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Nota técnica: Método para la cuantificación del inóculo de Tilletia ayresii Berk. en maximum Jacq.

Technical note: Method for the quantification of Tilletia ayresii Berk. inoculum in Panicum maximum Jacq.

J.A. Borges1 y O. Camacaro2

1Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas del Estado Yaracuy, Venezuela. 2Fundación CIEPE, Venezuela

Resumen

El carbón en inflorescencias de Panicum maximum Jacq. es causado por el hongo Tilletia ayresii, el cual inhabilita la producción de semillas al formar aga- llas en los ovarios de las espículas. El objetivo del presente trabajo fue establecer un método para cuantificar la producción de inóculo de T. ayresii en inflorescencias de P. maximum. Se recolectaron espículas afectadas, a las cuales se les determi- nó la longitud, peso total, peso vacío y peso del inoculo contenido. Para la cuantificación del inoculo total (IT) se uniformizó una metodología empleando una cámara McMaster para el conteo diferencial de las estructuras fúngicas (ef) que conforman el IT: teliosporas (TE), células estériles (CE) y conidias (CO). Los datos fueron sometidos a pruebas estadísticas para evaluar su normalidad y significancia. Los resultados muestran una longitud promedio de 4,2 mm para espículas afectadas con un peso total y del inoculo de 26 y 8,9 mg, respectivamen- te, al igual que se encontró alta correlación (r= 0,97/P<0,0001) entre el tamaño y peso total de espículas afectadas. Se encontró una alta producción de estructuras reproductivas del hongo T. ayresii, cuantificándose cargas de 9,2x104, 2,9x106 y 11,4x106 ef.mg-1 inoculo, distribuidas porcentualmente en 2,52; 11,37 y 86,11% respectivamente para TE, CE y CO, totalizando 20,9x107 ef.espicula-1 afectada. En conclusión, T. ayresii posee una alta capacidad de producción de inóculo via- ble para futuras infestaciones, conformado en su mayoría por conidias, conside- radas como la primera fuente de infestación y teliosporas verrugosas que confor- man el inóculo latente en el suelo. Palabras clave: Carbón, espículas, teliosporas, conidias.

Recibido el 28-6-1010 z Aceptado el 12-9-2011 Autor de correspondencia e-mail: [email protected]; [email protected]

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Abstract

Inflorescence smut of Panicum maximum Jacq. is caused by the Tilletia ayresii, which disables the production of seeds to form galls on the ovaries of the spicules. The aim of this study was to establish a method to quantify the production of inoculum of T. ayresii in inflorescences of P. maximum. Spicules affected were collected, which were determined length, total weight, empty weight and weight of the inoculum content. To quantify the total inoculum (IT) standardizes a methodology for using a McMaster counting chamber differential fungal structures (fs) providing the IT: teliospores (TE), sterile cells (EC) and conidia (CO). The data were subjected to statistical tests to assess normality and significance. The results show an average length of 4.2 mm by spicules affected, with a total weight and inoculums weight of 26 and 8.9 mg, respectively, as found high correlation (r = 0.97/P<0.0001) between the size and weight of spicules affected. There was high production of reproductive structures of the fungus T. ayresii and quantified loads of 9.2x104, 2.9x106 and 11.4x106 mg.ef-1 inoculum with a percentage distribution in 2.52; 11.37 and 86.11% respectively for TE, CE and CO, totaling 20.9x107 ef-1.spicule affected. In conclusion, T. ayresii has a high capacity to produce viable inoculum for future infestations, consisting mostly of conidia, which are considered the primary source of infestation and warty teliospores that form the dormant inoculum in the soil. Key words: Smut, spicules, teliospores, conidia.

Introducción Introduction

El género Tilletia Tul. & C. Tul. The genre Tilletia Tul. & C. Tul. consta de aproximadamente 140 espe- has approximately 140 distribution cies de distribución restringida a plan- species restricted to plants belonging to tas pertenecientes a la familia de las the gramineae family (), and is gramíneas (Poaceae) y es el género más the biggest genre of the order grande dentro del Orden Tilletiales [, Ustilaginomycetes, [Basidiomycota, Ustilaginomycetes, Exobasidiomycetidae] (Vánky, 2002). Exobasidiomycetidae] (Vánky, 2002). Tilletia characterizes by the formation Tilletia se caracteriza por la formación of pigmented telispores and hyaline de teliosporas pigmentadas y células sterile cells. In most of the species, estériles hialinas. En la mayoría de las telispores form in the ovaries of the host especies, las teliosporas se forman en plants. los ovarios de la planta huesped. T. ayresii specie was reported in La especie T. ayresii fue reporta- 1899 by Massee and corroborated by da en el año 1899 por Massee y luego Vánky and Bauer (1992) as a cause of corroborada por Vánky y Bauer (1992) the truly smut of the ovary in como causante del carbón verdadero del inflorescence of Panicum maximum, ovario en inflorescencias de Panicum which symptoms characterize by

461 Borges y Camacaro maximum, cuya sintomatología se ca- having soros in ovaries of different racteriza por presentar soros en ova- flowers of the inflorescence forming rios de varias flores de la inflorescencia galls in sack shapes, where the olivacea formando agallas en forma de sacos, mass of spores is formed by conidia donde la masa olivácea de esporas está fragile joined and warty teliospore conformada por conidias frágilmente (Pérez-Martínez and Luís, 2005). This unidas y teliosporas verrugosas (Pérez- pathology involves seriously the Martínez y Luís, 2005). Esta patolo- production of seeds of P. maximum gía compromete seriamente la produc- since causes the total destruction of ción de semilla de P. maximum ya que the ovary, therefore, disables the ocasiona la destrucción total del ova- production of viable seeds (Delgado et rio y en consecuencia inhabilita la pro- al., 1990; Verzignassi y Dornelas, ducción de semillas viables (Delgado 2001). T. ayresii also affects some et al., 1990; Verzignassi y Dornelas, species of Hyparhenia, Panicum, 2001). T. ayresii también afecta varias and Urochloa (Poaceae), but especies de Hyparhenia, Panicum, the main host is P. maximum (Pérez Setaria y Urochloa (Poaceae), pero su and Minter, 2005). principal hospedero es P. maximum Due to the importance of this (Pérez y Minter, 2005). pathology and its negative effect in the Dada la importancia de esta pa- production plans of P. maximum tología y su efecto negativo en los pla- seeds, it is necessary to carry research nes de producción de semilla de P. that allow contributing with tools and maximum, se hacen necesarias las solutions for such problems, however, investigaciones que permitan aportar there is little research committed to herramientas y soluciones a tal pro- the knowledge of T. ayresii while there blema, sin embargo, son pocos los tra- are huge advances in those Tilletia bajos dedicados al conocimiento de T. species that affect crops of economical ayresii mientras que existen mayores importance such as wheat (T. indica, avances en aquellas especies de Tilletia T. controversa) and rice (T. horrida). que afectan cultivos de importancia It has been reported the presence económica como el trigo (T. indica, T. of T. ayresii affecting inflorescence of controversa) y el arroz (T. horrida). P. maximum in countries like Brazil Se ha reportado la presencia de (Verzignassi and Dornelas, 2001), Co- T. ayresii afectando inflorescencias de lombia (Piepenbring, 2002), Costa Rica P. maximum en países como Brasil (Piepenbring, 1996), Cuba (Pérez- (Verzignassi y Dornelas, 2001), Colom- Martínez and Luís, 2005), Panamá bia (Piepenbring, 2002), Costa Rica (Piepenbring, 2001), as well as (Piepenbring, 1996), Cuba (Pérez- countries of the African continent. Martínez y Luís, 2005), Panamá Due to the relevance that this (Piepenbring, 2001), así como en paí- pathogen represents for the sustainable ses del continente Africano. production of seeds on cultivars of P. Debido a la relevancia que este maximum in producer countries, it is patógeno representa para la producción posed the necessity of going deeper on sostenible de semillas en cultivares de its knowledge with the aim of offering

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P. maximum en los países producto- literature for future research that res, se plantea la necesidad de profun- allow developing methods for its con- dizar más en su conocimiento, a fin de trol and handle, therefore, the current brindar un punto de partida para fu- research had as objective establishing turas investigaciones que permitan a method to quantify the inoculums desarrollar métodos para su control y production of T. ayresii in manejo, por lo que el presente trabajo inflorescences of P. maximum. tuvo como objetivo establecer un mé- todo para cuantificar la producción de Materials and methods inóculo de T. ayresii en inflorescencias de P. maximum. Samples were recollected in the Experimental Field of INIA, Yaracuy, Materiales y métodos area characterized as Tropical Dry Forest (BsT), according to the Las muestras fueron recolecta- Holdridge classification (1967). All das en el Campo Experimental del plants of Guinea pasture (P. INIA Yaracuy, zona caracterizada maximum) were diagnosed which como Bosque Seco Tropical (BsT), de inflorescences had increased in sized acuerdo a la clasificación de Holdridge and presented deformation of the (1967). Se diagnosticaron todas aque- spicules. The affected and closed llas plantas de Pasto Guinea (P. spicules, with spores of the studies maximum) que en sus inflorescencias funfus were carefully recollected. presentaban aumento en el tamaño y Measurement and weight of deformación de las espículas. Se reco- spicules: a total of 20 spicules that lectaron cuidadosamente espículas afec- presented characteristics thickness of tadas y aún cerradas, contentivas de this pathology were taken, which were las esporas del hongo en cuestión. measured longitudinally employing a Medición y pesaje de espículas: vernier, then, were weighted in an Se tomaron un total de 20 espículas analytical balance of precision 0.001 que presentaban engrosamiento ca- g. The spores (inoculum) were carefully racterístico de esta patología, las cua- removed from each spicule using a les fueron medidas longitudinalmente needle of dissection and a clamp under empleando un vernier y posterior- a stereoscope magnifying glass and mente pesadas en una balanza analí- weighted in the same balance. The data tica de precisión 0,001 g. Las esporas obtained from this process were (inoculo) fue retirado cuidadosamen- analyzed through the descriptive and te de cada espícula con la ayuda de correlation statistics, employing the una aguja de disección y pinza, bajo InfoStat program. una lupa estereoscópica y pesado en Preparation of samples: to divide la misma balanza. Los datos obteni- and do the differential quantification of dos de este proceso fueron analizados the total inoculum (IT) was proceeded mediante estadística descriptiva y to prepare a suspension of the spores in correlación, empleando el programa distilled water in proportion 1:400, InfoStat. equal to 10 mg of inoculum suspended

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Preparación de las muestras: in 4 mL of distilled water, which was Para realizar la separación y added 50 μL of Tween 20 and was put cuantificación diferencial del inóculo for a minute on a mixer Vortex Mixer total (IT), se procedió a preparar una (VM-2000 Digisistem) with the aim of suspensión de las esporas en agua des- pulling away and homogenize the mass tilada en proporción 1:400, esto equi- of spores in the suspension. The liquid vale a 10 mg de inoculo suspendido was put in a glass tube (12 x 75 mm) en 4 mL de agua destilada, a la que and was submitted to centrifugation se adicionó 50 μL de Tween 20 y se (IEC-CL-10 Thermo) for 5 minutes at colocó durante un minuto sobre un 2000 rpm to divide the fungi structures mezclador Vortex Mixer (VM-2000 presented inside the IT. From the Digisistem) a fin de desprender y ho- supernatant was taken an aliquot (600 mogeneizar la masa de esporas en la μL) that was put in a chamber suspensión. Se colocó el líquido en un McMaster to do the recount of each of tubo de vidrio (12 x 75mm) y se some- the structures of the inoculum, leaving tió a centrifugación (IEC-CL-10 it set for 3 min with the aim of Thermo) durante 5 minutos a 2000 stabilizing the suspension inside the rpm para separar las estructuras chamber. fúngicas presentes dentro del IT. Del Uniformity of the counting sobrenadante se tomó una alícuota method: due to the huge quantity of (600 μL) que fue colocada en una cá- structures present in the inoculum, mara McMaster para realizar el re- was necessary the uniformity of the cuento de cada una de las estructu- counting method through the ras confortantes de inóculo, dejándo- McMaster chamber, for this was taken se reposar durante 3 min a fin de que an aliquot from the centrifuged se estabilizara la suspensión dentro suspension and put in the reticulum de la cámara. of the chamber. Readings of both the Uniformización del método de liquid and the end of the post- contaje: Debido a la gran cantidad de centrifuged were done. The data estructuras presentes en el inoculo, se obtained were multiplied by a factor hizo necesaria la uniformización del (0.4) and processed statistically using método de contaje a través de la cáma- the T test to differentiate the most ra McMaster, para lo cual se tomó una significant values, being these the alícuota de la suspensión centrifugada reference to do de differential counting. y se colocó en los retículos de la cáma- Differential counts of structures: ra. Se realizaron lecturas tanto del lí- for the quantification was employed an quido sobrenadante como del fondo de- adaptation of the quantitative method cantado poscentrifugación. Los datos of counting McMaster for eggs of gastro obtenidos fueron multiplicados por un intestinal parasites, where were taken factor (0,4) y procesados into consideration each of the following estadísticamente mediante la prueba T structures: teliospores (TE), sterile cells para diferenciar los valores más signi- (CE) and conidia (CO) present in a ficativos, siendo estos la referencia para counting area of 0.15 mL with the help realizar los contajes diferenciales. of an optical microscope (10X), in order

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Contaje diferencial de las estruc- to differentiate the structures was turas: Para la cuantificación se em- tinted with 5 ìL cotton blue for each pleó una adaptación del método cuan- mL of spore suspension of the fungi. titativo de contaje McMaster para hue- Once quantified the structures vos de parásitos gastrointestinales, en forming the IT, was proceeded to el cual se tomaron en cuenta cada una transform the results with a de las siguientes estructuras: correlation factor (FC): teliosporas (TE), células estériles (CE) FC: dilution of the suspension/ y conidias (CO) presentes en un área counted volume in the reticulum de conteo de 0,15 mL, con la ayuda de FC = 400/0.15 un microscopio óptico (10X), para dife- FC = 2.666 renciar las estructuras, se realizó una Once obtained the FC for the tinción con 5 μL de Azul de Algodón chamber of McMaster, it was por cada mL de suspensión de esporas proceeded to calculate the differential del hongo. number of counted structures, Una vez cuantificadas las estruc- employing the formula: turas conformantes del IT, se procedió NDE= NEC x FC a transformar los resultados con un Where: factor de corrección (FC): NDE: differential number of FC = Dilución de la suspensión/ counted structures Volumen contado en el retículo NEC: number of structures FC = 400/0,15 counted by the reticulum FC = 2.666 FC: correlation factor of the Una vez obtenido el FC para la McMaster chamber cámara de McMaster se procedió a cal- Consequently, is calculated the cular el número diferencial de estruc- total inoculums content on each floret turas contadas, empleando la fórmula: with the formula: NDE = NEC x FC IT = ∑(TE + CE + CO) Donde: Where: NDE: número diferencial de es- IT: Total inoculum tructuras contadas TE: teliospores NEC: número de estructuras con- CE: sterile cells tadas por retículo CO: conidia FC: Factor de corrección de la These calculi are close to the real cámara McMaster number of differential structures Y luego se calcula el inóculo to- present in the charge of inoculums tal contenido en cada flósculo median- concentrated inside the ovary of the te la fórmula: plant affected by T. ayresii. IT = ∑(TE + CE + CO) Donde: Results and discussion IT: Inóculo total TE: Teliosporas The measurement results of the CE: Células estériles affected spicules are presented in table CO: Conidias 1. It is observed an average in the

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Estos cálculos nos aproximan al longitude of the affected spicules of 4.2 número real de estructuras diferencia- mm with a maximum size registered les presentes en la carga de inóculo of 6 mm. For the total and empty concentrada dentro del ovario de la weight of the spicules, were found planta afectada por T. ayresii. averages of 26 and 17.1 mg respectively, while the weight of the Resultados y discusión inoculums located in 8.9 mg varying from minimum and maximum, from Los resultados de las mediciones 5 mg to 13 mg respectively. Both va- de las espículas afectadas se presentan riables showed a correlation coefficient en el cuadro 1. Se observa un promedio highly significant between the en la longitud de espículas afectadas de longitude and the total weight of 4,2 mm, con un tamaño máximo regis- spicules (r=0.97/P<0.0001), but not in trado de 6 mm. Para el peso total y va- between and the inoculum content per cío de las espículas se encontraron pro- spicule. medios de 26 y 17,1 mg respectivamen- In table 2 are presented the te, mientras que el peso del inoculo se values comparisons obtained during ubico en 8,9 mg, variando entre un the uniformity process of counting, mínimo y máximo de 5 mg y 13 mg appreciating differences (P=0.0016) respectivamente. Ambas variables mos- between the Reading of both samples traron un coeficiente de correlación al- and being more significant in the to- tamente significativo entre la longitud tal values of those done after the y peso total de las espículas (r=0,97/ supernatant suspension post- P<0,0001), más no entre éstas y el con- centrifugation. Regarding the tenido de inoculo por espícula. structures present, it was higher the En el cuadro 2 se presentan la presence of TE and CE in the comparación de valores obtenidos du- supernatant, while the number of

Cuadro 1. Estadística descriptiva de las variables evaluadas en las espículas de P. maximum afectadas por T. ayresii.

Table 1. Descriptive statistics of the evaluated variables in spicules of P. maximum affected by T. ayresii.

Longitud de la Peso total de Peso vacio de Peso espícula (mm) espícula (mg) espícula (mg) inoculo (mg)

Media 4,2 26,0 17,1 8,9 D.E. 1,0 8,3 7,3 2,0 C.V. 24,6 31,8 42,6 22,7 Mín 3,0 15,0 7,0 5,0 Máx 6,0 40,0 31,0 13,0

N: 20; Intervalo de confianza: 90%. D.E: desviación estándar. C.V: Coeficiente de variación.

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Cuadro 2. Separación de medias y estadístico T aplicado para la uniformización del método de contaje de estructuras fúngicas reproductivas de T. ayresii.

Table 2. Mean separation and T statistical applied for the uniformity of the counting method of reproductive fungi structures of T. ayresii.

Estructuras fúngicas’”mL-1 de suspensión

Teliosporas Células estériles Conidias Total

Sobrenadante 346±39a 1088±198a 4284±327a 5718±499a Decante 234±24b 774±52b 4521±326a 5529±405b

Nivel de significancia estadística según Prueba de T

Valor de p 0,0007 0,0003 0,1269 0,0016

Letras distintas indican diferencias significativas (P≤0,05). Intervalo de confianza: 95% rante el proceso de uniformización del conidia “Y” present in both samples did contaje, apreciándose diferencias not show differences. This procedure (P=0,0016) entre las lecturas de am- was done with the purpose of bas muestras y siendo más significa- standardize a reading that would allow tivas en los valores totales de aquellas obtaining a real value in a field easy realizadas a partir de la suspensión to observe and count, since when sobrenadante post-centrifugación. En employing the suspension without lo que respecta a las estructuras pre- centrifuge is more difficult to sentes, fue mayor la presencia de TE differentiate the structures due to the y CE en el sobrenadante, mientras que high concentration of these. el número de conidias “Y” presentes en The results of the differential and ambas muestras no mostró diferen- total quantification of IT of T. ayresii cias. Este procedimiento se realizó a are presented in table 3. Ripened fin de uniformizar una lectura que teliospores were found over 9. 2x104 permitiera obtener un valor real en un ef.mg-1 of the inoculum along to a campo de fácil observación y contaje, higher number of sterile cells (2.9x106 ya que al emplear la suspensión sin ef.mg-1 of inoculum). In a higher centrifugar se hace difícil la diferen- quantity were presented conidia which ciación de las estructuras debido a la are characteristics of this specie by alta concentración de las mismas. their “Y” shape in the rest of the Los resultados de la inoculum. These conidia or secondary cuantificación diferencial y total del IT spores constitute the primary source de T. ayresii se presentan en el cuadro of infection and are the one found in

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Cuadro 3. Inoculo total, diferencial y distribución porcentual de T. ayresii en espículas de P. máximum afectadas.

Table 3. Total and differential inoculum, percentage distribution of T. ayrensii in spicules of affected P. maximum.

Teliosporas Células Conidias Total estériles

Estructuras fúngicas/mg inoculo 9,2x104 2,9x106 11,4x106 15,2x106 Inoculo por espícula afectada (±8,9 mg) 8,2x106 2,5x107 10,2x107 20,9x107 Distribución porcentual del inoculo (%) 2,52 11,37 86,11 100

3. Se encontraron teliosporas maduras higher percentage forming IT (86.11%) por encima de 9,2x104 ef’.mg-1 de ino- inside soro. These were characterized culo en conjunto a un número mayor by having thin walls, most of them in de células estériles (2,9x106 ef.mg-1 de “Y” shape, clear like a balloon, when inóculo). En mayor cantidad se presen- germinating these form hyfas, out of taron las conidias características de which can generate blasto-conidia and esta especie por su forma de “Y” en el balitospores (Vánky and Bauer, 1992). resto del inóculo. Estas conidias o es- However, in spite of these structures poras secundarias constituyen la fuen- were found in a higher proportion te primaria de infección y son las que inside the IT, their longevity is se encuentran en mayor porcentaje ephemeral (Smilanick et al., 1989), conformando el IT (86,11%) dentro del which justifies the formation of soro. Estas se caracterizaron por po- teliospores in all the species of the seer paredes delgadas, en su mayoría Tilletiales order to guarantee the en forma de “Y”, translucidas y dis- perpetuation of the inoculums through puestas más o menos como un balón the time. suelto, al germinar forman hifas, de It is known that teliospores are las cuales se pueden generar tanto resistant structures that might blastoconidias como balistosporas remain viable for a long time. (Vánky y Bauer, 1992). Sin embargo, Babadoost et al. (2004) mentioned that a pesar de que estas estructuras se en- 13.3% survival and 16.5% of contraron en mayor proporción den- germination in teliospores of T. indica tro del IT, su longevidad es muy efí- after 32 months in the soil. This mera (Smilanick et al., 1989), lo que reference shows the resistance that justifica la formación de teliosporas en have these structures to stay for longer todas las especies del orden Tilletiales time in the soil until are presented the para garantizar la perpetuación del necessary conditions to initiate the inoculo a través del tiempo. infestation, which is generally

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Es conocido que las teliosporas son observed during the flowering phase estructuras de resistencia que pueden in Guinea pasture, being this an permanecer viables durante largo tiem- inconvenient at the moment of po. Babadoost et al. (2004) señalaron un deciding which measures to apply to 13,3% de supervivencia y un 16,5% de control the pathogen in soils highly germinación en teliosporas de T. indi- infected. On this matter, it is ca luego de 32 meses en el suelo. Esta important to mention that most of the referencia demuestra la resistencia que cultivars and clones of P. maximum poseen estas estructuras para perma- have a high sensitiveness to this necer por largo tiempo en el suelo has- pathogen (Delgado et al., 1990), with ta que se presenten las condiciones ne- incidence degrees that vary from 40 to cesarias para iniciar la infestación, lo 47% and high dispersion indexes in cual generalmente se observa durante different months of the year. la etapa de floración del pasto Guinea, The results obtained showed the siendo esto un inconveniente al momen- high production of reproductive to de decidir qué medidas aplicar para structures of the fungi T. ayresii to controlar el patógeno en suelos alta- form soros inside the ovary of the mente infectados. Al respecto, es im- inflorescence of P. maximum, which portante señalar que la mayoría de contribute to be a permanent source cultivares y clones de P. maximum of the viable inoculums in cultivars of poseen una alta susceptibilidad a este sensitive Guinea pasture and in lands patógeno (Delgado et al., 1990), con gra- highly infected by the teliospores. dos de incidencia variables entre 40 y 47%, e índices de dispersión altos en Conclusion diferentes meses del año. Los resultados obtenidos demos- T. ayresii fungus has a high traron la alta producción de estructu- capacity of production of the viable ras reproductivas del hongo T. ayresii inoculums for future infestations, al formar los soros dentro del ovario mostly form by conidia that are de las inflorescencias de P. maximum, considered the first source of lo cual contribuye a ser una fuente infestation and warty teliospores that permanente de inóculo viable en form the latent inoculums in the cultivares de pasto Guinea susceptibles environment, waiting the necessary y en terrenos altamente infectados por conditions for its germination and las teliosporas. infestation of new plants.

Conclusión End of english version

El hongo T. ayresii posee una alta capacidad de producción de inóculo via- ble para futuras infestaciones, confor- conforman el inóculo latente en el me- mado en su mayoría por conidias que dio ambiente a la espera de la condi- se consideran la primera fuente de in- ciones necesarias para su germinación festación y teliosporas verrugosas que e infestación de nuevas plantas.

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