Famiglia dei Virgaviridae Classificazione Gruppo IV (+ssRNA) Ordine non assegnato Famiglia Virgaviridae Generi appartenenti alla famiglia Virgaviridae 1. , specie tipo Soil-borne wheat mosaic (SBWMV) 2. Goravirus , specie tipo Gentian ovary ringspot virus (GORV) 3. , specie tipo Barley stripe (BSMV) 4. , specie tipo Peanut clump virus (PCV) 5. , specie tipo Potato mop-top virus (PMTV) 6. , specie tipo (TMV) 7. , specie tipo Tobacco rattle virus (TRV) a. Genere Furovirus 1. Chinese wheat mosaic virus 2. Japanese soil-borne wheat mosaic virus 3. Oat golden stripe virus 4. Soil-borne cereal mosaic virus 5. Soil-borne wheat mosaic virus 6. Sorghum chlorotic spot virus b. Genere Goravirus 1. Drakaea virus A 2. Gentian ovary ringspot virus c. Genere Hordeivirus 1. Anthoxanthum latent blanching virus 2. Barley stripe mosaic virus 3. Lychnis ringspot virus 4. Poa semilatent virus d. Genere Pecluvirus 1. Indian peanut clump virus 2. Peanut clump virus e. Genere Pomovirus 1. Beet soil-borne virus 2. Beet virus Q 3. Broad bean necrosis virus 4. Potato mop-top virus f. Genere Tobamovirus 1. Bell pepper mottle virus 2. Brugmansia mild mottle virus 3. Cactus mild mottle virus 4. Clitoria yellow mottle virus 5. Cucumber fruit mottle mosaic virus 6. Cucumber green mottle mosaic virus 7. Cucumber mottle virus 8. Frangipani mosaic virus 9. Hibiscus latent Fort Pierce virus 10. Hibiscus latent Singapore virus 11. Kyuri green mottle mosaic virus 12. Maracuja mosaic virus 13. Obuda pepper virus 14. Odontoglossum ringspot virus 15. Paprika mild mottle virus 16. Passion fruit mosaic virus 17. Pepper mild mottle virus 18. Rattail cactus necrosis-associated virus 19. Rehmannia mosaic virus 20. Ribgrass mosaic virus 21. Sammons's Opuntia virus 22. Streptocarpus flower break virus 23. Sunn-hemp mosaic virus 24. Tobacco latent virus 25. Tobacco mild green mosaic virus 26. Tobacco mosaic virus 27. Tomato mosaic virus 28. Tomato mottle mosaic virus 29. Tropical soda apple mosaic virus 30. Turnip vein-clearing virus 31. Ullucus mild mottle virus 32. Wasabi mottle virus 33. Yellow tailflower mild mottle virus 34. Youcai mosaic virus 35. Zucchini green mottle mosaic virus g. Genere Tobravirus 1. Pea early-browning virus 2. Pepper ringspot virus 3. Tobacco rattle virus

Nella famiglia Virgaviridae vi sono 56 specie, divise in 7 generi. Virgaviridae è una famiglia di virus RNA a singolo filamento positivo. Le piante servono come ospiti naturali. Il nome della famiglia deriva dalla parola latina virga (asta), in quanto tutti i virus di questa famiglia sono a forma di asta, bacilliformi. I virus della famiglia Virgaviridae sono caratterizzati da unica proteina di replicazione simile alle proteine alfa. I virus dei Virgaviridae non sono avvolti dal pericapside e presentano geometrie bacilliformi ad elica rigida e simmetria elicoidale (figura 1). Il diametro è di circa 20-25 nm (figura 1) ed i virioni hanno un canale centrale (figura 2). I genomi sono a RNA lineare, a singolo- filamento, senso positivo, con una struttura simile a 3'- tRNA e nessuna coda poliA (figura 2). Possono essere costituiti da uno, due o tre segmenti, a seconda del genere. Le proteine del capside sono circa 19-24 kiloDaltons (figura 2). La replica virale è citoplasmatica. L'ingresso nella cellula ospite viene raggiunta con la penetrazione nella stessa cellula. La replicazione avviene secondo il modello del virus RNA a filamento positivo. La trascrizione del virus RNA a filamento positivo avviene secondo il metodo classico di questi virus. La traduzione avviene per scansione perdente e soppressione del terminatore. Il virus esce dalla cellula ospite con il movimento virale tripartito non tubulare guidato e con il movimento virale monopartito non tubulare guidato. Le piante servono come ospiti naturali.

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Figura 1 - Particelle di virioni della famiglia Virgaviridae al microscopio elettronico. Soilborne wheat mosaic virus (genere Furovirus ) di lunghezza bimodale (140 and 280 nm) e diametro trasversale di 22 nm. (A). Gentian ovary ringspot virus , del genere Goravirus (B). Barley stripe mosaic virus ( Hordeivirus ), di diametro di 22 nm, elicoidale, con il passo dell'elica base è di 2,5-2,6 nm, Con la formazione separata del capside delle diverse specie di RNA sono prodotte particelle di lunghezze diverse: 148, 128, 108 e 100 nm in ceppi “pseudo quadripartiti”; 143, 128 e 112 nm in ceppi "ortotripartiti"; 146 e 128 nm in ceppi “pseudobipartiti” (C). Peanut clump virus specie tipo del genere Pecluvirus (D). Potato mop-top virus ( Pomovirus ) di 20 nm di spessore, con una struttura elicoidale allentata ad una estremità (E). Tobacco mosaic virus , specie tipo del genere Tobamovirus di circa 18 nm di diametro e 300-310 nm di lunghezza (F). Tobacco rattle virus specie tipo del genere Tobravirus , con virioni lunghi tra 45 e 190 nm (G).

3 • Furovirus

• Goravirus

• Hordeivirus

4 • Pecluvirus

• Pomovirus

5 • Tobamovirus

• Tobravirus

Figura 2 – Schema dei virioni e dei genomi dei generi della famiglia Virgaviridae . Furovirus : virioni senza pericapside, bacilliforme, a simmetria elicoidale, composti da due segmenti di circa 140-160 nm e 260-300 nm di lunghezza e 20 nm di diametro (A1); genoma segmentato, lineare, a ssRNA (+), con i due segmenti , rispettivamente, di 6-7 kb e di 3,5-3,6 kb, con RNA genomici provvisti di capside ed a struttura simile a tRNA in 3 ‘ (A2). Goravirus : rappresentazione schematica della struttura genomica di Gentian ovary ringspot virus (GORV) che è costituito da RNA1 (lungo 5519 basi) e RNA2 (per

6 il quale le sequenze di poliU e poliA si trovano tra la prima e la seconda ORF). RdRp è la polimerasi RNA dipendente; CP è la proteina del capside; TGB è un blocco di tripli geni, per cui molti generi dl virus delle piante codificano un "blocco genico triplo" (TGB), che rappresenta un modulo genico specializzato, evolutivamente conservato, coinvolto nei movimenti cellula-cellula e nei movimenti a lunga distanza; CRP è la proteina ricca in cisteina (B). Hordeivirus : virioni bacillifortmi di 20-25 nm di diametro e di tre lunghezze: 150-160 nm, 126 nm e 109 nm a seconda del tipo di RNA incapsulato. Il nucleocapside è longitudinale striato (C1); genoma segmentato, lineare, tripartito o quadripartito, a ssRNA (+), composto da RNA-alpha = 3,8 kb, RNA-beta = 3,3 kb e RNA-gamma = 2,9-3,3. Il terminale 3' di ciascun RNA contiene una struttura simile a tRNA. Il terminale 5' è provvisto di capside (m7G5pppGUA). Si possono contare 7 ORF (C2). Pecluvirus : virioni non avvolti nel pericapside, bacilliformi, a simmetria elicoidale e composti da due segmenti di lunghezza di 190 e 245 nm, rispettivamente, e di 21 nm di diametro (D1); genoma segmentato, lineare, a ssRNA (+), con due segmenti che sono, rispettivamente, di 5,9 e 4,8 kb. Gli RNA genomici sono provvisti di capside (D2). Pomovirus : virioni senza pericapside, bacilliformi, a simmetria elicoidale di 21 nm di diametro ed una lunghezza di 245 nm; il genoma è lineare e segmentato e i tre segmenti sono di lunghezza di 6, 3,5 e 3 kb (E1 e E2). Tobamovirus : virioni senza pericapside avvolgente, a forma di bastoncino elicoidale, a simmetria elicoidale, di circa 18 nm di diametro e 300-310 nm di lunghezza.(F1); il genoma è monopartito, lineare, a ssRNA (+) di 6,3-6,5 kb. Il terminale 3 ' ha una struttura simile a tRNA. Il terminale 5 'ha un capside nucleotidico metilato, m7G5'pppG (F2). L'RNA del virione è infettivo e costituisce il genoma e l'RNA messaggero virale. Gli ORF prossimali al terminatore 5' sono tradotti direttamente per produrre i costituenti virali del complesso di replicasi. RdRp viene tradotto con la soppressione del terminatore alla fine di ORF1. La piccola replicasi è coinvolta nella replica e funge da soppressore del silenziamento dell'RNA. Le proteine di movimento e la proteina capsidica (CP) sono espresse da mRNA subgenomici distinti. Tobravirus : virioni non avvolti dal pericapside assente, a forma di bacchetta, a simmetria elicoidale. Il virione è composto da due segmenti di lunghezza 180-215 e 46-115 nm e di 22 nm di diametro.(G1); il genoma è segmentato, bipartito, lineare, a ssRNA (+). L’RNA a singolo filamento è di 26,84 kb, di una lunghezza totale di 8600–11300 nucleotides. I due segmenti sono rispettivamente di 6,8 e 4,5 kb. I RNA genomici sono provvisti di capside, non sono poliadenilati in 3 (G2). Nella figura 3 sono indicati i sintomi causati dalle infezioni dei generi e delle principali specie virali su alcune specie di piante coltivate. • Furovirus , Soilborne wheat mosaic virus (specie tipo):

7 • Goravirus , Gentian ovary ringspot virus (specie tipo):

• Hordeivirus , Barley stripe mosaic virus (specie tipo):

8 • Pecluvirus , Peanut clump virus (PCV): (specie tipo):

• Pomovirus , Potato mop-top virus (PMTV):

9 • Tobamovirus , Tobacco mosaic virus (TMV):

• Tobravirus , Tobacco rattle virus (TRV):

Figura 3 – Danni arrecati alle piante coltivate da alcune specie virali della famiglia Virgaviridae . Genere Furovirus , Soilborne wheat mosaic (SBWM): larga chiazza di grano scolorito a causa di SBWMV (A1); i sintomi di SBWM variano dai mosaici gialli, verdi, gialli prominenti sulle foglie (A2). Genere Goravirus , Gentian ovary ringspot virus (GORV):

10 iintomi di macchie anulari sulla superficie esterna delle pareti ovariche di genziana (Gentiana triflora ). I petali sono stati Rimossi (B1). A sinistra, sintomi conseguenti l'inoculazione in foglie con GORV e, a destra, controllo non inoculato (B2). Genere Hordeivirus , Barley stripe mosaic virus (BSMV): i primi sintomi appaiono sulla seconda o terza foglia e poi su tutte le foglie prodotte successivamente. Le foglie appena sviluppate hanno strisce gialle, in particolare sulla guaina fogliare e sulla parte basale della lamina. Le strisce si estendono gradualmente lungo tutta la lunghezza della foglia e diventano presto necrotiche (C1 e C2). Le piante infette sono di solito deboli e poco sviluppate (C1). In molte piante infette, le parti più giovani sono poco sviluppate o avvizzite, spesso di colore marrone, ma a volte l’orzo può svilupparsi quasi normalmente e non presentare sintomi. La variazione dei sintomi è correlata alla virulenza del patogeno e alla resistenza dell'ospite. Pecluvirus , Peanut clump virus (PCV): le piante infette precocemente sono evidenti nel campo perché sono gravemente poco sviluppate e di colore verde scuro (D1); le giovani foglie mostrano sintomi rappresentati da mosaici, chiazze e clorosi (D2); le foglie più vecchie sono di colore verde più scuro, con chiazze più leggere (D3). Pomovirus , Potato mop-top virus (PMTV): sintomi sulla sezione trasversale del tubero (E1); sintomi sulla superficie esterna del tubero (E2); sintomi secondari di crepe e rotture su tubero di patata (E3). Tobamovirus , Tobacco mosaic virus (TMV): sintomi di mosaico del tabacco su foglia di tabacco (E1), su foglia (E2) e su bacca (E3) di pomodoro, su foglia di fagiolo (E4), su piante di petunia (E5). Tobravirus , Tobacco rattle virus (TRV): sintomi tipici rappresentati da macchie ad anello su foglie di peonia (F).

Replicazione citoplasmica La replicazione nel citoplasma della cellula ospite avviene secondo le seguenti fasi (figura 2): • Il virus penetra nella cellula ospite. • Il virus si spoglia del proprio capside e rilascia RNA genomico virale nel citoplasma. • L'RNA virale viene tradotto per produrre le due proteine necessarie per la sintesi di RNA (replicazione e trascrizione). • La replica avviene nelle fabbriche virali citoplasmatiche. Un genoma dsRNA viene sintetizzato dal ssRNA(+) genomico. • Il genoma dsRNA viene trascritto/replicato fornendo così mRNA virali/nuovi genomi ssRNA(+). • Il RdRp riconosce i promotori subgenomiali interni sull'RNA a senso negativo per trascrivere gli RNA subgenomiali a c-terminali 3' che genereranno la proteina capsidica, le proteine di movimento e il soppressore virale del silenziamento RNA (VSR). • Assemblaggio del virus nel citoplasma. Ogni segmento (se multipartito) è avvolto dal capside.. • Le proteine del movimento virale mediano il trasferimento intercellulare.

Soppressione del silenziamento dell’RNA Le seguenti proteine dei generi della famiglia Virgaviridae operano la soppressione del silenziamento di RNA: ° La proteina di 19K di Soilborne wheat mosaic virus ( Furovirus ). ° La proteina P15 di Peanut clump virus ( Pecluvirus ). ° La proteina γ-b di Barley stripe mosaic virus ( Hordeivirus ). ° La subunità di replicasi di 126 kDa di Tobacco mosaic virus ( Tobamovirus ). ° La proteina di 16 K di Tobacco rattle virus (Tobravirus ).

Sono ora indicate alcune proteine di alcuni virus della famiglia Virgaviridae :

11 ° Grande subunità di replicasi ( large replicase subunit ): è una RNA polimerasi RNA dipendente attiva nella replicazione virale di RNA. ° Piccola subunità di replicasi ( small replicase subunit ): è una metiltransferasi attiva nell'incapsulamento di RNA in un capside ( capping ) e nell'elicasi di RNA. La metiltransferasi mostra un'attività enzimatica di capping citoplasmatica. Questa funzione è necessaria poiché tutti gli RNA virali sono sintetizzati nel citoplasma e gli enzimi di capping della cellula ospite sono limitati al nucleo. La regione dell'elicasi probabilmente esibisce le attività di esecuzione di NTPase e dell'RNA. Funziona anche come soppressore del silenziamento del corrispondente gene di silenziamento mediato dall'RNA, noto anche come silenziamento del gene post- trascrizionale (PTGS), un meccanismo di difesa virale delle piante che limita l'accumulo di RNA viral nelle cellule infette. Può mediare la soppressione di silenziamento anche attraverso l'inibizione di HEN1 mediata da siRNA oppure dalla demetilazione di siRNA. Questa proteina viene tradotta come una proteina di fusione attraverso la lettura episodica di un codone di terminazione. Quando il passaggio del codone terminatore TGA si verifica tra i codoni per Gln- 1116 e Gln-1118, ciò comporta l'aggiunta della regione RdRp alla replicasi. ° Proteina α A : svolge attività di metiltransferasi e elicasi. La metiltransferasi mostra un'attività enzimatica di capping citoplasmatica. Questa funzione è necessaria poiché tutti gli RNA virali sono sintetizzati nel citoplasma e gli enzimi di capping della cellula ospite sono limitati al nucleo. La regione elicasi esibisce le attività di svolgimento di NTPase e RNA. Il genoma di Barley stripe mosaic virus (BSMV) è costituito da tre RNA lineari, positivi, a singolo filamento, incapsulati in virioni separati denominati RNA-alfa, RNA-beta e RNA-gamma. Tre proteine (alfa-A, beta-A e gamma-A) sono tradotte direttamente da questi RNA genomici e le proteine rimanenti codificate su RNA-beta (beta-B, beta-C e beta-D) e RNA-gamma (gamma -B) sono espressi attraverso tre RNA subgenomiali messaggeri. ° Proteina del capside : La proteina del capside (CP) si auto-assembla per formare virioni a forma di barra di circa 25 nm di diametro con un canale centrale che racchiude l'RNA genomico virale. ° Proteina di movimento TGB1 ( Barley stripe mosaic virus ): trasporta il genoma virale alle cellule vegetali vicine direttamente attraverso il plasmodesma. La proteina di movimento consente l'efficente propagazione del virus da una cellula ospite ad un'altra, escludendo la barriera di parete delle stesse cellule ospiti.Si hanno in interazioni omologhe che portano alla formazione di un complesso ribonucleoproteinico contenente RNA virale genomico e messaggero (vRNPs). TGBp2 e TGBp3 sono necessari per la consegna intracellulare di vRNP contenenti TGBp1 attraverso i plasmodesmi. ° Proteina di movimento TGB2 (Barley stripe mosaic virus ): partecipa al trasporto di RNA virale verso il plasmodesma. Probabilmente è destinato al plasmodesma da TGBp3, insieme a RNA virali-TGBp1 (complesso RNP). Può trasportare al plasmodesma e aumentare il loro limite di esclusione dimensionale. Questa proteina viene tradotta come una proteina di fusione attraverso la lettura episodica di un codone di terminazione. La lettura del codone terminatore TGA si verifica tra i codoni per Gly-131 e Ser-133, producendo così la proteina leggera di translazione minore TGB2. ° Proteina di movimento TGB3 ( Barley stripe mosaic virus ): partecipa al trasporto di RNA virale al plasmodesma. TGBp3 contiene segnali di targeting del plasmodesma ed è, pertanto, coinvolto nel targeting di TGBp2 e RNA virali-TGBp1 (complesso RNP), al plasmodesma. Può trasportare al plasmodesma e aumentare il loro limite di esclusione delle dimensioni. ° Proteina P39 ( Peanut clump virus ): può essere coinvolta nella trasmissione dei virioni e trasmissione mediata dal vettore del virus. Viene espressa attraverso un meccanismo di scansione perdente. Circa un terzo dei ribosomi non riesce ad avviare la traduzione della CP e quindi tradurre la proteina P39. ° Suppressore di silenziamento RNA ( Peanut clump virus ): si tratta di una proteina γ. Si tratta del soppressore di silenziamento del gene mediato da RNA, noto anche come silenziamento del

12 gene post-trascrizionale (PTGS), meccanismo di difesa virale delle piante che esegue l'inibizione sequenziale delle espressioni di mRNA virali. ° Proteina di 16kDa ( Tobacco rattle virus ):

I virus delle piante agiscono come attivatori e target di silenziamento del RNA e hanno evoluto proteine per sopprimere questa risposta alla difesa vegetale durante l'infezione. Sebbene il tobamovirus (TMV) del mirtillo del tabacco innesca la produzione di piccoli RNA interferenti virali (siRNA), ciò non porta ad un silenziamento efficace di TMV né è un ibrido di fluorescenza verde TMV-verde (GFP) in grado di indurre la silenziosità di un GFP- Transgene in Nicotiana benthamiana, che indica che un soppressore di silenziamento TMV è attivo e agisce a valle della produzione di siRNA. D'altro canto, TMV-GFP non è in grado di diffondersi in cellule in cui si stabilisce il silenziamento di GFP, suggerendo che il soppressore virale di silenziamento non riesca a ripristinare il silenziamento già accertato. Anche se le prove precedenti indicano che l'attività di soppressione silenziosa del tobamovirus risiede nella subunità di replicasi virale da 126 kDa, il meccanismo di soppressione silenziosa da parte di questa famiglia di virus non è noto. Qui si connette l'attività di soppressione silenziosa di questa proteina con la nostra precedente constatazione che l'infezione di tobamovirus mosaico di colza di petrolio porta ad interferenza con la metilazione mediata da HEN1 di siRNA e microRNA (miRNA). Abbiamo dimostrato che l'infezione TMV porta allo stesso modo all'interferenza con la metilazione HEN1-mediata di piccoli RNA e che questa interferenza e la formazione di sintomi della malattia indotta da virus sono legati all'attività di soppressione silenziosa della proteina di 126 kDa. Inoltre, dimostriamo che anche il virus della crisalide Turnip interferisce con la metilazione di siRNA, ma, in contrasto con i tobamovirus, non con la metilazione di miRNA.

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