Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw JIHOýESKÁ UNIVERZITA V ýESKÝCH BUDċJOVICÍCH ZemČGČlská fakulta

DIPLOMOVÉ PRÁCE

Téma: HODNOCENÍ ÚýINNOSTI VYBRANÝCH DRUHģ ENTOMOPATOGENNÍCH HUB PěI SAMOSTATNÉ APLIKACI A APLIKACI VE SMċSI VÍCE DRUHģ

Vypracoval: JAN KRÁLOVEC Vedoucí diplomové práce: prof. Ing. ZDENċK LANDA, CSc.

2012

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

PROHLÁŠENÍ:

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracoval samostatnČ na základČ vlastních zjištČní a materiálĤ uvedených v seznamu literatury.

…………………………………….

Jan Královec

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

'Čkuji prof. Ing. ZdeĖku Landovi, CSc. za odborné vedení pĜi této práci, cenné rady, ochotu, trpČlivost a pomoc, které mi poskytoval v prĤEČhu studia a zpracování této diplomové práce. PodČkování dále patĜí Ing. Andree Bohaté, Ph.D. a Ing. JanČ Kroþákové za pomoc, rady a pĜipomínky a pracovníkĤm Katedry rostlinné výroby a agroekologie Marii Nýdlové a Olze Divišové za pomoc a asistenci pĜi zakládání pokusĤ.

ZvláštČ bych chtČl podČkovat mé rodinČ za všestrannou podporu, kterou mi poskytovala po celou dobu studia na vysoké škole

Jan Královec

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Královec J. (2012). Hodnocení úþinnosti vybraných druhĤ entomopatogenních hub pĜi samostatné aplikaci a aplikaci ve smČsi více druhĤ. [Evaluation of the effectiveness of chosen strains of entomopathogenous fungi in individual application and in application of more strain mixture] The University of South Bohemia, faculty of Agrarian, ýeské BudČjovice, Czech Republic.

Annotation

This diploma theses focuses on comparison of natural and intentionally inducated supressiveness of environment induced by application of entomopathogenous fungi Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea a . In tests were evaluated the in vitro parameters as well as the effectiveness in vivo biotests on insect host larva Tenebrio molitor. The species of entomopatoghenous fungi were applied in suspensions, single strains and also in combination of two strains. In the in vitro conditions the possibilities of objective evaluation of the supresivity level were tested by using the CFU test (Colony Forming Units) on three different nutrient media (PDA, PDA + A , PDA + D), as one of the basic evaluation parameters. Further the germination tests were evaluated according to GI (Germination Index), determination of radial growth (comparison of median cultures) and interaction of strain suspensions on nutrient media PDA. In the in vivo biotests were watched the epizooties from suspensions of these entomopathogenic fungi on insect larva Tenebrio molitor in competitive test of strains according to FDI (Fungl development index) evaluation scala. Chosen larva covered by fully sporulating mycelium from epizootie were further evaluated in CFU test. The result were dominant strain/s on the larva from applied suspensions.

key words – entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea, Lecanicillium muscarium, Tenebrio molitor, CFU, nutriet media (PDA, PDA + A , PDA + D), bioassay

Ch F-X ang PD e

w

w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

Ch F-X ang PD e

w

w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Obsah:

1. ÚVOD……………………………………………...... 1 2. LITERÁRNÍ PěEHLED……………………………….……...3 2. 1 Integrovaná ochrana rostlin………………………….………….3 2.2Biologická ochrana rostlin…………………………………..……4 2. 3 Entomopatogenní houby………………………………………...6 2. 3. 1 ZaĜazení entomopatogenních hub do systému………………….…….6 2. 3. 2 ZatĜídČní jednotlivých entomopatogenních hub do systému….……..9 2. 3. 2. 1 Rod Beauveria VUILL. 1912…………………………………….…...9 2. 3. 2. 1. 1 Entomopatogenní houba Beauveria bassiana (Bals. – Criv.) Vuill. 1912…………………………………….…..10 2. 3. 2. 2 Rod Metarhizium Sorokin 1879…………………………………..….12 2. 3. 2. 2. 1 Entomopatogenní houba Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin 1883……………………………….……13 2. 3. 2. 3 Rod Isarium Pers. 1794………………………………….…….……..13 2. 3. 2. 3. 1 Entomopatogenní houba Isaria fumosorosea Wize 1904……..…..14 2. 3. 2. 4 Rod Lecanicillium Zare & W. Gams 2001………………….……….16 2. 3. 2. 4. 1 Entomopatogenní houba Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & W. Gams 2001……………………...17 2. 4 Potemník mouþný Tenebrio molitor…………………………...18 2. 5 Vývoj entomopatogenních hub………………………………..18 2. 6 Obecná charakteristika vztahĤ entomopatogenních hub k hostitelĤm……………………………………………………21 2. 7 Biopreparáty na bázi entomopatogenních hub…………….…..24 2. 8 Faktory ovlivĖující entomopatogenní houby…………….……28 2. 8. 1 Abiotické faktory……………………………………………..…….…28 2. 8. 1. 1 PĤda……………………………………………………….…………28 2. 8. 1. 2 Sluneþní záĜení…………………………………………….………...29 2. 8. 1. 3 Pesticidy…………………………………………………….……….30 2. 8. 1. 4 Relativní vlhkost…………………………………………….……….30 2. 8. 1. 5 Teplota……………………………………………………….………30 2. 8. 2. Biotické faktory………….…………………………………….……...31 2. 8. 2. 1 Bakterie………………………………………………………….…...31

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 8. 2. 2 Patogen……………………………………………………….……...31 2. 8. 2. 3 Hostitel………………………………………….…………………...32 3. MATERIÁL A METODIKA…………….…………………..33 3. 1 Druhy studovaných entomopatogenních hub………………….33 3. 1. 1 Beauveria bassiana kmen I 101…………………………..……33 3. 1. 2 Metarhizium anisopliae kmen F-52………………….….……..34 3. 1. 3 Isaria fumosorosea kmen PFR 97……….………….….……...34 3. 1. 4 kmen I9………………………………….……..34 3. 2 Studovaný druh hmyzu……………………………...... 35 3. 2. 1 Potemník mouþný (Tenebrio molitor L.)……………………….…….35 3. 3 Používaná živná média………………………………………...35 3. 3. 1 Potato Dextrose Agar……………………….…………….…...35 3. 3. 2 Selektivní média………………………………………….……36 3. 3. 2. 1 Potato Dextrose Agar + Antibiotikum…………………..…...36 3. 3. 2. 2 Potato Dextrose Agar + Dodine…………………………...….36 3. 4 Udržování kultur a kultivace entomopatogenních hub………...36 3. 5 PĜíprava základní konidiové suspenze kmenĤ entomopatogenních hub……………………………………….37 3. 6 Metodika provádČných pokusĤ………………………………..38 3. 6. 1 Standardní test klíþivosti – GI (Germination Index)………….……38 3. 6. 2 Standardní test CFU (Colony Forming Units)…………...…..39 3. 6. 3 Standardní laboratorní biotest…………………….…….….…40 3. 6. 4 Konkurenþní test - porovnání úþinnosti vybraných kmenĤ entomopatogenních hub v kombinaci………………….……42 3. 6. 5 Radiální rĤst a výtČžnost………………………………………..…….42 3. 6. 6 Interakce………………………………………………………..….…..43 3. 7 Využívaná technika pĜi pokusech………………….…………..43 4. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST A VÝSLEDKY….…………....44 5. DISKUZE A ZÁVċR…….…………………………………..61 6. LITERATURA……….………………………………………67 7. PěÍLOHY…………………………………………….………74

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 1. ÚVOD

Integrovaná ochrana rostlin má za dobu své existence velmi rozmanitý vývoj. Vznikla v podstatČ až v dobČ, kdy þlovČk výraznČ zmČnil druhovou skladbu životního prostĜedí díky ekonomickému zefektivnČní obhospodaĜování zemČGČlské pĤdy. NáslednČ dochází k rozmachu a širokému využívání pesticidní chemie. Postupem þasu se zvyšuje reziduální zatíženost zemČGČlských produktĤ jak rostlinných, tak i živoþišných a zanedbatelné není ani zatížení životního prostĜedí. Teprve poznání všech negativních chemických úþinkĤ zmínČných pĜípravkĤ vedlo k jejich omezování a následnému nahrazení pĜípravky pĜijatelnými z hlediska toxikologie i ekologie. Do popĜedí se dostává systém biologické ochrany rostlin proti hmyzím škĤdcĤm. Významnou skupinou biologické ochrany jsou mimo jiné i entomopatogenní houby (dále jen EH). Jejich využíváním je možno snížit negativní zatíženost (toxicitu QČkterých používaných úþinných látek, kumulaci jejich reziduí v potravním ĜetČzci a vznik rezistentních populací cílových organizmĤ) a þasto i jednostranné použití klasických konvenþních chemických pesticidĤ. Integrovaný ochranný zásah populaci zemČGČlského škĤdce v daném místČ sníží, není však snahou daný druh škĤdce vyhubit zcela. Každá zemČGČlská plodina má menší þi vČtší spektrum druhĤ škĤdcĤ schopných dosáhnout vysokých populaþních hustot a zpĤsobovat významné zemČGČlsko-ekonomické škody. ZvláštČ významné druhy škĤdcĤ jsou proto monitorovány státní rostlinolékaĜskou správou, která je sleduje a vyhodnocuje þetnost jejich výskytu. Jednou z prioritních alternativ v zemích šetrných k životnímu prostĜedí je zavádČní biopreparátĤ na bázi rĤzných druhĤ mikroorganizmĤ do zemČGČlské praxe. Na trhu v EU a ve svČWČ (USA) se objevují stále nové komerþní pĜípravky s biopreparáty na bázi EH (Jaronski et al., 2007). Jsou také registrovány biopreparáty na bázi EH pro ochranu skleníkových plodin. Biopreparáty na bázi tČchto hub musí splĖovat Ĝadu kvalitativních a kvantitativních parametrĤ a podléhají kompletnímu registraþnímu procesu. Kvalita se hodnotí pomocí klíþových parametrĤ se specifikací podílu aktivní a doplĖkové složky v biopreparátu. Z kvantitativních parametrĤ se hodnotí stanovení poþtu infekþních jednotek a vitality spor. Kvantitativní parametr CFU (colony forming units) udává, kolik jednotek patogena pĜítomných v 1 g nebo 1 ml biopreparátu utvoĜí samostatnou kolonii na umČlé živné pĤGČ (Krátká, 2007).

1

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Cílem této práce je porovnání pĜirozené a zámČrnČ indukované supresivity prostĜedí navozené aplikací entomopatogenních hub Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea a Lecanicillium lecanii. V testech budou hodnoceny jak in vitro parametry (CFU) tak úþinnost v in vivo biotestech na vybraném druhu hostitele.

2

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. LITERÁRNÍ PěEHLED

2. 1 Integrovaná ochrana rostlin

Postupy používající všechny ekonomicky, ekologicky a toxikologicky pĜijatelné metody pro udržení škodlivého organismu pod hladinou škodlivosti s pĜednostním zámČrným využitím pĜirozených omezujících faktorĤ se podle definice IOLB (Mezinárodní organizace pro biologickou kontrolu) nazývají od roku 1973 komplexním pojmem integrovaná ochrana (Soukup, 2005). Integrovaná ochrana rostlin (dále jen IOR) s sebou nese zásadní zmČny v ochranČ zemČGČlských rostlin. Moderní zemČGČlské praktiky vedou ke zmČnám v rovnováze pĜírody, tyto zmČny pak zpĤsobují další úþinky na ekosystém, ve kterém se nachází systém hospodaĜení (Pluke et al., 1999). IOR PĤžeme dále definovat jako peþlivé zvažování veškerých dostupných metod ochrany rostlin a následná integrace vhodných opatĜení, která potlaþují rozvoj populací škodlivých organismĤ a udržují používání pĜípravkĤ na ochranu rostlin a jiných forem zásahĤ na úrovních, které lze z hospodáĜského a ekologického hlediska odĤvodnit a které snižují þi minimalizují rizika pro lidské zdraví nebo životní prostĜedí (SmČrnice evrop. Parlamentu a rady, 2009/128/ES). Jedno z hlavních hledisek je snížení absolutních dávek používaných pesticidĤ. IOR s sebou nese snížení rizik a omezení dopadĤ používání pesticidĤ na lidské zdraví a životní prostĜedí, s cílem podpoĜit vývoj a zavádČní IOR a alternativních pĜístupĤ nebo postupĤ, aby se snížila závislost na používání pesticidĤ (SmČrnice evrop. Parlamentu a rady, 2009/128/ES). ZmČny biologické rozmanitosti v dĤsledku lidské þinnosti byly rychlejší v posledních 50 letech než kdykoliv v lidské historii. ěídící zmČny, které zpĤsobují ztráty biologické rozmanitosti, povedou ke zmČQČ daného ekosystému. Tyto zmČny jsou buć stabilní, nevykazují žádné známky, þi klesající v þase, nebo jsou vedeny ke zvyšování intenzity (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). Dnes témČĜ zaniká dĜívČjší pestrá mozaika polí, luk a pastevních pozemkĤ, mizí velká þást lemovaných útvarĤ a probíhají nejrĤznČjší regulace mokĜadĤ, podmáþených míst a vodoteþí. NČmecká studie nedávno ukázala, že struktura zemČGČlské krajiny má vliv na agroekosystém v biologické rozmanitosti, která zahrnuje i EH a tedy i ekosystémové služby (Tscharntke et al., 2005). V ýR se navzdory celkovČ neuspokojivému stavu pĜírodního prostĜedí, ve srovnání s ostatními þlenskými zemČmi EU, uchovaly cenné þásti pĜírody v relativnČ dobrém stavu nebo stavu, který skýtá možnost obnovy pĜírodních procesĤ (Brožová,

3

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2004). UmČt zaznamenat a vysvČtlit dlouhodobé zmČny vegetace je mimoĜádnČ dĤležité z hlediska ochrany diverzity druhĤ a spoleþenstev (Hédl, 2005). Plevelná spoleþenstva se utváĜejí pod vlivem vzájemnČ podmínČného komplexu pĜírodních podmínek a uplatĖované soustavy hospodaĜení (Soukup, 2005). Stále více se uznává, že biologická rozmanitost v agroekosystémech pĜináší významné tendence do zemČGČlské výroby jako biologickou kontrolu nad škĤdci (Meyling, Eilenberg , 2007). Používání chemických metod ošetĜení plodin je omezováno výbČrem odrĤd se zvýšenou rezistencí proti chorobám a škĤdcĤm. IOR vychází pĜedevším ze správných agrotechnických postupĤ, spoþívajících ve správném dodržování stĜídání plodin v osevních postupech, v optimálních zpĤsobech obdČlávání þi zpracování pĤdy, v þištČní osiva, v péþi o kvalitu statkových hnojiv a v termínech skliznČ narušujících reprodukþní cyklus plevelĤ (omezující tvorbu diaspor a jejich šíĜení). Provázanost þlánkĤ systému IOR umožĖuje minimalizovat spotĜebu pesticidĤ v ochranČ rostlin pĜi zabezpeþení SĜimČĜených výnosĤ.

2. 2 Biologická ochrana rostlin

Biologickou ochranou rozumíme využívání živých pĜirozených nepĜátel pro regulaci škodlivých organismĤ (Landa et al., 2007a). Biologická ochrana rostlin je nejþastČji definována jako zámČrné využívání živých pĜirozených nepĜátel nebo antagonistických organismĤ, s cílem snížit populaþní hustotu škodlivých þinitelĤ, živoþichĤ nebo rostlin na ekonomicky pĜijatelnou úroveĖ (Landa et al., 2002).

Využití živých organismĤ k biologické ochranČ je možné tČmito zpĤsoby:

x Podpora a udržení užiteþných organismĤ Podpora v pĜirozených podmínkách, kdy v pestrých spoleþenstvech roste více druhĤ kulturních rostlin a není tak problém najít potravu v dobČ vegetace dostupnou pro larvy i dospČlce užiteþných druhĤ. Takto podporovat lze napĜ. dravé roztoþe a nČkteré druhy hmyzu napĜ. z þeledi: Coccinellidae, rodu: Coccinella, druh: Coccinella septempunctata L. (slunéþko sedmiteþné) a rodu: Adalia, druh: Adalia bipunctata L. (slunéþko dvouteþné). VČtšinou se však dospČlci živí nektarem z kvČWĤ a larvy jsou dravé napĜ. pestĜenky, lumci. K ochranČ polních i lesních kultur proti hrabošĤm SĜispívá podpora dravých ptákĤ a sov (Kazda et al., 2010). 4

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw EH konkrétnČ Beauveria bassiana a Metarhizium anisopliae, patĜí mezi SĜirozené nepĜátele škĤdcĤ v agroekosystémech a jsou kandidáti pro budoucí zachování biologické kontroly v oblastech mírného pásma (Meyling, Eilenberg, 2007). Biologická ochrana je biologická kontrolní strategie, která pĜijímá zemČGČlské praktiky a ekologické manipulace za úþelem zvýšení životních podmínek pro konkrétní pĜirozené nepĜátele škĤdcĤ. Je to úþelná manipulace životního prostĜedí ve prospČch EH, a proto je nutná základní znalost aspektĤ ekologie, faktorĤ životního prostĜedí, agronomické praxe, pĜirozeného výskytu agroekosystémových organismĤ, populaþní dynamiky a interakce s jinými organismy.

x Introdukce nových užiteþných organismĤ V ýR se tato metoda využívá velmi málo. ÚspČšnČ probČhla napĜíklad introdukce chalcidky Aphelimus mali H. (mšicovníka vlnatkového), jakožto SĜirozeného nepĜítele mšice Eriosoma lanigerum H. (vlnatky krvavé). (Kazda et al., 2010).

x UmČlé masové namnožení a vysazení užiteþných organismĤ 3Ĝirození nepĜátelé jsou produkováni a jednorázovČ nebo periodicky introdukováni do napadených zemČGČlských plodin. Cílem je nejen okamžitý ochranný efekt, ale i dlouhodobČjší regulace populací multivoltinních druhĤ škĤdcĤ (po celou dobu pČstitelského cyklu, úþinnost i na generace cílového škĤdce, které se realizují až po introdukci). Strategie má výraznČ technologický charakter, nutným pĜedpokladem jsou masové chovy a umČlé produkce. KomerþQČ je tato strategie realizována standardními prostĜedky a SĜípravky biologické ochrany. Metoda opakovaných introdukcí v prĤEČhu jedné vegetace je témČĜ výhradnČ využívána v komplexní biologické ochranČ.

Správné zvládnutí biologické ochrany zaruþuje na rozdíl od ochrany chemické dlouhodobou ochranu rostliny proti pĜesnČ specifikovanému škĤdci nebo chorobČ. Základním úspČchem pĜi využití biologické ochrany rostlin je správné urþení organismu, který rostliny poškozuje a následný výbČr vhodného biologického preparátu (Kazda et al., 2010). 5

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 3 Entomopatogenní houby

Velmi zajímavou skupinou hub jsou entomopatogenní houby (dále jen EH), které patĜí mezi nejdéle známé a nejþastČji determinované entomopatogenní mikroorganismy asociované s hmyzem, protože jejich rĤst na povrchu tČla rĤzných hostitelĤ je na rozdíl od ostatních skupin entomopatogenních mikroorganismĤ snadno vizuálnČ patrný (Landa, 1994). Zahrnují mnoho druhĤ, které jsou v posledních letech zkoumány pro úþely biologické ochrany. ýasto vyvolávají pĜirozené epizootie v populacích hmyzu, þímž se Ĝadí mezi významné mikroorganismy regulující hmyzí populace (Butt, Goettel, 2000). Entomopatogení organismy patĜí mezi pĜirozené nepĜátele hmyzích škĤdcĤ v agroekosystémech (Meyling, Eilenberg, 2007). Zvláštní skupinu hub pĜedstavují druhy, které mohou vyvolávat primární onemocnČní rĤzných vývojových stádií hmyzu (Landa, 1998). PomČrnČ velkou skupinu EH tvoĜí druhy, které kromČ hmyzu rostou i na mrtvém substrátu organických zbytkĤ a jejichž patogenita pro hmyz je jen jednou z možností jejich existence (Weiser, 1966). Na rozdíl od bakterií a virĤ, které musí vniknout pĜímo do tČla hmyzu a vyvolat onemocnČní, EH infikují hmyz pĜímým prĤnikem pĜes pokožku (Leger, Wang, 2009). Ve skuteþnosti existuje více než 700 druhĤ EH, které jsou SĤvodci onemocnČní hmyzu (Hajek, 2004). EH byly zkoumány díky své úþinnosti v boji proti širokému spektru hmyzích škĤdcĤ (Butt et al., 2001).

2. 3. 1 ZaĜazení entomopatogenních hub do systému

Pravé houby (Ĝíše: Mycota) se dČlí do þtyĜ skupin: , , a (Maniania et al., 2007). Mnoho druhĤ EH patĜících do tĜíd Hyphomycetes a Zygomycetes vyvolává primární onemocnČní u suchozemského hmyzu, zatímco houby náležející do tĜídy a Oomycetes napadají pĜevážnČ hmyz vodní (Butt, Goettel, 2000). Z nČkolika odlišných revizí se pro klasifikaci EH nejvíce ujal upravený klasifikaþní systém Ainswortha (Ainsworth, 1973). Dle klasifikaþního systému Ainswortha jsou nejvyššími taxony hub Myxomycota - houby vytváĜející plasmodiální formy a Eumycota – houby, které zpravidla vytváĜí mycelium.

6

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Všechny EH patĜí do kmene Eumycota, kde jsou zastoupeny v podkmenech (tĜídy Chytridiomycetes, Blastocladiales); Zygomycotina (tĜída Zygomycetes: Ĝády , ); Ascomycotina (tĜída Pyrenomycetes: Ĝády Spaeriales, ); Basidiomycotina. V umČle vytvoĜené skupinČ Deuteromycotina (tĜída Hyphomycetes: Ĝád Moniliales) (Inglis et al., 2001) jsou zaĜazena imperfektní stádia hub. V pododdČlení Deuteromycotina je zastoupena pĜevážná þást rodĤ s druhy EH, které mají praktický a potencionální význam v biologické ochranČ rostlin. K nejznámČjším patĜí houby rodĤ Beauveria, Metarhizium, Isaria (=Paecilomyces), Lecanicillium (=Verticillium), Hirsutella, Nomuraea a Tolypocladium (Maniania et al., 2007). V tČchto rodech je zastoupena Ĝada druhĤ, z nichž je již v souþasnosti celá Ĝada využívána ve formČ standardních biopreparátĤ k biologické regulaci populací škĤdcĤ zemČGČlských plodin a kultur. VČtšina hub této skupiny mĤže realizovat kompletní vývojový cyklus i v alternativních systémech bez pĜímé vazby na živého hostitele, to znamená, že prodČlají saprofytický cyklus na odumírající organické hmotČ rĤzného SĤvodu. Další velmi významnou skupinu hub tvoĜí druhy náležející do Ĝádu Entomophthorales (podkmen Zygomycotina; tĜída Zygomycetes). EH zastoupené v tomto Ĝádu (napĜ. houby patĜící do rodĤ Conidiobolus, Entomophaga, Entomophthora, Erynia, Neozygites a další) reprezentují obligátnČ parazitické druhy, jejichž vývojový cyklus je vázán výhradnČ na živého hostitele. PrávČ tento biotrofní charakter však znemožĖuje praktické využívání tČchto hub. PĜevážnou vČtšinu hub z Ĝádu Entomophthorales je možno produkovat pouze v „in vivo“ systémech na pĜirozených hostitelích, což prakticky znemožĖuje jejich masovou produkci, která je nezbytným SĜedpokladem komercionalizace standardních biopreparátĤ (Papierok, Hajek, 1999; Pell et al., 2001).

7

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 1 Hlavní taxony hub a seznam entomopatogenních hub KMEN 7ěÍDA ěÁD DRUH Ascomycota Hemiascomycetes Endomycetales Blastodendrion psedococci 3Ĝedstavují Monosporella unicuspidata nejvČtší Mycoderma sp. taxonomickou skupinu v rámci Laboulbeniomycetes Laboulbeniales Fanniomyces ceratophorus Eumycot, s více Filariomyces forficulae než 30 000 druhĤ. virescens Trenomyces histophthorus

Loculoascomycetes Pleosporeales Podonectria coccicola

Plectomycetes Ascospherales Ascophaera apis

Pyrenomycetes Sphaeriales Cordycepioideus bisporus Cordyceps aphodii Torrubiella carnata Nectia flammea Hypocrella amomi Calonectria pruinosa Aschersonia aleyrodis

Coelomycetes Tetranacrium sp. Aspergillus flavus

Hyphomycetes Beauveria bassiana Culicinomyces avenaceum Fusarium entomophila Hirsutella thompsonii Metarhizium anisopliae Nomuraea rileyi Pecilomyces fumosoroseus Sorosporella uvella Stibella nigra Tolypocladium cylindrosporum Verticillium lacanii Basidiomycota Phragmobasidiomycetes Septobasidiales Septobasidium clelandii Uredinella sp. Chytridiomycota Chytridiomycetes Chytridiales Myiophagus ucrainicus

Blastocladiales Coelomomyces stegomyiae Coelomycidium simuli Oomycota Oomycetes Legenidials Lagenidium giganteum

Saprolegniales Aphanomycopsis sexualis Leptolegnia chapmani Zygomycota Trichomycetes Legeriomyces sp. V souþasnosti asi 200 známých Eccrinales Taeniella carani druhĤ. Assellariales Asellaria aselli 8

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Amoebidiales Amoebidium parasiticus

Zygomycetes Entomophthorales Conidiobolus coronatus Entomophthora muscae Entomophaga grylli Erynia aquatica Mucor hienalis

Mucorales Sporodiniella umbellata

(upraveno podle Srivastava et al., 2009)

2. 3. 2 ZatĜídČní jednotlivých entomopatogenních hub do systému

2. 3. 2. 1 Rod Beauveria VUILL. 1912

Rod Beauveria Vuillemin reprezentují široce polyfágní houby, které se bČžnČ vyskytují v pĤGČ a parazitují na pĤdním hmyzu, pĜípadnČ na stádiích hmyzu, která se v pĤGČ vyskytují pouze pĜíležitostnČ (hibernace). V sortimentu hostitelĤ jsou zastoupeny i fytofágní druhy z ĜádĤ rovnokĜídlí (Orthoptera), brouci (Coleoptera) napĜ. potemník mouþný (Tenebrio molitor L.), larvy a kukly motýlĤ (Lepidoptera) napĜ. zavíjeþ kukuĜLþný (Ostrinia nubilalis H.) a dvoukĜídlého hmyzu. V souþasnosti jsou k dispozici i kmeny B. bassiana vysoce virulentní vĤþi nČkterým druhĤm stejnokĜídlého hmyzu (Homoptera). Nákazy vyvolané tČmito houbami jsou oznaþovány jako „bílé muskardiny“, protože infikovaný jedinec zpravidla porĤstá hustým, bílým myceliem (Weiser, 1966), SĜekrývajícím exoskelet se vzpĜímenými svazky hyf (synemata). Konidiogenní buĖky þasto bývají v hustých svazcích (nebo pĜeslenech þi samostatnČ), bezbarvé, s kulovitou nebo baĖkovitou bází a vroubkovitým (zubovitým) apikálním prodloužením (rachis – páteĜ), nesoucí po jedné konidii na každém zubu, konidie nepĜehrádkované (Humber, 1997). 'Ĥležité charakteristické znaky: 9bohaté mycelium uvnitĜ i na povrchu hostitele, rozmnožovací orgány jsou na povrchu hostitele 9mycelium barvy bílé, krémové, oranžové nebo rĤžové 9konidie se oddČlují jednotlivČ vyrĤstající z hyf umístČných na konidioforech jednotlivČ nebo v pĜeslenech Mezi zástupce rodu Beauveria VUILL. jsou Ĝazeny B. bassiana , B. brongiartii, B. globurifera, B. tenella, B. velata, B. amorpha a B. annulatus. 9

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 3. 2. 1. 1 Entomopatogenní houba Beauveria bassiana (Bals. – Criv.) Vuill. 1912

Houba Beauveria bassiana byla jedním z prvních poznaných pĤvodcĤ hmyzích nákaz. Již od 16. století byla sledována nákaza v chovech bource morušového. Choroba byla oznaþována v Itálii jako ”mal del segno” nebo ”calcino”, na území Francie byla známa pod názvem ”muscardine”. Parazitický pĤvod tohoto onemocnČní housenek bource morušového prokázal na poþátku tĜicátých let 19. století Agostino Bassi. Determinaci této EH provedl v roce 1835 Giuseppe Balsamo Crivelli a zaĜadil ji do rodu Botrytis (Botrytis paradoxa), pozdČji zmČnil oznaþení na Botrytis bassiana na poþest jejího objevitele. V roce 1912 revidoval systematické zaĜazení Vuillemin a do dnešní doby je respektováno jeho zaĜazení do rodu Beauveria a oznaþení druhu bassiana (Dirlbeková, 1991). EH Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Deuteromycotina: Hyphomycetes) se pĜirozenČ vyskytuje v pĜírodČ, je kosmopolitnČ rozšíĜená a je typickým SĜedstavitelem entomopatogenní mykoflóry pĤdy, kde pĜežívá ve formČ konidií nebo saprofytického mycelia. Byla izolována z více jak 700 druhĤ hmyzu, z devíti ĜádĤ, nejvíce hostitelĤ se nachází mezi Lepidoptera a Coleoptera. B. bassiana zpĤsobuje primární onemocnČní u více než 100 druhĤ hmyzu (Hajek, Leger, 1994). Výskyt na škĤdcích kolonizujících výhradnČ nadzemní þásti rostlin je velmi Ĝídký (Weiser, 1966), nicménČ v pĤGČ je houba B. bassiana perzistentní až po dobu 2 let (Lingg, Donaldson, 1981). Konidie obsahují na svém povrchu látku ze skupiny monoaminĤ známou jako hydrophobins, která poskytuje ochranu konidiím v pĜirozeném prostĜedí a zvyšuje jejich hydrofobní vlastnosti (Bidochka et al., 1995). Na umČlých živných pĤdách i na pĜirozeném hostiteli vytváĜí mycelium mléþQČ bílé barvy. Konidie jsou globoidního až subgloboidního tvaru, velikost 2-3x2,0-2,5µm. Konidiogenní struktury tvoĜí husté shluky, hrozny (Dirlbeková, 1991). NejþastČjší cestou penetrace houby B. bassiana do hostitele je povrch tČla (Ferron, 1978), pĜes kutikulu a stigmata. KromČ tČchto hlavních zpĤsobĤ infikuje B. bassiana hmyz též per os, zvláštČ druhy s kousavým ústním ústrojím (Feng et al., 1994). Byla však zaznamenána také infekce pĜes dýchací systém (Clark et al., 1968) a ústní ústrojí (Siebeneicher et al., 1992). K nákaze hmyzu dochází konidiemi, které klíþí na povrchu kutikuly a po krátkém rĤstu po povrchu vnikají vláknem kolmo do chitinového pokryvu

10

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw kutikuly a dále do dutiny tČlní. Rostoucí klíþní vlákno enzymaticky penetruje povrch (Smith, Grula, 1981). Aby mohlo dojít k penetraci a následné infekci, musí B. bassiana produkovat nejménČ dva typy enzymĤ v urþitém poĜadí. Jakmile pronikne houba dovnitĜ WČla hostitele, produkuje sekundární metabolit beauvericin pro oslabení imunitního systému hostitele. Po smrti hostitele umožĖuje houbČ produkované antibiotikum (oosporein) konkurovat intestinálním bakteriím. UvnitĜ tČla vznikají válcovité konidie, endokonidie (blastospory), které na fruktifikujících vláknech vyrĤstají porĤznu po dvou i více na krátké stopce. Z endokonidií narĤstají další hyfy a na tČch se po urþitém rĤstu tvoĜí opČt endokonidie. NarĤstající hyfy vyplní tČlo hmyzu (Weiser, 1966). PĜi vlhkosti 92 % a více prorĤstají hyfy na povrch tČla. Na povrchu mumifikovaného tČla se zdvíhají vlákna, na kterých se vyvíjejí vzdušné konidie. Optimální teplota rĤstu je 23 - 26°C pĜi relativní vlhkosti vzduchu nebo vlhkosti substrátu 80 - 100%. Minimální teplota pro rĤst mycelia je 5 - 8°C, maximální teplota pro rĤst mycelia je 28 - 31°C (Dirlbeková, 1991). V pĜírodČ pĜetrvává druh Beauveria bassiana v povrchových vrstvách pĤdy jako mycelium jednak v uhynulých hostitelích a jednak na organických zbytcích (saprofytní fáze). Navzdory velkému množství hostitelĤ byly pouze zĜídka sledovány epizootie zpĤsobené houbou B. bassiana u pĜirozených populací škĤdcĤ (Feng et al., 1994). Houba mĤže též kolonizovat rostliny jako endofyt, þehož je možno využít pĜi redukci zavíjeþe kukuĜLþného (Ostrinia nubilalis) (Bing, Lewis, 1992). Dávky blízké LD50 mohou iniciovat subletální nebo sekundární efekt. Jedná se pĜedevším o ovlivnČní reprodukþního potenciálu (plodnosti) (napĜ. u Leptinotarsa decemlineata, Sitona lineatus) (Feng et al., 1994). Beauveria bassiana je typickým pĜedstavitelem entomopatogenní mykoflóry SĤdy. Je rozšíĜena po celém svČWČ. PĜestože se jedná o typického zástupce pĤdní mykoflóry, komerþní využití preparátĤ na bázi EH je cíleno na foliární škĤdce (škĤdci nadzemních þástí rostlin). Tato houba je nejþastČji aplikována ve formČ postĜiku konidiovou suspenzí. Byla testována v laboratorních i polních podmínkách proti množství škĤdcĤ, jako jsou tĜásnČnky, molice a mšice (Legaspi et al., 2000). Izolace kmenĤ B. bassiana ze zástupcĤ Ĝádu Diptera (Muscidae) a následné testování demonstrují potenciál k využití v biologické ochranČ také proti mouchám (Watson et al., 1995). Mimoto je tato houba neškodná pro Ĝadu necílových organizmĤ (Goettel et al.,

11

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 1990). PĜestože není B. bassiana pĜirozeným nepĜítelem molic, jsou nymfální stádia vysoce náchylná k tomuto patogenu. Studiu patogenity k roztoþĤm byla vČnována menší pozornost, pĜestože se jedná o Ĝadu škĤdcĤ. Jejich malá velikost þasto ztČžuje diagnostiku. Jako hostitel houby B. bassiana je citováno množství roztoþĤ. Pena et al. (1996) demonstruje patogenitu k roztoþi Polyphagotarsonemus latus (Banks). EH druhu Beauveria bassiana je používaná v ochranČ proti lýkožroutu smrkovému (Ips typographus). Využívání tohoto biopreparátu v boji s lýkožroutem je rozšíĜeno zejména v NČmecku, Švýcarsku a Rakousku. Experimentují s ním však i další zemČ, vþetnČýeské republiky. V roce 2007 byl takovýto biopreparát použit i na vybrané lokalitČ NP Šumava (Landa et al., 2007b).

2. 3. 2. 2 Rod Metarhizium Sorokin 1879

Tento rod reprezentují zástupci druhĤ široce polyfágních hub M. album, M. brunneum, M. anisopliae a M. flavoviridae, které jsou pĜevážnČ vázány na pĤdní hmyz, s širokým spektrem hostitelĤ (rovnokĜídlí - Orthoptera, brouci - Coleoptera a dvoukĜídlí - Diptera) a jimiž zpĤsobená infekce byla zaznamenána na více než 200 hostitelích (Maniania et al., 2007). Infekce jedince je snadno rozpoznatelná nČkolik dní po smrti. Zpoþátku jsou vidČt jen bílé vláknité hyfy, které se následnČ rozrĤstají a zabarvují od olivova až na charakteristickou zelenou barvu mycelia. Nákazy vyvolané tČmito houbami jsou oznaþovány jako „zelené muskar-diny“. V závislosti na druhu a kmenu Metarhizia, se vláknité mycelium mĤže zbarvovat od bílé pĜes žlutou až po hnČdou a zelenou barvu. Tyto houby jsou kosmopolitnČ rozšíĜeny a zcela bČžnČ se vyskytují v zemČGČlských i nezemČGČlských pĤdách (lesních ekosystémech) v celé oblasti mírného pásma (Weiser, 1966). Navíc nedávná zjištČní naznaþují, že tyto houby tvoĜí asociace s koĜeny rostlin v rhizosféĜe a pĜežívají v tomto prostĜedí lépe než v okolní pĤGČ (Zdroj -1, 2012). Druhy rodu Metarhizium jsou také známé tím, že produkují látky, které jsou toxické pro þlenovce.

12

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 3. 2. 2. 1 Entomopatogenní houba Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin 1883

Druh M. anisopliae byl poprvé izolován a popsán v roce 1878 Meþnikovem na vrubounovitém broukovi z þeledi Scarabeidae Anisopliae austriaca. V roce 1879 jej Sorokin zaĜadil do systému. V souþasnosti je považován druh M. anisopliae za polyfyletický, kmeny jsou dále dČleny do 4 poddruhĤ: M. anisopliae var. anisopliae, M. anisopliae var. majus, M. anisopliae var. lepidiotum, M. anisopliae var. acridum (Driver et al., 2000). Infikuje více než 200 druhĤ hmyzu z rozdílných ĜádĤ, pĜedevším Orthoptera, Hemiptera, Coleoptera, Diptera, Lepidoptera a Hymenoptera. PatĜí mezi EČžné zástupce pĤdní mykoflóry, nicménČ se po celém svČWČ v malé míĜe vyskytuje i na hmyzu ve fyloplánu (Inglis et al., 2001). Houba M. anisopliae produkuje dva typy spor, vzdušné dlouhé tyþinkovité konidie, které vytváĜejí kompaktní sloupce ĜetízkĤ (Humber, 1997) a jsou produkovány na specializovaných sporogenních krátkých hyfách nazývaných phialidy v prĤEČhu saprofytické fáze a jsou oznaþovány jako asexuální spory. Druhý typ spor je produkován v hmyzí hemolymfČ a oznaþuje se jako blastospory (Leland, 2001). Nákazy vyvolané houbou M. anisopliae jsou oznaþovány jako „zelená muskardina“, protože infikovaný jedinec porĤstá hustým, tmavČ zeleným myceliem. Konidiofory jsou vČtvené, tvoĜící útvary podobné hustým mnohoramenným svícnĤm. Vzdušné konidie obsahují na svém povrchu látku ze skupiny monoaminĤ známou jako hydrophobins, která poskytuje ochranu konidiím v pĜirozeném prostĜedí a zvyšuje jejich hydrofobní vlastnosti. M. anisopliae používá pĜi penetraci hmyzí kutikuly podobnČ jako vČtšina ostatních druhĤ EH kombinaci biochemických (enzymy) a fyzikálnČ mechanických (mechanický tlak penetrující hyfy) prvkĤ. NejvýznamnČjším kutikulu degradujícím enzymem je subtilisin napĜ. Pr1 (Wang et al., 2002). Optimální teplota pro vČtšinu kmenĤ M. anisopliae je 25oC, nicménČ teplotní rĤstový pomČr se u jednotlivých kmenĤ mĤže znaþQČ lišit.

2. 3. 2. 3 Rod Isarium Pers. 1794

Rod Isarium (=Paecilomyces) (Maniania et al., 2007) reprezentují široce polyfágní entomofágní, akarifágní a nematofágní druhy hub, které iniciují nákazy na zástupcích z mnoha ĜádĤ hmyzu (Orthoptera, Thysanoptera, Homoptera, Coleoptera,

13

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Lepidoptera, Diptera), fytofágních roztoþích (napĜ. sviluškovití – Tetranychidae) a QČkterých druzích háćátek (cystotvorná háćátka z rodĤ Globodera, Heterodera) (Koubová, 2009). Rod Paecilomyces byl definován a popsán Bainierem. V roce 1974 provedl Samson revizi rodu, který rozdČlil 31 blízce pĜíbuzných druhĤ hub do dvou sekcí - Paecilomyces a Isarioidea. Taxonomie rodu je však stále ponČkud nejasná a pravidelnČ se objevují revize rodu (Humber, 1997). K nejvýznamnČjším zástupcĤm rodu Isarium patĜí široce polyfágní Isaria fumosorosea. I. fumosorosea se mĤže vyvíjet jako ektoparazit na nČkterých druzích rzí (Uromyces dianthi) a na rĤzných druzích padlí (Sphaerotheca fuliginea) (Landa, 1994). Rod Isarium obsahuje i další druhy hub jako jsou Isaria farinosa, I. amoennerosea, I. javanica a I. tenuipes (Maniania et al., 2007). Základní charakteristika zástupcĤ rodu Isaria: 9zahrnuje 10 druhĤ (Nguya et al., 2007) 9popsáno na druhu Isaria fumosorosea 9druhy jsou saprofytické a entomopatogenní 9u mezofilních druhĤ se optimální teplota rĤstu pohybuje mezi 20 – 24oC 9kolonie zabarvující se do svČtlých barev (bílé, žluté, svČtle zelené, rĤžové) 9tvorba synnemata (coremií-konidiomat) u entomopatogenních druhĤ (Koubová, 2009)

2. 3. 2. 3. 1 Entomopatogenní houba Isaria fumosorosea Wize 1904

Houba Isaria fumosorosea (= Paecilomyces fumosoroseus) (Maniania et al., 2007) je schopna infikovat široký hostitelský okruh a byla zjištČna na více než 40 druzích hmyzu (Hoddle, 2004) z více než 25 þeledí (Koubová, 2009). Vykazuje nejen statut entomopatogenní a akarifágní houby, ale za urþitých okolností vykazuje i statut mykoparazita. I. fumosorosea je hojnČ rozšíĜený kosmopolitní druh, také þasto izolován z rĤzných pĤd (Koubová, 2009). Z abiotických faktorĤ pĤsobících na infekþní cyklus je nejdĤležitČjší relativní vzdušná vlhkost. PĜi klíþení konidií vyžaduje I. fumosorosea nejménČ 10 - 12 hodin vlhkost vyšší než 95%. Teplota se ukazuje ménČ limitujícím faktorem. Optimální rĤst je sledován pĜi 20 - 30°C (prĤPČrný rĤst houby dosahoval 0 - 5,2 mm za den), vyšší teploty (30 - 40°C) omezovaly rĤst více než teploty nižší (8 - 11°C) (Vidal et al., 1997).

14

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Na pĜirozeném hostiteli i na umČlých živných pĤdách vytváĜí I. fumosorosea bílé plsĢovité kultury (prĤPČr okolo 4 cm za 14 dnĤ pĜi 25oC), které pozdČji mČní barvu do odstínĤ narĤžovČlé, nafialovČlé až šedofialové barvy. Barevné zabarvení kolonií pĜímo koreluje se stupnČm sporulace kultury (Landa 1994). Hlavní znaky druhu jsou urþovány na morfologických strukturách sporulujících kultur. Nejprve vytváĜejí konidiofory, které jsou na hyfách umístČny pĜeslenovitým zpĤsobem. Na koncích konidioforĤ se následnČ formují konidiogenní phialidy (3-6 phialid na 1 konidioforu), na kterých se vytváĜejí oválné konidie. Konidie se na koncích phialid oddČlují postupnČ, nejmladší konidie je vždy v kontaktu s phialidou a odtlaþuje starší konidie dál do tvoĜícího se Ĝetízku. V jednom Ĝetízku konidií pĜichyceném na konidiogenní fialidČ mĤže být pĜítomno i více než 50 konidií (Osborne, Landa, 1992). Konidie I. fumosorosea jsou silnČ hydrofobní. I. fumosorosea je jeden z nejvíce perspektivních houbových druhĤ, který byl popsán jako patogen molice T. vaporariorum (Bolckmans et al., 1995) a Bemisia tabaci (Osborne, Landa, 1992). První záznam o asociaci s molicemi pochází z ýíny z roku 1983, kde byla I. fumosorosea zjištČna jako patogen pĜirozenČ se vyskytující v populacích molice skleníkové T. vaporariorum ve sklenících z oblasti Pekingu, kde SĤsobila velmi silné spontánní epizootie, které doþasnČ zcela zdecimovaly populace tohoto škĤdce. Druhým pĜípadem pĜirozené epizootie zpĤsobené I. fumosorosea v populacích molic byl periodický výskyt tohoto patogena v populacích molice tabákové Bemisia tabaci na FloridČ (Osborne et al., 1990). I. fumosorosea zpĤsobila rozsáhlé epizootie v populacích B. tabaci a T. vaporariorum jak ve sklenících, tak i v polních kulturách (Osborne, Landa, 1992). Tento nález inicioval intenzivní výzkum, který vyústil v pomČrnČ rychlý vývoj biopreparátu na bázi I. fumosorosea, který je známý pod obchodním názvem "PFR 97 WDG - Apopka®" (Apopka – jméno oblasti na FloridČ, kde byl v roce 1987 poprvé zachycen a odizolován Dr. Lance S. Osbornem), v souþasnosti je uložen v centrální americké sbírce mikroorganizmĤ (ATCC). Biopreparáty na bázi PFR 97 lze považovat za bezpeþné a z hlediska pĜípadné toxicity za bezproblémové (Landa, 1994). Molice B. tabaci a T. vaporariorum patĜí mezi velmi senzitivní hostitele, na kterých mĤže I. fumosorosea prodČlávat vývoj na všech vývojových stádiích (Bohatá, 2005). I. fumosorosea byla testována i s cílem následného zámČrného využití v biologické regulaci populací nČkterých druhĤ mšic. V krátké dobČ po aplikaci (1-2 hod.), lze na ošetĜených mšicích sledovat známky “intoxikace“, které se projevují sníženou

15

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw pohyblivostí, tzv. “knock down“ efektem a nekoordinovaným pohybem (Landa, 1994). Další pokusy s touto houbou prokázaly široce polyfágní základ a vysokou virulenci vĤþi WĜásnČnkám, larvám nČkterých druhĤ motýlĤ, larvám a kuklám vrtalek a dokonce i akaricidní úþinnost vĤþi svilušce chmelové. I. Fumosorosea je schopna vyvolávat i nákazu na vajíþkách svilušek. V nČkolika pĜípadech byl prokázán i stimulující vliv na vývoj hostitelské rostliny (Landa, 1994). Na bázi tohoto kmene PFR 97 je konstruován biopreparát, který je registrován pod obchodním názvem "PFR 97 205%WDG-Apopka®" (pro distribuci v USA) a PREFERAL ® (pro distribuci v zemích EU). Tento biopreparát obsahuje blastospory I. fumosorosea vyprodukované pomocí submerzní fermentace a jemnČ mletou nutritivní složku. Tyto složky jsou formulovány do podoby drobných, vodou rozpustných granulí. Výrobce (CERTIS USA) garantuje standardní obsah úþinné složky na úrovni minimálnČ 1.0 x 109 CFU/1 g preparátu, pĜi 95% klíþivosti blastospor ve finálním produktu (Pell et al., 2001). I. fumosorosea je vzhledem k širokému hostitelskému okruhu považována za nadČjného þinitele biologické ochrany (Koubová, 2009). V její prospČch mluví i výsledky testĤ toxicity, kompatibility s pĜirozenými nepĜáteli a minimálním nebezpeþím pro životní prostĜedí (Osborne, Landa, 1992).

2. 3. 2. 4 Rod Lecanicillium Zare & W. Gams 2001

Houby rodu Lecanicillium (= Verticillium) (Maniania et al., 2007) jsou významnými patogeny hmyzu a nČkteré byly vyvinuty jako komerþní biopesticidy (Goettel et al., 2008). Rod Verticillium, byl klasifikován na rod Lecanicillium ve kterém jsou zahrnuty Ĝády hub jako Lecanicillium lecanii, L. muscarium a L. longisporum (Güclü et al., 2010). NČkteré izoláty jsou také velmi aktivní proti fytopatogenním háćátkĤm nebo houbám. Lecanicillium spp. využívají k pĜímé penetraci integumentu hmyzu a bunČþných stČn houbových patogenĤ rostlin jak mechanického pĤsobení, tak i hydrolytických enzymĤ. (Goettel et al., 2008) V pĜípadČ mykoparazitismu rostlinných patogenĤ je mechanismus úþinku spojen s kolonizací pletiv hostitelské rostliny a vyvoláním systémové získané rezistence (SAR). Bylo také prokázáno, že hybridní kmeny Lecanicillium spp. získané fúzí protoplastĤ, které nesou rodiþovské vlastnosti, mají širší hostitelský okruh a další prospČšné vlastnosti, jako napĜ. zvýšenou vitalitu.

16

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Tyto hybridy vykazují vyšší virulenci vĤþi mšicím, molicím a cystotvornému háćátku sójovému (Heterodera glycines) (Koubová, 2009).

2. 3. 2. 4. 1 Entomopatogenní houba Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & W. Gams 2001

Zare a Gams provedli v roce 2001 revizi rodu a druhu. Lecanicillium muscarium je kosmopolitnČ rozšíĜený druh EH. Houba tvoĜí rozrĤstající vzdušné mycelium, které je zbarveno do svČtlejších odstínĤ bílé barvy. V prĤEČhu konidiogeneze se tvoĜí dlouhé, úzké lahvicovité konidiofory, na jejichž koncích se postupnČ tvoĜí elipsoidní konidie. Konidiofory jsou uspoĜádány v pĜeslenech a z jednoho místa protilehle vyrĤstají 2, 3 až 4 konidiofory. Na koncích hyf mĤže být pĜeslen tvoĜen i více konidiofory. Konidiofory jsou vytváĜeny postupnČ, mladší konidie odtlaþuje dĜíve vytvoĜenou konidii do vytváĜejícího se shluku, který má podobu kuliþky. V závČreþné fázi sporulace se kuliþky pokrývají mucilagenní hmotou, která udržuje kompaktní tvar finálního útvaru (Šimková, 2011). Konidie jsou slizovité, pĜichytávající se na kutikulu hostitele. Teplotní optimum pro L. muscarium je 15 – 25°C. Optimum pro vlhkost 85 – 90%, vysoká vlhkost je nezbytná nejménČ po dobu 10 – 12 hodin. Spory L. muscarium jsou poškozovány ultrafialovým záĜením. Houba je schopna bČhem svého vývoje produkovat toxin bassianolide (Cloyd, 2005). L. muscarium je velmi dobĜe známá polyfágní EH. Spontánní epizootie zpĤsobené tímto patogenem jsou nejþastČji zaznamenány v populacích hmyzu Ĝádu Homoptera, zvláštČ pak v populacích rĤzných druhĤ mšic, molic (Hall, 1982) a þervcĤ (Hall, 1981). ýasté jsou záznamy i s výskytem Lecanicillium spp. v populacích hostitelĤ patĜících do jiných ĜádĤ hmyzu. V sortimentu hostitelĤ patogena byly zaznamenáni zástupci z ĜádĤ Orthoptera, Heteroptera, Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera a Thysanoptera, z nichž zejména nČkteré druhy tĜásnČnek patĜí k velmi EČžným hostitelĤm. Spektrum parazitizmu této houby (mykoparazitizmus) však není omezeno pouze na hmyz. Houba Lecanicillium spp. je rovnČž schopna potlaþovat Ĝadu houbových patogenĤ rostlin, jako padlí, rzi, plísnČ nebo Pythium (Goettel et al., 2008).

17

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 4 Potemník mouþný Tenebrio molitor

Druh potemník mouþný (Tenebrio molitor L.) patĜí mezi brouky (Coleoptera) do þeledi: Tenebrionidae. DospČlý brouk (dále jen imago) je dlouhý okolo 15 mm, jeho larvy jsou dlouhé až 30 mm. Oznaþován pĜevážnČ za synantropní druh. Jeho larva i imago škodí na obilí, mouce a mouþných produktech. Ve volné pĜírodČ se vyskytuje v odumírajících starých listnatých stromech a v ptaþích hnízdech (HĤrka, 2005). Pro laboratorní úþely se tento druh chová v umČlých speciálních chovech. PĜi chovu tohoto brouka se zachovává optimální teplota 20°C (pokojová teplota), pĜi níž trvá vývojový cyklus 5 až 6 mČsícĤ. PĜi vyšší teplotČ se vývojový cyklus urychlí. U WČchto intenzivních chovĤ je nutné od sebe oddČlit stadium larvy a stadium imaga.

2. 5 Vývoj entomopatogenních hub

Infekþní cyklus entomopatogenních deuteromycet lze rozdČlit do pČti fází: I. SĜichycení spory na povrchu hostitele II. vytvoĜení klíþku III. penetrace kutikulou IV. vegetativní rĤst V. konidiogeneze (Osborne, Landa, 1992).

Obecný model vývoje mykóz na hostiteli lze rozdČlit do tĜí fází: I. SĜichycení a klíþení konidií na povrchu kutikuly hostitele (primární interakce) II. prĤnik patogena do tČlní dutiny hostitele a vytvoĜení povrchového mycelia (parazitická fáze vývojového cyklu) III. externí sporulace a tvorba konidií nové generace (saprofytická fáze vývojového cyklu)

Vznik houbových epizootií v populacích hmyzu vyvolávají vitální a virulentní konidie (Boucias et al., 1988), které jsou energeticky dostateþQČ vybaveny, bez nutnosti absorbování externí živiny. K šíĜení konidií dochází nejþastČji nad povrchem pĤdy díky YČtru nebo dešĢové vodČ, v pĤdních þástech se konidie šíĜí pomocí pohybu vody v pĤGČ. 18

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw UvnitĜ hmyzí populace dochází k šíĜení nákaz v souvislosti s vnitropopulaþními procesy (migrace, kopulace a kladení vajíþek). Nejprve je tĜeba, aby konidie ulpČly na povrchu potenciálního hostitele (Hajek, 2004).

Primární adheze konidií je zajištČna: 9SĜímou vazbou mezi dvČma hydrofobními povrchy (konidie-kutikula hmyzu) 9prostĜednictvím elektrostatických sil 9molekulární interakcí mezi látkami (hemaglutiny, glykoproteiny, steroly, polární lipidy), které jsou pĜítomny na povrchu konidií a kutikuly hostitele

Konidie nČkterých druhĤ hub jsou pro tuto fázi vybaveny adhezívními substancemi (napĜ. mucilageny), pomocí kterých vytváĜejí pevnou vazbu s kutikulou hostitele již pĜi prvém kontaktu (napĜ. houby Verticillium lecanii, Aschersonia aleyrodis, Hirsutella thompsonii) (Vestergaard et al., 1999). Jiné druhy entomopatogenních hub (napĜ. Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus) produkují suché, silnČ hydrofobní konidie s rozmanitČ strukturovaným povrchem. Klíþení konidií silnČ ovlivĖují abiotické a biotické podmínky (Hesketh et al. 2009), dále závisí na externích živinách a zároveĖ na pĜítomnosti látek inhibiþní povahy na povrchu kutikuly hostitele (mastné kyseliny a melanin) (Inglis et al., 2001). PĜi klíþení konidií v prvé þásti dochází k jejich výraznému bobtnání, které je doprovázeno komplexní pĜestavbou stČn a následnou tvorbou primárních klíþNĤ (Boucias et al., 1988), které vytváĜejí rĤzné penetraþní struktury (napĜ. zduĜelá špiþka klíþku, apresorium nebo extracelulární pouzdro). Z tČchto struktur se dále formuje penetraþní hyfa, která proniká do tČla hostitele (Sosa-Gomez et al., 1997). Od urþité fáze naklíþení je další vývoj patogena závislý na externím nutriþním zdroji a dochází k utilizaci látek SĜítomných v kutikule hostitele (Boucias et al., 1988). 3Ĝi pĜímé penetraci kutikulou uplatĖují houby kombinaci biochemických (enzymy) a fyzikálnČ mechanických (tlak penetrující hyfy) prvkĤ. V prvé fázi penetrace jsou v oblasti apresoria (plochý terþovitý útvar na hyfách, který je pĜitištČn na tČlo hostitele) pronikající hyfy produkovány kutikulu degradující enzymy. Mezi enzymy podílející se na penetraci patĜí endoproteázy, esterázy, lipázy, chitinázy a chitobiázy, SĜLþemž nejvýznamnČjší roli hrají exoproteázy (Butt et al., 1998). Koncová špiþka invazní hyfy tlakem proniká narušenou kutikulou hostitele do tČlní dutiny. ýastým 19

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw místem penetrace jsou ménČ sklerotizované þásti na povrchu tČla (Boucias, Pendland, 1984). KromČ pĜímé penetrace kutikulou, využívají EH k pronikání do tČlní dutiny i SĜirozené otvory. Po proniknutí invazní hyfy do tČla hostitele nastupuje vlastní parazitická fáze. Patogen zpravidla rychle kolonizuje tČlní dutinu, kde vytváĜí buć jedno nebo vícebunČþná hyfová tČlíska (blastospory) (Inglis et al., 2001), která postrádají bunČþnou stČnu, nicménČ jsou pokryty tenkou fibrilózní vrstvou na plazmatické membránČ. Blastospory se pomnožují puþením a ve velmi krátké dobČ zcela vyplĖují tČlní dutinu hostitele. Dále se invaze patogena šíĜí pomocí hostitelské lymfy a nakonec napadá hostitelovy orgány a tkánČ, následnČ na to hostitel umírá. Smrtí hostitele konþí parazitická þást cyklu. Jiné houby zabíjí hmyz mnohem rychleji, napĜíklad prostĜednictvím využití toxinĤ, které produkují. Rychlost infikace hmyzího hostitele a následný projev smrti jsou závislé i na druhu a kmenu hub, na velikosti hostitele a okolních podmínkách (Inglis et al., 2001). Vývojový cyklus uzavírá saprofytická fáze, kdy vČtšina entomopatogenních deuteromycet tvoĜí myceliální masu uvnitĜ tČlní dutiny usmrceného hostitele (tzv. mumifikace hostitele). Z myceliální masy pak na povrch tČla mumifikovaného jedince prorĤstá mycelium, na kterém se tvoĜí druhovČ specifické konidiofory, jejichž SĜítomnost signalizuje poþátek poslední þásti vývojového cyklu patogena - konidiogenezi (Landa, 1994). V této fázi jsou nejpatrnČjší morfologické rozdíly mezi jednotlivými druhy EH (konidiofor, tvar a velikost konidií, uspoĜádání konidií atd.). Saprotrofní fáze patogena konþí úplnou sporulací. K šíĜení patogena dochází pomocí konidií šíĜených nejþastČji pasivnČ (voda, proudČní vzduchu) nebo pĜímým kontaktem zdravých jedincĤ s jedinci infikovanými (Osborne, Landa,1992).

20

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 2 Pronikání EH invazní cestou do hostitele HOUBA šíĜení spor vČtrem Ļ SPORY (asexuální reprodukce) Ļ pronikání do hostitele pomocí enzymatické degradace HOSTITELOVA EPIKUTIKULA (1. primární vrstva) Ļ HOSTITELOVA PROKUTIKULA (2. primární vrstva) Ļ HOSTITELģV EPIDERMIS vícebunČþná hyfová tČlíska (blastospory) Ļ HOSTITELOVA HEMOLYMFA vyprodukované toxiny Ļ VNITěNÍ ORGÁNY (stĜevo, mozek a další orgány) Ļ HOSTITELOVA SMRT S MUMIFIKOVANÝM VZHLEDEM Ļ VYPRODUKOVANÉ SPORY NA HOSTITELI Ļ SPORY ROZPTÝLENÉ VZDUCHEM NEBO VODOU Ļ 3ěÍPRAVA PRO DALŠÍ INFEKCE

(upraveno podle Srivastava et al., 2009)

2. 6 Obecná charakteristika vztahĤ entomopatogenních hub k hostitelĤm

Mezi EH mĤžeme nalézt vysoce specifické druhy, které se vyskytují pouze na jednom hostiteli nebo jen na urþitém stádiu jednoho hostitele a zároveĖ druhy, které napadají celou Ĝadu druhĤ, rodĤ, þeledí nebo i vyšších systematických skupin (Weiser, 1966). EH a jejich hostitelé se vyskytují volnČ v krajinČ a jsou ovlivĖovány biotickými a abiotickými faktory. ZmČny životního prostĜedí, zejména pĜíchod nových druhĤ (hostitel, houba), zmČny klimatu, fragmentace mají vliv na celou tuto komunitu. Vzájemná interakce je pravdČpodobnČ nejvČtší v polo-pĜírodních stanovištích.

21

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Patogenita je kvalitativní schopnost patogena zpĤsobit onemocnČní a je urþena celou Ĝadou faktorĤ, vþetnČ fyziologie hostitele (napĜ. obranné mechanismy), fyziologie hub (napĜ. patogenita faktorĤ - tvorba enzymĤ a toxinĤ) a podmínkami prostĜedí (Inglis et al., 2001). Další možností pronikání patogena do tČla hostitele je prostĜednictvím SĜirozených tČlních otvorĤ (ústní orgán, tracheální systém, Ĝitní otvor, a další). EH parazitují na zástupcích všech ĜádĤ hmyzu Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Homoptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Coleoptera a Diptera (Weiser, 1966). Houby mají jedno z nejširších hostitelských spekter v rámci patogenĤ þlenovcĤ (Inglis et al., 2001). NejþastČji infikovaným vývojovým stádiem hmyzu jsou larvy, ménČ þasto kukly a dospČlci. Vajíþka hmyzu jsou infikována velice málo.

TABULKA 3 Hmyzí škĤdci a entomopatogenní houby ěÁD CÍLOVÝ HMYZÍ INFIKOVANÝ HOUBA (TěÍDA) ŠKģDCE Coleoptera Acanthoscelides obtectus imago Beauveria bassiana zrnokaz fazolový (Hyphomycetes)

Leptinotarsa decemlineata larva, nymfa a Beauveria bassiana mandelinka bramborová dospČlec (Hyphomycetes)

Otiorhynchus sulcatus larva Beauveria bassiana, lalokonosec rýhovaný, B. brongniartii, Sitona lineatus M. anisopliae, listopas þárkovaný M. flavoviride, P. fumosoroseus (Hyphomycetes)

Oryctes rhinoceros dospČlec M. anisopliae (Hyphomycetes) nosorožík larva B. bassiana, B.tenella, M. anisopliae, P. fumosoroseus, Aspergillus fumigatus (Hyphomycetes)

Sitophilus oryzae dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes) pilous rýžový

Sitophilus granarius dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes) pilous þerný Diptera Arachnocampa luminosa larva Tolypocladium spp. (Hyphomycetes)

Aedes cantator larva Erynia aquatica (Entomophthoraceae)

22

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Aedes aegypti dospČlec Coelomomyces stegomyiae komár tropický (Coelomomycetaeceae)

larva Laptolegnia chapmanii (Oomycetes) larva M. anisopliae (Hyphomycetes)

Aedes kochi larvy Lagenidium giganteum (Oomycetes)

Culex pipiens larvy Lagenidium giganteum komár pisklavý, (Oomycetes) Anopheles stephensi

Culex quinquefasciatus, larvy Laptolegnia (Oomycetes) Culex pipiens, Aedes aegypti, Anopheles quadrimaculatus

Culex pipiens, larva M. anisopliae (Hyphomycetes) Aedes aegypti, Anopheles stephensi

Culex quinquefasciatus larva M. anisopliae (Hyphomycetes)

Delia antiqua dospČlec Metarhizium anisopliae kvČtilka cibulová (Hyphomycetes)

Musca domestica dospČlec Entomophthora muscae moucha domácí (Entomophthoraceae)

dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes) Hemiptera Adelphocoris spp. nymfa a B. bassiana, M. anisopliae klopuška, dospČlec (Hyphomycetes) Eurygaster integriceps, Lygus lineolaris Homoptera Acyrthosiphon pisum dospČlec Conidiobolus obscurus kyjatka hrachová (Entomophthoraceae)

Acyrthosiphon pisum, dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes), Lipaphis erysimi Entomophthora muscae, mšice trýzelová, Erynia aquatica Pemphigus sinobursaris, (Entomophthoraceae) Rhopalosiphum padi mšice stĜemchová

Bemisia argentifolii dospČlec P. fumosoroseus molice bavlníková (Hyphomycetes)

Cameraria ohridella kukla V. lecanii (Hyphomycetes) klínČnka jírovcová

23

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Diuraphis noxia dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes) mšice zhoubná

Macrosiphoniella sanborni dospČlec V. lecanii (Hyphomycetes) kyjatka chryzanténová

Nilaparvata lugens dospČlec B. bassiana (Hyphomycetes)

Hymenoptera Cephalcia tannourinensis larva B. bassiana (Hyphomycetes) Lepidoptera Galleria mellonella nymfa a B. bassiana, M. anisopliae zavíjeþ voskový dospČlec (Hyphomycetes)

larva B. bassiana (Hyphomycetes)

Heliothis zea larva Nomureae rileyi (Hyphomycetes)

Lambdina inconsequens, nymfa a B. bassiana, M. anisopliae Melanoplus sanguinipes dospČlec (Hyphomycetes)

Porthetria disper vajíþka Entomophthora aulicae (Entomophthoraceae) Thysanoptera Frankliniella occidentalis nymfa a Verticillium lecanii WĜásnČnka západní dospČlec (Hyphomycetes)

Taeniothrips inconsequens nymfa a Paecilomyces fumosoroseus dospČlec (Hyphomycetes) (upraveno podle Srivastava et al., 2009)

2. 7 Biopreparáty na bázi entomopatogenních hub

9Čtšina EH mĤže realizovat kompletní vývojový cyklus i v alternativních systémech, bez pĜímé vazby na živého hostitele (napĜ. saprofytický cyklus na odumírající organické hmotČ rĤzného pĤvodu). Statut fakultativních parazitĤ umožĖuje produkci biomasy infekþních jednotek (konidií, resp. blastospor) pomocí velkokapacitních biotechnologií, což je základní technologický pĜedpoklad pro vývoj a tržní realizaci standardního biopreparátu (Koubová, 2009). NejvČtší množství biopreparátĤ na bázi spor EH je produkováno pomocí in vitro produkþních systémĤ využívajících substráty, nejþastČji semena rĤzných druhĤ rostlin (rýže, proso, kukuĜice, pšenice, jeþmen). Technologie je zpravidla dvoufázová, v prvé fázi je vyprodukováno þisté, koncentrované inokulum, kterým je ve druhé fázi ošetĜen sterilní nebo semisterilní substrát. Produkt je k jednoduché finalizaci pĜipraven po 2-3 týdnech kultivace a formulaci tvoĜí rĤznČ upravený (napĜ. mletý) komplex „patogen-

24

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw substrát“ (Grimm, 2001). Tyto technologie produkce jsou v dnešní dobČ upĜednostĖovány, protože jsou þasto koncipovány na bázi zámČrného využívání obnovitelných pĜírodních zdrojĤ, pĜípadnČ i odpadních organických produktĤ. Takto konstruované biopreparáty bývají zpravidla nestandardní v klíþových kvalitativních a kvantitativních parametrech a jejich registrace ve vyspČlých zemích je vzhledem k vysokým nárokĤm registraþních procesĤ prakticky nemožná. K podstatnČ standardnČjším biopreparátĤm patĜí tzv. „pytlová metoda“ (u nás známá také pod pojmem jako „Kybalova metoda“), pĜi které jsou masy spor EH produkovány v aerobním prostĜedí na myceliu porĤstajícím povrch sterilního tekutého živného média, které je uzavĜeno ve sterilních PVC pytlích. Kompletní biomasa (mycelium a spory) je po usušení finalizována mletím a smísením s inertním nosiþem (siloxid, jemnČ mletá kĜemelina). Touto metodou byl i v ýR produkován doposud jediný tržnČ dostupný biopreparát na bázi houby B. bassiana mající obchodní název BOVEROL (Weiser, 1991). 1Čkteré druhy EH je možno produkovat jako submerzní kultury, lze je v principu považovat za technologické analogie pĜirozených procesĤ vývoje EH na hmyzích hostitelích, kdy v klíþové parazitické þásti vývojového cyklu patogen proniká do tČlní dutiny hostitele a v semiaerobních podmínkách v tekutém prostĜedí (hemolymfa) vytváĜí zvláštní tenkostČnné, jednobunČþné, tvarovČ a velikostí pomČrnČ nestabilní útvary nazývané blastospory (nČkdy též hyfová tČlíska) (Humber, 1997). Submerzní kultury se pomČrnČ snadno upravují a dotváĜejí do standardní formy biopreparátĤ. Vývoj biotechnologií orientovaných do oblasti velkokapacitních submerzních kultivací vláknitých hub lze považovat za nejvýznamnČjší vývoj standardních mykoinsekticidĤ a mykofungicidĤ. VČtšina v souþasnosti komerþQČ dostupných preparátĤ na bázi hub je konstruována na bázi blastospor, resp. biomasy získané pomocí submerzních kultivací (Wright, Carruthers, 1999). Standardní biopreparáty na bázi EH musí splĖovat mnohá kvalitativní a kvantitativní kritéria a podléhají kompletnímu registraþnímu procesu. Mezi klíþové parametry kvalitativní povahy patĜí garance druhu a kmene patogena, specifikace podílu aktivní a doplĖkové složky v biopreparátu a maximální pĜípustná kontaminace (zastoupení cizorodých biotických pĜímČsí, napĜ. bakterií, v 1 g/ml pĜípravku). Mezi hlavní kvantitativní a kvalitativní parametry houbových biopreparátĤ patĜí (Inglis et al., 2001):

25

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw x poþet infekþních jednotek (garantovaný minimální poþet konidií resp. blastospor; zpravidla se pohybuje v rozmezí 1,0 x 108 - 1,0 x 1010 konidií v 1 g/ml biopreparátu) x klíþivost konidií (garantovaná vitalita konidií nebo blastospor v % ) x poþet jednotek tvoĜících kolonie (CFU - colony forming unit) - specifický údaj kvalitativní povahy, udávající z kolika jednotek patogena pĜítomných v 1 g/ml biopreparátu se pĜi kultivaci na umČlé živné pĤGČ vytvoĜí samostatná kolonie)

I. Standardní biopreparáty konstruované na bázi hub B. bassiana, P. fumosoroseus nebo V. lecanii jsou již v zahraniþí komerþQČ dostupné a jsou využívány v programech biologické ochrany rĤzných zemČGČlských plodin a kultur (Patoþka, 2010).

II. Další skupinu houbových biopreparátĤ pĜedstavují pĜípravky, které byly cílenČ vyvinuty pro úþely pĤdní aplikace proti pĤvodcĤm onemocnČní a škĤdcĤm vyskytujícím se v pĤGČ.

a) biopreparáty na bázi myceliových granulí - patogen je finalizován do formy sušených myceliových fragmentĤ, které po aplikaci do pĤdy absorbují vodu a postupnČ regenerují do standardní formy mycelia, na kterém se tvoĜí konidie, které mohou infikovat hmyzího hostitele (Andersch et al., 1990)

b) biopreparáty na bázi alginátových pelet - smíšená biomasa (mycelium, blastospory, konidie) patogena je spolu s nutritivní složkou imobilizována do drobných pelet, které po aplikaci do pĤdy absorbují vodu, imobilizovaná houba regeneruje a s využitím živin, které jsou souþástí pelety realizuje kompletní saprofytický cyklus, jehož výsledkem je tvorba nové generace konidií (Eyal et al., 1994)

Souþasný sortiment biopreparátĤ konstruovaných na bázi nČkterého kmene EH je relativnČ úzký a zahrnuje pĜevážnČ specifické kmeny hub rodĤ Beauveria, Lecanicillium, Paecilomyces a Metarhizium. V souþasné dobČ je již pĜibližnČ 25 druhĤ využíváno ve formČ standardních biopreparátĤ. V následujícím pĜehledu (TABULKA 4)

26

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw jsou uvedeny pĜíklady komerþních biopreparátĤ používaných v praktické biologické ochranČ rostlin ve svČWČ (Srivastava et al., 2009).

TABULKA 4 Komerþní biopreparáty EH registrované pro potĜeby biologické ochrany proti hmyzím škĤdcĤm HOUBA KOMERýNÍ CÍLOVÝ VÝROBCE OBLAST BIOPREPARÁT ŠKģDCE POUŽITÍ B. bassiana Ago Bio Bassiana hmyz Ago Biocontrol Jižní Amerika M. anisopliae Ago Bio Metarhizium motýli a brouci Ago Biocontrol Jižní Amerika 50 L. lecanii Ago Bio Verticillium zelené housenky Ago Biocontrol Jižní Amerika 50 L. gigantum Laginex AS komáĜi Agraquest Inc B. brongniartii Engerlingspilz chroust obecný Andermatt Švýcarsko L. gigantum Leganidium gigantum komáĜi CA Dept of Health - M. anisopliae Bioblast termiti Ecoscience USA ESF 1 M. anisopliae Biopath Roach švábi Ecoscience/Terminex USA ESF 1 Chamber M. flavoviride Green Muscle kobylky, International Institute - saranþata of Bio. Con. L. lecanii Mycotal molice Koppert Nizozemsko L. lecanii Vertalec mšice Koppert Nizozemsko B. bassiana Botanigard molice, Mycotech Jižní Parkmont, WĜásnČnky, mšice USA B. bassiana Mycotrol molice, Mycotech Jižní Parkmont, WĜásnČnky, mšice USA B. brongniartii Betel chroust obecný NPP/Calliope ostrov Reunion B. bassiana Ostrinil Oryctes nubialis, NPP/Calliope Francie O. funacalis I. fumosorosea PFR-97 molice, roztoþi Thermo trilogy - Apopka 97 WĜásnČnky, mšice B. bassiana Naturalis stejnokĜídlí, Troy bioscience USA brouci, ploštice M. anisopliae Biogreen švábi Biocare Rakousko I. fumosorosea Per97 molice Grace USA - údaje nejsou k dispozici, (upraveno podle Srivastava et al., 2009)

27

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 8 Faktory ovlivĖující entomopatogenní houby

2. 8. 1 Abiotické faktory

Na šíĜení infekþních propagulí hub v prostĜedí se nejþastČji podílí voda, vlhkost, teplota, vzduch a jeho složení, svČtlo, dále vítr, déšĢ, pohyb vody v pĤGČ, vodní páry. Délka vývoje cyklu probíhá v úzké korelaci s okolní teplotou.

2. 8. 1. 1 PĤda

Mnoho EH náležejících do tĜídy Hyphomycetes je považováno za typické pĜedstavitele SĤdního ekosystému (Inglis et al., 2001). EH obývající pĤdní prostĜedí jsou chránČny proti vysychání, ultrafialovému záĜení (Jaronski et al., 2007) a extrémním teplotám, nicménČ jejich rozšíĜení je sezónní a zpĤsobuje jejich celkové prostorové rozšíĜení. 3Ĝevážná vČtšina EH obývajících pĤdní prostĜedí produkuje hydrofobní konidie, které se SĜi kontaktu s hmyzí kutikulou snadno pĜichytí na její povrch (McCoy et al., 2002). Fyzikální vlastnosti pĤdy mohou ovlivnit perzistenci (Jaronski et al., 2007) a prostorovou interakci pĤdního hmyzu a houbových patogenĤ v pĤGČ (Villani et al., 1994). NapĜíklad textura pĤdy ovlivĖuje sporulaci a schopnost konidií navázat kontakt s potencionálním hostitelem, ale rovnČž i perzistenci a þetnost konidií v pĤdním profilu (Li, Holdom, 1993). Jílové frakce mají snad nejvČtší vliv na pĤdní mikroorganismy z GĤvodu svého velkého a reaktivního povrchu. (Jaronski et al., 2007). Vzájemné interakce mezi pĤdními jílovými minerály a konidiemi hub mohou omezit pronikání konidií pĤdním profilem. Naopak tomu je v písþitých pĤdách, kde se zĜejmČ tyto interakce nevyskytují a neomezují tak pohyb konidií v pĤdním profilu (Ignoffo et al., 1977). PĤda pĜedstavuje mimoĜádnČ heterogenní prostĜedí, dokonce i v metru (Jaronski et al., 2007). VČtšina druhĤ EH je tolerantní k širokému rozpČtí pH (pH 5 - 10), kdy neutrální SĤdní reakce (pH 7) se považuje za optimální. Chemické vlastnosti charakteristické pro jednotlivé pĤdní druhy (typy) mohou ovlivĖovat pĜežívání hub v pĤGČ a vnímavost hostitele k houbové infekci podobnČ jako kationtová výmČnná kapacita a urþité minerály (napĜ. mČć a síra), které jsou do pĤdy obvykle vnášeny ve formČ hnojiv (McCoy et al., 2002).

28

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 5 PrĤEČh životního cyklu B. bassiana a M. anisopliae v severních oblastech mírného pásma

B. bassiana B. bassiana B. bassiana

rostlinná þást? rozptýlení vČtrem infekce hmyzu na rozptýlení deštČm svrchní þásti

rozptýlení hmyzem rostliny

B. bassiana; M. svrchní pĤda B. bassiana; B. bassiana; M. anisopliae anisopliae

M. anisopliae B. bassiana; M. anisopliae úhyn hmyzu produkce konidií vytrvalé konidie infekce hmyzu v pĤGČ

M. anisopliae pĤdní koĜenová pĤsobnost?

Šedé pozadí pĜedstavuje pĤdní prostĜedí. Životní cyklus je založen na souþasných znalostech ekologie hub v mírných oblastech. Významné rozptýlení a infekþní cesty jsou oznaþeny šipkami. V každém ekologickém oddČlení ukazují na význam prostoru pro životní cykly B. bassiana a M. anisopliae.

upraveno podle (Meyling, Eilenberg, 2007)

2. 8. 1. 2 Sluneþní záĜení

Konidie, hyfová tČlíska a hyfy všech Hyphomycetes jsou vysoce náchylné k poškození sluneþním záĜením. Významné rozdíly v citlivosti k záĜení byly zaznamenány i mezi jednotlivými druhy EH. Rozdíl mĤže být mimo jiné zpĤsoben i tím, že konidie hub, které jsou pigmentované, jsou více perzistentní ke sluneþnímu záĜení než konidie obsahující ménČ pigmentu (Ignoffo, Garcia, 1992). PĜirozené sluneþní záĜení o vlnové délce 290 - 400 nm ovlivĖuje perzistenci EH vyskytujících se na povrchu listĤ a v menší míĜe i na ostatních substrátech (Fuxa, 1987). Mikrolokalita, ve které se houby nacházejí, je dĤležitým faktorem ovlivĖujícím jejich perzistenci. 3Ĝežívaní konidií na substrátu, který je exponován pĜímému sluneþnímu záĜení, je podstatnČ sníženo ve srovnání s propagulemi, které jsou pĜed pĜímým sluneþním záĜením chránČny napĜ. rostlinným pokryvem (Inglis et al., 1993). Vlivem UV záĜení se u konidií, které zĤstaly životaschopné snižuje rychlost klíþení, což mĤže být zpĤsobeno následkem pĜímého poškození nukleových kyselin a proteinĤ (Moore et al., 1993). 29

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 8. 1. 3 Pesticidy

Chemické insekticidy, herbicidy a fungicidy jsou obvykle používány v konvenþních zemČGČlských postupech. Tyto slouþeniny a zejména fungicidy jsou používány na rostlinné patogeny, které mohou negativnČ ovlivnit populaci EH. PĜehled dosud publikovaných studií o úþincích chemických pesticidĤ na EH ukazuje, že insekticidy a herbicidy nebyly tak škodlivé na rĤst hub, zatímco fungicidy v nČkterých SĜípadech škodlivé byly (Klingen a Haukeland, 2006). DĤsledkem složitých interakcí a složení agroekosystému nemá aplikace specifických fungicidĤ na výskyt EH v pĤGČ dopad (Meyling, Eilenberg, 2007).

2. 8. 1. 4 Relativní vlhkost

Vysoká relativní vzdušná vlhkost je pro EH nezbytná. Vlhkost nad 90% v mikroprostĜedí okolí houby je nutné pro klíþení, infekci a sporulaci, ale je i považována za nejkritiþWČjší environmentální faktor ovlivĖující vývoj onemocnČní (Hesketh et al., 2009). Voda není dĤležitá pouze pro klíþení infekþních propagulí, ale má rovnČž vliv i na prĤEČh konidiogeneze na povrchu mrtvého hostitele, kdy je zapotĜebí vysoká vlhkost, protože produkce konidií mĤže ovlivnit horizontální rozšíĜení patogena. Vlhkost má významný vliv na perzistenci inokula, nejþastČji vykazují konidie stabilitu ve studených a suchých podmínkách (Inglis et al., 2001). Pouze v období od proniknutí patogena do tČlní dutiny do opČtovného prorĤstání mycelia na povrch tČla, nejsou nároky na vysokou vlhkost v okolním prostĜedí tak vysoké (Landa, 1994). Vliv teploty a vlhkosti spolu velmi úzce koreluje.

2. 8. 1. 5 Teplota

Okolní teplota ovlivĖuje rychlost klíþení, rĤst a následnou smrt hostitele s tvorbou nových konidií (Hasketh et al., 2009). EH se obecnČ Ĝadí mezi mezofilní organismy a optimální teplota pro vČtšinu EH náležejících do tĜídy Hyphomycetes se pohybuje mezi 20 - 25oC, nicménČ infekce a následný vznik onemocnČní mĤže probíhat v teplotním rozmezí 15 - 30oC. PĜi teplotČ nad 30oC je vegetativní rĤst u YČtšiny taxonĤ inhibován a pĜi teplotČ 37oC již rĤst ustává. Je zcela zĜejmé, že okolní teplota má vliv na prĤEČh a rychlost infekce, þímž ovlivĖuje þas potĜebný pro uhynutí 30

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw hostitele (Inglis et al., 2001). Teplota prostĜedí pĜedstavuje dĤležitý faktor, který pĤsobí nejen samostatnČ, ale souþasnČ urþuje i nasycení vzduchu vodními parami (Weiser, 1966). VČtšina druhĤ EH je dokonale adaptována i na dlouhotrvající nízké teploty a SĜežívá i dlouhodobé zmrazení, toho se využívá pĜi dlouhodobém uchovávání všech druhĤ/kmenĤ hub pro laboratorní sbírky. Bylo zaznamenáno, že kolísání teplot má významný vliv na in vitro rĤst mnohých Hyphomycetes. NicménČ, vliv kolísaní teplot v podmínkách in vivo je ménČþastý. Neschopnost EH rĤst pĜi teplotČ lidského tČla má GĤležitý význam pĜi registraci biopreparátu pro komerþní použití (Inglis et al., 2001).

2. 8. 2. Biotické faktory

2. 8. 2. 1 Bakterie

McCoy et al. (2002) pĜedpokládají, že v pĤGČ se vyskytuje pĜibližnČ 464 druhĤ hub a kvasinek a dále bakterie a aktinomycety, jejichž význam a role závisí na fyziologických a morfologických vlastnostech rĤzných typĤ pĤd. Gottlieb (1976) uvádí, že v jednom gramu pĤdy odebraném z povrchové vrstvy na zemČGČlsky obhospodaĜované orné pĤGČ se nachází 106 - 108 bakterií, 106 - 107 aktinomycet, 5 x 104 - 106 houbových propagulí, 105 - 106 prvokĤ a 104 - 5x 105Ĝas. PĜirozenČ se vyskytující SĤdní mikroorganismy a jejich sekundární metabolity vykazují v urþitých pĤdních podmínkách antagonistické pĤsobení ovlivĖující infekþnost a pĜežívání EH v pĤdních ekosystémech (McCoy et al., 2002).

2. 8. 2. 2 Patogen

Patogenita je schopnost patogena vyvolat onemocnČní v hmyzí populaci (Inglis et al., 2001). Pro úspČšnou kontrolu hmyzí populace je nezbytný výbČr vhodného kmene, který je schopný penetrovat a infikovat jedince. U mnoha kmenĤ EH mĤže pĜi jejich opČtovné kultivaci na umČlých živných pĤdách nebo pĜi dlouhodobČjším skladování docházet ke snižování virulence k cílovému škĤdci nebo v horším pĜípadČ PĤže dojít až k úplné ztrátČ této vlastnosti (Goettel, 1992). Za úþelem zachování nebo navýšení virulence použitého kmene, je proto þasto zdĤrazĖována nutnost udržovat virulenci kmenĤ pasážováním pĜes pĜirozeného hmyzího hostitele (Hirte et al., 1989). 31

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 2. 8. 2. 3 Hostitel

a) živoþišný hostitel

Mezi významné fyziologické a morfologické faktory, které ovlivĖují rozvoj onemocnČní zpĤsobených EH v populaci hmyzích hostitelĤ, patĜí populaþní hustota, chování a bionomie hostitele, vývojové stádium, dostupnost potravy, genetický základ, možné mechanické þi chemické poranČní nebo poranČní zpĤsobené parazity nebo predátory. Jeden z nejdĤležitČjších aspektĤ prĤEČhu houbového onemocnČní pĜedstavuje stres. Stresovaný organizmus je více náchylný k onemocnČní vyvolané EH. Stres hmyzu (jedince, populace) mĤže být zpĤsoben jedním nebo více faktory (pĜemnožení populace, nedostatek potravy, vystavení chemickým stresorĤm, nepĜíznivé podmínky prostĜedí nebo ztráta imunity) (Inglis et al., 2001). Vývojové stádium hmyzu pĜedstavuje významný prvek predeterminace prĤEČhu houbového onemocnČní. Ne všechna vývojová stádia hmyzu mohou být infikována EH. V mnoha pĜípadech jsou juvenilní stádia hmyzu (larvy, nymfy) více náchylná k infekci než dospČlci (Butt, Goettel, 2000; Inglis et al., 2001). Juvenilní stádia hmyzu jsou náchylnČjší k nákazám deuteromycetami zpravidla proto, že mají slabší kutikulu a vnČjší kostra nepĜedstavuje tak významnou obrannou bariéru jako v pĜípadČ dospČlcĤ (Weiser, 1966).

V souþasné dobČ je známo jen málo pĜíkladĤ šíĜení konidií EH pomocí biotických vektorĤ. Jedním z pĜíkladĤ jsou chvostoskoci, kteĜí jsou schopni pĜenášet konidie nČkolika druhĤ entomopatogenních hyphomycet na kutikule a v zažívacím traktu (Dromph, 2001) a tak hrají velmi významnou roli pĜi rozšiĜování houbového inokula v pĤGČ.

b) rostlinný hostitel

Mnohé vlastnosti (produkce chemických látek, rĤst, morfologie) hostitelských rostlin mohou mít pĜímý nebo nepĜímý vliv na pĜežívání propagulí EH a jejich úþinnost (Elliot et al., 2000). Rostliny produkují široké spektrum chemických látek, které v závislosti na jejich charakteru, koncentraci a biologické aktivitČ mohou ovlivnit životnost konidií nebo náchylnost škĤdcĤ k EH (Vega et al., 1997; Butt, 2002). 32

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3. MATERIÁL A METODIKA

3. 1 Druhy studovaných entomopatogenních hub

TABULKA 6 Entomopatogenní houby používané v pokusech HOUBA KMEN ZDROJ 3ģVOD ROK Beauveria I101 Ips typhographus ýR (Šumava - Prameny 2004 bassiana Vltavy)

Metarhizium F-52 Cydia pomonella Rakousko 1971 anisopliae Isaria PRF 97 Phenacoccus sp. Florida (Apopka) 1987 fumosorosea

Lecanicillium I9 Ips typhographus ýR (Šumava - Kvilda) 1999 lecanii

Pro úþely pokusĤ byly používány kmeny (TABULKA 6) z mykologické sbírky Katedry rostlinné výroby a agroekologie, oddČlení RostlinolékaĜství na ZemČGČlské fakultČ Jihoþeské univerzity v ýeských BudČjovicích (dále jen KRV). Všechny druhy/kmeny hub v této sbírce byly dlouhodobČ uchovávány ve formČ suchých alginátových pelet s biomasou partikulárního kmene zmrazené pĜi teplotČ -20 až -22ºC.

3. 1. 1 Beauveria bassiana kmen I 101

Kmen oznaþovaný jako Bba I101 byl izolován v roce 2004 v NP Šumava, oblast - Prameny Vltavy. Patogen byl nalezen na dospČlci lýkožrouta smrkového (Ips typographus), ze kterého byl následnČ odizolován pomocí selektivního živného média na bázi fungicidní látky dodine. NáslednČ byl kmen pasážován pĜes umČlou živnou pĤdu PDA (Potato Dextrose Agar). Po úplném pĜHþištČní byly spory imobilizovány do formy alginátových pelet, které jsou uchovávány v mykologické sbírce na KRV.

33

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3. 1. 2 Metarhizium anisopliae kmen F-52

Kmen F-52 (pĤvodní oznaþení M-43) je úþinnou složkou pĜípravku Bio 1020®. Pro experimentální úþely byl na KRV izolován v roce 2009 pĜímo z uvedeného preparátu. Referenþní typový kmen je uložen v americké sbírce mikroorganismĤ pod oznaþením ATCC 90448. V roce 1971 byl kmen, který dostal název Ma43 izolován z mrtvé larvy obaleþe jabloĖového (Cydia pomonella) poslané z Rakouska do Ústavu pro biologickou ochranu v nČmeckém Darmstadtu. Kmen byl patogenní pro mnoho druhĤ hmyzu, a proto byl poslán do rĤzných laboratoĜí. KromČ toho se stal základem pro komerþní vývoj M. anisopliae Bio 1020 pro biologickou ochranu proti lalokonosci rýhovanému (Otiorhynchus sulcatus). PozdČji se izolát stal aktivní složkou nČkolika dalších komerþních produktĤ v USA.

3. 1. 3 Isaria fumosorosea kmen PFR 97

V roce 1993 byl kmen poskytnut oddČlení RostlinolékaĜství KRV firmou Certis USA, kde je uložen ve formČ alginátových pelet v mykologické sbírce. Referenþní typový kmen je uložen v americké sbírce mikroorganismĤ pod oznaþením ATCC 20874. V roce 1994 byla udČlena licence belgické firmČ BIOBEST k používání tohoto preparátu v EvropČ, kde je biopreparát na bázi PFR 97 registrován pod komerþním názvem PreFeRal®WG.

3. 1. 4 Lecanicillium lecanii kmen I9

Kmen I9 byl odizolován z dospČlcĤ lýkožrouta smrkového (Ips typhographus) odchycených feromonovými lapaþi v oblasti NP a CHKO Šumava v roce 1999. Od tohoto roku je tento kmen souþástí mykologické sbírky KRV.

34

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3. 2 Studovaný druh hmyzu

3. 2. 1 Potemník mouþný (Tenebrio molitor L.)

Larvy Tenebrio molitor (dále jen larvy) byly zakoupeny ve specializovaných prodejnách v ý. BudČjovicích. Jsou bČžnČ známy jako žlutí mouþní þervi, mají þásteþQČ sklerotizovanou kutikulu a jsou vhodným hostitelským organismem v biotestech provádČných s entomopatogenními houbami. Zakoupené larvy byly udržovány v chovu na KRV pĜi pokojové teplotČ. Do testu byly vybírány larvy stejné velikosti. Vzhledem k tomu, že larvy se kupují ve specializovaných obchodech a není známo jejich vývojové stádium, je jediným výbČrovým kritériem právČ velikost. Do pokusĤ se vybíraly larvy bez zjevných známek onemocnČní þi mechanického poškození.

3. 3 Používaná živná média Kultivaþní sterilní médium, které bylo rozléváno na Petriho misky, bylo SĜipravováno z polotovarĤ od firem pĤsobících na trhu ýR (EU).

Petriho misky

Tyto misky byly použity pro pČstování kultur mikroorganismĤ v podmínkách in vitro. Mohou být jak sklenČné, tak i plastové, v pĜípadČ mého pokusu se jednalo o plastové misky s víþkem o prĤPČru 90 mm.

UmČlé živné pĤdy

Živné pĤdy byly pĜipraveny ze standardního pĜedem namíchaného práškového agaru, který byl smíchán s vodou, uvaĜen a ve sterilním prostĜedí rozlit do pĜipravených Petriho misek.

3. 3. 1 Potato Dextrose Agar

Hlavním používaným živným médiem byl bramboroglukózový agar (dále jen PDA). PDA byl pĜipraven smícháním 500 ml destilované vody s 12g PDB (Potato Dextrose 35

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Broth) a 8g 2% bakteriologického agaru. SmČs byla uvaĜena ve sterilním prostĜedí a rozlita do pĜipravených Petriho misek o prĤPČru víþka 90 mm.

3. 3. 2 Selektivní média

PatĜí mezi živná média obsahující fungicidy nebo antibiotika, která podporují UĤst entomopatogenních hub a zároveĖ eliminují rĤst saprotrofních hub a bakterií. Citlivé kmeny entomopatogenních hub mohou být kvĤli selektivním složkám v živné SĤGČ potlaþeny a tak mohou dávat nepĜesné údaje o druhové rozmanitosti a hustotČ inokula v prostĜedí. V této práci byly využívány 2 druhy selektivních médií:

3. 3. 2. 1 Potato Dextrose Agar + Antibiotikum

Jedná se o umČlou živnou pĤdu PDA s antibiotickou složkou Chloramfenikol – 0,25g/500ml (dále jen PDA + A). Chloramfenikol inhibuje bakteriální syntézy bílkovin, proto je oznaþován za bakteriostatické antibiotikum.

3. 3. 2. 2 Potato Dextrose Agar + Dodine

NejselektivnČjší používanou živnou pĤdou je PDA s pĜídavkem fungicidní ~þinné látky dodine (dále jen PDA + D). Mimo jiné slouží pro izolaci entomopatogenních hub z pĤdy. Citlivé kmeny entomopatogenních hub mohou být kvĤli selektivní složce dodine v živné pĤGČ potlaþeny a tím se i rĤst kolonií mĤže prodloužit o 3 až 4 dny. Úþinná látka dodine je obsažena z 65% v komerþním fungicidním pĜípravku Syllit 65 WP.

3. 4 Udržování kultur a kultivace entomopatogenních hub

V testech byly použity druhy hub z mykologické sbírky KRV. Všechny entomopatogenní houby v této sbírce jsou dlouhodobČ uchovávány ve formČ alginátových pelet.

36

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Cílem tvorby alginátových pelet je imobilizace biomasy (konidie, blastospory, mycelium, atd.) a její udržování v rozmezí teplot -20 až -22°C. Pro pĜípravu pelet slouží suspenze konidií hub jako základ, dále dvouprocentní alginát sodný (Na sĤl kyseliny alginové) a jemnČ mleté pĜesáté pšeniþné otruby. SmČs otrub a alginátu sodného se smíchá a steriluje. Do vychladlé smČsi se pĜidá suspenze spor v pomČru 1:1. Poslední složkou pro pĜípravu pelet je sterilní roztok chloridu

vápenatého (0,25M CaCl2) do kterého se pomocí nálevky kape pĜipravená smČs a chemická reakce zaruþí vznik pravidelných kuliþek. V roztoku chloridu vápenatého se nechají kuliþky vytvrdit po dobu 1 - 2 hodin. Po uplynutí potĜebné doby je pĜebyteþný roztok odstranČn a samotné kuliþky jsou sušeny v aktivním proudu vzduchu po dobu QČkolika hodin pĜi nižších teplotách, aby nedošlo k poškození imobilizované biomasy. Po vyschnutí jsou pelety ukládány do plastových kontejnerĤ, které jsou oznaþeny a skladovány pĜi již uvedených teplotách. Takto formulované spory je možno uchovávat po Ĝadu let bez jakýchkoli kvalitativních zmČn. Pro aktivaci (oživení) již uložených kmenĤ z mykologické sbírky se používají sterilní vlhké komĤrky (Petriho misky) s dvouprocentním bakteriologickým agarem. Na povrch Petriho misky se pravidelnČ rozmístí pelety (5 - 10 ks). Inkubace probíhá po dobu 3 - 5 dnĤ pĜi teplotČ 23 ± 2 °C. Zhruba 2 - 3 dny po zahájení inkubace na povrchu pelet zaþne rĤst mycelium, které 4. - 5. den zaþíná sporulovat. V dobČ, kdy je na peletách již sporulující mycelium, je možné novČ vytvoĜené spory pĜeoþkovat na sterilní živnou pĤdu, þímž se získá základní kultura pro další fáze pokusĤ.

3. 5 PĜíprava základní konidiové suspenze kmenĤ entomopatogenních hub

Pro pokusy byly využívány konidiové suspenze, získané pĜelitím povrchu plnČ sporulující kultury, která byla kultivována na PDA po dobu 10 - 14 dnĤ sterilní destilovanou vodou. Sterilizovaná destilovaná voda obsahovala pĜídavek 0,05% Tween 80 (dále jen roztok Tween). Suspenze se ĜádnČ protĜepaly a následnČ se pĜelily pĜes sterilní gázu do sterilní Erlenmeyerovy baĖky za úþelem odstranČní shlukĤ konidií resp. kusĤ mycelia. V pĜípadČ potĜeby byly Erlenmeyerovy baĖky umístČny na tĜepaþku a WĜepány po dobu 15 min. pĜi 200 r.p.m.. Takto pĜipravené suspenze se dle potĜeby naĜedily a po opČtovné homogenizaci se nanesly do poþítací komĤrky (hematocymetr) pod svČtelný mikroskop a v pĜedem stanoveném poþítacím poli se po sedimentaci 37

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw konidií stanovil titr. Hodnota titru byla vypoþítána na základČ dvou opakování (horní a dolní poþítací pole komĤrky). Všechny základní suspenze byly poté adjustovány na standardní titr 1x106 konidií/ml (dále jen standardní titr suspenze).

3. 6 Metodika provádČných pokusĤ

3. 6. 1 Standardní test klíþivosti – GI (Germination Index)

Cílem testu klíþivosti bylo zjistit procento klíþivosti pĜíslušné populace konidií. Byl odebrán vzorek standardního titru suspenze 1x106/ml. Tato konidiová suspenze byla laboratorní kliþkou nanesena podélnČ na sterilní povrch živné pĤdy PDA na podložním sklíþku v podobČ 10 kapek. Po zaschnutí se sklíþko vložilo do vlhké komĤrky, kterou tvoĜily Petriho misky, na jejichž dnČ byl vlhký filtraþní papír. Petriho misky byly uloženy do vytemperovaného termostatu na požadovanou teplotu 25°C. Vyhodnocení se provádČlo po 24 hod. pomocí svČtelného mikroskopu. Hodnoceno bylo minimálnČ 100 spor z vybraných sekcí (zorné pole mikroskopu). Ke každé konidii byl pĜLĜazen SĜíslušný index GI (TABULKA 7), který specifikuje vývoj patogena a stupeĖ naklíþení. Z vyhodnocených vzorkĤ bylo vypoþteno procento klíþivosti.

38

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 7 Hodnotící indexová stupnice (GI) pro kmeny entomopatogenních hub G index Charakteristika

0 na konidiích nejsou zĜejmé žádné morfologické zmČny

0,5 konidie jsou zĜetelnČ protáhlejší, nabobtnalé, na konidii je zĜetelný jednostranný klíþek velikosti v pomČru pĜibližnČ 1:0,5 k mateþné konidii

1 velikost klíþku na konidii je v pomČru 1:1 k velikosti mateþné konidie

1,5 primární klíþek je 2-3 x delší než mateþná konidie, na mateþné konidii jsou ]Ĝejmé 2 kratší klíþky

2 klíþek je více než 3 x tak dlouhý jako mateþná konidie, sekundární vČtvení na jednom z klíþku, na mateþné konidii jsou dva dlouhé klíþky

2,5 poþátek sporulace

3 plná sporulace

(upravené schéma používané na oddČlení RostlinolékaĜství KRV)

3. 6. 2 Standardní test CFU (Colony Forming Units)

Principem testu je stanovení specifického údaje kvantitativní povahy, který udává, z kolika infekþních propagulí patogena se pĜi kultivaci na umČlé živné pĤGČ vytvoĜí samostatná kolonie. Pro základ testu CFU byl použit standardní titr suspenze 1x106/ml.Tato suspenze byla naĜedČna na výchozí suspenzi pro jednotlivé kmeny o titru 5x102/ml a souþasnČ na výchozí suspenzi pro kombinace jednotlivých kmenĤ o titru 5x102/ml (2,5x102/ml pro jeden kmen + 2,5x102/ml pro další kmen v dané kombinaci). Výchozí suspenze v množství 0,5 ml se v sedmi opakováních nanášela na Petriho misky obsahující živná média PDA, PDA + A, PDA + D. Nanesené suspenze se dĤkladnČ rozetĜely pomocí inokulaþní hokejky pohybem na otoþném stolku. Na svrchní stranu Petriho misky byl zaznamenán kmen houby, pĜíslušný titr suspenze a datum provedení vzorkĤ. Po zaschnutí suspenze (cca 24 hod.) byly Petriho misky uloženy do igelitových sáþNĤ a 39

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw umístČny do termostatu vytemperovaného na 25°C. Hodnocení poþtu kolonií CFU se provádČlo 4. a 7. den (4. den PDA a PDA+A a 7. den PDA+D). Z hodnocené sady se do vlastního výpoþtu bralo 5 hodnot (minima a maxima z jednotlivých opakování se nezapoþítávala). Pro kontrolní variantu se na konci pokusu odebralo 0,5 ml roztoku Tween a ve WĜech opakováních se nanášelo na povrch PDA v Petriho misce. SpoleþQČ s ostatními vzorky byly kontrolní varianty dále uchovávány ve stejných podmínkách.

3. 6. 3 Standardní laboratorní biotest

Na zaþátku testu se larvy povrchovČ sterilovaly pĜelitím jednoprocentního roztoku SAVA (0,05% NaClO). NáslednČ se v co nejkratší dobČ 3x promyly sterilní vodou (larvy T. molitor jsou citlivé a pĜi pomalém postupu mohou zemĜít). Pro rychlé oschnutí se larvy umístily na filtraþní papír. Do standardního titru suspenze 1x106/ml se larvy ponoĜily na 2s. Namoþené larvy se umístily do vlhkých komĤrek (krabiþky na tkáĖové kultury o 12ti buĖkách se dvČma filtraþními papírky na dnČ každé buĖky, zvlhþené roztokem Tween). V testu bylo použito 25 larev. Vlhké komĤrky byly uloženy do vytemperovaného termostatu s požadovanou teplotu 20°C. Hodnocení pokusĤ bylo provádČno 1. - 10. den pomocí svČtelné binolupy. Každé larvČ byl pĜLĜazen pĜíslušný index FDI charakterizující klíþovou fázi vývoje houby (TABULKA 8). Pomocí regresní analýzy byl z jednotlivých stanovených indexĤ stanoven výsledný index 1,5. Pro kontrolní variantu byl na konci testu použit stejný postup, jen standardní titr suspenze kmenĤ byl nahrazen roztokem Tween.

40

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 8 Hodnotící indexová stupnice (FDI) pro T. molitor

INDEX VÝVOJE POPIS SYMPTOMģ Fotografie

na larvách nejsou vidČt žádné známky 0 infekce

na larvách se objevují drobné 0,5 melanizaþní skvrny, postupnČ po celém povrchu, ještČ se nespojují

YČtší melanizaþní skvrny, které se 1 mohou zaþít spojovat, skvrny jsou þerné

mezi hrudními konþetinami larev se

objevuje vláknité mycelium, pouze 1,5 jednotlivé hyfy

mycelium zaþíná tvoĜit vatovité 2 struktury, zatím nemá vyvinuté fruktifikaþní orgány

na konci hyf mycelia se zaþínají

objevovat sporulující konidiofory, 2,5 poþínající sporulace

larva je pokrytá plnČ sporulujícím

myceliem, které tvoĜí nové konidie ve 3 velkém poþtu

(upravené schéma používané na oddČlení RostlinolékaĜství KRV) 41

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3. 6. 4 Konkurenþní test - porovnání úþinnosti vybraných kmenĤ entomopatogenních hub v kombinaci

Test se provádČl na vybraných larvách, které prošly standardním biotestem. Larva, která vykazovala stupeĖ sporulace (tzn. stupeĖ 2,5 a 3), byla vyjmuta z vlhké komĤrky a vložena do zkumavky s roztokem Tween. Následným promícháním na vertexu došlo k uvolnČní spor z povrchu tČla larvy. V poþítací komĤrce byla spoþítána koncentrace tČchto spor. Suspenze byla dále adjustována na koncentraci 1x106 a následnČ naĜedČna na koncentraci 1x102. Pro stanovení CFU byla na povrch PDA+D v Petriho misce nanesena suspenze o koncentraci 1x102 v množství 0,5 ml. Suspenze se po povrchu agaru pravidelnČ rozptýlila pomocí inokulaþní hokejky pohybem na otoþném stolku. Byla provedena 3 opakování na každou reprezentující larvu. Po dĤkladném vsáknutí (zaschnutí) suspenze se vzorky uložily do igelitových sáþNĤ a umístily do termostatu vytemperovaného na 25°C. Hodnocení jednotlivých Petriho misek probíhalo cca po 7 dnech, kdy byly jednotlivé kultury dobĜe morfologicky rozlišitelné. Hlavním cílem bylo zjistit jaký kmen houby se na povrchu larvy dokáže prosadit (rĤstu mycelia a produkce spor). Pro kontrolní variantu byla použita larva z kontrolní varianty standardního biotestu. Vyjmutá larva z vlhké komĤrky byla vložena do zkumavky s roztokem Tween a následnČ promíchána na vertexu. Ze zkumavky byl odebrán kontrolní vzorek na PDA+D.

3. 6. 5 Radiální rĤst a výtČžnost

Suspenze o standardním titru 1x106/ml byla nanesena pomocí sterilní kliþky ve formČ kapky do stĜedu Petriho misky s umČlým živným médiem PDA v 5 opakováních. Po zaschnutí kapky se Petriho misky vložily v plastikových sáþcích do termostatu, který byl vytemperován na teplotu 25°C. Hodnocení a mČĜení prĤPČru stĜedových kultur se provádČlo po 21 dnech, nejménČ u 4 kultur od každého kmene. Hodnocení radiálního rĤstu probíhalo na základČ PČĜení dvou na sebe kolmých prĤPČUĤ získané stĜedové kultury. Ze zjištČných rozmČUĤ se vypoþítala plocha kultury.

42

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Po zmČĜení a vyfotografování kultur následovala jejich homogenizace. Ze živného média se vyĜízla pouze porostlá þást, která se vložila do mixéru, kde po dobu 20 s probíhala homogenizace. Poþítání spor se provádČlo v kalibrované poþítací komĤrce pod svČtelným mikroskopem. Poþítalo se vždy ze dvou opakování, výsledná hodnota byla jejich prĤPČrem. ZjištČné hodnoty byly upraveny podle velikosti kultury na hodnoty reprezentující množství spor na kulturu, resp. na 1mm2.

3. 6. 6 Interakce

Základní suspenze jednotlivých kmenĤ a kmenĤ v kombinaci o standardním titru byla nanesena na umČlá živná média PDA. Nanášelo se pomocí inokulaþní kliþky ve formČ jedné kapky nalevo a napravo od stĜedu Petriho misky v pomyslné rovinČ 2,5 cm od okraje Petriho misky. Po zaschnutí kapky na živném médiu PDA se Petriho misky vložily v igelitových sáþcích do termostatu, který byl vytemperován na teplotu 25°C. Hodnocení interakce kultur se provádČlo po 21 dnech nejménČ u 3 kultur od každého z kmenĤ.

3. 7 Využívaná technika pĜi pokusech

Pro veškerou laboratorní þinnost ve sterilním prostĜedí byl využíván flow box BIOHAZARD. Používané laboratorní pomĤcky byly sterilizovány ve sterilizátoru STERICELL. PĜi vyhodnocování pokusĤ a tvorbČ originální digitalizované fotodokumentace bylo použito zaĜízení (Canon EOS 300D Digital), které je k dispozici na KRV (svČtelný mikroskop Nikon a binokulární mikroskop Weiss). PĜevážná vČtšina foto obrázkĤ vybraných a zaĜazených do diplomové práce jsou originály.

43

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 4. EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST A VÝSLEDKY

POKUS 1

Standardní test klíþivosti – GI (Germination Index) Cílem tohoto testu je zjistit procento klíþivosti a stupeĖ naklíþení pĜíslušné populace konidií.

Základní údaje k pokusu: x odebrán vzorek standardního titru suspenze 1x106/ml x konidiová suspenze laboratorní kliþkou nanesena podélnČ na sterilní povrch živné pĤdy PDA na podložním sklíþku v podobČ 10 kapek x po zaschnutí se sklíþko vložilo do vlhké komĤrky, kterou tvoĜily Petriho misky, na jejichž dnČ byl vlhký filtraþní papír x Petriho misky byly uloženy do vytemperovaného termostatu na požadovanou teplotu 25°C x vyhodnocení se provádČlo po 24 hod. pomocí svČtelného mikroskopu x hodnoceno bylo minimálnČ 100 spor z vybraných sekcí (zorné pole mikroskopu) x ke každé konidii byl pĜLĜazen pĜíslušný index GI, který specifikuje vývoj patogena a stupeĖ naklíþení x z vyhodnocených vzorkĤ bylo vypoþteno procento klíþivosti

TABULKA 9 Klíþivost a rĤst kmenĤ KMENY PRģ0ċR GI KlLÍýIVOST % I 101 2 100 F-52 1,99 100 PFR 97 2 100 I 9 2 100 I 101 + F-52 1,99 100 I 101 + PFR 97 2 100 I 101 + I 9 2 100 F-52 + PFR 97 2 100 F-52 + I 9 2 100 PFR 97 + I 9 2 100

44

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

Výsledek pokusu:

U všech kmenĤ (samostatné i v kombinaci) byla klíþivost po 24 hodinách 100%. V kombinaci se druhy hub negativnČ neovlivĖují (klíþivost byla dČlána na živné pĤGČ PDA). Po 48 hod. všechny druhy hub (samostatné i v kombinaci) dosahovaly indexu 2,5-3.

POKUS 2 Standardní test CFU na živných pĤdách PDA, PDA + A, PDA + D pro jednotlivé kmeny

Cílem pokusu je zjistit jestli živné pĤdy (PDA, PDA + A, PDA + D) ovlivĖují jednotlivé kmeny EH.

Základní údaje k pokusu:

x použit standardní titr suspenze 1x106/ml x suspenze byla naĜedČna na výchozí suspenzi pro jednotlivé kmeny o titru 5x102/ml x výchozí suspenze v množství 0,5 ml (= titr 2,5x102/ml) se v sedmi opakováních nanášela na Petriho misky obsahující živná média PDA, PDA + A, PDA + D x nanesené suspenze se dĤkladnČ rozetĜely pomocí inokulaþní hokejky pohybem na otoþném stolku x po zaschnutí suspenze (cca 24 hod.) byly Petriho misky uloženy do igelitových sáþNĤ a umístČny do termostatu vytemperovaného na 25°C x hodnocení poþtu kolonií CFU se provádČlo 4. a 7. den (4. den PDA a PDA+A a 7. den PDA+D) x do vlastního výpoþtu se bralo 5 hodnot (minima a maxima z jednotlivých opakování se nezapoþítávala)

45

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

Výsledek pokusu: Kontrola: A) Všechny druhy živných pĤd (PDA, PDA + A, PDA + D) porostly koloniemi jednotlivých kmenĤ.

B) I 101 kolonie byly rovnomČrnČ rozmístČny na povrchu živné pĤdy, prĤEČh UĤstu byl normální. Na tĜech rozdílných pĤdách byla zaznamenána nepatrná klesající tendence v poþtu narostlých kolonií a to z PDA na PDA+A a na PDA+D. Procentická odchylka mezi živnými pĤdami není YČtší než 2%.

C) F-52 kolonie byly rovnomČrnČ rozmístČny na povrchu živné pĤdy, prĤEČh UĤstu byl normální. Na tĜech rozdílných pĤdách byla zaznamenána nepatrná klesající tendence v poþtu narostlých kolonií a to z PDA na PDA+D a na PDA+A. Na živných pĤdách PDA+A byly zaznamenány v 7 opakováních skokovČ odlišné poþty kolonií. Procentická odchylka mezi živnými pĤdami je 7%.

D) PFR 97 kolonie byly rovnomČrnČ rozmístČny na povrchu živné pĤdy, prĤEČh rĤstu byl normální. Na tĜech rozdílných pĤdách byla zaznamenána klesající tendence v poþtu narostlých kolonií a to z PDA+D na PDA a na PDA+A. Procentická odchylka mezi živnými pĤdami je pĜes 15%.

E) I 9 kolonie byly rovnomČrnČ rozmístČny na povrchu živné pĤdy, prĤEČh UĤstu byl normální. Na tĜech rozdílných pĤdách byla zaznamenána nepatrná klesající tendence v poþtu narostlých kolonií a to z PDA+A na PDA+D a na PDA. Procentická odchylka mezi živnými pĤdami je 8%.

46

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw GRAF 1

PrĤPČrný poþet kolonií v CFU jednotlivých kmenĤ, každé živné pĤdy zvlášĢ

STANDARDNÍ TEST CFU PRO JEDNOTLIVÉ KMENY I 9 I 101

1 F-52 PFR 97

Ý 0,9 E I N 0,8 N R

ċ O 0,7 L M 0,6 O ģ

K 0,5 R P T

0,4 ) E

6 0,3 ( ý 0 O

1 0,2 P x 0,1 0 PDA PDA + A PDA+D

TABULKA 10

Vyhodnocení CFU max. a min. poþet kolonií pro jednotlivé kmeny na rĤzných živných SĤdách ŽIVNÁ PģDA PDA PDA + A PDA + D

KMEN TVOěÍCÍ NEJPOýETĕÉJŠÍ I 9 I 9 I 9 KOLONII Ø POýET SPOR TVOěÍCÍ KOLONII 0,741·106 0,824·106 0,764·106 SMODCH ±11,37 ±9,37 ±4,45 KMEN TVOěÍCÍ NEJMÉNċ PFR 97 PFR 97 F-52 POýETNOU KOLONII Ø POýET SPOR TVOěÍCÍ KOLONII 0,608·106 0,576·106 0,628·106 SMODCH ±4,87 ±8,11 ±13,37

Zhodnocení pokusu:

Kmeny I 101, F-52 a I 9 nejsou ovlivĖovány živnými pĤdami. Procentická odchylka mezi živnými pĤdami nebyla vČtší jak 10%.U kmene PFR 97 je pozorováno že živné pĤdy ovlivĖují rĤst a tvorbu kolonií. Procentická odchylka mezi živnými SĤdami je vČtší než 10 %. Na rĤzných živných pĤdách tvoĜil nejpoþetnČjší kolonie kmen I 9. Naopak nejménČ poþetné kolonie tvoĜil kmen PFR 97 na živných pĤdách PDA a PDA + A. Na PDA + D vytvoĜil nejménČ poþetnou kolonii kmen F-52.

47

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw POKUS 3 Standardní test CFU – pro kmeny v kombinaci

Cílem pokusu je zjistit jestli se mezi sebou jednotlivé kmeny ovlivĖují v kombinacích kmenĤ a jestli se ovlivĖování mČní s druhem živné pĤdy.

Základní údaje k pokusu:

x použit standardní titr suspenze 1x106/ml x suspenze byla naĜedČna na výchozí suspenzi pro kombinace jednotlivých kmenĤ o titru 5x102/ml (2,5x102/ml pro jeden kmen + 2,5x102/ml pro další kmen v dané kombinaci). x výchozí suspenze v množství 0,5 ml (= titr 1,25x102/ml) se v sedmi opakováních nanášela na Petriho misky obsahující živná média PDA, PDA + A, PDA + D x nanesené suspenze se dĤkladnČ rozetĜely pomocí inokulaþní hokejky pohybem na otoþném stolku x po zaschnutí suspenze (cca 24 hod.) byly Petriho misky uloženy do igelitových sáþNĤ a umístČny do termostatu vytemperovaného na 25°C x hodnocení poþtu kolonií CFU se provádČlo 4. a 7. den (4. den PDA a PDA+A a 7. den PDA+D) x do vlastního výpoþtu se bralo 5 hodnot (minima a maxima z jednotlivých opakování se nezapoþítávala)

48

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw GRAF 2 GRAF 3 kombinace kmenĤ I 101 + F-52 kombinace kmenĤ I 101 + I 9

STANDARDNÍ TEST CFU PRO I 101 STANDARDNÍ TEST CFU PRO I 101 KOMBINACE KMENģ I 101 a F-52 F -52 KOMBINACE KMENģ I 101 a I 9 I 9

1

Ý 0,9 E 1 I N 0,8 0,9 Ý E N R 0,8 N I R N 0,7 ċ O 0,7 ċ O L L 0,6 M M O

0,6 ģ O

ģ K 0,5 0,5 R P K T R )

E 0,4

0,4 6 P ( T ý

0 ) 0,3 O 0,3 E 1 P 6 x

( 0,2ý 0,2

0 0,1 O

1 0,1

P 0 x 0 PDA PDA + A PDA+D PDA PDA + A PDA+D ŽIVNÉ PģDY ŽIVNÁ PģDA

GRAF 4 GRAF 5 kombinace kmenĤ I 101 + PFR 97 kombinace kmenĤ F-52 + PFR 97

STANDARDNÍ TEST CFU PRO I 101 STANDARDNÍ TEST CFU PRO F - 52

KOMBINACE KMENģ I 101 a PFR PFR 97 KOMBINACE KMENģ F-52 a PFR 97 T T PFR 97

E 1 E 1 ý 0,9 ý 0,9 O O

P P 0,8

0,8 Ý Ý

E 0,7 E 0,7 I I N N

N 0,6 N 0,6 R R

ċ O 0,5 ċ O 0,5 L L M 0,4 M 0,4 O O ģ ģ K K

R 0,3 R 0,3 P P

0,2 0,2 ) )

6 0,1 6 0,1 ( (

0 0 0 0 1 1 x PDA PDA + A PDA+D x PDA PDA + A PDA+D ŽIVNÁ PģDA ŽIVNÁ PģDA

GRAF 6 GRAF 7 kombinace kmenĤ F-52 + I 9 kombinace kmenĤ I 9 + PFR 97

STANDARDNÍ TEST CFU PRO F - 52 STANDARDNÍ TEST CFU PRO I 9 KOMBINACE KMENģ F-52 a I 9 I 9 KOMBINACE KMENģ I 9 a PFR 97 PFR 97 1

1 Ý Ý

E 0,9 E 0,9 I I N N 0,8 N

N 0,8 R R ċ O ċ O 0,7 0,7 L L M 0,6 M 0,6 O O ģ 0,5 ģ 0,5 K K R R

P

P 0,4 T T

0,4 ) ) E 0,3 E

6 6 0,3 ( ý 0,2 ( ý 0 0 0,2 O O 1 0,1 1 P P

x x 0,1 0 0 PDA PDA + A PDA+D PDA PDA + A PDA+D ŽIVNÁ PģDA ŽIVNÁ PģDA

49

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 11 Vyhodnocení CFU max. a min. poþet kolonií pro jednotlivé kmeny v kombinacích na UĤzných živných pĤdách ŽIVNÁ PģDA PDA PDA + A PDA + D KOMBINACE KMENģ TVOěÍCÍ NEJPOýETĕċJŠÍ KOLONII I 101 + I 9 I 101 + F-52 I 101 + I 9 Ø POýET SPOR TVOěÍCÍCH KOLONII 0,600x106 + 0,728x106 0,816x106 + 0,624x106 0,744x106 + 0,528x106 SMODCH ± 1,85 ± 7,31 ± 3,44 ± 3,01 ± 8,89 ± 4,71 KOMBINACE KMENģ TVOěÍCÍ NEJMÉNċ POýETNOU KOLONII F-52 + PFR 97 F-52 + PFR 97 F-52 + I 9 Ø POýET SPOR TVOěÍCÍCH KOLONII 0,392x106 + 0,656x106 0,380x106 + 0,648x106 0,576x106 + 0,432x106 SMODCH ± 4,44 ± 5,34 ± 1,02 ± 5,84 ± 1,85 ± 8,01

Výsledek pokusu: Kontrola: A) Všechny druhy živných pĤd (PDA, PDA + A, PDA + D) porostly koloniemi jednotlivých kmenĤ v kombinacích.

B) I 101 + F-52 na PDA, F-52 tvoĜilo celoplošnČ menší kolonie. Na PDA+A, F-52 tvoĜilo celoplošnČ menší kolonie. Na živné pĤGČ PDA+D už netvoĜí oba dva druhy hub mezi sebou zóny celoplošnČ, ale naopak kmen I 101 tvoĜí menší kolonie a vrĤstá do F-52. F-52 potlaþuje I 101 v rĤstu (PěÍLOHA 1).

C) I 101 + PFR 97 na PDA vytváĜí celoplošnČ I 101 menší kolonie v blízkosti PFR 97. Na PDA+A vytváĜí celoplošnČ I 101 menší kolonie v blízkosti PFR 97 má I 101 zmČQČný (jiný) genotyp (PěÍLOHA 2). Na živné pĤGČ PDA+D vytváĜí celoplošnČ I 101 menší velikost kolonie a normální vzhled.

D) I 101 + I 9 na živných pĤdách PDA, PDA+A a PDA+D se tyto druhy vzájemnČ neovlivĖují.

50

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw E) F-52 + PFR 97 na PDA tvoĜí celoplošnČ F-52 menší a potlaþené kolonie YĤþi druhu PFR 97. Na PDA+A tvoĜí celoplošnČ F-52 opČt menší a potlaþené kolonie vĤþi druhu PFR 97. Na živné pĤGČ PDA+D tvoĜí celoplošnČ F-52 vČtší kolonie než na pĤdách PDA a PDA+A.

F) F-52 + I 9 na PDA a PDA+A se celoplošnČ oba druhy neovlivĖují ani pĜi vrĤstání v blízkosti do sebe. I 9 tvoĜí na celé ploše vČtší poþet kolonií. Na PDA+D vytváĜí celoplošnČ F-52 vČtší kolonie a naopak I 9 tvoĜí menší poþet kolonií.

G) PFR 97 + I 9 na PDA a PDA+A se celoplošnČ oba druhy neovlivĖují ani SĜi vrĤstání v blízkosti do sebe.Na PDA+D vytváĜí celoplošnČ I 9 menší kolonie.

Zhodnocení pokusu: Na PDA a PDA + D tvoĜil nejpoþetnČjší kolonie v kombinaci kmenĤ kombinace I 101 + I 9. Na PDA + A tvoĜil nejpoþetnČjší kolonii v kombinaci kmenĤ kombinace I 101 + F-52. Kmen I 101 se jeví jako kmen který tvoĜí poþetné kolonie v kombinaci s kmeny I 9 a F-52. Naopak nejménČ poþetné kolonie tvoĜil kmen PFR 97 na živných SĤdách PDA a PDA + A. Na PDA + D vytvoĜil nejménČ poþetnou kolonii kmen F-52.

POKUS 4 Standardní laboratorní biotest na hmyzím hostiteli Tenebrio molitor

Principem testu je zjistit kdy dosáhnou kmeny na larvČ vývojového indexu 1,5 (FDI).

Základní údaje k pokusu: x larvy se povrchovČ sterilovaly pĜelitím jednoprocentního roztoku SAVA (0,05% NaClO), dále se v co nejkratší dobČ 3x promyly sterilní vodou a umístily na filtraþní papír x do standardního titru suspenze 1x106/ml pro jednotlivé kmeny se larvy ponoĜily na 2s („dip-test“) 51

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw x pro kombinace jednotlivých kmenĤ se standardní suspenze naĜedila na výchozí suspenzi o titru 1x106/ml (5x105/ml pro jeden kmen + 5x105/ml pro další kmen v dané kombinaci) a larvy se ponoĜily na 2s („dip-test“) x namoþené larvy se umístily do vlhkých komĤrek (krabiþky na tkáĖové kultury o 12ti buĖkách se dvČma filtraþními papírky na dnČ každé buĖky, zvlhþené roztokem Tween) x v testu bylo použito 25 larev x vlhké komĤrky byly uloženy do vytemperovaného termostatu s požadovanou teplotu 20°C x hodnocení pokusĤ bylo provádČno 1. - 10. den pomocí svČtelné binolupy x ke každé larvČ byl pĜLĜazen pĜíslušný index FDI charakterizující klíþovou fázi vývoje houby x pomocí regresní analýzy byl z jednotlivých stanovených indexĤ stanoven výsledný index 1,5

GRAF 8 PrĤEČh standardního biotestu pro jednotlivé kmeny a kmeny v kombinacích na larvČ Tenebrio molitor

PRģ%ċH STANDARDNÍHO BIOTESTU VŠECH KMENģ I 101 3 F-52

2,5 PFR 97

E

J I 9

O 2 V I 101+F-52 Ý V 1,5

X I 101+PFR 97 E D

N 1 I 101+I 9 I

0,5 F-52+PFR 97 F-52+I 9 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PFR 97+I 9 DNY

52

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

GRAF 9 Dosažený vývojový index 1,5 podle FDI na larvČ Tenebrio molitor, seĜazeno od kmenĤ které dosáhnou index 1,5 jako první

DOSAŽENÝ VÝVOJOVÝ INDEX 1,5 PODLE FDI NA 10 LARVċ 9 8 7 6 Y

N 5 D 4 3 2 1 0

7 9 9 7 1 2 2 9 I I 7 9 I9 I9 0 -5 -5 + + 9 + 1 F F R 2 1 R R 7 I F 5 0 F F 9 + P - 1 P P 1 + F I + R 0 2 1 F 1 -5 0 P I F KMEN I1

Výsledek pokusu: Kontrola: A) Všechny larvy namoþené do standardního a výchozího titru 1x106/ml byly mrtvé a porostlé testovanými kmeny.

Zhodnocení pokusu:

Na larvách se prosadily ke konci 5. dne jednotlivé kmeny I 101 a F-52 (PěÍLOHA 3), které dosáhly vývojového indexu houby 1,5 podle FDI jako první. Vývojový index 1,5 dosáhl jako poslední kmen I 9 na konci 8 dne.V kombinaci kmenĤ se prosadily na larvách kmeny na zaþátku 6 dne I 101 + F-52, které dosáhly vývojového indexu houby 1,5 podle FDI jako první. Vývojový index 1,5 dosáhl jako poslední kmen PFR 97 + I 9 na zaþátku 8 dne.

53

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

POKUS 5 Sledování prĤEČhu infekce na povrchu hostitelské larvy Tenebrio molitor – konkurenþní test

Cílem testu bylo zjistit, který kmen se prosadil (rĤstu mycelia a produkce spor) na larvách, které byly ponoĜené do suspenze z kombinace kmenĤ (Standardní laboratorní biotest).

Základní údaje k pokusu:

x larvy se povrchovČ sterilovaly pĜelitím jednoprocentního roztoku SAVA (0,05% NaClO), dále se v co nejkratší dobČ 3x promyly sterilní vodou a umístily na filtraþní papír x pro kombinace jednotlivých kmenĤ se standardní suspenze 1x106/ml naĜedila na výchozí suspenzi o titru 1x106/ml 1:1 (5x105/ml pro jeden kmen + 5x105/ml pro další kmen v dané kombinaci) a larvy se ponoĜily na 2s („dip-test“) x namoþené larvy se umístily do vlhkých komĤrek (krabiþky na tkáĖové kultury o 12ti buĖkách se dvČma filtraþními papírky na dnČ každé buĖky, zvlhþené roztokem Tween) x v testu bylo použito 25 larev x vlhké komĤrky byly uloženy do vytemperovaného termostatu s požadovanou teplotu 20°C x hodnocení pokusĤ bylo provádČno 10. den pomocí svČtelné binolupy x ke každé larvČ byl pĜLĜazen pĜíslušný index FDI charakterizující klíþovou fázi vývoje houby x larva, která vykazovala stupeĖ sporulace (tzn. stupeĖ 2,5 a 3) byla vyjmuta z vlhké komĤrky a vložena do zkumavky s roztokem Tween x následným promícháním na vertexu došlo k uvolnČní spor z povrchu tČla larvy x suspenze byla dále adjustována na koncentraci 1x106ml a následnČ naĜedČna na koncentraci 1x102 ml

54

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw x pro stanovení CFU byla na povrch PDA+D v Petriho misce nanesena suspenze o koncentraci 1x102 v množství 0,5 ml x suspenze se po povrchu agaru pravidelnČ rozptýlila, byla provedena 3 opakování na každou reprezentující larvu x po dĤkladném vsáknutí (zaschnutí) suspenze, se vzorky uložily do igelitových sáþNĤ a umístily do termostatu vytemperovaného na 25°C x hodnocení cca po 7 dnech, kdy byly jednotlivé kultury dobĜe morfologicky rozlišitelné

GRAF 10 Kombinace kmenĤ na larvČ 10. den

KOMBINACE KMENģ NA LARVċ 10. DEN

E

J 3

O 2,5 V 2 Ý

V 1,5

X 1

E 0,5 D 0 N I 2 7 9 7 9 9 -5 9 I 9 I I F R + R + + 2 1 7 + F -5 F 0 9 1 P P 1 10 + F + I R I 2 1 F -5 0 P F I1 KMEN

TABULKA 12 Vyhodnocení kmenĤ v kombinaci na hmyzím hosti KOMBINACE I 101 F-52 F-52 I 101 I 101 PFR 97 KMENģ + F-52 + PFR 97 + I 9 + PFR 97 + I 9 + I 9

Ø INDEX VÝVOJE 2,90 2,85 2,85 2,65 2,65 1,25

±SMODCH ±0,24 ±0,25 ±0,33 ±0,43 ±0,32 ±0,77

55

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

TABULKA 13 Vyhodnocení konkurenþního testu CFU

KOMBINACE I 101 I 101 I 101 F-52 F-52 PFR 97 KMENģ + F-52 + PFR 97 + I 9 + PFR 97 + I 9 + I 9 POýET VYTVOěENÝCH 6 + 11 1 + 11 2 + 24 18 + 3 1 + 32 10 + .5 KOLONIÍ A PROSAZUJÍCÍ F-52 PFR 97 I 9 F-52 I 9 I 9 KMEN POýET VYTVOěENÝCH 5 + 10 2 + 10 1 + 5 2 + 15 12 + 3 14 + 1 KOLONIÍ A PROSAZUJÍCÍ F-52 PFR 97 I 9 PFR 97 F-52 I 9 KMEN

Výsledek pokusu:

Kontrola: A) Všechny larvy namoþené do výchozího titru 1x106/ml byly mrtvé a porostlé testovanými kmeny.

Zhodnocení pokusu: Na larvách v kombinaci kmenĤ I 101 + F-52 se prosadil kmen F-52. Na larvách v kombinaci kmenĤ I 101 + PFR 97 se prosadil kmen PFR 97. Na larvách v kombinaci kmenĤ I 101 + I 9 se prosadil kmen I 9. Na larvách v kombinaci kmenĤ F-52 + PFR 97 se prosadily oba dva kmeny. Na larvách v kombinaci kmenĤ F 52 + I 9 se prosadily oba dva kmeny. Na larvách v kombinaci kmenĤ PFR 97 + I 9 se prosadil kmen I 9.

56

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

POKUS 6 Radiální rĤst a výtČžnost

Cílem testu bylo zjistit prĤPČr stĜedových kultur vyprodukovaných pĜi kultivaci kmenĤ, následnČ vypoþítat jejich plochu a zjistit množství spor vyprodukovaných pĜi kultivaci kmenĤ na živné pĤGČ. Dále bylo tĜeba rozlišit jednotlivé kmeny vybraných druhĤ EH použitých v testu (PěÍLOHY 4, 5, 6) a podle toho urþit který kmen se více prosazuje na larvách Tenebrio molitor.

Základní údaje k pokusu:

x suspenze o standardním titru 1x106/ml byla nanesena pomocí sterilní kliþky ve formČ kapky do stĜedu Petriho misky s umČlým živným médiem PDA v 5 opakováních x po zaschnutí kapky se Petriho misky vložily v plastikových sáþcích do termostatu, který byl vytemperován na teplotu 25°C x hodnocení a mČĜení prĤPČru stĜedových kultur se provádČlo po 21 dnech, nejménČ u 4 kultur od každého kmene x hodnocení radiálního rĤstu probíhalo na základČ mČĜení dvou na sebe kolmých prĤPČUĤ získané stĜedové kultury x ze zjištČných rozmČUĤ se vypoþítala plocha kultury x po zmČĜení a vyfotografování kultur následovala jejich homogenizace x ze živného média se vyĜízla pouze porostlá þást, která se vložila do mixéru, kde po dobu 20 s probíhala homogenizace x poþítání spor se provádČlo v kalibrované poþítací komĤrce pod svČtelným mikroskopem x poþítalo se vždy ze dvou opakování, výsledná hodnota byla jejich prĤPČrem x zjištČné hodnoty byly upraveny podle velikosti kultury na hodnoty reprezentující množství spor na kulturu, resp. na 1mm2

TABULKA 14 57

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Vyhodnocení radiálního rĤstu a výtČžnosti spor KMENY Ø KULTURY PLOCHA PRODUKCE SPOR PRODUKCE SPOR (mm) (mm2) (SPOR/1 KULTURA) (mm2) I 101 66,00±1,15 3421,19 4,51x109±5,62x108 1,26x106 F-52 63,50±0,58 3166,92 7,04x108±3,75x106 1,97x105 PFR 97 40,00±0,82 1256,64 4,23x108±6,25x107 1,18x105 I 9 51,25±0,50 2062,90 2,25x109±1,25x108 6,30x105 I 101 + F-52 50,25±5,85 1983,18 3,90x109±7,75x108 1,09x106 I 101 + PFR 97 39,88±1,25 1248,79 2,73x108±5,50x107 7,63x104 I 101 + I 9 51,50±0,93 2083,07 3,13x109±1,50x108 8,75x105 F-52 + PFR 97 37,00±1,20 1075,21 1,89x108±1,13x107 5,28x104 F-52 + I 9 51,00±1,07 2042,82 3,45x109±2,50x107 9,66x105 PFR 97 + I 9 36,13±0,99 1024,96 1,84x108±8,13x107 5,14x104

GRAF 11 Vyhodnocení prĤPČUĤ stĜedových kultur vzestupnČ dle velikosti (mm)

PRģ0ċR STěEDOVÝCH KULTUR 70 )

m 60 m (

Y 50 R U

T 40 L U K 30 R ċ

M 20 ģ R

P 10

0

7 9 9 7 7 2 9 9 9 2 1 I 9 9 -5 I I I -5 0 + R R R F + F 1 F + I 7 F F + 2 1 9 P P P 1 -5 0 R + + 0 F 1 2 1 1 I F 5 0 I P - 1 F I KMENY

58

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 15 Rozlišené (prosazující se) kmeny z kombinací stĜedových kultur KMENY Z KOMBINACÍ PROSAZUJÍCÍ SE KMEN I 101 + F-52 F-52 I 101 + PFR 97 PFR 97 I 101 + I 9 I9 F-52 + PFR 97 PFR 97 F-52 + I 9 I9 PFR 97 + I 9 PFR 97

Výsledek pokusu:

Produkce spor je po 21 dnech nejvČtší u kmene I 101 a koreluje s velikostí kultury. SouþasnČ je u tohoto kmene zaznamenán i nejvČtší prĤPČr stĜedové kultury. Naopak nejmenší produkce spor je u kombinací kmenĤ PFR 97 + I 9 a F-52 + PFR 97. I zde produkce spor koreluje s velikostí kultury. SouþasnČ je u tČchto kmenĤ zaznamenán i nejmenší prĤPČr stĜedové kultury. Z testu vyplývá, že kmen PFR 97 tvoĜí nejménČ spor a zároveĖ nejmenší plochu stĜedové kultury z jednotlivých kmenĤ a taktéž z kombinací jednotlivých kmenĤ.

POKUS 7 Interakce

Cílem bylo zjistit jak na sebe pĤsobí jednotlivé kultury kmenĤ bČhem rĤstu.

Základní údaje k pokusu:

x suspenze o standardním titru 1x106/ml byla nanesena na umČlá živná média PDA, pomocí inokulaþní kliþky ve formČ jedné kapky nalevo a napravo od stĜedu Petriho misky v pomyslné rovinČ 2,5 cm od okraje Petriho misky x po zaschnutí kapky na živném médiu PDA se Petriho misky vložily v igelitových sáþcích do termostatu, který byl vytemperován na teplotu 25°C x hodnocení interakce kultur se provádČlo po 21 dnech nejménČ u 3 kultur od každého z kmenĤ

59

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw TABULKA 16 NejvýraznČji se projevující kmen v kombinaci KMENY Z KOMBINACÍ PROJEVUJÍCÍ SE KMEN/Y I 101 + F-52 F-52 i I101 I 101 + PFR 97 PFR 97 I 101 + I 9 I9 F-52 + PFR 97 PFR 97 F-52 + I 9 I9 PFR 97 + I 9 PFR 97

Výsledek pokusu:

Samostatné kmeny se mezi sebou zásadnČ neovlivĖují. V místech možného styku vytváĜí hraniþní zóny (PěÍLOHA 7).Naopak kmeny z kombinací se výraznČ ovlivĖují (PěÍLOHY 8 a 9). NejvýraznČji se v kombinacích projevuje kmen I 9 a kmen PFR 97. Výrazný projev kmene I 9 v kombinaci spoþívá v jeho rychlém rĤstu a zároveĖ v tvorbČ nejpravidelnČjších kultur, souþasnČ ostatní kmen z kombinace zásadnČ moc neovlivĖuje. Kmen PFR 97 v kombinaci se též výraznČ projevuje, což spoþívá v jeho sice pomalém rĤstu avšak tvorbČ pravidelných kultur a též tvorbČ velkých viditelných hraniþních zón s druhým kmenem z kombinace. F-52 má snahu se prosadit a zároveĖ v kombinacích na hranicích styku kmenĤ ustupuje. Kmen I 101 má též snahu prosadit se a zároveĖ v kombinacích na hranicích styku kmenĤ ustupuje.

60

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 5. DISKUZE A ZÁVċR

Pro metody využívající živých pastí se využívají zejména larvy Galleria mellonella a Tenebrio molitor (Zdroj 3). Pro svĤj výzkum jsem tedy jako živý pokusný materiál zvolil larvy Tenebrio molitor, jelikož jsem je na základČ prostudované literatury a rady vedoucího mé diplomové práce vyhodnotil jako vhodný a též dostupný materiál pro úþely tohoto pokusu.

0,05% roztok Tween 80 (polyethylen glykol sorbitan) (Bohatá, 2005), používaný v mých pokusech je chemická látka schválená v EU jako smáþedlo které zvyšuje smáþendlivost jak suspenzí hub užívaných pro pokusy tak i smáþenlivost výsledných biopreparátĤ.

3Ĝi hodnocení všech þtyĜ kmenĤ EH byly využity laboratorní testy a byly zformulovány následující závČry:

POKUS 1 Standardní test klíþivosti – GI

x udává procento klíþivosti, stupeĖ naklíþení pĜíslušné populace konidií a následný vývoj patogena

Ö100% klíþivost byla po 24 hodinách prokázána u všech þtyĜ kmenĤ EH jak v samostatných pokusech tak v pokusech ve vzájemných kombinacích, tzn. klíþivost není významnČ ovlivĖována ani živnou pĤdou ani vzájemnými interakcemi kmenĤ EH

61

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw POKUS 2 Standardní test CFU na živných pĤdách PDA, PDA + A, PDA + D pro jednotlivé kmeny

x udává, zda živné pĤdy (PDA, PDA + A, PDA + D) ovlivĖují jednotlivé kmeny EH

9poþetné kolonie jednotlivých kmenĤ EH v prĤEČhu celého testu rostly na živných pĤdách rovnomČrnČ po celém povrchu a souþasnČ prĤEČh jejich UĤstu byl standardní

9celkovČ nejpoþetnČjší kolonie dle testu tvoĜil kmen I 9 9nejménČ poþetné kolonie vytvoĜil kmen PFR 97 konkrétnČ na živných SĤdách PDA a PDA + A; a souþasnČ kmen F-52 na živné pĤGČ PDA + D

Öživné pĤdy ovlivĖují rĤst a tvorbu kolonií kmene PFR 97; procentická odchylka mezi živnými pĤdami je vČtší než 10 % Öz vyjmenovaných þtyĜ kmenĤ EH je tedy samotný kmen PFR 97 na živných SĤdách závislý nejvíce a tedy potĜebuje velmi specifické podmínky k tomu, aby se mohl projevit a pĜípadnČ ovlivnit svého hostitele (živnou pĤdu) Ös nutností specifických podmínek kmene PFR 97 souvisí i jeho nejvýraznČjší projev na živné pĤGČ PDA + D, kdy se tento kmen projevil nejsuverénnČji oproti ostatním kmenĤm, které na pĜítomnost dodinu nereagují tak kladnČ jako právČ kmen PFR 97 Ökmeny I 101, F-52 a I 9 živnými pĤdami ovlivnČny nejsou; procentická odchylka mezi živnými pĤdami není vČtší než 10 % Ötyto kmeny se dokážou na svém hostiteli projevit þastČji i pĜi ménČ specifických podmínkách

62

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw POKUS 3 Standardní test CFU na živných pĤdách PDA, PDA + A, PDA + D pro kmeny v kombinaci

x udává, zda se jednotlivé kmeny v kombinacích vzájemnČ ovlivĖují a zda se na ovlivĖování podílí také druh živné pĤdy

9nejpoþetnČjší kolonie kmenĤ vytvoĜila kombinace kmenĤ I 101 + I 9 na živných pĤdách PDA a PDA + D a souþasnČ kombinace kmenĤ I 101 + F-52 a to na živné pĤGČ PDA + A 9nejménČ poþetné kolonie tvoĜil na živných pĤdách PDA a PDA + A kmen PFR 97 a souþasnČ na živné pĤGČ PDA + D kmen F-52

Öpro tvorbu nejpoþetnČjších kolonií je tedy vhodná kombinace kmenĤ s kmenem I 101 a zároveĖ vhodnČ zvolený druh živné pĤdy – pro kombinaci kmene I 101 s kmenem I 9 je to živná pĤda PDA a PDA + D, pro kombinaci kmene I 101 s kmenem F-52 je to živná pĤda PDA+A Ödalo by se Ĝíci, že kmen I 101 má pro ostatní kmeny v kombinacích nejsilnČjší stimulaþní úþinek, což se projevuje pĜítomností nejpoþetnČjších kolonií spor v kombinaþních testech kmene I 101 s ostatními kmeny na živné pĤGČ

POKUS 4 Standardní laboratorní biotest na hmyzím hostiteli Tenebrio molitor

x udává, kdy dosáhnou kmeny EH na larvČ Tenebrio molitor vývojového indexu 1,5 (FDI)

9vývojový index 1,5 znaþí, že larva je mrtvá a na jejím povrchu se zaþíná objevovat vláknité mycelium - pouze jednotlivé hyfy 9tohoto indexu jako první dosáhly kmeny I 101 a F-52, které se na larvách zaþaly prosazovat ke konci 5. dne

63

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 9nejdéle, na konci 8. dne, vývojového indexu 1,5 dosáhl kmen I 9 9z kombinací kmenĤ vývojového indexu nejrychleji, na zaþátku 6 dne, dosáhla kombinace I 101 + F-52 9nejpozdČji dosáhla tohoto indexu, na zaþátku 8 dne, kombinace kmenĤ PFR 97 + I 9

Ökmeny I 101 a F-52 vykazují jak v testech jednotlivých, tak v testech kombinaþních na larvČ Tenebrio molitor nejsuverénnČjší viditelné projevy mortality (porĤstání myceliem) ÖPĤžeme tedy konstatovat, že tyto kmeny jsou nejrychlejším a nejúþinnČjším spouštČþem úmrtnosti

POKUS 5 Sledování prĤEČhu infekce na povrchu hostitelské larvy Tenebrio molitor – konkurenþní test

x udává, který kmen z kombinace se na larvách Tenebrio molitor prosadí 10. den po jejich namoþení do suspenze z kombinací tČchto kmenĤ

9schopnost prosadit se byla v tomto testu posuzována dle porĤstání larvy plnČ sporulujícím myceliem

Övysoká schopnost prosadit se byla zaznamenána u kmene F-52 v kombinacích a souþasnČ tento kmen má na druhý kmen z kombinace nižší konkurenþní schopnost, tzn. vČtšinou se projeví oba souþasnČ Övysokou schopnost prosadit se v kombinacích má také kmen I 9, u tohoto kmene se ale z velké míry projevuje na druhý kmen z kombinace vyšší konkurenþní schopnost, tzn. v kombinacích s kmenem I 9 se vČtšinou projeví právČ tento kmen

64

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Öz testu vyplývá, že nejnižší schopnost prosadit se na larvČ Tenebrio molitor má v kombinaci kmenĤ kmen I 101 POKUS 6 Radiální rĤst a výtČžnost

x udává prĤPČr stĜedových kultur, plochu tČchto kultur a též množství vyprodukovaných spor bČhem kultivací kmenĤ

9nejvČtší prĤPČr stĜedové kultury a souþasnČ nejvyšší produkce spor po 21 dnech byla zaznamenána u kmene I 101 9nejmenší prĤPČr stĜedové kultury a souþasnČ nejmenší produkce spor po 21 dnech byla zaznamenána u kombinace kmenĤ PFR 97 + I9 a F-52 + PFR 97 a souþasnČ u samostatného kmene PFR 97

Öv konkurenþním testu dosahuje rychlého rĤstu kmen PFR 97 v kombinacích a naopak kmen I 101 v kombinacích se neprosazuje

POKUS 7 Interakce

x udává, jak na sebe pĤsobí jednotlivé kultury kmenĤ bČhem rĤstu

9u samostatných kmenĤ nedochází k zásadnímu ovlivĖování 9kmen I 9 v kombinaci se prosadí a ostatní kmen z kombinace zásadnČ moc neovlivĖuje 9kmen PFR 97 v kombinaci se také prosadí a zárovČĖ na rozhraní obou kmenĤ tvoĜí výrazné hraniþní zóny (zejména s kmenem F-52) 9kmen F-52 v kombinacích se sice projeví avšak na rozhraní obou kmneĤ SĜevážnČ ustupuje 9kmen I 101 v kombinacích se projevuje avšak na rozhraní pĜevážnČ ustupuje

65

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw

ÖnejvýraznČji se v kombinacích projevuje kmen I 9 a kmen PFR 97 Ökmen I 9 se razantnČ projevuje (rychlý rĤst, pravidelné kultury) a zároveĖ není YĤþi druhému kmeni z kombinace pĜíliš agresivní Ökmen PFR 97 se též razantnČ projevuje (tvorba pravidelných kultur), ale oproti kmenu I 9 je vĤþi druhému kmenu z kombinace agresivní (tvorba velkých viditelných hraniþních zón)

. TABULKA 17 Uvedené prosazující se kmeny z pokusĤ 6, 7 a 5 KOMBINACE STěEDOVÉ INTERAKCE PROSAZUJÍCÍ SE KMENģ KULTURY KMEN/Y NA LARVċ T. MOLITOR I 101 + F-52 F-52 F-52 i I 101 F-52 I 101 + PFR 97 PFR 97 PFR 97 PFR 97 I 101 + I 9 I9 I9 I9 F-52 + PFR 97 PFR 97 PFR 97 PFR 97 i F-52 F-52 + I 9 I9 I9 I9 i F-52 PFR 97 + I 9 PFR 97 PFR 97 I9

Z uvedené tabulky je vidČt, který/é kmen/y se prosazují z dané kombinace kmenĤ v provádČných pokusech (POKUS 6 stĜedové kultury, POKUS 7 interakce, POKUS 5 sledování prĤEČhu infekce na povrchu hostitelské larvy).

66

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Ainsworth G.C. 1973: Introduction and keys to higher taxa, Vol. IV.A: 1-7, In: Ainsworth, G.C., Sparrow F.K., Sussman A.S., (Eds.): The Fungi - An Advanced Treatise. Academic Press, New York.

Andersch W., Hartwig J., Reinecke P., Roberts D. 1990: Production of mycelial granules of the entomopathogenic Metarhizium anisopliae for biological control of soil pests. In: Proceedings of 5 Int. Colloq. Invert. Pathol. and Microb. Control., Adelaide, Australia, 2-5.

Bidochka M.J., StLeger R.J., Joshi L., Roberts D.W. 1995: The rodlet layer from aerial and submerged conidia of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana contains hydrophobin. Mycol. Res., 99 (4): 403-406.

Bing L.A., Lewis L.C. 1992: Endophytic Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin in corn: the influence of the plant growth stage and Ostrinia nubilalis (Hübner). Biocontrol Science and Technology, 2: 39-47.

Bohatá A. 2005: Využití entomopatogenních a mykoparazitických hub v ochranČ sazenic rychlé zeleniny a okrasných kvČtin (disertaþní práce). ZF JU, ýeské BudČjovice, 173.

Bolckmans K., Sterk G., Eyal J., Sels B., Stepman W. 1995: PreFeRal, (Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith, strain Apopka 97), a new microbial pesticide for the biological control of whiteflies in greenhuses. Mededelingen Faculteit Landbouwkundige, Universiteit Gent, 60: 719-724.

Boucias D.G., Pendland J.C. 1984: Nutritional requirements for conidial germination of several host range pathotypes of the entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi. J. Inverteb. Pathology, 43: 288-292.

Boucias D.G., Pendland J.C., Latge J.P. 1988: Nonspecific factors involved in attachment of entomopathogenic Deuteromycetes to host insect cuticle. Applied and Environmental Microbiology, 54: 1795-1805.

Brožová J. 2004: Biologická rozmanitost v ýeské republice. Souþasný stav a trendy. Ministerstvo životního prostĜedí. Praha. ISBN-80-7212-344-0. 7-18.

Butt T.M., Segers R.J., Leal S.C.M., Kerry B.R. 1998: Variation in the subtilisins of fungal pathogens of insects and nematodes. In: Bridge P., Couteaudier Y., Clarkson J. (Eds.): Molecular Variability of Fungal Pathogens. CAB International, Wallingford, UK, 149-169.

Butt T.M., Goettel M.S. 2000: Biooassays of Entomopathogenous Fungi. In: Navon A.,Ascher K.R.S. (Eds.): Bioassays of Entomopathogenic Microbes and Nematodes. CAB International, Wallingford, UK, 95-140.

67

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Butt M.T., Jackson CH., Magan N. 2001: Introduction – Fungal bilogical control agents. In: Butt T.M., Jackson C., Magan N. (Eds.): Fungi as biocontrol agents – progress, problems and potential. CABI Publishing.

Butt T.M. 2002: Use of Entomopathogenous Fungi or the Control of Insect Pests. In: Esser K., Lemke P.A. (Eds.): The Mycota XI.-Agricultural Applications. Springer, Verlag Berlin Heidelberg, 111-134.

Clark T.B., Kellen W.R., Fukuda T., Lindegren J.E. 1968: Field and laboratory studies of the pathogecity of the fungus Beauveria bassiana to three genera of mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology, 11: 1-7.

Cloyd R. 2005: The Entomopathogen Verticillium lecanii.http://www.entomology. wisc.edu/mbcn/kyf612.html, 20.3.2012.

Dirlbeková O. 1991: Biologické zdroje pro mechanickou ochranu rostlin (I.Deuteromycetes, Beauveria bassiana) Studie VTR, ÚVTIZ, ě. Rostl. Výr. 11: 10 - 21.

Driver F., Milner R.J., Trueman J.W. 2000: A taxonomic revision of Metarhizium based on a phylogenetic analysis of rDNA sequence data. Mycological Research,104: 134-150.

Dromph K.M., 2001: Dispersal of entomopathogenic hyphomycete fungi by collembolans. Soil Biol. Biochem., 33: 2047-2051.

Elliot S.L., Sabelis M.W., Janssen A., van der Geest L.P.S., Beerling E.A.M., Fransen J. 2000: Can plants use entomopathogens as bodyguards? Ecology Letters, 3: 228-235.Environmental Microbiology, 54: 1795-1805.

Feng M.G., Poprawski T.J., Khachatourians G.G., 1994: Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control - current status. Biocontrol Science and Technology, 4:3-34.

Ferron P. 1978: Biological control of insect pests by entomogenous fungi. Annual Review of Entomology, 23: 409-442.

Eyal J., Mabud A., Fischbein K.L., Walter J.F., Osborne L.S., Landa Z. 1994: Assessment of Beauveria bassiana Nov. EO-1 Strain, Which Produces a Red Pigment for Microbial Control. Applied Biochemistry and Biotechnology, 44: 65-80.

Fuxa J.R. 1987: Ecological considerations for the use of entomopathogens in IPM. Annu. Rev. Entomol., 32: 225-251.

Goettel M.S., Poprawski T.J., Vanderberg J.D., Li Z., Roberts D.W. 1990: Safety to nontarget invertebrates of fungal biocontrol agents. In: Laird M., Lacey L.A., Davidson E.W. (Eds): Safety of microbial Insecticides. CRC Press, Boca Ratón, FL, 209-231.

Goettel M.S. 1992: Fungal agents for biocontrol. In: Lomer C.J., Prior C. (Eds.): Biological Control of Locusts and Grasshoppers. CAB International, Wallingord, UK, 122-132. 68

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Goettel M.S., Koike M., Kim J.J., Aiuchi D., Shinya R., Brodeur J. 2008: Potential of Lecanicillium spp. for management of insects, nematodes and plant diseases. Journal of Invertebrate Pathology, 98 (3): 256-261.

Gottlieb D. 1976: Production and role of antibiotics in soil. Journal of Antibiotics. 29: 987-1000.

Grimm C. 2001: Economic feasibility of a small-scale production plant for entomopathogenic fungi in Nicaragua.Crop-Protection. 2001, 20: 7, 623-630.

Güclü S., Ak K., Eken C., Akyol H., Sekban R., Beytut B., Yildirim R. 2010: Pathogenicity of Lecanicillium muscarium against Ricania simulans. Bulletin of Insectology 63 (2): 243-246.

Hajek A.E., StLeger R.J. 1994: Interactions between fungal pathogens and insect hosts. Anu. Rev. Entomol., 39: 293-322.

Hajek A.E. 2004: Natural enemies: an introduction to biological control. The Edinburg Building, Cambridge, 22: 203-209.

Hall R.A. 1981: The fungus Verticillium lecanii as a microbial insecticide against aphids and scales. In: Burges H.D. (Ed.): Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980. Academic Press, London, 483-498.

Hall R.A. 1982: Control of whitefly, Trialeurodes vaporariorum and cotton aphid, Aphis gossypii, in greenhouses by two isolates of the fungus, Verticillium lecanii. Ann Appl Biol. 101: 1–11.

Hédl R. 2005: Sledování zmČn vegetace. In: VaþkáĜ D. (Eds.): Ukazatele zmČn biodiverzity. Academia Praha, 171-194.

Hesketh H., Roy H.E., Eilenberg J., Pell J.K, Hails R.S. 2009: Challenges in modelling complexity of fungal entomopathogens in semi-natural populations of insects. BioControl, 55: 55-73.

Hirte W.F., Glathe I., Adam H. 1989: Production and application of microbial preparation with Aschersonia spores. Zentrallbl. Microbiol., 144: 155-162.

Hoddle M.S. 2004: Biological control of whiteflies ornamental crops. In: Heinz K.M., van Driesche R.G., Parrella P. (Eds.): Biocontrol in protected culture. Ball Publishing, Batavia, 149-170.

Humber R. A. 1997: Fungi-Identification. In: Lacey L. A. (Ed.): Manual of Techniques in Insect Pathology. Academic Press, Chapter III.,153-185.

+Ĥrka K. 2005: Brouci ýeské a Slovenské republiky. Nakladatelství Kabourek, Zlín.

69

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Ignoffo C.M., Garcia C., Hosteller D.L., Pinnell R.E. 1977: Vertical movement of conidia of Nomuraea rileyi through sand and loam soils. J. Econ. Entomol., 70: 163- 164. Ignoffo C.M., Garcia C. 1992: Influence of conidial color on inactivation of several entomogenous fungi by simulated sunlight. Environ. Entomol., 21: 913-917.

Inglis G.D., Goettel M.S., Johnson D.L. 1993: Persistence of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, on phylloplanes of crested wheatgrass and alfalfa. Biological Control, 3: 258-270.

Inglish G.D., Goettel M.S., Butt T.M., Strasser H. 2001: Use of Hyphomycetes fungi for manging Insect Pests. In: Butt T.M., Jackson C., Magan N. (Eds.): Fungi as biocontrol agents – progress, problems and potential. CAB International, Wallingford, UK, 23-69.

Jaronski S.T. 2007: Soil ekology of the entomopathogenic Ascomycetes: A critical examination of Chat we (think) we knot. In: Ekesi S., Maniania N.K. (Eds.): Use of Entomopathogenic Fungi in Biological Pest Management. Research Signpost, Kerala. 91-173.

Kazda J., Mikulka J., Prokinová E. 2010: Encyklopedie ochrany rostlin. Vydavatelstí Profi Presss r.o.,Praha,10-51.

Klingen I., Haukeland S. 2006: The soil as a reservoir for natural enemies of pest insects and mites with emphasis on fungi and nematodes. In: Eilenberg J., Hokkanen H.M.T. (Eds.): An Ecologicaland Societal Approach to Biological Control. Springer, Dordrecht, The Netherlands, 145–211.

Koubová D. 2009: Využití hub v biologické ochranČ rostlin proti škĤdcĤm. UZEI, Agronavigátor: 1-42.

Krátká J. 2007: Laboratorní metody. In: KĤdela V., Breunová M. a kol. (Eds.): ýesko- anglická rostlinolékaĜská terminologie = Czech-English plant health terminology. Academia, Praha, 1. vyd.: 534-555.

Landa Z. 1994: Entomopatogenní houby v biologické ochranČ rostlin (habilitaþní práce). ZF JU, ýeské BudČjovice, 204.

Landa Z. 1998: Biopreparáty na bázi entomopatogenních hub. Agro, 10: 7-12.

Landa Z., Bobková P., Bohatá A. 2002: RostlinolékaĜská terminologie 13. Biologická ochrana. Plant Protection Science, 38 (3), I-XXXIV.

Landa Z., Bobková P., Bohatá A. 2007a: Biologické metody. In: KĤdela V., Breunová M. a kol. (Eds.): ýesko-anglická rostlinolékaĜská terminologie = Czech-English plant health terminology. Academia, P raha, 1. vyd.: 697-724.

Landa Z., KĜenová Z., VojtČch O. 2007b: Využití houby Beauveria bassiana v ochranČ proti lýkožroutu smrkovému. Lesnická práce, 10: 14-15.

70

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Legaspi J.C., Poprawski T.J., Legaspi B.C. 2000: Laboratory and field evaluation of Beauveria bassiana against sugarcane stalkborers (Lepidoptera: Pyralidae) in the Lower Rio Grande Valley of Texas. Journal of Economic Entomology, 93 (1): 54-59.

Leger St.J.R., Wang C. 2009: Entomopathogenic Fungi and the Genomics Era. In: Stock S.P., Vandenberg J., Glazer I., Boemare N. (Eds): Insect Pathogens Molecular Approaches and Techniques.CAB International, London, 16: 365-368.

Leland J.E. 2001: Environmental-stress tolerant formulations of Metarhizium anisopliae var. acridum for control of African Desert Locust (Schistocerca gregaria). Ph.D. Thesis. Faculty of Virginia Polytechnic Institute and State University.

Li D.P., Holdom D.G. 1993: Effect of soil matric potential on sporulation and conidial survival of Metarhizium anisopliae. J. Invertebr. Pathol., 62: 273-277.

Lingg A.J., Donaldson M.D. 1981: Biotic and abiotic factors affecting stability of B. bassania conidia in soil. J. Invert. Pathol., 38: 191-200.

Maniania N.K., Nchu F., Ekesi S. 2007: Fungal pathogens for biocontrol of ticks. In: Ekesi S., Maniania N.K. (Eds.): Use of Entomopathogenic Fungi in Biological Pest Management. Research Signpost, Kerala. 275-294.

McCoy C.W., Quintela E.D., Faria M.R. 2002: Environmental persistence of entomopathogenic fungi. In: Baur, M.E., Fuxa, J.R. (Eds.): Factors affecting the survival of entomopathogens. Southern Cooperative Series Bulletin 400.

Meyling N.V., Eilenberg J. (2007): Ecology of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in temperate agroecosystems: Potential for conservation biological control. Biological Control 43,145–155.

Millennium Ecosystem Assessment (2005): Ecosystems and human well-being: biodiversity synthesis. World Resources Institute, Washington, DC.

Moore D., Bridge P.D., Higgins P.M., Bateman R.P., Prior C. 1993: Ultra-violet radiation damage to Metahizium flavoviridae conidia and the protection given by vegetable and mineral oil and chemical sunscreens. Ann. Appl. Biol., 122: 605-616.

Osborne L.S., Landa Z. 1992: Biological control of whiteflies with entomopathogenic fungi. Florida Entomologist, Vol. 75, No. 4: 456-471.

Osborne L.S., Storey G.K., McCoy C.W., Walter J.F. 1990: Potential for controlling the sweetpotato whitefly, Bemisia tabaci, with the fungus Paecilomyces fumosoroseus. Proc. 5th Int. Colloquim on Ivertebrate Pathology and Biological Control, Adelaide, Australia, 386-390.

Papierok B., Hajek A.E. 1999: Fungi – Entomophthorales. In: Lacey L.A. (Ed.): Manual of techniques in insect pathology. Academic Press, Chapter V-2, 188-212.

Patoþka J. 2010: Destruxiny: cyklohexadepsipeptidy entomopatogenních hub. Wednesday. 71

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Pell J.K., Eilenberg J., Hajek A.E., Steinraus D.C. 2001: Biologiy, Ecology and Pest Management Potential of Entomophthorales. In: Butt T.M., Jackson C., Magan N. (Eds.): Fungi as biocontrol agents – progress, problems and potential. CABI Publishing, 71-153.

Pena, J.E., Osborne, L.S., Duncas, R.E. 1996: Potential of fungi as biocontrol agents of Polyphagotarsonemus latus (Acari: Tarsonemidae). Entomophaga, 41: 27-36.

Pluke R., Permual D., Leibee G. 1999: Integrated pest management and the use of botanicals in Guyana,3.

Siebeneicher S.R., Vinson S.B., Kenerley C.M. 1992: Infection of the red imported fire ant by Beauveria bassiana through various routes of exposure. Journal of Invertebrate Pathology, 59: 280-285.

SMċRNICE EVROPSKÉHO PARLAMENTU A RADY 2009/128/ES ze dne 21. Ĝíjna 2009, kterou se stanoví rámec pro þinnost Spoleþenství za úþelem dosažení udržitelného používání pesticidĤ.

Smith R.J., Grula E.A. 1981: Nutritional requirements for conidial germination and hyphal growth of Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate Pathology, 37 (3): 222- 230.

Sosa-Gomez D.R., Boucias D.G., Nation J.L. 1997: Attachment of Metarhizium anisopliae to the Southern Green Stink Bug Nezera viridula Cuticle and Fungistatic Effect of Cuticular Lipids and Aldehydes. Journal of Invertebrate Pathology, 69: 31-39.

Soukup J. 2005: Metody regulace zaplevelení In: Mikulka J., Kneifelová M., Martinková Z., Soukup J., Uhlík J. (Eds.): Plevelné rostliny. Vydavatelstí Profi Presss r.o. Praha,39-42.

Srivastava C.N., Maurya P., Sharma P., Mohan L. 2009: Prospective role of insecticides of fungal origin. Review, Entomological Research, 341-355.

Šimková J. 2011: Vývoj formulaþní biomasy mitosporických hub cílené na využití v programech biointenzivní integrované ochrany rostlin (disertaþní práce). ZF JU, ýeské BudČjovice.

Tscharntke T., Klein A.M., Kruess A., Steffan-Dewenter I., Thies C. 2005: Landscape perspectives on agricultural intensification and biodiversity-ecosystem service management. Ecol. Lett. 8, 857–874.

Vega F.E., Dowd P.F., McGuire M.R., Jackson M.A., Nelsen T.C. 1997: In vitro effects of secondary plant compounds on germination of blastospores of the entomopathogenic fungus Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Journal of Invertebrate Pathology, 70 (3): 209-213.

72

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw Vestergaard S., Butt T.M., Bresciani J., Gillespie A.T., Eilenberg J. 1999: Light and Electron Microscopy Studies of the Infection of the Western Flower Thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae) by the Entomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology, 7: 25-33.

Vidal C., Fargues J., Lacey L.A. 1997: Intraspecific variability of Paecilomyces fumosoroseus: Effect of temperature on vegetative growth. Journal of Invertebrate Pathology, 70: 18 - 26.

Villani M.G., Krueger S.R., Schroeder P.C., Consolif F., Consolif N.H., Preston- Wilsey L.M., Roberts D.W. 1994: Soil applications effects of Metarhizium anisopliae on japanese beetle (Coleoptera: Scarabaeidae) behavior and survival in turfgrass microcosms. Environ, Entomol, 23 (2): 502-513.

Wang C., Typas M.A., Butt T.M. 2002: Detection and characterisation of pr1 virulent gene deficiencies in the insect Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters, 213: 251-255.

Watson D.W., Geden C.J., Long S.J., Rutz D.A. 1995: Efficacy of Beauveria bassiana for Controlling the House Fly and Stable Fly (Diptera: Muscidae). Biological Control, 5: 405-411.

Weiser J. 1966: Houbová onemocnČní hmyzu.: Nemoci hmyzu. Academia, Praha, 232- 324.

Weiser J. 1991: Mikrobiální insekticidy. In: Hrdý I. (Ed.) Biopesticidy v zemČGČlství. MZ ýR, Praha,30-43.

Wright S.P., Carruthers R. 1999: Production, Delivery and Use of Mycoinsecticides for control of Insect Pests in field Crops. In: Biopesticides – use and delivery. Hall F.R., Menn J.J. (Eds.), Humana Press, Totowa, New Yersey, 233-270.

Zdroj 1 Metarhizium a. Online, cit.18.3.2012, dostupné z http://www.biocontrol.entomology.cornell.edu/pathogens/Metarhizium.html.

Zdroj 2 B. bassiana, I. Fumosorosea, Metarhizium a. Online, cit.18.3.2012, dostupné z http://www.mycobank.org/DefaultInfo.aspx?Page=Home

Zdroj 3 Online, cit. 15.2.2011, dostupné z http://pdfserve.informaworld.com/507979

73

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 7. PěÍLOHY

Jako pĜílohy byly použity fotografie z mého vlastního výzkumu.

3Ĝíloha 1: Kmeny I 101 + F-52 na živné pĤGČ PDA + D

3Ĝíloha 2: Kmeny I 101 + PFR 97 na živné pĤGČ PDA + A

3Ĝíloha 3: PĜíklad kombinace kmenĤ I 101 + F-52

na larvČ T. molitor 10. den hodnocení

3Ĝíloha 4: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (1. þást)

3Ĝíloha 5: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (2. þást)

3Ĝíloha 6: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (3. þást)

3Ĝíloha 7: PĜíklady interakce kultur jednotlivých kmenĤ

3Ĝíloha 8: PĜíklady interakce kultur kombinací kmenĤ (1. þást)

3Ĝíloha 9: PĜíklady interakce kultur kombinací kmenĤ (2. þást)

74

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 1: Kmeny I 101 + F-52 na živné pĤGČ PDA + D

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 2: Kmeny I 101 + PFR 97 na živné pĤGČ PDA + A

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 3: PĜíklad kombinace kmenĤ I 101 + F-52 na larvČ T. molitor 10. den hodnocení

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 4: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (1. þást) (vlevo a vpravo nahoĜe jednotlivé kmeny, dole uprostĜed kmeny kombinací)

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 5: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (2. þást) (vlevo a vpravo nahoĜe jednotlivé kmeny, dole uprostĜed kmeny kombinací)

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 6: PĜíklady stĜedových kultur kombinací kmenĤ (3. þást) (vlevo a vpravo nahoĜe jednotlivé kmeny, dole uprostĜed kmeny kombinací)

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 7: PĜíklady interakce kultur jednotlivých kmenĤ

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 8: PĜíklady interakce kultur kombinací kmenĤ (1. þást)

Ch F-X ang PD e

w w m w Click to buy NOW! o . .c tr e ac ar ker-softw 3Ĝíloha 9: PĜíklady interakce kultur kombinací kmenĤ (2. þást)