A Dai dati grezzi all’interpretazione biologica:
progettazione e analisi degli esperimenti di espressione genica
realizzati mediante microarray
A A
Dante Alighieri, Divina Commedia, Inferno canto XXVI, 116-120 Indice
Abstract ...... 1 INTRODUZIONE Introduzione ...... 3 METODI Capitolo 1 ...... 9 METODI PER LA PROGETTAZIONE DI ESPERIMENTI DI “CLASS COMPARISON” ...... 9 Capitolo 2 ...... 17 METODI DI ESTRAZIONE DEI DATI GREZZI...... 17 Capitolo 3 ...... 24 METODI DI VISUALIZZAZIONE DEI DATI ...... 24 A A A Capitolo 4 ...... 39 METODI DI SOTTRAZIONE DEL “BACKGROUND” ...... 39 subtract minimum Normexp + offset Capitolo 5 ...... 47 METODI DI NORMALIZZAZIONE DEI DATI ...... 47 LO(W)ESS lin-log scale 5.3.2 quantile Aquantile Capitolo 6 ...... 57 AUTOMATIZZAZIONE DEL PRE-TRATTAMENTO DEI DATI: IL SOFTWARE FEATURE EXTRACTION® ...... 57 A A A A A Capitolo 7 ...... 63 METODI DI ANALISI STATISTICA DEI DATI ...... 63 A a priori a priori A A Capitolo 8 ...... 84 METODI DI ESTRAZIONE DELL’INFORMAZIONE BIOLOGICA ...... 84
A A
RISULTATI E DISCUSSIONE Capitolo 9 ...... 93 APPLICAZIONE DEI METODI IN ESPERIMENTI DI ESPRESSIONE GENICA REALIZZATI MEDIANTE MICROARRAY: RISULTATI E DISCUSSIONE...... 93 A A A A
CONCLUSIONI Capitolo 10 ...... 116 CONCLUSIONI ...... 116 Ringraziamenti ...... 122 Bibliografia...... 122
A Abstract microarray A
Introduzione
A Haemophilus influenzae Saccharomyces cerevisiae A A A A A
A A A A A A
Figura I1: Ibridizzazione degli acidi nucleici
A A A A
Figura I2: Diagramma di flusso operativo di un esperimento di microarray A
Figura I3: SAM A LIMMA A MAANOVA A A A
Capitolo 1 Metodi per la progettazione di esperimenti di “class comparison” • • •
1.1. Necessità di replicare le osservazioni random random A A A A
A
1.2. Fattori di confondimento A A A A A A 1.3. Schemi di confronto dei campioni
1.3.1. “Reference Design” A
Figura 1.1: Schema del ”Reference Design” per quattro campioni appartenenti a due classi
indiretto 2 4 α + z1− z1−β n = 2 δ 2 σ • • • •
• •
1.3.2. “Balanced Block Design”
Figura 1.2: A
2 α + z1− z1−β n = 2 δ 2 τ • •
1.3.3. Disegno sperimentale a “Loop”
Figura 1.3: Schema del disegno a “loop”.
Capitolo 2 Metodi di estrazione dei dati grezzi quantizzazione
2.1 Il processo di quantizzazione del dato
Figura 2.1: Schema del tubo fotomoltiplicatore di un laser
A A A A A A
Figura 2.2: Catena di generazione del segnale per eccitazione del fluorocromo con scanner laser.
spot spot
Figura 2.3: Immagini acquisite da ciascun canale dello scanner (sinistra e centro) e immagine prodotta dalla sovrapposizione dei due canali (destra)
spot • • •
4.1.1 “Gridding” dell’immagine spot
Figura 2.4: Sovrapposizione della griglia digitale all’immagine
spot spot
Figura 2.5: Parte del file contenente le informazioni relative a ciascun gene
spot spot spot spot
spot spot
4.1.2 Segmentazione spot spot spot “foreground” “background”
spot segmentazione spaziale
Figura 2.7: Segmentazione spaziale dello spot con griglia di forma prefissata.
spot segmentazione per intensità
Figura 2.8: Segmentazione per intensità con algoritmo SRG.
4.1.3 Estrazione delle intensità di “foreground” e di “background” spot spot spot spot A A A A A
A
Capitolo 3
Metodi di visualizzazione dei dati
3.1 Scatterplot scatterplot
Figura 3.1: Scatterplot di due aliquote dello stesso mRNA ibridizzate sullo stesso vetrino.
scatterplot scatterplot A scatterplot
scatterplot 3.2 MA plot ed RI plot A scatterplot
Figura 3.2: Intervalli di rappresentatività dei “fold-change” (FC) e dei log-“fold-change”
Figura 3.3: Distribuzione “skewed” dei fold-change (in alto) e distribuzione gaussiana dei log-fold-change (in basso)
A A A A
Figura 3.4: MA plot di un esperimento
A A A
Figura 3.5: RI plot di un esperimento
3.3 M plot “diagnostici”
3.3.1 M-Mb plot
Figura 3.6: Grafici M- M b di due array con alta (sx) e bassa (dx) correlazione fra M e Mb
A A
Figura 3.7: Effetto ventaglio visualizzato su un grafico MA
3.4 Image-plot Image-plot
Figura 3.8: Image-plot del “background” di un array su canali separati
Image-plot
Figura 3.9: Image-plot dei due canali sovrapposti
Image-plot Image-plot Image-plot
Figura 3.10: Image-plot di un set di tre array prima (sopra) e dopo (sotto) l’eliminazione delle distorsioni lineari
3.5 Boxplot boxplot
Figura 3.11: Boxplot di un insieme di dati
Distanza o Range Inter-Quartile
Figura 3.12: Posizione dei quantili nel boxplot e identificazione degli outlier
A
Figura 3.13: Boxplot di quattro array
3.6 Density plot
Figura 3.14: Density plot dei segnali di intensità di 10 array
Figura 3.15: Density plot delle intensità corrette
3.7 Analisi delle Componenti Principali (PCA)
Figura 3.16: Matrice dei dati. Il quadrato rosso individua l’espressione del gene g nel campione s
A
Figura 3.17: Spazio dei geni
Figura 3.18: Spazio degli esperimenti
A A
Figura 3.19: Informazione spiegata dalle prime due componenti principali.
A A
Figura 3.20: Rappresentazione dell’espressione di 21 geni nello spazio degli esperimenti
Figura 3.21: Rappresentazione 3D dei dati standardizzati
A
Figura 3.22: Rappresentazione dell’insieme dei dati sulle prime due PC
A A A
Tabella 3.1: Matrice delle abbondanze
3.8 “Heatmap”: visualizzazione di somiglianze
Figura 3.23: Mappa in falsi colori o “heatmap” dei dati di espressione genica
A A
Capitolo 4
Metodi di sottrazione del “background” A A A LIMMA Bioconductor
4.1 Il “background” “Background” alto
Segnale debole
Figura 4.1: a) Microarray con “background” alto dovuto ad ibridizzazione fuori dallo spot. b) Microarray con “comete” dovute a deposizione non precisa delle sonde. c) Microarray con depositi irregolari della soluzione di buffer tampone per la deposizione. d) Microarray con spot sovrapposti e di diametro irregolare.
4.2 Stima del “background”
4.2.1 “Background” locale
Figura 4.2: Intorno dello spot per il calcolo del “background” in diversi software di analisi.
4.2.2 “Background” da sotto-griglie
Figura 4.3: Sotto-griglia dell’array sulla quale calcolare il “background”.
4.2.3 “Background” da un intorno ampio dello spot
Figura 4.4: Calcolo del “background” su un intorno ampio dello spot.
4.2.4 “Background” da aree dedicate del vetrino
Figura 4.5: Calcolo del “background” su aree vuote del microarray.
4.3 Metodi di sottrazione del “background”
4.3.1 Metodo subtract subtract A A A
Figura 4.6: MA plot di dati grezzi a cui è stato applicato il metodo subtract
4.3.2 Metodo minimum subtract subtract minimum
Figura 4.7: MA plot di dati grezzi a cui è stato applicato il metodo minimum
4.3.3 Metodo Normexp + offset Normexp Normexp Normexp offset offset
Figura 4.8: MA plot di dati a cui è stato applicato il metodo Normexp + offset
4.4 Controllo di qualità dei dati
Capitolo 5 Metodi di normalizzazione dei dati • • A • • • • •
5.1 Normalizzazione dei dati
Figura 5.1: Scatterplot di due aliquote dello stesso mRNA ibridizzate su un vetrino.
A A Figura 5.2: Grafico MA di un array su cui è stato ibridizzato lo stesso RNA marcato con entrambi i fluorocromi
within-array between-arrays. within-array between-array
• tutti i geni sull’array. • geni espressi in maniera costante. • controlli. spiked, (titration) spiked A A titration A A
5.2 Normalizzazione within-array
5.2.1 Normalizzazione globale
Figura 5.3: sx) Istogramma della distribuzione dei dati prima della normalizzazione (in rosso) e
dopo lo spostamento della media (in blu).
dx) Scatterplot dei dati prima della normalizzazione (in rosso) e dopo la
normalizzazione (in blu).
LIMMA median.
5.2.2 Normalizzazione intensità-dipendente: LO(W)ESS e rlowess A LO(W)ESS LOESS over-fitting LO(W)ESS LOESS l, 3 1− | x |3 |, x |<1 w(x) = ( ) 0 |, x |≥1 LIMMA LOESS.
Figura 5.4: Correzione dei dati con l’applicazione di una normalizzazione LO(W)ESS.
LO(W)ESS d q LO(W)ESS rlowess LO(W)ESS
5.2.3 Trasformazione lineare-logaritmica o lin-log di lin-log
i di
5.2.4 Correzione “paired-slide” o “self-normalization” lin-log ≅ 1 1 1 1 []log R/G -c- ()log R' /G'-c' ≅ []log R/G + log G' /R' = log RG' /GR' = ()M − M ' 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ≅ ≅ 1 1 ≅ []log R/G + log R' /G' (M + M )' 2 2 2 2 A 1 LO(W)ESS (M + M )' 2 1 (A + A )' 2 LIMMA
5.3 Normalizzazione “multiple-slides” o “between arrays”
5.3.1 Normalizzazione scale between-arrays
Figura 5.5: Box-plot degli array prima (sx) e dopo (dx) la normalizzazione between-arrays
LOESS scale σ σ
MAD i aˆi = I I ∏ MAD i i=1 A A A
5.3.2 Normalizzazione quantile e Aquantile quantile quantile quantile
Figura 5.6: MA-plot di dati: a) non normalizzati,, b) normalizzati within-array
e c) normalizzati between-arrays.
A LOESS
quantile Aquantile A scale LOESS
A
Capitolo 6 Automatizzazione del pre-trattamento dei dati: il software Feature Extraction® A A
A
6.1 Algoritmo “FindSpots and SpotAnalysis”
Figura 6.1: ”Bright Corner” posizionati agli angoli dei microarray prodotti da Agilent
6.1.1 “Cookie Cutter”
Figura 6.2: Metodo “Cookie Cutter” per la definizione delle aree per il calcolo delle intensità (sx) e sovrapposizione di “cookie” adiacenti (dx) A 6.1.2 “Whole Spot”
Figura 6.3: Metodo “Whole Spot” per la definizione delle aree per il calcolo delle intensità
Figura 6.4: Selezione del raggio per il calcolo dell’intensità di “background”: spot-specifica (sx) e area-specifica (dx).
6.2 Algoritmo “PolyOutlierFlagger” A
A
Figura 6.5: Metodo Definizione dei limiti di rigetto per la selezione degli spot “outlier”.
A 6.3 Algoritmo “BGSubtractor”
A A A A A
6.4 Algoritmo “Dye Normalization” A • A • • • • ρ − ρ CS = R G N A
A A LO(W)ESS
Capitolo 7 Metodi di analisi statistica dei dati A A A A A A A A SAM A LIMMA A MAANOVA A A A
7.1 Analisi della significatività sui microarray A SAM SAM • Ipotesi nulla: • Ipotesi alternativa:
SAM Dati di espressione genica
Normalizzazione
Definizione e calcolo Generazione delle del punteggio d(i) permutazioni
Definizione e calcolo del punteg gio d p(i)
Identificazione dei geni potenzialmente significativi
Stima di FDR *
Scelta di ∆
Selezione dei geni differenzialmente espressi
Figura 7.1: Diagramma delle operazioni effettuate nell’analisi della significatività statistica.
*FDR (False Discovery Rate)
SAM SAM d(i) i x i)( − x i)( d i)( = C1 C 2 s i)( + s0 • • fudge factor”
1 1 + n1 n2 s i)( = n1 n2 [x i)( − x i)]( 2 + [x i)( − x i)]( 2 ∑ h C1 ∑ k C2 n1 + n2 − 2 h=1 k=1 • • • A d(i) s(i) d(i) so s0 d(i) s(i) s0 d(i) s(i). d(i); g g g d(i) p dp(i) i
xG1 i)( − xG2 i)( d p i)( = s i)( + s0 G
dp )1( ≥dp )2( ≥dp )3( ≥...≥dp(k)
dp(i)
n p d p (k ) d E (k) = ∑ n p p=1
Figura 7.2: Punteggi di permutazione e punteggio atteso su tutte le permutazioni
di(k) d(i) di(k) dE(k) SAM
Figura 7.3: “SAM plot”
di(k) ≅dE(k). ∆ d(i) t1 d(i) t2 i d (k) − d E (k) ≥ ∆ ≥
Figura 7.4: SAM plot con apposizione della soglia superiore t 1 e della soglia inferiore t 2
1 n p ∑ card {i | d p i)( ≥ t1 ∨ d p i)( ≤ t2} FDR ≈ n p p=1 card {i | d i)( ≥ t1 ∨ d i)( ≤ t2}
d p (k) − d E (k) < ∆ ∆ ∆
Tabella 7.1: ∆
7.2 Inferenza statistica classica e approccio bayesiano empirico Passo 1: Passo 2: A Passo 3: θ a priori θ
7.2.1 Scelta della distribuzione a priori e stimatori della media e della varianza a priori
Metodo bayesiano classico: a priori a priori Metodo bayesiano parametrico moderno a priori a priori Metodo bayesiano soggettivo: a priori a priori LIMMA
7.2.2 Metodo bayesiano parametrico moderno per la scelta delle distribuzioni a priori µ σ a priori σ σ a priori a priori a posteriori a priori a posteriori 2 ˆ ˆ µ µ µ µ N(µ,σµ)
m y + −1 d 2 σ 2 1 n ˆ 0 ˆ 2 µ = σ µ = 2 + 2 1 1 d σ 0 2 + 2 d σ 0 a priori a priori a priori Γ µ σ Γ µ σ σ µ σ σ a posteriori a priori µ σ Γ µ σ ν σ
k0 n µi = µ0 + y k0 + kn k0 + ki
ki = k0 + n
vi = v0 + n
2 2 2 k0n 2 viσ i = v0σ 0 + (n − )1 s + (y − µ0 ) k0 + n i
7.2.3 Statistica “B” e modello gerarchico per i dati di espressione genica B
Rij M ij = log 2 Gij i j µ σ µ σ ∼ µ σ ∀ g 0 I g = 1 g a posteriori a posteriori g
Pr( I g = |1 M ij ) Bg = log Pr( I g = |0 M ij ) A
p Pr(Mij | I g = 1) Bg = log 1−p Pr( Mij | I g = 0) Pr(M | I = 1) p Pr(Migg= | I = 1) ∏ ig ≠ i g = log 1−pMI Pr( | = 0) Pr( MI | = 0) igg= ∏i≠ g ig p Pr(M | I = 1) = log i= g g 1−p Pr( Mi= g | I g = 0) Mg p p Bg Mg|I g=1 Mg|I g=0 Mg Pr( M | I = )1 ≡ f (M ) i g Ii =1 i
Pr( M | I = )0 ≡ f (M ) i g Ii =0 i µ σ µ σ g a+ s2 + M 2 p 1 g g . Bg = log 2 1− p 1+ nc 2 M g. a+ s g + 1+ nc B ≥ Mg. a Mg. B A B
7.3 Fonti di variabilità sui dati di espressione genica e modellazione della varianza dei dati random” varietà trattato non-trattato controllo • A A • • • A • • • • A
A
Figura 7.5: Schematizzazione dell’effetto combinato DV
A A • •
Figura 7.6: Schematizzazione dell’effetto combinato AG
Figura 7.7: Schematizzazione dell’effetto combinato DG
Figura 7.8: Schematizzazione dell’effetto combinato VG
A A A A A A
7.3.1 Modelli additivi ANOVA per l’analisi dell’espressione
yijkg i j k g A bilanciato A Modelli additivi misti yijkg µ + A i + D j + V k + G g + (VG) kg + (AG) ig + (DG) jg + εijkg
• µ • ε σ A yijkg µ + A i + D j + AD k + x ijkg xijkg A A µ a posteriori A MAANOVA within-arrays A g xijkg µg+ (VG) kg + (AG) ig + (DG) jg + εijkg µ
A A A misto Modelli additivi fissi A A yijkg µ + A i + D j + V k + G g + (VG) kg + εijkg A yijkg µ + A i + D j + V k + G g + (VG) kg + (AG) ig + εijkg r yijkgr µ + A i + D j + V k + G g + (VG) kg + (AG) ig + (DG) jg + S r(ig) + εijkgr modello fisso 2 [y − µ − A − D − V − G − (VG) − (AG) − (DG) − S ] ∑ijkgr ijkgr i j k g kg ig jg r(ig)
A = D = V = G = (AG ) = (AG ) = (VG ) = (VG ) = (DG ) = (DG ) = S = 0 ∑ i ∑ j ∑ k ∑ g ∑g ig ∑i ig ∑gkg ∑ k kg ∑gjg ∑ jjg ∑ r r(ig )
VG kg = t.. kg . − t.. k.. − t... g. + t.....
7.3.2 “Nested” F-test e determinazione dei geni differenzialmente espressi
• ipotesi nulla o modello nullo: • ipotesi alternativa o modello alternativo: k ≠ K E(y) = β 0 + β1 x1 + β 2 x2 + β g xg E(y) K K E(y) = β 0 + β1 x1 + β 2 x2 + β g x g + β g +1 x g+1 + + β k xk K H 0 : β g+1 = β g+2 = = β k = 0 H a : almeno un parametro β a con a = g +1,... k è diverso da 0 (SSE reduced − SSE full ) (k − g) F = SSE full []n − ()k +1 k − g n − (k +1)
F > Fk−g ,n−()k+1
(rss 0 − rss 1 /() df 0 − df 1 ) F = rss 1 / df 1 rss df 2 σ pool
(rss 0 − rss 1 /() df 0 − df 1 ) F = 2 σ pool
(rss 0 − rss 1 /() df 0 − df 1 ) F = 2 (rss 1 / df 1 +σ pool 2/) scatterplot
Capitolo 8 Metodi di estrazione dell’informazione biologica A
8.1 Banche dati di annotazioni geniche
GenBank A A
UniGene
Entrez Gene (LocusLink)
Ensembl Genome Browser
KEGG Pathway
OMIM
HomoloGene
GeneOntology
8.2 Strumenti per “single-gene analysis”
8.2.1 GeneCards®
Figura 8.1: Interfaccia iniziale di GeneCards
A 8.3 Strumenti per l’analisi “pathway-level” A A A A
8.3.1 Pathway Explorer homo sapiens
Figura 8.2: Interfaccia iniziale di PathwayExplorer
Figura 8.3: Visualizzazione della posizione di sei geni differenzialmente espressi utilizzando PathwayExplorer
8.3.2 PathwayExpress A
Figura 8.4: Schematizzazione della propagazione del segnale genico
Figura 8.5: Risultati di un’analisi realizzata con PathwayExpress
A
8.4 Rendere i dati pubblici: standard MIAME A A A A A A
8.4.1 GEO Omnibus
8.4.2 ArrayExpress A A A A A A A A A
A
Capitolo 9 Applicazione dei metodi in esperimenti di espressione genica realizzati mediante microarray: risultati e discussione LIMMA MAANOVA SAM Genesis Pathway Express Pathway Explorer
A 9.1 Esperimento E1: analisi dell’espressione genica in tessuto cerebrale di ratti trattati con fenitoina [66]. A A A A A A A A A A A A A A A A A A A µ A A A A A
9.1.1 Esperimento E1: disegno sperimentale
A
Figura 9.1: Disegno dell’esperimento E1. Le frecce servono ad evidenziare il “loop”.
9.1.2 Esperimento E1: sottrazione del “background” subtract minimum normexp+offset scatterplot scatterplot
Figura 9.2: Scatterplot delle intensità del “foreground” dei due canali nell’array 1(sx) e ingrandimento alle basse intensità di segnale (dx) scatterplot A
Figura 9.3: Scatterplot del logaritmo delle intensità MA plot
Figura 9.4: MA plot dei dati grezzi (sx), dei dati ripuliti col metodo subtract (centro) e dei dati ripuliti col metodo minimum (dx) A
A
Figura 9.5: Scatterplot dei dati logaritmici di intensità del “background” dell’array 1 subtract minimum
9.1.3 Esperimento E1: normalizzazione MA plot LIMMA SAM within-array LOESS A
Figura 9.6: MA plot dell’array 1 normalizzato utilizzando il metodo LOESS
Figura 9.7: Boxplot dei docici array normalizzati con il metodo LOESS. A sinistra i sei array sui quali sono stati ibridizzati i campioni di ippocampo. A destra i sei array sui quali sono stati ibridizzati i campioni di corteccia frontale. between-array MAANOVA linlog rlowess
Figura 9.8: Applicazione della trasformazione lin-log (sx) e del metodo rlowess (dx) all’array 1 A rlowess
9.1.4 Esperimento E1: analisi statistica e risultati LIMMA SAM MAANOVA LIMMA SAM
Figura 9.9: Diagrammi di Venn della liste di geni differenzialmente espressi ricavate utilizzando i tre metodi statistici A
A A A
Figura 9.10: Prime due componenti principali dei profili di espressione di ippocampo e corteccia frontale A
9.1.5 Esperimento E1: Validazione in real time RT- PCR Akt1 Impa1 Mapk10 Fyn Rapgef4 Prkce Frap1 Cap1 Gad1 Grina Gclc, Rapgef4.
9.1.6 Esperimento E1: Analisi di “pathway” e interpretazione dei dati Pathway Express Pathway Explorer A A A Pathway Express) Pathway Express Pathway Explorer GeneCards® PubMed Gabra5
NEURONAL Gad1 EXCITABILITY Glud1 Glutamatergic Glutamatergic Modulation of of Modulation
GABAergic and and GABAergic Grina neurotransmission neurotransmission Akt1 Frap1 Prkce survival survival NEUROPROTECTIVE Junb proliferation and proliferation and
EFFECT Regulation cell of Mapk10
Gsr
action Gclc Antioxidant Rab5a Rab11b MEMBRANE TRAFFICKING Rasa2 Ap1s1
UNDEREXPRESSED GENES IN Gfap MOOD DISORDERS Cap1
A Pdyn
Ube2g1
Uba5
Ubac1 MYO-INOSITOL REGULATION Impa1
Tabella 9.1: Riassunto dei geni interpretati e regolati dalla fenitoina nell’ippocampo A A A Frap1 Gsr Gfap Pdyn Cap1
9.2 Esperimento E2: Caratterizzazione dei profili di espressione di cellule di lievito trasfettate con cinque varianti missenso del gene BRCA1 [71]. A A S. cerevisiae A A A
A in silico A A A A A A A A A A A S. cerevisiae µ A A A A A
9.2.1 Esperimento E2: disegno sperimentale A A A
Figura 9.11: Disegno dell’esperimento E2
9.2.2 Esperimento E2: sottrazione del “background” subtract minimum scatterplot A density plot
Figura 9.12: Scatterplot delle intensità del “foreground” dei due canali nell’array 1(sx) e ingrandimento alle basse intensità di segnale (dx)
Figura 9.13: Scatterplot del logaritmo delle intensità (sx) e Density plot dei dati grezzi (dx) MA plot minimum subtract
A Figura 9.14: MA plot dei dati grezzi (sx), dei dati ripuliti col metodo subtract (centro) e dei dati ripuliti col metodo minimum (dx)
9.2.3 Esperimento E2: Normalizzazione LIMMA SAM LOESS
Figura 9.15: MA plot dei dati non normalizzati (sx), normalizzati con il metodo LOESS (centro) e con il metodo Aquantile (dx) per tre array utilizzati nell’esperimento E2 Aquantile MAANOVA linlog rlowess. MAANOVA between array
A 9.2.4 Esperimento E2: analisi statistica e risultati SAM LIMMA “wild-type” MAANOVA
Figura 9.16: Sovrapposizione fra le liste di geni differenzialmente espressi ricavate utilizzando SAM, LIMMA e MAANOVA per i gruppi fenotipici R (sx) e RP (dx) LIMMA SAM LIMMA LIMMA
A
Figura 9.17: Intersezione delle tre liste di geni differenzialmente espressi ricavate nell’esperimento E2 utilizzando LIMMA A heatmap
9.2.5 Esperimento E2: Validazione in real time RT- PCR RNR1, POL30, SKM1, HHF2 ADE1
9.2.6 Esperimento E2: analisi di “pathway” e interpretazione Pathway Explorer Pathway Express S.cerevisiae Pathway Explorer A A
A Induzione della ricombinazione omologa Recupero della proliferazione R P RP R P RP Up Down Up Down Up Down Up Down Up Down Up Down HHF2 HHF2 HTA2 HTA2 HTB2 Assemblaggio HTB2 HTB2 HAT1 della cromatina HIF1 HAT1 HAT1 ADE1 ADE13 ADE17 ADE1 ADE6 ADE13 ADE4 ADE4 RNR2 Metabolismo dei ADE17 URA3 RNR1 RNR1 RNR1 URA2 RNR4 nucleotidi ADE4 DUT1 URA3 DUT1 DCD1 PRS4 DUT1 CDC6 CLN1 CLB6 Ciclo cellulare CLNG1 RFC5 DRC1 DDC1 IPL1 FLO11 MEP2 Crescita invasiva GPA2 SKM1 DIG2 SKM1 e pseudo-ifale HMS1 ASH1 SKM1 ARP7 ARP7 Rimodellazione ARP9 ARP9 della cromatina SFH1 SFH1 Controllo del TOP2 TOP2 MSH2 MSH2 MSH2 MSH2 ciclo cellulare MSH2 MSH2 Tabella 9.2: Tabella riassuntiva dei geni coinvolti nei fenotipi analizzati nell’esperimento E2
9.3 Esperimento E3: Caratterizzazione dei profili di espressione di due varianti missenso di BRCA1 trasfettate in cellule HeLa A A
A A A A A A A A A A A A A A A A A A µ A A A A A A A A A A
9.3.1 Esperimento E3: disegno sperimentale A A A
Figura 9.17: Disegno dell’esperimento E3
9.3.2 Esperimento E3: sottrazione del “background” scatterplot
Figura 9.19: : Scatterplot delle intensità del “foreground” dei sue canali nell’array 1(sx) e ingrandimento alle basse intensità di segnale (dx)
A
Figura 9.20: Scatterplot dei dati logaritmici di intensità del “background” dell’array 1 A subtract
Figura 9.21: MA plot dei dati d’intensità dell’array 1 senza sottrazione del “background” (sx) e utilizzando per la sottrazione il metodo subtract (dx) minimum Normexp+offset
A Figura 9.22: MA plot dei dati d’intensità dell’array utilizzando il metodo minimum (sx) e il metodo Normexp+offset (dx)
9.3.3 Esperimento E3: normalizzazione Image-plot A
Figura 9.23: Image-plot prima(sx) e dopo (centro) dell’applicazione del metodo LOESS e MA plot (dx) dell’array 1 boxplot
Figura 9.24: Logaritmo dei dati di intensità relativi al canale rosso prima (sx) e dopo (dx) la normalizzazione su singolo canale. quantile A
Figura 9.25: Boxplot dei dati relativi alla classe di campioni di HeLa trasfettate con la mutazione M1775R prima (sx) e dopo (dx) la normalizzazione con il metodo quantile
9.4 Esperimento E4: analisi dell'espressione genica in tessuti di ratti trattati con T 1AM. A A AA A A A A A A A A A A A A A A A A A µ A A A A A A A A A A A
9.4.1 Esperimento E4: disegno sperimentale
A
Figura 9.19: Disegno sperimentale dell’esperimento E4
Capitolo 10 Conclusioni ad hoc a priori • • • •
a priori A M- A A
Normexp + offset A A LOESS between array MAANOVA between array LIMMA within between array LIMMA
SAM SAM SAM plot SAM SAM A LIMMA
SAM LIMMA
MAANOVA between array MAANOVA MAANOVA Pathway Express Pathway Explorer
Ringraziamenti
A A A A
Bibliografia A The Human Genome Project: lessons from large-scale biology. 300 Importance of replication in microarray gene expression studies: statistical methods and evidence from repetitive cDNA hybridizations. A A 97 A Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays. 32 Suppl Comparison of microarray designs for class comparison and class discovery. 18 Design of studies using DNA microarrays. 23 Design issues for cDNA microarray experiments. 3 Questions and answers on design of dual-label microarrays for identifying differentially expressed genes. 95 A Statistical issues in the design and analysis of gene expression microarray studies of animal models. 8 Statistical issues in cDNA microarray data analysis. 224 Microarray experimental design: power and sample size considerations. 16 Sample size determination in microarray experiments for class comparison and prognostic classification. 6 Design of microarray experiments for genetical genomics studies. 174 A Statistical design and the analysis of gene expression microarray data. 89 Optimal designs for 2-color microarray experiments. 10 A A Microarray data analysis: from hypotheses to conclusions using gene expression data. 26 A An assessment of recently published gene expression data analyses: reporting experimental design and statistical factors. 6 The microarray data analysis process: from raw data to biological significance. 3 Analysis and management of microarray gene expression data. 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