Análisis De La Biodiversidad De Curculiónidos Sobre Ulex Con

Análisis de la biodiversidad de curculiónidos sobre Ulex

con especial atención en la interacción Ulex-Exapion

Clara Pitarch Soler Máster Oficial en Biodiversidad: Conservación y Evolución

Tutor: Mario Zabal Aguirre

Tutora Académica: Maria del Mar Ferrer Suay

Valencia, septiembre de 2018 ABSTRACT Fires disrupt interactions in the ecosystem affected. In this context, Ulex-Exapion interaction has a special interest. Ulex genus is adapted to fire; not only does it regenerate faster after a fire but also antagonistic interactions are disrupted. In the present study weevil biodiversity on U. parviflorus is analyzed in order to determine the effect of a fire in weevil community. Samples are collected from a recent fire (2015) and an older one (2012). Species richness is analyzed and compared in order to observe differences among fired, non-fired areas and patches in the middle of the fire. Only when comparing the recently-fired area with the other areas significant results are obtained. Accordingly, recovery time of weevil populations after fire is estimated less than 6 years. Moreover, determining the typical host of the weevil biodiversity observed on U. parviflorus is essential in order to understand how weevils are affecting the plant life-cycle. 17 species were collected; nonetheless, only 3 of them are identified as potentially seed predators (Exapion fasciolatum, Lepidapion sp. and Pachytychius sparsutus). On the other hand, Exapiina phylogeny is inferred in order to (i) identify all the species collected from U. parviflorus and initially classified as E. fasciolatum and (ii) identify Exapion species collected from other Ulex species for comparing phylogenies of both genus and determining coevolution events. Species found on U. parviflorus are identified as E. fasciolatum and Lepidapion sp, Species collected from U. baeticus, U. europaeus and U. erinaceus are described as E. ulicis and from U. micrantus, U. minor, U. densus and U. canescens. as E. lemovicinum.

RESUMEN Los incendios afectan a la biodiversidad y a la red de interacciones del ecosistema afectado. En este contexto, la interacción Ulex-Exapion es de especial interés ya que el género Ulex está compuesta por plantas pirófilas, las cuales obtienen diversos beneficios tras un incendio; entre ellos, quedan libres de depredadores. Se analiza cómo la biodiversidad de curculiónidos sobre U. parviflorus se ve afectada tras un incendio recogiendo muestras de incendios recientes (2015) y antiguos (2012). La riqueza específica es analizada y comparada para determinar si se observan diferencias entre zonas incendiadas, no incendiadas y parches. Solo en el interior del incendio reciente se observa una reducción significativa en la diversidad de curculiónidos, por lo que se estima un tiempo de recuperación de las poblaciones de menos de 6 años. Por otra parte, determinar el hospedador típico de todas las especies encontradas sobre U. parviflorus es esencial para comprender en qué medida la planta se ve afectada por los curculiónidos que viven sobre ella. De las 17 especies encontradas, únicamente 3 son posibles depredadoras de sus semillas (Exapion fasciolatum, Lepidapion sp. y Pachytychius sparsutus), aunque se encuentran otras posibles depredadoras de las hojas. Por otra parte, se realiza una filogenia dentro de la subtribu Exapiina con el objetivo de (i) identificar las especies clasificadas como E. fasciolatum recogidas sobre U. parviflorus y (ii) identificar otras especies de Exapion sobre plantas del género Ulex y comparar con la filogenia de la planta para determinar si han ocurrido fenómenos de coevolución entre ambos géneros. Se identifican las especies sobre U. parviflorus como E. fasciolatum y Lepidapion sp, las halladas sobre U. baeticus, U. europaeus y U. erinaceus como E. ulicis y las encontradas en U. micrantus, U. minor, U. densus y U. canescens. como E. lemovicinum. Palabras clave: plant-animal interaction, seed predation, fire, weevil biodiversity, Ulex, Exapion

ÍNDICE 1. Introducción ...... 3 2. Objetivos ...... 5 3. Material y métodos ...... 6 3.1. Recogida de muestras ...... 6 3.2. Análisis estadísticos ...... 9 3.3. Extracción, amplificación y secuenciación del ADN ...... 10 3.4. Análisis de las secuencias ...... 12 3.5. Filogenias ...... 13 4. Resultados ...... 14 4.1. Diversidad ...... 14 4.2. Estadística ...... 16 4.3. Identificación de especies ...... 17 4.4. Frutos ...... 20 4.5. Filogenias ...... 20 5. Discusión ...... 23 5.1. Efectos del incendio sobre la diversidad ...... 23 5.2. Identificación de especies y determinación de su hospedador definitivo ...... 25 5.3. Filogenias ...... 28 6. Conclusión ...... 30 7. Agradecimientos...... 30 8. Referencias ...... 31 9. Apéndices ...... 35

1. Introducción Los ecosistemas se basan en interacciones. Cada especie se encuentra directa o indirectamente relacionada con el resto a través de éstas. Las plantas son la base de cualquier red de interacción trófica (Seckbach & Dubinsky, 2011). Los recursos que ofrecieron, especialmente en el Cretácico, son la base de la diversidad animal encontrada en la actualidad (Seckbach & Dubinsky, 2011; Herrera & Pellmyr, 2008), lo cual ha dado lugar a una gran variedad de interacciones. Existen diferentes tipos de interacciones, las cuales pueden clasificarse de forma distinta en función de su naturaleza. Algunas de ellas son positivas para ambas especies, como son las relaciones mutualistas. Incluye las relaciones entre plantas y polinizadores, por ejemplo. Otras, sin embargo, favorecen a uno de los organismos causándole al otro un perjuicio. Esto ocurre en las relaciones de depredación, donde un individuo obtiene un beneficio en términos energéticos a costa de destruir total o parcialmente tejidos de otro. Por otra parte, se pueden describir interacciones generalistas y especialistas. A pesar de que las interacciones en la naturaleza siguen un continuo dentro de estos rangos, (Poisot et al., 2015), la división en dos clases simplifica el análisis. De esta manera, aplicada a la depredación sobre plantas, las especies generalistas serían aquellas que depredan sobre diversos géneros o familias (polífagas), mientras que las especialistas se alimentan exclusivamente de un género, subfamilia o familia (oligófagas). Las especialistas tienden a tener mayor éxito cuando el ecosistema no se encuentra perturbado; sin embargo, en caso de alteraciones en el ecosistema, las especies generalistas obtienen una ventaja, ya que pueden aprovechar los pocos recursos presentes, mientras las especialistas perecen si su hospedador desaparece.

El trabajo de final de máster pretende analizar la interacción antagonista especialista que existe entre fabáceas del género Ulex y curculiónidos del género Exapion. Los curculióniodos son coleópteros herbívoros pertenecientes a la superfamilia Curculionoidea. Se trata de uno de los grupos más diversos del orden Coleoptera (McKeena et al., 2008), con hasta 85.000 especies descritas (Ugarte & Alonso-Zarazaga, 2002). Su gran diversidad se debe a fenómenos de coevolución con angiospermas (entre otros: Winter et al., 2017; McKeena et al., 2008; Ugarte & Alonso-Zarazaga, 2002). Las interacciones entre apiónidos (Coleoptera, Curculionoidea, Apionidae) y aliagas han sido objeto de estudio en trabajos anteriores (Barat et al., 2007, 2008), los cuales se centraban en el efecto de la fenología sobre la interacción y cómo esto puede dar lugar a fenómenos de especiación incluso en simpatría. Los apiónidos son altamente especialistas; tienden a

3 ser oligófagos dentro de un mismo género e incluso se ha descrito alguna especie monófaga. Con lo que respecta a la subtribu Exapiina, donde se incluyen los géneros Exapion y Lepidapion, es especialista en fabáceas (Winter et al., 2017).

Este trabajo se incluye dentro del proyecto "Fuego e interacciones bióticas a escala de paisaje" (CGL2015-64086-P), subvencionado por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). Investigador principal: Juli G. Pausas. Desarrollado en el Centro de Investigación sobre la Desertificación (CIDE-CSIC). En él se analiza cómo los incendios afectan a las interacciones planta-animal. Los incendios son un factor más a tener en cuenta en los ecosistemas mediterráneos, donde se trata de un proceso natural más (Pausas & Keeley 2009). Muchas plantas han desarrollado adaptaciones específicas al fuego, como por ejemplo la serotinia en los pinos (Hernández-Serrano et al. 2013, 2014; Castellanos et al., 2015), el rebrote tras un fuego a partir de brotes basales o incluso a partir del tronco, como ocurre en el género Quercus (Pausas & Keeley, 2017), etc. Las aliagas también presentan adaptaciones que les aportan ventajas tras un fuego. Ulex es un género de angiospermas fabáceas de la tribu Genisteae nativo del oeste de Europa y el noroeste de África (Hornoy et al., 2013). Es en el sur de la Península Ibérica donde se encuentra la mayor diversidad de especies dentro del género (Cubas et al., 2005). Se trata de plantas pirófilas, las cuales tienden a producir material inflamable, especialmente en zonas de fuegos recurrentes (Moreira et al., 2014). A temperatura ambiente las semillas de algunas especies de Ulex, como por ejemplo U. parviflorus, se encuentran inactivas; en los picos estivales de temperatura germina un pequeño porcentaje pero no es hasta que se alcanzan temperaturas típicas de un incendio cuando la mayoría de semillas despierta y germina (Moreira & Pausas, 2012). Otras especies como U. europaeus son capaces de rebrotar inmediatamente después de un incendio.

Los animales presentan menos adaptaciones a fuegos, y si ocurren, éstas son comportamentales (Pausas & Parr, 2018), lo cual las hace más susceptibles a este tipo de alteraciones y tienden a huir de estas zonas. Las comunidades de pequeños animales, como son los invertebrados, se ven seriamente disminuidas tras un incendio, ya sea porque mueren quemados, de inanición al no disponer de plantas sobre las que alimentarse o porque se retiran a zonas sin quemar. Para las aliagas esto significa que, tras un incendio, las nuevas plantas crecerán libres de depredadores (García et al., 2016). Los beneficios serán mayores para la planta si se trata de una interacción especialista ya que éstos tardan más en recolonizar las áreas quemadas que animales más generalistas;

4 como dependen en mayor medida de la especie sobre la que depredan no son capaces de recolonizar el terreno hasta que la zona se encuentra regenerada.

En este trabajo se estudia la diversidad de curculiónidos presentes sobre Ulex parviflorus. Se ha descrito una interacción negativa especialista entre U. parviflorus y Exapion fasciolatum (Apionidae: Apioninae: Exapiini) (García et al., 2016); aunque no es la única especie encontrada sobre la planta, sí es la más abundante. De entrada, la presencia de una especie de curculiónido sobre una planta no es un indicativo directo de que se esté alimentando de ella (Kitson et al., 2013). El estudio de García et al. (2016) demuestra que E. fasciolatum depende totalmente de U. parviflorus para completar su ciclo vital. En primavera, cuando la planta florece, las hembras depositan los huevos dentro de los ovarios de U. parviflorus. De esta manera las larvas y pupas de E. fasciolatum se desarrollan alimentándose de las semillas de la planta. Más tarde, con la dehiscencia de los frutos emergen los adultos del curculiónido.

El trabajo está especialmente enfocado a la depredación de las semillas de Ulex parviflorus, ya que es lo que más afecta al éxito reproductivo de la planta (Pereira et al., 2014). En U. europaeus, Barat et al. (2008) describió una depredación de hasta un 90% de sus semillas por parte de E. ulicis, lo que genera un gran impacto en el éxito reproductivo de la planta. Por ello, no solo se pretende identificar las especies halladas sobre la planta, sino también determinar cuáles se desarrollan dentro de fruto depredando las semillas.

Como se ha comentado anteriormente, la diversificación de las plantas con flor fue acompañada de un incremento en la diversidad de curculiónidos debido a fenómenos de coevolución (Winter et al., 2017), el cual es un mecanismo esencial en la diversificación dentro de la clase Insecta (Letsch et al., 2018). Se han descrito especies de Exapion distintas viviendo sobre especies diferentes de Ulex (Barat et al., 2007, 2008). Considerando la gran diversidad del género en la Península Ibérica, es posible que hayan ocurrido eventos de coevolución y sobre cada especie de Ulex se encuentre una distinta de Exapion. En el presente trabajo se analiza también la diversidad del género Exapion viviendo sobre Ulex de toda la Península.

2. Objetivos 1. Determinar en qué medida el fuego afecta a las comunidades de curculiónidos y cuánto tiempo tardan en recuperarse tras un incendio. Para ello se analiza la biodiversidad de

5 curculiónidos presentes sobre Ulex parviflorus en zonas que han sufrido incendios recientes, incendios más antiguos y zonas no incendiadas. La hipótesis es que hay especies que son mejores colonizadoras y, por tanto, recolonizarán antes que otras. Para ello se examina la diversidad de curculiónidos dentro del incendio en función de la distancia a la que se encuentren del margen de éste.

2. Determinar cuáles de las especies de curculiónidos halladas sobre U. parviflorus depredan sus semillas y cuáles se encuentran allí por otros motivos. Para ello se identificarán tanto las especies encontradas sobre la planta como aquellas halladas dentro de los frutos.

3. Identificar las especies de Exapion recogidas sobre diferentes especies de Ulex de la península Ibérica a través de una reconstrucción filogenética y evaluar la posible codivergencia entre ambos géneros.

3. Material y métodos 3.1. Recogida de muestras La fenología de la planta es esencial a la hora de recoger las muestras. Las plantas de Ulex parviflorus florecen en primavera y E. fasciolatum pone sus huevos en ese momento. Es por ello que las muestras de curculiónidos adultos se recogen siempre entre marzo y mayo, dependiendo de los meses de floración de ese año, mientras que los frutos se recogen a partir de junio, en el momento en que las semillas maduran.

Entre marzo y abril de 2017 se recogen curculiónidos sobre Ulex parviflorus alrededor de la localidad de Pego (Alicante) (Figura 1). En mayo de 2015 hubo un incendio, por lo que se considera un fuego reciente. Con tal de poder comparar posteriormente el tiempo de recuperación de un ecosistema tras un evento con tanto impacto en la biodiversidad como es un incendio, se toman muestras de zonas afectadas por incendios anteriores a 2015. En 2012 un incendio afectó a terrenos pertenecientes a Andilla (Valencia) (Figura 2). Las muestras de este incendio fueron recogidas en marzo de 2018.

Se registra la localización de las plantas de las que se recogen muestras con un GPS. Los puntos muestreados se visualizarán con el programa QGIs (QGIS Development Team, 2018), un programa del tipo de sistema de información geográfica (GIS) que digitaliza los incendios y muestreos, permite calcular distancias, tamaños, etc. La extensión del incendio es proporcionada por la Generalitat Valenciana (Direcció General de Prevenció

Figura 1. Incendio de Pego (verde). Los puntos rojos marcan los plots que agrupan las plantas muestreadas junto con su código de identificación. Imagen extraída de QGIs.

Figura 2. Incendio de Andilla (verde). Los puntos rojos corresponden a los plots donde se agrupan las plantas muestreadas y el número es el código de cada plot. Imagen extraída de QGIs

7 i Extinció d'Incendis Forestals). Una vez reconocidos los límites de los incendios se recogen muestras del interior del incendio (se agrupan en la categoría Dentro), de zonas sin incendiar (Fuera) y dentro de parches (Parches), los cuales corresponden a zonas dentro de los límites del incendio que no fueron quemadas porque estaban más protegidas (cultivos, casas, etc.).

Tras seleccionar una planta, se geolocaliza y se extiende un mantel blanco bajo ella; se sacude con un bastón y se recogen los curculiónidos que caen al mantel. Estos se guardan cuidadosamente en tubos rotulados con la referencia de la localización y el número de individuos recogidos. Las plantas sin curculiónidos son también anotadas para incluirlas en el análisis posterior. Las plantas son agrupadas en plots. El número de plantas dentro de cada uno, así como su localización en coordenadas geográficas y la categoría donde se clasifican (Dentro, Fuera y Parches) se pueden observar en las Tablas 2 y 3 en la sección de Resultados

Al llegar al laboratorio las muestras recogidas se introducen en etanol absoluto y los curculiónidos son clasificados por diferencias morfológicas en los días posteriores.

Paralelamente a este proceso, se recogen frutos en distintos puntos de la Península Ibérica de diferentes especies de Ulex (U. micranthos, U. minor, U. baeticus, U. densus, U. europaeus y U. canescens) y se recogen los individuos de Exapion que salen de ellos. Las coordenadas del punto de recogida aparecen descritas en la Tabla 1 y el mapa con la localización de los puntos en la Figura 3. Se toma una muestra de colección de Genista hispanica para incluir un grupo externo al análisis. En este muestreo se recogen exclusivamente curculiónidos del género Exapion, con tal de identificar la especie presente en cada aliaga.

Tabla 1. Coordenadas de las plantas donde fueron recogidas únicamente especies de Exapion.

Especie Latitud Longitud U. micranthus 42° 08' 53'' N 8° 41' 46'' O U. minor 40° 16' 43'' N 7° 59' 30'' O U. baeticus 36° 39' 22'' N 5° 06' 37'' O U. densus 38° 24' 56'' N 9° 12' 40'' O U. europaeus 39° 40' 23'' N 9° 00' 52'' O U. erinaceus 37° 00' 56'' N 8° 57' 08'' O U. canescens 36° 45' 53'' N 2° 10' 53'' O

Figura 3. Localización geográfica de las muestras de Ulex donde se recogieron las especies de Exapion.

Por otra parte, se recogen frutos de U. parviflorus en Pego en junio de 2017, se geolocaliza la posición de cada planta con un GPS y se colocan en placas Petri con la referencia de la localización. Una vez en el laboratorio se espera a su deshiscencia y se anota qué animal o animales salen de cada una de las semillas. Tanto los adultos como las larvas se guardan de forma individual en tubos Eppendorf de 1,5 ml rotuladas con la referencia de la planta en la que se encuentran.

3.2.Análisis estadísticos Se calcula la riqueza específica para cada localidad utilizando el programa estadístico R (R Core Team, 2018). Posteriormente se comparan los datos brutos por una parte y las medias y desviaciones estándar por otra con el objetivo de observar diferencias entre zonas.

Se analizan diferencias entre las medias de la riqueza específica de cada categoría: dentro del incendio (Dentro) y fuera del incendio (Fuera) en Andilla; dentro del incendio (Dentro), fuera del incendio (Fuera) y en los parches (Parches) en Pego. Para ello se comprueba la normalidad y heterocasticidad (prueba de Shapiro-Wilks y prueba de

Escriba aquí la ecuación.Levene, respectivamente) y se comparan las medias mediante métodos paramétricos (ANOVA) y no paramétricos (test de Kruskal-Wallis y test de Wilcoxon) según convenga. También se lleva a cabo un modelo lineal generalizado o GLM (Williams et al., 1984) ya que las muestras son conteos que se ajustan mejor a una distribución de Poisson que a una normal. Se toma como variable explicativa la categoría; es decir, si se trata del interior, el exterior del incendio o los parches, con tal de encontrar diferencias significativas entre las riquezas específicas tomando como factor la categoría (Dentro, Fuera y Parches). De la misma forma, en otro análisis con GLM, se añade como variable explicativa de la riqueza específica la distancia a la zona más cercana sin incendiar (borde del incendio o parches), considerando sólo la categoría “Dentro” y, en todo caso, la categoría “Parche” dependiendo de si se consideran estas últimas zonas refugios para el insecto o no.

3.3. Extracción, amplificación y secuenciación del ADN Se selecciona un individuo de cada especie y se procede a la extracción de su ADN siguiendo el protocolo de Speedtool para la extracción a partir de tejidos de Biotools BandM Labs S.A. Se comprueba el éxito de la extracción mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Una vez asegurada la extracción, se procede a la amplificación del gen correspondiente a la subunidad ribosómica 28S. Se lleva a cabo en un termociclador 2720 de Applied Biosystems. Se prepara una mezcla de reacción a la que se le añade, por muestra, 2,5 μl del Buffer de reacción, 1 μl de cloruro de magnesio, 0,5 μl de dNTPs, 0,25 μl de cada primer a una concentración de 20 μM, 0,5 μl de la polimerasa Taq de Biotools DNA polymerase (5 U/μl), 0,2 μl de BSA y 2 μl de ADN cuando se observan bandas definidas de ADN genómico visualizado en el gel de agarosa o 4 μl cuando la banda es débil. Finalmente, se añade agua hasta llegar a un volumen final por muestra de 25 μl. Las secuencias de los primers son extraídas del estudio de Winter et al. (2017) (28S forward: 5'-AGTAGCTGCGAGCGAACAGG-3'; 28S reverse: 5'- TCGCTACGGACCTCCATCAG-3'). Las condiciones de PCR son las siguientes: 4 minutos a 94ºC en la etapa de desnaturalización, 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 52ºC, y 75 segundos a 72ºC, y un último paso de extensión de las cadenas a 72ºC durante 10 minutos. Se confirma la amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Tras la purificación del producto amplificado mediante el kit de GE HEalthcare illustra™ GFX™ PCR DNA & Gel Band Purification Kit, se comprueba de nuevo con una electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Se miden las concentraciones del producto de purificación utilizando un espectrofluorómetro Mithras LB 940 (Berthold Tecnologies GmbH & Co. KG). Para ello se prepara una solución 1/200 de Picogreen (Invitrogen™ Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kit) añadiendo 0,5 μl del producto junto con 197,5 μl de TE1X y 2 μl de muestra en una placa multipocillo, se deja incubar durante 1 minuto en oscuridad y se mide en el espectrofluorómetro. Se añaden 5 estándares a concentraciones conocidas del fago λ que permitirán crear una curva patrón con la que calcular la concentración de las muestras. Si las concentraciones están por debajo de 20 ng/μl se repite el proceso de amplificación y purificación; si superan los 80 ng/μl se diluyen. Las muestras son enviadas siguiendo el protocolo de preparación de LIGHTRUN Tube (GATC Services) a GATC Biotech, a Eurofins Genomics Company. Dos muestras por individuo son enviadas, una con el primer forward y otra con el primer reverse.

Junto con las secuencias de las diferentes especies de curculiónidos, las muestras tomadas de Exapion sobre otras especies de Ulex y Genista hispanica son procesadas de la misma manera: se extrae su ADN, pero se amplifica, además del gen nuclear correspondiente a la subunidad de ARN ribosómico 28S, una región del gen nuclear del factor de elongación 1-α (EF1- α) y el gen mitocondrial COI. En ambos casos se utilizan los mismos primers que en el artículo de Barat et al., 2008 (EF1- α forward: 5’- CTCTTCTGGCCTTCACTCTTG-3’; EF1-α reverse: 5’- GTCACCAGCTACATAACCACG-3’; COI forward: 5’- CAACATTTACAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’; COI reverse: 5’- TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3’). Tanto la mezcla de reactivos como el volumen final (25 μl) se preparan de la misma forma que en la amplificación de la subunidad ribosómica 28S. Lo mismo ocurre con las condiciones de PCR para amplificar el gen EF1- α, pero no con las condiciones de amplificación del gen COI. Para este gen las condiciones son: 2 minutos a 94ºC en la etapa de desnaturalización, 35 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 1 minuto a 48ºC, y 1 minuto a 72ºC, y un último paso de extensión de las cadenas a 72ºC durante 10 minutos. En ambos casos se confirma la amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se purifican las muestras y se

11 preparan dos por individuo siguiendo el protocolo especificado por GATC Biotech, a Eurofins Company para la secuenciación LIGHTRUN tube.

3.4.Análisis de las secuencias Se editan las secuencias con el programa CodonCode (v 8.0.2. CodonCode Corporation, www.codoncode.com). Aquí se analizan los resultados de la secuenciación, modificando la secuencia nucleotídica en los casos en que se considera incoherente con el cromograma; finalmente se obtiene una secuencia por individuo recortada al nivel de los primers, sin estos quedar incluidos.

Las secuencias del gen nuclear correspondiente a la subunidad de ARN ribosómico 28S de las especies de curculiónidos por determinar son comparadas con las bases de datos nucleotídica de NCBI a través de BLASTN (www.ncbi.nlm.nih.gov). A pesar de que el objetivo es identificarlas a nivel de género, en muchos casos esto no es posible, y quedan clasificadas a nivel de tribu, subfamilia o familia. Tras la caracterización de las especies se realiza una búsqueda bibliográfica de los hábitos vitales y alimenticios del taxón al que pertenezca cada una de ellas.

Con lo que respecta a las secuencias de Exapion, tanto las recogidas en otras especies de Ulex y Genista hispanica, como los individuos de Ulex parviflorus, el procedimiento a seguir es diferente al descrito arriba. Se va a inferir una filogenia para cada gen de forma individual (28S, EF1-α y COI) y con los tres genes concatenados. Para ello es necesario incluir todas las secuencias que se encuentren en la base de datos de nucleótidos de GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) de la tribu Exapiini (Exapion y Lepidapion) así como una especie cercana fuera de ella que actúe como grupo externo. En este caso, se escoge Catapion meieri (Catapiina, Oxystomatini, Apioninae, Apionidae).

Inicialmente se alinean con ClustalX (Higgins et al., 1996) implementado en BioEdit (Hall, 1999) y se agrupan aquellos individuos que compartan la misma secuencia. Para EF1-α y COI, los cuales son genes codificantes, se comprueba si existe saturación en las terceras posiciones de los codones mediante el programa DAMBE (Xia X., 2018), el cual infiere la saturación con el modelo descrito por Xia et al., 2003. En el caso de EF1-α no se obtuvo saturación, aunque sí en el gen COI, por lo que se eliminaron las terceras posiciones de este último en la inferencia filogenética. Del gen EF1-α se eliminan las regiones intrónicas ya que son excesivamente variables como para asegurar un alineamiento correcto.

3.5.Filogenias Los programas de inferencia filogenética son utilizados dentro de la plataforma CIPRES (Miller et al., 2010), donde se ejecutan: RAxML (Stamatakis, 2014) para inferencias por máxima verosimilitud y MrBayes (Huelsenbeck et al., 2001; Ronquist & Huelsenbeck, 2003) para inferencias bayesianas. El modelo evolutivo aplicado en las inferencias por máxima verosimilitud está establecido por defecto en RAxML y se trata del modelo Gamma en todas las inferencias. Se ejecutan 1000 réplicas de bootstrap rápido. En las inferencias bayesianas se aplica el modelo evolutivo General Time Reversible (GTM) en todos los genes, elegido para cada gen individual mediante jModelTest (Posada, 2008). Se corren dos carreras en paralelo con 7 cadenas cada una hasta alcanzar una convergencia de 0,01. Dicho criterio se obtiene tras 2880000 generaciones en las filogenias de la tribu y tras 645000 en las del género Exapion, muestreando árboles cada 100 generaciones en ambos. Esto resultó en un total de 28800 árboles por carrera para Exapiina y 6450 para Exapion, de los que se desecharon los primeros 7200 y 1613 árboles respectivamente, que suponen el 25% del total, durante el burnin. A partir de los 21600 árboles en Exapiina y 4837 en Exapion restantes se calcularon los árboles consenso según la regla de la mayoría (>50%) y las probabilidades posteriores de cada nodo.

El resultado es abierto con el visualizador de árboles filogenéticos FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/), donde se observan de manera gráfica las inferencias filogenéticas y el soporte de cada rama y/o nodo (bootstrap para resultados máxima verosimilitud y probabilidades posteriores para inferencia bayesiana).

Al pesar los individuos recogidos sobre U. parviflorus se observa una distribución trimodal, la cual difícilmente se corresponde con una distribución lógica de pesos dentro de una especie. Como se sospecha que hay más de una especie presente, se secuencian tres individuos, uno de cada moda, y se añaden al análisis filogenético (EXLEP1, EXLEP2 y EXLEP3 en orden decreciente de pesos). Posteriormente se añade un individuo más de la moda de menor peso (EXLEP4).

Por tanto, se infieren filogenias de la tribu Exapiini en conjunto y del género Exapion de forma exclusiva. En el segundo caso se utiliza la secuencia de Lepidapion cretacecum como grupo externo y no se incluye el gen de la subunidad ribosómica 28S, ya que es un gen altamente conservado que no permite distinguir entre especies dentro de un mismo género.

4. Resultados 4.1.Diversidad Se recogieron un total de 17 especies de curculiónidos sobre Ulex parviflorus. Las especies clasificadas inicialmente como Exapion son finalmente dos; se identifican mediante los análisis filognéticos. Las imágenes de cada una de las especies sin identificar pueden verse en los Apéndice 1. 11 especies fueron encontradas en el incendio de Pego en 2017 y 9 en el de Andilla en 2018. Únicamente 5 de las especies se encuentran en ambas localidades (las dos clasificadas a priori como Exapion, SP04, SP05 y SP11); el resto son exclusivas de cada zona. La riqueza específica por categoría, así como sus medias y desviaciones estándar, aparecen representados en las Figuras 4 y 5. El número de individuos recogido en cada plot así como sus valores de riqueza específica se

encuentran descritos en las Tablas 2 y 3.

)

S Riqueza específica (

Figura 4. Diagrama de cajas de la riqueza específica (S). En el caso de Andilla, la riqueza de especies dentro del incendio varía de 2 a 6, mientras que fuera va de 1 a 5. En el caso de Pego, dentro del incendio se han encontrado de 0 a 4 especies, fuera de 0 a 6 y en los parches de 0 a 5 Diversidad media

5 4 3 2 1 0

Riqueza específica (S) Andilla Andilla Andilla Pego Pego Pego Dentro Fuera + Fuera Dentro Fuera Parches Parches Figura 5. Medias y error estándar de la riqueza específica (S) por zonas. No se observan diferencias significativas entre ninguna de las excepto en el interior del incendio en Pego.

Tabla 2. Datos de las muestras tomadas en Pego divididos por plot. Incluye la localización en coordenadas geográficas, el número de plantas agrupadas por plot, la categoría de la zona, la distancia al borde del incendio y a los parches (en metros) y la riqueza específica (S) calculada para cada plot.

Plot Latitud Longitud N° Categoría Distancia al Distancia S Plot Latitud Longitud N° Categoría Distancia al Distancia S plantas borde parches plantas borde parches UN01 38° 49' 36’‘ N 0° 8' 11’‘ O 5 Dentro 359 1146 0 USQ08 38° 50' 11’‘ N 0° 8' 6’‘ O 18 Fuera - - 5 UN02 38° 49' 32’‘ N 0° 8' 17’‘ O 10 Dentro 526 1092 0 USQ09 38° 50' 10’‘ N 0° 8' 11’‘ O 45 Fuera - - 6 UN03 38° 49' 33’‘ N 0° 8' 26’‘ O 10 Dentro 541 1097 4 USQ10 38° 50' 9’‘ N 0° 8' 20’’ O 21 Fuera - - 4 UN04 38° 49' 35’‘ N 0° 8' 31’‘ O 11 Dentro 468 993 0 USQ13 38° 49' 39’‘ N 0° 10' 42’’ O 7 Fuera - - 1 UN05/06 38° 49' 32’‘ N 0° 8' 33’‘ O 54 Dentro 556 997 1 USQ14 38° 48' 2’‘ N 0° 7' 24’‘ O 12 Fuera - - 6 UN07 38° 49' 43’‘ N 0° 7' 50’‘ O 11 Dentro 127 1031 0 USQ16 38° 49' 36’‘ N 0° 6' 44’‘ O 21 Fuera - - 1 UN08 38° 49' 47’‘ N 0° 7' 42’‘ O 12 Dentro 59 1085 0 USQ19 38° 49' 34’‘ N 0° 7' 7’‘ O 37 Fuera - - 5 UN09 38° 49' 49’‘ N 0° 8' 35’‘ O 21 Dentro 58 595 1 USQ20 38° 49' 50’‘ N 0° 6' 52’‘ O 41 Fuera - - 4 UN11 38° 49' 28’‘ N 0° 8' 51’‘ O 38 Dentro 803 755 1 USQ21 38° 49' 27’‘ N 0° 6' 9’‘ O 39 Fuera - - 4 UN12 38° 49' 24’‘ N 0° 8' 29’‘ O 62 Dentro 811 1020 1 USQ22 38° 48' 26’‘ N 0° 6' 32’‘ O 37 Fuera - - 5 UN13 38° 49' 21’‘ N 0° 8' 46’‘ O 103 Dentro 941 981 1 USQ23 38° 48' 31’‘ N 0° 6' 58’‘ O 13 Fuera - - 2 UN14 38° 48' 59’‘ N 0° 8' 20’‘ O 78 Dentro 494 475 2 USQ25 38° 49' 34’‘ N 0° 6' 29’‘ O 12 Fuera - - 3 UN15 38° 49' 16’‘ N 0° 8' 44’‘ O 21 Dentro 1017 1131 1 USQ31 38° 48' 21’‘ N 0° 8' 24’‘ O 16 Fuera - - 6 UN16 38° 48' 31’‘ N 0° 7' 35’‘ O 40 Dentro 242 504 0 USQ32 38° 48' 25’‘ N 0° 8' 24’‘ O 5 Fuera - - 4 UN17 38° 48' 50’‘ N 0° 7' 30’‘ O 106 Dentro 752 65 3 UN10 38° 49' 31’‘ N 0° 9' 30’‘ O 54 Parches 918 - 2 UN18 38° 49' 42’‘ N 0° 7' 14’‘ O 25 Dentro 58 794 3 UN19 38° 49' 15’‘ N 0° 7' 6’‘ O 108 Parches 446 - 1 UN20 38° 49' 45’‘ N 0° 7' 16’‘ O 69 Dentro 175 912 1 UN22 38° 48' 50’‘ N 0° 6' 44’‘ O 35 Parches 619 - 1 UN21 38° 48' 50’‘ N 0° 7' 5’‘ O 58 Dentro 622 124 3 USQ11 38° 50' 6’‘ N 0° 8' 54’‘ O 11 Parches 524 - 4 UN23 38° 49' 26’‘ N 0° 9' 16’‘ O 60 Dentro 1237 336 1 USQ12 38° 49' 45’‘ N 0° 9' 42’‘ O 10 Parches 558 - 2 USQ01 38° 49' 43’‘ N 0° 7' 51’‘ O 13 Dentro 156 1026 0 USQ15 38° 48' 48’‘ N 0° 7' 28’‘ O 7 Parches 738 - 5 VE01 38° 49' 28’‘ N 0° 6' 42’‘ O 18 Dentro 114 415 3 USQ17 38° 49' 24’‘ N 0° 6' 58’‘ O 2 Parches 223 - 0 USQ02 38° 50' 3’‘ N 0° 7' 25’‘ O 12 Fuera - - 1 USQ24 38° 48' 47’‘ N 0° 6' 37’‘ O 39 Parches 566 - 4 USQ03 38° 50' 8’‘ N 0° 7' 37’‘ O 11 Fuera - - 3 USQ26 38° 49' 5’‘ N 0° 7' 23’‘ O 12 Parches 870 - 4 USQ04 38° 50' 1’‘ N 0° 8' 14’‘ O 40 Fuera - - 5 USQ27 38° 49' 9’‘ N 0° 7' 28’‘ O 3 Parches 841 - 5 USQ05 38° 49' 59’‘ N 0° 8' 17’‘ O 11 Fuera - - 0 USQ29 38° 48' 46’‘ N 0° 7' 55’‘ O 4 Parches 444 - 2 USQ06 38° 49' 56’‘ N 0° 8' 23’‘ O 21 Fuera - - 4 USQ30 38° 48' 47’‘ N 0° 7' 55’‘ O 20 Parches 463 - 3 USQ07 38° 50' 9’‘ N 0° 8' 1’‘ O 28 Fuera - - 3

Tabla 3. Información sobre las muestras recogidas en Andilla divididas por plot. Incluye la localización en coordenadas geográficas, la altitud a la que se encontraron (en metros), el número de plantas agrupadas por plot, la categoría de la zona y la riqueza específica calculada para cada plot.

Plot Latitud Longitud N° de plantas Categoría S AN04 39° 46' 1'' N 0° 42' 3'' O 11 Dentro 4 AN07 39° 52' 46'' N 0° 40' 43'' O 12 Dentro 6 AN08 39° 51' 56'' N 0° 41' 8'' O 12 Dentro 2 AN09 39° 51' 17'' N 0° 41' 53'' O 12 Dentro 2 AN11 39° 49' 49'' N 0° 42' 30'' O 16 Dentro 2 AN12 39° 50' 25'' N 0° 43' 10'' O 12 Dentro 3 AN01 39° 44' 14'' N 0° 40' 20'' O 9 Fuera 1 AN02 39° 43' 58'' N 0° 40' 28'' O 8 Fuera 3 AN03 39° 44' 12'' N 0° 40' 36'' O 12 Fuera 5 AN05 39° 53' 35'' N 0° 40' 12'' O 12 Fuera 4 AN06 39° 53' 27'' N 0° 40' 32'' O 13 Fuera 3 AN10 39° 45' 26'' N 0° 42' 30'' O 21 Fuera 4 AN15 39° 51' 19'' N 0° 42' 57'' O 13 Fuera 2 AN16 39° 53' 15'' N 0° 42' 40'' O 13 Fuera 4 AN13 39° 46' 30'' N 0° 41' 57'' O 16 Parches 4 AN14 39° 48' 52'' N 0° 41' 18'' O 13 Parches 3

4.2.Estadística El test de Kruskal-Wallis aporta valores significativos cuando se compara la riqueza específica entre las distintas zonas del incendio (Dentro, Fuera y Parches) en la localidad de Pego (p<0.001) pero no en Andilla (p>0.05). Mediante el test de Wilcoxon se comprueba que estas diferencias son significativas únicamente en el interior del incendio de Pego (Tabla 4).

El resultado sigue siendo significativo en Pego al realizar una ANOVA (p<0.001). Con el modelo lineal generalizado (GLM) se siguen obteniendo valores muy significativos en el interior del incendio de la localidad de Pego (p<0.001).

El GLM aplicado al interior del incendio de Pego donde se añade la variable distancia a una zona sin incendiar no aporta valores significativos (p>0.05).

Tabla 4. p-valores del test de Wilcoxon para la riqueza específica. Se comparan pares de variables para ver si siguen la misma distribución. Aparecen marcados (**) los valores significativos.

Andilla In Andilla Out Pego In Pego Out Pego Patch Andilla In - 0.7402 **0.0109 0.5171 0.7008 Andilla Out - **2.4x10-3 0.5003 0.5542 Pego In - **1.2x10-4 **0.01016 Pego Out - 0.199 Pego Patch -

4.3.Identificación de especies Los resultados de la búsqueda por similitud en la base de datos del NCBI mediante BLAST, así como los porcentajes de similitud y cobertura, se muestran en la Tabla 5. Tras una revisión bibliográfica de los géneros con los que se encuentran coincidencias, se determina la familia de la planta sobre la que suelen encontrarse y/o depredar. Se intenta determinar la interacción al nivel taxonómico más bajo posible. Tres especies fueron enviadas al Museo de Historia Natural de Madrid para que fuesen identificadas a nivel morfológico por el experto en curculiónidos Miguel Ángel Alonso-Zarazaga (Exapion, SP02, SP03) al observar su presencia en frutos.

Las especies de la subfamilia Cyclominae (Tabla 5: SP01, SP05, SP06, SP07, SP08, SP09 y SP12) y de la tribu Hylobiini (Tabla 5: SP03, SP06, SP07, SP08 y SP15) tienden a ser especialistas en un grupo vegetal; en general cada tribu se alimenta de un grupo diferente. Hay además hay gran variedad en cuanto a su alimentación; sin embargo, en ningún caso se alimentan de fabáceas (Yunakov et al., 2018). Los adultos de la subfamilia Cyclominae se alimentan de las hojas de plantas de la familia Amaranthaceae; las larvas, de sus raíces. Los adultos de la tribu Hylobini se encuentran en bosques de coníferas, viviendo sobre pinos.

En el caso de la subfamilia Entiminae (Tabla 5: SP01, SP04, SP05, SP10 y SP12), las larvas no se desarrollan dentro del tejido de la planta, sino que la depredación se limita a las hojas (Kitson et al., 2013). Adultos del género Sitona han sido descritos como depredadores de hojas de fabáceas, no de sus semillas (Carcamo et al., 2015).

La especiación dentro de los apiónidos (Apionidae) (Tabla 5: SP02) se debe esencialmente a la diversificación de las fabáceas. Es por ello esencial esta interacción en la evolución de la tribu y, en la actualidad, es también la más conservada, a pesar de que dentro de la tribu haya habido variaciones en la planta huésped, las cuales han contribuido

17 a la especialización de nuevas subtribus. (Winter et al., 2017). Se ha descrito la alimentación de fabáceas de la subfamilia Papilonoideae por parte de la subtribu Synapiina (Winter et al 2017).

La tribu Derelomini (Tabla 5: SP03, SP06, SP07) está descrita como polinizadora de plantas de la familia Cyclanthaceae (Friedman, 2006), en especial de palmeras de zonas neotropicales.

Scolytinae (Tabla 5: SP04) es una subfamilia polífaga de la que hay poca información descrita (Yukanov et al., 2018), sin embargo el estudio de Nikulina et al. (2015) explica que se alimentan del floema de las plantas, mientras que las larvas se alimentan en las galerías que forman los escarabajos en la madera de los micelos de los hongos simbiontes. No se alimentan, por tanto, de fabáceas, sino de árboles con tronco, especialmente pinos.

El género Phrissotrichum (Tabla 5: SP11) se alimenta de Cistaceae. La tribu Aplemonini, a la que pertenece el género, es polífaga; se ha descrito una adaptación a climas secos donde se alimenta de plantas de las familias Hypericaceae, Plumbaginaceae, Polygonaceae y Crassulaceae (Winter et al., 2017).

El género Ceutorhynchus (Tabla 5: SP13) se alimenta de Brasicaceas. Aunque dentro de la subfamilia Ceutorhynchinae hay gran diversidad de interacciones planta-escarabajo, en ningún caso se describe interacción con fabáceas, aunque sí con pinos, dientes de león y ajo, entre otros. (Letsch et al., 2018).

La tribu Malvapini (Tabla 5: SP14), como su nombre indica, se alimenta de malváceas (Malvaceae) (Winter et al., 2017).

Tabla 5. Resultados de la búsqueda de BLAST en la base de datos del NCBI de secuencias similares a las obtenidas. Aparecen los géneros con mayores porcentajes de identidad y cobertura obtenidos en BLAST, así como la tribu, subtribu (si la tiene), subfamilia y familia. Se determina la familia de las plantas donde se suelen encontrar con el rango taxonómico más bajo posible (marcado en negrita).

Especie % id % cobertura Género Tribu (subtribu) Familia (subfamilia) Hospedador típico 96 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) SP01 96 100 Spartecerus Tropiphorini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) 95 100 Naupactus Naupactini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) SP02 100 94 Ischonopterapion Oxystomatini (Synapiina) Apionidae (Apioninae) Fabaceae (Winter et al., 2017) 98 98 y 94 Stenopterapion Oxystomatini (Synapiina) Apionidae (Apioninae) Fabaceae (Winter et al., 2017) SP03 94 100 Tranes Hylobiini Curculionidae (Molytinae) Pinaceae (Yukanov et al., 2018) 94 100 Araucarietius Derelomini Curculionidae (Curculioninae) Cyclanthaceae (Friedman, 2006) SP04 99 100 Sitona Sitonini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) 98 97 Ambrosiodmus Xyleborini Curculionidae (Scolytinae) Pinaceae (Nikanov et al., 2015) SP05 95 100 Sitona Sitonini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) 95 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) 94 100 Tranes Hylobiini Curculionidae (Molytinae) Pinaceae (Yukanov et al., 2018) SP06 94 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) 94 100 Araucarietius Derelomini Curculionidae (Curculioninae) Cyclanthaceae (Friedman, 2006) 95 100 Tranes Hylobiini Curculionidae (Molytinae) Pinaceae (Yukanov et al., 2018) SP07 95 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) 95 100 Araucarietius Derelomini Curculionidae (Curculioninae) Cyclanthaceae (Friedman, 2006) SP08 95 100 Tranes Hylobiini Curculionidae (Molytinae) Pinaceae (Yukanov et al., 2018) 94 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) SP09 97 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) SP10 99 100 Sitona Sitonini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) SP11 99 100 Phrissotrichum Aplemonini Apionidae (Apioninae) Cistaceae (Winter et al., 2017) 96 100 Aesiotes Aterpini (Aterpina) Curculionidae (Cyclominae) Amaranthaceae (Yukanov et al., 2018) SP12 95 100 Spartecerus Tropiphorini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) 95 100 Sitona Sitonini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) 95 100 Catasarcus Tropiphorini Curculionidae (Entiminae) Fabaceae (Carcamo et al., 2015; Kitson et al., 2013) SP13 98 100 Ceutorhynchus Ceutorhynchini Curculionidae (Ceutorhynchinae) Brasicaceae (Letsch et al., 2018) 99 100 Pseudapion Malvapiini Apionidae (Apioninae) Malvaceae (Winter et al., 2017) SP14 99 99 Malvapion Malvapiini Apionidae (Apioninae) Malvaceae (Winter et al., 2017) 99 99 Rhopalapion Malvapiini Apionidae (Apioninae) Malvaceae (Winter et al., 2017) SP15 94 100 Tranes Hylobiini Curculionidae (Molytinae) Pinaceae (Yukanov et al., 2018)

4.4.Frutos Se observó la dehiscenciade 38661 frutos procedentes de 253 plantas. Se registró la presencia de 3 especies diferentes de curculiónidos y al menos tres especies de avispas parásitas, una de polilla y una de coleóptero no curculiónido.Las frecuencias absolutas y relativas se pueden observar en la Tabla 6. Se recogieron 100 larvas de curculiónido que no se pueden clasificarlas a nivel morfológico por su similitud entre especies.

E. fasciolatum Lepidapion sp. P. sparsutus Larvas Frecuencias absolutas 528 1 7 100 Frecuencias relativa 0.830 0.002 0.011 0.157 (con larvas)s Frecuencias relativas 0.985 0.002 0.013 - (sin larvas) Tabla 6. Frecuencias de las especies de curculiónidos encontrados dentro de frutos. Las frecuencias relativas están calculadas a partir del número de curculiónidos recogidos (incluyendo larvas en la segunda fila y sin larvas en la tercera)

4.5.Filogenias En las inferencias por máxima verosimilitud las filogenias a partir de genes individuales otorgan un boceto de las relaciones entre especies; sin embargo los soportes en general son bajos por lo que muchas de las relaciones no quedan totalmente resueltas. La información útil se obtiene a la hora de concatenar los tres genes (Figuras 6 y 7).

En el caso de la inferencia bayesiana (Figuras 8 y 9), es cierto que aparecen muchas politomías, pero las relaciones que quedan resueltas tienen un soporte muy elevado (mayor de 80% en todos los casos). La filogenia dentro de Exapion queda mejor resuelta cuando se coloca Lepidapion como grupo externo y se elimina la subunidad ribosómica 28S (Figura 9).

Se observan agrupaciones constantes tanto en las inferencias por máxima verosimilitud como a partir de métodos bayesianos. La primera en el género Lepidapion, el cual se encuentra claramente diferenciado de Exapion e incluye las secuencias EXLEP3 y EXLEP4 (Figuras 6 y 8).

Por otra parte, en todos los casos (Figuras 6 a 9) se observan dos grupos distintos dentro del género Exapion,; un primer grupo con E. formaneki, E. ulicis y las especies de Exapion recogidas sobre U. baeticus (EX3), U. europaeus (EX5) y U. erinaceus (EX6) y

20 un segundo grupo E. brevisculum, E. canescens, E.compactum, E. corniculatum, E. lemovicinum, E. uliciperda, EXLEP1, EXLEP2 y especies de Exapion encontradas sobre U. micrantus (EX1), U. minor (EX2), U. densus (EX4), U. canescens (EX7) y Genista hispanica (EX8).

EX3 aparece siempre agrupado junto a E.ulicis; como grupo externo a ellos se encuentran EX5 y EX6, y fuera, E. formaneki. Los cinco forman uno de los grupos dentro del género Exapion. Esta agrupación tiene un elevado soporte en ambos tipos de inferencias. EXLEP1 y EXLEP2 se encuentran siempre agrupados, cercanos a E. lemovicinum, EX1, EX2, EX4 y EX7. Cercana a estas agrupaciones, aunque siempre separada, se encuentra la especie EX8. Las relaciones entre el resto de especies dentro del segundo grupo (E. brevisculum, E. canescens, E.compactum, E. corniculatum y E. uliciperda) no quedan definidas ya que se encuentran en posiciones diferentes en cada inferencia y tienen bajo soporte. Con lo que respecta a E. difficile, E. elongatulum, E. fusicroste, E. subparallellum y E. uliciperda, quedan clasificados de forma diferente en cada inferencia.

Figura 6. Inferencia filogenética por máxima veorsimilitud a partir de los genes ribosómico 28S, EF1-α y COI. Se incluyen los géneros Exapion y Lepidapion, los cuales quedan claramente separados. Como grupo externo se incluye Catapion meieri. No aparecen los soportes bootstrap por debajo de 50. La escala muestra el número de sustituciones por posición nucleotídica.

Figura 7. Inferencia filogenética del género Exapion por máxima verosimilitud con los genes EF1- α y COI concatenados. Se utiliza Lepidapion cretacecum como grupo externo. Se muestran los valores bootstrap por encima de 50. La escala muestra el número de sustituciones por posición nucleotídica.

Figura 8. Filogenia de los géneros Exapion y Lepidapion basada en inferencia bayesiana. Incluye los genes de la subunidad ribosómica 28S, EF1-α y COI concatenados. Las probabilidades posteriores menores del 75% no aparecen representadas. La escala muestra el número de sustituciones por posición nucleotídica.

Figura 9. Filogenia del género Exapion inferida a partir de métodos bayesianos mediante la concatenación de los genes EF1-α y COI. Se utiliza Lepidapion cretacecum como grupo externo. Se muestran exclusivamente las probabilidades posteriores por encima de 75%. La escala muestra el número de sustituciones por posición nucleotídica.

5. Discusión 5.1. Efectos del incendio sobre la diversidad La riqueza específica oscila en torno a los mismos valores en todas las zonas excepto en los datos del interior del incendio de Pego, donde se ve reducida. Estas diferencias se confirman al llevar a cabo los test de Wilcoxon, de Kruskal-Wallis, ANOVA y GLM. En resumen, los resultados estadísticos muestran una biodiversidad similar entre todas las zonas estudiadas a excepción de la zona correspondiente al interior del incendio de Pego. Con toda seguridad este hecho demuestra que en Pego todavía no ha pasado el tiempo suficiente como para que la biodiversidad se recupere tras un incendio.

Sin embargo, es sorprendente que algunas zonas no se vean afectadas por el fuego, como es el caso de los parches. Son lugares no incendiados, pero se encontraron rodeados durante el incendio, alcanzando probablemente temperaturas tan elevadas que acabaron, sino con toda, con gran parte de la biodiversidad allí presente. Si es así, ¿cómo es posible que la riqueza específica sea igual a la de zonas no afectadas por el fuego? Lo más

23 probable es que la biodiversidad sí se vea reducida tras un incendio. A pesar de ello, su tiempo de recuperación sería diferente (más rápido) al de las zonas incendiadas. Como la vegetación no tiene que rebrotar o volver a germinar, se elimina este tiempo de espera y las especies pueden volver a las plantas al poco tiempo del incendio. En este caso, ¿de dónde aparecen las especies recolonizadoras? Se podrían ofrecer varias explicaciones no excluyentes entre ellas.

Es probable que algunos de los parches sean lo suficientemente grandes como para que la temperatura en las zonas más centrales no haya aumentado tanto y la fauna allí presente se haya mantenido. En este caso, muchos individuos podrían haberse desplazado a estos núcleos más fríos durante el incendio y, una vez pasado el fuego, haber recolonizado las plantas más cercanas al borde. O bien que los recolonizadores sean únicamente los supervivientes presentes en este núcleo frío. Otra posibilidad es que la biodiversidad encontrada en el centro del incendio se deba a especies recolonizadoras provenientes del exterior del incendio. Una vez pasado el fuego, algunas especies migrarían cruzando la zona incendiada, donde no habría vegetación, hasta hallar un parche, en el cual la flora sería la misma que antes de que ocurriese el incendio pero libre de competidores. Así, los recolonizadores proliferarían rápidamente en ausencia de competidores, recuperando rápidamente la biodiversidad original.

Al comparar la biodiversidad actual dentro de las zonas incendiadas se puede extraer una conclusión general. El hecho de que la riqueza específica en el interior del incendio de Andilla no sea significativamente diferente a la de zonas que no han sufrido incendios permite inferir que ha pasado el tiempo suficiente como para que diversidad de curculiónidos se haya recuperado. Por el contrario, en el interior del incendio de Pego se observan diferencias significativas, por lo que la biodiversidad de Pego se encuentra reducida con respecto a la de otras zonas no incendiadas. Esto quiere decir que no ha pasado el tiempo suficiente como para que la diversidad de curculiónidos se recupere tras una alteración de tales magnitudes. Teniendo en cuenta la antigüedad de ambos incendios es posible estimar el tiempo de recuperación de la biodiversidad de curculiónidos tras un fuego, el cual sería mayor de 2 años y menor de 6.

Por otra parte, no se obtienen valores significativos al añadir la variable distancia al borde del incendio en el GLM del interior del incendio de Pego. Lo cual quiere decir que no se observa un patrón diferencial de la biodiversidad influido por la distancia a la zona sin

24 incendiar más cercana. Esto no tiene por qué significar que no haya especies con mayor capacidad dispersiva de otras. Ya se ha comentado anteriormente que las especies más generalistas colonizan más tempranamente, puesto que no requieren del tiempo de espera hasta que rebrota o germina una planta en concreto; podrían recolonizar las primeras plantas que crezcan tras un incendio. Habría que considerar, no solo qué especies son más generalistas, sino también qué plantas aparecen antes tras un incendio, puesto que esto puede aportar una ventaja a las especies especialistas de las primeras plantas en reaparecer.

5.2. Identificación de especies y determinación de su hospedador definitivo La búsqueda por similitud de SP01 (Apéndice 1.I) no da resultados concluyentes, ya que el porcentaje de coincidencia con las secuencias de la base de datos no es lo suficientemente elevado como para afirmar que se trata de una especie en concreto. Además, coincide en porcentaje con varias especies, las cuales únicamente tienen en común la familia: Curculionidae. Se trata probablemente de una especie cuyo gen ribosómico 28S no se encuentre en la base de datos, y es muy posible que pertenezca a la subfamilia Entiminae, ya que la mayoría de especies similares pertenecen a ella. Por cuestiones de tamaño, es poco probable que las larvas se desarrollen dentro de fruto, aunque sí es posible que se alimenten de las hojas de Ulex, ya que la subfamilia es depredadora de fabáceas.

Los resultados de SP02 (Apéndice 1.II) lo clasifican dentro de la subtribu Synapiina (Oxystomatini, Apioninae, Apionidae) y alberga gran similitud con los géneros Ischnopterapion y Stenopterapion. Esta es una de las especies identificada morfológicamente por Miguel Ángel Alonso-Zarazaga, quien concluyó que se trataba de Protopirapion atratulum, especie de la misma subtribu que los géneros obtenidos en BLAST. Tras una búsqueda en la base de datos nucleotídica del NCBI se confirma que no hay ninguna secuencia correspondiente a la subunidad ribosómica 28S de la especie descrita por Alonso-Zarazaga, por lo que es probable que se trate de P. atratulum. Como se ha mencionado anteriormente, la subtribu Synapiina es depredadora de fabáceas papilionoides, donde no queda incluido el género Ulex.

En el caso de SP03 (Apéndice 1.III), la cual fue identificada por Alonso-Zarazaga como Pachytychius sparsutus, el porcentaje de idenitdad máximo obtenido en BLAST es de un 94%, correspondiente a los géneros Tranes y Araucarietius. En este caso, el parentesco

25 en común se remonta a familia: todos son Curculionidae. Tras una búsqueda de P. sparsutus en NCBI se confirma que el gen de la subunidad ribosómica 28S no se encuentra en la base de datos. Con los bajos porcentajes de identidad obtenidos en BLAST (Tabla 5), el resultado más fiable es la identificación por parte del experto, por lo que se trataría probablemente de P. sparsutus (Storeini, Curculioninae, Curculionidae). Yukanov et al. (2018) describe que los adultos de la especie viven sobre fabáceas, en concreto sobre Cytisus scoparius, Genista pilosa y G. tinctoria. De todas formas, se ha observado la presencia de esta especie dentro de frutos de U. parviflorus; aunque la cifra puede ser considerada anecdótica (representa un 0,13% del total de curculiónidos adultos encontrados dentro de fruto) se deben hacer futuros estudios para confirmar que se trata de una especie depredadora de las semillas de U. parviflorus o son casos aislados.

SP04 (Apéndice 1.IV y V) presenta un 99% de identidad con el género Sitona (Sitonini, Entiminae, Curculionidae), al igual que SP10 (Apéndice 1.X). Comparando con imágenes de bases de datos, como por ejemplo la de International Weevil Communiy (http://weevil.info), se confirma la similitud con dicho género, por lo que es muy posible que se trate de especies diferentes ambas dentro del género Sitona. De ser así, la presencia de ambas se debería a una depredación sobre las hojas de U. parviflorus.

Con lo que respecta a SP05 (Apéndices 1.IV y V), la puntuación máxima de identidad es del 95%, coincidiendo con las mismas especies que SP04. Por tanto, lo único que se puede esclarecer de esta especie es su familia: Curculionidae. Probablemente se trate de una especie donde el gen ribosómico 28S no haya sido secuenciado y subido a la base de datos del NCBI para ninguna de las de su género o incluso dentro de su misma tribu. Por otra parte, es posible que esté estrechamente relacionada con SP04; si fuese el caso podría estar alimentándose de las hojas de U. parviflorus.

Algo similar ocurre con SP06 (Apéndice 1.VI) y SP07 (Apéndice 1.VII); el porcentaje de identidad máximo obtenido en BLAST es del 94% y 95% respectivamente, los cuales se dan con géneros como Tranes (Hylobiini, Molytinae, Curculionidae), Aesiotes (Aterpini, Cyclominae, Curculionidae) y Araucarietius (Derelomini, Curculioninae, Curculionidae) entre otros (Tabla 5). SP08 (Apéndice 1.VIII) se encuentra en la misma situación que estos dos, coincidiendo en un 95% con Tranes (Hylobiini, Molytinae, Curculionidae) y un 94% con Aesiotes (Aterpini, Cyclominae, Curculionidae). Todos ellos comparten familia (Curculionidae), pero pertenecen a subfamilias y tribus diferentes. Por tanto, lo

26 más probable es que pertenezca cada una a una especie sin secuencias en la base de datos del NCBI. Poco se puede decir sobre su alimentación; aunque ninguno de los géneros con los que guarda similitud se alimentan de fabáceas, su presencia sobre U. parviflorus puede explicarse si se trata de especies que habitan bosques de coníferas.

La búsqueda de SP09 (Apéndice 1.IX) obtiene un 97% de identidad con el género Aesiotes, lo cual indica que, aunque probablemente no se trate del mismo género, sí pertenezca a la misma tribu Aterpini (Cyclominae, Curculioniade), la cual se alimenta de la familia Amaranthaceae.

Se obtienen un 99% de identidad entre SP11 (Apéndice 1.XI) y secuencias del género Phrissotrichum (Aplemonini, Apioninae, Apionidae) con el 100% de cobertura, por lo que probablemente SP11 pertenezca a este género, no se alimentan de fabáceas sino de cistáceas, plantas típicas de regiones mediterráneas, lo cual podría explicar su presencia sobre U. parviflorus.

En cuanto a SP12 (Apéndice 1.XII), todas las coincidencias con un porcentaje de identidad elevado pertenecen a la subfamilia Entiminae (Curculionidae); sin embargo, el máximo es de un 95% por lo que probablemente pertenezca a un género cuya secuencia para la región ribosómica 28S no se encuentre en la base de datos del NCBI. A pesar de que la subfamilia se alimenta de hojas de fabáceas, es poco probable que se trate de una especie depredadora de U. parviflorus puesto que únicamente se encontró un individuo en todos los muestreos.

Con lo que respecta a SP13 (Apéndice 1.XIII), se trata de una especie del género Ceutorhynchus (Ceutorhynchini, Ceutorhynchinae, Curculionidae) ya que el porcentaje de coincidencia es del 98% en toda la longitud de la secuencia. Comparando con las imágenes de la base de datos de International Weevil Community (http://weevil.info) se confirma la similitud morfológica con el género; como se alimenta de brasicáceas, su presencia en U. parviflorus sería accidental.

SP14 (Apéndice 1.XIV) pertenece a la tribu Malvapiini (Apioninae, Apionidae); aunque no es posible determinar el género ya que coincide con el mismo porcentaje con secuencias de tres géneros diferentes dentro de la misma tribu, todos ellos se alimentan de malváceas.

SP15 (Apéndice 1.XV) no se puede clasificar con seguridad ya que los porcentajes de coincidencia son bajos (por debajo del 95% todos ellos). Por ello, analizando los géneros de coincidencia, únicamente se puede concluir, con no mucha seguridad, que probablemente pertenezca a una especie dentro de la subfamilia Curculioninae (Curculionidae), de alguna tribu cuya subunidad 28S no ha sido descrita en la base de datos del NCBI. Sin embargo, solo se recogió un individuo que multiplicaba por mucho en tamaño al resto de especies, por lo que es muy improbable que se desarrolle en el interior de los frutos.

En resumen, con la búsqueda comparativa de secuencias en la base de datos del NCBI mediante BLAST y una posterior revisión bibliográfica de los géneros, tribus o subfamilias descritas, se puede concluir que, de las 15 especies no identificadas halladas sobre U. parviflorus, únicamente P. sparsutus sería un posible depredador de sus semillas. Otras especies (género Sitona) podrían encontrarse depredando las hojas de la planta aunque sin afectar a su reproducción de forma directa. Cabe la posibilidad de que especies que se han descrito alimentándose de fabáceas de otros géneros, como P. atratulum, sí estén depredando sobre Ulex a pesar de no ser su hospedador típico. El resto de se hallarían ahí por otros motivos; accidental a causa de interacciones con otras especies de plantas adyacentes, refugio contra depredadores, etc.,

Para confirmar estos resultados se llevará a cabo un análisis de las larvas halladas dentro de fruto. Es necesario identificarlas a nivel molecular puesto que morfológicamente son todas iguales. Para ello se empleará la técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPs). Esto implica generar mapas de restricción de las secuencias obtenidas de E. fasciolatum, Lepidapion sp, y P. sparsutus, comparar qué enzima (o enzimas) generan cortes que permitan diferenciar entre las tres especies, amplificar la subunidad ribosómica 28S de las larvas extraídas de frutos de U. parviflorus, llevar a cabo una digestión enzimática para poder observar los resultados en un gel de agarosa y determinar así, en función del número de bandas observadas, de qué especie se trata.

5.3. Filogenias No es posible resolver la filogenia a nivel global aunque sí se observan agrupaciones bien resueltas. Para empezar, el género Lepidapion queda claramente separado del género Exapion, con una probabilidad del 100% en el caso de la inferencia bayesiana. Por tanto, se confirma la identidad de EXLEP3 y EXLEP4 como una especie dentro del género

Lepidapion (Apéndice 1.XVII). Por otra parte, se observan dos grupos diferenciados dentro del género Exapion, lo cual coincide con la clasificación actual del género en dos subgéneros diferentes, a pesar de que hay ciertas incongruencias con las especies dentro de cada subgénero: Exapion y Ulapion. Dentro del subgénero Exapion se encuentra la especie E. compactum; en Ulapion se encuentra E. ulicis, especie que queda clasificada en un grupo diferente al resto junto con E. formaneki. Por tanto la filogenia concuerda con la clasificación actual dentro del género.

A nivel más local se crean agrupaciones con un soporte muy elevado en ambas inferencias que nos permiten identificar con un cierto porcentaje de error la mayoría de especies de Exapion encontradas. Así, se puede confirmar que la especie encontrada sobre U. baeticus (EX3) se trata de E. ulicis, mientras que las halladas en U. europaeus (EX5) y U. erinaceus (EX6) pueden pertenecer a la misma especie o a otra muy cercana a ella. Los estudios de Barat et al. (2007, 2008) confirman la relación U. europaeus – E. ulicis, por lo que es probable que todo este grupo sea la misma especie. Algo similar ocurre con las especies encontradas sobre U. micrantus (EX1), U. minor (EX2), U. densus (EX4) y U. canescens (EX7). En las filogenias aparecen formando una politomía junto con E. lemovicinum. Aunque el soporte es bajo en todas las inferencias, los estudios de Barat et al. (2007, 2008) respaldan la relación U. minor – E. lemovicinum, por lo que es probable que todas estas especies de Exapion sean E. lemovicinum.

Por otra parte, los individuos de Exapion recogidos sobre U. parviflorus (EXLPE1 y EXLEP2) aparecen agrupados con un elevado soporte en todas las filogenias y separados del resto de especies. Individuos de esta especie fueron identificados por Alonso- Zarazaga como E. fasciolatum (Apéndice 1.VI), y el estudio de García et al. 2016 confirma la relación U. parviflorus–E.fasciolatum. Queda por tanto confirmada su identidad como especie diferente y se encuentra emparentada muy cercanamente con E. lemovicinum y una especie encontrada sobre Genista hispanica, la cual no puede ser identificada puesto que aparece de forma independiente en todas las filogenias.

Los resultados muestran que una misma especie de Exapion puede encontrarse sobre diferentes especies de Ulex. Cabría esperar que las poblaciones de Ulex que comparten la misma especie de Exapion se encontrasen coexistiendo o en zonas cercanas. No es el caso; por poner un ejemplo, la especie descrita como E. lemovicinum se encuentra en U. micranthos, recogida cerca de Vigo, y U. canescens, cerca de Almería, entre otros puntos.

Otra posibilidad es que hayan ocurrido fenómenos de coevolución entre las especies de Exapion y Ulex, lo cual solo es posible de comprobar comparando las filogenias de ambos géneros. Además, sería recomendable que las filogenias se llevasen a cabo a partir de las mismas plantas de las que se recogen los curculiónidos para así tener en cuenta las poblaciones en la reconstrucción.

6. Conclusión En resumen, la biodiversidad de curculiónidos encontrada sobre Ulex parviflorus no se debe únicamente a especies depredadoras de semillas. Se han observado especies con hospedadores que cohabitan en las mismas zonas que U. parviflorus, por lo que su presencia en la aliaga sería casual, así como otras depredadoras de las hojas. Además, la biodiversidad se ve reducida tras un incendio; no solamente afecta a aquellas especies cuyo ciclo vital depende, total o parcialmente, de plantas pirófilas, sino también a las que se encuentran en la planta por otros motivos. El tiempo de recuperación de la biodiversidad estimado es mayor de 2 años y menor de 6. En otras zonas cercanas a los incendios, como son los parches, la biodiversidad no se ve afectada, o no en la misma medida y tienen un tiempo de recuperación más corto que las zonas incendiadas.

Por otra parte, se han podido identificar las especies de Exapion recogidas sobre Ulex. Ello ha permitido destapar la clasificación inicial errónea de las especies sobre U. parviflorus: los individuos correspondientes a las modas de mayor peso pertenecen a la especie E. fasciolatum, mientras que los menos pesados se corresponden con individuos de una especie dentro del género Lepidapion. Finalmente, las especies encontradas sobre U. baeticus, U. europaeus y U. erinaceus fueron identificadas como E. ulicis, y las halladas sobre U. micrantus, U. minor, U. densus y U. canescens. como E. lemovicinum. La especie encontrada sobre Genista hispanica no pudo ser identificada a partir de las inferencias filogenéticas. La presencia de las mismas especies sobre diferentes plantas no puede explicarse por situaciones de proximidad entre plantas, por lo que faltaría comparar si estas interacciones son constantes en otros puntos geográficos y si se deben a eventos de coevolución.

7. Agradecimientos En primer lugar nombrar al proyecto FILAS: "Fuego e interacciones bióticas a escala de paisaje" (CGL2015-64086-P), subvencionado por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). Investigador principal: Juli G. Pausas. Desarrollado en el

Centro de Investigación sobre la Desertificación (CIDE-CSIC). Gracias a incluir el TFM en el proyecto se han podido pagar todos los gastos derivados de los análisis, especialmente de la parte experimental. En segundo lugar agradecer a Bruno Moreira, quien recogió los frutos de diferentes especies de Ulex en distintos puntos de la Península Ibérica y sin ellos no habría sido posible inferir las filogenias. Agradecer también a Juli G. Pausas por los consejos para el análisis de los datos. Por último, queda mencionar a Mario Zabal, quien me ha explicado con detalle absolutamente todo, el global del proyecto, las técnicas de laboratorio y bioinformáticas, sus bases teóricas y todo lo relacionado con este TFM.

8. Referencias Barat, M., Tarayre, M. and Atlan, A. (2007). Plant phenology and seed predation: interactions between gorses and weevils in Brittany (France). Entomologia Experimentalis et Applicata, 124(2), pp.167-176.

BARAT, M., TARAYRE, M. and ATLAN, A. (2008). Genetic divergence and ecological specialisation of seed weevils (Exapion spp.) on gorses (Ulex spp.). Ecological Entomology, 33(3), pp.328-336.

Carcamo, H., Herle, C. and Lupwayi, N. (2015). Sitona lineatus (Coleoptera: Curculionidae) Larval Feeding on Pisum sativum L. Affects Soil and Plant Nitrogen. Journal of Insect Science, 15(1), pp.74-74.

Castellanos, M., González-Martínez, S. and Pausas, J. (2015). Field heritability of a plant adaptation to fire in heterogeneous landscapes. Molecular Ecology, 24(22), pp.5633- 5642.

Cubas, P., Pardo, C. and Tahiri, H. (2005). Genetic variation and relationships among Ulex (Fabaceae) species in southern Spain and northern Morocco assessed by chloroplast microsatellite (cpSSR) markers. American Journal of Botany, 92(12), pp.2031-2043.

Friedman, A. (2006). Derelomus piriformis Hoffmann (Curculionoidea: Curculionidae: Curculioninae: Derelomini), a new invasive species in Israel. Phytoparasitica, 34(4), pp.357-359.

García, Y., Castellanos, M. and Pausas, J. (2016). Fires can benefit plants by disrupting antagonistic interactions. Oecologia, 182(4), pp.1165-1173.

Hall, T.A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41, pp.95- 98.

Hernández-Serrano, A., Verdú, M., González-Martínez, S. and Pausas, J. (2013). Fire structures pine serotiny at different scales. American Journal of Botany, 100(12), pp.2349-2356.

Hernández-Serrano, A., Verdú, M., Santos-del-Blanco, L., Climent, J., González- Martínez, S. and Pausas, J. (2014). Heritability and quantitative genetic divergence of serotiny, a fire-persistence plant trait. Annals of Botany, 114(3), pp.571-577.

Herrera, C. and Pellmyr, O. (2008). Plant-animal interactions. Malden, MA: Blackwell Science.

Higgins DG, Thompson JD, Gibson TJ. (1996). Using CLUSTAL for multiple sequence alignments. Methods in Enzymology, 266, pp.383-402

Hornoy, B., Atlan, A., Roussel, V., Buckley, Y. and Tarayre, M. (2013). Two colonisation stages generate two different patterns of genetic diversity within native and invasive ranges of Ulex europaeus. Heredity, 111(5), pp.355-363.

Huelsenbeck, J. (2001). Bayesian Inference of Phylogeny and Its Impact on Evolutionary Biology. Science, 294(5550), pp.2310-2314.

Kitson, J., Warren, B., Vincent Florens, F., Baider, C., Strasberg, D. and Emerson, B. (2013). Molecular characterization of trophic ecology within an island radiation of insect herbivores (Curculionidae: Entiminae:Cratopus). Molecular Ecology, 22(21), pp.5441- 5455.

Letsch, H., Gottsberger, B., Metzl, C., Astrin, J., Friedman, A., McKenna, D. and Fiedler, K. (2018). Climate and host-plant associations shaped the evolution of ceutorhynch weevils throughout the Cenozoic. Evolution.

McKenna, D., Sequeira, A., Marvaldi, A. and Farrell, B. (2009). Temporal lags and overlap in the diversification of weevils and flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(17), pp.7083-7088.

Miller, M., Pfeiffer, W. and Schwartz, T. (2010). Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees. 2010 Gateway Computing Environments Workshop (GCE).

Moreira, B. and Pausas, J. (2012). Tanned or Burned: The Role of Fire in Shaping Physical Seed Dormancy. PLoS ONE, 7(12), p.e51523.

Moreira, B., Castellanos, M. and Pausas, J. (2014). Genetic component of flammability variation in a Mediterranean shrub. Molecular Ecology, 23(5), pp.1213-1223.

NIKULINA, T., MANDELSHTAM, M., PETROV, A., NAZARENKO, V., YUKANOV, N. (2015). A survey of the weevils of Ukraine. Bark and ambrosia beetles (Coleoptera: Curculionidae: Platypodinae and Scolytinae). Zootaxa, 3912(1), pp.1-61..

Pausas, J. and Keeley, J. (2017). Epicormic Resprouting in Fire-Prone Ecosystems. Trends in Plant Science, 22(12), pp.1008-1015.

Pausas, J. and Parr, C. (2018). Towards an understanding of the evolutionary role of fire in animals. Evolutionary Ecology, 32(2-3), pp.113-125.

Pereira, C., Moura, M. and Da-Silva, P. (2014). Insect Seed Predators in Erythrina falcata (Fabaceae): Identification of Predatory Species and Ecological Consequences of Asynchronous Flowering. Neotropical Entomology, 43(3), pp.193-200.

Poisot, T., Kéfi, S., Morand, S., Stanko, M., Marquet, P. and Hochberg, M. (2015). A Continuum of Specialists and Generalists in Empirical Communities. PLOS ONE, 10(5), p.e0114674.

Posada, D. (2008). jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and Evolution, 25(7), pp. 1253–1256

QGIS Development Team (2018). QGIS Geographic Information System. Open Source Geospatial Foundation Project. http://qgis.osgeo.org

R Core Team (2018). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/

Ronquist, F. and Huelsenbeck, J. (2003). MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 19(12), pp.1572-1574.

Seckbach, J. and Dubinsky, Z. (2011). All flesh is grass. Dordrecht: Springer.

Stamatakis, A. (2014). RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post- analysis of large phylogenies. Bioinformatics, 30(9), pp.1312-1313.

Ugarte, I. and Alonso-Zarazaga, M.A. (2002). Bibliographical catalogue of the Curculionoidea (Coleoptera) of the Basque Country (exc. Scolytidae and Platypodidae). Naturzale, 17 pp.253-264.

Williams, D., McCullagh, P. and Nelder, J. (1984). Generalized Linear Models. Biometrics, 40(2), p.566.

Winter, S., Friedman, A., Astrin, J., Gottsberger, B. and Letsch, H. (2017). Timing and host plant associations in the evolution of the weevil tribe Apionini (Apioninae, Brentidae, Curculionoidea, Coleoptera) indicate an ancient co-diversification pattern of beetles and flowering plants. Molecular Phylogenetics and Evolution, 107, pp.179-190.

Xia, X. (2018). DAMBE7: New and Improved Tools for Data Analysis in Molecular Biology and Evolution. Molecular Biology and Evolution, 35(6), pp.1550-1552.

Xia, X., Xie, Z., Salemi, M., Chen, L. and Wang, Y. (2003). An index of substitution saturation and its application. Molecular Phylogenetics and Evolution, 26(1), pp.1-7.

YUNAKOV, N., NAZARENKO, V., FILIMONOV, R. and VOLOVNIK, S. (2018). A survey of the weevils of Ukraine (Coleoptera: Curculionoidea). Zootaxa, 4404(1), p.1.

9. Apéndices Apéndice 1. Imágenes de las especies encontradas sobre U. parviflorus. La línea negra corresponde a 1 mm.

I. Individuo de la especie SP01.

II. Individuo de la especie SP02.

III. Individuo de la especie SP03.

IV. Individuos de las especies SP04 (abajo) y SP05 V. Individuos de las especies SP04 (abajo) y SP05 (arriba).

(arriba). Vista lateral. La línea negra corresponde a 1 mm. Vista superior. La línea negra corresponde a 1 mm. La línea negra corresponde a 1 mm.

VII. Individuo de la especie SP07. VI. Individuo de la especie SP06.

VIII. Individuo de la especie SP08. IX. Individuo de la especie SP09.

X. Individuo de la especie SP10. XI. Individuo de la especie SP11.

XIII. Individuo de la especie SP13.

XII. Individuo de la especie SP12

XIV. Individuo de la especie SP14

XV. Individuo de la especie SP15. La línea negra corresponde a 1 mm

XVI. Ejemplar de la especie Exapion fasciolatum.

XVII. Ejemplares del género Lepidapion.