvo patalpinami į 70 % etilo alkoholio tirpalu pripildytus 5–10 ml mėgintuvėlius ir laikomi +4 °C temperatūroje.

9 pav. Suaugęs D. repens nematodas (juoda rodykle) šuns poodiniame audinyje, aptiktas šuns orchiektomijos operacijos metu (autoriaus nuotrauka) Fig. 9. D. repens adult nematode (black arrow) in the canine subcutaneous tissue during orchiectomy (photograph by the author)

Mėginių surinkimas B. canis genetinės įvairovės tyrimams. Šunų kraujo mėginiai buvo gauti iš Panevėžio, Marijampolės, Kėdainių, Vilniaus, Klaipėdos ir dviejų Kauno veterinarijos klinikų Lietuvoje 2016–2018 metais. Šunų, kuriems nustatyta babeziozė, mėginius atrinko veterinarijos gydytojai, atlikę kraujo citomorfologinį tyrimą, naudojamą pirmuonių nustatymui eritrocituose. Mėginių surinkimo vietos ir mėginių skaičius pavaizduoti 10 paveiksle. Iš viso surinkti 149 kraujo mėginiai.

10 pav. Mėginių surinkimo vietos skirtinguose Lietuvos miestuose ir surinktų mėginių skaičius Fig. 10. Sampling locations in different Lithuanian cities and the number of samples collected

Mėginiai naudojami koinfekcijų nustatymui. Mėginiai, kurie buvo surinkti 2013–2015 metais iš veterinarijos klinikose apsilankiusių atsitiktinai parinktų šunų (n=2180), taip pat buvo tiriami užsikrėtimui ektoparazitų pernešamų patogenų sukeliamoms A. phagocytophilum, B. canis ir D. repens koinfekcijoms įvertinti. Citomorfologinis tyrimas buvo naudojamas siekiant aptikti anaplazmų morules neutrofiluose, babezijų merozoitus eritrocituose ir dirofiliarijų mikrofiliarijas. Citomorfologinio tyrimo rezultatų patvirtinimui teigiami mėginiai buvo tiriami naudojant molekulinius metodus. Mėginiai, kurie buvo surinkti B. canis genotipų nustatymui (n=100) 2016–2018 metais, buvo tiriami dėl galimų koinfekcijų su A. phagocytophilum, D. repens ir B. canis patogenais.

Širdies kirminų (D. immitis) atvejis: anamnezė ir klinikiniai duomenys. 2017 metų sausio mėnesį Lietuvių šeima Kadisos mieste (Ispanija) priglaudė valkataujantį penkerių metų Ispanų kurtų (angl. Spanish galgo) veislės šunį. Šuo anksčiau priklausė vietos medžiotojams, bet po priekinės galūnės traumos buvo nebetinkamas medžioti. Šuo svėrė 13 kg (normalus šios veislės svoris 27–29 kg), buvo vangus, netoleravo krūvio. 2018 metų balandžio mėnesį šuo buvo atvežtas į Lietuvą, o gegužės mėn. apsilankė veterinarijos klinikoje Vilniuje. Veterinarijos gydytojams įtarus galimas ektoparazitų platinamas ligas, būdingas pietinėms Europos šalims, kraujo mėginiai buvo išsiųsti į VDU Gamtos mokslų fakultetą, Biologijos katedrą Kaune. Ektoparazitų platinamoms infekcijoms nustatyti buvo atlikti serologiniai mikroskopijos ir molekuliniai diagnostikos tyrimai. Po diagnozės patvirtinimo gyvūnas buvo gydomas Lino veterinarijos klinikoje Klaipėdoje. Prognozės įvertinimui buvo atlikta krūtinės rentgenograma ir kardioechoskopijos tyrimas.

Žmonių dirofiliariozės epidemiologinių duomenų surinkimas. Žmonių dirofiliariozės epidemiologiniai duomenys buvo surinkti bendradarbiaujant su Nacionalinės visuomenės sveikatos priežiūros laboratorija (NVSPL). Šioje laboratorijoje buvo registruojami atvejai apie žmonių susirgimus dirofiliarioze 2011–2018 metais. Skirtinguose Lietuvos miestuose oftolmologai ir chirurgai suaugusius helmintus pašalino iš žmonių poodinių audinių ir akies junginės maišelio. Helmintai buvo siunčiami į NVSPL rūšies identifikavimui. Rūšies patvirtinimui vienas mėginys buvo siunčiamas į Ciuricho universitetą parazitologijos institutą (SCUP).

2.2. Patogenų nustatymo metodai

2.2.1. Serologiniai patogenų nustatymo metodai

Šuns, atvežto iš Ispanijos, kraujo mėginys buvo ištirtas naudojant komercinį serologijos rinkinį SNAP 4Dx Plus (IDEXX Laboratories, Portlandas, JAV) (O’Connor, 2015) pagal gamintojo nurodytą instrukciją. Šiuo metodu galima aptikti D. immitis rūšies suaugusių patelių išskiriamus specifinius antigenus ir nustatyti penkių vektorių pernešamų patogenų (B. burgdorferi, E. canis, E. ewingii, A. phagocytophilum, A. platys) sukeliamas ligas.

2.2.2. Citomorfologinis kraujo tyrimas

Filiarijų lervinių stadijų (toliau tekste – mikrofiliarijos), babezijų merozoitų ir anaplazmų morulių aptikimui buvo taikomas citomorfologinis kraujo tyrimas. Kraujo mėginiai citomorfologiniam tyrimui buvo paruošiami per 24 valandas nuo kraujo surinkimo iš šunų. Ant objektinio stiklelio su specialia pipete užlašinami 6 μl kraujo, o kito objektinio stiklelio briauna užlašintas kraujas užtepamas plonu sluoksniu. Mėginys džiovinamas kambario temperatūroje apie 1 minutę. Išdžiovintas mėginys fiksuojamas metanolyje ir dažomas naudojant komercinį Romanovskio-Gimzos dažymo rinkinį (angl. Diff-quick) pagal gamintojo nurodytą instrukciją. Po dažymo mėginiai gausiai nuplaunami distiliuotu vandeniu. Išdžiovinti mėginiai buvo analizuojami mikroskopu (Leica DM1000) naudojant 100x ir 500x (su imersija) padidinimus (Rosenblatt, 2009).

2.2.3. Modifikuotas Knoto testas

Modifikuotas Knoto testas buvo taikomas mikrofiliarijoms aptikti kraujo mėginiuose, surinktuose iš prieglaudų šunų bei šuns, atvežto iš Ispanijos. Mėgintuvėlyje 1 ml kraujo buvo sumaišomas su 9 ml 2 % formalino. Mėgintuvėlis centrifuguojamas 1500 apsisukimų per minutę greičiu 5 minutes. Viršutinė centrifuguoto mišinio dalis nupilama į atliekų konteinerį, o nuosėdos sumaišomos su 35 μl 0,1 % metileno mėlio dažais. Nuosėdų mišinys (20 μl) lašinamas ant objektinio stiklo, uždengiama dengiamuoju stikleliu. Mėginys analizuojamas mikroskopu 100x padidinimu (Newton and Wright, 1956).

2.2.4. Suaugusių helmintų morfologinis identifikavimas

Laikinųjų preparatų paruošimui buvo atkerpama po 1 cm galvinės ir uodeginės nematodo dalies, kuriose išsidėstę morfologiniam identifikavimui svarbūs organai, o likusioji dalis naudojama molekuliniam identifikavimui. Nematodų laikinieji preparatai buvo ruošiami naudojant 50 % glicerino tirpalą (Rueda, 2008). Preparatai buvo tiriami mikroskopu (Motic

BA400 Tension), daromos helmintų nuotraukos bei atliekami matavimai. Helmintų rūšių apibūdinimui buvo naudojama Manfredi et al. (2007), publikacija.

2.3. Molekulinis patogenų rūšies identifikavimas ir genetinės įvairovės nustatymas

2.3.1. DNR išskyrimas

DNR išskyrimas iš šunų kraujo. Šunų kraujas sumaišomas vortex tipo purtykle. Kraujo mėginys centrifuguojamas, supernatantas nupilamas ir nuosėdos suspenduojamos 200 μl TE buferyje. DNR gryninimas atliekamas pagal (GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification) gamintojo instrukcijas („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). Išskirtos DNR kokybė ir švarumas pamatuojamas naudojant „NanoDrop” spektrofotometrą. Išskirta DNR laikoma -20 °C temperatūroje iki tolimesnio naudojimo.

DNR išskyrimas iš suaugusių nematodų. Nematodai supjaustomi į smulkius gabalėlius, patalpinami į 1,5 ml mėgintuvėlius, įpilama 180 μl lizės buferio. Tyrimas atliekamas naudojant „QIAamp DNA Mini Kit” rinkinį pagal gamintojo nurodytą instrukciją („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). Išskirtos DNR kokybė ir švarumas pamatuojamas naudojant „NanoDrop” spektrofotometrą. Išskirta DNR laikoma -20 °C temperatūroje iki tolimesnio naudojimo.

2.3.2. DNR pagausinimas PGR metodu

Patogenų PGR analizė buvo atlikta su „Mastercycler gradient“ ir “Eppendorf Mastercycler” (Vokietija) amplifikatoriais naudojant septynis skirtingus pradmenis (1 lentelė).

1 lentelė. Pradmenų sekos, amplifikuojamo fragmento dydis (bp – bazių poros) ir genomo regionas Table 1. Primer sequences, fragment size (bp – base pairs) and genomic region Nukleotidų seka Genomo Pradmenys bp Patogenas (5’ o 3’) regionas DIDR-F1 AGTGCGAATTGCAGACGCATTGAG 484 D. repens ITS-2 DIDR-R1 AGCGGGTAATCACGACTGAGTTGA 542 D. immitis DR COI-F1 AGTGTAGAGGGTCAGCCTGAGTTA DR COI-R1 ACAGGCACTGACAATACCAAT COI mtDNR 209 D. repens BABGF2 GTCTTGTAATTGGAATGATGG BABGR2 CCAAAGACTTTGATTTCTCTC 18S rRNR 559 B. canis F281&2a ACTGAGGATGAGAAAAGG-GATAGT R281 GTCCACAACCGCGACGGCGGCAAC Bc28.1 710 B. canis 16SwolbF GAAGATAATGACGGTACTCAC 16SwolbR3 GTCACTGATCCCACTTTAAATAAC 16S rRNR 1018 Wolbachia MAP4AP5 ATGAATTACAGAGAATTGCTTGTAGG msp4 849 A. phagocytophilum MSP4AP3 TTAATTGAAAGCAAATCTTGCTCCTATG msp4f CTATTGGYGGNGCYAGAGT msp4 301 A. phagocytophilum msp4r GTTCATGGAAAATTCCGTGGTA

Skirtingų genų fragmentų amplifikacijai naudojami reagentai, jų kiekiai ir koncentracijos pateikti 2 lentelėje. Amplifikatoriuje naudojamos programos, atliekant skirtingų genų amplifikaciją, pateiktos 3 lentelėje. Dirofilaria spp. ITS-2 regiono ir COI geno amplifikacija. Dirofiliarijų rūšies nustatymui buvo amplifikuojamos ribosominės RNR (rRNR) nukleotidų sekos, lokalizuotos tarp genų, koduojančių 5,8S rRNR ir 28S rRNR (ITS-2 regionas).

2 lentelė. Skirtingų genų fragmentų amplifikacijai naudojami reagentai, jų kiekis ir koncentracijos Table 2. Reagents, their amounts and concentrations are used to amplify different gene fragments Pradmenys DIDR-F1 DR COI-F1 BABGF2 F281&2a MAP4AP5 msp4f 16SwolbF Reagentai ir pradinės DIDR-R1 DR COI-R1 BABGR2 R281 MSP4AP3 msp4r 16SwolbR3 koncentracijos PGR mišinys 1 pvz. ddH2O 11,2 μl 12,1 μl 13,55 μl 13,8 μl 6,0 μl 9,0 μl 15,8 μl 10x PGR buferinis 2,0 μl 2,0 μl - - - - - tirpalas su KCl

25 mM MgCl2 1,6 μl 1,2 μl - - - - - 25 mM dNTP 0,2 μl 0,2 μl - - - - - DIDR-F1 (10 pm/μl) 1,25 μl ------DIDR-R1 (10 pm/μl) 1,25 μl ------BABGF2 (10 pml/μl) - - 0,625 μl - - - - BABGR2 (10 pml/μl) - - 0,625 μl - - - - DR COI-F1 (10 pm/μl) - 1,0 μl - - - - - DR COI-R1 (10 pm/μl) - 1,0 μl - - - - - F281&2a (10 pml/μl) - - - 0,5 μl - - - R281 (10 pml/μl) - - - 0,5 μl - - - MAP4AP5(10 pmol/μl) - - - - 2,0 μl - - MSP4AP3 (10 pmol/μl) - - - - 2,0 μl - - msp4f (10 pmol/μl) - - - - - 1,0 μl - msp4r (10 pmol/μl) - - - - - 1,0 μl - WolbF (10 pm/μl) ------1,0 μl WolbR3 (10 pm/μl) ------1,0 μl Taq DNR polimerazė 0,5 μl 0,5 μl 0,2 μl 0,2 μl - - 0,2 μl (5U/μl) 5x MyTaq DNR buferis - - 5,0 μl 5,0 μl - - 5,0 μl 2x PGR buferis - - - - 12,5 μl 13 μl Galutinis tūris 18 μl 18 μl 20 μl 20 μl 22,5 μl 24 μl 23 μl

Tyrime naudoti DIDR-R1 ir DIDR-F1 pradmenys, kurie buvo sukurti Rishniw ir kt. (2006) šešių skirtingų filiarijų rūšių (D. repens, D. immitis, Acanthocheilonema reconditum, Acanthocheilonema dracunculoides, Brugia pahangi ir Brugia malayi) aptikimui remiantis

43 amplifikuotų ITS-2 regiono fragmento dydžiu (Rishniw et al., 2006). Esant tiriamajame mėginyje D. repens DNR – amplifikuojamas 484 bp ITS-2 regiono fragmentas, o esant D. immitis DNR – 542 bp fragmentas. Vienos PGR reakcijos bendras tūris 20 μl: 18 μl PGR mišinio + 2 μl DNR. Mėginiai, kuriuose buvo aptiktos mikrofiliarijos, ir suaugusių helmintų mėginiai taip pat buvo tiriami su D. repens rūšiai specifiniais DR COI-F1, DR COI-R1 pradmenimis, kurie amplifikuoja mtDNR COI geno 209 bp ilgio fragmentą (Rishniw et al., 2006). Vienos PGR reakcijos bendras tūris 20 μl: 18 μl PGR mišinio + 2 μl DNR. Wolbachia endosimbiotinės bakterijos 16S rRNR geno amplifikacija. Atrinkti 49 geriausios kokybės D. repens teigiami mėginiai iš prieglaudų ir naminių šunų buvo analizuojami naudojant specifinius endosimbiotinių bakterijų Wolbachia 16SwolbF, 16SwolbR3 pradmenis, kurie amplifikuoja 16S rRNR geno 1018 bp fragmentą (Foster et al., 2008). Vienos PGR reakcijos bendras tūris 25 μl: 23 μl mišinio + 2 μl DNR. A. phagocytophilum msp4 geno fragmento amplifikacija lizdinės PGR metu. A. phagocytophilum patogenų nustatymui kraujo mėginiuose buvo atlikta lizdinė PGR. Lizdinė PGR atliekama dviem etapais. Siekiant išvengti užsikrėtimo, pirmo ir antro etapo metu PGR mišiniai ruošiami skirtingose patalpose. Pirmo etapo metu (pirma PGR) panaudoti specifiniai išoriniai pradmenys MAP4AP5 ir MSP4AP3, kurie amplifikuoja A. phagocytophilum msp4 geno 849 bp fragmentą (de la Fuente et al., 2005). Antrojo etapo metu (lizdinė PGR) panaudoti specifiniai vidiniai pradmenys msp4f ir msp4r, amplifikuojantys A. phagocytophilum msp4 geno 301 bp fragmentą (de la Fuente et al., 2005). Lizdinės PGR metu (antras etapas) vietoje DNR naudojami pirmos reakcijos PGR produktai. PGR reakcijų bendras tūris: I PGR – 25 μl: 22,5 μl PGR mišinio + 2,5 μl DNR; Lizdinė PGR – 25 μl: 24 μl PGR mišinio + 1 μl PGR produkto. B. canis 18S rRNR ir Bc28.1 genų fragmentų amplifikacija. B. canis 18S rRNR geno 559 bp fragmento pagausinimui naudoti B. canis specifiniai BABGF2, BABGR2 pradmenys (Adaszek and Winiarczyk, 2008). Vienos PGR reakcijos bendras tūris 25 μl: 20 μl PGR mišinio + 5 μl DNR. B. canis Bc28.1 geno 710 bp fragmento pagausinimui naudoti B. canis specifiniai F281&2a ir R281 pradmenys (Carcy et al., 2015). Vienos PGR reakcijos bendras tūris 25 μl: 20 μl PGR mišinio + 5 μl DNR.

3 lentelė. Amplifikatoriuje naudojamos programos atliekant skirtingų genų amplifikaciją (s – sekundės, temp – temperatūra, min – minutės) Table 3. The programs used for amplification of different genes in a thermocycler (s – seconds, temp – temperature, min – minutes) PRADMENYS DIDR-F1, DR COI-F1 BABGF2 F281&2a MAP4AP5 msp4f 16SwolbF DIDR-R1 DR COI-R1 BABGR2 R281 MSP4AP3 msp4r 16SwolbR3 Temp. Laikas Temp. Laikas Temp. Laikas Temp. Laikas Temp. Laikas Temp. Laikas Temp. Laikas PRADINĖ DENATŪRACIJA 94 ºC 2 min 94 ºC 2 min 92 ºC 2 min 94 ºC 3 min 95 ºC 5 min 95 ºC 5 min 95 °C 4 min Ciklų Ciklų Ciklų Ciklų Ciklų Ciklų Ciklų skaičius: 32 skaičius: 35 skaičius: 50 skaičius: 35 skaičius: 40 skaičius: 40 skaičius: 40 DENATŪRACIJA 94 ºC 30 s 94 ºC 30 s 92 ºC 60 s 94 ºC 30 s 95 ºC 30 s 95 ºC 30 s 94 °C 15 s

DNR PRADMENŲ HIBRIDIZACIJA 60 ºC 45 s 58 ºC 30 s 52 ºC 60 s 55 ºC 30 s 56 ºC 30 s 58 ºC 30 s 68 °C 30 s

DNR FRAGMENTO SINTEZĖ 72 ºC 30 s 72 ºC 30 s 72 ºC 90 s 72 ºC 60 s 72 ºC 50 s 72 ºC 50 s 72 °C 2 min

PASKUTINĖ DNR SINTEZĖS FAZĖ 72 ºC 7 min 72 ºC 7 min 72 ºC 5 min 72 ºC 7 min 72 ºC 5 min 72 ºC 5 min 72 °C 10 min LAIKYMAS 4 °C - 4 °C - 4 °C - 4 °C - 4 °C - 4 °C - 4 °C -

2.3.3. B. canis genotipų nustatymas PGR – RFIP metodu

B. canis padermių identifikavimui mėginiai buvo genotipuoti pagal du genus PGR-RFIP metodu, panaudojant HincII, MboI ir AluI restriktazes („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). HincII restriktazė buvo naudojama siekiant identifikuoti B. canis genotipus (A arba B) pagal 18S rRNR; MboI ir AluI restriktazės - identifikuojant B. canis genotipus (A/B/34.01) pagal Bc28.1 geną.

Restriktazės HincII protokolas. Vienam mėginiui sumaišoma 18 μl distiliuoto (be nukleazių) vandens, 2 μl 10x buferiu Tango ir 2 μl HincII restriktazės (250 U, 10 U/μl). Į kiekvieną 1,5 ml mėgintuvėlį įpilama po 22 μl mišinio. Atsargiai paimama 10 μl šviežio PGR produkto iš kiekvieno teigiamo mėginio ir perkeliama į skirtingus 1,5 ml mėgintuvėlius, kuriuose jau yra įpilta mišinio iš vandens, buferio ir restriktazės. Mėgintuvėliai gerai sumaišomi ir centrifuguojami 15 s 10 000 aps./min. greičiu. Mėgintuvėliai perkeliami į termostatą ir kultivuojami 3 val. 37 ºC temperatūroje. Rezultatai vertinami atliekant elektroforezę 2 % agarozės gelyje naudojant 50 bp molekulinės masės žymenį „GeneRuler DNA Ladder“ („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). Esant B. canis A genotipui 18S rRNR 559 bp

45 fragmentas kerpamas į 409 bp ir 150 bp fragmentus, o B genotipo atveju 18S rRNR 559 bp fragmentas lieka nepakitęs (Adaszek and Winiarczyk, 2008).

Restriktazės MboI protokolas. Vienam mėginiui sumaišoma 18 μl distiliuoto (be nukleazių) vandens, 2 μl 10x buferiu R ir 2 μl MboI restriktazės (1500 U, 10 U/μl). Į kiekvieną 1,5 ml mėgintuvėlį įpilame po 22 μl mišinio. Atsargiai paimama 10 μl PGR produkto iš kiekvieno teigiamo mėginio ir perkeliama į skirtingus 1,5 ml mėgintuvėlius, kuriuose jau yra įpilta mišinio iš vandens, buferio ir restriktazės. Mėgintuvėliai gerai sumaišomi ir centrifuguojami 15 s 10 000 aps./min. greičiu. Po to perkeliami į termostatą ir kultivuojami 3 val. 37 ºC temperatūroje. Rezultatai vertinami atliekant elektroforezę 2 % agarozės gelyje naudojant 100 bp molekulinės masės žymenį „GeneRuler DNA Ladder“ („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). Esant B. canis Bc28.1 – A genotipui Bc28.1 geno 710 bp fragmentas kerpamas į 300, 290, 70 ir 50 bp fragmentus, o esant Bc28.1 – B ir Bc28.1 –34.01 genotipo atveju 710 bp fragmentas kerpamas į 290, 170, 130, 70 ir 50 bp fragmentus (Adaszek and Winiarczyk, 2008) (11 pav.). Naudojant MboI restriktazę, identifikuojamas tik B. canis Bc28.1 – A genotipas. Bc28.1 – B ir Bc28.1 – 34.01 genotipų atskyrimui papildomai naudojama AluI restriktazė.

11 pav. B. canis A8, B, G, ir 34.04 padermių genotipavimas remiantis Bc28.1 geno RFIP analize, panaudojant MboI ir AluI restrikcijos fermentus (juodos juostos parodo kiekvieno restrikcijos fermento veikimo padėtį); MboI, AluI restriktazės kirpimo vietos žymimos rodykle viršuje (modifikuota pagal Carcy et al., 2015) Fig. 11. Identification of B. canis Bc28.1 gene strains (A8, B, G and 34.01) based on RFLP analysis, using MboI and AluI restriction enzymes (black bars indicate the action of each restriction enzyme); MboI, AluI restriction enzyme digestion sites are indicated by an arrow at the top (modified by Carcy et al., 2015)

Restriktazės AluI protokolas. Vienam mėginiui sumaišoma 18 μl distiliuoto (be nukleazių) vandens, 2 μl 10X Buffer Tango ir 2 μl AluI restriktazės. Į kiekvieną 1,5 ml mėgintuvėlį įpilame po 22 μl mišinio. Paimama 10 μl PGR produkto iš kiekvieno teigiamo mėginio ir perkeliama į skirtingus 1,5 ml mėgintuvėlius, kuriose jau yra įpilta mišinio iš vandens, buferio ir restriktazės.

Mėgintuvėliai gerai sumaišomi ir centrifuguojami 15 s 10 000 aps./min. greičiu. Perkeliami į termostatą ir kultivuojami 3 valandas 37 ºC temperatūroje. Rezultatai vertinami atliekant elektroforezę 2 % agarozės gelyje naudojant 50 bp molekulinės masės žymenį „GeneRuler DNA Ladder“ („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva). Esant B. canis Bc28.1-B genotipui fragmentas kerpamas į 320, 240, 90, 60 bp fragmentus, esant Bc28.1-34.01 genotipui fragmentas kerpamas į 410, 240, 60 bp fragmentus (11 pav.). Pagal Carcy et al. (2015) galimas ir „mišrus“ genotipas, kuriam esant Bc28.1 geno 710 bp fragmentas kerpamas į 410, 320, 240, 90, 60 bp fragmentus.

2.3.4. PGR produktų vizualizavimas

PGR produktai buvo vizualizuojami vykdant elektroforezę 1,5 % ar 2 % agarozės gelyje naudojant 0,5x TBE buferį. 2 % agarozės gelis ruošiamas, kai vizualizuojami rezultatai po PGR- RFIP analizės. Į paruoštą gelį įlašinamas atitinkamas kiekis etidžio bromido (100 ml agarozės tirpalui pilama 10 μl etidžio bromido (10 mg/ml)). Kiekvienas PGR mėginys sumaišomas su 2–3 μl 6x DNR Loading Dye („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva) bromfenolio mėlynojo dažo. Molekulinės masės žymuo „Gene RulerTM 50 bp/100 bp DNA Ladder Plus („Termo Fisher Scientific“, Lietuva) naudojamas PGR produktų dydžiui įvertinti. Rezultatai vertinami UV kameroje, naudojant GelDoc-It 310 ir VisionWorks LS sistemą.

2.3.5. DNR fragmentų iškirpimas iš gelio, valymas ir sekoskaita

D. repens, D. immitis, B. canis, A. phagocytophilum ir Wolbachia endosimbiotinės bakterijos PGR produktai iš agarozės gelio buvo iškerpami ir išvalomi naudojant GeneJET Gel Extraction rinkinį („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva) pagal gamintojo nurodytą protokolą. Išvalytų PGR produktų kokybės ir koncentracijos įvertinimui buvo atliekama elektroforezė 1,5 % agarozės gelyje naudojant Fast Ruler Middle Range („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva) molekulinės masės žymenį ir spektrofotometriją (NanoDrop” spektrofotometru). Išvalyti PGR produktai siunčiami sekoskaitai (Macrogen, Amsterdamas, Olandija). Sekoskaitai išsiųsti D. repens suaugusių helmintų COI geno (n=6), mikrofiliarijų COI geno (n=10) ir ITS-2 regiono (n=10), D. immitis mikrofiliarijų ITS-2 regiono (n=1), Wolbachia endosimbiotinės bakterijos 16S rRNR geno (n=5), A. phagocytophilum msp4 geno (n=3) ir B. canis 18S rRNR (n=30) ir Bc28.1 genų (n=32) mėginiai.

2.3.6. Filogenetinė analizė

Gautos mėginių nukleotidų sekos buvo tvarkomos naudojantis Mega 6 (Mega software package v.6.05) programą ir lyginamos su Genų banko (GenBank) duomenų bazėje esančiomis sekomis, naudojant BLAST (angl. basic local alignment search tool) sekų palyginimo algoritmą. Filogenetiniai medžiai buvo sudaromi naudojant didžiausio tikėtinumo (angl. maximum- likelihood) ir artimiausių kaimynų (angl. neighbour-joining) metodus bei HKY85 (angl. Hasegawa-Kishino-Yano), Kimura 2 paremetro (angl. Kimura 2-parameter) ir Tamura-Nei modelius.

2.4. Statistinė analizė

Prieglaudose laikomi šunys buvo suskirstyti į grupes pagal lytį (patinai, patelės), amžių (0,5– 3 metai; >3–6 metai; >6 metai) ir svorio kategoriją (smulkūs ≤10 kg; vidutiniai >10–25 kg; dideli > 25 kg). Buvo lyginamas užsikrėtimas D. repens nematodais tarp prieglaudų ir naminių šunų. Taip pat buvo lyginamas prieglaudų šunų užsikrėtimas tarp skirtingų grupių. Statistinė analizė atlikta naudojant SPSS (angl. Statistical Package for the Social Sciences) programinį paketą. Duomenys įvertinti naudojant pirsono χ2 (chi- kvadrato) kriterijų. χ2 kriterijaus p reikšmė parodo duomenų reikšmingumą. Duomenys statistiškai patikimi, kai p≤0,05. 95 % pasikliautinieji intervalai (PI) buvo skaičiuojami pagal Rojtman ir Lobanov (1985) pateiktas lenteles.

2.5. Širdies kirminų ligos gydymo protokolas

Nustačius širdies kirminų ligą šuniui, įvežtam į Lietuvą iš Ispanijos, buvo pritaikytas gydymas pagal Amerikos širdies kirminų asociacijos pateiktas gaires (Nelson et al., 2014). Gydymas susideda iš kelių etapų. Pirmus du mėnesius naudojami medikamentai, mikrofiliarijų (makrocikliniai laktonai) ir Wolbachia endosimbiotinių bakterijų (doksiciklinas) sunaikinimui. Vėliau naudojamas melarzominas, kuris sunaikina suaugusius (D. immitis) nematodus. Dėl mirštančių lervinių stadijų gali išsivystyti imuninės reakcijos (anafilaksija), todėl papildomai naudojami steroidiniai vaistai nuo uždegimo (gliukokortikoidai). Medikamentas, naudojamas suaugusio D. immitis helminto sunaikinimui (melarzominas), nėra registruotas Lietuvoje, todėl specialiu prašymu buvo gautas iš Ispanijoje esančios veterinarijos klinikos. Doksiciklino tabletės 10 mg/kg du kartus per dieną buvo naudojamos 4 savaites iš eilės. Prednizolono (gliukokortikoidais) tabletės 0,5 mg/kg buvo naudojamos du kartus kas 12 valandų pirmąją savaitę ir kas 24 valandas kitas tris savaites iš eilės. Tabletės buvo sugirdomos per os su pašaru. Milbemicimo oksimo (makrociklinis laktonas) tabletės 0,5 mg/kg buvo panaudotos 30-tą

48 gydymo dieną ir kaip prevencinė priemonė naudojamos 12 mėnesių iš eilės sugirdant su pašaru kas mėnesį. Praėjus 60 dienų nuo gydymo pradžios suaugusių kirminų sunaikinimui buvo naudojamas melarzominas. Injekcija (2,5 mg/kg) buvo leidžiama giliai į dorsalinius juosmens raumenis ties ketvirtu, penktu juosmens slanksteliu. Po vieno mėnesio (90-tą gydymo dieną) nuo pirmos melarzomino injekcijos kartojamos šio medikamento injekcijos du kartus kas 24 valandas tarp injekcijų.

3. REZULTATAI

3.1. Prieglaudų ir naminių šunų užsikrėtimas dirofiliarioze Lietuvoje

Atlikus citomorfologinį tyrimą iš naminių šunų kraujo (2013–2015 m.), mikrofiliarijos buvo aptiktos 42 (1,9 % 42/2180 95 % PI: 1,5–2,8 %) mėginiuose. Prieglaudų šunų užsikrėtimas dirofiliarijomis siekė 19 % (19/100 95 % PI: 11,8–27,4 %). Skirtingais mikroskopijos metodais nustatytos mikrofiliarijos pavaizduotos 12 paveiksle.

12 pav. D. repens mikrofiliarijos (pažymėtos juodomis rodyklėmis) citomorfologiniu metodu (500x padidinimas su imersija) (a) ir modifikuotu Knoto metodu (100x padidinimu) (b) Fig. 12. Microfilariae (black arrows) of D. repens during a blood smear microscopy at 500x magnification (oil immersion) (a) and the modified Knott’s test at 100x magnification (b)

Prieglaudų šunų kraujo mėginiai (n=100), citomorfologiniu metodu nustatyti teigiami naminių šunų kraujo mėginiai (n=42), ir šeši suaugusių helmintų mėginiai buvo tiriami molekuliniais metodais. Po rDNR ITS-2 regiono ir mtDNR COI geno amplifikacijos elektroforezės metodu vizualizuoti fragmentai atitiko D. repens rūšiai būdingus fragmento dydžius (484 bp ir 209 bp atitinkamai) (13 pav.) visuose teigiamuose (pagal citomorfologinį metodą) naminių šunų kraujo mėginiuose, prieglaudų šunų mėginiuose (pagal Knoto metodą) ir visuose tirtuose suaugusių helmintų mėginiuose.

13 pav. D. repens (iš šunų kraujo) PGR metodu pagausinto rDNR ITS-2 regiono fragmento (484 bp) (A) ir mtDNR COI geno fragmento (209 bp) (B) vizualizavimas 1,5 % agarozės gelyje (naudojant DIDR-F1, DIDR-R1 ir DR COI-F1, DR COI-R1 pradmenis atitinkamai). (A ir B): M – molekulinės masės žymuo Gene RulerTM 50 bp („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva); (A):1 – neigiamas mėginys; 2-4 – - - - D. repens teigiami mėginiai; K1 , K2 – neigiamos kontrolės (ddH2O). (B): K – neigiamos kontrolės (ddH2O); 1-4 – D. repens teigiami mėginiai Fig. 13. Identification of D. repens (from the canine blood samples) in 1.5 % agarose gel after PCR amplification of rDNA ITS-2 region fragments (484 bp) with DIDR-F1, DIDR-R1 primers (A) and mtDNA CO1 gene fragments (209 bp) with DR COI-F1, DR COI-R1 primers (B). (A and B): Lines M – TM Gene Ruler 50 bp DNA ladder („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania); (A): Lines K1, K2 – negative control (ddH2O); Line 1 – D. repens negative sample; Lines 2-4 – D. repens positive samples; (B): Lines K- – negative control; Lines 1-4 – D. repens positive samples

Nustatyta, kad prieglaudų šunys buvo labiau užsikrėtę dirofiliarijomis, negu naminiai šunys (χ2 = 100,039, df = 1, P < 0,0001). Prieglaudų šunų užsikrėtimas D. repens helmintais buvo nustatytas visose amžiaus grupėse: 0,5–3 metų amžiaus – 18,4 % (7/38); >3–6 metų amžiaus – 9,1 % (2/22); >6 metų amžiaus – 25,0 % (10/40). Patelių užsikrėtimas dirofiliarijomis siekė 16,4 % (9/55), o patinų – 22,2 % (10/45). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šunų užsikrėtimo dirofiliarijomis priklausomai nuo amžiaus ir lyties nustatyta nebuvo (p≥0,05). Vidutinių 20,8 % (15/72) ir stambių veislių 33,3 % (2/6) šunų užsikrėtimas dirofiliarijomis buvo didesnis, negu smulkių veislių 4,5 % (1/22), tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (χ2 = 3,165, df = 1, P = 0,106; χ2 = 4,084, df = 1, P = 0,107 atitinkamai).

3.2. Lietuvoje paplitusių dirofiliarijų rūšis remiantis suaugusių helmintų morfologiniu identifikavimu

Atlikus šešių suaugusių helmintų morfologinį identifikavimą, vienas individas turėjo nematodų patinams būdingus požymius, penki helmintai atitiko patelėms būdingus požymius. Skirtingų lyčių nematodų ir jų lytinių struktūrų pavyzdžiai pateikiami 14 paveiksle.

14 pav. D. repens patelė (a) – priekinėje dalyje esančios žiotys (trumpa rodyklė) ir vulva (ilga rodyklė); D. repens patinas (b) – rodyklėmis pažymėtos kairioji ir dešinioji spikulės Fig. 14. Anterior end of the female D. repens nematode (a) - oral opening (short arrow) and vulva (long arrow); posterior end of the male D. repens nematode (b) - left and right spiculas marked with black arrows

Rūšies identifikavimui buvo išmatuotas helmintų ilgis, patelių atstumas tarp priekinės dalies ir vulvos, patinėlių kairiosios ir dešiniosios spikulių ilgiai (4 lentelė). Visi matavimai atitiko D. repens rūšiai būdingus požymius.

4 lentelė. Nematodų matavimai morfologiniam identifikavimui Table 4. Measurements of nematode morphological identification Atstumas iki Spikulių ilgis (μm) Eil. Nr. Rūšis Lytis Ilgis (mm) vulvos (mm) Dešinioji Kairioji 1 D. repens ♂ 56 - 179,7 416,3 2 D. repens ♀ 119 1,34 - - 3 D. repens ♀ 159 1,31 - - 4 D. repens ♀ 113 1,29 - - 5 D. repens ♀ 132 129 - - 6 D. repens ♀ 164 1,28 - -

3.3. Lietuvoje paplitusių dirofiliarijų ITS-2 regiono ir COI geno sekų filogenetinė analizė

Po sekoskaitos, gautos D. repens suaugusių helmintų COI geno ir ITS-2 regiono sekos iš šunų kraujo mėginių, buvo lyginamos tarpusavyje ir su Genų banke esančiomis sekomis. Šio tyrimo metu gautos D. repens ITS-2 regiono sekos (n=10), kaip ir COI geno sekos (n=16), tarpusavyje buvo identiškos 100 %.

5 lentelė. D. repens (MH469230) ITS-2 regiono sekos palyginimas (nukleotidų skirtumai ir bendra informacija) su D. repens sekomis, esančiomis Genų banke Table 5. Comparsion of D. repens ITS-2 region sequence (MH469230) with sequences deposited in GenBank (nucleotide differences and general information) Prieigos numeris Šalis Nukleotidų skirtumai 1 3 4 5 21 22 26 44 231 MH469230 Lietuva C A T C A T A A T KR76387 Tunisas • • • • • • • • • JQ039744 Indija • • • • • • • T • KM108773 Čekija G T A A T A T • A

Iš viso Genų banke buvo prieinamos trys D. repens ITS-2 regiono sekos (5 lentelė). Į Genų banką buvo patalpinta viena D. repens ITS-2 regiono seka (MH469230). Nustatytas 100 % sekos identiškumas su D. repens ITS-2 regiono seka iš Tuniso (KR76387) ir 98 % ir 99 % identiškumas su sekomis iš Čekijos (KM108773) ir Indijos (JQ039744) atitinkamai (15 pav.). Tirtame ITS-2 regione nustatyti 9 variabilūs nukleotidai.

15 pav. Filogenetinis medis D. repens (iš šuns kraujo) ITS-2 regiono fragmento sekų pagrindu sudarytas naudojant didžiausio tikėtinumo metodą ir Tamura-Nei modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. bootstrap values), gautas naudojant 1000 pakartojimų. Analizuojama D. repens seka pažymėta juodu trikampiu (prieigos numeris MH469230). Genų banko sekos - patogeno rūšis; iš kokio organizmo išskirtos; prieigos numeris; šalis Fig. 15. The phylogenetic tree based on sequence of the ITS-2 region of D. repens (from canine blood samples), created using the maximum likelihood method and Tamura-Nei model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequence obtained in this study is marked with a black triangle. Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison. Identification source (host), accession numbers and the name of country are given after the names of species

Į Genų banką buvo patalpintos trys D. repens COI geno sekos: iš suaugusių helmintų (MH469228; MH469229) ir mikrofiliarijų (MH469227). Palyginus D. repens COI geno sekas iš Lietuvos su Genų banke esančiomis sekomis (6 lentelė), nustatytas 100 % sekų identiškumas su sekomis iš Slovakijos (KC985240; MG787424) ir 99 % identiškumas su D. repens sekomis iš Italijos (AJ2714614), Estijos (KR780980), Suomijos (KY828979), Čekijos (KR998258) ir Slovakijos (MF045816).

6 lentelė. D. repens (iš šunų kraujo ir suaugusių helmintų) COI geno fragmentų palyginimas (nukleotidų skirtumai ir bendra informacija) su D. repens sekomis, esančiomis Genų banke Table 6. Comparison of D. repens cox1 gene sequences from dog blood samples and adult worms with sequences deposited in GenBank (nucleotide differences and general information) Nukleotidų skirtumai Rūšis Prieigos numeris Šalis 1 126 174 D. repens (iš mikrofiliarijų) MH469227 Lietuva A A G D. repens (iš helminto) MH469229 Lietuva . . . D. repens (iš helminto) MH469228 Lietuva . . . D. repens (iš uodų) MG787424 Slovakija . . . D. repens (iš šunų) KC985240 Slovakija . . . D. repens (iš žmonių) MF045816 Slovakija . G . D. repens (iš šunų) KR780980 Estija . . A D. repens (iš žmonių) KR998258 Čekija G . A D. repens (iš šunų) KY828979 Suomija . . A D. repens (iš šunų) AM749230 Italija . . A

Filogenetinė analizė, paremta D. repens COI geno sekomis iš uodų, šunų ir žmonių, atskleidė keturias skirtingas dirofiliarijų padermes, paplitusias Europoje (16 pav.).

16 pav. Filogenetinis medis D. repens COI geno fragmento sekų pagrindu, sudarytas naudojant didžiausio tikėtinumo metodą ir Tamura-Nei modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. bootstrap values), gautas naudojant 1000 pakartojimų. Analizuojamos D. repens sekos pažymėtos juodu kvadratu (prieigos numeriai: šunų kraujo mėginys MH469227; suaugę helmintai MH469228; MH469229). Genų banko sekos – patogeno rūšis; iš kokio organizmo išskirtos; prieigos numeris; šalis Fig. 16. The phylogenetic tree based on D. repens sequences of the cox1 gene, created using the maximum likelihood method and Tamura-Nei model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequences obtained in this study are marked with a black square (MH469227: sequences obtained from canine blood; MH469228, MH469229: sequences obtained from two adult nematodes). Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison. Identification source (host), accession numbers and the name of country are given after the names of species

3.4. Širdies kirminų (D. immitis) atvejo analizė

Atlikus klinikinį tyrimą šuniui (Ispanų kurtui), atvežtam iš Ispanijos, jokių klinikinių simptomų (neskaitant fizinio krūvio netoleravimo), būdingų širdies kirminų ligai, nenustatyta. Krūtinės ląstos rentgeno ir kardioechoskopijos tyrimais pakitimai, būdingi širdies kirminų ligai, nebuvo nustatyti galimai dėl ankstyvos ligos stadijos. ELISA serologinis (SNAP 4Dx Plus Test, IDEXX) tyrimo rezultatas buvo teigiamas D. immitis suaugusių patelių išskiriamų antigenu atžvilgiu ir neigiamas kitų ektoparazitų pernešamų ligų atžvilgiu (B. burgdorferi, E. canis, E. ewingii, A. phagocytophilum, A. platys). Atlikus modifikuotą Knoto testą, buvo nustatytas nedidelis mikrofiliarijų kiekis kraujyje. Elektroforezės metu vizualizavus PGR produktus, DNR fragmentas atitiko D. immitis (542 bp) fragmento dydį.

7 lentelė. D. immitis (MH663471) ITS-2 regiono palyginimas (nukleotidų skirtumai ir bendra informacija) su D. immitis sekomis esančiomis Genų banke Table 7. Comparsion of D. immitis ITS-2 region sequences with sequences of D. immitis deposited in GenBank (nucleotide differences and general information) Prieigos numeris Šalis Nukleotidų skirtumai 2 6 8 9 18 19 MH663471 Lietuva T C A T T T EU182331 Kinija • • • • • • MF962487 Iranas • • • • • • EU182331 Turkija • • • • • • LN626262 Portugalija C A T A A A

Atlikus rRNR ITS-2 regiono 542 bp fragmento sekoskaitą ir filogenetinę sekų analizę nustatyta, kad tiriamoji seka (MH663471) genetiškai artimiausia D. immitis rūšiai (EU182331; MF962487; EU182331) (17 pav.). Palyginus gautą seką (MH663471) su sekomis, patalpintomis į Genų banką (7 lentelė), nustatytas 100 % identiškumas su kitomis D. immitis sekomis iš Kinijos (EU182331), Irano (MF962487), Turkijos (EU182331) ir 99 % identiškumas su D. immitis sekomis iš Portugalijos (LN626262).

17 pav. Filogenetinis medis D. immitis ITS-2 regiono fragmento sekos pagrindu, sudarytas naudojant didžiausio tikėtinumo metodą ir Tamura-Nei modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. bootstrap values). Analizuojama D. immitis seka pažymėta juodu apskritimu (prieigos numeris MH663471). Genų banko sekos – patogeno rūšis; iš kokio organizmo išskirtos; prieigos numeris; šalis Fig. 17. The phylogenetic tree based on D. immitis sequence of the ITS-2 region, created using the maximum likelihood method and Tamura-Nei model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequence obtained in this study is marked with a black circle (accession number MH663471). Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison. Identification source (host), accession numbers and the name of country are given after the names of species

Atlikus diagnostinius tyrimus ir nustačius širdies kirminų ligą, šuniui pirmą kartą Lietuvoje buvo pritaikytas gydymas pagal Amerikos širdies kirminų asociacijos pateiktas rekomendacijas. Per 12 val. po pirmos melarzomino injekcijos pasireiškė skausmingumas suleidimo vietoje, šuo buvo apatiškas, karščiavo. Praėjus 24 val. po injekcijos simptomai savaime dingo, o po dviejų savaičių pagerėjo apetitas, šuo pradėjo labiau toleruoti fizinį krūvį, priaugo svorio (prieš gydymą – 13 kg, po gydymo – 24 kg). Po antros ir trečios melarzomino injekcijos pasireiškė tik skausmingumas injekcijos leidimo vietoje, tačiau simptomas dingo savaime, praėjus 24 val. nuo injekcijos. Po 120 gydymo dienų, pakartojus Knoto testą, mikrofiliarijos nebuvo nustatytos.

3.5. Šunų sergančių dirofiliarioze užsikrėtimas Wolbachia endosimbiotine bakterija ir 16S rRNR geno fragmentų sekų analizė

Iš viso molekuliniais metodais ištirti 59 šunų kraujo mėginiai: 49 mėginiai šunų, užsikrėtusių D. repens parazitais, ir 10 kontrolinių mėginių, kuriuose nebuvo aptiktos dirofiliarijos. Iš 49 D. repens teigiamų mėginių 81,6 % (40/49, 95 % PI: 69,4–91,3 %) buvo nustatyta Wolbachia endosimbiotinė bakterija. Visuose D. repens neigiamuose mėginiuose Wolbachia endosimbiotinės bakterijos nebuvo aptiktos.

Buvo atlikta penkių teigiamų mėginių (prieglaudų ir naminių šunų) 16S rRNR geno fragmentų sekoskaita. Sekų analizės duomenimis, tiriamosios sekos buvo 100 % identiškos tarpusavyje ir 100 % sutapo su Wolbachia endosimbiotinės bakterijos sekomis, išskirtomis iš D. repens užkrėstų mėginių Kroatijoje (KY114937) ir Italijoje (AJ276500). Dvi sekos (MK050782; MK050783) buvo patalpintos į Genų banko duomenų bazę. Filogenetinės analizės duomenimis, Wolbachia bakterijų padermės pasiskirstymas priklauso nuo šių endosimbiotinių bakterijų šeimininkų (18 pav.). Filogenetiniame medyje Wolbachia bakterijos padermės aptiktos kitų šalių mėginiuose, užkrėstuose D. repens parazitais (KY114937; AJ276500) ir D. immitis rūšies parazitais (Z49261; KF977877; AF088187), sudaro dvi atskiras grupes.

18 pav. Filogenetinis medis Wolbachia endosimbiotinės bakterijos 16S rRNR geno sekų pagrindu, sudarytas naudojant artimiausių kaimynų metodą ir Kimura-2-Parametro modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. bootstrap values). Analizuojamos sekos pažymėtos juodu rombu (prieigos numeriai MK050782; MK050783); Brazilija (Br), Kroatija (Cr), Prancūzija (Fr), Italija (It), Jungtinės Amerikos valstijos (USA). Genų banko sekos - prieigos numeris; organizmo rūšis; iš kokio organizmo išskirtos, šalis Fig. 18. The phylogenetic tree based on Wolbachia endosymbiont sequences of the 16S rRNA gene, created using Neighbour-joining method and Kimura-2 parameter model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequences obtained in this study are marked with a black rhombus (accession numbers MK050782; MK050783). Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison. Name of bacteria, identification source (host) and the countries codes are given after the accession numbers

3.6. Žmonių poodinės dirofiliariozės (D. repens) atvejų Lietuvoje apžvalga

Bendradarbiaujant su Lietuvos nacionalinės visuomenės sveikatos priežiūros laboratorija (NVSPL) buvo surinkti duomenys apie žmonių dirofiliariozės susirgimus Lietuvoje (8 lentelė).

8 lentelė. Klinikiniai duomenys apie žmonių dirofiliariozės infekcijas Lietuvoje 2011–2018 metais Table 8. A summary of information about human infections of D. repens in Lithuania in the period 2011– 2018 Paciento Kelionės į Numeris Amžius Regionas Metai Helminto lokalizacija lytis endemines šalis

1 Moteris 76 Kauno Nebuvo išvykęs 2011 Akies junginė 2 Moteris 55 Vilniaus Turkija 2012 Poodinė (galvos sritis) 3 Vyras 7 Vilniaus Nebuvo išvykęs 2012 Poodinė (pilvo sritis) 4 Moteris 66 Vilniaus Nebuvo išvykęs 2013 Poodinė (galvos sritis) 5 Moteris 66 Ukmergės Nebuvo išvykęs 2013 Poodinė (krūtinės sritis) 6 Moteris 76 Kauno Nebuvo išvykęs 2014 Akies junginė 7 Moteris 51 Vilniaus Nebuvo išvykęs 2014 Akies junginė (19 pav.) 8 Vyras 79 Utenos Nebuvo išvykęs 2015 Poodinė (varpos srityje) Vokietija, Poodinė (krūtinės 9 Vyras 28 Klaipėdos 2018 Lenkija srityje)

Nuo 2011 m. iki 2018 m. buvo užfiksuoti devyni žmonių dirofiliariozės užsikrėtimo atvejai. Šešiems pacientams helmintai buvo rasti poodiniuose audiniuose, trims – akies junginėje (19 pav.). Septyni pacientai nebuvo išvykę iš Lietuvos teritorijos. Du pacientai per kelis metus buvo išvykę į šalis, kuriose yra paplitusi dirofiliariozė. Suaugusių nematodų D. repens rūšis buvo patvirtinta visuose tirtuose mėginiuose morfologinio identifikavimo metodu, Nacionalinėje visuomenės sveikatos priežiūros laboratorijoje ir vienas mėginys molekuliniais metodais – Ciuricho universiteto parazitologijos institute.

. 19 pav. D. repens helmintas (rodyklė) žmogaus akies junginėje Fig. 19. Subconjuctival localisation of a D. repens adult worm (arrow) in the human eye

3.7. Šunų užsikrėtimas vektorių pernešamų patogenų koinfekcijomis

Mėginiai, surinkti iš naminių šunų, buvo ištirti citomorfologiniu metodu, siekiant nustatyti galimą užsikrėtimą kitais patogenais ir įvertinti koinfekcijų tikimybę su D. repens helmintais. Iš 2180 kraujo mėginių, surinktų iš naminių šunų, trys (0,1 %) buvo infekuoti A. phagocytophilum ir 38 (1,7 %) buvo infekuoti B. canis rūšies patogenais. Iš 42 mėginių, kuriuose buvo aptiktos dirofiliarijos, devyniuose buvo nustatyti B. canis patogenai ir viename mėginyje aptikti du patogenai: A. phagocytophilum ir B. canis. Citomorfologinio tyrimo metu nustatyti babezijų merozoitai ir anaplazmų morulės pavaizduoti 20 paveiksle. Teigiami pagal citomorfologinį tyrimą B. canis ir A. phagocytophilum mėginiai buvo tiriami taikant molekulinius metodus. Atlikus 18S rRNR ir msp4 genų fragmentų pagausinimą PGR metodu nustatyta B. canis ir A. phagocytophilum DNR tirtuose mėginiuose. Visi trys A. phagocytophilum msp4 geno išvalyti PGR fragmentai išsiųsti sekoskaitai. Sekų analizė patvirtino PGR metu gautus rezultatus.

20 pav. Citomorfologinio kraujo tyrimo metu rasti patogenai šunų kraujo mėginiuose. Rodyklėmis pažymėta: B. canis merozoitai eritrocituose, (500x padidinimas su imersija) (a); A. phagocytophilum morulė neutrofile (1000x padidinimas su imersija) (b) Fig. 20. Vector-borne pathogens detected in co-infected canine blood samples during microscopy: (a) – merozoite (arrows) of B. canis in erythrocytes (500x oil immersion); (b) - morula (arrow) of A. phagocytophilum in neutrophil (1000x oil immersion)

Teigiami B. canis šunų kraujo mėginiai (2016–2018 m.), kurie buvo naudojami genetinės įvairovės tyrimams, buvo tiriami dėl koinfekcijų su D. repens ir A. phagocytophilum patogenais taikant PGR metodą. Iš 61 teigiamo B. canis mėginio aštuoniuose (13,1 %) mėginiuose nustatyti D. repens rūšies patogenai ir trijuose (4,9 %) mėginiuose nustatyti A. phagocytophilum patogenai. A. phagocytophilum msp4 ir D. repens COI geno sekų analizę patvirtino PGR analizės rezultatus visuose teigiamuose mėginiuose.

3.8. B. canis patogenų molekulinis nustatymas

B. canis patogenų nustatymui laboratorijoje iš surinktų 149 šunų kraujo mėginių buvo išskiriama DNR. Tinkamos kokybės DNR buvo išskirta iš 138 mėginių. Norint nustatyti genotipus pagal Bc28.1 geną visų pirma atliekamas šio geno 710 bp fragmento pagausinimas PGR metu. Atlikus 18S rRNR ir Bc28.1 geno fragmentų amplifikaciją, B. canis DNR nustatyta 112 (81,2 %) ir 107 (77,5 %) šunų mėginiuose (9 lentelė).

9 lentelė. Šunų užsikrėtimas B. canis patogenais pagal 18S rRNR ir Bc28.1 genus Table 9. The prevalence of B. canis in dogs by 18S rRNA and Bc28.1 genes Kraujo DNR Teigiamų mėginių skaičius po Veterinarijos klinika mėginių mėginių PGR skaičius skaičius 18S rRNR Bc28.1 Siaurio Šnauceris, Kaunas 80 71 55 55 Kriaučeliūno, Kaunas 26 26 21 22 Marijampolės 11 9 9 8 Vilniaus 5 5 3 3 Klaipėdos 18 18 17 15 Panevėžio 8 8 6 3 Kėdainių 1 1 1 1 Bendras skaičius 149 138 112 107

B. canis patogenais užkrėsti mėginiai buvo tiriami PGR-RFIP metodu naudojant restrikcijos fermentus MboI, HincII, AluI, kurie leidžia diferencijuoti skirtingus B. canis genotipus pagal 18S rRNR ir Bc28.1 genus (10 lentelė). Geriausios kokybės B. canis18S rRNR geno (n=30) ir Bc28.1 geno (n=32) mėginiai (priklausantys skirtingiems genotipams) iš skirtingų Lietuvos regionų buvo siunčiami sekoskaitai siekiant patvirtinti PGR-RFIP analizės rezultatus ir įvertinti padermių genetinę įvairovę.

3.9. B. canis genotipų nustatymas pagal 18S rRNR geną, remiantis PGR-RFIP analize

Panaudojus restrikcijos fermentą HincII pagal 18S rRNR geną, nustatyti trys skirtingi PGR fragmentų profiliai (A, B, A/B) (21 pav.). Esant A genotipui stebimi du fragmentai, kai 559 bp fragmentas kerpamas į 409 bp ir 150 bp fragmentus. B genotipo atveju stebimas vienas 559 bp fragmentas. Nustatytas „mišrus“ genotipas (A ir B genotipo), kai matomi trys DNR fragmentai: 559 bp fragmentas kerpamas į 409 bp ir 150 bp fragmentus išliekant ir 559 bp fragmentui. Pagal PGR-RFIP analizę A genotipas nustatytas 17 (15,2 %) mėginių, B genotipas – viename mėginyje (0,9 %) ir „mišrus“ A/B genotipas – 94 (83,9 %) mėginiuose (11 lentelė).

21 pav. B. canis genotipo nustatymas panaudojant HincII restriktazę. M – molekulinės masės žymuo (50 bp) („Thermo FisherScientific Baltics“, Lietuva), 1 šulinėlis – B genotipas (nepakitęs), 10, 12 šulinėliai – A genotipas (kerpamas į 409 bp ir 150 bp fragmentus, išnykstant 559 bp fragmentui), 2-9, 11, 13-15 šulinėliai – A/B genotipas (kerpamas į 409 bp ir 150 bp, išliekant ir 559 bp fragmentui); K- – neigiama kontrolė; K+ – teigiama kontrolė Fig. 21. Identification of B. canis genotipes using HincII restriction enzyme. Lines M – Gene RulerTM 50 bp DNA ladder („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania); Line K- - negative control; Line K+ – positive control; Line 1 – genotype B; Lines 10, 12 – genotype A; Lines 2-9, 11, 13-15 – genotype A/B

3.10. B. canis 18S rRNR geno sekų analizė

Išanalizavus šiame tyrime gautas B. canis 18S rRNR geno 486 bp fragmento sekas ir jas palyginus tarpusavyje, buvo aptiktos trys skirtingos variabilios sritys 80, 92 ir 93 nukleotidų pozicijose (10 lentelė). Genotipai buvo atskiriami pagal 18S rRNR geno 92 ir 93 nukleotidų pozicijose esančius GA→AG nukleotidų polimorfizmus (pilnoje 18rRNR geno sekoje – 610– 611). B. canis B genotipo atveju 92 ir 93 nukleotidų pozicijose stebimi A ir G nukleotidai, A genotipo atveju – G ir A nukleotidai ir A/B genotipo atveju elektroforeogramoje šiose pozicijose stebimi dviejų nukleotidų pikai G ir A→A ir G (R→R). Iš 30 nusekvenuotų sekų 16 sekų (53,3 %) atitiko mišrų A/B genotipą, 13 sekų (43,3 %) – A genotipą ir 1 seka (3,3 %) – B genotipą (10 lentelė).

10 lentelė. B. canis 18S rRNR geno sekų tarpusavio palyginimas (nukleotidų skirtumai ir bendra informacija) (G ir A→A ir G (R→R) atitinkamai; T/C - Y) Table 10. The comparison of the 18S rRNA gene sequences of B. canis (nucleotide differences and general information) (G and A→A and G [R→R] respectively; T/C - Y) Nukleotidų pozicijos Genotipas 80 92 93 18S rDNR - A (n=11) T G A (n=2) Y . . 18S rDNR - B (n=1) . A G 18S rDNR - A/B (n=15) . R R 18S rDNR - A/B (n=1) Y R R

Nustatyti penki skirtingi sekų variantai, remiantis GA→AG nukleotidų inversija 92–93 pozicijose (III-AG; IV-GA, V-RR) ir vieno nukleotido polimorfizmu T/C (Y) 80 pozicijoje (I-Y/GA, II-Y/RR) (10 lentelė; 22 pav.).

22 pav. Variabilios pozicijos B. canis 18S RNR geno sekose (raudonai apibrėžta: I-Y/GA (2 sekos); II-Y/RR (1 seka); III – AG (1 seka); IV-GA (13 sekų); V – RR (16 sekų)) Fig. 22. Variable regions in B. canis 18S RNA gene sequences (marked in red color: I-Y/GA [2 sequences]; II-Y/RR [1 sequence]; III – AG [1 sequence]; IV-GA [13 sequences]; V – RR [16 sequences])

Sudarant filogenetinį medį buvo įtrauktos B. canis 18S rRNR geno sekos, gautos šio tyrimo metu ir atitinkamos sekos, išskirtos iš šunų, patalpintos Genų banke iš Lietuvos (KM111283; KM111282), Lenkijos (KT844912; KT844884), Latvijos (JX227980), Estijos (KT008057), Turkijos (KF499115), Kroatijos (FJ209024) ir Čekijos respublikos (JX678979). Babesia vogeli (JN13120) 18S rRNR geno seka buvo įtraukta kaip išorinė seka. Filogenetiniame medyje (23 pav.) tiriamosios sekos išsiskyrė į tris pagrindinius klasterius (A; B; A/B) pagal 18S rDNR genotipus. Dvi sekos, priklausančios A genotipui (mėginiai iš Kauno-2KrA ir Panevežio-1rPnvzA), ir viena seka, priklausanti A/B genotipui (iš Vilniaus – 1VlnA/B), buvo unikalios lyginant su Genų banke esančiomis sekomis.

23 pav. Filogenetinis medis B. canis 18S rRNR geno sekų pagrindu sudarytas, naudojant didžiausio tikėtinumo metodą, HKY85 modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. bootstrap values). Analizuojamos sekos pažymėtos simboliais – ▲, ■, ●; mėginių numeriai; surinkimo vietos – Vilnius (VLN); Kėdainiai (Ked); Marijampolė (Mar); Klaipėda (Klp); Panevėžys (Pnvz); Siaurio Šnaucerio klinika (Sn); Kriaučeliūno klinika (Kr);Kroatija (HR); Lenkija (PL); Lietuva (LT); Latvija (LV); Estija (EE); Turkija (TR); Šveicarija (CH); Prancūzija (FR). Genų banko sekos - patogeno rūšis; prieigos numeris; iš kokio organizmo išskirtos, šalis Fig. 23. The phylogenetic tree based on B. canis 18S rRNA gene sequences, created using maximum likelihood method and Hasegawa-Kishino-Yano (HKY85) model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequences obtained in this study are marked with symbols – ▲, ■, ●; Sample numbers; Sampling locations – Vilnius (VLN); Kedainiai (Ked); Marijampole (Mar); Klaipeda (Klp); Panevežys (Pnvz); Siaurio Snaucerio Veterinary Clinic (Sn); Kriauceliuno Veterinary Clinic (Kr); Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison from: Croatia (HR); Poland (PL); Lithuania (LT); Latvia (LV); Estonia (EE); Turkey (TR); Switzerland (CH); France (FR). Accession numbers, identification source (host), and the counties code are given after the names of species

3.11. B. canis genotipų nustatymas pagal Bc28.1 geną, remiantis PGR-RFIP analize

Panaudojus restrikcijos fermentą MboI nustatyti du skirtingi PGR-RFIP profiliai, atitinkantys B. canis genotipus Bc28.1-A ir Bc28.1-B Bc28.1-34.01 (24 pav.). Bc28.1-A genotipo atveju 710 bp fragmentas kerpamas į 300 bp, 290 bp, 70 bp ir 50 bp fragmentus, o

63 esant Bc28.1-Bar Bc28.1-34.01 genotipams 710 bp fragmentas kerpamas į 290 bp, 170 bp, 130 bp, 70 bp ir 50 bp fragmentus.

24 pav. B. canis genotipų nustatymas panaudojant restrikcijos fermentą MboI. M – molekulinės masės žymuo (50 bp) („Thermo FisherScientific Baltics“, Lietuva); 1-4, 6-10, 12-15 šulinėliai – B/34.01 genotipas; 5 ir 11 šulinėliai – A genotipas; K- – neigiama kontrolė; K+ – teigiama kontrolė Fig. 24. Identification of B. canis genotipes using MboI restriction enzyme. Lines M – Gene RulerTM 50bp DNA ladder („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania); Line K- - negative control; Line K+ – positive control; Lines 1-4, 6-10, 12-15 – genotype B/34.01; Lines 5,11 – genotype A

Ištyrus 106 mėginius, 87 (82,1 %) mėginiuose nustatytas B/34.01 genotipas ir 19 (17,9 %) mėginių – Bc28.1-A genotipas (11 lentelė). Siekiant atskirti Bc28.1-B genotipą nuo Bc28.1-34.01 genotipo, mėginiai (n=87) buvo toliau tiriami naudojant restrikcijos fermentą AluI (25 pav.).

25 pav. B. canis genotipų nustatymas panaudojant restrikcijos fermentą AluI. M – molekulinės masės žymuo (50 bp) („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lietuva); 1-8, 10-14 šulinėliai – Bc28.1-B; 16 šulinėlis – Bc28.1- 34.01; 9 šulinėlis – „mišrus“genotipas Fig. 25. Identification of B. canis genotipes using AluI restriction enzyme. Lines M – Gene RulerTM 50 bp DNA ladder („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania); Lines 1-8, 10-14 – genotype Bc28.1-B; Line 16 – genotype Bc28.1-34.01; Line 9 – “mixed” genotype

Bc28.1-B genotipo atveju fragmentas kerpamas į 320, 240, 90, 60 bp fragmentus, Bc28.1-34.01 genotipo atveju fragmentas kerpamas į 410 bp, 240 bp, 60 bp fragmentus. Susidarius 410 bp, 320 bp, 240 bp, 90 bp, 60 bp fragmentams, toks rezultatas buvo laikomas „mišriu“ Bc28.1-34.01/Bc28.1-A arba Bc28.1-34.01/Bc28.1-B genotipu.

11 lentelė. B. canis genotipai ir mėginių skaičius pagal 18S rRNR ir Bc28.1 genus remiantis PGR-RFIP analize, panaudojus restrikcijos fermentus MboI, HincII, AluI Table 11. B. canis genotypes and sample numbers using the PCR-RFLP approach on Bc28.1 and 18S rRNA genes (PCR fragment was digested using restriction enzymes MboI, HincII, AluI) Veterinarijos klinika 18S rRNR (HincII) Bc28.1 (MboI ) Bc28.1 (AluI) B – 35 mėginiai Siaurio Šnauceris, A/B – 49 mėginiai B/34.01 – 43 mėginiai 34.01 – 5 mėginiai Kaunas A – 6 mėginiai A – 12 mėginių A/34.01 – 3 mėginiai B – 10 mėginiai A/B – 17 mėginių B/34.01 – 20 mėginių Kriaučeliūno, Kaunas 34.01 – 7 mėginiai A – 4 mėginiai A – 2 mėginiai A/34.01 – 3 mėginys B – 4 mėginiai B/34.01 – 6 mėginiai Marijampolės A/B – 9 mėginiai 34.01 – 1 mėginys A – 2 mėginiai A/34.01 – 1 mėginys B/34.01 – 2 mėginiai 34.01 – 1 mėginys Vilniaus A/B – 3 mėginiai A – 1 mėginys A/34.01 – 1 mėginys B – 1 mėginys B/34.01 – 13 mėginių B – 7 mėginiai Klaipėdos A – 1 mėginys A – 2 mėginiai 34.01 – 6 mėginiai A/B – 15 mėginių A/B – 1 mėginys B – 1 mėginys Panevėžio B/34.01 – 2 mėginiai A – 5 mėginiai 34.01 – 1 mėginys Kėdainių A – 1 mėginys B/34.01 – 1 mėginys 34.01 – 1 mėginys A/B – 94 mėginiai B – 57 mėginiai B/34.01 – 87 mėginiai Iš viso A – 17 mėginių 34.01 – 22 mėginiai A – 19 mėginiai B – 1 mėginys A/34.01 – 8 mėginiai

Panaudojus AluI restriktazę, 57 (65,5 %) mėginiuose nustatytas Bc28.1-B genotipas, 22 mėginiuose – Bc28.1-34.01 genotipas (25,3 %). Galima koinfekcija tarp dviejų padermių B. canis patogenų buvo nustatyta 8 (9,2 %) mėginiuose (11 lentelė).

3.12. B. canis Bc28.1 geno sekų ir filogenetinė analizės

Siekiant įvertinti B. canis padermių genetinę įvairovę pagal Bc28.1 geną, sekoskaitai buvo atrinkti geriausios kokybės 32 mėginiai. Atlikus Bc28.1 geno 632 bp fragmento sekų analizę, aptikta 18 variabilių nukleotidų pozicijų, 13 sekų variantų, o pagal nukleotidų polimorfizmą 478 ir 151 pozicijose identifikuoti keturi genotipai: Bc28.1-A, Bc28.1-B, Bc28.1-34.01 ir Bc28.1- 34.01/A. Trylika skirtingų B. canis Bc28.1 geno sekų buvo patalpintos į Genų banko duomenų bazę. Sekų analizės rezultatai parodė, kad Lietuvoje identifikuotos B. canis padermės yra 99 % identiškos (nuo 1 iki 6 nukleotidų skirtumai Bc28.1 geno sekoje) su padermėmis, identifikuotomis Prancūzijoje (Carcy et al., 2015). Lyginant gautas sekas su Prancūzijoje identifikuotomis trijų B. canis padermių Bc28.1 geno sekomis (KP863714.1; KP863713.1; CS019629.1), patalpintomis į Genų banką, B. canis padermės buvo atskiriamos pagal 478 nukleotido pozicijoje stebimą T→C nukleotidų inversiją ir 151 nukleotido pozicijoje stebimą G→A nukleotidų inversiją (12 lentelė).

12 lentelė. B. canis Bc28.1 geno sekų palyginimas su B. canis sekomis, patalpintomis į Genų banką iš Prancūzijos (FR) (KP863714.1; KP863713.1; CS019629.1) Table 12. Comparsion of B. canis Bc28.1 gene sequences with sequences of B. canis deposited in GenBank from France (FR) (KP863714.1; KP863713.1; CS019629.1)

Sekos gautos Nukleotidų skirtumai Lietuvoje ir Prancūzijoje 1 77 83 94 149 151 247 328 329 340 421 434 469 478 519 574 586 612 34.01 genotipas A A C A G G T C A T A G T C A A G G (KP863714.1) FR 11Kr T G ...... C . . . C . . 60Sn T G ...... C . . . C . . 10 Klp T G ...... C . . . C . . 9 Klp T G ...... C . . . C . . 18Sn T G ...... C . . . C . . 26Kr T G ...... C . . . C . . 39Sn T G ...... C . . . C . . 14Kr T G ...... C . . . C . A 13Klp T G . G ...... C ...... 1Pnvz T G . G ...... C ...... 1Vln T G . G ...... C ...... 1Ked T G . G ...... C ...... 50 Sn T G . G ...... C ...... 1Klp T G . G ...... C . . . C . . 5Mar T G . G ...... C . . . C . . 1 Sn T G . G A ...... C . . . C . . B (KP863713.1) FR A G C G G A T C A T A C T C C A G G 4Mar T ...... 21Kr T ...... C . . 4Klp T . . . A ...... C . . 15 Sn T . . . A ...... C . . 57 Sn T . . . A ...... C . . 19Kr T . . . A ...... C A . A (CS019629.1) FR A G A G G A C A G A C C A T C C G G 12Klp T ...... 2Mar T ...... 35Sn T ...... 67Sn T ...... 6Mar T ...... 3Vln T ...... C A ...... 34/A 4Vln T G C G G G C A G A C C A T A A G G 14Sn ...... 8Kr ...... 12Kr ...... A . . . T . . C . . Tyrimo metu gautų sekų numeriai ir mėginių surinkimo vietos: Kr – Kriaučeliūno klinika; Sn – Šnaucerio klinika; Klp – Klaipėda; Pnvz – Panevėžys; Vln – Vilnius; Ked- Kedainiai; Mar – Marijampolė. The representative sequences obtained in this study: Sample numbers; Sampling locations: Kr – Kriauceliunas veterinary clinic; Sn – Siaurio Snauceris veterinary clinic; Klp – Klaipėda; Pnvz – Panevėžys; Vln – Vilnius; Ked- Kedainiai; Mar – Marijampolė.

Jeigu 478 pozicijoje yra T nukleotidas, tai mėginys priskiriamas A genotipui, jeigu C nukleotidas – gali būti B arba 34.01 genotipai. B genotipas nuo 34.01 atskiriamas pagal G→A inversiją 151 pozicijoje. Jeigu šioje pozicijoje nustatomas G nukleotidas, tai mėginiai priskiriami 34.01 genotipui, jei stebimas A nukleotidas – B genotipui. Iš 32 sekų 16 sekų (50,0 %) nustatytas 34.01 genotipas, 6 sekose (18,8 %) – B ir 6 sekose (18,8 %) – A genotipai. Keturiose (12,5 %) šunų mėginiuose buvo identifikuota dviejų B. canis genotipų koinfekcija: keturiose sekose 151 pozicijoje stebimas G nukleotidas, kuris būdingas 34.01 genotipo sekoms, ir 478 pozicijoje stebimas T nukleotidas, būdingas A genotipo sekoms. Todėl toks B. canis genotipas apibūdintas kaip „mišrus“ – 34.01/A.

26 pav. Filogenetinis medis B. canis Bc28.1 geno sekų pagrindu sudarytas naudojant artimiausio kaimyno metodą, Kimura 2 parametro modelį. Medžio šakų susikirtimo taškuose esantys skaičiai nurodo filogenetinių ryšių patikimumo vertes (angl. Bootstrap values). Analizuojamos sekos: Vilnius (Vln); Kėdainiai (Ked); Marijampolė (Mar); Klaipėda (Klp); Panevėžys (Pnvz); Siaurio Šnaucerio klinika (Sn); Kriaučeliūno klinika (Kr) Genų banko sekos – prieigos numeris; patogeno rūšis; genotipas; iš kokio organizmo išskirtos; šalis (Prancūzija – France) Fig. 26. The phylogenetic tree based on B. canis Bc28.1 gene sequences, created using Neighbour- joining method and Kimura 2-parameter model with bootstrap analysis of 1000 replicates. The representative sequences obtained in this study: Sample numbers; Sampling location – Vilnius (Vln); Kedainiai (Ked); Marijampole (Mar); Klaipeda (Klp); Panevežys (Pnvz); Siaurio Snaucerio Veterinary Clinic (Sn); Kriauceliuno Veterinary Clinic (Kr); Sequences with accession numbers have been taken from GenBank for comparison. The names of species, name of B. canis isolates derived from cultures, identification source (host), and the name of country are given after accession numbers

B. canis Bc28.1 geno filogenetinis medis buvo sudarytas įtraukiant 32 sekas, gautas šio tyrimo metu, ir tris B. canis Bc28.1 geno sekas (išskirtos iš šunų) iš Prancūzijos (KP863713.1; KP863714.1; CS019629), patalpintas Genų banke (26 pav.). Filogenetiniame medyje B. canis padermės pasiskirsto į tris klasterius pagal genotipus (A; B; 34.01). Bc28.1 - 34.01 ir Bc28.1 – B genotipo sekos sudaro vieną bendrą grupę. „Mišraus“ genotipo (Bc28.1-A/ Bc28.1-34,01) sekos yra genetiškai artimiausios su Bc28.1-A genotipo sekomis ir kartu sudaro bendrą klasterį.

3.13. B. canis genotipų pagal 18S rRNR ir Bc28.1 genus paplitimas Lietuvoje

Remiantis 18S rRNR geno PGR-RFIP ir sekų analize, Lietuvoje 94 (83,9 %) šunims buvo nustatytas užsikrėtimas mišraus (A/B) B. canis genotipo patogenais (27 pav.). Šis genotipas buvo aptiktas visuose tirtuose regionuose, išskyrus Kėdainius. Virulentiškesnis B. canis B genotipas buvo nustatytas tik vienam šuniui vakarinėje Lietuvos dalyje (Klaipėdoje). Šunų užsikrėtimas A genotipo B. canis patogenais nustatytas Kaune, Klaipėdoje, Kėdainiuose ir Panevėžyje.

27 pav. B. canis genotipų pasiskirstymas Lietuvoje pagal 18S rRNR (a) ir Bc28.1 (b) genus remiantis PGR-RFIP analize Fig. 27. Distribution of B. canis strains in Lithuania based on18S rRNA (a) and Bc28.1 (b) genes PCR-RFLP analysis

Remiantis Bc28.1 geno PGR-RFIP ir sekų analize, Lietuvoje 57 (53,7 %) šunims buvo nustatytas užsikrėtimas virulentiškesnio B genotipo B. canis patogenais (27 pav.). Užsikrėtimas šio genotipo patogenais buvo nustatytas Kauno, Klaipėdos, Marijampolės ir Panevėžio miestuose. B. canis A genotipas buvo identifikuotas 19 (17,9 %) babezioze sergančių šunų iš Klaipėdos, Kauno ir Marijampolės. Šunų užsikrėtimas (20,8 %; 22/106) 34.01 genotipo B. canis patogenais buvo nustatytas Vilniuje, Kaune, Kėdainiuose ir Klaipėdoje, o užsikrėtimas (7,5 % 8/106) A/34.01 genotipo patogenais – Kaune, Marijampolėje ir Vilniuje.

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Dirofiliariozė Lietuvoje. Iki 2001 metų šunų poodinės dirofiliariozės infekcijos buvo registruojamos tik pietiniuose Europos regionuose (Otranto et al., 2013). Šunų užsikrėtimas D. repens rūšies nematodais pastaraisiais dešimtmečiais nustatytas daugelyje centrinės ir rytų Europos šalių: 13,0–49,2 % Serbijoje (Tasić et al., 2008, 2012; Spasojević-Kosić et al., 2012, 2014), 11,7–37,5 % Lenkijoje (Demiaszkiewicz et al., 2009, 2014; Swiatalska and Demiaszkiewicz, 2010; Osińska et al., 2014), 20,0–34,5 % Slovakijoje (Miterpáková et al., 2008, 2010; Iglódyová et al., 2012), 4,3–20,5 % Rumunijoje (Ciocan et al., 2010, 2013; Ilie et al., 2012; Ionică et al., 2015), 15,8 % Latvijoje (Vekšins et al., 2014), 14,0 % Vengrijoje (Fok et al., 2007), 9,0 % Čekijoje (Svobodová et al., 2006) ir 6,8 % Vokietijoje (Pantchev et al., 2009). Taip pat D. repens rūšies nematodų paplitimas užregistruotas Olandijos (Overgaauw and Van Dijk, 2009), Austrijos (Silbermayr et al., 2014; Fuehrer et al., 2016), Baltarusijos (Șuleșco et al., 2016) ir Ukrainos (Sałamatin et al., 2013) teritorijose. Estija ir Suomija yra šiauriausios Europos šalys, kuriose aptinkami D. repens rūšies helmintai (Jokelainen et al., 2016; Pietikäinen et al., 2017). Klimato kaita, globalinis atšilimas, žmonių ir naminių šunų migracija Europoje yra pagrindiniai faktoriai, lemiantys šių helmintų plitimą Europos šalyse (Genchi et al., 2011b, 2009). Geografinis dirofiliariozės paplitimas yra priklausomas ir nuo tinkamo vektoriaus paplitimo. Aplinkos ir klimato kaita daro didelę įtaką vektorių dauginimuisi ir platesniam paplitimui esamose ir naujose teritorijose, kur jie gali veikti kaip infekcijos šaltinis (Cancrini et al., 2006; Genchi et al., 2011b). Lietuvoje paplitusios uodų rūšys (A. vexans, C. annulata, C. pipiens, A. maculipennis, O. caspius ir O. excrucians) yra potencialūs D. repens helmintų vektoriai (Bernotiene, 2006; Simón et al., 2012), tačiau tikslios uodų rūšys, turinčios įtakos parazitų paplitimui Lietuvoje, nėra nustatytos. Reikalingi papildomi tyrimai, kurie padėtų nustatyti D. repens vystymuisi ir pernašai tinkamus vektorius, ir būtų galima įvertinti jų užsikrėtimą dirofiliarijų lervomis. Lietuvoje paplitusi dirofiliarijų rūšis ir šunų užsikrėtimas iki šiol nebuvo nenustatytas. Visuomenėje ir tarp veterinarijos gydytojų buvo pasklidusi klaidinga informacija (autoriaus žiniomis): manoma, kad Lietuvoje paplitusi šunų širdies kirminų liga (D. immitis). Šio tyrimo metu pirmą kartą Lietuvoje buvo nustatytas šunų užsikrėtimas D. repens rūšies helmintais ir atliktas rūšies identifikavimas ir apibūdinimas naudojant molekulinius ir morfologinius tyrimo metodus. Dirofiliarijų rūšiniai skirtumai daro didelę įtaką pasireiškusios ligos patogenezei (McCall et al., 2008b; Simón et al., 2012). D. immitis rūšies helmintai sukelia širdies kirminų ligą, kurios metu pasireiškia gyvybei pavojingi pažeidimai šunų organizme (Rawlings, 1980). Mažiau pavojingą poodinę dirofiliariozės infekciją šunims ir žmonėms sukelia D. repens rūšies

69 parazitai (Bredal et al., 1998; Rocconi et al., 2012; Borkowski et al., 2015). Tikslus Lietuvoje paplitusių dirofiliarijų rūšies nustatymas suteikia galimybę parinkti tinkamą prevenciją, gydymą ir prognozuoti ligos baigtį žmonių ir šunų infekcijų atveju. Tyrimo rezultatai parodė, kad prieglaudose laikomų šunų užsikrėtimas dirofiliarioze Lietuvoje siekė 19,0 %, o naminių šunų – 1,9 %. Visi užsikrėtę šunys niekada nebuvo išvykę iš Lietuvos teritorijos ribų, o tai įrodo, kad šie parazitai paplitę Lietuvos teritorijoje ir tarp tarpinių (uodų) ir galutinių (šunų) šeimininkų. Tyrimo metu nustatytas užsikrėtimas poodine dirofiliarioze tarp skirtingose aplinkos sąlygose gyvenančių šunų populiacijų. Panašus prieglaudų šunų užsikrėtimas D. repens patogenais nustatytas kaimyninėse šalyse: Latvijoje (15,8 %; 22/139) (Vekšins et al., 2014) ir Lenkijoje (11,3 %; 14/124) (Wróblewska et al., 2016). Rumunijoje (2,2 %; 2/92) (Ciocan et al., 2010) ir Italijoje (3,4 %; 4/118) (Giangaspero et al., 2013) prieglaudų šunų užsikrėtimas poodine dirofiliarioze buvo mažesnis negu Lietuvoje ir kaimyninėse Lietuvos šalyse. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad prieglaudų šunys dirofiliarioze buvo užsikrėtę labiau negu naminiai, o skirtumas buvo statistiškai reikšmingas. Skirtingam prieglaudų šunų ir naminių šunų užsikrėtimui dirofiliarioze įtakos gali turėti keletas faktorių. Nustatymo metodikų jautrumas yra vienas iš faktorių, galinčių daryti įtaką tokiems rezultatams. Mikrofiliarijų nustatymui naminių šunų kraujyje buvo naudojamas kraujo citomorfologinis tyrimas, o prieglaudų šunų – modifikuotasis Knoto testas ir molekulinė analizė. Modifikuotasis Knoto testas yra jautresnis, nes atlikimo metodikos ypatumai turi įtakos lervų sukoncentravimui (Newton and Wright, 1956). Maža mikrofiliarijų invazija gali daryti įtaką klaidingai neigiamam citomorfologinio tyrimo rezultatui. Prieglaudų šunys dažniausiai sugaunami valkataujantys mažiau urbanizuotose teritorijose – tai vienas iš pagrindinių faktorių lemenčių užsikrėtimo riziką. Tokia aplinka gali turėti įtakos didesnam valkataujančių šunų kontaktui su vektoriais, negu šunų, gyvenančių žmonių aplinkoje. Naminiai šunys, prižiūrimi žmonių, turi mažesnį kontaktą su vektoriais, dažniau lankosi veterinarijos įstaigose ir profilaktiškai apsaugomi nuo parazitų. Tyrimų rezultatai rodo, kad prieglaudų šunys gali būti pagrindinis dirofiliariozės infekcijos šaltinis Lietuvoje. Atsižvelgiant į tai, kad šunys yra pagrindinis rezervuarinis šeimininkas, toks šunų užsikrėtimas kelia grėsmę žmonių susirgimams. Norint kontroliuoti situaciją, turėtų būti įvestos griežtesnės taisyklės prieglaudų šunų prevencijoje nuo parazitų ir skiriama daugiau dėmesio visuomenės švietimui dėl tinkamo augintinių apsaugojimo nuo ektoparazitų pernešamų ligų. Žmonių dirofiliariozės atvejai per pastarąjį dešimtmetį užregistruoti penkiuose skirtinguose Lietuvos regionuose: Vilniuje, Kaune, Klaipėdoje, Ukmergėje ir Utenoje. Penki žmonių susirgimų atvejai užregistruoti centriniame ir rytiniame (Kaune, Vilniuje) Lietuvos

70 regione, kur buvo nustatyti ir šunų užsikrėtimo atvejai. Septyni iš devynių žmonių niekada nebuvo išvykę į šalis, kuriose paplitusi dirofiliariozė. Tai rodo, kad žmonių poodinės dirofiliariozės sukėlėjai endemiškai paplitę Lietuvos teritorijoje. Žmonių dirofiliariozės susirgimai pasireiškia sporadiškai Lietuvoje ir kaimyninėse šalyse (Latvijoje, Lenkijoje), kuriose pirmieji susirgimai buvo nustatyti panašiu metu, kaip ir Lietuvoje (Zarnowska-Prymek et al., 2008; Melbarde-Gorkusa et al., 2011; Cielecka et al., 2012). Šalyse, kuriose dirofiliariozės susirgimai žmonėms buvo nustatyti gerokai anksčiau negu rytinėje Europos dalyje, pastaruoju metu susirgimų skaičius dramatiškai išaugo (Genchi et al., 2011a; Simón et al., 2012; Sałamatin et al., 2013; Genchi and Kramer, 2017). Ši epidemiologinė dirofiliariozės situacija Europoje rodo, kad šalyse, kuriose šie patogenai anksčiau nebuvo paplitę, įskaitant ir Baltijos šalis, galima tikėtis spartaus žmonių susirgimų skaičiaus didėjimo ateityje. Remiantis iki šiol publikuotais duomenimis, endosimbiotinės bakterijos Wolbachia buvo nustatytos 26 filiarijų rūšyse (Kozek, 2005; Taylor et al., 2005; Lustigman et al., 2014). Šio tyrimo metu Lietuvoje pirmą kartą buvo nustatytas šunų, sergančių dirofiliarioze (D. repens), užsikrėtimas Wolbachia endosimbiotinėmis bakterijomis. Šių bakterijų DNR buvo nustatyta daugiau negu 80 % visų šunų, infekuotų D. repens parazitais. Kitų autorių publikacijose Wolbachia endobakterijos Europoje buvo nustatytos 30,6–52,6 % šunų, infekuotų D. repens ar D. immitis parazitais (Tabar et al., 2013; Landum et al., 2014). Tuo metu Azijos žemyne esančioje Turkijos dalyje Wolbachia buvo aptikta tik 6,2 %, iš visų D. immitis patogenais užsikrėtusių šunų (Simsek and Ciftci, 2016). Filogenetinės analizės duomenys rodo, kad Wolbachia endobakterijos, randamos D. repens ir D. immitis parazituose, formuoja vieną grupę, o padermių giminingumo pasiskirstymas priklauso nuo šeimininko rūšies, kurioje šios bakterijos sudaro simbiozę (Bandi et al., 1998; Bouchery et al., 2013). Šie rezultatai gali paskatinti tolimesnius tyrimus šioje srityje, siekiant pagerinti supratimą apie simbiozę tarp Wolbachia ir Dirofilaria spp. patogenų. Antibiotikų terapijos efektyvumas gydant šunis, užsikrėtusius širdies kirminų ligą, yra įrodytas ir įtrauktas į Amerikos Širdies Kirminų asociacijos pateiktas gaires (Nelson et al., 2014). Tačiau antibiotikų efektyvumas gydant poodinę dirofiliariozę kol kas nėra plačiai ištirtas. Tokia strategija nėra įtraukta į oficialias Europos dirofiliariozės ir angiostrongiliozės asociacijos gydymo gaires (ESDA, 2017). D. repens ir D. immitis rūšių vystymosi ciklas, biologinis ir genetinis giminingumas yra artimi, todėl manoma, kad antibiotikų panaudojimas gali duoti teigiamų rezultatų gydant poodinę dirofiliariozę (Giannelli et al., 2013). Atsižvelgiant į šiuos duomenis ir šio tyrimo metu gautus rezultatus, turėtų būti skiriamas didesnis dėmesys tyrimams, siekiant įvertinti antibiotikų efektyvumą prieš šias bakterijas.

Pastaruosius dešimtmečius širdies kirminų ligos atvejai šunims, atvežtiems iš pietinių šalių, buvo registruojami centrinės ir rytų Europos regionuose (Genchi et al., 2011b). Praėjus keliems metams D. immitis parazitų rūšis tapo endeminė šiose teritorijose: Vengrijoje (Jacsó et al., 2009), Čekijoje (Svobodová et al., 2006), Vokietijoje (Kronefeld et al., 2014), Lenkijoje (Swiatalska and Demiaszkiewicz, 2010), Rumunijoje (Mircean et al., 2012). D. repens ir D. immitis rūšių parazitai sparčiai plinta Europoje, tačiau paplitimas skiriasi (Baneth et al., 2016). Nepaisant to, kad abiejų rūšių vystymuisi reikalingos vienodos sąlygos (Genchi et al., 2009), poodinė dirofiliariozė paplitusi labiau į rytus, o širdies kirminų liga išsilaiko labiau pietinėje ir centrinėje Europos dalyse. Tokiam rūšių paplitimui įtakos gali turėti keletas faktorių (Genchi et al., 2011b). Širdies kirminų liga šunims dažniausiai baigiasi letaliai dėl helmintų vystymosi širdies ir plaučių kraujagyslėse, todėl infekuoti šunys trumpesnį laiką būna infekcijos platintojai. Poodinės dirofiliariozės atveju klinikiniai simptomai būna nežymūs arba infekcija pasireiškia subklinikine forma, todėl šie šunys gali platinti patogenus net keletą metų. Širdies kirminų liga sukelia ryškiai pastebimus simptomus, todėl infekuoti šunys būna atvežami į veterinarijos įstaigas, kuriose būna suteikiamas gydymas ir užkertamas kelias infekcijos plitimui. Abiejų rūšių dirofiliarijų lervų vystymuisi tinkami tie patys uodai, reikalingas vienodas laikas ir tos pačios klimato sąlygos (Genchi et al., 2009). Lietuvoje paplitusios uodų rūšys (pvz: C. pipiens s.l., A. maculipennis s.l., A. vexans), kurios tinkamos D. immitis lervų vystymuisi (Bernotienė, 2012). Remiantis šiais faktais ir tuo, kad D. repens rūšies helmintai paplitę Lietuvoje, galima prognozuoti D. immitis rūšies parazitų plitimą į Lietuvos teritoriją. Šio tyrimo metu aprašytas širdies kirminų atvejis rodo, kad šunys, atvykę iš pietinių šalių, gali veikti kaip infekcijos šaltinis Lietuvoje paplitusiems uodams. Tokių atvejų gali daugėti dėl laisvo žmonių ir naminių gyvūnų migracijos reglamentavimo (Rogers and Randolph, 2006). Todėl labai svarbu sudaryti aiškias rekomendacijas veterinarijos ir gyvūnų priežiūros specialistams, kurios užtikrintų ankstyvą prevenciją ir gydymą gyvūnams, atvykusiems iš endeminių šalių. Širdies kirminų atvejis, patvirtintas serologiniais, mikroskopiniais ir molekuliniais metodais, Lietuvoje aprašytas pirmą kartą. Pritaikytas gydymas pagal Amerikos Širdies Kirminų asociacijos pateiktas rekomendacijas buvo efektyvus. Koinfekcijos. Pastaraisiais dešimtmečiais vektorių pernešamų patogenų sukeliamų ligų susirgimų skaičius Lietuvoje ir Europoje sparčiai auga (Beugnet and Marié, 2009; Paulauskas et al., 2014; Zamokas et al., 2014). Šunys naudojami medžioklėje ir lauko sąlygomis laikomi šunys turi didesne tikimybę turėti kontaktą su skirtingų rūšių ektoparazitais (Cardoso et al., 2010). Didesnį kontaktą su skirtingais vektoriais gali turėti ir namuose laikomi šunys, kurie dažnai vedžiojami parkuose, ganyklose ar miškingose teritorijose ir nėra apsaugomi tinkamomis prevencijos priemonėmis (Beugnet and Marié, 2009). Tai gali paskatinti užsikrėtimą skirtingais

72 vektorių pernešamais patogenais. Šiltesnio klimato zonose, kur sutinkamas didelis spektras skirtingų vektorių, koinfekcijos šunims nustatomos tarp Ehrlichia, Anaplasma, Babesia, Borrelia, Bartonella, Rickettsia ir Dirofilaria spp. patogenų (Beall et al., 2008; Sainz et al., 2015; Capelli et al., 2018). Šio tyrimo metu Lietuvoje iš 42 mėginių, kuriuose buvo aptikti D. repens helmintai, devyniuose (21,42 %) buvo nustatyti B. canis patogenai ir viename (2,38 %) mėginyje aptikti trys patogenai: D. repens, A. phagocytophilum, B. canis. Slovakijoje atliktame tyrime 2,18 % šunų, užsikrėtusių D. repens parazitais, buvo užsikrėtę ir D. immitis rūšies parazitais (Víchová et al., 2014). Iš 366 D. repens teigiamų mėginių dvylikoje (3,27 %) buvo aptikti A. phagocytophilum ir keturiolikoje (3,55 %) B. canis patogenai. Viename mėginyje buvo nustatyti trys patogenai: D. repens, A. phagocytophilum ir B. canis. Tyrimų rezultatai rodo, kad šunys, užsikrėtę dirofiliarioze, gali būti užsikrėtę ir kitais vektorių platinamais patogenais. Koinfekcijų atvejai gali komplikuoti veterinarijos gydytojų darbą ir sudaryti sąlygas klysti diagnozuojant, gydant bei vertinant prognozę (Cardoso et al., 2010; De Tommasi et al., 2013). Nustačius vienos rūšies patogeną šunims reikėtų atlikti papildomus diagnostikos tyrimus dėl užsikrėtimo kitais patogenais, kurie paplitę toje pačioje teritorijoje. Šalyse, kuriose paplitusios skirtingos vektorių pernešamų patogenų rūšys, reikėtų sudaryti rekomendacijas vektorių pernešamų ligų diagnostikai (De Tommasi et al., 2013). Tokiose rekomendacijose galėtų būti nurodomos toje šalyje dažniausiai sutinkamos vektorių pernešamų patogenų ligos, diagnostikos metodai bei užregistruoti medikamentai, tinkami šių lygų gydymui. Šio tyrimo rezultatai bei anksčiau Lietuvoje atlikti tyrimai rodo, kad šalyje galima tikėtis B. canis, A. phagocytophilum, D. repens patogenų sukeliamų ligų šunims (Radzijevskaja et al., 2008; Paulauskas et al., 2014; Zamokas et al., 2014). Visi šie patogenai gali būti nustatomi mažiau jautriais mikroskopijos ir labiau jautriais molekuliniais metodais iš kraujo mėginių. Šio tyrimo rezultatai gali būti naudingi kuriant ir vystant infekcinių ligų molekulinės diagnostikos rinkinius, taikant realaus laiko dauginės PGR metodą (angl. multiplex real time PCR detection), kurio pagalba galima būtų nustatyti keletą patogenų vienu metu (Courtney et al., 2004; Hojgaard et al., 2014). Skirtingų ligų diagnostikos rinkiniai galėtų būti sudaromi remiantis epidemiologiniais duomenimis. Tokios galimybės galėtų sumažinti kaštus, diagnostinių klaidų tikimybę ir sutrumpintų diagnostikos laiką (De Tommasi et al., 2013). Europoje D. reticulatus erkės platina B. canis patogenus, o I. ricinus yra pagrindinis A. phagocytophilum vektorius (Homer et al., 2000; Sainz et al., 2015). Šių rūšių erkės plačiai paplitusios ir Lietuvos teritorijoje (Han et al., 2005; Paulauskas et al., 2006, 2015). Šunų granuliocitinės anaplazmozės sukėlėjai (A. phagocytophilum) buvo nustatyti D. reticulatus erkėse, surinktose nuo laukinių gyvūnų (Matsumoto et al., 2009). Manoma, kad šie patogenai patenka į Dermacentor spp. erkių organizmą kartu su gyvūnų krauju ir tuo metu atlikus tyrimą

73 galima aptikti jų DNR. Tačiau šių erkių gebėjimas pernešti anaplazmozės patogenus nėra patvirtintas tyrimais. Lietuvoje A. phagocytophilum patogenai buvo aptikti D. reticulatus erkėse, surinktose pievose ir pamiškėse (Paulauskas et al., 2012). Panašus tyrimas buvo atliktas Ukrainoje, Černobylio draudžiamoje zonoje, kurioje beveik nevyksta jokia žmonių veikla. Šioje teritorijoje surinktose D. reticulatus erkėse taip pat buvo aptikti A. phagocytophilum patogenai (Karbowiak et al., 2014). Šio darbo metu ištyrus šunų kraujo B. canis teigiamus mėginius (61), trijuose (4,9 %) mėginiuose nustatyti A. phagocytophilum patogenai. Atsižvelgiant į tyrimų rezultatus, galima manyti, kad D. reticulatus erkės gali būti ne tik B. canis vektorius, tačiau gali pernešti ir A. phagocytophilum patogenus. Mišrių infekcijų tyrimų rezultatams įtakos gali turėti skirtingų rūšių vektorių (pvz.: I. ricinus ir D. reticulatus) maitinimasis ant to paties šeimininko. Vieno šuns kraujo mėginyje buvo aptikti trys skirtingi patogenai (A. phagocytophilum, B. canis, D. repens), kurių vektoriai (uodai ir erkės) biologinėje klasifikacijoje priklauso skirtingų klasių nariuotakojams. Todėl reikalingi papildomi eksperimentai, leidžiantys patvirtinti arba paneigti D. reticulatus erkių gebėjimą pernešti A. phagocytophilum patogenus. Svarbu paminėti, kad granuliocitine anaplazmoze gali sirgti ir žmonės (Bakken et al., 1994). Šunų anaplazmozės infekcijos, nustatytos šiuo tyrimu, ir anksčiau atlikti tyrimai su erkėmis Lietuvoje rodo, kad žmonių granuliocitinės anaplazmozės susirgimai Lietuvoje yra tikėtini. Todėl reikėtų atkreipti žmonių ir medicinos specialistų dėmesį dėl susidariusios anaplazmozės epidemiologinės situacijos Lietuvoje. B. canis genetinė įvairovė. B. canis rūšies pirmuonys yra pagrindinis šunų babeziozės sukėlėjas Europoje. Šie pirmuonys dvidešimtame amžiuje buvo paplitę pietų Europoje, o pastaraisiais dešimtmečiai sparčiai plinta į centrinės ir šiaurinės Europos šalis: Kroatiją (Beck et al., 2009), Vokietiją (Heile et al., 2006), Vengriją (Földvári et al., 2005), Olandiją (Matjila et al., 2005), Čekiją (Mitkova et al., 2017), Slovakiją (Kubelová et al., 2011), Lenkiją (Adaszek and Winiarczyk, 2008), Šveicariją (Sager et al., 2005), Lietuvą (Paulauskas et al., 2014; Zamokas et al., 2014), Latviją (Berzina et al., 2013), Estiją (Tiškina et al., 2016), Jungtinę karalystę (Holm et al., 2006; De Marco et al., 2017) ir Norvegiją (Øines et al., 2010). Pagal klinikinius simptomus ir patogenezę šunų babeziozė yra skirstoma į komplikuotą ir nekomplikuotą formas (Matijatko et al., 2012). Komplikuotos babeziozės formos atveju letali ligos baigtis pasitaiko 50 % atvejų (Welzl et al., 2001). Šio tyrimo metu “Siaurio Šnaucerio” veterinarijos klinikoje buvo registruojamos komplikuotos ir nekomplikuotos šunų babeziozės ligos formos (duomenys nepateikti rezultatuose). Remiantis klinikiniais ir laboratoriniais duomenimis, šunims, sirgusiems komplikuota babeziozės forma, pasireiškė ūminis inkstų nepakankamumas, dauginis organų nepakankamumas, cerebrinės babeziozės komplikacija ir hepatopatija. Iš 55 šunų, kurių kraujo mėginiai buvo naudojami genotipų nustatymui,

74 komplikuota ligos forma sirgo 8 (14,5 %) šunys. Šunų mirtingumas sergant babezioze Vengrijoje ir Kroatijoje atliktuose tyrimuose siekė 12–20 %. Kitose Europos šalyse (Italijoje, Ispanijoje, Portugalijoje, Olandijoje, Lenkijoje) šunų mirtingumas siekė <5 %, o Prancūzijoje ~1 % (Matijatko et al., 2012; Carcy et al., 2015). Lenkijoje atlikti tyrimai, naudojant 18S rRNR geną, išskyrė du B. canis genotipus (A ir B) (Adaszek and Winiarczyk, 2008). Vėliau buvo ištirtas šių genotipų virulentiškumas atsižvelgiant į šunų, sergančių babezioze, trombocitopenijos lygį. Nustatyta, kad B genotipo B. canis padermės yra labiau virulentiškos (trombocitopenijos atžvilgiu), negu A genotipo (Adaszek et al., 2009). Šio tyrimo metu užsikrėtimas labiau virulentiško B genotipo B. canis padermėmis nustatytas tik viename mėginyje. Tai leidžia teigti, kad komplikuotas ligos formas Lietuvoje sukelia kitų padermių B. canis patogenai. Kyla klausimas, ar trombocitopenijos lygis yra susijęs su komplikuotų/nekomplikuotų formų pasireiškimu ir ar 18S rRNR genas yra tinkamas padermių virulentiškumo tyrimams. Pastaruoju metu mokslininkai kelia versijas, kad didžiausią įtaką komplikuotų ir nekomplikuotų formų pasireiškimui daro skirtingas organizmo atsakas į patogeną (Babesia spp.), tačiau faktoriai, lemiantys skirtingą ligos patogeniškumą, nėra nustatyti (Matijatko et al., 2007; Schetters et al., 2009). Šunų babeziozė pagal savo patogenezę yra lyginama su žmonių maliarija, kurią sukelia Plasmodium genties pirmuonys, besidauginantys žmogaus eritrocituose (Matijatko et al., 2012). Su graužikais atliktas tyrimas parodė, kad skirtingos pelių genetinės padermės pasižymi skirtingu imuniniu atsaku į Plasmodium genties patogenus (de Roode et al., 2004). Norint patikrinti šią hipotezę šunų babeziozės atžvilgiu, reikalingi genetinės įvairovės tyrimai, apimantys ir pirmuonis (B. canis), ir jų šeimininkus (šunis). Iš viso Europoje žinomi keturi B. canis genotipai, kurie išskiriami pagal GA→AG nukleotidų pakeitimus 610 ir 611 mažojo rRNR subvieneto gene (visame ilgyje) (Cacciò et al., 2002; Beck et al., 2009; Schaarschmidt et al., 2013). Pastaraisiais metais nustatyta dar viena padermė (be pavadinimo), kuri aptikta šunyse, sergančiuose subklinikine ligos forma (Łyp et al., 2015, 2016). Tyrime nustatyti anksčiau minėti A ir B genotipai pagal GA→AG nukleotidų pakeitimus. Padermės, nustatytos šunims, sergantiems subklinikine babeziozės forma, vietoje adenino ir/ar guanino turėjo timino nukleotidą. Šiame darbe pateikti rezultatai pagal 18S rRNR geno polimorfizmus išskyrė tris B. canis genotipus: A, B ir mišrų A/B, o atlikus sekų analizę nustatyti dar du unikalių sekų variantai pagal 80 ir 92-93 pozicijose esančių nukleotidų pakeitimus. Mišraus genotipo padermėms būdingas abiejų nukleotidų polimorfizmas tose pačiose pozicijose – stebimi GA/AG(RR) dvigubi pikai sekų chromatogramose. Šio genotipo B. canis patogenai buvo aptikti šunų kraujo mėginiuose ir erkėse Kroatijoje, Šveicarijoje (Beck et al., 2009; Schaarschmidt et al., 2013). Mišraus genotipo atvejai kitų šalių atliktuose tyrimuose

75 buvo paaiškinami užsikrėtimu skirtingų genotipų (A ir B) patogenais vienu metu (koinfekcija) (Beck et al., 2009). Tačiau toks užsikrėtimas skirtingomis padermėmis vienu metu yra mažai tikėtinas ir tai rodo šio tyrimo metu nustatytas 83,9 % (94/112) šunų užsikrėtimas „mišriu“ A/B genotipu skirtinguose Lietuvos regionuose. Tokį mišrų genotipo pasireiškimą galima paaiškinti genetiniu heterogeniškumu tarp 18S rRNR sekų kopijų (Beck et al., 2009; Schaarschmidt et al., 2013). Bc28.1 genas koduoja 28 kDa GPI baltymą, esantį merozoito paviršiuje, kuris daro įtaką patogeno patekimui į eritrocitus (Yang et al., 2012). Manoma, kad genetiniai tyrimai, naudojant šį geną, gali padėti sukurti efektyvesnes vakcinas nuo babeziozės. Vakarų Europos šalyse komerciškai prieinamos vakcinos buvo kuriamos išskiriant antigenus iš in vitro kultūrose auginamų B. canis patogenų (Schetters et al., 1995). Buvo pastebėta, kad iš A tipo patogenų in vitro kultūrose išskirti antigenai neapsaugo nuo B tipo patogenų padermių. Todėl vakcinų veiksmingumas gali būti labai susijęs su skirtingų genotipų patogenų paplitimu skirtinguose regionuose (Carcy et al., 2015). Prancūzijoje atlikti tyrimai parodė 24,6 % vakcinos efektyvumą (Bourdoiseau, 2006; Carcy et al., 2015). Prancūzijoje nustatytas šunų užsikrėtimas A genotipo 25,6 % ir 34.01 genotipo 26,9 % (pagal Bc28.1 geną) B. canis padermėmis rodo, kad vienas iš šių genotipų gali būti neatsparus naudojamai vakcinai. Dėl šios priežasties siūloma kurti polivalentes vakcinas, įterpiant skirtingų B. canis padermių antigenus (Moreau et al., 1989; Schetters et al., 1997). Lietuvoje šio tyrimo metu nustatytas šunų užsikrėtimas skirtingų genotipų B. canis patogenais gali būti naudingas polivalentės vakcinos kūrime. B. canis padermių paplitimas Europoje pagal Bc28.1 geną nustatytas keturiose Europos vietovėse: Pietvakarių (Portugalija), Vakarų (Prancūzija), Rytų (Vengrija, Slovakija, Rumunija, Bulgarija, Ukraina) ir Šiaurės rytų (Lenkija ir Rusija) regionuose (Carcy et al., 2015). Pietvakarių (89,7 %) ir rytų Europoje (57,1 %) didžiausias šunų užsikrėtimas nustatytas B genotipo B. canis patogenais. Šiaurės rytų Europoje didžiausias užsikrėtimas nustatytas A genotipo (72,1 %) B. canis patogenais. Užsikrėtimas 34.01 genotipo (27 %) B. canis patogenais iki šiol buvo nustatytas tik Prancūzijoje. Šio tyrimo metu Lietuvoje nustatytas užsikrėtimas trimis B. canis genotipais: B (53,7 % 57/106) A (17,9 % 19/106) ir 34.01 (20,8 % 22/106). B. canis 34.01 genotipo padermės buvo nustatytos visuose tirtuose Lietuvos regionuose (Vilniuje, Kaune, Klaipėdoje, Kedainiuose, Marijampolėje, Panevėžyje). Tai leidžia manyti, kad šis genotipas paplitęs visoje Lietuvoje. Keturiuose mėginiuose buvo aptiktas mišrus A/34 genotipas. Panašūs rezultatai buvo gauti ir Prancūzijoje, kur mokslininkai tai aiškina dviejų padermių infekcija vienu metu (Carcy et al., 2015). Tai, kad 34.01 genotipo paplitimas stebimas tik Lietuvoje ir Prancūzijoje, kelia daug klausimų. Manoma, kad ekologiniai veiksniai turi įtakos tam tikrų genotipų išlikimui (Carcy et al., 2015). Yra žinoma, kad skirtingų rūšių erkių

76 paplitimas lemia skirtingų rūšių babezijų patogenų paplitimą (Uilenberg, 2006). Todėl manoma, kad erkių genetinė įvairovė gali būti vienas iš faktorių, lemiančių tokį patogenų padermių paplitimą. Norint atsakyti į susidariusius klausimus reikėtų palyginti Prancūzijoje ir Lietuvoje paplitusių D. reticulatus erkių genetinę įvairovę. Taip pat reikalinga atlikti B. canis genetinės įvairovės tyrimus kitose Europos šalyse, kuriose duomenų apie skirtingų padermių paplitimą kol kas nėra (pvz.: Latvijoje, Estijoje).

IŠVADOS

1. Panaudojus mikroskopinius, morfologinius ir molekulinius tyrimo metodus nustatyta, kad Lietuvoje šunų dirofiliariozę sukelia D. repens rūšies parazitai. Tyrimų rezultatai parodė, kad šunų užsikėtimas dirofiliarioze priklauso nuo gyvūnų laikymo sąlygų – prieglaudų šunys buvo dažniau užsikrėtę (19,0 %) negu naminiai (1,9 %). Aprašyti žmonių užsikrėtimo atvejai rodo, kad žmonių infekcijas Lietuvoje taip pat sukelia D. repens rūšies parazitai. Visi šie tyrimai leidžia teigti, kad dirofiliariozė endemiškai paplitusi Lietuvos teritorijoje. 2. Šunų širdies kirminų atvejis, patvirtintas serologiniais, mikroskopiniais ir molekuliniais metodais, Lietuvoje aprašytas pirmą kartą. Šis širdies kirminų atvejis rodo, kad šunys, atvežti iš Pietų Europos šalių į Šiaurės Rytų Europos šalis, gali veikti kaip infekcijos šaltinis vietinių uodų populiacijoms. Tokie atvejai suteikia galimybę širdies kirminų sukėlėjams plisti į naujas teritorijas. 3. Panaudojus molekulinius tyrimo metodus nustatyta, kad didžioji dalis (81,6 %) šunų, sergančių dirofiliarioze, buvo užsikrėtę Wolbachia endosimbiotine bakterija. Remiantis ankstesnėmis publikacijomis ir šio tyrimo rezultatais galima teigti, kad Wolbachia endobakterijos turėtų būti vienas iš taikinių taikant gydymą šunims, sergantiems poodine dirofiliarioze Lietuvoje. 4. Tyrimo metu nustatytos šunų B. canis skirtingų padermių sukeltos infekcijos šešiuose Lietuvos regionuose. Babezioze sergančiuose šunyse identifikuoti trys B. canis genotipai pagal 18S rRNR geną: A, B, ir „mišrus“ A/B, iš kurių Lietuvoje vyrauja A/B (83,9 %) genotipas. Remiantis B. canis 18S rRNR geno sekų analize identifikuoti 5 sekų variantai. Pagal Bc28.1 identifikuotos keturios B. canis padermės: A, B, 34,01 ir A/34,01. Didžiausias paplitimas buvo nustatytas B genotipo B. canis patogenais (53,7 %). Remiantis Bc28.1 geno sekų analize nustatyta, kad B. canis padermės pasižymi dideliu heterogeniškumu: identifikuota 13 skirtingų sekų variantų. 5. Lietuvoje aptiktų B. canis padermių genetinė įvairovė ir pasiskirstymas skyrėsi nuo kitų Europos regionų. B. canis genotipų paplitimas Lietuvoje buvo panašiausias su Rytų ir Vakarų Europoje nustatytu paplitimu. B. canis Bc28.1-34.01 genotipas, aptiktas Lietuvoje, iki šiol buvo nustatytas tik Prancūzijoje. 6. Nustatytos šunų koinfekcijos tarp A. phagocytophilum, B. canis ir D. repens patogenų rodo, kad nustačius vienos rūšies vektorių pernešamus patogenus tikslinga atlikti papildomą diagnostiką kitų vektorių pernešamų patogenų atžvilgiu. Atsižvelgiant į tai, kad anaplazmoze gali sirgti ir žmonės, šio tyrimo rezultatai rodo, kad žmonių susirgimai Lietuvoje yra tikėtini.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Abbate, J. M., Napoli, E., Arfuso, F., Gaglio, G., Giannetto, S., Halos, L., Beugnet, F., Brianti, E. 2018. Six-month field efficacy and safety of the combined treatment of dogs with Frontline Tri-Act® and NexGard Spectra®. Parasites and Vectors, 11: 425. 2. Aboge, G. O., Jia, H., Terkawi, M. A., Goo, Y., Kuriki, K., Nishikawa, Y., Igarashi, I., Suzuki, H., Xuan, X. 2007. A novel 57-kDa merozoite protein of Babesia gibsoni is a prospective antigen for diagnosis and serosurvey of canine babesiosis by enzyme-linked immunosorbent assay. Veterinary Parasitology, 149(1-2): 85–94. 3. Adaszek, Ł., Winiarczyk, S. 2008. Molecular characterization of Babesia canis canis isolates from naturally infected dogs in Poland. Veterinary Parasitology, 152(3-4): 235–241. 4. Adaszek, Ł., Winiarczyk, S., Skrzypczak, M. 2009. The clinical course of babesiosis in 76 dogs infected with protozoan parasites Babesia canis canis. Polish Journal of Veterinary Sciences, 12(1): 81–87. 5. Adaszek, Ł., Martinez, A. C., Winiarczyk, S. 2011. The factors affecting the distribution of babesiosis in dogs in Poland. Veterinary Parasitology, 181(2-4):160–165. 6. Albanese, F., Abramo, F., Braglia, C., Caporali, C., Venco, L., Vercelli, A., Ghibaudo, G., Leone, F., Carrani, F., Giannelli, A., Otranto, D. 2013. Nodular lesions due to infestation by Dirofilaria repens in dogs from Italy. Veterinary Dermatology, 24(2): 255–256. 7. Albonico, F., Loiacono, M., Gioia, G., Genchi, C., Genchi, M., Mortarino, M. 2014. Rapid differentiation of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in canine peripheral blood by real- time PCR coupled to high resolution melting analysis. Veterinary Parasitology, 200(1-2): 128–132. 8. Alho, A. M., Fiarresga, A., Landum, M., Lima, C., Gamboa, Ó., Meireles, J., Sales Luís, J., Madeira de Carvalho, L. 2016. A homemade snare: An alternative method for mechanical removal of Dirofilaria immitis in dogs. Veterinary Medicine International, 2016: 1–6. 9. Ambrasienė, D., Turčinavičienė, J., Vaščilo, I., Žygutienė, M. 2004. The prevalence of Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus ticks detected by PCR in Lithuania. Veterinarija ir zootechnika, 28(50): 45–47. 10. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A., Sulzer, A. J. 1980. Canine babesiosis: indirect fluorescent antibody test for a North American isolate of Babesia gibsoni. American Journal of Veterinary Research, 41(12): 2102–2105. 11. Asokliene, L. 2004. Tickborne encephalitis in Lithuania. Weekly releases, 8(26): 2494. 12. Ayoob, A. L., Hackner, S. G., Prittie, J. 2010. Clinical management of canine babesiosis. Journal of Veterinary Emergency and Critical Care, 20(1): 77–89.

13. Bakken, J. S., Dumler, J. S., Chen, S. M., Eckman, M. R., Van Etta, L. L., Walker, D. H. 1994. Human granulocytic ehrlichiosis in the upper Midwest United States. A new species emerging? The Journal of the American Medical Association, 272(3): 212–218. 14. Bandi, C., Anderson, T. J. C., Genchi, C., Blaxter, M. L. 1998. Phylogeny of Wolbachia in filarial nematodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 265(1413): 2407– 2413. 15. Bandi, C., Dunn, A. M., Hurst, G. D. D., Rigaud, T. 2001. Inherited microorganisms, sex- specific virulence and reproductive parasitism. Trends in Parasitology, 17(2): 88–94. 16. Baneth, G., Harrus, S., Ohnona, F. S., Schlesinger, Y. 2009. Longitudinal quantification of Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary Microbiology, 136(3-4): 321–325. 17. Baneth, G., Bourdeau, P., Bourdoiseau, G., Bowman, D., Breitschwerdt, E., Capelli, G., Cardoso, L., Dantas-Torres, F., Day, M., Dedet, J. P., Dobler, G., Ferrer, L., Irwin, P., Kempf, V., Kohn, B., Lappin, M., Little, S., Maggi, R., Mirá, G., Naucke, T., Oliva, G., Otranto, D., Penzhorn, B., Pfeffer, M., Roura, X., Sainz, A., Shaw, S., Shin, S., Solano-Gallego, L., Straubinger, R., Traub, R., Trees, A., Truyen, U., Demonceau, T., Fitzgerald, R., Gatti, D., Hostetler, J., Kilmer, B., Krieger, K., Mencke, N., Mendão, C., Mottier, L., Pachnicke, S., Rees, B., Siebert, S., Stanneck, D., Tarancán Mingote, M., Von Simson, C., Weston, S. 2012. Vector-borne diseases - constant challenge for practicing veterinarians: recommendations from the CVBD World forum. Parasites and Vectors, 5: 55. 18. Baneth, G., Thamsborg, S. M., Otranto, D., Guillot, J., Blaga, R., Deplazes, P., Solano- Gallego, L. 2016. Major parasitic zoonoses associated with dogs and cats in Europe. Journal of Comparative Pathology, 155(1 Suppl): 54–74. 19. Bazzocchi, C., Mortarino, M., Grandi, G., Kramer, L. H., Genchi, C., Bandi, C., Genchi, M., Sacchi, L., McCall, J. W. 2008. Combined ivermectin and doxycycline treatment has microfilaricidal and adulticidal activity against Dirofilaria immitis in experimentally infected dogs. International Journal for Parasitology, 38(12): 1401–1410. 20. Beall, M. J., Chandrashekar, R., Eberts, M. D., Cyr, K. E., Diniz, P. P. V. P., Mainville, C., Hegarty, B. C., Crawford, J. M., Breitschwerdt, E. B. 2008. Serological and molecular prevalence of Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, and Ehrlichia species in dogs from Minnesota. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 8(4): 455–464. 21. Beck, R., Vojta, L., Mrljak, V., Marinculić, A., Beck, A., Živičnjak, T., Cacciò, S. M. 2009. Diversity of Babesia and Theileria species in symptomatic and asymptomatic dogs in Croatia. International Journal for Parasitology, 39(7): 843–848. 22. Beden, U., Hokelek, M., Acici, M., Umur, S., Gungor, I., Sullu, Y. 2007. A case of orbital

dirofilariasis in Northern Turkey. Ophthal. Ophthalmic Plastic & Reconstructive Surgery, 23(4): 329–331. 23. Bernotienė, R. 2006. New and rare for Lithuania insect species, records and destriptions. Volume 18. Vilnius, Lithuania, Lithuanian Entomological Society, 156 pp. 24. Bernotienė, R. 2012. The fauna and seasonal activity of mosquitoes (Diptera: Culicidae) in the Curonian Spit (Russia, Lithuania). European Mosquito Bulletin, 30: 72–78. 25. Berrada, Z. L., Telford, S. R. 2009. Burden of tick-borne infections on American companion animals. Topics in Companion Animal Medicine, 24(4): 175–181. 26. Berzina, I., Capligina, V., Baumanis, V., Ranka, R., Cirule, D., Matise, I. 2013. Autochthonous canine babesiosis caused by Babesia canis canis in Latvia. Veterinary Parasitology, 196(3-4): 515–518. 27. Beugnet, F., Marié, J. L. 2009. Emerging arthropod-borne diseases of companion animals in Europe. Veterinary Parasitology, 163(4): 298–305. 28. Birkenheuer, A. J., Levy, M. G., Breitschwerdt, E. B. 2003. Development and evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni (Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples. Journal of Clinical Microbiology, 41(9): 4172–4177. 29. Birkenheuer, A. J., Correa, M. T., Levy, M. G., Breitschwerdt, E. B. 2005. Geographic distribution of babesiosis among dogs in the United States and association with dog bites: 150 cases (2000-2003). American Veterinary Medical Association, 227(6): 942–947. 30. Bocková, E., Rudolf, I., Kočišová, A., Betášová, L., Venclíková, K., Mendel, J., Hubálek, Z. 2013. Dirofilaria repens microfilariae in Aedes vexans mosquitoes in Slovakia. Parasitology Research, 112(10): 3465–3470. 31. Boldbaatar, D., Battsetseg, B., Matsuo, T., Hatta, T., Umemiya-Shirafuji, R., Xuan, X., Fujisaki, K. 2008. Tick vitellogenin receptor reveals critical role in oocyte development and transovarial transmission of Babesia parasite. Biochemistry and Cell Biology, 86(4): 331–344. 32. Boldbaatar, D., Umemiya-Shirafuji, R., Liao, M., Tanaka, T., Xuan, X., Fujisaki, K. 2010. Multiple vitellogenins from the Haemaphysalis longicornis tick are crucial for ovarian development. Journal of Insect Physiology, 56(11): 1587–1598. 33. Borkowski, P. K., Rymkiewicz, G., Golebiewska, J., Nestoros, N., Romejko-Jarosinska, J., Zarnowska-Prymek, H., Masny, A., Palucki, J., Cielecka, D. 2015. The first case of human autochtonous subconjunctival dirofilariosis in Poland and MALT lymphoma as possible consequence of this parasitosis. Infectious Agents and Cancer, 10(1): 1. 34. Bouchery, T., Lefoulon, E., Karadjian, G., Nieguitsila, A., Martin, C. 2013. The symbiotic role of Wolbachia in Onchocercidae and its impact on filariasis. Clinical Microbiology and Infection, 19(2): 131–140.

35. Bourdoiseau, G. 2006. Canine babesiosis in France. Veterinary Parasitology, 138(1-2):118– 125. 36. Bredal, W. P., Gjerde, B., Eberhard, M. L., Aleksandersen, M., Wilhelmsen, D. K., Mansfield, L. S. 1998. Adult Dirofilaria repens in a subcutaneous granuloma on the chest of a dog. Journal of Small Animal Practice, 39(12): 595–597. 37. Brianti, E., Pennisi, M. G., Brucato, G., Risitano, A. L., Gaglio, G., Lombardo, G., Malara, D., Fogliazza, A., Giannetto, S. 2010. Efficacy of the fipronil 10%+(S)-methoprene 9% combination against Rhipicephalus sanguineus in naturally infested dogs: Speed of kill, persistent efficacy on immature and adult stages and effect of water. Veterinary Parasitology, 170(1-2): 96–103. 38. Cacciò, S. M., Antunovic, B., Moretti, A., Mangili, V., Marinculic, A., Baric, R. R., Slemenda, S. B., Pieniazek, N. J. 2002. Molecular characterisation of Babesia canis canis and Babesia canis vogeli from naturally infected European dogs. Veterinary Parasitology, 106(4): 285– 292. 39. Camacho, A. T., Guitián, F. J., Pallas, E., Gestal, J. J., Olmeda, A. S., Goethert, H. K., Telford, S. R. 2001. Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like agent. Veterinary Record, 149(18): 552–555. 40. Camacho, A. T., Pallas, E., Gestal, J. J., Guitián, F. J., Olmeda, A. S., Telford, S. R., Spielman, A. 2003. Ixodes hexagonus is the main candidate as vector of Theileria annae in northwest Spain. Veterinary Parasitology, 112(1-2): 157–163. 41. Cancrini, G., Magi, M., Gabrielli, S., Arispici, M., Tolari, F., Dell’Omodarme, M., Prati, M. C. 2006. Natural vectors of dirofilariasis in rural and urban areas of the Tuscan region, central Italy. Journal of Medical Entomology, 43(3): 574–579. 42. Cancrini, G., Scaramozzino, P., Gabrielli, S., Di Paolo, M., Toma, L., Romi, R. 2007. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology, 44(6): 1064–1066. 43. Cao, W. C., Zhao, Q. M., Zhang, P. H., Dumler, J. S., Zhang, X. T., Fang, L. Q., Yang, H. 2000. Granulocytic Ehrlichiae in Ixodes persulcatus ticks from an area in China where Lyme disease is endemic. Journal of Clinical Microbiology, 38(11): 4208–4210. 44. Capelli, G., Genchi, C., Baneth, G., Bourdeau, P., Brianti, E., Cardoso, L., Danesi, P., Fuehrer, H. P., Giannelli, A., Ionicǎ, A. M., Maia, C., Modrý, D., Montarsi, F., Krücken, J., Papadopoulos, E., Petrić, D., Pfeffer, M., Savić, S., Otranto, D., Poppert, S., Silaghi, C. 2018. Recent advances on Dirofilaria repens in dogs and humans in Europe. Parasites and Vectors, 11: 663.

45. Carcy, B., Précigout, E., Schetters, T., Gorenflot, A. 2006. Genetic basis for GPI-anchor merozoite surface antigen polymorphism of Babesia and resulting antigenic diversity. Veterinary Parasitology, 138(1-2): 33–49. 46. Carcy, B., Randazzo, S., Depoix, D., Adaszek, L., Cardoso, L., Baneth, G., Gorenflot, A., Schetters, T.P. 2015. Classification of Babesia canis strains in Europe based on polymorphism of the Bc28.1-gene from the Babesia canis Bc28 multigene family. Veterinary Parasitology, 211(3-4): 111–123. 47. Cardoso, L., Costa, Á., Tuna, J., Vieira, L., Eyal, O., Yisaschar-Mekuzas, Y., Baneth, G. 2008. Babesia canis canis and Babesia canis vogeli infections in dogs from northern Portugal. Veterinary Parasitology, 56(3-4): 199–204. 48. Cardoso, L., Yisaschar-Mekuzas, Y., Rodrigues, F. T., Costa, Á., MacHado, J., Diz-Lopes, D., Baneth, G. 2010. Canine babesiosis in northern Portugal and molecular characterization of vector-borne co-infections. Parasites and Vectors, 3(1): 27. 49. Carlyon, J. A., Fikrig, E. 2006. Mechanisms of evasion of neutrophil killing by Anaplasma phagocytophilum. Current Opinion in Hematology, 13(1): 28–33. 50. Carrade, D. D., Foley, J. E., Borjesson, D. L., Sykes, J. E. 2009. Canine granulocytic anaplasmosis: A review. Journal of Veterinary Internal Medicine, 23(6): 1129–1141. 51. Carret, C., Walas, F., Carcy, B., Grande, N., Précigout, É., Moubri, K., Schetters, T. P., Gorenflot, A. 1999. Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes. Journal of Eukaryotic Microbiology, 46(3): 298–303. 52. Casiraghi, M., Anderson, T. J., Bandi, C., Bazzocchi, C., Genchi, C. 2001. A phylogenetic analysis of filarial nematodes: Comparison with the phylogeny of Wolbachia endosymbionts. Parasitology, 1: 93–103. 53. Chen, S. M., Dumler, J. S., Bakken, J. S., Walker, D. H. 1994. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. Journal of Clinical Microbiology, 32(3): 589–595. 54. Choi, K. S., Garyu, J., Park, J., Dumler, J. S. 2003. Diminished adhesion of Anaplasma phagocytophilum-infected neutrophils to endothelial cells, is associated with reduced expression of leukocyte surface selectin. Infection and Immunity, 71(8): 4586–4594. 55. Cielecka, D., Zarnowska-Prymek, H., Masny, A., Salamatin, R., Wesołowska, M., Gołab, E. 2012. Human dirofilariosis in Poland: the first cases of autochthonous infections with Dirofilaria repens. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 19(3): 445–450.

56. Ciocan, R., Darăbuș, G., Jascó, O., Fok, É. 2010. Detection of Dirofilaria spp. in dogs by PCR. Bulletin UASVM, Veterinary Medicine, 67(2): 40–44. 57. Ciocan, R., Mederle, N., Jacsó, O., Tánczos, B., Fok, É. 2013. Autochthonous cases of Dirofilaria in dogs from Timiș County (Western Part) Romania. Global Journal of Medical Research, 13(2): 29–34. 58. Conrad, P., Thomford, J., Yamane, I., Whiting, J., Bosma, L., Uno, T., Holshuh, H. J., Shelly, S. 1991. Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs. American Veterinary Medical Association, 199(5): 601–605. 59. Courtney, J. W., Kostelnik, L. M., Zeidner, N. S., Massung, R. F. 2004. Multiplex real-time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi. Journal of Clinical Microbiology, 42(7): 3164–3168. 60. Damle, A. S., Iravane Bajaj, J. A., Khaparkhuntikar, M. N., Maher, G. T., Patil, R. V. 2014. Microfilaria in human subcutaneous dirofilariasis: A case report. Journal of Clinical and Diagnostic Research, 8(3): 113–114. 61. Day, M. J. 2011. One health: The importance of companion animal vector-borne diseases. Parasites and Vectors, 4(1): 49 62. de la Fuente, J., Massung, R. F., Wong, S. J., Chu, F. K., Lutz, H., Meli, M., von Loewenich, F. D., Grzeszczuk, A., Torina, A., Caracappa, S., Mangold, A. J., Naranjo, V., Stuen, S., Kocan, K. M. 2005. Sequence analysis of the msp4 gene of Anaplasma phagocytophilum strains. Journal of Clinical Microbiology, 43(3): 1309–1317. 63. de la Fuente, J., Ruiz-Fons, F., Naranjo, V., Torina, A., Rodríguez, O., Gortázar, C. 2008. Evidence of Anaplasma infections in European roe deer (Capreolus capreolus) from southern Spain. Research in Veterinary Science, 84(3): 382–386. 64. de Marco, M. D. M. F., Hernández-Triana, L. M., Phipps, L. P., Hansford, K., Mitchell, E. S., Cull, B., Swainsbury, C. S., Fooks, A.R., Medlock, J. M., Johnson, N. 2017. Emergence of Babesia canis in southern England. Parasites and Vectors, 10(1): 241. 65. de Roode, J. C., Culleton, R., Cheesman, S. J., Carter, R., Read, A. F. 2004. Host heterogeneity is a determinant of competitive exclusion or coexistence in genetically diverse malaria infections. Proceedings. Biological Sciences, 271(1543): 1073–1080. 66. De Tommasi, A. S., Otranto, D., Dantas-Torres, F., Capelli, G., Breitschwerdt, E. B., De Caprariis, D. 2013. Are vector-borne pathogen co-infections complicating the clinical presentation in dogs? Parasites and Vectors, 6: 97. 67. de Vries, P. J., Visser, L. G., Vetter, H. C., Muller, H. P., Polderman, A. M. 2003. Migrating subcutaneous swellings due to dirofilariasis after a visit to the South of France. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde, 147(12): 566–569. (In Dutch)

68. Demiaszkiewicz, A. W., Polańczyk, G., Pyziel, A. M., Kuligowska, I., Lachowicz, J. 2009. The first foci of dirofilariosis of dogs evoked by Dirofilaria repens Railliet et Henry, 1911 in central Poland. Wiadomości parazytologiczne, 55(4): 367–370. (In Polish) 69. Demiaszkiewicz, A. W., Polańczyk, G., Osińska, B., Pyziel, A. M., Kuligowska, I., Lachowicz, J., Sikorski, A. 2014. The prevalence and distribution of Dirofilaria repens in dogs in the Mazovian Province of central-eastern Poland. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 21(4): 701–704. 70. Di Cesare, A., Otranto, D., Di Giulio, E., Simonato, G., Latrofa, M. S., La Torre, F., Coccia, G., Traversa, D. 2013. Microfilarial periodicity of Dirofilaria repens in naturally infested dogs. Parasitology Research, 112(12): 4273–4279. 71. Duarte, S. C., Linhares, G. F., Romanowsky, T. N., da Silveira Neto, O. J., Borges, L. M. 2008. Assessment of primers designed for the subspecies-specific discrimination among Babesia canis canis, Babesia canis vogeli and Babesia canis rossi by PCR assay. Veterinary Parasitology, 152(1-2): 16–20. 72. Dumler, J. S., Barbet, A. F., Bekker, C. P. J., Dasch, G. A., Palmer, G. H., Ray, S. C., Rikihisa, Y., Rurangirwa, F. R. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51(6): 2145–2165. 73. Dumler, J. S., Barat, N. C., Barat, C. E., Bakken, J. S. 2007. Human granulocytic anaplasmosis and macrophage activation. Clinical Infectious Diseases, 45(2): 199–204. 74. Eberts, M. D., Vissotto de Paiva Diniz, P. P., Beall, M. J., Stillman, B. A., Chandrashekar, R., Breitschwerdt, E. B. 2011. Typical and atypical manifestations of Anaplasma phagocytophilum infection in dogs. Journal of the American Animal Hospital Association, 47(6): 86–94. 75. EEA, 2017. Climate change, impacts and vulnerability in Europe 2016. An indicator-based report. Luxembourg, Publications Office of the European Union, 419 pp. 76. Egenvall, A., Bjöersdorff, A., Lilliehöök, I., Olsson Engvall, E., Karlstam, E., Artursson, K., Hedhammar, A., Gunnarsson, A. 1998. Early manifestations of granulocytic ehrlichiosis in dogs inoculated experimentally with a Swedish Ehrlichia species isolate. Veterinary Record, 143(15): 412–417. 77. Egenvall, A., Lilliehöök, I., Bjöersdorff, A., Olsson Engvall, E., Karlstam, E., Artursson, K., Heldtander, M., Gunnarsson, A. 2000. Detection of granulocytic Ehrlichia species DNA by

PCR in persistently infected dogs. Veterinary Record, 146(7): 186–190. 78. Eichenberger, R. M., Riond, B., Willi, B., Hofmann-Lehmann, R., Deplazes, P. 2016. Prognostic markers in acute Babesia canis infections. Journal of Veterinary Internal Medicine, 30(1): 174–182. 79. ESCCAP, 2017. Worm Control in Dogs and Cats, Europe. ESCCAP Guideliene 01 third edition, July 2017. http://www.esccap.org/uploads/docs/0x0o7jda_ESCCAP_Guideline_ 01_Third_Edition_July_2017.pdf. Downloaded on 8 January 2018. 80. ESDA, 2017. Guidelines for clinical management of subcutaneous dirofilariosis in dogs and cats, July 2017. https://www.esda.vet/wp-content/uploads/2017/11/GUIDELINES-FOR- CLINICAL-MANAGEMENT-OF-SUBCUTANEOUS-DIROFILARIOSIS-IN-DOGS-AND- CATS.pdf. Downloaded on 24 March 2019. 81. Falkenö, U., Tasker, S., Osterman-Lind, E., Tvedten, H. W. 2013. Theileria annae in a young Swedish dog. Acta Veterinaria Scandinavica, 55: 50. 82. Fallah Tafti, M. R., Hajilary, A., Siatiri, H., Rokni, M. B., Mobedi, I., Mowlavi, G. 2010. Ocular dirofilariasis, a case report. Iran. Journal of Parasitology, 5(3): 64–68. 83. Fenn, K., Blaxter, M. 2006. Wolbachia genomes: revealing the biology of parasitism and mutualism. Trends in Parasitology, 22(2): 60–65. 84. Fodor, E., Fok, E., Maka, E., Lukáts, O., Tóth, J. 2009. Recently recognized cases of ophthalmofilariasis in Hungary. European Journal of Ophthalmology, 19(4): 675–678. 85. Foggie, A. 1956. The effect of tick-borne fever on the resistance of lambs to staphylococci. Journal of Comparative Pathology, 66(3): 278–85. 86. Földvári, G., Hell, É., Farkas, R. 2005. Babesia canis canis in dogs from Hungary: detection by PCR and sequencing. Veterinary Parasitology, 127(3-4): 221–226. 87. Fok, É., Kiss, G., Majoros, G., Jacsó, O., Farkas, R., Gyurkovszky, M. 2007. Preliminary results of an epidemiological survey on dirofilariosis of dogs and cats in Hungary. Mappe Parassitologiche, 8: 195–196. 88. Foster, J. M., Ganatra, M., Kamal, I., Ware, J., Makarova, K., Ivanova, N., Bhattacharyya, A., Kapatral, V., Kumar, S., Posfai, J., Vincze, T., Ingram, J., Moran, L., Lapidus, A., Omelchenko, M., Kyrpides, N., Ghedin, E., Wang, S., Goltsman, E., Joukov, V., Ostrovskaya, O., Tsukerman, K., Mazur, M., Comb, D., Koonin, E., Slatko, B. 2005. The Wolbachia genome of Brugia malayi: endosymbiont evolution within a human pathogenic nematode. PLoS Biology, 3(4): 121. 89. Foster, J. M., Kumar, S., Ford, L., Johnston, K. L., Ben, R., Graeff-Teixeira, C., Taylor, M. J. 2008. Absence of Wolbachia endobacteria in the non-filariid nematodes Angiostrongylus cantonensis and A. costaricensis. Parasites and Vectors, 1(1): 31.

90. Freyburger, L., Lemaitre, L., Medaille, C., Oberli, F., Fanchon, L., Ergamo, P. 2011. Comparative safety study of two commercialised vaccines against canine babesiosis induced by Babesia canis. Parasite, 18(4): 311–318. (In French) 91. Fuehrer, H. P., Auer, H., Leschnik, M., Silbermayr, K., Duscher, G., Joachim, A. 2016. Dirofilaria in humans, dogs, and vectors in Austria (1978-2014) - from imported pathogens to the endemicity of Dirofilaria repens. PLoS Neglected Tropical Diseases, 10(5): e0004547. 92. Fukumoto, S., Suzuki, H., Igarashi, I., Xuan, X. 2005. Fatal experimental transplacental Babesia gibsoni infections in dogs. International Journal for Parasitology, 35(9): 1031–1035. 93. Furlanello, T., Fiorio, F., Caldin, M., Lubas, G., Solano-Gallego, L. 2005. Clinicopathological findings in naturally occurring cases of babesiosis caused by large form Babesia from dogs of northeastern Italy. Veterinary Parasitology, 134(1-2): 77–85. 94. Furtado, A. P., Melo, F. T. V., Giese, E. G., dos Santos, J. N. 2010. Morphological redescription of Dirofilaria immitis. Journal for Parasitology, 96(3): 499–504. 95. Gabrielli, S., Otašević, S., Ignjatović, A., Savić, S., Fraulo, M., Arsić-Arsenijević, V., Momčilović, S., Cancrini, G. 2015. Canine Babesioses in Noninvestigated Areas of Serbia. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 15(9): 535–538. 96. Gaunt, S., Beall, M., Stillman, B., Lorentzen, L., Diniz, P., Chandrashekar, R., Breitschwerdt, E. 2010. Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findings. Parasites and Vectors, 3(1): 33. 97. Genchi, C., Genchi, M., Petry, G., Kruedewagen, E. M., Schaper, R. 2013. Evaluation of the efficacy of imidacloprid 10 % / moxidectin 2.5 % (advocate®, advantage® multi, bayer) for the prevention of Dirofilaria repens infection in dogs. Parasitology Research, 112(Suppl 1): 81–89. 98. Genchi, C., Rinaldi, L., Cascone, C., Mortarino, M., Cringoli, G. 2005. Is heartworm disease really spreading in Europe? Veterinary Parasitology, 133(2-3): 137–148. 99. Genchi, C., Rinaldi, L., Mortarino, M., Genchi, M., Cringoli, G. 2009. Climate and Dirofilaria infection in Europe. Veterinary Parasitology, 163(4): 286–292. 100. Genchi, C., Kramer, L. H., Rivasi, F. 2011a. Dirofilarial infections in Europe. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 11(10): 1307–1317. 101. Genchi, C., Mortarino, M., Rinaldi, L., Cringoli, G., Traldi, G., Genchi, M. 2011b. Changing climate and changing vector-borne disease distribution: The example of Dirofilaria in Europe. Veterinary Parasitology, 176(4): 295–299. 102. Genchi, C., Kramer, L. 2017. Subcutaneous dirofilariosis (Dirofilaria repens): an infection spreading throughout the old world. Parasites and Vectors, 10(Suppl 2): 517. 103. Giangaspero, A., Marangi, M., Latrofa, M. S., Martinelli, D., Traversa, D., Otranto, D.,

Genchi, C. 2013. Evidences of increasing risk of dirofilarioses in southern Italy. Parasitology Research, 112(3): 1357–1361. 104. Giannelli, A., Ramos, R. A. N., Traversa, D., Brianti, E., Annoscia, G., Bastelli, F., Dantas- Torres, F., Otranto, D. 2013. Treatment of Dirofilaria repens microfilariaemia with a combination of doxycycline hyclate and ivermectin. Veterinary Parasitology, 197(3-4): 702– 704. 105. Gioia, G., Lecová, L., Genchi, M., Ferri, E., Genchi, C., Mortarino, M. 2010. Highly sensitive multiplex PCR for simultaneous detection and discrimination of Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in canine peripheral blood. Veterinary Parasitology, 172(1-2): 160–163. 106. Goldstein, R. E., Eberts, M. D., Beall, M. J., Thatcher, B., Chandrashekar, R., Alleman, A. R. 2014. Performance comparison of SNAP® 4Dx® plus and AccuPlex®4 for the detection of antibodies to Borrelia burgdorferi and Anaplasma phagocytophilum. The International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 12(2): 141–147. 107. Gorezis, S., Psilla, M., Asproudis, I., Peschos, D., Papadopoulou, C., Stefaniotou, M. 2006. Intravitreal dirofilariasis: A rare ocular infection. Orbit, 25(1): 57–59. 108. Grab, D. J., Nyarko, E., Barat, N. C., Nikolskaia, O. V., Dumler, J. S. 2007. Anaplasma phagocytophilum-Borrelia burgdorferi coinfection enhances chemokine, cytokine, and matrix metalloprotease expression by human brain microvascular endothelial cells. Clinical and Vaccine Immunology, 14(11): 1420–1424. 109. Granick, J. L., Armstrong, P. J., Bender, J. B. 2009. Anaplasma phagocytophilum infection in dogs: 34 cases (2000–2007). Journal of the American Veterinary Medical Association, 234(12): 1559–1565. 110. Greene, C. E. 2012. Infectious Diseases of the Dog and Cat. 4th Edition, Philadelphia, USA, W.B. Saunders Company, 1376 pp. 111. Groen, J., Koraka, P., Nur, Y., Avsic-Zupanc, T., Goessens, W., Ott, A., Osterhaus, A. 2002. Serologic evidence of ehrlichiosis among humans and wild animals in the Netherlands. The European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 21(1): 46–49. 112. Han, D., Yoon, W.-K., Hyun, C. 2014. Cerebellar encephalopathy from diminazene aceturate (beneril) toxicity in a dog. Korean Journal of Veterinary Research, 54(3): 193–196. 113. Han, X., Juceviciene, A., Uzcategui, N. Y., Brummer-Korvenkontio, H., Zygutiene, M., Jääskeläinen, A., Leinikki, P., Vapalahti, O. 2005. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus in Ixodes ricinus ticks in Lithuania. Journal of Medical Virology, 77(2): 249–256. 114. Hansford, K. M., Pietzsch, M. E., Cull, B., Medlock, J. M. 2014. Tickborne diseases: importation of R sanguineus into the UK via dogs. Veterinary Record, 175(15): 385–386.

115. Hargis, A. M., Lewis, T. P., Duclos, D. D., Loeffler, D. G., Rausch, R. L. 2002. Dermatitis associated with microfilariae (Filarioidea) in 10 dogs. Veterinary Dermatology, 10(2): 95–107. 116. Harrus, S., Waner, T., Aizenberg, I., Foley, J. E., Poland, A. M., Bark, H. 1998. Amplification of ehrlichial DNA from dogs 34 months after infection with Ehrlichia canis. Journal of Clinical Microbiology, 36(1): 73–76. 117. Harrus, S., Alleman, A. R., Bark, H., Mahan, S. M., Waner, T. 2002. Comparison of three enzyme-linked immunosorbant assays with the indirect immunofluorescent antibody test for the diagnosis of canine infection with Ehrlichia canis. Veterinary Microbiology, 86(4): 361–368. 118. Hartelt, K., Rieker, T., Oehme, R. M., Brockmann, S. O., Müller, W., Dorn, N., 2007. First evidence of Babesia gibsoni (Asian genotype) in dogs in Western Europe. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 7(2): 163–166. 119. Heile, C., Heydorn, A. O., Schein, E. 2006. Dermacentor reticulatus (Fabricius, 1794) - distribution, biology and vector for Babesia canis in Germany. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift, 119(7-8): 330–334. (In German) 120. Herron, M. J., Nelson, C. M., Larson, J., Snapp, K. R., Kansas, G. S., Goodman, J. L. 2000. Intracellular parasitism by the human granulocytic ehrlichiosis bacterium through the P-selectin ligand, PSGL-1. Science, 288(5471): 1653–1656. 121. Hojgaard, A., Lukacik, G., Piesman, J. 2014. Detection of Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti, with two different multiplex PCR assays. Ticks and Tick-borne Diseases, 5(3): 349–351. 122. Holm, L. P., Kerr, M. G., Trees, A. J., McGarry, J. W., Munro, E. R., Shaw, S. E. 2006. Fatal babesiosis in an untravelled British dog. Veterinary Record, 159(6): 179–180. 123. Homer, M. J., Aguilar-Delfin, I., Telford, S. R., Krause, P. J., Persing, D. H. 2000. Babesiosis. Clinical Microbiology Reviews, 13(3): 451–469. 124. Hunfeld, K. P., Hildebrandt, A., Gray, J. S. 2008. Babesiosis: Recent insights into an ancient disease. International Journal for Parasitology, 38(11): 1219–1237. 125. Iglódyová, A., Miterpáková, M., Hurnková, Z., Antolová, D., Dubinský, P., Letková, V. 2012. Canine dirofilariosis under specific environmental conditions of the Eastern Slovak Lowland. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 19(1): 57–60. 126. Ilie, M. S., Imre, K., Hotea, I., Darabuş, G. 2012. Survey of canine dirofilariosis from southwestern Romania - preliminary results. In: Grandi, G., Kramer, L., Genchi, C., editors. Third European Dirofilaria Days, Parma, Italy, pp. 68. 127. Ilyasov, B., Kartashev, V., Bastrikov, N., Madjugina, L., González-Miguel, J., Morchón, R., Simón, F. 2015. Thirty cases of human subcutaneous dirofilariasis reported in Rostov-on-Don (Southwestern Russian Federation). Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 33(4):

233–237. 128. Imre, M., Farkas, R., Ilie, M. S., Imre, K., Dǎrǎbuş, G. 2013. Survey of babesiosis in symptomatic dogs from Romania: occurrence of Babesia gibsoni associated with breed. Ticks and Tick-borne Diseases, 4(6): 500–502. 129. Ionică, A. M., Matei, I. A., Mircean, V., Dumitrache, M. O., D’Amico, G., Győrke, A., Pantchev, N., Annoscia, G., Albrechtová, K., Otranto, D., Modrý, D., Mihalca, A. D. 2015. Current surveys on the prevalence and distribution of Dirofilaria spp. and Acanthocheilonema reconditum infections in dogs in Romania. Parasitology Research, 114(3): 975–982. 130. Ionică, A. M., Matei, I. A., D’Amico, G., Bel, L. V., Dumitrache, M. O., Modrý, D., Mihalca, A. D. 2017. Dirofilaria immitis and D. repens show circadian co-periodicity in naturally co- infected dogs. Parasites and Vectors, 10(1): 116. 131. Irwin, P. J. 2009. Canine babesiosis: From molecular taxonomy to control. Parasites and Vectors, 2(Suppl 1): S4. 132. Irwin, P. J. 2010. Canine Babesiosis. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 33(4): 885–904. 133. Ishihara, K., Kitagawa, H., Ojima, M., Yagata, Y., Suganuma, Y. 1978. Clinicopathological studies on canine dirofilarial hemoglobinuria. The Japanese Journal of Veterinary Science, 40(5): 525–537. 134. Ishihara, K., Kitagawa, H., Sasaki, Y. 1988. Efficacy of heartworm removal in dogs with dirofilarial hemoglobinuria using flexible alligator forceps. The Japanese Journal of Veterinary Science, 50(3): 739–745. 135. Jacobson, L. S., Reyers, F., Berry, W. L., Viljoen, E. 1996. Changes in haematocrit after treatment of uncomplicated canine babesiosis: a comparison between diminazene and trypan blue, and an evaluation of the influence of parasitaemia. Journal of the South African Veterinary Association, 67(2): 77–82. 136. Jacobson, L. S. 2006. The South African form of severe and complicated canine babesiosis: Clinical advances 1994-2004. Veterinary Parasitology, 138(1-2): 126–139. 137. Jacsó, O., Mándoki, M., Majoros, G., Pétsch, M., Mortarino, M., Genchi, C., Fok, É. 2009. First autochthonous Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) infection in a dog in Hungary. Helminthologia, 46(3): 159–161. 138. Jäderlund, K. H., Bergström, K., Egenvall, A., Hedhammar, Å. 2009. Cerebrospinal fluid PCR and antibody concentrations against Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorferi sensu lato in dogs with neurological signs. Journal of Veterinary Internal Medicine, 23(3): 669–672.

139. Jaenson, T. G. T., Jaenson, D. G. E., Eisen, L., Petersson, E., Lindgren, E. 2012. Changes in the geographical distribution and abundance of the tick Ixodes ricinus during the past 30 years in Sweden. Parasites and Vectors, 5: 8. 140. Jalovecka, M., Hajdusek, O., Sojka, D., Kopacek, P., Malandrin, L. 2018. The complexity of piroplasms life cycles. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 8: 248. 141. Jankauskaitė, A., Pockevičius, A., Petkevičius, S. 2011. Roundworms in dogs subcutaneous tissue in Lithuania - the first case. Vet Info, 79(5): 30–31. 142. Jefferies, R., Ryan, U. M., Irwin, P. J. 2007a. PCR-RFLP for the detection and differentiation of the canine piroplasm species and its use with filter paper-based technologies. Veterinary Parasitology, 144(1-2): 20–27. 143. Jefferies, R., Ryan, U. M., Jardine, J., Broughton, D. K., Robertson, I. D., Irwin, P. J. 2007b. Blood, Bull Terriers and Babesiosis: further evidence for direct transmission of Babesia gibsoni in dogs. Australian Veterinary Journal, 85(11): 459–463. 144. Jefferies, R., Ryan, U. M., Jardine, J., Robertson, I. D., Irwin, P. J. 2007c. Babesia gibsoni: detection during experimental infections and after combined atovaquone and azithromycin therapy. Experimental Parasitology, 117(2): 115–23. 145. Jensen, J., Simon, D., Escobar, H. M., Soller, J. T., Bullerdiek, J., Beelitz, P., Pfister, K., Nolte, I. 2007. Anaplasma phagocytophilum in dogs in Germany. Zoonoses and Public Health, 54(2): 94–101. 146. Jokelainen, P., Mõtsküla, P. F., Heikkinen, P., Ülevaino, E., Oksanen, A., Lassen, B. 2016. Dirofilaria repens microfilaremia in three dogs in Estonia. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 16(2): 136–138. 147. Juceviciene, A. 2002. Prevalence of tick-borne-encephalitis virus antibodies in Lithuania. Journal of Clinical Virology, 25(1): 23–27. 148. Juceviciene, A., Zygutiene, M., Leinikki, P., Brummer-Korvenkontio, H., Salminen, M., Han, X., Vapalahti, O. 2005. Tick-borne encephalitis virus infections in Lithuanian domestic animals and ticks. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 37(10): 742–746. 149. Kaiser, L., Spickard, R. C., Sparks, H. V., Williams, J. F. 1989. Dirofilaria immitis: alteration of endothelium-dependent relaxation in the in vivo canine femoral artery. Experimental Parasitology, 69(1): 9–15. 150. Kalaivani, K., Senthil-Nathan, S., Murugesan, A. G. 2012. Biological activity of selected Lamiaceae and Zingiberaceae plant essential oils against the dengue vector Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae). Parasitology Research, 110(3): 1261–1268. 151. Karakashian, S. J., Rudzinska, M. A., Spielman, A., Lewengrub, S., Piesman, J., Shoukrey, N. 1983. Ultrastructural studies on sporogony of Babesia microti in salivary gland cells of the tick

Ixodes dammini. Cell and Tissue Research, 231(2): 275–287. 152. Karbowiak, G., Vichová, B., Slivinska, K., Werszko, J., Didyk, J., Peťko, B., Stanko, M., Akimov, I. 2014. The infection of questing Dermacentor reticulatus ticks with Babesia canis and Anaplasma phagocytophilum in the Chernobyl exclusion zone. Veterinary Parasitology, 204(3-4): 372–375. 153. Kartashev, V., Afonin, A., González-Miguel, J., Sepúlveda, R., Simón, L., Morchón, R., Simón, F. 2014. Regional Warming and Emerging Vector-Borne Zoonotic Dirofilariosis in the Russian Federation, Ukraine, and Other Post-Soviet States from 1981 to 2011 and Projection by 2030. BioMed Research International, 1–11. 154. Kartashev, V., Tverdokhlebova, T., Korzan, A., Vedenkov, A., Simón, L., González-Miguel, J., Morchón, R., Siles-Lucas, M., Simón, F. 2015. Human subcutaneous/ocular dirofilariasis in the Russian Federation and Belarus, 1997-2013. International Journal of Infectious Diseases, 33: 209–211. 155. Khanna, V., Tilak, K., Rasheed, S., Mukhopadhyay, C. 2014. Identification and preservation of intestinal parasites using methylene blue-glycerol mount: a new approach to stool microscopy. Journal of Parasitology Research, 2014: 1–4. 156. Kirillov, D. F., Tarasov, A. V., Shevchuk, E. A., Matina, O. N. 2011. Observation of dirofilariosis in the practical work of the otorhinolaryngologist. Vestnik otorinolaringologii, (5): 70–71. (In Russian) 157. Kohn, B., Galke, D., Beelitz, P., Pfister, K. 2008. Clinical features of canine granulocytic anaplasmosis in 18 naturally infected dogs. Journal of Veterinary Internal Medicine, 22(6): 1289–1295. 158. Kohn, B., Silaghi, C., Galke, D., Arndt, G., Pfister, K. 2011. Infections with Anaplasma phagocytophilum in dogs in Germany. Research in Veterinary Science, 91(1): 71–76. 159. Kozek, W. J. 2005. What is new in the Wolbachia/Dirofilaria interaction? Veterinary Parasitology, 133(2-3): 127–132. 160. Kramer, L., Simón, F., Tamarozzi, F., Genchi, M., Bazzocchi, C. 2005. Is Wolbachia complicating the pathological effects of Dirofilaria immitis infections? Veterinary Parasitology, 133(2-3): 133–136. 161. Krause, P. J. 2019. Human babesiosis. International Journal for Parasitology, 49(2): 165–174. 162. Kronefeld, M., Kampen, H., Sassnau, R., Werner, D. 2014. Molecular detection of Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens and Setaria tundra in mosquitoes from Germany. Parasites and Vectors, 7: 30. 163. Kubelová, M., Sedlák, K., Panev, A., Široký, P. 2013. Conflicting results of serological, PCR and microscopic methods clarify the various risk levels of canine babesiosis in Slovakia: a

complex approach to Babesia canis diagnostics. Veterinary Parasitology, 191(3-4): 353–357. 164. Kubelová, M., Tkadlec, E., Bednář, M., Roubalová, E., Široký, P. 2011. West-to-east differences of Babesia canis canis prevalence in Dermacentor reticulatus ticks in Slovakia. Veterinary Parasitology, 180(3-4): 191–196. 165. Landum, M., Ferreira, C. C., Calado, M., Alho, A. M., Maurício, I. L., Meireles, J. S., Carvalho, L. M. de, Cunha, C., Belo, S. 2014. Detection of Wolbachia in Dirofilaria infected dogs in Portugal. Veterinary Parasitology, 204(3-4): 407–410. 166. Last, R. D., Hill, J. D., Matjila, P. T., Reme, C. A. 2007. A field trial evaluation of the prophylactic efficacy of amitraz-impregnated collars against canine babesiosis (Babesia canis rossi) in South Africa. Journal of the South African Veterinary Association, 78(2): 63–65. 167. Latrofa, M. S., Weigl, S., Dantas-Torres, F., Annoscia, G., Traversa, D., Brianti, E., Otranto, D. 2012. A multiplex PCR for the simultaneous detection of species of filarioids infesting dogs. Acta Tropica, 122(1): 150–154. 168. Lee, S. G., Moon, H. S., Hyun, C. 2008. Percutaneous heartworm removal from dogs with severe heart worm (Dirofilaria immitis) infestation. Journal of Veterinary Science, 9(2): 197– 202. 169. Lefoulon, E., Bain, O., Makepeace, B. L., d’Haese, C., Uni, S., Martin, C., Gavotte, L. 2016. Breakdown of coevolution between symbiotic bacteria Wolbachia and their filarial hosts. PeerJ, 4: 1840. 170. Levin, M. L., Fish, D. 2000. Acquisition of coinfection and simultaneous transmission of Borrelia burgdorferi and Ehrlichia phagocytophila by Ixodes scapularis ticks. Infection and Immunity, 68(4): 2183–2186. 171. Levy, M. G., Breitschwerdt, E. B., Moncol, D. J. 1987. Antibody activity to Babesia canis in dogs in North Carolina. American Journal of Veterinary Research, 48(3): 339–341. 172. Lima, M. L. F., Soares, P. T., Ramos, C. A. N., Araújo, F. R., Ramos, R. A. N., Souza, I. I. F., Faustino, M. A. G., Alves, L. C. A. 2010. Molecular detection of Anaplasma platys in a naturally-infected cat in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 41(2): 381–385. 173. Linda, S., Dina, C., Muza, K. 2012. Occurrence of Dirofilaria spp. in dogs in Latvia (2008- 2011). In Animals. Health. Food Hygiene. International Scientific Conference Proceedings, November 10th, 2006. Jelgava, Latvia, pp. 148–152. 174. Little, S. E. 2010. Ehrlichiosis and anaplasmosis in dogs and cats. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice, 40(6): 1121–1140. 175. Logar, J., Novšak, V., Rakovec, S., Staniša, O. 2001. Subcutaneous infection caused by Dirofilaria repens imported to Slovenia. Journal of Infection, 42(1): 72–74.

176. Lustigman, S., Melnikow, E., Anand, S. B., Contreras, A., Nandi, V., Liu, J., Bell, A., Unnasch, T. R., Rogers, M. B., Ghedin, E. 2014. Potential involvement of Brugia malayi cysteine proteases in the maintenance of the endosymbiotic relationship with Wolbachia. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance, 4(3): 267–277. 177. Łyp, P., Adaszek, Furmaga, B., Winiarczyk, S. 2015. Identification of new 18S rRNA strains of Babesia canis isolated from dogs with subclinical babesiosis. Polish Journal of Veterinary Sciences, 18(3): 573–577. 178. Łyp, P., Bartnicki, M., Staniec, M., Winiarczyk, S., Adaszek, Ł. 2016. Occurrence of different strains of Babesia canis in dogs in eastern Poland. Journal of Veterinary Research, 60(4): 423–427. 179. Magnis, J., Lorentz, S., Guardone, L., Grimm, F., Magi, M., Naucke, T. J., Deplazes, P. 2013. Morphometric analyses of canine blood microfilariae isolated by the Knott’s test enables Dirofilaria immitis and D. repens species-specific and Acanthocheilonema (syn. Dipetalonema) genus-specific diagnosis. Parasites and Vectors, 6: 48. 180. Majláthová, V., Majláth, I., Víchová, B., Gul’ová, I., Derdáková, M., Sesztáková, E., Pet’ko, B. 2011. Polymerase chain reaction confirmation of Babesia canis canis and Anaplasma phagocytophilum in dogs suspected of babesiosis in Slovakia. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 11(11): 1447–1451. 181. Manfredi, M. T., Di Cerbo, A., Genchi, M. 2007. Biology of filarial worms parasitizing dogs and cats. Mappe Parassitologiche, 8: 39–45. 182. Maretzki, C. H., Fisher, D. J., Greene, C. E. 1994. Granulocytic ehrlichiosis and meningitis in a dog. Journal of the American Veterinary Medical Association, 205(11): 1554–1556. 183. Martinod, S., Laurent, N., Moreau, Y. 1986. Resistance and immunity of dogs against Babesia canis in an endemic area. Veterinary Parasitology, 19(3-4): 245–254. 184. Marušić, Z., Stastny, T., Kirac, I., Stojćević, D., Krušlin, B., Tomas, D. 2008. Subcutaneous dirofilariasis caused by Dirofilaria repens diagnosed by histopathologic and polymerase chain reaction analysis. Acta Dermatovenerologica Croatica, 16(4): 222–225. 185. Masny, A., Lewin, T., Salamatin, R., Golab, E. 2011. Autochthonous canine Dirofilaria repens in the vicinity of Warsaw. Polish Journal of Veterinary Sciences, 14(4): 659–61. 186. Massung, R. F., Slater, K. G. 2003. Comparison of PCR assays for detection of the agent of human granulocytic ehrlichiosis, Anaplasma phagocytophilum. Journal of Clinical Microbiology, 41(2): 717–722. 187. Matějů, J., Chanová, M., Modrý, D., Mitková, B., Hrazdilová, K., Žampachová, V., Kolářová, L. 2016. Dirofilaria repens: emergence of autochthonous human infections in the Czech Republic (case reports). BMC Infectious Diseases, 16: 171.

188. Máthé, Á., Vörös, K., Papp, L., Reiczigel, J. 2006. Clinical manifestations of canine babesiosis in Hungary (63 cases). Acta Veterinaria Hungarica, 54(3): 367–385. 189. Matijatko, V., Mrljak, V., Kiš, I., Kučer, N., Foršek, J., Živičnjak, T., Romić, Ž., Šimec, Z., Ceron, J. J. 2007. Evidence of an acute phase response in dogs naturally infected with Babesia canis. Veterinary Parasitology, 144(3-4): 242–250. 190. Matijatko, V., Torti, M., Schetters, T. P. 2012. Canine babesiosis in Europe: How many diseases? Trends in Parasitology, 28(3): 99–105. 191. Matjila, T. P., Nijhof, A. M., Taoufik, A., Houwers, D., Teske, E., Penzhorn, B. L., De Lange, T., Jongejan, F. 2005. Autochthonous canine babesiosis in the Netherlands. Veterinary Parasitology, 131(1-2): 23–29. 192. Matsumoto, K., Grzeszczuk, A., Brouqui, P., Raoult, D. 2009. Rickettsia raoultii and Anaplasma phagocytophilum in Dermacentor reticulatus ticks collected from Bialowieza Primeval Forest European bison (Bison bonasus bonasus), Poland. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 15(Suppl. 2): 286–287. 193. Matsuu, A., Koshida, Y., Kawahara, M., Inoue, K., Ikadai, H., Hikasa, Y., Okano, S., Higuchi, S. 2004. Efficacy of atovaquone against Babesia gibsoni in vivo and in vitro. Veterinary Parasitology, 124(1-2): 9–18. 194. Maurin, M., Bakken, J. S., Dumler, J. S. 2003. Antibiotic susceptibilities of Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum strains from various geographic areas in the United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47(1): 413–415. 195. Mazepa, A. W., Kidd, L. B., Young, K. M., Trepanier, L. A. 2014. Clinical presentation of 26 Anaplasma phagocytophilum-seropositive dogs residing in an endemic area. Journal of the American Animal Hospital Association, 46(6): 405–412. 196. McCall, J. W., Genchi, C., Kramer, L., Guerrero, J., Dzimianski, M. T., Supakorndej, P., Mansour, A. M., McCall, S. D., Supakorndej, N., Grandi, G., Carson, B. 2008a. Heartworm and Wolbachia: therapeutic implications. Veterinary Parasitology, 158(3): 204–214. 197. McCall, J. W., Genchi, C., Kramer, L. H., Guerrero, J., Venco, L. 2008b. Heartworm disease in animals and humans. Advances in Parasitology, 66: 193–285. 198. McCall, J. W., Kramer, L., Genchi, C., Guerrero, J., Dzimianski, M. T., Mansour, A., McCall, S. D., Carson, B. 2014. Effects of doxycycline on heartworm embryogenesis, transmission, circulating microfilaria, and adult worms in microfilaremic dogs. Veterinary Parasitology, 206(1-2): 5–13. 199. Mehlhorn, H., Schein, E., Voigt, W. P. 1980. Light and electron microscopic study on developmental stages of Babesia canis within the gut of the tick Dermacentor reticulatus. Journal of Parasitology, 66(2): 220–228.

200. Mehlhorn, H., Schein, E. 1985. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Advances in Parasitology, 23: 37–103. 201. Melbarde-Gorkusa, I., Abolins, A., Strumfa, I., Martinsons, A., Gardovskis, J. 2011. Human dirofilariasis in Latvia - the first case in surgical practice. Acta Chirurgica Latviensis, 11(1): 172–174. 202. Meyer, A., Todt, C., Mikkelsen, N. T., Lieb, B. 2010. Fast evolving 18S rRNA sequences from Solenogastres (Mollusca) resist standard PCR amplification and give new insights into mollusk substitution rate heterogeneity. BMC Evolutionary Biology, 10: 70. 203. Michalski, M. L., Bain, O., Fischer, K., Fischer, P. U., Kumar, S., Foster, J. M. 2010. Identification and phylogenetic analysis of Dirofilaria ursi (Nematoda: Filarioidea) from Wisconsin black bears (Ursus americanus) and its Wolbachia endosymbiont. Journal of Parasitology, 96(2): 412–419. 204. Mickienė, A., Laiškonis, A., Günther, G., Vene, S., Lundkvist, Å., Lindquist, L. 2002. Tickborne encephalitis in an area of high endemicity in Lithuania: disease severity and long- term prognosis. Clinical Infectious Diseases, 35(6): 650–658. 205. Miller, D. M., Swan, G. E., Lobetti, R. G., Jacobson, L. S. 2012. The pharmacokinetics of diminazene aceturate after intramuscular administration in healthy dogs. Journal of the South African Veterinary Association, 76(3): 146–150. 206. Mircean, V., Dumitrache, M. O., Györke, A., Pantchev, N., Jodies, R., Mihalca, A. D., Cozma, V. 2012. Seroprevalence and geographic distribution of Dirofilaria immitis and tick-borne infections (Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdorferi sensu lato, and Ehrlichia canis) in dogs from Romania. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 12(7): 595–604. 207. Miró, G., Checa, R., Paparini, A., Ortega, N., González-Fraga, J. L., Gofton, A., Bartolomé, A., Montoya, A., Gálvez, R., Mayo, P. P., Irwin, P. 2015. Theileria annae (syn. Babesia microti-like) infection in dogs in NW Spain detected using direct and indirect diagnostic techniques: clinical report of 75 cases. Parasites and Vectors, 8: 217. 208. Miterpáková, M., Antolová, D., Hurníková, Z., Dubinský, P. 2008. Dirofilariosis in Slovakia - a new endemic area in Central Europe. Helminthologia, 45(1): 20–23. 209. Miterpáková, M., Antolová, D., Hurníková, Z., Dubinský, P., Pavlaĉka, A., Németh, J. 2010. Dirofilaria infections in working dogs in Slovakia. Journal of Helminthology, 84(2): 173–176. 210. Mitkova, B., Hrazdilova, K., Novotna, M., Jurankova, J., Hofmannova, L., Forejtek, P., Modry, D. 2017. Autochthonous Babesia canis, Hepatozoon canis and imported Babesia gibsoni infection in dogs in the Czech Republic. Veterinární Medicína, 62: 138–146.

211. Morchón, R., Carretón, E., González-Miguel, J., Mellado-Hernández, I. 2012. Heartworm disease (Dirofilaria immitis) and their vectors in Europe - new distribution trends. Frontiers in Physiology, 3: 196. 212. Moreau, Y., Vidor, E., Bissuel, G., Dubreuil, N. 1989. Vaccination against canine babesiosis: an overview of field observations. Transactions of The Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 83: 95–96. 213. Motiejunas, L., Bunikis, J., Barbour, A. G., Sadziene, A. 1994. Lyme borreliosis in Lithuania. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 26(2): 149–155. 214. Murase, T., Maede, Y. 1990. Increased erythrophagocytic activity of macrophages in dogs with Babesia gibsoni infection. The Japanese Journal of Veterinary Science, 52(2): 321–327. 215. Muro, A., Genchi, C., Cordero, M., Simón, F. 1999. Human dirofilariasis in the European union. Parasitology Today, 15(9): 386–389. 216. Najm, N. A., Meyer-Kayser, E., Hoffmann, L., Herb, I., Fensterer, V., Pfister, K., Silaghi, C. 2014. A molecular survey of Babesia spp. and Theileria spp. in red foxes (Vulpes vulpes) and their ticks from Thuringia, Germany. Ticks and Tick-borne Diseases, 5(4): 386–391. 217. Neitz, W. O. 1956. Classification transmission and biology of piroplasms of domestic animals. Annals of the New York Academy of Sciences, 64(2): 56–111. 218. Nelson, C. T., McCall, J. W., Carithers, D. 2014. Current canine guidelines for the prevention, diagnosis, and management of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in dogs. American Heartworm Society, July 2014. https://www.heartwormsociety.org/images/pdf/2014-AHS- Canine-Guidelines.pdf. Downloaded on 12 June 2019. 219. Newton, W. L., Wright, W. H. 1956. The occurrence of a dog filariid other than Dirofilaria immitis in the United States. The Journal of Parasitology, 42(3): 246–258. 220. Nicholson, W. L., Allen, K. E., McQuiston, J. H., Breitschwerdt, E. B., Little, S. E. 2010. The increasing recognition of rickettsial pathogens in dogs and people. Trends in Parasitology, 26(4): 205–212. 221. O’Connor, T. P. 2015. SNAP Assay Technology. Topics in Companion Animal Medicine, 30(4): 132–138. 222. Øines, Ø., Storli, K., Brun-Hansen, H. 2010. First case of babesiosis caused by Babesia canis canis in a dog from Norway. Veterinary Parasitology, 171(3-4): 350–353. 223. Osińska, B., Demiaszkiewicz, A. W., Pyziel, A. M., Kuligowska, I., Lachowicz, J., Dolka, I. 2014. Prevalence of Dirofilaria repens in dogs in central-eastern Poland and histopathological changes caused by this infection. Bulletin- Veterinary Institute in Pulawy, 58: 35–39. 224. Otranto, D., Dantas-Torres, F., Breitschwerdt, E. B. 2009. Managing canine vector-borne diseases of zoonotic concern: part two. Trends in Parasitology, 25(5): 228–235.

225. Otranto, D., Eberhard, M. L. 2011. Zoonotic helminths affecting the human eye. Parasites and Vectors, 4: 41. 226. Otranto, D., Dantas-Torres, F., Brianti, E., Traversa, D., Petrić, D., Genchi, C., Capelli, G. 2013. Vector-borne helminths of dogs and humans in Europe. Parasites and Vectors, 6: 16. 227. Overås, J., Lund, A., Ulvund, M. J., Waldeland, H. 1993. Tick-borne fever as a possible predisposing factor in septicaemic pasteurellosis in lambs. Veterinary Record, 133(16): 398. 228. Overgaauw, P., Van Dijk, E. 2009. Autochthonous case of Dirofiloria repens in a dog in the Netherlands. Veterinary Record, 164(5): 158. 229. Pakalniškis, S., Rimšaitė, J., Sprangauskaitė-Bernotienė, R., Butautaitė, R., Podėnas, S. 2000. Checklist of Lithuanian Diptera. Acta Zoologica Lituanica, 10(1): 3–58. 230. Pampiglione, S., Rivasi, F. 2000. Human dirofilariasis due to Dirofilaria (Nochtiella) repens: an update of world literature from 1995 to 2000. Parassitologia, 42(3-4): 231–254. 231. Pampiglione, S., Rivasi, F., Angeli, G., Boldorini, R., Incensati, R. M., Pastormerlo, M., Pavesi, M., Ramponi, A. 2001. Dirofilariasis due to Dirofilaria repens in Italy, an emergent zoonosis: report of 60 new cases. Histopathology, 38(4): 344–354. 232. Pantchev, N., Norden, N., Lorentzen, L., Rossi, M., Rossi, U., Brand, B., Dyachenko, V. 2009. Current surveys on the prevalence and distribution of Dirofilaria spp. in dogs in Germany. Parasitology Research, 105(Suppl 1): 63–74. 233. Parola, P., Davoust, B., Raoult, D. 2005. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses. Veterinary Research, 36(3): 469–492. 234. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Rosef, O., Turcinavicienė, J., Ambrasiene, D., Makarevičiute, D. 2006. Genetic variation of ticks (Ixodes ricinus L.) in the Lithuanian and Norwegian populations. Experimental and Applied Acarology, 40(3-4): 259–270. 235. Paulauskas, A., Rosef, O., Radzijevskaja, J., Turcinaviciene, J., Ambrasiene, D. 2009a. Infestation of mice and voles with Ixodes ricinus ticks in Lithuania and Norway. Estonian Journal of Ecology, 58(2): 112–125. 236. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Rosef, O. 2009b. Anaplasma in ticks feeding on migrating birds and questing ticks in Lithuania and Norway. Clinical Microbiology and Infection, 15(Suppl 2): 34–36. 237. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Rosef, O. 2012. Molecular detection and characterization of Anaplasma phagocytophilum strains. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 35(2): 187–195. 238. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Karvelienė, B., Grigonis, A., Aleksandravičienė, A., Zamokas, G., Babickaitė, L., Sabūnas, V., Petkevičius, S. 2014. Detection and molecular characterization of canine babesiosis causative agent Babesia canis in the naturally infected

dog in Lithuania. Veterinary Parasitology, 205(3-4): 702–706. 239. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Mardosaitė-Busaitienė, D., Aleksandravičienė, A., Galdikas, M., Krikštolaitis, R. 2015. New localities of Dermacentor reticulatus ticks in the Baltic countries. Ticks and Tick-borne Diseases, 6(5): 630–635. 240. Petney, T. N., Pfäffle, M. P., Skuballa, J. D. 2012. An annotated checklist of the ticks (Acari: Ixodida) of Germany. Systematic and Applied Acarology, 17(2): 115–170. 241. Petrocheilou, V., Theodorakis, M., Williams, J., Prifti, H., Georgilis, K., Apostolopoulou, I., Mavrikakis, M. 1998. Microfilaremia from a Dirofilaria-like parasite in Greece. Case report. Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 106(2): 315–318. 242. Piesman, J., Mather, T. N., Sinsky, R. J., Spielman, A. 1987. Duration of tick attachment and Borrelia burgdorferi transmission. Journal of Clinical Microbiology, 25(3): 557–558. 243. Pietikäinen, R., Nordling, S., Jokiranta, S., Saari, S., Heikkinen, P., Gardiner, C., Kerttula, A. M., Kantanen, T., Nikanorova, A., Laaksonen, S., Lavikainen, A., Oksanen, A. 2017. Dirofilaria repens transmission in southeastern Finland. Parasites and Vectors, 10: 561. 244. Popescu, I., Tudose, I., Racz, P., Muntau, B., Giurcaneanu, C., Poppert, S. 2012. Human Dirofilaria repens infection in Romania: a case report. Case Reports in Infectious Diseases, 2012: 1–4. 245. Poppert, S., Hodapp, M., Krueger, A., Hegasy, G., Niesen, W. D., Kern, W. V., Tannich, E. 2009. Dirofilaria repens infection and concomitant meningoencephalitis. Emerging Infectious Diseases, 15(11): 1844–1846. 246. Qurollo, B. A., Balakrishnan, N., Cannon, C. Z., Maggi, R. G., Breitschwerdt, E. B. 2014. Co-infection with Anaplasma platys, Bartonella henselae, Bartonella koehlerae and “Candidatus Mycoplasma haemominutum” in a cat diagnosed with splenic plasmacytosis and multiple myeloma. Journal of Feline Medicine and Surgery, 16(8): 713–720. 247. Radzijevskaja, J., Indriulytė, R., Paulauskas, A., Ambrasienė, D., Turčinavičienė, J. 2005. Genetic polymorphism study of Ixodes ricinus L. populations in Lithuania using RAPD markers. Acta Zoologica Lithuania, 15(4): 341–348. 248. Radzijevskaja, J., Paulauskas, A., Rosef, O. 2008. Prevalence of Anaplasma phagocytophilum and Babesia divergens in Ixodes ricinus ticks from Lithuania and Norway. International Journal of Medical Microbiology, 298(Supp 1): 218–221. 249. Radzijevskaja, J., Mardosaite-Busaitiene, D., Aleksandravičiene, A., Paulauskas, A. 2018. Investigation of Babesia spp. in sympatric populations of Dermacentor reticulatus and Ixodes ricinus ticks in Lithuania and Latvia. Ticks and Tick-borne Diseases, 9(2): 270–274. 250. Randolph, S. E. 2009. Perspectives on climate change impacts on infectious diseases. Ecology, 90(4): 927–931.

251. Rawlings, C. A. 1980. Acute response of pulmonary blood flow and right ventricular function to Dirofilaria immitis adults and microfilaria. American Journal of Veterinary Research, 41(2): 244–249. 252. René, M., Chêne, J., Beaufils, J. P., Valiente Moro, C., Bourdoiseau, G., Mavingui, P., Chabanne, L. 2012. First evidence and molecular characterization of Babesia vogeli in naturally infected dogs and Rhipicephalus sanguineus ticks in southern France. Veterinary Parasitology, 187(3-4): 399–407. 253. Richter, P. J., Kimsey, R. B., Madigan, J. E., Barlough, J. E., Dumler, J. S., Brooks, D. L. 1996. Ixodes pacificus (Acari: Ixodidae) as a vector of Ehrlichia equi (Rickettsiales: Ehrlichieae). Journal of Medical Entomology, 33(1): 1–5. 254. Rikihisa, Y. 2011. Mechanisms of obligatory intracellular infection with Anaplasma phagocytophilum. Clinical Microbiology Reviews, 24(3): 469–489. 255. Rishniw, M., Barr, S. C., Simpson, K. W., Frongillo, M. F., Franz, M., Dominguez Alpizar, J. L. 2006. Discrimination between six species of canine microfilariae by a single polymerase chain reaction. Veterinary Parasitology, 135(3-4): 303–314. 256. Rocconi, F., Di Tommaso, M., Traversa, D., Palmieri, C., Pampurini, F., Boari, A. 2012. Allergic dermatitis by Dirofilaria repens in a dog: clinical picture and treatment. Parasitology Research, 111(1): 493–496. 257. Rogers, D. J., Randolph, S. E. 2006. Climate change and vector-borne diseases. Advances in Parasitology, 62: 345–381. 258. Rojtman, V. A., Lobanov, A. L. 1985. Method of estimationof parasite hemipopulation abundance in host population. In: Sonin, M. D. (Ed) Research on Morphology, Taxonomy and Biology of Bird Helminths. Proceedings of Helminthology Laboratory. Volume XXXIII. Moscow, Russia: Nauka, pp. 102–123. (In Russian) 259. Rosenblatt, J. E. 2009. Laboratory diagnosis of infections due to blood and tissue parasites. Clinical Infectious Diseases, 49(7): 1103–1108. 260. Rossi, A., Peix, Á., Pavlikovskaya, T., Sagach, O., Nikolaenko, S., Chizh, N., Kartashev, V., Simón, F., Siles-Lucas, M. 2015. Genetic diversity of Dirofilaria spp. isolated from subcutaneous and ocular lesions of human patients in Ukraine. Acta Tropica, 142: 1–4. 261. Rudolf, I., Šebesta, O., Mendel, J., Betášová, L., Bocková, E., Jedličková, P., Venclíková, K., Blažejová, H., Šikutová, S., Hubálek, Z. 2014. Zoonotic Dirofilaria repens (Nematoda: Filarioidea) in Aedes vexans mosquitoes, Czech Republic. Parasitology Research, 113(12): 4663– 4667. 262. Rudzinska, M.A., Lewengrub, S., Spielman, A., Piesman, J. 1983a. Invasion of Babesia microti into Epithelial Cells of the Tick Gut. The Journal of Protozoology, 30(2): 338–46.

100

263. Rudzinska, M. A., Spielman, A., Lewengrub, S., Trager, W., Piesman, J. 1983b. Sexuality in piroplasms as revealed by electron microscopy in Babesia microti. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(10): 2966–2970. 264. Rueda, L. M. 2008. Global diversity of mosquitoes (Insecta: Diptera: Culicidae) in freshwater. Hydrobiologia, 595(1): 477–487. 265. Sager, H., Casati, S., Hartmeier, G., Sommer, B. 2005. Autochthonous cases of canine babesiosis in the canton Solothurn. Schweizer Archiv für Tierheilkunde, 147(6): 259–265. (In German) 266. Sainz, Á., Roura, X., Miró, G., Estrada-Peña, A., Kohn, B., Harrus, S., Solano-Gallego, L. 2015. Guideline for veterinary practitioners on canine ehrlichiosis and anaplasmosis in Europe. Parasites and Vectors, 8: 75. 267. Sakuma, M., Setoguchi, A., Endo, Y. 2009. Possible emergence of drug-resistant variants of Babesia gibsoni in clinical cases treated with atovaquone and azithromycin. Journal of Veterinary Internal Medicine, 23(3): 493–498. 268. Sałamatin, R. V., Pavlikovska, T. M., Sagach, O. S., Nikolayenko, S. M., Kornyushin, V. V., Kharchenko, V. O., Masny, A., Cielecka, D., Konieczna-Sałamatin, J., Conn, D. B., Golab, E. 2013. Human dirofilariasis due to Dirofilaria repens in Ukraine, an emergent zoonosis: epidemiological report of 1465 cases. Acta Parasitologica, 58(4): 592–598. 269. Sanogo, Y. O., Davoust, B., Inokuma, H., Camicas, J. L., Parola, P., Brouqui, P., 2003. First evidence of Anaplasma platys in Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodida) collected from dogs in Africa. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 70(3): 205–512. 270. Sassi, S. H., Abid, L., Dhouib, R., Mrad, K., Bouguila, H., Abbes, I., Driss, M., Ben Ghorbel, R., Ben Romdhane, K. 2006. Conjunctival dirofilariasis due to Dirofilaria repens. A new Tunisian case. Journal Français D'Ophtalmologie, 29(2): 5. (In French) 271. Sassnau, R., Czajka, C., Kronefeld, M., Werner, D., Genchi, C., Tannich, E., Kampen, H. 2014. Dirofilaria repens and Dirofilaria immitis DNA findings in mosquitoes in Germany: temperature data allow autochthonous extrinsic development. Parasitology Research, 113(8): 3057–3061. 272. Schaarschmidt, D., Gilli, U., Gottstein, B., Marreros, N., Kuhnert, P., Daeppen, J. A., Rosenberg, G., Hirt, D., Frey, C. F. 2013. Questing Dermacentor reticulatus harbouring Babesia canis DNA associated with outbreaks of canine babesiosis in the Swiss Midlands. Ticks and Tick-borne Diseases, 4(4): 334–340. 273. Schetters, T. P., Kleuskens, J. A., Scholtes, N. C., Pasman, J. W., Bos, H. J. 1994. Vaccination of dogs against Babesia canis infection using antigens from culture supernatants with emphasis on clinical babesiosis. Veterinary Parasitology, 52(3-4): 219–233.

101

274. Schetters, T., Kleuskens, J., Scholtes, N., Bos, H. J. 1995. Strain variation limits protective activity of vaccines based on soluble Babesia canis antigens. Parasite Immunology, 17(4): 215–218. 275. Schetters, T. P., Kleuskens, J. A., Scholtes, N. C., Pasman, J. W., Goovaerts, D. 1997. Vaccination of dogs against Babesia canis infection. Veterinary Parasitology, 73(1-2): 35–41. 276. Schetters, T. P., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., De Leeuw, P. W., Finizio, A. L., Gorenflot, A. 2009. Systemic inflammatory responses in dogs experimentally infected with Babesia canis; a haematological study. Veterinary Parasitology, 162(1-2): 7–15. 277. Schnyder, M., Deplazes, P. 2012. Cross-reactions of sera from dogs infected with Angiostrongylus vasorum in commercially available Dirofilaria immitis test kits. Parasites and Vectors, 5: 258. 278. Schoeman, J. P. 2009. Canine Babesiosis. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 76(1): 59–66. 279. Seinhorst, J. W. 1959. A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous glycerin. Nematologica, 4(1): 67–69. 280. Shaw, S. E., Day, M. J., Birtles, R. J., Breitschwerdt, E. B. 2001. Tick-borne infectious diseases of dogs. Trends in Parasitology, 17(2): 74–80. 281. Silbermayr, K., Eigner, B., Joachim, A., Duscher, G. G., Seidel, B., Allerberger, F., Indra, A., Hufnagl, P., Fuehrer, H. P. 2014. Autochthonous Dirofilaria repens in Austria. Parasites and Vectors, 7: 226. 282. Simes, P. B., Cardoso, L., Arajo, M., Yisaschar-Mekuzas, Y., Baneth, G. 2011. Babesiosis due to the canine Babesia microti-like small piroplasm in dogs - first report from Portugal and possible vertical transmission. Parasites and Vectors, 4: 50. 283. Simón, F., López-Belmonte, J., Marcos-Atxutegi, C., Morchón, R., Martín-Pacho, J. R. 2005. What is happening outside North America regarding human dirofilariasis? Veterinary Parasitology, 133(2-3): 181–189. 284. Simón, F., Siles-Lucas, M., Morchón, R., González-Miguel, J., Mellado, I., Carretón, E., Montoya-Alonso, J. A. 2012. Human and animal dirofilariasis: the emergence of a zoonotic mosaic. Clinical Microbiology Reviews, 25(3): 507–544. 285. Simpson, R. M., Gaunt, S. D., Hair, J. A., Kocan, K. M., Henk, W. G., Casey, H. W. 1991. Evaluation of Rhipicephalus sanguineus as a potential biologic vector of Ehrlichia platys. American Journal of Veterinary Research, 52(9): 1537–1541. 286. Simsek, S., Ciftci, A. T. 2016. Serological and molecular detection of Dirofilaria species in stray dogs and investigation of Wolbachia DNA by PCR in Turkey. Journal of Arthropod- Borne Diseases, 10(4): 445–453.

102

287. Sironi, M., Bandi, C., Sacchi, L., Sacco, B. Di, Damiani, G., Genchi, C. 1995. Molecular evidence for a close relative of the arthropod endosymbiont Wolbachia in a filarial worm. Molecular and Biochemical Parasitology, 74(2): 223–227. 288. Soares, J. F., Girotto, A., Brandão, P. E., Da Silva, A. S., França, R. T., Lopes, S. T., Labruna, M. B. 2011. Detection and molecular characterization of a canine piroplasm from Brazil. Veterinary Parasitology, 180(3-4): 203–208. 289. Solano-Gallego, L., Llull, J., Osso, M., Hegarty, B., Breitschwerdt, E. 2006. A serological study of exposure to arthropod-borne pathogens in dogs from northeastern Spain. Veterinary Research, 37(2): 231–244. 290. Solano-Gallego, L., Trotta, M., Carli, E., Carcy, B., Caldin, M., Furlanello, T. 2008. Babesia canis canis and Babesia canis vogeli clinicopathological findings and DNA detection by means of PCR-RFLP in blood from Italian dogs suspected of tick-borne disease. Veterinary Parasitology, 157(3-4):211–221. 291. Solano-Gallego, L., Baneth, G. 2011. Babesiosis in dogs and cats-expanding parasitological and clinical spectra. Veterinary Parasitology, 181(1): 48–60. 292. Solano-Gallego, L., Sainz, Á., Roura, X., Estrada-Peña, A., Miró, G. 2016. A review of canine babesiosis: the European perspective. Parasites and Vectors, 9: 336 293. Spasojević-Kosić, L., Lalošević, V., Lalošević, D., Simin, S., Vasić, I., Kuruca, L. 2012. Prevalence of dirolirariosis in pet dogs in Novi Sad. Contemporary agriculture / Savremena poljoprivreda, 61(3-4): 247–254. 294. Spasojević-Kosić, L., Simin, S., Lalošević, V., Lalošević, D., Kuruca, L., Nikolić, S., Nerac, D. 2014. Updating the prevalence of canine dirofilariosis in pet dogs in Novi Sad, Vojvodina, Serbia. Contemporary agriculture / Savremena poljoprivreda, 63 (4-5): 487–493. 295. Stegeman, J. R., Birkenheuer, A. J., Kruger, J. M., Breitschwerdt, E. B. 2003. Transfusion- associated Babesia gibsoni infection in a dog. Journal of the American Veterinary Medical Association, 222(7): 959–963. 296. Șuleșco, T., Volkova, T., Yashkova, S., Tomazatos, A., von Thien, H., Lühken, R., Tannich, E. 2016. Detection of Dirofilaria repens and Dirofilaria immitis DNA in mosquitoes from Belarus. Parasitology Research, 115(9): 3535–3541. 297. Svobodova, V., Svobodova, Z., Beladicova, V., Valentova, D. 2005. First cases of canine dirofilariosis in Slovakia: a case report. Veterinární medicína, 50(11): 510–512. 298. Svobodová, Z., Svobodová, V., Genchi, C., Forejtek, P. 2006. The first report of authochthonous dirofilariosis in dogs in the Czech Republic. Helminthologia, 43(4): 242–245. 299. Świątalska, A., Demiaszkiewicz, A. 2012. First autochthonous case of Dirofilaria immitis invasion in dog in Poland. Žycie Weterynaryjne, 87: 685–686. (In Polish).

103

300. Tabar, M. D., Altet, L., Martínez, V., Roura, X. 2013. Wolbachia, filariae and Leishmania coinfection in dogs from a Mediterranean area. Journal of Small Animal Practice, 54(4): 174–178. 301. Tarello, W. 2002. Cutaneous lesions in dogs with Dirofilaria (Nochtiella) repens infestation and concurrent tick-borne transmitted diseases. Veterinary Dermatology, 13(5): 267–274. 302. Tasić, A., Rossi, L., Tasić, S., Miladinović-Tasić, N., Ilić, T., Dimitrijević, S. 2008. Survey of canine dirofilariasis in Vojvodina, Serbia. Parasitology Research, 103(6): 1297–1302. 303. Tasić, A., Tasić-Otašević, S., Gabrielli, S., Miladinović-Tasić, N., Ignjatović, A., Đorđević, J., Dimitrijević, S., Cancrini, G. 2012. Canine Dirofilaria infections in two uninvestigated areas of Serbia: epidemiological and genetic aspects. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 12(12): 1031–1035. 304. Tasić, S., Stoiljković, N., Miladinović-Tasić, N., Tasić, A., Mihailović, D., Rossi, L., Gabrielli, S., Cancrini, G. 2011. Subcutaneous dirofilariosis in South-East Serbia - case report. Zoonoses and Public Health, 58(5): 318–322. 305. Taylor, M. J., Bandi, C., Hoerauf, A. 2005. Wolbachia bacterial endosymbionts of filarial nematodes. Advances in Parasitology, 60: 245–284. 306. Telford, S. R., Dawson, J. E., Katavolos, P., Warner, C. K., Kolbert, C. P., Persing, D. H. 1996. Perpetuation of the agent of human granulocytic ehrlichiosis in a deer tick-rodent cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(12): 6209–6214. 307. Tijsse-Klasen, E., Hansford, K. M., Jahfari, S., Phipps, P., Sprong, H., Medlock, J. M. 2013. Spotted fever group rickettsiae in Dermacentor reticulatus and Haemaphysalis punctata ticks in the UK. Parasites and Vectors, 6: 212. 308. Tiškina, V., Capligina, V., Must, K., Berzina, I., Ranka, R., Jokelainen, P. 2016. Fatal Babesia canis canis infection in a splenectomized Estonian dog. Acta Veterinaria Scandinavica, 58(7): 13–19. 309. Tolnai, Z., Széll, Z., Sproch, Á., Szeredi, L., Sréter, T. 2014. Dirofilaria immitis: an emerging parasite in dogs, red foxes and golden jackals in Hungary. Veterinary Parasitology, 203(3-4): 339–342. 310. Traversa, D., Aste, G., Milillo, P., Capelli, G., Pampurini, F., Tunesi, C., Santori, D., Paoletti, B., Boari, A. 2010. Autochthonous foci of canine and feline infections by Dirofilaria immitis and Dirofilaria repens in central Italy. Veterinary Parasitology, 169(1-2): 128–132. 311. Trotta, M., Carli, E., Novari, G., Furlanello, T., Solano-Gallego, L. 2009. Clinicopathological findings, molecular detection and characterization of Babesia gibsoni infection in a sick dog from Italy. Veterinary Parasitology, 165(3-4): 318–22. 312. Uilenberg, G. 2006. Babesia - a historical overview. Veterinary Parasitology, 138(1-2): 3–10.

104

313. Vekšins, A., Krūklīte, A., Keidāne, D., Houtana, I. M. 2014. Dirofilaria repens infection among dogs in latvian animal shelters during 2013. In Research and Practice in Veterinary Medicine - 2014, November 27-28, 2014. Jelgava, Latvia, pp. 118. (In Latvian) 314. Vial, H. J., Gorenflot, A. 2006. Chemotherapy against babesiosis. Veterinary Parasitology, 138(1-2): 147–160. 315. Víchová, B., Miterpáková, M., Iglódyová, A. 2014. Molecular detection of co-infections with Anaplasma phagocytophilum and/or Babesia canis canis in Dirofilaria-positive dogs from Slovakia. Veterinary Parasitology, 203(1-2): 167–172. 316. Víchová, B., Horská, M., Blaňarová, L., Švihran, M., Andersson, M., Peťko, B. 2016. First molecular identification of Babesia gibsoni in dogs from Slovakia, central Europe. Ticks and Tick-borne Diseases, 7(1): 54–59. 317. Wardrop, K. J., Reine, N., Birkenheuer, A., Hale, A., Hohenhaus, A., Crawford, C., Lappin, M. R. 2005. Canine and feline blood donor screening for infectious disease. Journal of Veterinary Internal Medicine, 19(1): 135–142. 318. Webber, W. A., Hawking, F. 1955. Experimental maintenance of Dirofilaria repens and D. immitis in dogs. Experimental Parasitology, 4(2): 143–164. 319. Welzl, C., Leisewitz, A. L., Jacobson, L. S., Vaughan-Scott, T., Myburgh, E. 2001. Systemic inflammatory response syndrome and multiple-organ damage/dysfunction in complicated canine babesiosis. Journal of the South African Veterinary Association, 72(3): 158–162. 320. Wirtgen, M., Nahayo, A., Linden, A., Garigliany, M., Desmecht, D. 2011. Detection of Anaplasma phagocytophilum in Dermacentor reticulatus ticks. Veterinary Record, 168(7): 195. 321. Wróblewska, P., Wilczyńska, M., Zaleśny, G. 2016. The evaluation of dirofilariosis among shelter dogs in Kraków. Annals of Parasitology, 62: 140. 322. Yang, Y. S., Murciano, B., Moubri, K., Cibrelus, P., Schetters, T., Gorenflot, A., Delbecq, S., Roumestand, C. 2012. Structural and functional characterization of Bc28.1, major erythrocyte- binding protein from Babesia canis merozoite surface. The Journal of Biological Chemistry, 287(12): 9495–9508. 323. Yeagley, T. J., Reichard, M. V., Hempstead, J. E., Allen, K. E., Parsons, L. M., White, M. A., Little, S. E., Meinkoth, J. H. 2009. Detection of Babesia gibsoni and the canine small Babesia ‘Spanish isolate’ in blood samples obtained from dogs confiscated from dogfighting operations. Journal of the American Veterinary Medical Association, 235(5): 535–539. 324. Zahler, M., Schein, E., Rinder, H., Gothe, R. 1998. Characteristic genotypes discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and pathogenicity to dogs. Parasitology Research, 84(7): 544–548.

105

325. Zamokas, G., Grigonis, A., Karvelienė, B., Daunoras, G., Babickaitė, L., Šapaliene, I. 2014. Importance of haematological changes in diagnosing canine babesiosis. Veterinarija ir zootechnika, 67(89): 94–98. 326. Zarnowska-Prymek, H., Cielecka, D., Salamatin, R. 2008. Dirofilariasis - Dirofilaria repens - first time described in Polish patients. Przegląd Epidemiologiczny, 62(3): 547–551. (In Polish) 327. Zittra, C., Kocziha, Z., Pinnyei, S., Harl, J., Kieser, K., Laciny, A., Eigner, B., Silbermayr, K., Duscher, G. G., Fok, É., Fuehrer, H. P. 2015. Screening blood-fed mosquitoes for the diagnosis of filarioid helminths and avian malaria. Parasites and Vectors, 8: 16.

106

PUBLIKACIJŲ SARAŠAS

1. Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Karvelienė, B., Grigonis, A., Aleksandravičienė, A., Zamokas, G., Babickaitė, L., Sabūnas, V., Petkevičius, S. 2014. Detection and molecular characterization of canine babesiosis causative agent Babesia canis in the naturally infected dog in Lithuania. Veterinary parasitology, 205(3-4): 702–706. DOI: 10.1016/j.vetpar.2014.09.001 2. Sabūnas, V., Radzijevskaja, J., Sakalauskas, P., Paulauskas, A. 2019. First report of heartworm (Dirofilaria immitis) infection in an imported dog in Lithuania. Helminthologia, 56(1): 57–61. DOI: 10.2478/helm-2018-0036 3. Sabūnas, V., Radzijevskaja, J., Sakalauskas, P., Petkevičius, S., Karvelienė, B., Žiliukienė, J., Lipatova, I., Paulauskas, A. 2019. Dirofilaria repens in dogs and humans in Lithuania. Parasites & Vectors, 12(1): 177. DOI: 10.1186/s13071-019-3406-y

Publikacijos tarptautinių konferencijų leidiniuose:

1. Venslovaitis, L., Radzijevskaja, J., Aleksandravičienė, A., Sabūnas, V., Mardosaitė- Busaitienė, D., Paulauskas, A. Current distribution and the diversity of Babesia canis strains in Europe. The vital nature sign [elektroninis išteklius]: 9th international scientific conference: abstract book. Kaunas: Vytautas Magnus university. ISSN 2335-8653. 2015, [no. 9], p. 54–54. 2. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Petkevičius, S. The first cases of Dirofilaria repens infection in dogs in Lithuania. 8th international conference on biodiversity research, Daugavpils, 28-30 April, 2015: book of abstracts. Daugavpils, Latvia: Saule, 2015. p. 132–132. 3. Sabūnas, V., Sakalauskas, P., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J. Dirofilaria repens infection in Lithuania. The vital nature sign [elektroninis išteklius]: 9th international scientific conference: abstract book. Kaunas: Vytautas Magnus university. ISSN 2335-8653. 2015, [no. 9], p. 42–42. 4. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Jokubauskienė, G. Dirofilariasis - the new zoonosis in Lithuania. 10th European vertebrate pest management conference, Sevilla, 21– 25 September 2015: abstracts. Sevilla: Universidad de Sevilla, 2015. p. 79–79. 5. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Sakalauskas, P., Jokūbauskienė, G. Dirofilaria repens rūšies sukeliama dirofiliariozė, nauja plintanti zoonozė Lietuvoje.

107

Jaunieji mokslininkai – žemės ūkio pažangai: 4-oji jaunųjų mokslininkų konferencija, 2015 m. lapkričio 5 d., Lietuvos mokslų akademija, Vilnius: pranešimų tezės. Akademija, Kauno p. 43–43. 6. Sakalauskas, P., Sabūnas, V., Radzijevskaja, J., Paulauskas, A. Molecular identification of new zoonotic parasites Dirofilaria repens in Lithuania. Vita Scientia 2016: international conference of Life science expansion, 2016 sausio 4 d., Vilnius: conference abstracts book. Vilnius: Lithuanian Life science centre, 2016. p. 55–55. 7. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Sakalauskas, P., Pažereckas, L. Canine Dirofilaria infections in Lithuania. German society for parasitology: 27th annual meeting, 9–12 March 2016, Göttingen, Germany: program and abstracts. Göttingen: University of Göttingen, 2016. p. 52–52. 8. Radzijevskaja, J., Mardosaitė-Busaitienė, D., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Tick-borne pathogens in ticks collected from domestic dogs and cats in Lithuania. E-SOVE 2016: The 20th European society for vector ecology conference, October 3–7, 2016, Lisbon, Portugal: book of abstracts. Wageningen: Wageningen Academic Publishers, 2016. p. 148–148. 9. Sabūnas, V.,Radzijevskaja, J., Paulauskas, A.Dirofiliariozė Europoje-naujos, greitai plintančios zoonozės apžvalga. Tyrimai, diagnostika ir gydymas. Tarptautinis veterinarijos kongresas 2016, Kaunas 10. Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Dirofilariasis in Lithuania. Neglected vectors and vector-borne diseases (EurNegVec) with MC and WG meeting of the COST Action TD1303 [electronic resource]: 3rd conference, 2016 May 24–26, Zaragoza, Spain: abstract book. Zara p. 96–96. 11. Sabūnas, V. Dirofiliariozė – ne tik augintinių, bet ir šeimininkų liga. Mokslinė praktinė konferencija “Rinktiniai aferezių ir klinikinės toksikologijos klausimai“. 2017 m. balandžio 6 d., Kaunas, Lietuva. 12. Sakalauskas, P., Sabūnas, V., Radzijevskaja, J., Paulauskas, A. Prevalence of Dirofilaria repens in dogs from Lithuania. Helminthological days 2017 May 8–12, 2017, Duchonka, Slovakia: programme & abstracts / editors Martina Orosová, Marta Špakulová. Košice: Slovak Society for Parasitology at SAS, 2017. p. 49–49. 13. Tamoliūnaitė, D., Radzijevskaja, J., Paulauskas, A., Sabūnas, V., Karvelienė, B., Zamokas, G. Identification of Babesia canis genotypes in dogs from Lithuania. COINS 2018: 13th international conference of life sciences, 28 February – 2 March 2018: book of abstracts. Vilnius: Vilniaus universitetas, Gyvybės mokslų centras, 2018. p. 77–78. 14. Tamoliūnaitė, D., Radzijevskaja, J., Paulauskas, A., Sabūnas, V., Karvelienė, B., Zamokas, G. Molecular detection and genotypes characterization of Canine babesiosis causative agent

108

Babesia canis. Smart Bio: ICSB 2nd international conference, 3–5 May 2018, Kaunas: abstracts book. Kaunas: Vytautas Magnus University, 2018. p. 206–206. 15. Radzijevskaja, J., Tamoliūnaitė, D., Paulauskas, A., Sabūnas, V., Karvelienė, B., Zamokas, G. Molecular characterization of Babesia canis strains detected in naturally infected dogs in Lithuania. VAAM 2018: annual conference of the Association for General and Applied Microbiology, 15–18 April 2018, Wolfsburg, Germany: abstracts. Braunschweig: Springer, 2018. p. 49–49. 16. Radzijevskaja, J., Paulauskas, A., Tamoliūnaitė, D., Sabūnas, V., Karvelienė, B. Canine babesiosis in Lithuania. Workshop on Arthropod-borne diseases transmitted by ticks, mites, fleas, and lice, 15–16 November 2018, Greifswald-Isle of Riems, Germany. Greifswald: Friedrich-Loeffler-Institut, 2018. p. 18–18. 17. Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Aleksandravičienė, A., Paulauskas, A. Mosquito-borne and Tick-borne infections in dogs from Lithuania. The 49th Annual SOVE Conference, 22–26 September 2019, San Juan, Puerto Rico.

109

SUMMARY OF DISSERTATION

Introduction. Vector-borne diseases (VBD) for humans and animals are caused by bacteria, parasites or viruses transmitted by the bite of hematophagous arthropods (mainly ticks and mosquitoes) (Beugnet and Marié, 2009). The majority of these diseases have zoonotic potential, therefore their management requires a multidisciplinary approach (Parola et al., 2005). Previously vector-borne diseases were largely spread in southern European countries. In the past decades these pathogens have been increasingly recognized as a cause of diseases in dogs and humans in temperate climates and urban environments in Europe (Shaw et al., 2001; Genchi et al., 2005, 2009; Simón et al., 2012). Global warming, simplification of the rules for traveling with animal companions, and intense movements of production animals provide ideal conditions for the circulation of pathogens. All these factors related with human activities determine the spread of vector-borne diseases in non-endemic geographical locations (Beugnet and Marié, 2009). Dirofilariosis is an emerging vector-borne parasitic zoonotic infection caused by nematodes of the genus Dirofilaria (Simón et al., 2012). The majority of cases in humans and animals are caused by two Dirofilaria species, Dirofilaria repens Railliet et Henry, 1911 and Dirofilaria immitis Leidy, 1856, both of which can infect numerous mammalian species (McCall et al., 2008b). Adult nematodes of D. repens most often are found in subcutaneous tissues, whereas D. immitis is the causal agent of canine and feline cardiopulmonary dirofilariosis. In Lithuania, the first case of canine dirofilariosis was recorded in 2010 in a small animal clinic of the Veterinary Academy in Kaunas in central Lithuania (Jankauskaitė et al., 2011). Since then, a growing number of canine dirofilariosis cases have been documented in different veterinary clinics throughout the country. Human dirofilariosis was diagnosed in Lithuania for the first time in September 2011. However, to the authors’ knowledge, no data have been published about the presence and prevalence of autochthonous D. repens infection in dogs and humans in Lithuania. Therefore, one of the tasks of the present study is to determine the predominant species and the prevalence rate of dirofilariosis in dogs and to describe the cases of human dirofilariosis in Lithuania. Knowing predominant species of dirofilariosis in Lithuania provides an opportunity to predict the spreading of the disease and to apply prevention and treatment for dogs and humans. Canine babesiosis caused by Babesia canis is an emerging infectious disease in Europe (Irwin, 2009). Although previously uncommon, canine babesiosis has become quite frequent in Lithuania during the past decade. Expansion of B. canis in Lithuania, as in other European

110 countries, is directly related to the expanding range of the main vector – Dermacentor reticulatus tick (Paulauskas et al., 2015). Effective ways to protect dogs against babesiosis have recently been examined. In the past decades vaccine called Pirodog® (Merial) has been developed and is commercially available in Europe. This vaccine induces a partial protection for dogs newly exposed to B. canis by shortening and diminishing the severity of clinical signs (Schetters et al., 1995, 1997, 1994). Experiments with vaccine have indicated that antigenic diversity is present in B. canis strains. Dogs vaccinated with antigens derived from B. canis strain A were protected against homologous infection, but not against infection with a heterologous B. canis strain B (Matijatko et al., 2012; Carcy et al., 2015). It was also found that pathogenesis of canine babesiosis is dependent on strains of B. canis (Schetters et al., 2009). It has been observed that the 18S rRNA gene is responsible for the virulence of different B. canis strains associated with thrombocytopenia (Adaszek et al., 2009). The 18S rRNA gene is less suited to study genetic diversity, because it is relatively conserved among strains of B. canis. The Bc28.1 gene encodes a 28 kDa GPI (glycosyl-phosphatidylinositol) protein located on the surface of the merozoite, which affects protozoan access to dog erythrocytes (Yang et al., 2012). These genes are currently used as genetic markers to analyse vaccine efficacy, especially within the bovine Babesia (e.g., B. bovis) species. Determining the genetic diversity of the B. canis protozoan in Lithuania may be useful for vaccine development, assessing its potential for use and for predicting the likelihood of a complicated disease. Canine granulocytic anaplasmosis is caused by gram negative intracelular bacteria Anaplasma phagocytophilum (Majláthová et al., 2011). A. phagocytophilum can infect humans and several animals other than dogs, including cats, sheep, goats, cows, equines, rodents, roe deer, deer, other wild mammals, and birds (Chen et al., 1994; de la Fuente et al., 2005). Anaplasmosis infections have been reported in many countries in North America, Europe and East Asia (Beugnet and Marié, 2009). Ixodes ricinus is the only known vector for A. phagocytophilum in Europe (Jensen et al., 2007). A direct detection method (blood smear) has low sensitivity, morula of A. phagocytophilum can be observed in neutrophils in up to 60 % of clinical cases (Kohn et al., 2008). Most dogs naturally infected with A. phagocytophilum probably remain healthy, as indicated by the high number of healthy seropositive dogs relative to dogs with the clinical disease (Kohn et al., 2011). A. phagocytophilum pathogens can cause zoonotic diseases. Studies of granulocytic anaplasmosis infections in dogs play a major role in human medicine and help to draw attention of human medicine practitioners in Lithuania. Co-infections with different VBD are common, because some species are transmitted in the same arthropod vector (Víchová et al., 2014). Most vector-borne diseases have the special feature of causing similar clinical signs and abnormal laboratory findings in dogs. Co-infected

111 cases are complicated for practitioners, and may cause failures in diagnosis, treatment and prognosis (Cardoso et al., 2010; Gaunt et al., 2010; De Tommasi et al., 2013). Therefore, it is important to know the prevalence of co-infected dogs in Lithuania.

The aim of the dissertation is to determine the prevalence of vector-borne pathogens in dogs in Lithuania.

The main objectives of the research: 1. Determine the predominant species and the prevalence rate of filarial parasites in pet and shelter dogs using microscopic, morphological, and molecular methods; 2. Describe the cases of human dirofilariosis in Lithuania; 3. Determine the prevalence of Wolbachia endosymbiont bacteria in dogs infected with Dirofilaria spp. parasites; 4. Determine the genetic diversity of B. canis parasites detected in dogs using genetic markers and to assess the geographical distribution of B. canis strains in Lithuania; 5. Determine the prevalence of co-infections with vector-borne diseases in dogs.

Propositions to be defended: 1. Dirofilaria repens is the main etiological agent of dirofilariosis in Lithuania; 2. Dirofilaria immitis is not prevalent in Lithuania, but imported cases from endemic countries are possible; 3. Infections of human dirofilariosis occur sporadically in western, eastern, northern, and central regions of Lithuania; 4. 81.6% dogs positive for D. repens in Lithuania are infected with Wolbachia endosymbiont bacteria; 5. Different strains of Babesia canis have spread in all major regions of Lithuania; 6. Co-infections with Anaplasma phagocytophilum, Babesia canis and Dirofilaria repens are expected in pet dogs in Lithuania.

The novelty of the research. The present research determined predominant parasite species and the prevalence of atochtonous dirofilariosis in dogs in Lithuania for the first time. Dogs are the most important source for human transmission of dirofilariosis. At present study the cases of human dirofilariosis in Lithuania were first described and published in a

112 scientific journal (Parasites and Vectors). This review is very important for public health and helps to draw attention of human and veterinary medicine practitioners to dirofilariosis. The study reported the first case of canine heartworm infection in a dog imported in Lithuania from Spain. Heartworm-infected dogs transported to North-Eastern Europe from endemic areas could act as microfilarial reservoirs for the local mosquito population, which could increase the risk of spreading the disease. The endosymbiontic Wolbachia bacterium plays an important role in D. repens biology and contributes to the inflammatory pathology of the infection. This is the first study on the detection of the endosymbiontic Wolbachia bacteria in Lithuanian dogs infected with D. repens. For the first time the prevalence of vector-borne co-infections with D. repens, A. phagocytophilum and B. canis in dogs was determined in Lithuania. Sequences obtained from PCR products of the partial msp4 of A. phagocytophilum (n=1) were deposited in GenBank under accession numbers: MN078318 Sequences obtained from PCR products of the partial rDNA ITS-2 region of D. repens (n=1) and D. immitis (n=1), mtDNA cox1 (n=3) gene of D. repens (derived from the blood sample (n=1) of dog and adult nematodes (n=2)) and the partial 16S rRNA gene of Wolbachia (n=2) were deposited in GenBank under accession numbers: MH469230; MH663471, MH469227; MH469228; MH469229; MK050782-MK050783, respectively. For the first time molecular characterisation of B. canis 18S rRNA and the Bc28.1 gene using PCR-RFLP method in Lithuania were made. The Bc28.1 gene is used for antigenic diversity studies. Previously the Bc28.1-34.01 genotype of B. canis was only found in France. The results presented in this study are of significance to the development of vaccines against B. canis. Sequences obtained from PCR products of the partial 18S rRNA (n = 5) and the Bc28.1 (n = 13) gene of B. canis (derived from the blood samples of dogs) were submitted to GenBank under the accession numbers: the 18S rRNA gene sequences: genotype A – MN078319; MN078322; genotype B – MN078320; genotype A/B – MN078321; MN078323. The Bc28.1 gene sequences: genotype 34.01 – MN078324; MN078325; MN078326; MN078327; MN078328; genotype B – MN078329; MN078330; MN078331; MN078332; genotype A – MN078333; MN078334; genotype 34/A (“mixed”) – MN078335; MN078336.

The content and scope of the dissertation. The dissertation consists of the explanation of abbreviations, an introduction, a literature review, materials and methods, results, a discussion, conclusions, a list of publications, the curriculum vitae, and acknowledgments. The dissertation contains 137 pages, 27 figures, 12 tables, and 327 references.

113

MATERIALS AND METHODS

Blood sample collection. In co-operation with veterinary clinics and animal shelters in Kaunas (central Lithuania) and Vilnius (eastern Lithuania), a total of 2280 dogs (2180 pet dogs and 100 shelter dogs) were investigated for the presence of microfilariae in their blood in 2013– 2015. In 2013–2015, using a surgical technique adult worms were removed from skin nodules of six dogs presented in small animal clinics (Fig. 9). The dog blood samples were taken from the cephalic vein, collected in EDTA-containing vacutainers and then stored at 4 °C or -20 °C until DNA isolation. These samples were also used for detection of co-infections with other vector- borne pathogens. None of the dogs examined had been imported from endemic countries or had ever travelled outside Lithuania. Dogs younger than 6 months were excluded due to the long life cycle of Dirofilaria. The sex, age, and body size of the shelter dogs were recorded. The microfilariae were detected based on blood smear microscopy and the modified Knott’s test. The PCR and sequence analysis were applied in order to confirm diagnosis and molecularly characterize the Dirofilaria species. To determine genetic diversity and distribution of strains of B. canis in Lithuania, in total 149 blood samples from dogs positive (blood smear) for Babesia spp. were collected in 2016– 2017. The samples were collected from different veterinary clinics in different regions of Lithuania: Klaipėda, Marijampolė, Vilnius, Panevėžys, Kėdainiai, and Kaunas (Fig. 10). Randomly selected samples (n = 61) were also investigated for vector-borne co-infections.

Human cases. Data on human dirofilariosis cases (patients’ travel history and other anamnestic data) were collected from the National Public Health Surveillance Laboratory (NVSPL), where each of the nine human dirofilariosis cases during the period 2011–2018 had been registered. Adult worms were removed from patients during surgical procedures by ophthalmologists and surgeons in different areas of Lithuania. Helminths were subsequently sent to the NVSPL for further investigation. Species identification was undertaken using morphological and morphometric analysis. To confirm the diagnosis in the first case (Patient no. 1; Table 1), helminths were sent for investigation to the Swiss Institute of Parasitology of the University of Zurich (SCUP).

Heart worm (Dirofilaria immitis) case history and observations. In January 2017, a 5-year-old male Spanish greyhound (Spanish galgo) was found free ranging in Cádiz (province of southern Spain) by a Lithuanian family. The dog was owned by local hunters, but after a leg trauma it was not suitable for hunting. The dog had lost significant amount of its body fat and muscle mass, weighed 13 kg (normal weight of a male Spanish greyhound dog is 27–29 kg) and

114 was lethargic and exercise-intolerant. In April 2018, the dog arrived in Lithuania. In May 2018, the dog was referred to a small animal veterinary clinic in Vilnius for wellness screening. Blood samples were send to the Vytautas Magnus University the Faculty of Natural Sciences for investigation of vector born diseases. Following the confirmation of the diagnosis, echocardiography and chest radiography were carried out to evaluate the patient prognosis.

Morphological identification of helminths. Adult nematodes were identified by morphological and molecular methods. After extraction, helminths were placed in 70% ethanol and then stored at 4 °C. Posterior and anterior ends of the nematode were used for morphological identification and other parts were used for molecular identification. The slides were made using 50% glycerine. Helminths were measured using a Motic BA400 Tension microscope. Microscopic identification of adult nematode was made using Manfredi et al. (2007) and Peters (2003) publications.

Serology. Blood sample collected from dog imported from Spain was investigated for the presence of circulating female (D. immitis) antigens and tick-transmitted pathogens (Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis, Ehrlichia ewingii, Anaplasma phagocytophilum and Anaplasma platys) were performed using SNAP 4Dx Plus Test (IDEXX Laboratories, Portland, USA).

Blood smear. After blood collection, a thin blood smear was immediately prepared. The slides were air-dried, fixed with methanol and stained with Giemsa stain. Slides were observed for microfilaria by light microscopy at 100× and 500× (oil immersion) magnification (Rosenblatt, 2009).

Modified Knott’s test. Briefly, 1 ml of EDTA blood was added to 9 ml of 2% formalin, mixed by inversion and centrifuged at 3000× g for 5 min. The supernatant was discarded. The sediment was mixed with 35 μl of 0.1% methylene blue and 20 μl of this mixture was observed using a light microscope (Newton and Wright, 1956).

DNA extraction. Genomic DNA was extracted from 200 μl aliquots of EDTA blood (taken from vena cephalica of the examined dog) using the GeneJet Whole Blood Genomic DNA Purification kit („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania) according to the manufacturer’s instructions. DNA from mature helminths was extracted using a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer’s instructions.

PCR amplification. Analysis of the polymerase chain reaction (PCR) was carried out using Eppendorf thermocycler “Mastercycler” personal. Seven different primers were used (Table 1). Reagents for the amplification of different gene fragments, their amounts and

115 concentrations are presented in Table 2. The programs used in the thermocycler for amplification of different genes are presented in Table 3.

Amplification of partial sequences from ITS-2 region and cox1 gene Dirofilaria spp. To identify filarioid species, conventional PCR and pan-filarial primers (DIDR-F1, DIDR-R1) were used that amplify fragments of different length of the internal transcribed spacer region 2 (ITS- 2) of the ribosomal DNA from six different filarioid species (D. repens, D. immitis, Acanthocheilonema reconditum, Acanthocheilonema dracunculoides, Brugia pahangi and Brugia malayi) (Rishniw et al., 2006). The PCR was carried out as described by Rishniw et al. (2006). The identification was performed based on 484 bp fragments for D. repens and 542 bp for D. immitis. Blood samples positive for microfilaria and adult nematode samples were then verified with a D. repens specific primer set (DR COI-F1/DR COI-R1) based on partial (209 bp) amplification of cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) gene, as described by Rishniw et al. (2006).

Amplification of partial sequences from the 16S rRNA gene of Wolbachia. Samples positive for Dirofilaria spp. nematodes in pet and shelter dogs were further analysed by PCR (primers 16SwolbF/16SwolbR3) of the 16S rRNA gene fragment of Wolbachia endosymbiont bacteria in 2017. The specific products obtained of 1018 bp were considered a positive result.

Amplification of partial sequences from msp4 gene of A. phagocytophilum. Nested polymerase chain reaction was performed to amplify a 301 bp fragment of the msp4 gene of A. phagocytophilum (de la Fuente et al., 2005). The external primers MAP4AP5 and MSP4AP3 were used to amplify msp4 gene 849 bp fragment in the first PCR, and the amplified product of this reaction was used as the template for a later nested PCR reaction, performed with the internal primers msp4f and msp4r.

Amplification of partial sequences from 18S rRNA and Bc28.1 genes of B. canis. The amplification of B. canis DNA through PCR was performed using primers BAB GF2 and BAB GR2, which amplify a 559 bp region of the 18S rRNA gene of B. canis. Standard PCR conditions were used previously described by Adaszek and Winiarczyk (2008). A fragment (710 bp) of the Bc28.1 gene was amplified with F281&2a and R281 primers as described by Carcy et al. (2015).

RFLP assay using Hinc, MboI and AluI restriction fragments. The genetic diversity of B. canis strains isolated from naturally infected dogs in Lithuania was investigated using PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay based on 18S rRNA and Bc28.1 gene. Positive 18S rRNA gene PCR products were digested with HincII (Adaszek and Winiarczyk, 116

2008) and the Bc28.1 gene was digested with MboI and AluI restriction enzymes (Carcy et al., 2015). The digestion products were visualized on the standard agarose gel using 50 bp (HinC, AluI) and 100 bp (AluI) markers (GeneRuler DNA Ladder [„Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania]). A PCR fragment of the 18S rRNA gene was digested with the HincII restriction enzyme, allowing the classification of B. canis isolates into two groups that were termed group 18S RNA A when the PCR fragment (559 bp) was cut into two fragments of 409 bp and 150 bp, and group 18S RNA B when the 559 bp PCR fragment remained uncut. PCR fragments of the Bc28.1 gene were digested with the combination of two restriction enzymes (MboI and AluI) allowing the classification of B. canis isolates into three groups – A; B; 34.01 (Carcy et al., 2015). The genotype Bc28.1 – A was identified after MboI digestion (Fig. 11). Bc28.1 – A group was identified when the PCR 710 bp fragment was cut into 300, 290, 70 ir 50 bp fragments and group Bc28.1 – B/34.01when the 710 bp fragment was cut into 290, 170, 130, 70, and 50 bp. AluI digestion enabled the identification of strains from genotype 34.01 and B (Fig. 11). Bc28.1 – B group was identified when the PCR 710 bp fragment was cut into 320, 240, 90, and 60 bp fragments, Bc28.1-34.01 when the fragment was cut into 410, 240, and 60 bp fragments and mixed 34A/34B (possibly co-infected samples) group when the fragment was cut into 410, 320, 240, 90, and 60 bp fragments.

Electrophoresis. Products of amplification were identified in 1.5% and 2% agarose gel, after electrophoresis in standard conditions and staining with ethidium bromide solution (10 μl in 100 ml gel) and visualized with the UV transilluminator (GelDoc-It 310 and VisionWorks LS [Germany]). A 2% agarose gel was prepared by visualizing the results after the PCR-RFLP analysis. DNA fragment sizes were assessed by comparison with GeneRulerTM 50 bp or 100 bp DNA Ladder („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania).

Sequence and phylogenetic analysis. D. repens (n=26), D. immitis (n=1), A. phagocytophilum (n=3), B. canis (n=62), and Wolbachia (n=5) positive PCR products were extracted from the agarose gel and purified using the GeneJET Gel Extraction Kit („Thermo Fisher Scientific Baltics“, Lithuania) according to the manufacturer’s instruction. PCR products were sent for sequencing (Macrogen, Amsterdam, Netherlands). The obtained sequences were edited using the Mega program (Mega software package v.6.05) and were aligned with each other and compared with the sequence data available from GenBank using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). A phylogenetic tree was constructed based on the sequence distance method using the maximum-likelihood (ML) and

117 neighbour-joining (NJ) methods. Pairwise distances between the sequences were computed using the Hasegawa-Kishino-Yano (HKY85), Kimura 2-parameter, and Tamura-Nei models.

Statistical analysis. Pearson’s Chi-square analysis was performed with D. repens infection in shelter dogs (0, negative; 1, positive) against independent variables, including sex, age (0.5–3 years; > 3–6 years; and > 6 years), and body size (small, ≤ 10 kg; medium-sized, > 10–25 kg; and large, > 25 kg) groups. Statistical analysis was carried out using the statistical software IBM SPSS Statistics software v.23 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA); P > 0.05 was considered insignificant.

Treatment of heart-worm infected Spanish greyhound. Treatment using the guidelines recommended by the American Heartworm Society (Nelson et al., 2014) was applied. Adjunct therapy. The routine dose of prednisone at 0.5 mg/kg twice daily for the first week and 0.5 mg/kg once daily for the second week, 0.5 mg/kg every other day for the third and fourth weeks and doxycycline at 10 mg/kg twice daily for 4 weeks was applied. To kill susceptible larval stages milbemycin oxime (0.5 mg/kg) at day 30 of treatment was administered orally and continued monthly (Nelson et al., 2014). Adulticide therapy. Following the adjunct therapy, three-dose regimen of melarsomine (one injection of 2.5 mg/kg body weight followed at least one month later by two injections of the same dose 24 hours apart) was used. Animal care and handling were carried out in accordance with institutional guidelines.

RESULTS AND DISCUSSION

Prevalence of dirofilariosis in pet and shelter dogs. Overall, 61 (2.7%, 95% CI: 2.3– 3.9%) of the 2280 blood samples from pet and shelter dogs were found to be positive for the presence of microfilariae. A total of 42 (1.9%, 95 % CI: 1.5–2.8%) of the 2180 pet dog blood smears (Fig. 12a) were positive for microfilariae. Using the modified Knott’s method (Fig. 12b), microfilariae were found in 19 (19%, 95% CI: 11.8–27.4%) of the 100 shelter dogs. The infection rate of D. repens parasites was significantly higher in shelter dogs (19.0%) than in pet dogs (1.9%) (χ2 = 100.039, df = 1, P < 0.0001). The shelter dogs were 0.5 to 18 years-old, with a median age of 5 years (IQR 2.0–10.0). Infected animals were identified in all age groups: 0.5–3 years, prevalence of 18.4% (7/38); > 3–6 years, prevalence of 9.1% (2/22); and > 6 years, prevalence of 25.0% (10/40). The infection rate in males was 22.2% (10/45) and 16.4% (9/55) in females. There were no significant differences in prevalence (P > 0.05) between shelter dogs of different sexes and ages. Additionally, dogs in the medium (20.8%; 15/72) and large size

118

(33.3%, 2/6) dog groups were more frequently infected than small dogs (4.5%, 1/22); however, body size was not a statistically significant factor (χ2 = 3.165, df = 1, P = 0.106; χ2 = 4.084, df = 1, P = 0.107, respectively). It is worth mentioning that the examined dogs had never travelled outside Lithuania. The prevalence of D. repens infection was significantly higher in shelter dogs (19.0%). A similar prevalence of infection among shelter dogs has been obtained in the neighbouring countries of Latvia (15.8%; 22/139) (Vekšins et al., 2014) and Poland (11.3%; 14/124) (Wróblewska et al., 2016), while a lower incidence of D. repens infection has been detected in Italy (3.4%; 4/118) (Giangaspero et al., 2013) and Romania (2.2%; 2/92) (Ciocan et al., 2010). Several factors could explain the difference in the prevalence of infection in shelter and pet dogs detected in the present study. The detection method may affect the sensitivity of the parasite detection. Microfilariae in blood samples from the pet dogs were detected based on blood smear analysis, while in shelter dogs, Knott’s test was applied for parasite detection. Knott’s test is a more sensitive test because it concentrates the microfilaria, making it less likely to be missed during microscopic examination. Perhaps the most important factor is that shelter dogs are most often caught roaming free in streets and are in greater contact with vectors than dogs living in the human environment. Furthermore, shelter dogs do not usually receive prophylactic treatments and are therefore at a higher risk of infection. These findings suggest that shelter dogs may serve as major reservoirs for D. repens in urban areas in Lithuania. Given that dogs are the most important source for human transmission of dirofilariosis (McCall et al., 2008b), there should be stricter rules around the use of preventive measures and regulations for free-ranging dogs.

Prevalent species of dirofilaria in Lithuania, based on morphological identification of adult helminths. The length of the helminths and the distance between the oral opening and vulva for females or the length of the left and right spicule for males were measured. One male and five females were identified. All measurements (Table 4) of adult worms removed from dogs were within the known range for D. repens. Examples of different sexual structures of D. repens female and male nematodes are shown in Figure 14.

Molecular and phylogenetic analysis of filarioid parasites. PCR amplification of the partial ITS-2 region and cox1 gene (Fig. 13) confirmed the D. repens species in all the positive samples (62 blood and 6 adult worm samples). No other filarioid species were found during this research. Best quality PCR products of D. repens for the ITS-2 region and cox1 gene were purified and sequenced to confirm the PCR results. The sequence analysis of the partial ITS-2 region

119

(Table 5) showed that Lithuanian D. repens isolates derived from the blood of dogs were 100% identical to each other and to the corresponding D. repens sequence from Tunisia deposited in GenBank (KR676387) and shared 98–99% similarity (one to nine nucleotides difference) with D. repens isolates from the Czech Republic and India (Fig. 15). Lithuanian D. repens cox1 sequences derived from canine blood and adult nematode samples were identical to each other and showed 99–100% similarity to other European strains of D. repens (accession numbers: MG787424, KC985240, KR780980, KY828979, KR998258, AM749230, and MF045816) (Table 6). The phylogenetic analysis of the partial cox1 gene for D. repens isolates from mosquitoes, dogs, and humans revealed four different cox1 variants. Analysed sequences included three variable sites (Fig 16).

Heartworm case analysis. During the clinical examination, no symptoms of heartworm disease were detected. Thoracic radiograph and echocardiography did not show any identifiable abnormalities commonly found with heartworm disease and appeared fairly normal, most likely due to an early asymptomatic stage of infestation with D. immitis. In ELISA negative results were reported for B. burgdorferi, E. canis, E. ewingii, A. phagocytophilum, and A. platys antibodies and positive for circulating female (D. immitis) antigens. Low numbers of microfilaria were found in the examined blood sample using the Knott’s test. Visualization of the PCR product of the examined sample by gel electrophoresis demonstrated DNA fragment of the expected size for D. immitis (542 bp). The sequence analysis (Table 7) of partial ITS-2 region revealed that the sequence had 99–100% identity with the D. immitis sequences deposited in GenBank, thereby confirming the D. immitis diagnosis. The phylogenetic analysis based on partial ITS-2 region sequence (Fig. 17) shows phylogenetic relationship of D. immitis obtained in present study and other filarial nematodes. Using the recommended treatment within 12 hours of the first injection of melarsomine, tenderness at the injection site, fever, lethargy and tremor were noted and after 24 hours the symptoms completely disappeared. Two weeks after the first injection of melarsomine, the dog started to gain weight, became more active and started to tolerate exercises. No side effects were noticed after the second and third melarsomine injection. Despite the fact that the period suitable for heartworm transmission in Lithuania is short (Genchi et al., 2005), previously reported autochthonous cases of subcutaneous dirofilariosis and knowledge that both filarial species require the same temperature and the same time interval for incubation in vector suggest that an increase in the autochthonous heartworm cases in this area is possible. Furthermore, numerous suitable vector species (such as Culex pipiens s.l.,

120

Anopheles maculipennis s.l., Aedes vexans) for parasite development and transmission are found in Lithuania (Bernotienė, 2012). Due to the complicated parasite life cycle, heartworm disease is chronic and asymptomatic in the primary stage of development. Veterinary clinicians in non- endemic areas lack experience in identifying the disease, therefore most cases are under diagnosed, microfilaremic dogs often do not get appropriate treatment and become the source of infection to the local mosquito population (McCall et al., 2008b). On the basis of this report it can be stated that heartworm infected dogs transported to Lithuania from parasite endemic areas could act as donors of microfilariae to local mosquito species. Protocols of periodic heartworm antigen testing, in particular for traveling dogs, enable diagnosing early stages of heartworm disease and preventing transmission of microfilariae. A clear understanding of the biological life cycle of D. immitis, importance of asymptomatic dog treatment, and disease prevention in healthy dogs are critical to stop the spread of the disease in previously non-endemic areas.

Wolbachia endosymbiont of D. repens in Lithuania. Wolbachia endobacteria were found to be positive for D. repens in 40 of the 49 samples (81.6%, 95% CI: 69.4–91.3%). All Dirofilaria negative samples were also negative for Wolbachia. Sequence analysis of the partial 16S rRNA gene showed that the obtained sequences were identical, displaying homology (100%) with sequences of Wolbachia endosymbiont of D. repens in Croatia (KY114937) and Italy (AJ276500). The phylogenetic analyses of 16S rRNA sequences confirmed that Wolbachia endosymbionts of Dirofilaria separated according to the host species (Fig.18). More studies on Wolbachia have been carried out around the world on arthropods than on filarioids (Kozek, 2005; Lustigman et al., 2014; Lefoulon et al., 2016). Based on the data thus far obtained, endosymbiontic Wolbachia has been detected in at least 26 filarioid species (Taylor et al., 2005; Lustigman et al., 2014). This is the first report on the detection of endosymbiontic Wolbachia bacteria in Lithuanian dogs infected with D. repens. Wolbachia DNA was detected in the blood of more than 80.0% of all the dogs infected with Dirofilaria. According to previous reports, Wolbachia endosymbionts are detected in 30.6–52.6% of dogs infected with D. repens or D. immitis in Europe (Tabar et al., 2013; Landum et al., 2014). Meanwhile in the Asian part of Turkey, Wolbachia has been detected in just 6.2% of the tested dogs infected with D. immitis (Simsek and Ciftci, 2016). These studies will drive further investigations to improve understanding of the importance of symbiosis between Wolbachia and Dirofilaria. Wolbachia could therefore be used as a target of antibiotic therapy (Foster et al., 2008; Simón et al., 2012; Bouchery et al., 2013).

121

Human dirofilariosis in Lithuania. Overall, nine cases of human dirofilariosis infection were observed between 2011 and 2018 in Lithuania (Table 8). In three cases worms were found in the ocular localisation, and in six cases in subcutaneous tissue (Fig. 19). Seven of the nine infected humans had not travelled outside Lithuania. However, two patients had travelled to endemic countries within the two years prior to diagnosis. All nine nematodes were identified as D. repens. Human dirofilariosis has been diagnosed in five different areas in eastern, central, western and north-eastern Lithuania: Vilnius, Kaunas, Klaipėda, Ukmergė, and Utena. Five human cases of autochthonous D. repens have been found in the central and eastern parts of the country (Kaunas, Vilnius) in areas where dirofilariosis has been diagnosed in dogs. A total of seven out of the nine people investigated had never travelled to endemic countries. These data show that human subcutaneous dirofilariosis is also endemic in Lithuania. Human Dirofilaria infections are sporadic in Lithuania and in neighbouring countries, where the first cases of dirofilariosis were noted at a similar time (Zarnowska-Prymek et al., 2008; Melbarde-Gorkusa et al., 2011; Cielecka et al., 2012). In the past few decades, the number of human infections in previously endemic countries has increased dramatically (Genchi et al., 2011a; Simón et al., 2012; Sałamatin et al., 2013; Genchi and Kramer, 2017). The current epidemiological situation of dirofilariosis in Europe, including in the Baltic countries, suggests that previously non-endemic countries should expect an increase in human infections in future.

Co-infections of vector-borne pathogens in dogs. The blood samples of pet dogs in this study were also tested for the presence of vector-borne pathogens and possible co-infection with D. repens. Out of 2180 blood samples from pet dogs, in 3 (0.1%) samples morula of A. phagocytophilum (Fig. 20b) and in 38 (1.7%) samples large piroplasma merozoites of B. canis (Fig. 20a) were detected. Of 42 microfilariae (D. repens) positive samples, nine contained co-infection with B. canis and in one sample a triple-infection with D. repens, B. canis and A. phagocytophilum was detected. Visualization of the PCR product of the examined sample by gel electrophoresis demonstrated DNA fragment of the expected size for A. phagocytophilum 301 bp (msp4) and B. canis 559 bp (18S rRNA). The sequence analysis of partial msp4 and 18S rRNA genes confirmed PCR results. B. canis positive blood samples (n=61) used for genetic diversity studies were also tested for detection of mixed infections with D. repens and A. phagocytophilum. Out of 61 B. canis positive blood samples, 8 (13.1%) were also positive for D. repens and 3 (4.9%) samples were positive for A. phagocytophilum.

122

A similar study in Slovakia demonstrated that 2.18% D. repens infected dogs were co- infected with D. immitis (Víchová et al., 2014). In the same study, out of 366 D. repens infected dogs, 12 (3.27%) were co-infected with A. phagocytophilum and 14 (3.55%) with B. canis. In one sample a triple infection with D. repens, A. phagocytophilum, and B. canis was detected. In warm climate countries, where a large spectrum of different vectors are found, co-infections in dogs with Ehrlichia, Anaplasma, Babesia, Borrelia, Bartonella, Rickettsia, and Dirofilaria are detected (Beall et al., 2008; Sainz et al., 2015; Capelli et al., 2018). Findings of the present study suggest that co-infections with anaplasmosis, babesiosis, and dirofilariosis in dogs in Lithuania are expected. Co-infection cases are complicated for practitioners and may cause failures in diagnosis, treatment and prognosis (Cardoso et al., 2010; De Tommasi et al., 2013). The results of this study may be useful in developing molecular diagnostic kits for infectious diseases using a real-time multiplex PCR method, which can detect multiple pathogens simultaneously (Courtney et al., 2004; Hojgaard et al., 2014). Diagnostic kits for different vector-borne diseases could be based on epidemiological data of different countries (De Tommasi et al., 2013). In European countries, main vectors of B. canis and A. phagocytophilum are D. reticulatus and I. ricinus ticks respectively. Several recent publications have reported the detection of spotted fever group rickettsiae pathogens in D. reticulatus ticks across Europe (Matsumoto et al., 2009; Tijsse-Klasen et al., 2013). In one study A. phagocytophilum pathogens were detected in D. reticulatus engorged ticks collected from wild animals (Wirtgen et al., 2011). The presence of A. phagocytophilum in ticks collected from animal hosts gives no information whether the source of infection is the blood of the host, or whether the pathogen was present in the tick before feeding. A. phagocytophilum bacteria was detected in questing D. reticulatus ticks collected in Lithuania and Ukraine (Chernobyl exclusion zone) (Paulauskas et al., 2012; Karbowiak et al., 2014). The ability of D. reticulatus ticks to transmit A. phagocytophilum bacteria is still not clearly understood. These findings suggest that D. reticulatus is a potential vector for A. phagocytophilum. However, different species of vectors could feed on the same animal and transmit different pathogens. Accordingly, further investigation is needed for accurate determination of D. reticulatus tick capability to transmit A. phagocytophilum pathogens. A. phagocytophilum has an important zoonotic potential (Bakken et al., 1994). On the basis of this report it can be stated, that human granulocytic anaplasmosis infections could be expected in Lithuania.

123

Molecular detection of B. canis pathogens. Blood samples (n = 149) collected from different veterinary clinics located in different regions of Lithuania were used for B. canis DNA extraction. Good quality DNA were extracted from 138 blood samples. In overall 112 (81.2%) and 107 (77.5%) canine blood samples B. canis DNA were found after amplification of 18S rRNA 559 bp and Bc28.1 710 bp gene fragments respectively (Table 9).

Determination of B. canis genotypes by 18S rRNA gene based on PCR-RFLP analysis. Using the restriction enzyme HincII according to digest the 18S rRNA gene, three different profiles of PCR fragments (A, B, A/B) were detected (Fig. 21): genotype A when the PCR fragment (559 bp) was cut into two fragments of 409 bp and 150 bp, and genotype B when the 559 bp PCR fragment remained uncut. A “mixed” genotype (genotype A and B) was detected: when the 559 bp fragment was digested into 409 bp and 150 bp fragments while 559 bp fragment remain unchanged. According to PCR-RFLP analysis, genotype A was detected in 17 (15.2%) samples, genotype B in one sample (0.9%) and “mixed” A/B genotype in 94 (83.9%) samples (Table 11).

Sequence phylogenetic analysis of B. canis 18S rRNA gene. After sequences analysis of the 486 bp fragment of the B. canis 18S rRNA gene obtained in this study, three different variable regions were detected at positions 80, 92, and 93 (Table 10). Genotypes were identified by GA→AG nucleotide polymorphism at positions 92 and 93 of the 18S rRNA gene (positions 610-611 in full 18S rRNA gene sequences). Of 30 analysed samples in 16 (53.3%) “mixed” genotype A/B, 13 (43.3%) genotype A, and in 1 sample (3.3%) genotype B were identified (Table 10). Five different sequence variants were identified based on GA→AG nucleotide inversion in positions 92-93 (III-AG; IV-GA, V-RR) and one nucleotide polymorphism T/C (Y) in position 80 (IY/GA; II-Y/RR) (Table 10; Figure 22). A phylogenetic tree was created inserting the 18S rRNA gene sequence obtained during this study (n = 30) and the corresponding sequences obtained from dogs (Canis familiaris) deposited in the GenBank from Lithuania (KM111283; KM111282), Poland (KT844912; KT844884), Latvia (JX227980), Estonia (KT008057) Turkey (KF499115), Croatia (FJ209024), and Czech Republic (JX678979). The Babesia vogeli 18S rRNA gene sequence (JN13120) was included as an outgroup. In the phylogenetic tree (Fig. 23), the analysed sequences were separated into three major clusters (A; B; A/B) according to 18S rRNA genotypes. Two sequences of genotype A (samples from Kaunas – 2KrA and Panevėžys – 1rPnvzA) and one sequence of genotype A/B (from Vilnius – 1VlnA/B) were unique comparing with sequences from GenBank.

124

Canine babesiosis is classified into complicated and uncomplicated form according to clinical symptoms and pathogenesis (Matijatko et al., 2012). In the case of complicated form of babesiosis, the mortality rate is about 50% (Welzl et al., 2001). In the present study, complicated and uncomplicated forms of canine babesiosis were recorded at “Siaurio Šnauceris” veterinary clinic (data not shown in the results). Of 55 dogs whose blood samples were used to determine the genetic diversity of B. canis, 8 (14.5%) dogs developed a complicated form of the disease. In other studies, the mortality rate of dogs in Hungary and Croatia ranged from 12 to 20% in B. canis cases (Máthé et al., 2006). In other European countries (Italy, Spain, Portugal, the Netherlands, and Poland), the dog mortality rate was <5% and in France ~ 1.5% (Matijatko et al., 2012). In Poland, two genotypes – A and B of B. canis 18S rRNA gene were isolated (Adaszek and Winiarczyk, 2008). The strains of B. canis genotype B were found to be more virulent (in relation to thrombocytopenia) than genotype A (Adaszek et al., 2009). In this study, strains of the more virulent B. canis genotype B were detected in only one sample. This suggests that the complicated forms of disease in Lithuania are caused by pathogens of other strains of B. canis. The question is whether the level of thrombocytopenia is related to the occurrence of complicated/uncomplicated forms of babesiosis and whether the 18S rRNA gene is suitable for studies of strain virulence. In other studies the cases of “mixed” genotype A/B were explained as co-infection with A and B genotype strains in the same sample (Beck et al., 2009). In the present study, 83.9% (94/112) dogs were infected with the “mixed” genotype in different regions of Lithuania. This phenomenon can be explained by genetic heterogeneity between copies of B. canis 18S rRNA sequences (Beck et al., 2009; Schaarschmidt et al., 2013).

Determination of B. canis genotypes by Bc28.1 gene based on PCR-RFLP analysis. Using restriction enzyme MboI according to digest the Bc28.1 gene, two profiles of PCR fragments (A and 34/B) were detected (Fig. 24): genotype Bc28.1-A where the PCR fragment 710 bp was digested into 300 bp, 290 bp, 70 bp, and 50 bp fragments, and Bc28.1-B or Bc28.1- 34.01 where the 710 bp PCR fragment was digested into 290 bp, 170 bp, 130 bp, 70 bp, and 50 bp fragments. Using restriction enzyme MboI, genotype B/34.01 was detected in 87 (82.1%) and genotype A in 19 (17.9%) samples (Table 11). In order to isolate the Bc28.1-B genotype from the Bc28.1-34.01 genotype, samples (n = 87) were further tested using the restriction enzyme AluI (Fig. 25). Using restriction enzyme AluI, genotype Bc28.1-B was detected in 57 (65.5%) and genotype Bc28.1-34.01 in 22 (25.3%) samples. In 8 (9.2%) samples possibly co-infections among two genotypes – Bc28.1-A

125 and Bc28.1-34,01 were detected. A total of 32 best quality samples of the Bc28.1 gene were sent for sequencing.

Sequence phylogenetic analysis of the Bc28.1 gene from B. canis. Following the sequence analysis of the Bc28.1 gene, 18 variable nucleotide positions, 13 sequence variants and four genotypes were identified by nucleotide polymorphism at positions 478 and 151: Bc28.1-A, Bc28.1-B, Bc28.1-34.01 and Bc28.1-34.01/A. Thirteen different sequences of B. canis Bc28.1 gene were deposited in GenBank. The sequence analysis demonstrated that B. canis strains obtained in Lithuania are 99% identical (1 to 6 nucleotides differences) with the strains obtained in France. Comparing the sequences of three B. canis strains obtained in France (KP863714.1; KP863713.1; CS019629.1) with the strains of B. canis obtained in the present study, genotypes were separated according to T→C and G→A nucleotide inversion in positions 478 and 151 respectively (Table 12). Following the sequence analysis, in 16 (50.0%) sequences genotype 34.01, in 6 (18.8%) sequences genotype B and in 6 (18.8%) sequences genotype A were identified. In four (12.5%) samples, co-infection of two B. canis genotypes were identified: G nucleotide was observed at position 151 which is characteristic for genotype 34.01 and T nucleotide observed at position 478 which is characteristic for genotype A. Therefore, these strains of B. canis are described as “mixed” – 34.01/A. The phylogenetic tree was created including 32 sequences of the Bc28.1 gene in B. canis obtained in this study and three different sequences of the Bc28.1 gene in B. canis obtained from dogs (Canis familiaris) in France (KP863713.1; KP863714.1; CS019629) (Fig. 26). In the phylogenetic tree, the analysed sequences were separated into three major clusters according to Bc28.1 genotypes: Bc28.1-A; Bc28.1-B; and Bc28.1-34.01. The sequences of the mixed genotype (Bc28.1-A/Bc28.1-34.01) are genetically related to Bc28.1-A genotype sequences and together form a single cluster.

Distribution of B. canis genotypes according to the 18S rRNA and Bc28.1 gene in Lithuania. Based on the 18S rRNA gene PCR-RFLP analysis and sequence analysis, in 94 (83.9%) dogs “mixed” genotype A/B was identified in Lithuania (Fig. 27). These B. canis strains were detected in all investigated regions of Lithuania except for Kėdainiai. The “virulent” B. canis genotype B was detected only in one dog in Klaipėda (western part of Lithuania). Genotype A and genotype B of B. canis pathogens were detected in Kaunas, Klaipėda, Kėdainiai, and Panevėžys. Based on Bc28.1 gene PGR-RFLP and sequence analysis, in 57 (53.7%) canine blood samples genotype B of B. canis pathogens was detected in Lithuania (Fig. 27). Infections of

126 genotype B were detected in Kaunas, Klaipėda, Marijampolė, and Panevėžys. B. canis genotype A was identified in blood samples collected from dogs in Klaipėda, Kaunas and Marijampolė. Infections of 34.01 B. canis strains (20.8%; 22/106) in Vilnius, Kaunas, Kėdainiai, and Klaipėda were detected in samples collected from dogs.

The Bc28.1 gene encodes a 28 kDa GPI (glycosyl-phosphatidylinositol) protein located on the merozoite surface, which affects protozoan access to dog erythrocytes (Yang et al., 2012). These genes are currently used as genetic markers to analyse vaccine efficacy, especially within the bovine Babesia (e.g., B. bovis) species. Determining the genetic diversity of B. canis protozoans in Lithuania may be useful for vaccine development, assessing its potential for use and for predicting the likelihood of complicated diseases. In Western European countries, commercially available vaccines against B. canis infection have been developed by isolating antigens from in vitro cultures of B. canis pathogens (Schetters et al., 1995). Dogs vaccinated with antigens derived from in vitro cultures of B. canis strain A of parasites were protected against infection, but not against infection with B. canis strain B. Therefore, the efficacy of vaccines can be strongly related to the prevalence of different genotypes in different regions (Carcy et al., 2015). The study findings in France demonstrated 24.6% vaccine efficacy against babesiosis (Bourdoiseau, 2006; Carcy et al., 2015). The prevalence of B. canis genotype A and genotype 34.01 – 25.6% and 26.9% in dogs in France respectively, suggests that one of these two genotypes may not be resistant to vaccination. It is therefore proposed to develop polyvalent vaccines by including antigens of different strains of B. canis (Schetters et al., 1997; Moreau et al., 1989). The information on the prevalence of B. canis strains in Lithuania determined in the present study can be very useful for the development of a polyvalent vaccine. The distribution of B. canis strains according to the Bc28.1 gene was determinated in four European regions: Southwest (Portugal), West (France), East (Hungary, Slovakia, Romania, Bulgaria, and Ukraine) and North East (Poland and Russia) (Carcy et al., 2015). Prior to the present study canine infections of B. canis genotype 34.01 were detected only in France. These findings suggest that ecological factors affect the survival of certain genotypes (Carcy et al., 2015). It is known that the distribution of different tick species affects the distribution of different pathogen species (Uilenberg, 2006). It is suggested that genetic diversity is one of the factors affecting the distribution of different B. canis strains. In order to find the answer, it is necessary to compare the genetic diversity of D. reticulatus ticks in France and Lithuania. It is also necessary to carry out research on B. canis genetic diversity in other European countries where there is no data on the prevalence of different strains of B. canis (e.g., Latvia and Estonia). 127

CONCLUSIONS

1. The results of the present study have demonstrated that Dirofilaria repens is the main etiological agent of dirofilariosis in Lithuania. The prevalence of dirofilariosis is dependent on the dogs housing conditions – shelter dogs were more infected (19.0%) than pet dogs (1.9%). The cases described demonstrate that human dirofilariosis infections are caused by the same parasite species as in canine cases. These results suggest that D. repens parasites are endemic in Lithuania. 2. This is the first confirmed report of canine heartworm infection in an imported dog in Lithuania. Transportation of heartworm-infected dogs to North-Eastern Europe from endemic areas could act as microfilarial reservoirs for the local mosquito population, which could increase the risk of spreading the disease. 3. The Wolbachia filarioid endosymbiotic bacterial DNA was detected in the vast majority (81.6%) of dogs infected with D. repens. These findings demonstrate that Wolbachia endobacteria should be one of the targets for treating canine subcutaneous dirofilariosis. 4. In the present study three different strains of B. canis 18S rRNA gene were detected in six different regions of Lithuania: 18S rRNA-A; 18S rRNA-B; 18S rRNA-A/B with predominance of genotype A/B (83.9%). Based on the sequence analysis of the 18S rRNA gene in B. canis, three different sequence variants were detected. Four different strains of B. canis Bc28.1 gene were identified: A, B, 34.01, and A/34.01 with predominance of genotype B (53.7%). Based on the sequence analysis of the B. canis Bc28.1 gene in B. canis, 13 different sequence variants were detected. These findings demonstrate high heterogeneity among B. canis Bc28.1 gene strains. 5. The results of our study show that the distribution of B. canis Bc28.1 genotypes in Lithuania differ from those obtained in Central and South Western European countries. The distribution of B. canis Bc28.1 genotypes in Lithuania showed similarity to the findings in Eastern and Western Europe. B. canis Bc28.1-34.01 genotype identified in the present study was previously detected only in France. 6. The findings of the present study suggest that co-infections with anaplasmosis, babesiosis, and dirofilariosis in dogs in Lithuania are expected.

128

GYVENIMO APRAŠYMAS/CURRICULUM VITAE

Vardas, Pavardė: Vytautas Sabūnas Gimimo data: 1987 gruodžio 14 d. El. paštas: [email protected] Telefonas: +37062541474

Išsilavinimas 1994–2006 m. Klaipėdos „Vėtrungės“ gimnazija. 2006–2012 m. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Veterinarijos akademija, veterinarinės medicinos magistro kvalifikacinis laipsnis ir veterinarijos gydytojo kvalifikacija. 2014–2018 m. Vytauto Didžiojo universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Biologijos mokslo krypties doktorantūros studijos.

Darbo patirtis 2012–2018.06 m. Veterinarijos klinika UAB „Siaurio Šnauceris“. Kaunas. Pareigos: veterinarijos gydytojas. 2018.06 iki dabar – Lino veterinarijos klinika. Klaipėda. Pareigos: veterinarijos gydytojas.

Kitos publikacijos 1. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J. 2015. Dirofiliariozė – sparčiai Lietuvoje plintanti zoonozė. Žurnalas „Vetinfo“. 2. Sabūnas, V., Paulauskas, A., Radzijevskaja, J., Nugaraitė, D. 2017. Nauja kačių infekcinė liga Lietuvoje. Žurnalas „Vetinfo“. 3. Sabūnas, V., Šurkus, J. 2018. Pakaitinė inkstų terapija. Žurnalas „Vetinfo“. 4. Daunoras, G., Grigonis, A., Šurkus, J., Sabūnas, V. 2019. Smulkiųjų gyvūnų apsinuodijimai [Elektroninis išteklius]: Medicinos ir veterinarijos toksikologija. ISBN 978-609-96096-3-8.

Kitos mokslinės konferencijos 1. Sabūnas, V. Įdomioji hemodializė. Mokslinė praktinė konferencija „Gydomųjų aferezių ir klinikinės toksikologijos aktualijos“. 2017 m. spalio 26 d., Kaunas, Lietuva. 2. Sabūnas, V. Įdomioji hemodializė. Teorinė – praktinė konferencija „Aktualūs dializės klausimai“. 2017 m. rugsėjo 28 d., Kaunas, Lietuva.

129

3. Radzijevskaja, J., Lipatova, I., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Detection of Bartonella henselae and Bartonella clarridgeiae in cats and cat fleas in Lithuania. Final 4th conference on Neglected vectors and vector-borne diseases (Eurnegvec) with management committee and working group; Meetings of the COST Action TD1303, 11– 13 September 2017, Crete, Greece. 4. Radzijevskaja, J., Razgūnaitė, M., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Investigation of Toxoplasma gondii and Bartonella spp. pathogens in domestic cats in Lithuania. Smart Bio: international conference, 18–20 May, 2017, Kaunas, Lithuania. 5. Razgūnaitė, M., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Nugaraitė, D., Paulauskas, A., Karvelienė, B., Zamokas, G. Identification of Mycoplasma spp. Pathogens in Domestic cats in Lithuania. COINS 2018: 13th international conference of life sciences, 28 February – 2 March 2018, Vilnius, Lithuania. 6. Razgūnaitė, M., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Paulauskas, A., Karvelienė, B., Zamokas, G. Prevalence and diversity of Mycoplasma spp. pathogens in domestic cats. Smart Bio: ICSB 2nd international conference, 3–5 May 2018, Kaunas, Lithuania. 7. Sabūnas, V., Šurkus, J., Paulauskas, L., Parapijonavičius, V., Grėbliauskas, L., Siaurys, V. Successful management of acute kidney failure in a dog following calcipotriol ingestion. Clinical toxicology: 38th International Congress of the European Association of Poisons Centres and Clinical Toxicologists (EAPCCT): 22–25 May 2018, Bucharest, Romania. Philadelphia, PA : Tayl p. 477-477. 8. Lipatova, I., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Investigation of causative agent of cat scratch disease in cats and their fleas in Lithuania. DGP 2018: 28th annual meeting of the German Society for Parasitology, 21–24 March 2018, Berlin, Germany.

Mokymai ir seminarai 1. Organizuotas kvalifikacijos kėlimo seminaras veterinarijos gydytojams tema „Ektoparazitų pernešamos ligos naminiams gyvūnams, jų diagnostika, paplitimas, keliamos problemos“. 2015 m. kovo 19 d., Kaunas, Lietuva. 2. Skaitytas pranešimas veterinarijos gydytojų kvalifikacijos kėlimo seminare – „Dirofiliariozė. Ektoparazitų sukeliamos ir pernešamos ligos. Jų prevencija ir gydymas“. 2016 m. rugsėjo 7 d., Kaunas, Lietuva. 3. Skaitytas pranešimas veterinarijos gydytojų kvalifikacijos kėlimo seminare „Ortopedijos ir artritų aktualijos. Hematologijos ir citologijos pagrindai“. 2016 m. spalio 28 d., Kaunas, Lietuva.

130

4. Skaitytas pranešimas veterinarijos gydytojų kvalifikacijos kėlimo seminare – „Dažniausiai ektoparazitų pernešamos ligos šunims Lietuvoje – epidemiologija, diagnostika, atvejų analizavimas“. 2016 m. vasario 18 d., Kaunas, Lietuva. 5. Skaitytas pranešimas Lietuvos klinikinės toksikologijos draugijos SAM ESSC apsinuodijimų informacijos biuro seminare „Praktiniai klinikinės toksikologijos aspektai“. 2018 m. birželio 2–3 d., Vilniaus rajonas, Lietuva. 6. Šurkus, J., Sabūnas, V., Žiginskienė, E. Hemodializė smulkiųjų gyvūnų toksinio ūminio inkstų nepakankamumo gydyme. Lietuvos nefrologijos, dializės ir transplantacijos asociacijos XI-asis suvažiavimas. 2018 m. lapkričio 17–18 d., Kaunas, Lietuva. 7. Skaityti pranešimai veterinarijos gydytojų kvalifikacijos kėlimo seminare „Svarbiausi kraujo ląstelių patologiniai pakitimai, diagnozuojant smulkiųjų gyvūnų susirgimus“. Tema – „Vektorių pernešamos infekcijos Lietuvoje: piroplazmozė, babeziozė, dirofiliariozė“. 2019 m. balandžio 26 d., Kaunas, Lietuva.

Stažuotės/Kursai IV Parasitology Summer Course (ParSCo) “Arthropod vectors and transmitted pathogens in the mediterranean area”, 5–12 September 2014, Italy.

Narystė asociacijose 2013 iki dabar – Lietuvos smulkių gyvūnų veterinarijos gydytojų asociacija (LSGVGA) 2016 iki dabar – Lietuvos aferezių ir klinikinės toksikologijos asociacija (LieAKTA) ------Name, surname: Vytautas Sabūnas Data of birth: 14 December 1987 E-mail: [email protected] Phone number: +37062541474

Education 1994–2006 “Vėtrungės” gymnasium, Klaipėda, Lithuania. 2006–2012 – Faculty of Veterinary Medicine of the Lithuanian University of Health Sciences. Master of Veterinary Science, qualification of a veterinary doctor. 2014–2018 – Faculty of Natural Sciences of Vytautas Magnus University, Kaunas, Lithuania. PhD studies in Biology.

131

Work experience April 2012–June 2018 – UAB “Siaurio Šnauceris” Veterinary Clinic, Kaunas, Lithuania, a veterinary doctor of small animals. June 2018 – Linas Veterinary Clinic. Klaipėda, Lithuania, a veterinary doctor of small animals.

Other scientific conferences 1. Sabūnas, V. “Interesting hemodialysis”. Scientific Practical Conference "Actual Issues of Therapeutic Apheresis and Clinical Toxicology" 26 October 2017, Kaunas, Lithuania. 2. Sabūnas, V. “Interesting hemodialysis”. Theoretical - Practical Conference "Relevent Dialysis Issues". 28 September 2017, Kaunas, Lithuania. 3. Radzijevskaja, J., Lipatova, I., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Detection of Bartonella henselae and Bartonella clarridgeiae in cats and cat fleas in Lithuania. Final 4th conference on Neglected vectors and vector-borne diseases (Eurnegvec) with management committee and working group; Meetings of the COST Action TD1303, 11– 13 September 2017, Crete, Greece. 4. Radzijevskaja, J., Razgūnaitė, M., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Investigation of Toxoplasma gondii and Bartonella spp. pathogens in domestic cats in Lithuania. Smart Bio: international conference, 18–20 May, 2017, Kaunas, Lithuania. 5. Razgūnaitė, M., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Nugaraitė, D., Paulauskas, A., Karvelienė, B., Zamokas, G. Identification of Mycoplasma spp. Pathogens in Domestic cats in Lithuania. COINS 2018: 13th international conference of life sciences, 28 February – 2 March 2018, Vilnius, Lithuania. 6. Razgūnaitė, M., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Paulauskas, A., Karvelienė, B., Zamokas, G. Prevalence and diversity of Mycoplasma spp. pathogens in domestic cats. Smart Bio: ICSB 2nd international conference, 3–5 May 2018, Kaunas, Lithuania. 7. Sabūnas, V., Šurkus, J., Paulauskas, L., Parapijonavičius, V., Grėbliauskas, L., Siaurys, V. Successful management of acute kidney failure in a dog following calcipotriol ingestion. Clinical toxicology : 38th International Congress of the European Association of Poisons Centres and Clinical Toxicologists (EAPCCT): 22–25 May 2018, Bucharest, Romania. Philadelphia, PA : Tayl p. 477-477. 8. Lipatova, I., Radzijevskaja, J., Sabūnas, V., Paulauskas, A. Investigation of causative agent of cat scratch disease in cats and their fleas in Lithuania. DGP 2018: 28th annual meeting of the German Society for Parasitology, 21–24 March 2018, Berlin, Germany.

132

Qualification training seminars

1. Organized a qualification training seminar for veterinary practitioners – “Companion animal vector-borne diseases: prevalence and diagnostic”, 19 March 2015, Kaunas, Lithuania. 2. Oral presentation in a qualification training seminar for veterinary practitioners. “Dirofilariosis and other vector-borne diseases: prevention and treatment”, 7 September 2016, Kaunas, Lithuania. 3. Oral presentation in a qualification training seminar for veterinary practitioners. “Basics of hematology and cytology”. 28 October 2016, Kaunas, Lithuania. 4. Oral presentation in a qualification training seminar for veterinary practitioners. “Most common vector-borne diseases in dogs in Lithuania – epidemiology, diagnostics, clinical cases”. 18 February 2016, Kaunas, Lithuania. 5. Oral presentation in a qualification training seminar for the Lithuanian Society of Clinical Toxicology HESC (Health Emergency Situations Centre) Poison Information Bureau (PIB) – “Practical aspects of clinical toxicology: presentation of clinical cases”. 2-3 June 2018, Vilnius, Lithuania. 6. Sabūnas, V, Šurkus, J, Žiginskienė, E. “Hemodialysis in the treatment of acute toxic renal failure in small animals”. XI annual meeting of Lithuanian Nephrology, Dialysis and Transplantation Association. 17-18 November 2018, Kaunas, Lithuania. 7. Oral presentation in a qualification training seminar for veterinary practitioners. “Vector- born diseases in Lithuania – piroplasmosis, anaplasmosis, dirofilariosis”. 26 April 2019, Kaunas, Lithuania.

Internship IV Parasitology Summer Course (ParSCo) “Arthropod vectors and transmitted pathogens in the Mediterranean area”, 5–12 September 2014, Italy.

Membership in Associations Since 2013 – Lithuanian Small Animal Veterinary Association (LSAVA). Since 2016 – Lithuanian Association of Apheresis and Clinical Toxicology.

133

PADĖKA / ACKNOWLEDGMENT

Norėčiau išreikšti ypatingą padėką savo mokslinio darbo vadovei prof. dr. Janai Radzijevskajai už vertingas konsultacijas, skatinimą, patarimus, puikias darbo sąlygas ir darbų organizavimą. Ypač norėčiau padėkoti mokslinio darbo konsultantui prof. dr. (HP) Algimantui Paulauskas už įžvalgas, patarimus ir kritiškas pastabas rengiant mokslinius straipsnius, disertaciją ir pranešimus mokslo konferencijose. Už profesionalų mokslinės veiklos šioje srityje koordinavimą. Norėčiau padėkoti dr. Vytautui Mažeikai už pagalbą ir patarimus identifikuojant helmintų rūšis. Dėkoju prof. dr. (HP) Sauliui Petkevičiui už įžvalgas ir patarimus veterinarinės parazitologijos klausimais. Ypač dėkingas esu Nacionalinė visuomenės sveikatos priežiūros laboratorijos parazitologinių tyrimų poskyrio vedėjai Jolantai Žiliukienei už bendradarbiavimą žmonių parazitologijos srityje. Nuoširdžiai dėkoju doc. dr. Birutei Karvelienei, dr. Irmai Ražanskei, dr. Indrei Lipatovai, dr. Loretai Griciuvienei, Povilui Sakalauskui, Dovilei Tamoliūnaitei ir Matui Galdikui už suteiktą pagalbą skirtinguose disertacijos rengimo etapuose. Labai norėčiau padėkoti „Siaurio Šanaucerio“ veterinarijos klinikos vadovui Vytautui Siauriui už kritišką mastymą, įžvalgas, patarimus ir nuolatinį palaikymą. Dėkoju „Lino veterinarijos klinika“ savininkui Linui Varanauskui ir direktorei Rasai Budginienei už lankstumą siekiant suderinti darbo krūvį ir mokslinę veiklą. Nuoširdžiausiai dėkoju tėvams ir artimiausiems žmonėms už rūpestį ir palaikymą. ------I would like to express my special appreciation and thanks to my scientific supervisor Prof. dr. Jana Radzijevskaja for her invaluable guidance, encouragement, advice, and for providing perfect working conditions. I would especially like to thank my scientific consultant Prof. dr. (HP) Algimantas Paulauskas for insights, advice and critical remarks on preparing scientific articles, the dissertation and reports at scientific conferences. I would like to thank dr. Vytautas Mažeika, for helping in the identification of the helminth species.

134

I would like to thank Prof. dr. (HP) Saulius Petkevičius for insights and advice on the issues of veterinary parasitology. I would like to express my special thanks to Jolanta Žiliukienė, Director of the National Public Health Surveillance Laboratory for co-operation in the field of human parasitology. My sincere thanks also goes dr. Birutė Karvelienė, dr. Irma Ražanskė, dr. Indrė Lipatova, Povilas Sakalauskas, Dovilė Tamoliūnaitė, and Matas Galdikas for their help at different stages of the dissertation. I would like to express my special appreciation and thanks to Vytautas Siaurys, Head of “Siaurio Šnauceris” Veterinary Clinic, for critical thinking, insights, advice and constant support. I would like to thank, Head of “Lino veterinarijos klinka” Linas Varanauskas and director Rasa Budginiene for the opportunity to combine practical veterinary activities with scientific activities. And finally, I am so grateful to my parents and close friends who have provided moral and emotional support.

135

PRIEDAI

Tiriamų prieglaudose laikomų šunų duomenys; – D. repens teigiami mėginiai Veislė Amžius Lytis Svorio kategorija Anglų buldogas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 12 ♂ Mažas Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Jorkšyro terjeras 8 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♂ Vidutinis Mišrūnas 7 ♀ Vidutinis Mišrūnas 4 ♂ Vidutinis Mišrūnas 1,5 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 4 ♂ Mažas Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Foksterjeras 4 ♂ Vidutinis Mišrūnas 5 ♀ Vidutinis Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Mišrūnas 4 ♀ Vidutinis Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♂ Mažas Mišrūnas 1 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 2 ♂ Vidutinis Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1,5 ♂ Vidutinis MIšrūnas 4 ♂ Mažas Mišrūnas 6 ♀ Vidutinis Mišrūnas 10 ♀ Vidutinis Mišrūnas 6 ♂ Mažas Jagterjeras 9 ♂ Vidutinis Mišrūnas 11 ♀ Mažas Mišrūnas 1 ♀ Mažas Mišrūnas 7 ♀ Mažas Mišrūnas 6 ♀ Mažas Mišrūnas 7 ♀ Stambus Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1,5 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 4 ♀ Vidutinis Mišrūnas 8 ♂ Vidutinis Mišrūnas 6 ♂ Vidutinis Mišrūnas 3 ♂ Vidutinis Mišrūnas 4 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1,5 ♂ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 6 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♂ Vidutinis Mišrūnas 1 ♀ Vidutinis Mišrūnas 7 ♂ Stambus

136

Priedo tęsinys Šuns veislė Amžius Lytis Svorio kategorija Mišrūnas 2 ♀ Stambus Mišrūnas 3 ♂ Mažas Mišrūnas 1 ♀ Vidutinis Mišrūnas 6 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1 ♀ Vidutinis Mišrūnas 5 ♂ Vidutinis Mišrūnas 5 ♂ Vidutinis Mišrūnas 5 ♂ Stambus Mišrūnas 5 ♀ Stambus Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 6 ♂ Vidutinis Mišrūnas 5 ♀ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 8 ♂ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 12 ♂ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 2 ♀ Vidutinis Mišrūnas 8 ♀ Vidutinis Mišrūnas 1,5 ♂ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 12 ♂ Vidutinis Mišrūnas 17 ♀ Vidutinis Mišrūnas 13 ♂ Vidutinis Mišrūnas 14 ♀ Mažas Mišrūnas 9 ♀ Mažas Mišrūnas 13 ♂ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 4 ♀ Vidutinis Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 9 ♀ Vidutinis Mišrūnas 7 ♀ Mažas Mišrūnas 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 5 ♀ Vidutinis Šarpėjus 3 ♀ Vidutinis Mišrūnas 5 ♀ Mažas Mišrūnas 3 ♀ Mažas Mišrūnas 7 ♂ Mažas Mišrūnas 12 ♂ Mažas Mišrūnas 18 ♀ Mažas Mišrūnas 11 ♀ Mažas Mišrūnas 10 ♂ Mažas Mišrūnas 10 ♂ Vidutinis Mišrūnas 10 ♂ Mažas Mišrūnas 10 ♂ Mažas Mišrūnas 10 ♀ Mažas Vokiečių aviganis 9 ♂ Didelis Mišrūnas 12 ♀ Vidutinis Mišrūnas 11 ♂ Vidutinis Mišrūnas 12 ♂ Vidutinis Mišrūnas 9 ♂ Vidutinis Mišrūnas 8 mėn. ♀ Vidutinis

137

Vytautas SABŪNAS

ŠUNŲ UŽSIKRĖTIMAS VEKTORIŲ PERNEŠAMAIS PATOGENAIS

Mokslo daktaro disertacija

Spausdino – Vytauto Didžiojo universitetas K. Donelaičio g. 58, LT-44248 Kaunas Užsakymo Nr. K19-089. Tiražas 15 egz. 2019 09 23. Nemokamai

138