La Tracciabilità Di Razza Della Carne Ovina Con

Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 1 LA TRACCIABILITÀ DI RAZZA DELLA CARNE OVINA CON METODOLOGIE DI GENETICA MOLECOLARE: RISULTATI PRELIMINARI THE BREED TRACEABILITY OF SHEEP MEAT BY USING MOLECULAR GENETICS METHODS: PRELIMINARY RESULTS

Bramante A. 1, Cecchi F. 1, Ciani E. 2, Castellana E.2, D’Andrea M.S. 3, Pilla F. 3, Ciampolini R.1 1Facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università di Pisa, Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi e Igiene degli Alimenti 2Facoltà di Scienze Biotecnologiche dell’Università di Bari, Dipartimento di Fisiologia Generale ed Ambientale 3Facoltà di Agraria, Università degli Studi del Molise, Dipartimento SAVA

SUMMARY Safety and quality foods of animal origin are extremely important for consumers. The aim of this work was to evaluate the feasibility of a method to track the breed origin of sheep meat all along the production chain using molecular genetics tools. A total of 800 samples evenly distributed among seven Italian sheep breeds have been typed at 19 STR markers, together with 90 samples from both imported sheep animals and local crossbred animals withdrawn at slaughterhouses. A maximum likelihood assignment test was adopted to evaluate STR ability to allocate samples to their true breed of origin. Sarda animals were all correctly allocated, as well as more than 98% of samples from the other breeds. Only slightly worst allocation performances were observed for imported and crossbred animals. Preliminary results seem quite promising, though further analyses will be needed in order to better understand the statistical power of such an assignment test before implementation in the sheep meat production chain.

KEYWORDS Breed traceability, STR markers, probabilistic approach, likelihood, sheep products

molecolare può essere risolutivo dal momento INTRODUZIONE che il DNA rappresenta una vera e propria eti- L’ovinicoltura gioca un ruolo di estrema impor- chetta indelebile ed inalterabile che accompa- tanza sul territorio nazionale, soprattutto per le gna l’animale dalla nascita alle tavole del con- aree interne ed insulari svantaggiate e margi- sumatore, e permette di risalire dalla carne in nali, con importanti ripercussioni dal punto di qualunque stadio della catena produttiva e di- vista sociale, economico ed ambientale. La ga- stributiva, all’identità dell’animale che l’ha pro- ranzia di sicurezza e qualità del prodotto ali- dotta e/o alla sua razza d’origine. I risultati di mentare di origine animale è un problema questa ricerca contribuiscono alla protezione estremamente sentito dai produttori, trasfor- della carne ovina italiana integrando un siste- matori, distributori e soprattutto dai consuma- ma di certificazione e di controllo dei processi e tori. Nonostante alcuni accorgimenti, il sistema dei prodotti mediante metodologie genomiche attualmente applicato è esposto a rischi, per la per la rintracciabilità delle razze allo studio. possibilità di interferire sulla filiera con devia- Con la presente ricerca si è inteso realizzare un zioni dolose o colpose, non sempre facilmente sistema di rintracciabilità della carne ovina ba- evidenziabili. Un sistema di tracciabilità del sato sulla tipizzazione di marcatori genetici in prodotto, effettuato con metodiche di genetica tessuti o tagli di carne, prelevati nei diversi li-

41 Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 1 velli della filiera produttiva e distributiva. ad un minimo grado di separazione tra le razze, parametro importante per la precisione di asse- MATERIALI E METODI gnazione (3). Mediante il software Arlequin sono stati calcolati l’eterozigosi osservata e attesa Oggetto della ricerca sono state le maggiori raz- e la significatività della differenza tra questi va- ze autoctone dell’Italia meridionale continenta- lori (deviazione dall’equilibrio di Hardy- le: Altamurana, Bagnolese, Gentile di Puglia, Weinberg per ogni marcatore, per ogni razza), il Laticauda, Leccese, Sarda e Comisana; sono numero di alleli per marcatore, per razza ed il stati inoltre campionati capi di importazione di test di assegnazione degli individui alla popola- provenienza estera reperibili sul mercato italia- zione di appartenenza. Il software Arlequin no. A partire dalle informazioni raccolte attra- analizza i profili allelici degli individui e resti- verso le indagini aziendali e dai dati provenien- tuisce un valore di likelihood (verosimiglianza) ti dal Libro Genealogico, è stato individuato, per di ogni individuo, di appartenere ad ognuna del- ogni razza, un campione costituito da soggetti le razze analizzate. Il valore più alto corrispon- non imparentati almeno fino alla terza genera- de alla razza alla quale è più probabile che zione, assortito in modo da assicurare la mag- l’individuo appartenga. I valori di likelihood re- giore rappresentatività sul territorio di ciascuna stituiti dal software sono stati confrontati tra realtà genetica. Per ogni razza oggetto di studio razze, soggetto per soggetto, allo scopo di identi- sono stati campionati 100 soggetti provenienti ficare la presenza di errori di assegnazione. da più aziende rappresentative dell’intera area Mediante una funzione implementata su foglio di allevamento. Al fine di effettuare le analisi di di calcolo Excel, per ogni individuo è stato veri- rintracciabilità genetica sui prodotti, che comu- ficato che il valore di likelihood più alto corri- nemente si trovano realmente in commercio in spondesse alla probabilità di appartenere alla periodi stagionali di massima richiesta del mer- razza corretta piuttosto che a qualsiasi altra tra cato, sono stati campionati in date diverse, quelle analizzate. La verifica è possibile in que- campioni biologici di DNA di soggetti di impor- sta fase di ottimizzazione della metodica dato tazione di origine razziale ignota, unitamente a che il lavoro è condotto su campioni di cui è nota soggetti meticci di provenienza nazionale pro- la provenienza. Al fine di determinare dotti di incrocio, provenienti da zone di vendita l’appartenenza o meno di un determinato cam- diverse, per un totale di 90 capi. pione biologico ad una specifica razza, è stata Per ciascun soggetto sono stati prelevati 2 ml di inoltre utilizzata la funzione di Tracciabilità sangue periferico, conservato a -20°C fino al Razziale implementata nel Software “TraceD- momento dell’estrazione del DNA effettuata NA2” creato dal nostro gruppo di ricerca (dati mediante utilizzo del kit GenElute Blood Ge- non ancora pubblicati). nomic Dna Kit Minipreps (Sigma-Aldrich). Il Software TraceDNA2 ha confrontato i genoti- Sono stati considerati 19 marcatori genomici pi multilocus ottenuti dai campioni biologici dei STR selezionati dal panel proposto dalla Com- prodotti commercializzati prelevati sul mercato, missione ISAG/FAO per la “Measurement of con i genotipi multilocus delle razze presenti nel Domestic Animal Diversity” (1). Per ognuno di database oggetto di confronto. essi sono state elaborate delle reazioni teoriche di amplificazione in multiplex e considerate RISULTATI eventuali sostituzioni, sulla base delle valuta- zioni e delle informazioni ottenute dalle banche Per i 19 marcatori analizzati è stato evidenziato genomiche. un buon grado di polimorfismo, con un totale di L’analisi dei marcatori STR è stata condotta con 338 alleli, un numero di alleli per marcatore va- 5 reazioni di multiplex-PCR utilizzando il kit riabile tra 10 (locus BM1824) e 31 (locus commerciale Multiplex PCR Kit (Cat. N° MAF214), ed un numero medio di alleli per lo- 206143, QIAgen). Gli amplificati sono stati se- cus pari a 17,79 (± 4,95) (Tabella 1). parati ed analizzati in elettroforesi capillare Adottando l’approccio di maximum likelihood mediante sequenziatore automatico ABI Prism per il campione relativo alla popolazione com- 310 Genetic Analyzer. Per ogni campione, sono plessiva, costituito dai dati genotipici, tutti i state ottenute le taglie alleliche dei 19 marcato- soggetti di razza Sarda (N=99) sono assegnati ri analizzati. Il dato molecolare grezzo è stato correttamente alla razza d’origine e per tutte le categorizzato e sottoposto all’analisi statistica altre razze le percentuali di corretta assegna- relativa ai parametri di genetica di popolazione. zione superano il 98%. I loci STR mostrano di Quest’analisi preliminare è necessaria al fine di avere una buona performance di corretta attri- valutare la fattibilità di un test di assegnazione buzione per la coppia di razze campane. A titolo di razza (2). Il metodo proposto richiede infatti di esempio in figura 1 è riportato il risultato re- il rispetto dell’equilibrio di Hardy Weinberg, lativo a 4 razze oggetto di studio. Come è possi- l’assenza di linkage disequilibrium tra loci, oltre bile osservare le razze Sarda e Altamurana sono

42 Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 1 perfettamente discrimate, mentre le razze Ba- te similarità genetica esistenza tra le due popo- gnolese e Laticauda vengono discriminate con lazioni. un livello di precisione inferiore dovuto alla for-

Figura 1 : Grafici dei valori di log-likelihood ratio ottenuti mediante analisi con loci STR per le coppie Altamurana vs Sarda (a) e Bagnolese Laticauda (b)

Figura 2 : Risultato di Attribuzione di Identità Razziale per i Capi di importazione provenienti dalla Romania.

In figura 2 si riporta a titolo esemplificativo un mo notare che il Software riconosce nel soggetto file di output del Software riguardante V2802 la razza Laticauda, nel soggetto V2804 la l’attribuzione di identità razziale dei capi di im- Comisana e nel soggetto V2806 la Bagnolese. portazione provenienti dalla Romania. Possia- Per quanto riguarda i capi di importazione pro-

43 Italian Journal of Food Safety, Vol. 1 N. 1 venienti dalla Spagna, Ungheria e agnelli tri- BIBLIOGRAFIA meticci, il Software non ha attribuito questi soggetti ad alcuna delle razze pure presenti nel 1. ISAG/FAO Standing Committee. 2004. Sec- database, mentre ha riconosciuto come pecore ondary Guidelines for Development of Na- Comisane alcuni dei soggetti presenti nel grup- tional Animal Genetic Resources Manage- po delle Merinizzate e dei capi di importazione. ment Plans. Measurement of Domestic An- imal Diversity (Mo-DAD): Recommended CONSIDERAZIONI E Microsatellite Markers. Recommendations of joint ISAG/FAO Standing Committee. CONCLUSIONI http://dad.fao.org/ Accessed Jan. 26, I risultati ottenuti sono incoraggianti, tuttavia, 2009.ISAG/FAO per la “Measurement of al fine di saggiarne la solidità e la conseguente Domestic Animal Diversity” (2004). applicabilità all’interno di una filiera alimenta- 2. Mburu D.N., Ochieng J.W., Kuria S.G., re, si rendono necessari ulteriori analisi di con- Jianlin H., Kaufmann B., Rege J.E., ferma. Il passo successivo sarà quindi quello di Hanotte O. (2003). Genetic diversity and re- effettuare una più approfondita analisi della po- lationships of indigenous Kenyan camel tenza statistica del test alla base della metodica (Camelus dromedarius) populations: impli- attraverso test mirati. La metodica che propo- cations for their classification. Anim Genet. niamo per la rintracciabilità razziale prodotta 34(1):26-32. con i risultati di questa ricerca, potrebbe costi- 3. Cornuet J.M., Piry S., Luikart G., Estoup tuire un valido sostegno alle produzioni delle A., Solignac M. (1999). New methods em- razze oggetto dello studio, nel caso in cui queste ploying multilocus genotypes to select or ex- venissero protette da un disciplinare che san- clude populations as origins of individuals. cisse uno status di prodotto monorazza relativo Genetics 153(4):1989-2000. ai prodotti carnei tradizionali e tipici.