INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA – PPG GCBEv

CITOGENÉTICA COMPARATIVA DE Baryancistrus xanthellus RAPP PY-DANIEL, ZUANON E DE OLIVEIRA, 2011 (LORICARIIDAE, ANCISTRINI) DE DIFERENTES LOCALIDADES DA PORÇÃO MÉDIA DO RIO XINGU, ALTAMIRA, PARÁ

LARISSA AZEVEDO DE MEDEIROS

MANAUS-AM Maio - 2014 ii

LARISSA AZEVEDO DE MEDEIROS

CITOGENÉTICA COMPARATIVA DE Baryancistrus xanthellus RAPP PY-DANIEL, ZUANON E DE OLIVEIRA, 2011 (LORICARIIDAE, ANCISTRINI) DE DIFERENTES LOCALIDADES DA PORÇÃO MÉDIA DO RIO XINGU, ALTAMIRA, PARÁ

Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

Orientadora: Eliana Feldberg, Dra. - INPA

Coorientador: Leandro Sousa, Dr. - UFPA

MANAUS – AM Maio – 2014 iii

FICHA CATALOGRÁFICA

M488 Medeiros, Larissa Azevedo de Citogenética comparativa de Baryancistrus Xanthellus Rapp Py- Daniel, Zuanon e de Oliveira, 2011 (Loricariidae, Ancistrini) de diferentes localidades da porção média do Rio Xingu, Altamira, Pará / Larissa Azevedo de Medeiros. --- Manaus: [s.n.], 2014. xii, 56 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2014. Orientador : Eliana Feldberg. Coorientador : Leandro Sousa. Área de concentração : Biodiversidade.

1. Baryancistrus xanthellus. 2. Morfotipos. I. Título.

CDD 597.0929

Sinopse Neste trabalho foi feita uma análise cariotípica de espécimes de Baryancistrus xanthellus de quatro localidades da Volta Grande do rio Xingu, utilizando ferramentas clássicas (coloração convencional, detecção da heterocromatina e regiões organizadoras de nucléolo) e moleculares (mapeamento dos rDNA 18S e 5S e dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6), com intuito de verificar se existiam diferenças entre os indivíduos ao longo de um trecho de corredeiras, dado a sua baixa vagilidade. A partir dos dados obtidos foi possível verificar que não houve diferenças entre os espécimes coletados, indicando que, apesar da baixa vagilidade da espécie, os pedrais e corredeiras p o d e m não estar atuando como barreiras reprodutivas, evitando assim o acúmulo de diferenças cromossômicas.

Palavras-chave: sequências repetitivas, elementos transponíveis, morfotipos, FISH.

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Dedico esta Dissertação à minha mãe

Lucélia, aos meus avós Julieta e Osvaldo e ao meu eterno amigo Eduardo. v

Cântico negro

"Vem por aqui" — dizem-me alguns com os olhos doces Estendendo-me os braços, e seguros De que seria bom que eu os ouvisse Quando me dizem: "vem por aqui!" Eu olho-os com olhos lassos, (Há, nos olhos meus, ironias e cansaços) E cruzo os braços, E nunca vou por ali... A minha glória é esta: Criar desumanidades! Não acompanhar ninguém. — Que eu vivo com o mesmo sem-vontade Com que rasguei o ventre à minha mãe Não, não vou por aí! Só vou por onde Me levam meus próprios passos... Se ao que busco saber nenhum de vós responde Por que me repetis: "vem por aqui!"?

Prefiro escorregar nos becos lamacentos, Redemoinhar aos ventos, Como farrapos, arrastar os pés sangrentos, A ir por aí... Se vim ao mundo, foi Só para desflorar florestas virgens, E desenhar meus próprios pés na areia inexplorada! O mais que faço não vale nada.

Como, pois, sereis vós Que me dareis impulsos, ferramentas e coragem Para eu derrubar os meus obstáculos?... Corre, nas vossas veias, sangue velho dos avós, E vós amais o que é fácil! Eu amo o Longe e a Miragem, Amo os abismos, as torrentes, os desertos...

Ide! Tendes estradas, Tendes jardins, tendes canteiros, Tendes pátria, tendes tetos, E tendes regras, e tratados, e filósofos, e sábios... Eu tenho a minha Loucura! Levanto-a, como um facho, a arder na noite escura, E sinto espuma, e sangue, e cânticos nos lábios... Deus e o Diabo é que guiam, mais ninguém! Todos tiveram pai, todos tiveram mãe; Mas eu, que nunca principio nem acabo, Nasci do amor que há entre Deus e o Diabo.

Ah, que ninguém me dê piedosas intenções, Ninguém me peça definições! Ninguém me diga: "vem por aqui"! A minha vida é um vendaval que se soltou, É uma onda que se alevantou, É um átomo a mais que se animou... Não sei por onde vou, Não sei para onde vou Sei que não vou por aí!

José Régio

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A realização deste estudo foi possível devido:

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), ao programa de pós- graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEV) e ao laboratório de Genética Animal (LGA). Aos financiamentos fornecidos pelo Centro de Estudos de Adaptações da Biota Aquática da Amazônia – ADAPTA (INCT/CNPq/FAPEAM 573976/2008-2) e pelo Projeto “Genômica comparativa de peixes amazônicos frente a diferentes desafios ambientais” – (PRONEX/FAPEAM/CNPq 003/2009- Processo: 653:2009). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa durante a realização deste estudo. vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço inicialmente a todos os trabalhadores e trabalhadoras que através dos impostos, que pesam mais em seus bolsos, possibilitaram que houvesse recursos financeiros para concessão de bolsas e de projetos. Essas mesmas pessoas que nos pagam para fazer o que fazemos são frequentemente esquecidas e pejorativamente adjetivadas no meio acadêmico de recebedores de “bolsa esmola” e, em quem recai a culpa de todas as coisas que não andam bem no país. A estas pessoas, eu presto os meus sinceros agradecimentos. Agradeço ao CNPQ pelo financiamento do projeto junto a FAPEAM e pela concessão da bolsa. À minha orientadora, Dra. Eliana Feldberg por aceitar me orientar, pelas contribuições e sugestões ao trabalho e pelas rápidas correções. Ao meu coorientador Dr. Leandro Sousa, pela ajuda nas coletas, identificação dos espécimes e pela acolhida em Altamira. À LEME engenharia por permitir minha participação na coleta. Ao mergulhador Dani pela eficiência e rapidez na coleta dos amarelinhos. À todas as pessoas que participaram da expedição, tornando-a divertida e de muito aprendizado. À Tati pela ajuda nas preparações, pelas contribuições, amizade e acolhida. À Ondina e Thaís pela ajuda nas preparações e pela companhia. Ao Galuch por transportar os peixes até Manaus. Aos referees que avaliaram, corrigiram e contribuíram na elaboração do meu plano. Não tenho como nomeá-los porque as informações são confidenciais. Aos membros da banca da minha qualificação, Professoras Gislene Zilse, Danielle Matoso e Maria Cláudia Gross pelas contribuições. Aos membros da banda da minha defesa, Professores Lúcia Rapp Py-Daniel, Vera Val e Carlos Schneider pelas correções e contribuições ao trabalho. Aos professores da UFRN Ricardo Andreazze e Herbet Tadeu por me incentivarem a fazer a seleção de mestrado do INPA, pelos conselhos e dicas de permanência em Manaus. Especialmente a Ricardo por me alertar que aqui tem baratas bem maiores que no RN. Agradeço especialmente à minha mãe, Lucélia, por ter sempre me apoiado em todas as minhas escolhas, me ajudado de todas as formas possíveis e ter se viii mantido presente na minha vida, especialmente nesses dois anos de mestrado. Obrigada também pelos doces, raivinhas e pipocas bokus enviadas. À minha avó Julieta (Vó êta) e ao meu avô Osvaldo, também por terem sido avós muito presentes na minha vida, me ajudando em todos os momentos. Obrigada pelo amor, dedicação e apoio nas minhas decisões. Ao meu pai, Demétrio, por incentivar e apoiar a minha vinda para Manaus e por ter ajudado a despertar em mim o interesse pela natureza, especialmente os peixes. Ao meu tio e padrinho Gutinho pelos incentivos que me ajudaram nessa jornada. Ao meu primo Raphael, que juntamente com Alano e Aldrey me acolheram tão bem quando eu cheguei a Manaus. Agradeço imensamente pela amizade, preocupação e por quererem sempre me animar e me ver mais feliz aqui. Agradeço também aos meus amigos de Natal, que dentro do possível mantiveram-se presentes esses dois anos e jamais foram esquecidos: Bel, Natália, Pedro Raoni, Duda, Fernando, Allan Rocha, Alan Michel, Lucca, Ana Carla, João Víctor, Eliezer, Vítor, Fábio, Alessandro, Guillermo, Thiago e Priscilla. Ao amigo Gideão Wagner, pelas preciosas sugestões de como melhorar o FISH e por me ajudar com vários esclarecimentos. E por fim, agradeço enormemente ao Eduardo por ter sido tão dedicado, companheiro, amoroso, compreensivo, amigo e tantas outras coisas que não caberiam num papel. Esses dois anos foram extremamente difíceis para mim e com absoluta certeza, só melhoraram depois da sua presença na minha vida. Obrigada por ter dividido comigo tantas coisas boas e as ruins sempre me ajudado a superá-las, por me ensinar tantas coisas, sendo praticamente um google ambulante, pelas conversas, pelas risadas e por toda a felicidade que você me proporciona todos os dias.

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RESUMO

Baryancistrus xanthellus é uma espécie de grande importância econômica, pois suas características morfológicas e padrões de cor fazem com que seja um dos peixes ornamentais mais comercializados no município de Altamira. É encontrado em toda a área conhecida como Volta Grande do Xingu, região onde está ocorrendo a construção da Usina Hidrelétrica de Belo Monte, que ameaça a sua existência. Estudos citogenéticos para Ancistrini são escassos, restringindo-se principalmente à citogenética clássica. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar citogeneticamente por meio de ferramentas clássicas e moleculares espécimes de B. xanthellus, coletados em quatro localidades da Volta Grande do Xingu e verificar se existem diferenças entre estes espécimes, de acordo com suas ocorrências. Os resultados indicaram a manutenção do número diploide igual a 52 cromossomos, região organizadora de nucléolo simples confirmada pelo mapeamento do DNAr 18S e DNAr 5S intersticial em apenas um par. Foram observados grandes blocos de heterocromatina nos pares 1 e 10 e nas regiões equivalentes à RON e ao DNAr 5S. O mapeamento dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 resultou em marcações dispersas em todo o conjunto cromossômico. Não foram observadas variações entre os espécimes das quatro localidades indicando que, apesar da baixa vagilidade da espécie, os pedrais e corredeiras p o d e m não estar atuando como barreiras, evitando assim o acúmulo de diferenças cromossômicas. Ainda, os dados obtidos neste trabalho corroboram com a proposta filogenética mais aceita para Ancistrini, de que o gênero Baryancistrus ocupa uma posição basal nesta tribo.

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ABSTRACT

Baryancistrus xanthellus is a species of great economic importance, because its morphological features and color patterns make it one of the most commercialized ornamental fishes at Altamira city. It is found in the whole area of Volta Grande do Xingu, the region where Belo Monte Hydroelectric Plant is being built, threatening this fish existence. Cytogenetic studies for Ancistrini are scarce, restricting mainly to classic cytogenetics. The present work had as objective characterizing cytogenetically, by means of classic and molecular tools, specimens of B. xanthellus, collected in four sites of Volta Grande do Xingu and verifying if there are any differences among these specimens, according to their sites. The results indicated the conservation of the diploid number equal to 52 chromosomes, a simple nucleoli organizer region confirmed by the interstitial 18S rDNA and 5S rDNA mapping in a single pair. Large heterochromatin blocks were observed in pairs 1 and 10 and in the regions equivalent to the NOR and to the 5S rDNA. Mapping Rex1, Rex3, and Rex6 retroelements resulted in spread markings in the whole chromosomal set. Variations among the specimens from the four sites were not observed, indicating that, despite the low motility of this species, rocky areas and river chutes are not acting as barriers, thus, avoiding chromosomal differences accumulation. Yet, the data obtained in this work corroborate the most accepted phylogenetic proposition for Ancistrini, that Baryancistrus genus occupies a basal position in this tribe.

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SUMÁRIO

1. Introdução ...... 1 1.1 Ordem Siluriformes ...... 2 1.2 Família Locariidae ...... 3 1.3 Baryancistrus xanthellus ...... 4 1.4 A citogenética como ferramenta de estudo ...... 6 1.5 Sequências repetitivas de DNA ...... 6 1.6 Objetivo Geral ...... 11 1.6.1 Objetivos Específicos ...... 11 2. Material e Métodos ...... 11 2.1 Material ...... 11 2.1.1 Coletas ...... 11 2.2 Métodos ...... 13 2.2.1 Indução Mitótica ...... 13 2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos ...... 13 2.2.3 Coloração convencional (Giemsa) ...... 14 2.2.4 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON) ...... 14 2.2.5 Detecção das Regiões de Heterocromatina Constitutiva em cromossomos mitóticos ...... 14 2.2.6 Extração de DNA ...... 15 2.2.7 Preparação das sondas de DNAr 18S e 5S ...... 15 2.2.8 Identificação dos Elementos Transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 através de PCR (Polymerase Chain Reaction)...... 17 2.2.9 Hibridização in situ por Fluorescência (FISH) ...... 17 3. Resultados...... 19 4. Discussão ...... 26 5. Conclusões ...... 39 6. Referências Bibliográficas ...... 40

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Alguns dos padrões de coloração encontrados em B. Xanthellus ...... 6

Figura 2. Mapa da volta grande do Xingu. Os círculos vermelhos indicam as localidades de coleta. As localidades 1, 2, 3 e 4 equivalem respectivamente ao rio Bacajá, Jericoá (a), Jericoá (b) e Ilha da Fazenda ...... 12

Figura 3. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos à coloração convencional com Giemsa, os quadros indicam os pares que apresentam as Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON)...... 21

Figura 4a. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos ao bandamento C para identificação das regiões heterocromáticas. As letras a e b referem-se às localidades 1 e 2 ...... 22

Figura 4b. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos ao bandamento C para identificação das regiões heterocromáticas. As letras c e d referem-se às localidades 3 e 4 ...... 23

Figura 5. Mapeamento dos DNAr 18S (sinal vermelho) e 5S (sinal verde) através da double FISH ...... 24

Figura 6. Mapeamento dos retroelementos Rex1 (a), Rex3 (b) e Rex6 (c), sinal vermelho, através da Hibridização in situ por Fluorescência ...... 25

Figura 7. Árvore de máxima parcimônia com base em dados morfológicos proposta por Armbruster (2004) para a tribo Ancistrini ...... 38

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1. Introdução

A bacia amazônica é a maior bacia hidrográfica do mundo, drenando uma área de aproximadamente 7 milhões de km², sendo desses, aproximadamente 63% em território brasileiro. Na margem esquerda os principais afluentes são os rios Japurá, Negro e Trombetas, na margem direita, os rios Juruá, Purus, Madeira, Xingu e Tapajós (Agência Nacional de Águas - Governo Federal http://www2.ana.gov.br/; Projeto Radam 1974; Goulding et al. 2003). O rio Xingu pertence ao grupo dos rios de águas claras, pobres em sedimentos, podendo ser ricas em matéria dissolvida em algumas áreas (Sioli 1984). De suas nascentes no Planalto Central Brasileiro até sua foz no rio Amazonas possui uma extensão de aproximadamente 1.500 km e drena uma área de 540.000 km² (Miranda et al. 1988). Nasce na Serra do Roncador a oeste e na Serra Azul ao norte, no leste do Mato Grosso. Corre paralelo aos rios Tapajós e Tocantins na direção sul-norte, deságua ao sul da ilha de Gurupá (Pará) na margem direita do Amazonas, do qual é um dos maiores afluentes (AAI 2009). Recebe o rio Iriri, seu principal afluente, no curso médio inferior próximo à cidade de Altamira, em seguida sofre uma acentuada deflexão formando a chamada Volta Grande, de grandes corredeiras, com um desnível de 85m em 160 km. Essas corredeiras são formadas pelo desnível abrupto provocado pela transição para a planície amazônica, estando muitas delas previstas no aproveitamento para a geração de energia elétrica (Junk 1987), como é o caso da UHE (Usina Hidrelétrica) Belo Monte (Eletrobrás CNEC 1980). A construção de usinas hidrelétricas alterou imensamente áreas de corredeiras de diversos rios amazônicos, como exemplo pode-se citar a UHE de Tucurui (rio Tocantins), a UHE de Balbina (rio Uatumã) e a UHE de Samuel (rio Jamari). Em todos esses casos, boa parte das corredeiras e da ictiofauna associada desapareceu (Zuanon 1999). De acordo com o “Painel de Especialistas - Análise Crítica do Estudo de Impacto Ambiental do Aproveitamento Hidrelétrico de Belo Monte”, a situação dos peixes reofílicos, aqueles com distribuição fortemente associada aos pedrais e corredeiras, é bastante crítica. Nas áreas de reservatório é provável que as espécies reofílicas encontradas sejam extintas devido ao represamento do rio, em consequência do aumento do volume de água e de sua permanência no sistema por 2 um período maior de tempo. Isso acarreta uma diminuição dos teores de oxigênio e desestruturação dos ambientes de fundo, além da diminuição das algas reofílicas, que atuam como base da cadeia de produção de alimentos para a maior parte dos peixes dessas áreas, provocada pela diminuição da incidência luminosa no fundo. Segundo o próprio EIA (Estudo de Impacto Ambiental) de Belo Monte, a volta grande do Xingu será a área do rio com maior perda de habitats, e consequentemente onde se preveem os impactos mais graves, como a mortalidade e diminuição de espécies que são características de pedrais (Relatório Final Ictiofauna e Pesca). De acordo com o levantamento da ictiofauna do EIA – Belo Monte, a ordem Siluriformes é a segunda mais abundante, tanto em número de espécies, quanto em número de famílias, para todo o curso do rio Xingu. Nas áreas restritas a corredeiras, Zuanon (1999) verificou que as espécies mais encontradas eram da família Loricariidae, seguida da Cichlidae, com 25 e 18 espécies respectivamente. Atualmente estima-se a presença de mais de 40 espécies de Loricariidae apenas nesses trechos de corredeiras (Leandro Sousa, comunicação pessoal).

1.1 Ordem Siluriformes

A ordem Siluriformes é representada pelos bagres, cascudos e acaris e contém mais de 3000 espécies descritas, além de uma estimativa de aproximadamente 1700 desconhecidas, distribuídas em 36 famílias e 478 gêneros (Ferraris 2007). De modo geral são peixes muito populares, utilizados na pesca esportiva, como alimento e alguns são bastante valorizados no comércio de peixes ornamentais, tendo grande importância econômica (Zuanon 1999; Nelson 2006). As famílias Ariidae e Plotosidae são compostas por peixes que habitam ambientes marinhos, enquanto as demais são encontradas predominantemente em água doce, podendo também invadir ambientes estuarinos. São encontrados em todos os continentes, com exceção dos extremos dos hemisférios norte e sul (de Pinna 1998; Nelson 2006; Armbrüster 2011), entretanto existem registros fósseis do Eoceno e Oligoceno na Antártida (Grande e Eastman 1986). A maior diversidade dessas espécies ocorre nas regiões tropicais, especialmente América 3 do Sul, África subsaariana e sudeste da Ásia, sendo que 40% dessas espécies estão presentes na região neotropical, muitas delas ocorrendo na Amazônia (Py- Daniel e Fernandes 2005; Armbrüster 2011). Apesar dos progressos na determinação filogenética dos Siluriformes, ainda há muito desacordo sobre as relações entre algumas famílias (Nelson 2006).

1.2 Família Loricariidae

Os peixes desta família são comumente reconhecidos por possuírem o corpo recoberto por três ou mais séries de placas dérmicas, por isso o nome popular de “cascudos”, e a boca em forma de ventosa localizada na região ventral. Alimentam-se principalmente de algas e microorganismos que aderem ao substrato rígido ou lama no leito dos rios (Silvano et al. 2001). São amplamente distribuídos por toda região neotropical, da Costa Rica à Argentina (Reis et al. 2003) e apresentam uma grande variação morfológica e de coloração. A classificação de suas subfamílias e o agrupamento dos gêneros têm sido alvo de constantes reformulações, desafiando os sistematas a realizarem uma classificação mais precisa (Reis et al. 2006). A família Loricariidae é a mais diversa entre os Siluriformes, abrigando aproximadamente 24% da diversidade dessa ordem (Nelson 2006; Armbrüster 2011) e está entre as mais diversas do mundo (Isbrücker 1980; Nelson 2006). De acordo com Eschmeyer e Fong (2014) esta família apresenta 936 espécies descritas, sendo 813 válidas. Só nos últimos 10 anos foram descritas 174 novas espécies. Loricariidae era dividida em seis subfamílias: Hypoptopomatinae, Hypostominae, Ancistrinae, Loricariinae, Neoplecostominae e Lithogeninae (Schaefer 1987; Reis et al. 2003), mas a subfamília Ancistrinae foi considerada sinônima de Hypostominae e passou a ser uma tribo desta subfamília (Armbrüster 2004) e em seguida a subfamília Delturinae foi incorporada a esta família (Reis et al. 2006). A subfamília Hypostominae atualmente é dividida nas tribos Corymbophanini, Rhinelepini, Hypostomini, Pterygoplichthini e Ancistrini. A tribo Ancistrini abriga aproximadamente 217 espécies (Fisch-Muller 2003) distribuídas em 24 gêneros (Ferraris 2007) e foi proposta como tribo após uma detalhada revisão taxonômica, 4 entretanto vários problemas taxonômicos ainda são inerentes (Armbrüster 2004). Esta tribo inclui várias espécies com conflitos taxonômicos o que muitas vezes as tornam de difícil identificação (Alves et al. 2003) e poucos trabalhos foram realizados na intenção de resolvê-los, sendo a maior parte deles baseados em dados morfológicos. (Isbrücker 1980; Schaefer 1986; 1987). Apesar de numerosa, a família Loricariidae possui poucos estudos relacionados à sua caracterização cromossômica (Kavalco et al 2005). Artoni e Bertollo (2001) sugeriram que o número diploide igual a 54 cromossomos é um caráter plesiomórfico uma vez que o mesmo é encontrado nos gêneros basais e no grupo externo, a família Trichomycteridae. Entretanto, os poucos dados coletados apontam para uma grande variação quanto ao número diploide, de 2n=34 em Ancistrus sp.1 “Purus” (de Oliveira et al. 2009) a 2n=96 em Hemipsilichthys gobio (Kavalco et al. 2004). Segundo Alves (2000), Hypostominae é a subfamília de Loricariidae mais estudada e poucas espécies apresentam 2n=54 cromossomos. Em Ancistrini todos os representantes apresentam 2n≤54, indicando que fusões cêntricas contribuíram para a carioevolução desta tribo (Mariotto et al. 2011). Ancistrus é o gênero mais estudado e o que apresenta maior variação quanto ao número cromossômico de 2n=34 a 2n=54 (de Oliveira et al. 2009, Mariotto et al. 2011). Poucos estudos citogenéticos foram realizados com os demais gêneros, mas os resultados apontam para 2n=52 em Baryancistrus, Hypancistrus e Scobinancistrus (Souza et al. 2004; Silva et al. 2014; Cardoso et al. 2013). A maioria dos estudos se refere ao número diploide e detecção de algumas sequências repetitivas, como heterocromatina e os DNA ribossomais. Poucos são os estudos citogenéticos envolvendo o mapeamento de elementos transponíveis para a tribo Ancistrini (Silva et al. 2014; Favarato 2014).

1.3 Baryancistrus xanthellus

Os peixes do gênero Baryancistrus são muito populares no comércio de espécies ornamentais devido ao seu padrão de coloração muito atraente, normalmente com pontos brilhantes sobre o corpo mais escuro. Muitas espécies deste gênero são frequentemente comercializadas sem sequer terem sido descritas (Carvalho Júnior et al. 2009). 5

Antes de 2011 haviam sido descritas apenas quatro espécies neste gênero: Baryancistrus niveatus (Castelnau 1855), do rio Araguaia, B. longipinnis (Kindle 1895) do rio Tocantins, B. demantoides (Werneke, Sabaj, Lujan e Armbrüster 2005) e B. beggini (Lujan, Arce e Armbrüster 2009), ambos da área de confluência dos rios Orinoco e Ventuari, na Venezuela e Colômbia. Mais recentemente foram descritas duas novas espécies do rio Xingu: Baryancistrus chrysolomus (Rapp Py-Daniel, Zuanon e de Oliveira 2011) e Baryancistrus xanthellus (Rapp Py-Daniel, Zuanon e de Oliveira 2011). Baryancistrus xanthellus tem grande importância econômica, pois devido às suas características morfológicas e padrões de coloração é um dos peixes ornamentais mais comercializados no município de Altamira, Estado do Pará, sendo uma importante fonte de renda para os pescadores e para os exportadores locais. Esta espécie é capturada em toda a área conhecida como Volta Grande do Xingu, acima das cachoeiras de Belo Monte e no Rio Iriri (Rapp Py- Daniel et al. 2011; Leandro Sousa, comunicação pessoal). B. xanthellus é caracterizada pela presença de pontos amarelos por todo o corpo e manchas amarelas conspícuas nas pontas das nadadeiras dorsal e caudal. Devido à presença desses pontos, que variam em tamanho e intensidade, a espécie é conhecida popularmente como “amarelinho” ou “cascudo pepita de ouro”. Possui o corpo com coloração marrom escuro no dorso, sendo um pouco mais claro na região ventral (figura 1). Acredita-se que os pontos amarelos são maiores nos juvenis tornando-se proporcionalmente menores, mais numerosos e mais claros nos adultos e que as faixas amarelas das nadadeiras dorsal e caudal tendem a ficar mais delgadas, reduzindo-se a um pequeno ponto distal localizado na porção anterior das nadadeiras; estas podem ser variações ontogenéticas (Rapp Py-Daniel et al. 2011). Antes da descrição formal dessa espécie, os morfotipos encontrados foram classificados em “L”, como L18, L85, L117, L81 e outros (Rapp Py-Daniel et al. 2011). Entretanto, Leandro Sousa (Comunicação pessoal) em expedições realizadas no rio Xingu percebeu que estas variações não têm necessariamente relação com as fases juvenil e adulta, uma vez que são encontrados diferentes padrões em indivíduos de mesmo tamanho, em diferentes trechos do rio.

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Figura 1. Alguns dos padrões de coloração encontrados em B. xanthellus (Fotos: Leandro Sousa).

1.4 A Citogenética como ferramenta de estudo

A citogenética, baseada na análise da diversidade cromossômica, pode auxiliar no entendimento das relações filogenéticas entre peixes através de informações como número de cromossomos e de braços cromossômicos, a posição do centrômero, a distribuição da heterocromatina e a localização das regiões organizadoras de nucléolos. Essas ferramentas clássicas associadas mais recentemente às ferramentas de citogenética molecular podem auxiliar na elucidação de problemas taxonômicos e filogenéticos (Pieczarka 1995; Almeida- Toledo 1998; Artoni et al. 2000; Martins et al. 2010). Podem ser ainda ferramentas úteis para a genética da conservação de grupos problemáticos em relação à taxonomia, por revelar polimorfismos populacionais, diferenciar espécies crípticas e fornecer dados que muitas vezes não são possíveis através de outras técnicas (Allendorf e Luikart 2007). Atualmente, a associação entre dados genéticos e morfológicos tem sido cada vez mais utilizada na compreensão dos processos envolvidos na diversificação de diferentes grupos de organismos (Cheverud 1988).

1.5 Sequências repetitivas de DNA

Dentre as sequências analisadas citogeneticamente, as repetitivas ganham destaque por serem importantes marcadores cromossômicos usados em estudos 7 evolutivos e citotaxonômicos, além de fornecerem dados para compreensão de rearranjos cromossômicos e identificação do sexo (Ferreira e Martins 2008). As sequências de DNA repetitivas podem ser classificadas em “repetitivas organizadas em tandem” ou “repetitivas dispersas”. O primeiro tipo pode ser representado pelos minissatélites, microssatélites e sequências que codificam os RNA ribossomais. Já o segundo é representado principalmente pelos elementos transponíveis do genoma, como transposons e retrotransposons (Guerra 2004; Cioffi et al 2010). Nos eucariotos superiores, as sequências de DNA ribossomal são organizadas em duas famílias multigênicas: uma delas é a do DNAr 45S que codifica os RNAr 18S, 5,8S e 28S e a outra corresponde ao DNAr 5S, que codifica o RNAr 5S (Carvalho 2009; Martins e Galetti Jr. 2001). O DNAr 45S é considerado uma sequência moderadamente repetitiva, formando blocos com repetições em um ou mais pares de cromossomos, que correspondem às constrições secundárias, observadas pela coloração por nitrato de prata. Essas sequências de DNA ribossômico formam as Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON). O DNAr 5S tem sua sequência mais variável, entretanto é normalmente encontrado em apenas um par cromossômico (Guerra 2004). A análise da diversidade cariotípica pode ser complementada pela localização de genes específicos, como os envolvidos na formação da RON. Nos peixes, por exemplo, a localização do DNAr 45S é um importante marcador cromossômico, já que algumas famílias apresentam apenas um par de RON (Feldberg et al. 1992; Galetti Jr. et al. 1984; Terencio et al. 2012), enquanto outras apresentam RON múltipla (Nakayama et al.; 2012; Favarato 2014) ou até mesmo nos cromossomos sexuais (Bertollo e Cavallaro 1992; Born e Bertollo 2000; Valentim et al. 2013). A localização da RON pode ser direta pela Hibridização in situ por Fluorescência (FISH), através de sondas que identificam sequências de DNAr que compõem a RON como por exemplo o DNAr 18S. Pode ser também indireta, através da coloração das proteínas associadas a essas regiões, resultantes da transcrição desses genes na interfase anterior, pelo nitrato de prata (Howell e Black 1980, Kavalco et al. 2005). A heterocromatina constitutiva é formada por sequências altamente repetitivas de DNA que apresentam um alto grau de compactação nos cromossomos, tornando- se inacessíveis à maquinaria de transcrição. Por este motivo, sua atividade 8 transcricional é baixa ou inexistente e a replicação ocorre tardiamente na fase S da interfase, em relação aos outros tipos de cromatina (Pieczarka 1995, Guerra 1989, Huisinga et al. 2006). Sua função está associada à regulação da expressão gênica, ao silenciamento gênico, à regulação epigenética e pode ainda mediar a própria segregação cromossômica. Além disso, pode reprimir recombinações ilegítimas entre sequencias de DNA repetitivo disperso protegendo a integridade do genoma (Hall e Grewal 2003). Apresenta um importante papel na diversificação dos peixes (Ojima e Ueda 1979, Kavalco et al. 2004) e a banda C, que permite determinar padrões de heterocromatina, tem se mostrado bastante eficiente na detecção de polimorfismos e na caracterização da variabilidade intraespecífica e interpopulacional em muitas espécies da ictiofauna (Mantovani et al. 2000). Vários fatores podem influenciar na formação e manutenção da heterocromatina, como a localização nuclear e cromossômica e a presença e densidade de DNA repetitivo (Weiler e Wakimoto 1995; Hall e Grewal 2003; Grewal e Jia 2007). Dentre as sequências de DNA repetitivas dispersas estão os Elementos Transponíveis (ET). Estas são sequências moderadamente repetitivas que possuem a capacidade de mover-se dentro do genoma, seja ao longo de um cromossomo ou entre sítios não homólogos (Charlesworth et al. 1994; Ferreira et al. 2011). Esta capacidade de mobilidade pode resultar em alterações estruturais como duplicações ou deleções nos locais de inserção e como consequência gerar variabilidade no número de cópias de determinadas sequências, podendo então levar a mudanças na expressão gênica (Capy et al. 1998). Hoje já se sabe que esses elementos têm uma influência significativa sobre a evolução dos genomas (Kazazian 2004), pois podem interferir nos processos evolutivos devido a sua atividade transponível, causando mutações estruturais nos cromossomos e aumento das taxas de rearranjos (Koga et al. 2000), especialmente nas regiões centroméricas e teloméricas. Podem ainda estar envolvidos na regulação epigenética, modificando a cromatina, e na diferenciação e inativação de cromossomos sexuais (Lyon 2000; Peaston et al. 2004; Han e Boeke 2005; Slotkin e Martienssen 2007). Devido a estes fatores, os ET podem ser considerados como os componentes integrados do genoma com um dos papéis mais importantes na evolução (Biémont 2010). A atividade e evolução dos elementos transponíveis podem ser fontes de 9 biodiversidade para os vertebrados e têm o potencial de moldar genomas e promover o surgimento de novas espécies (Oliver et al. 2009; Böhne et al. 2008; Kidwell et al. 2000). A análise filogenética de vários retrotransposons de várias espécies de peixes revelou a presença de ondas de retrotransposição, que podem ter sido associadas com eventos de especiação (Volff et al. 2001c). Isto pode ser evidenciado graças à capacidade dos ET de gerar mutações juntamente ao poder de regular os sistemas genéticos e à sensibilidade ao estresse ambiental, que podem não apenas gerar polimorfismos genéticos que favorecem a adaptação da população, mas também promove especiação (Flavell 1982; Georgiev et al. 1983; McDonald 1983; Syvanen 1984). Os Elementos Transponíveis podem ser divididos em duas classes, de acordo com sua organização estrutural e mecanismo de transposição. A classe I é representada pelos retrotransposons que se movem no genoma através de um cDNA originado de um molde de RNA, sob ação de uma transcriptase reversa, semelhante ao mecanismo “copiar e colar”. Nesta classe estão incluídos os retrotransposons que apresentam longas repetições terminais, LTR – retrotransposons, e os non-LTR retrotransposons, que carecem dessas repetições. Estes últimos são ainda divididos em LINEs (long interspersed elements) e SINEs (short interspersed elements) (Kazazian 2004; Charlesworth et al. 1994). Os LINEs são elementos autônomos, pois codificam as enzimas necessárias para sua retrotransposição, enquanto que os SINEs são elementos não autônomos que necessitam das proteínas codificadas pelos LINEs (Böhne et al. 2008). A classe II engloba os transposons, que se movem no genoma através da enzima transposase. Esta enzima promove a excisão da sequência e sua reinserção em uma nova localização do genoma, assemelhando-se ao mecanismo de “cortar e colar” (Kidweell e Lisch 2001; Charlesworth et al., 1994; Böhne et al. 2008). Os peixes apresentam todas as classes de ET d e s c r i t a s (Volff et al. 2003). No entanto, apenas alguns destes elementos têm sido estudados e mapeados nos cromossomos deste grupo, até o presente. Entre os mais estudados estão os ET do grupo Rex (Rex1, Rex3 e Rex6), que são non-LTR retrotransposons e foram descritos pela primeira vez no genoma de Xiphophorus maculatus. Além de codificarem uma transcriptase reversa, os Rex1 e Rex3 codificam também uma endonuclease apurínica/apirimidínica necessária para a 10 clivagem da sequência alvo (Volff 1999; 2000). Rex6 também codifica uma transcriptase reversa e uma suposta enzima endonuclease de restrição (Volff et al. 2001b). Aparentemente estes são os ET mais abundantes nos teleósteos e têm sido ativos durante a evolução de diferentes linhagens (Volff 2001a; 2001b). Estes elementos aparecem como os mais estudados nos cromossomos de peixes (Ferreira et al. 2011), já que muitos eventos de transposição estão potencialmente relacionados com processos de especiação, especialmente os que envolvem os non-LTR retrotransposons (Volff et al. 2000; Volff 2001c). Por este motivo, o mapeamento dos retrotransposons da família Rex vem sendo realizado nos genomas de diferentes espécies (Volff et al. 1999, 2000). Deste modo, o estudo da genômica comparativa pode ser útil para o entendimento da dinâmica de processos adaptativos decorrentes de variações ambientais naturais e antropogênicas. No caso do Baryancistrus xanthellus é observada uma variação dos padrões de sua coloração ao longo do rio Xingu, o que poderia refletir apenas uma diversidade morfológica resultante da interferência do ambiente ou poderia caracterizar um complexo de espécies, dado o comportamento territorialista e a baixa vagilidade desta espécie, que poderia incorrer no isolamento reprodutivo e permitir o acúmulo de mutações específicas em cada população. Neste sentido, analisar a organização do genoma e realizar o mapeamento físico de genes pode ajudar a elucidar conflitos taxonômicos e remeter à história evolutiva destes peixes. Além disso, o rio Xingu está prestes a sofrer uma das maiores modificações, a construção da UHE Belo Monte. Esta obra prevê a diminuição da vazão e o aumento no nível da água em vários trechos e como consequência, muitas áreas de corredeiras e sua ictiofauna associada serão afetadas. O “amarelinho” é um peixe restrito a corredeiras, podendo sofrer impactos relacionados à perda de habitat e até mesmo a extinção local. Dessa forma, o desaparecimento dessa espécie trará consigo prejuízos econômicos e ecológicos difíceis de mensurar.

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1.6. Objetivo Geral

Caracterizar por meio de técnicas da citogenética clássica e molecular espécimes de Baryancistrus xanthellus coletados em diferentes localidades da Volta Grande do Xingu, município de Altamira – Pará.

1.6.1 Objetivos Específicos

o Cariotipar os espécimes coletados. o Identificar as regiões heterocromáticas e Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON). o Realizar o mapeamento físico dos genes DNAr 5S e DNAr 18S. o Mapear a distribuição cromossômica dos elementos transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 nos espécimes coletados. o Verificar se há variações citogenéticas entre as localidades em que os exemplares foram coletados.

2. Material e Métodos

2.1 Material

2.1.1 Coletas

Treze espécimes foram coletados em quatro diferentes localidades da Volta Grande do Xingu, município de Altamira, estado do Pará, conforme o mapa apresentado na Figura 2. Nas localidades 1, 2, 3 e 4 foram coletados 1 (macho), 3 (2 machos e 1 fêmea), 3 (1 macho, 1 fêmea e 1 não identificado) e 6 (2 machos, 2 fêmeas e 2 não identificados) espécimes respectivamente. A localidade 1 situa-se no rio Bacajá, as 2 e 3 em uma região chamada Jericoá e a 4 em uma região chamada Ilha da Fazenda. A coleta foi realizada através de mergulhos livres nas corredeiras em áreas de pedrais. As coletas foram feitas com autorização do ICMBio SISBIO (10609- 1/2007) em nome de Eliana Feldberg. Para realização dos procedimentos experimentais com os espécimes foi obtido o “Parecer Consubstanciado Sobre Protocolos de Pesquisas no Uso de Animais” de número 12

030/2013. Os espécimes foram depositados na Coleção Ictiológica do INPA com números de tombamento: INPA 43926, 43927, 43928 e 43929.

Figura 2. Mapa da volta grande do Xingu. Os círculos vermelhos indicam as localidades de coleta. As localidades 1, 2, 3 e 4 equivalem respectivamente ao rio Bacajá, Jericoá - a, Jericoá - b e Ilha da Fazenda. O quadrado preto representa a localização do município de Altamira.

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2.2 Métodos

2.2.1 Indução mitótica

A técnica utilizada para a indução de mitoses foi a descrita para peixes por Oliveira et al. (1988). Esta técnica consiste na aplicação de uma solução de fermento biológico (0,5g de fermento e 0,5g de açúcar diluídos em 10ml de água destilada) incubada por 20 minutos em estufa a 37ºC. A solução foi injetada intramuscularmente na região dorso-lateral do peixe, na proporção de 1ml para 100g de massa do animal. O peixe foi mantido em aquário aerado por 24 horas e consecutivamente submetido ao protocolo de obtenção de cromossomos mitóticos.

2.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos

Para obtenção dos cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica “air drying” modificada para peixes por Bertollo et al. (1978), que consiste em injetar intraperitonialmente uma solução aquosa de colchicina 0,025% na proporção de 1ml para cada 100g de massa do animal e manter o peixe em aquário aerado por 45 minutos. Em seguida o animal é anestesiado com óleo de cravo (Eugenol) e sacrificado. O rim cefálico é então retirado e armazenado em cubetas de vidro contendo 10ml de solução hipotônica de cloreto de potássio (0,075M). Posteriormente o material é bem dissociado com o auxílio de uma seringa de vidro sem agulha, para uma melhor separação dos blocos celulares. A suspenção obtida é levada para estufa ou banho maria a 37ºC por 30 minutos, ressuspendida com o auxílio de uma pipeta pasteur e transferida para um tubo de centrífuga, onde se deve adicionar 8 gotas de fixador Carnoy (metanol e ácido acético 3:1) recém preparado e na temperatura de 4ºC. As suspensões devem ser centrifugadas durante 10 minutos a 900rpm e o sobrenadante deve ser descartado. Depois dessa etapa adiciona-se 8ml de fixador Carnoy e o material é novamente ressuspendido, centrifugado e o sobrenadante descartado por mais duas vezes. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante, adiciona- se 1,5ml de fixador, ressuspende e armazena em tubos tipo eppendorf a uma temperatura de -10ºC. 14

2.2.3 Coloração convencional (Giemsa)

Para a preparação das lâminas, as mesmas foram lavadas, secas e posteriormente aquecidas a 60ºC em banho-maria. Em seguida a suspensão celular foi gotejada sobre a lâmina. As lâminas secaram naturalmente ao ar e em seguida foram coradas com Giemsa diluído a 10% em tampão fosfato, pH 6,8 a 0,06M por 10 minutos e secas novamente ao ar, e então observadas ao microscópio. Os cromossomos foram classificados em metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos, de acordo com Levan et al. (1964).

2.2.4 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (Ag-RON)

Para a caracterização das regiões organizadoras de nucléolos (RON) foi utilizada a técnica descrita por Howell e Black (1980), que consiste em pingar sobre a lâmina contendo a preparação cromossômica 1mL de uma solução coloidal, obtida com 1g de gelatina comercial sem sabor dissolvida em 50mL de água destilada, e acrescida de 0,5mL de ácido fórmico. Em seguida foi adicionada sobre a solução coloidal 2mL de solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 50%, agitando levemente as lâminas que foram posteriormente cobertas com lamínula. As lâminas foram acondicionadas em câmara úmida e levadas à estufa a 60ºC por um período de 5 a 7 minutos até atingirem uma coloração marrom dourada, sendo então lavadas em água destilada até que a lamínula seja removida. As lâminas secaram diretamente ao ar.

2.2.5 Detecção das regiões de heterocromatina constitutiva em cromossomos mitóticos

Para a caracterização da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de banda C descrita por Sumner (1972). As lâminas, contendo as preparações cromossômicas, foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 46ºC, lavadas em água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Em seguida foram incubadas a 46ºC em solução de hidróxido de bário a 5%, filtrada e recém- p r e p a r a d a , por 40 segundos. A ação do hidróxido de bário foi interrompida imergindo rapidamente as lâminas em solução de HCl 0,2N (46ºC) sendo 15 posteriormente lavadas em água destilada. Após secas, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trissódico 0,03M, pH 6,8) em banho-maria a 60ºC, por um período de 15 minutos sendo posteriormente lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida foram coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 10 minutos, lavadas em água de torneira e secas novamente ao ar.

Citogenética Molecular

2.2.6 Extração de DNA

Para a extração de DNA foi utilizado o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989) para o qual aproximadamente 20mg de tecido muscular foi utilizado. O tecido foi fragmentado em pequenos pedaços e para dissolvê-lo foi utilizado o tampão de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM). Em seguida foram acrescentados: 15µL de proteinase K (10 mg/mL) e 10µL de RNAse A (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente digerido e posteriormente foram feitas lavagens sucessivas com fenol clorofórmio e clorofórmio hidratado (500μL de cada um destes reagentes). Após a lise, o DNA foi separado das proteínas por precipitação salina juntamente com centrifugação a 14000rpm, sendo adicionados em seguida 600μL de Isopropanol 100% gelado para precipitação do sobrenadante, juntamente com uma etapa de centrifugação. Ao final o DNA foi hidratado em 100μL de água milli-Q, sendo feita em seguida a eletroforese com gel de agarose a 1%, corado com GelRed Acid Gel Stain Biotium (1:500), para estimar a integridade do material (com tampão Tris-Borato- EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos). A visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency). O DNA extraído também foi quantificado em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare).

2.2.7 Preparação das sondas de DNAr 18S e 5S

As sondas 18S e 5S foram amplificadas por PCR (Polymerase Chain Reaction). Para a amplificação do rDNA 18S foram utilizados os primers 18Sf (5’- 16

CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT-3’) e 18Sr (5’-CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA-3’) (Gross et al. 2010). A sonda foi i s o l a d a e marcada com Digoxigenina- 11-dUTP (Roche Applied Science) pelo método Nick translation e a detecção do sinal de hibridação foi realizada usando anti-digoxigenina-rodamina (Roche Applied Science). Os parâmetros para marcação e amplificação foram: 31µl de água Milli-Q, 5µl de tampão da enzima Taq polimerase (10X), 5µl de MgCl2 (25mM), 1µl de dATP, dCTP e dGTP e 0,7µl de dTTP (2mM cada), 0,8µl de Digoxigenina-11-dUTP, 1µl de cada primer (10mM), 0,5µl de Taq polimerase (5U/µL) e 2µl de DNA molde. Total da reação: 50µl. O programa de PCR seguiu as seguintes especificações:

94º C ---- 2 min 95º C ---- 45 seg 34 ciclos 52,1º C ---- 45 seg 72º C ---- 1 min e 30 seg 72º C ---- 5 min 12º C ---- manutenção

Para a amplificação do rDNA 5S foram utilizados os primers 5Sa (5’ TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’) e 5Sb (5’-CAGGCT GGT ATG GCC GTA AGC- 3’) (Martins e Galetti Jr. 1999). A sonda foi marcada com Biotina-16- dUTP (Roche Applied Science) por Nick translation, a detecção do sinal de hibridação foi realizada usando Avidina-fluoresceína conjugada (FITC) e os parâmetros para marcação e amplificação foram: 33µl de água Milli-Q, 2µl de tampão da enzima Taq polimerase (10X), 5µl de MgCl2 (25mM), 1µl de dATP, dCTP e dGTP e 0,5µl de dTTP (2mM cada), 2µl de Biotina-16-dUTP, 1µl de cada primer (10mM), 0,5µl de Taq polimerase (5U/µL) e 2µl de DNA molde. Total da reação: 50µl. O programa de PCR utilizado apresentou as seguintes condições: 95ºC ---- 5 min 95ºC ---- 1 min 34 ciclos 55ºC ---- 45 seg 72ºC ---- 1 min 72ºC ---- 7 min 12ºC ---- manutenção 17

Os produtos gerados foram visualizados em gel de agarose 1%.

2.2.8 Identificação dos elementos transponíveis Rex1, Rex3 e Rex6 através de PCR (Polymerase Chain Reaction)

Para amplificação de elementos transponíveis já identificados e caracterizados como conservados em outras espécies de peixes, foram utilizados os primers de: Rex1 (RTX1-F1 5’ TTC TCC AGT GCC TTC AAC ACC e RTX1- R3 5’ TCC CTC AGC AGA AAG AGT CTG CTC) (Volff et al. 2000), Rex3 (RTX3-F3 5’ CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG e RTX3-R3 5’ TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) e Rex6 (Rex6-Medf1 5` TAA AGC ATA CAT GGA GCG CCAC e Rex6-Medr1 5’ GGT CCT CTA CCA GAG GCC TGGG) (Volff et al. 1999, 2000, 2001c, 2001b). A amplificação e marcação dos elementos transponíveis foi feita de acordo com os seguintes parâmetros: 17,5µl de água Milli-Q, 2,5µl de tampão da enzima

Taq polimerase (10X), 1µl de MgCl2 (25mM), 0,5µl de dATP, dCTP e dGTP e 0,5µl de dTTP (2mM cada), 0,5µl de Digoxigenina-11-dUTP, 0,5µl de cada primer (10mM), 0,3µl de Taq polimerase (5U/µL) e 1µl de DNA molde. Ao final, o produto da PCR foi observado em gel de agarose a 1%. T o t a l d a r e a ç ã o : 2 5 µL. O programa de PCR utilizado apresentou as seguintes condições:

95º C -- 5 min 95º C -- 40 s 34 ciclos 55º C -- 40 s 72º C -- 2 min 72º C -- 5 min 4º C --Manutenção

2.2.9 Hibridização in situ por fluorescência (FISH)

A Hibridização in situ por fluorescência foi realizada seguindo o protocolo de Pinkel et al. (1986) com adaptações. As preparações cromossômicas foram pingadas nas lâminas e estas secas naturalmente. Em seguida as lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x durante 5 minutos em temperatura ambiente, 18 sendo depois desidratadas em séries alcoólicas 70, 85 e 100%, 5 minutos cada e secas ao ar. Em seguida foram incubadas em 90μl de RNAse (0,4% RNAse/2xSSC) a 37 °C por 1h em câmara úmida. Após este processo, as lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC por 5 minutos cada e em PBS 1x também por

5 minutos. Em seguida foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1x/50mM MgCl2 durante 10 minutos à temperatura ambiente e lavadas em PBS 1x por 5 minutos, sendo posteriormente desidratadas em série alcoólica gelada (70, 85, 100 %) por 5 minutos cada. Simultaneamente a desidratação em série alcoólica, a solução de hibridação que contém formamida 100% (concentração final 50%), sulfato de dextrano 50%, 20xSSC (concentração final de 2xSSC), as sondas marcadas e água milli-Q foi desnaturada a 99ºC por um período de 10 min e imediatamente acondicionada em gelo. Após esta etapa o DNA cromossômico foi desnaturado com formamida 70% em 2xSSC a 73ºC por 6 min e desidratado em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5 minutos cada, secando ao ar. A solução de hibridação foi colocada sobre a lâmina com os cromossomos desnaturados e incubada em câmara úmida a 37ºC por aproximadamente 16-18 horas. Decorrido este tempo as lâminas foram lavadas duas vezes em formamida 15% a 42ºC durante 10 minutos e após esta etapa foram lavadas em Tween 0,5% por 5 minutos. As lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos, para a detecção do sinal, e depois lavadas duas vezes com Tween 0,5% por cinco minutos cada. Um mix contendo os anticorpos específicos (anti digoxigenina-rodamina (1:200) + FITC Avidina para double FISH e anti digoxigenina-rodamina (1:200) para os Rex) e o tampão C foi colocado sobre as lamínulas sobre as quais, as lâminas com as preparações cromossômicas foram colocadas e em seguida incubadas por 60 minutos a 37ºC. Finalizada esta etapa, as lâminas foram lavadas 3 vezes com Tween 0,5% à temperatura ambiente por 5 minutos cada, desidratadas em série alcoólica gelada (-20ºC) 70, 85 e 100% durante 5 minutos cada e após secas, montadas com antifade (Vectashield) e DAPI, sendo por fim cobertas com lamínulas. A análise das lâminas se deu no microscópio de epifluerescência Olympus BX51 e as imagens foram capturadas com câmera digital acoplada (Olympus DP71). As metáfases foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS6 e classificadas de acordo com Levan et al. (1964).

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3. Resultados

A análise das metáfases submetidas à coloração convencional revelou que a espécie Baryancistrus xanthellus apresenta o número diploide igual a 52 cromossomos, com fórmula cariotípica de 16m+28sm+8st, número fundamental (NF) igual a 104 para machos e fêmeas e não foram observados cromossomos sexuais diferenciados. Também não houve diferença de número diploide e fórmula cariotípica entre os espécimes coletados nas diferentes localidades (tabela 1 e figura 3). A detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo, por impregnação com nitrato de prata (AgNO3), revelou um sistema simples, com marcações localizadas na porção intersticial do braço curto do quarto par metacêntrico de todos os indivíduos analisados. Heteromorfismo referente ao tamanho da RON foi observado em espécimes das localidades 2 e 4 (figura 3). As regiões ricas em heterocromatina constitutiva foram encontradas na posição pericentromérica da maioria dos cromossomos e grandes blocos foram encontrados em quase todo o braço curto do par 1 e braço longo do par 10. Também foi observada a co-localização de ambos rDNA (18S e 5S) com heterocromatina nos espécimes de todas as localidades (Figura 4a e 4b).

O mapeamento do DNAr 18S confirmou a marcação da RON pelo AgNO3, ou seja, na região interstici al do braço curto do quarto par metacêntrico. Esse resultado apresentou-se igual para todos os espécimes de todas as localidades. Assim como na RON, heteromorfismo referente ao tamanho das marcações foi encontrado em espécimes das localidades 2 e 3 (figura 5). O mapeamento do DNAr 5S resultou em marcação simples na região pericentromérica do sétimo par metacêntrico, para todos os espécimes analisados (figura 5). Para todos os espécimes analisados, os retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 apresentaram um padrão disperso em todos os cromossomos, não havendo a formação de blocos nem a predominância de marcações em cromossomos específicos. A intensidade do sinal foi maior para o Rex1, indicando a maior quantidade deste retroelemento nos espécimes, seguido dos Rex3 e Rex6 em quantidades semelhantes (Figura 6).

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Tabela 1. Contagem de metáfases para a definição do número diploide (2n), fórmula cariotípica e identificação do par da Região Organizadora de Nucléolo (RON) para os espécimes coletados em cada uma das quatro localidades. M=macho; F=fêmea; m=metacêntrico; sm=submetacêntrico; st=subtelocêntrico; p=braço curto.

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Figura 3. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos à coloração convencional com Giemsa. As letras a, b, c e d referem-se respectivamente às localidades 1, 2, 3 e 4. Os quadros destacados indicam o par da RON, detectado por impregnação por nitrato de prata. 22

Figura 4a. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos ao bandamento C para identificação das regiões heterocromáticas. As letras a e b referem-se às localidades 1 e 2. 23

Figura 4b. Cariótipos de Baryancistrus xanthellus submetidos ao bandamento C para identificação das regiões heterocromáticas. As letras c e d referem-se às localidades 3 e 4. 24

Figura 5. Mapeamento dos rDNA 18S (sinal vermelho) e 5S (sinal verde) por double FISH. As letras a, b, c e d referem-se respectivamente às localidades 1, 2, 3 e 4. 25

Figura 6. Mapeamento dos retroelementos Rex1 (a), Rex3 (b) e Rex6 (c), sinal vermelho, através da hibridização in situ por Fluorescência. 26

4. Discussão

Para a família Loricariidae é relatada a existência de dados citogenéticos para cerca de 10% do total estimado de espécies (Reis et al. 2003; Kavalco et al. 2005) e estes mostram uma grande diversidade cariotípica em relação ao número diploide, que varia de 34 (Hypostominae) a 96 (Delturinae) (Kavalco et al. 2004; de Oliveira et al. 2009). O número diploide igual a 54 cromossomos, em sua maioria com dois braços, representa a condição plesiomórfica para este grupo de peixes já que é encontrado nos gêneros basais e no grupo externo, a família Trichomycteridae (Artoni e Bertollo 2001; Alves et al. 2005; Kavalco et al. 2005). Esses dados corroboram a proposta filogenética mais aceita até então para Loricariidae, de Armbruster (2004). Na subfamília Hypostominae, no entanto, poucas espécies apresentam 2n=54 cromossomos. Se compararmos as tribos Ancistrini e Hypostomini é possível observar tendências evolutivas distintas em relação à organização do conjunto cromossômico. Enquanto Ancistrini apresenta 2n≤54, indicando que a carioevolução ocorreu por meio de fusões cêntricas (Mariotto et al. 2011), em Hypostomini todas as espécies estudadas até então apresentam 2n≥54, indicando o processo inverso, no qual as fissões cêntricas foram responsáveis pelo aumento do número diploide (Artoni e Bertollo 1996; 2001). Para a tribo Ancistrini (subfamília Hypostominae) o número diploide mais frequente é 52 cromossomos, s e n d o a maioria com dois braços. Isto foi verificado na espécie estudada no presente trabalho e em outras de diferentes gêneros como Peckoltia, Hemiancistrus, Hypancistrus, Scobinancistrus e Panaque. Ancistrus é o gênero mais especioso e sua diferenciação cariotípica geralmente está associada a uma redução do número diploide, que pode variar de 34 a 54 (Oliveira et al. 2007; 2008; Mariotto et al. 2009). Apesar da tendência de manutenção do número diploide, com exceção de Ancistrus, há uma grande variação entre as fórmulas cariotípicas (Artoni e Bertollo 2001; Alves et al. 2003; 2006; Souza et al. 2004; 2009; de Oliveira et al. 2007). Os autores sugerem que a redução do número diploide para 2n=52 em Ancistrini deveu-se provavelmente a processos de fusão cêntrica e que inversões pericêntricas e paracêntricas foram os principais rearranjos que geraram as diferentes fórmulas cariotípicas encontradas 27 nas espécies dessa tribo (Alves et al. 2003; de Oliveira et al. 2007; 2008; Mariotto et al. 2009; Bueno et al. 2012; Ziemniczak et al. 2012). Devido a esta grande variação, a tribo Ancistrini é considerada pouco conservada em relação à sua estrutura cariotípica. A diferenciação cariotípica destas espécies pode, portanto, estar associada a processos de especiação morfológica indicando que rearranjos cromossômicos como fusões, inversões, deleções, duplicações e heterocromatinização podem contribuir na diferenciação do grupo (Artoni e Bertollo 2001; Milhomem et al. 2010; Mariotto et al. 2011; Bueno et al. 2012; Ziemniczak 2011). Segundo Ziemniczak (2011), esta grande diversificação cariotípica pode desempenhar um importante papel no isolamento genético e reprodutivo das espécies de Ancistrini. Baryancistrus xanthellus não conserva o número diploide considerado ancestral para a família (2n=54), mas o considerado ancestral para a tribo (2n=52) e a Região Organizadora de Nucléolo (RON) é simples e localizada em posição intersticial. A RON foi positiva para banda C, diferente de outras espécies como do gênero Peckoltia que têm um bloco heterocromático adjacente à RON (Souza et al. 2009). Nenhuma diferença cariotípica foi observada entre os indivíduos das quatro localidades. O mesmo ocorreu com dados moleculares, que não indicaram estruturação entres as diferentes populações e morfotipos de Baryancistrus xanthellus, o que sugere que o isolamento e posterior acúmulo de diferenças na coloração entre as populações ocorreram em um tempo ainda recente, não sendo detectados com o COI (Ribeiro comunicação pessoal). Artoni (1996) sugeriu que a localização da RON terminal no braço longo de um único par metacêntrico é possivelmente uma característica basal para Loricariidae. Entretanto Alves et al. (2003) encontraram pela primeira vez RON em posição intersticial em Ancistrini (Ancistrus n.sp.1). Este fenótipo também podia ser encontrado frequentemente em espécies de Neoplecostominae, Hypoptopomatinae (Alves 2000) e em algumas outras espécies de Hypostominae (Artoni e Bertollo 1996). Essa presença frequente de RON intersticiais em diversas espécies de Loricariidae e grupos relacionados levou Alves et al. (2003) a sugerirem que esta seria uma característica primitiva para esta família. Em Ancistrini a localização das RON em posição terminal do braço longo é mantida para a maioria das espécies (Artoni e Bertollo 1996; Alves 2000; Alves 28 et al. 2003). Esta característica é observada frequentemente nos gêneros Hypancistrus, Scobinancistrus, Hemiancistrus e Peckotlia (de Oliveira et al. 2006; Souza et al. 2009; Cardoso et al. 2013; Silva et al. 2014). Entretanto, estudos mais recentes, incluindo este, apontam que há muitas espécies que apresentam RON localizadas no braço curto, em posição intersticial ou terminal, como por exemplo, espécies dos gêneros Ancistrus, Hemiancistrus, Megalancistrus e Panaque (Lara 1998; Artoni e Bertollo 2001; de Oliveira et al. 2009, 2006). Esta diversidade de localização e número de RON reflete a grande diversidade em Loricariidae, principalmente nos grupos derivados, como a tribo Ancistrini. No gênero Baryancistrus a RON está localizada em posição intersticial do braço curto do terceiro par metacêntrico em B. niveatus (Souza et al. 2004) e no quarto par metacêntrico em B. xanthellus (presente trabalho). Como citado anteriormente, este caráter não pode ser considerado específico para cada gênero, visto que espécies do mesmo gênero podem apresentar marcações em localizações completamente diferentes. Em Ancistrus e Hemiancitrus, por exemplo, são encontradas marcações simples nos braços curtos, braços longos ou ainda marcações múltiplas (de Oliveira et al. 2006, 2009). Heteromorfismo quanto ao tamanho da RON entre os cromos s o mo s h o mó l o g o s é frequente em Loricariidae, principalmente em casos de RON simples, como em algumas espécies de Hypoptopomatinae e Neoplecostominae. Em Hypostominae pode ser encontrado esse heteromorfismo em espécies com RON múltiplas (Artoni e Bertollo 1996; Alves et al. 2003; Rubert et al. 2008; Milhomem et al. 2010; Ziemniczak et al. 2012; Mariotto et al. 2009; 2011; de Oliveira 2006). No presente trabalho, em alguns espécimes de B. xanthellus a RON foi heteromórfica em relação ao tamanho, comparando-se os homólogos. Souza et al. (2004) também encontraram uma situação semelhante em alguns espécimes de B. niveattus. Segundo Mariotto et al. (2013), a diferença de tamanho verificada na RON de várias espécies da tribo Ancistrini, provavelmente seja uma característica relacionada com uma ancestralidade comum, uma vez que é compartilhada por muitos táxons na família Loricariidae. Este heteromorfismo é muito comum em peixes neotropicais (Foresti et al. 1981; Almeida-Toledo et al. 2000) e tem sido explicado como uma duplicação dos genes ribossomais ou um processo de acúmulo desses genes em um dos homólogos por crossing-over 29 desigual (Foresti et al. 1981; Almeida-Toledo et al. 2000; Swarca et al. 2001). Isto pode acontecer devido a presença de heterocromatina constitutiva entre os genes ribossomais, que pode possibilitar permutas desiguais entre as cromátides (Sola et al. 1988) ou pelo acúmulo de heterocromatina constitutiva em posição adjacente à RON (Vicari et al. 2008). O estudo da heterocromatina constitutiva em peixes tem fornecido importantes informações para a compreensão da evolução cariotípica deste grupo (Kavalco et al. 2004), tem se mostrado eficiente na identificação de polimorfismos e revelado a variabilidade intrapopulacional para algumas espécies da ictiofauna (Mantovani et al. 2000). Em Loricariidae a quantidade e a distribuição da heterocromatina é amplamente variável. Ziemniczak et al. (2012) sugeriram que a ausência de grandes e numerosos blocos de heterocromatina parece ser um caráter cariotípico plesiomórfico em Loricariidae. Analisando espécies de alguns gêneros de Neoplecostominae, considerados basais para a família, observou-se uma menor quantidade de heterocromatina se comparado a uma espécie de Hypoptopomatinae. Comparando-se espécies dessas duas subfamílias com espécies derivadas dos gêneros Hypostomus e Ancistrus, a quantidade de heterocromatina também foi menor (Artoni e Bertollo 1999; de Oliveira 2006; de Oliveira et al. 2008; Mariotto et al. 2009; Traldi et al. 2012). A condição de pouca quantidade de heterocromatina encontrada nos gêneros basais é t a mb é m compartilhada com a família Trichomycteridae (Primo 2009). Em B. xanthellus, todos os espécimes analisados apresentaram pequenos blocos heterocromáticos na posição centromérica da maior parte dos pares cromossômicos. G randes blocos foram observados no braço curto do par 1 e no braço longo do par 10. Também foram observadas marcações conspícuas com os sítios de DNAr 18S e 5S (pares 4 e 7 respectivamente) de todos os espécimes. No segundo par de um espécime da localidade 3, além da marcação pericentromérica, houve mais uma na região distal do braço longo (figura 4b). Situação semelhante foi encontrada por Traldi et al (2012) para Hypostomus iheringii, na qual os pares 1 e 5 apresentaram diferentes padrões de bandamento C entre diferentes espécimes. Em algumas espécies de Astyanax (Characidae) uma grande variação das regiões heterocromáticas foi observada entre os espécimes (Mantovani et al. 2000; Kantek et al. 2008; Hashimoto e Porto- 30

Foresti 2010). De acordo com Mantovani et al. (2000), essa variação pode ser resultado de heterocromatinização (King 1980), crossing over desigual (Smith 1976), amplificação, acúmulo e eliminação de sequências heterocromáticas (John 1988). Além desses fatores, outro que não pode ser desconsiderado é a ação dos elementos transponíveis nos genomas (Hashimoto e Porto-Foresti 2010). Uma possível explicação para o aparecimento de blocos heterocromáticos na região terminal do braço longo do par 2 em um espécime da localidade 3 poderia ser o modelo proposto por Schweizer e Loidl (1987), no qual a orientação dos cromossomos durante a interfase (Orientação de Rabl) permitiria a transferência de heterocromatina entre locais equidistantes de cromossomos não homólogos. Um padrão de banda-C semelhante ao de B. xanthellus foi observado em B. niveattus, na qual blocos conspícuos foram observados na região pericentromérica de grande parte dos pares cromossômicos. Os pares 1 e 10, assim como em B. xanthellus, apresentaram um dos braços quase totalmente heterocromático, sendo a principal diferença entre as duas espécies a presença de grandes blocos heterocromáticos nos pares 11 e 22 em B. niveattus (Souza et al. 2004). Nas espécies de Ancistrus estudadas por de Oliveira (2006) houve uma grande diversidade nos padrões de heterocromatina em relação à distribuição e ao tamanho dos blocos, sendo esses padrões distintos para cada espécie analisada. Em estudos mais recentes foi possível verificar a presença de grandes blocos heterocromáticos em dois ou mais pares cromossômicos nos gêneros Scobinancistrus, Hypancistrus e especialmente em Peckotlia (Souza et al. 2009; Cardoso et al. 2013; Silva et al 2014). Esta característica parece ser comum à tribo Ancistrini e corrobora com a sugestão proposta por Ziemniczak et al. (2012), que uma maior quantidade de heterocromatina, organizada em grandes blocos é comum aos grupos derivados de Loricariidae. Nos eucariotos existem duas classes de genes ribossomais, compostas por sequências repetidas em tandem. Uma delas é a de rDNA 45S, que inclui os genes 18S, 5,8S e 28S, separados por espaçadores intergênicos não transcritos. A outra classe é o rDNA 5S (Long e David 1980). O mapeamento físico dessas sequências é uma ferramenta bastante útil em estudos evolutivos e citotaxonômicos devido a aparente conservação molecular e da localização dos genes ribossomais entre grupos de organismos estreitamente relacionados (Traldi 31 et al. 2013). Em Siluriformes o mapeamento dos genes ribossomais 18S e 5S ainda é muito escasso (Kavalco et al. 2004; Centofante et al. 2006; Mendes -Neto et al. 2011). Em Loricariidae, cromossomos com marcações sintênicas dos DNAr 18S e 5S foram observadas em espécies de Neoplecostominae, Hipoptopomatinae (Ziemniczak 2012), Loricariinae (Kavalco et al. 2004), Hypostominae (tribos Ancistrini e Hypostomini) (Mariotto et al. 2011; Traldi et al. 2013) e também no grupo externo, Trichomycteridae (Ziemniczak 2012). Com base nestes dados, Ziemniczak (2012) inferiu que a sintenia destas classes de DNAr em um único par de cromossomos é um estado primitivo para a família. Em B. xanthellus a hibridização simultânea das duas sondas (double- FISH) confirmou a marcação da RON pela impregnação por AgNO3 (DNAr 18S) na posição intersticial do braço curto do quarto par metacêntrico, enquanto que a hibridização da sonda DNAr 5S apresentou sua localização na região pericentromérica do sétimo par metacêntrico, não havendo diferença entre as diferentes localidades e nem entre machos e fêmeas (Figura 5). Essa distribuição dos DNAr em diferentes pares cromossômicos, configura então, uma apomorfia em Loricariidae, segundo Ziemniczak et al. (2012). Na tribo Ancistrini espécies de apenas dois gêneros, até então, possuem mapeamento do DNAr 5S: Ancistrus (Mariotto et al. 2011; Favarato 2014) e Hypancistrus (Silva et al. 2014). Nessas espécies, o mapeamento se deu por double-FISH (DNAr 18S e 5S). Esta é a forma mais precisa de atestar de forma definitiva a co-localização, ou não, dos genes ribossomais (Reis et al. 2012). Assim como observado para a Ag-RON e DNAr 18S, o DNAr 5S também se apresenta de forma variável entre as diferentes espécies de Ancistrini. Em um trabalho realizado por Mariotto et al. (2011), no qual foram hibridizadas as sondas de DNAr 18S e 5S em sete espécies de Ancistrus, todas apresentaram marcações do DNAr 18S em apenas um par. Entretanto, apenas uma espécie apresentou um único par contendo o 5S, Ancistrus sp. 06. Esta mesma espécie também apresentou sintenia entre os dois genes ribossomais. As demais espécies apresentaram dois ou três pares nos quais se localizavam o DNAr 5S, sendo que em três dessas espécies um dos pares apresentou sintenia das marcações do 5S e 18S. Em relação à posição no cromossomo o 5S também se mostrou variável ocupando porções pericentroméricas, intersticiais ou terminais. Favarato (2014) também 32 observou situações semelhantes com outras sete espécies de Ancistrus. Em Hypancistrus cf. debilittera e H. zebra o mapeamento do DNAr 5S revelou marcações em dois pares de cromossomos, entretanto, em H. cf. debilittera um dos pares apresentou duas marcações intersticiais no braço longo em todos os espécimes, variando às vezes o tamanho. Não foi encontrada sintenia com o DNAr 18S em ambas espécies. Em H. zebra apenas um par apresentou marcação do DNAr 18S na porção terminal do braço longo, enquanto que em H. cf. debilittera quatro espécimes apresentaram marcação em um par, em alguns casos duas no mesmo par, e uma apresentou uma marcação extra em apenas um dos homólogos de outro par. A combinação das variações das marcações dos genes ribossomais gerou em H. cf. debilittera cinco diferentes padrões (Silva et al. 2014). A existência de sítios múltiplos do DNAr 5S em diversas espécies pode ser considerada um importante indicativo da enorme diversidade cariotípica presente em Ancistrini, e deve corresponder a uma condição apomórfica no grupo. Estas variações quanto ao número e localização de sítios ribossomais podem ser resultados de diversos processos, como eventos de transposição, inversões pericêntricas e paracêntricas, translocações e são importantes para a compreensão da diversidade cromossômica da tribo Ancistrini (Mariotto et al 2011). Os estudos existentes até então apontam que a localização do DNAr 5S em um único par cromossômico ocorre na tribo Ancistrini mas em menor proporção que marcações múltiplas e até então foi encontrada apenas em algumas espécies do gênero Ancistrus, apesar de não se apresentar como padrão para este gênero (Mariotto et al. 2011; Favarato 2014). Para o gênero Baryancistrus este é o primeiro registro de mapeamento do rDNA 5S, que se apresentou como marcação simples, contrastando com a maior parte das espécies de Ancistrini já estudadas. De acordo com Martins e Galetti Jr. (1999) a localização dos genes ribossomais em cromossomos diferentes pode ser vantajosa se comparada à disposição sintênica, pois pode evitar rearranjos desfavoráveis (Dover 1986), já que a ocorrência de crossing-over desigual pode ser frequente em cromossomos com genes ribossomais co-localizados. A associação do DNA ribossomal com heterocromatina é uma característica recorrente na história evolutiva de peixes neotropicais (Vicari et al. 2003). Em 33 alguns casos os blocos heterocromáticos podem estar adjacentes às regiões nucleolares, enquanto que em outros as marcações podem estar sobrepostas ou intercaladas (Artoni e Bertollo 1999; Pendàs et al. 1993a; b). A associação dos DNAr com heterocromatina, a qual apresenta grandes quantidades de DNA satélite e elementos transponíveis (Dimitri et al. 2009), pode facilitar acontecimentos de transposição que podem mover a RON para outras regiões do genoma (Moreira-Filho et al. 1984; Vicari et al. 2008; Gross et al. 2009; 2010), favorecer a duplicação de genes e crossing over desigual, podendo levar à variação de tamanho dos segmentos de heterocromatina, bem como do número de cistrons de DNAr (Sola et al. 1988; Vicari et al. 2003; 2008). Comparando os cariótipos apresentados nas figuras 4a, 4b e 5 é possível observar a nítida associação de blocos heterocromáticos com a localização dos DNAr 18S e 5S nos espécimes de B. xanthellus. Como mencionado anteriormente, o DNAr 18S, equivalente à RON detectada pela impregnação por AgNO3, apresentou heteromorfismo de tamanho entre os homólogos em alguns espécimes. Isto provavelmente se deu pela presença da heterocromatina associada aos genes ribossomais nesses espécimes, o que permitiu a ocorrência de permutas desiguais, causando o heteromorfismo em relação ao tamanho (Sola et al. 1988). Isto também foi observado por de Oliveira (2006) em diversas espécies de Ancistrus. O mapeamento cromossômico de elementos transponíveis em peixes tem mostrado que tais sequências podem ser encontradas associadas à heterocromatina ou dispersas nos cromossomos. Esses elementos têm uma importante influência na evolução de diversos organismos, atuando em rearranjos cromossômicos, regulação gênica, diferenciação sexual e causando mutações estruturais, o que gera, muitas vezes, grandes mudanças no genoma de seus hospedeiros e promove domesticação molecular (Ferreira et al. 2011). Ferreira et al. (2011), em uma revisão sobre elementos transponíveis no genoma de peixes, concluíram que em espécies pertencentes a linhagens basais e com grandes genomas, os elementos transponíveis geralmente se apresentam dispersos nos cromossomos ocupando também regiões eucromáticas. Já e m espécies pertencentes a grupos derivados, com genomas mais compactos, é evidente a compactação destes elementos especialmente em sequências heterocromáticas. Uma explicação dada para esta observação é que em regiões 34 pobres em genes, por sofrerem menos pressão seletiva, a presença dos elementos transponíveis acaba sendo mais tolerada. Além disto, a presença e a natureza dos elementos repetitivos podem atuar como gatilho para a formação da heterocromatina (Dorer e Henikoff 1994; Selker 2002; Slotkin e Martienssen 2007). Para a família Loricariidae, estudos relativos ao mapeamento de elementos transponíveis ainda são muito escassos. O mapeamento dos Rex1 e Rex3 em três espécies de Hypoptopomatinae revelou uma organização dispersa destes elementos tanto em regiões eucromáticas como em regiões heterocromáticas, sendo que o Rex3 apresentou-se ainda mais disperso que o Rex 1 nas três espécies analisadas. Os autores sugeriram que esta distribuição semelhante dos dois retroelementos poderia ser devido a uma co-evolução dos mesmos (Ferreira et al. 2010). Alves et al. (2013) observaram em três espécies de Hypostomus que a hibridização do elemento Rex1 produziu sinais em vários cromossomos, revelando pequenas marcações dispersas nos cromossomos das espécies analisadas. Entretanto, algumas regiões apresentaram um acúmulo associado a regiões heterocromáticas e ao DNAr 5S. S egundo os autores, aparentemente este acúmulo não indica que o Rex1 apresenta um papel essencial na estrutura e organização dos domínios de heterocromatina. Em outras quatro espécies de Hypostomus, as localizações dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 também se mostraram dispersas nos cromossomos (Traldi 2012). Blanco (2012) também observou uma situação semelhante em espécies de Harttia, diferindo apenas na quantidade de marcações apresentadas, que foi muito maior se comparado à Hypoptopomatinae (Ferreira et al. 2010). Aparentemente esta pode ser uma condição compartilhada na família Loricariidae. Ainda, segundo Traldi (2012) o acúmulo de Rex em regiões eucromáticas pode estar associada à domesticação molecular pelos genomas hospedeiro em Hypostomus, fazendo com que estas sequências possam posteriormente adquirir novas funções regulatórias (Miller et al. 1997). Os elementos transponíveis também podem manter-se em regiões ricas em genes de forma neutra, sendo tolerados quando não apresentam efeitos deletérios ou qualquer influência sobre a regulação gênica (Rebollo et al. 2012). Em B. xanthellus, o mapeamento dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 por hibridação in situ por fluorescência revelou que estas sequências estão dispersas 35 apresentando um aspecto “pulverizado” em quase todos os cromossomos, tanto em regiões heterocromáticas quanto em eucromáticas, independente das localidades de coleta dos espécimes (Figura 6). Este dado corrobora os já descritos anteriormente para outras espécies de Loricariidae, que indicam que a presença destas sequências de forma dispersa no cariótipo pode ser uma característica comum à família (Traldi 2012; Blanco 2012; Alves et al. 2013). Entretanto, o mapeamento dos retroelementos Rex em Ancistrini é muito recente e escasso. Em Ancistrus os retroelementos Rex se mostraram organizados na forma de clusters concentrados principalmente nas porções finais e pericentroméricas dos cromossomos e também em algumas regiões eucromáticas, diferindo do padrão considerado mais comum para Loricariidae (Favarato 2014). Aparentemente não foi observada associação desses elementos transponíveis com o surgimento e diferenciação dos cromossomos sexuais em Ancistrus, diferentemente do observado por Blanco (2012). Este sugeriu o envolvimento dessas sequências em um processo de fissão que resultou na formação do cromossomo Y em Harttia. Em Hypancistrus zebra e Hypancistrus cf. debilittera, o Rex3 foi mapeado com o objetivo de verificar a associação entre a presença do retroelemento e os polimorfismos encontrados nesta última espécie (Silva et al. 2014). Os autores observaram que o Rex3 apresentou-se disperso na região eucromática, com alguns blocos um pouco mais compactados em alguns pares em H. zebra. Já em H. cf. debilittera foram encontrados grandes blocos com marcações, muitas vezes coincidentes com heterocromatina, contrastando assim como em Ancistrus, com o padrão disperso comum em Loricariidae. Acredita-se que espécies de ordens basais com genomas maiores tendem a apresentar os retroelementos Rex dispersos quando comparadas às de ordens derivadas, que apresentam genomas mais compactos (Ferreira et al. 2011). Em espécies da família Cichlidae o mapeamento dos elementos Rex mostrou que estes são preferencialmente agrupados em regiões pericentroméricas e frequentemente coincidentes com regiões heterocromáticas (Valente et al. 2011). Schneider et al. (2013) compararam a ocorrência destes elementos em espécies de tribos basais com espécies de tribos derivadas e sugeriram que estes estão sob ação de mecanismos evolutivos que tendem a acumulá-los em regiões cromossômicas específicas, especialmente em regiões heterocromáticas. Além 36 disso, os autores também observaram que as sequências nucleotídicas dos Rex1 e Rex3 foram mais conservadas em espécies basais como Cichla monoculus que em derivadas, como Symphysodon discus. O mapeamento físico de Rex3 em espécies de Notothenioidei resultou em uma distribuição homogênea das marcações, que se apresentaram espalhadas por todos os cromossomos, com um acúmulo sutil em algumas regiões. Apenas uma espécie, Notothenia coriiceps, apresentou um padrão de distribuição compartimentalizado nas regiões pericentroméricas. A espécie em questão apresenta um cariótipo derivado com um número reduzido de cromossomos, que por sua vez apresentam um grande tamanho e que possivelmente foram originados por rearranjos Robertsonianos. Os autores sugerem a associação destes rearranjos com a compartimentalização desses retroelementos (Ozouf-Costaz et al. 2004). Analisando a filogenia proposta por Armbrüster (2004) para a tribo Ancistrini ( F i g u r a 7 ) é possível observar que o gênero Ancistrus ocupa uma posição derivada enquanto que Baryancistrus ocupa uma posição basal. Além disso, o genoma das espécies de Ancistrus são mais c ompactos e há neste gênero uma tendência para a redução do número diploide, diferentemente do que ocorre com os outros gêneros da tribo. Possivelmente, situações semelhantes aos exemplos anteriores se apliquem também à tribo Ancistrini. Na qual a compactação do genoma das espécies derivadas, como as do gênero Ancistrus, esteja relacionada à compartimentalização dos retroelementos em detrimento às espécies basais, como B. xanthellus, que apresentam estas sequências dispersas nos cromossomos. Outra possibilidade seria que o padrão de compartimentalização dos Rex é uma característica exclusiva do gênero Ancistrus, o qual parece ter uma evolução paralela na tribo, enquanto que nas outras espécies o padrão disperso, comum à Loricariidae, seria mantido. De qualquer forma, ainda são necessários mais estudos referentes a estas sequências em Ancistrini, de modo que o mecanismo de evolução e organização dos retroelementos entre as espécies da tribo possa ser melhor esclarecido. De uma maneira geral, os dados deste trabalho e os poucos dados descritos na literatura para loricariídeos sugerem que esta diversidade vista nos padrões das marcações dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 entre as espécies de Ancistrini podem refletir a grande diversidade morfológica encontrada na tribo. Apesar de não serem encontradas variações citogenéticas entre os espécimes 37 das diferentes localidades, a partir dos marcadores utilizados no presente trabalho, as diferenças na coloração são claramente observadas e outras metodologias podem ser aplicadas para auxiliar no seu entendimento. Esta diversidade nos padrões de cor representa uma riqueza de valor inestimável e é importante não apenas a compreensão de sua origem, mas também a preservação destes padrões, dos quais alguns podem estar ameaçados pelas mudanças de hábitat provocadas pela construção da Usina Hidrelétrica de Belo monte.

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Figura 7. Árvore de máxima parcimônia com base em dados morfológicos proposta por Armbruster (2004) para a tribo Ancistrini.

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5. Conclusões

Não foram observadas variações citogenéticas entre os espécimes das quatro localidades, o que indica que os pedrais e corredeiras p o d e m não estar atuando como barreiras reprodutivas evitando assim o acúmulo de diferenças cromossômicas. B. xanthellus conserva o número diploide mais comum para a tribo Ancistrini, 2n=52. A RON simples no braço curto de um par metacêntrico e a presença de blocos heterocromáticos nos pares 1 e 10 são características compartilhadas p e l a s duas e s p é c i e s de Baryancistrus citogeneticamente caracterizadas até então. O mapeamento dos DNAr 18S e 5S resultou em marcações não sintênicas. Este dado corrobora o proposto para Loricariidae, que a não sintenia seria um caráter derivado, já que a tribo Ancistrini é uma das mais derivadas de Loricariidae, segundo Armbruster, 2004. Os retroelementos REX apresentaram um padrão disperso, característica considerada comum aos Loricariídeos. As semelhanças entre os padrões das três sequências indicam que podem estar evoluindo de maneira conjunta.

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6. Referências Bibliográficas

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