VILNIAUS PEDAGOGINIS UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS ZOOLOGIJOS KATEDRA

BRIGITA PAULAVIČIŪTĖ

ELACHISTA GENTIES DRUGIŲ (: ) DNR MOLEKULINIŲ ŽYMENŲ PAIEŠKA, ANALIZĖ IR PANAUDOJIMAS POPULIACIJŲ TYRIMUOSE

MAGISTRO DARBAS (Zoologija)

Mokslinis vadovas doc. dr. Virginijus Sruoga

Vilnius – 2006 TURINYS

1. ĮVADAS 3

2. LITERATŪROS APŽVALGA 6

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 10

4. TYRIMŲ METODIKA IR MEDŽIAGA 11

5. MODELINIŲ RŪŠIŲ TYRIMAS TRADICINIAIS

ENTOMOLOGIJOS METODAIS

5.1. Elachista argentella 20

5.2. Elachista pollinariella 24

5.3. Elachista maculicerusella 28

6. MOLEKULINIŲ DNR TYRIMŲ TAIKYMAS ELACHISTA MODELINĖMS

RŪŠIMS

6.1. DNR išskyrimas 34

6.2. Atsitiktinių ir specifinių pradmenų pritaikymo rezultatai 36

7. MODELINIŲ ELACHISTA RŪŠIŲ MTITOCHONDRINĖS DNR COI GENO

ATKARPŲ CHARAKTERISTIKOS IR POLIMORFIZMAS

7.1. Modelinių Elachista rūšių sekų polimorfizmas 40

7.2. Amplifikuotų DNR COI geno atkarpų polimorfizmas skirtingose populiacijose 51

8. IŠVADOS 53

LITERATŪRA 54

SANTRAUKA 60

SUMMARY 61

PRIEDAS NR.1 62

2 1. ĮVADAS

Elachistidae – gana smulkių drugių šeima. Daugelio jų išskleistų sparnų ilgis siekia tik apie 6–13 cm. Elachistidae drugiai paplitę visame pasaulyje, tačiau dauguma rūšių žinomos iš šiaurinio pusrutulio. Elachistidae galva padengta prigludusiais žvyneliais. Galvos šonuose virš pakaušio styro du pašiauštų žvynelių kuokštai, suteikiantys galvai charakteringą išvaizdą. Apatinės lūpos čiuopikliai dažniausiai vidutinio dydžio, neretai dvigubai ilgesni už galvos plotį, išlenkti į viršų ar rečiau trumpi, nukreipti žemyn. Žandų čiuopikliai redukuoti. Svarbus išorinis šios šeimos požymis yra trumpas straubliukas, dažnai ne ilgesnis už apatinės lūpos čiuopiklius. Straubliuko pagrindas padengtas žvyneliais. Antenos siūliškos, truputį ilgesnės už pusę priekinio sparno ilgio. Pirmasis antenos narelis ilgesnis ir truputį platesnis už kitus narelius. Ant priekinio šio narelio krašto yra eilė retų, labai plonų žvynelių. Elachistidae sparno piešinys dažniausiai susideda iš sparno viduryje esančios šviesios skersinės juostos ir dėmių tamsiame fone. Tačiau gali būti ir tamsios dėmės šviesiame sparnų fone. Kai kurių rūšių sparnuose atskiri tamsūs žvyneliai gali būti išsidėstę padrikai, nesudarydami aiškaus piešinio. Kartais priekiniai sparnai vienspalviai – balti, rusvi ar pilki. Užpakaliniai sparnai siauri ir lancetiški, juos dengiantys žvyneliai vienspalviai, o sparnų kraštai su labai ilgais, plauko pavidalo žvyneliais. Daugelis Elachistidae rūšių išoriškai yra panašios ir sunkiai atskiriamos, todėl drugio spalva ir raštas nėra esminis požymis, nors dažnai gelbsti kaip papildomas rūšies skiriamasis bruožas. Pagrindinis dėmesys apibūdinant rūšį skiriamas patinų genitalijų struktūrai. Jų sandaros ir formos ypatumai dažniausiai yra patikimiausi apibūdinant rūšis arba kitų sistematinių rangų taksonus. Elachistidae vikšrų gyvenimo būdas augalų audinių viduje vadinamas minavimu, o augalų asimiliaciniuose audiniuose padaryti pažeidimai vadinami minomis. Jų vikšrai dažniausiai būna balsvos, gelsvos ar žalsvos spalvos, rečiau rusvi ar rausvi. Vikšro galva suplota dorsoventraline kryptimi, rudai juodos spalvos. Vikšras turi išvystytas tris poras krūtinės ir keturias poras pilvelio kojų (Paulavičiūtė, 2005). Elachistidų lėliukės mažos, apie 3–5 mm. ilgio, tačiau kai kurios gali siekti 7 mm. Paviršinėse lėliukių struktūrose matomos antenos, galva ir pilvelis. Pilvelyje matomi segmentai ant kurių išsidėstčiusios taškinės duobutės. Tik keletas Elachistidae drugių rūšių lėliuke virsta minos viduje. Daugelis rūšių lėliuke virsta ant lapo ar stiebo, arba ant žemės prisitvirtinusios

3 kremasteriu ir šilko siūlu. Lėliukių spalva varijuoja nuo tamsiai rudos iki šviesiai rudos spalvos (Patočka, 1999). Elachistidae šeimos drugiams būdinga siaura trofinė specializacija. Dauguma rūšių minuoja 3 šeimų augalus: miglinių (Poaceae), viksvuolinių (Cyperaceae) ir vikšrinių (Junaceae). Tačiau kai kurios rūšys minuoja sausmedinių (Caprifolaceae) ir agurklinių (Boraginaceae) šeimų augalų lapus. Lietuvoje Elachistidae drugiai paplitę plačiai. Apie 90% jų rūšių trofiškai susiję su plačiai paplitusiomis varpinėmis žolėmis, todėl šie drugiai būdingi daugeliui mūsų buveinių. Lietuvoje Elachistidae šeimos drugiai nėra pakankamai ištirti ir nedaug žinoma apie šios šeimos rūšinę sudėtį ir ypač apie biologijos ypatumus. Duomenys apie daugelį Elachistidae šeimos rūšių yra fragmentiniai ir negalutiniai. Daug likusių neaiškumų reikia atskleisti, tikslinti ar patvirtinti išsamesniais tyrimais. Molekuliniai tyrimo metodai sparčiai išplito paskutiniaisias dešimtmečiais. Šiandien jie plačiai taikomi įvairiose biologijos mokslo šakose: ekologijoje, evoliucijoje, populiacijų tyrimuose ir kt. Šių metodų pagalba galime atsakyti daugelį klausimų, į kuriuos sunku būtų atsakyti pasitelkus tik tradicinius tyrimo metodus. Pastaraisiais metais molekuliniai tyrimo metodai pradėti taikyti entomologiniuose tyrimuose. Minuojantys drugiai yra pripažįstami kaip tinkamas objektas bendriems biogeografiniams tyrimams (Puplesis, Diškus, 2003). Pasirinkta modelinė grupė – Elachistidae iki šiol buvo tyrinėjama pasitelkiant tik tradicinius entomologijos tyrimų metodus (Kaila, 1999), o molekuliniai DNR tyrimai niekada nebuvo taikomi. Todėl šių progresyvių metodų įsisavinimas ir jų panaudojimas filogenetinių ir filogeografinių problemų sprendimui yra labai aktualus ir savalaikis. Plačiai pripažįstama, kad molekulinių DNR tyrimų rezultatai yra svarus argumentas ne tik tikslinant taksonominių grupių filogenezes, bet ir nagrinėjant organizmų migravimo ir faunų formavimosi ypatumus (Roderick, 1996; Caterino et al.,2000; Hewitt, 2004; Vandewoestijne et al., 2004). Šiame darbe buvo pasirinktos trys Elachistidae šeimos rūšys: Elachista argentella, Elachista maculicerusella, Elachista pollinariella. Modelinėmis rūšimis jos pasirinktos dėl savo morfologinių savybių. Norint apibūdinti šias rūšis, nebūtina daryti genitalijų preparato, pakanka išorinių morfologinių požymių pvz. priekinių sparnų rašto, drugio dydžio. Be to pasirinktos modelinės rūšys yra vienos dažniausių Lietuvoje. Buvo tirtos modelinių Elachista rūšių mitochondrinės DNR COI genas. Šis genas plačiai taikomas populiaciniuose ir tarprūšiniuose tyrimuose.

4 Svarbiausias šio tyrimų etapo rezultatas buvo tai, kad pirmą kartą tiriamoje taksonominėje grupėje pavyko pritaikyti molekulinių tyrimų metodus. Tai sudaro prielaidas toliau tirti pasirinktų rūšių genetinį polimorfizmą ir panaudoti šiuos tyrimus populiacijų panašumų ir skirtumų nustatymui bei tarprūšinių ryšių analizei. Padėka Dėkoju darbo vadovui doc. dr. V. Sruogai už pagalbą atliekant tyrimus ir metodinius patarimus rašant magistrinį darbą, dr. V. Stunžėnui ir visiems P. Šivickio labaratorijos darbuotojams už konsultacijas ir pagalbą molekulinių tyrimų metu. Dėkoju recenzentei dr. Rasai Bernotienei už mano darbo recenziją.

5 SANTRAUKA

Pasirinkta modelinė grupė – Elachistidae (Insecta: Lepidoptera) iki šiol buvo tyrinėjama pasitelkiant tik tradicinius tyrimo metodus, o molekuliniai DNR tyrimo metodai niekada nebuvo taikomi. Modelinėmis pasirinktos rūšys Elachista argentella, E. maculicerusella ir E. pollinariella. Tyrimui pasirinktos skirtingais atstumais viena nuo kitos nutolusios populiacijos. Elachista argentella, E. maculicerusella ir E. pollinariella buvo tiriamos tradiciniais entomologijos metodais: darant morfologinius preparatus, identifikuojant rūšis, dokumentuojant svarbias morfologines struktūras taksonomijai. Modelinėms Elachista rūšims pritaikytas DNR išskyrimo metodas. Molekulinių tyrimų metu išbandyti 4 specifiniai ir 2 atsitiktiniai pradmenys. Elachista argentella, E. maculicerusella ir E. pollinariella rūšims pritaikyta oliginukleotidų pora, amplifikuojanti mtDNR citochromoksidazės COI geno atkarpą. Įvertintas sekvenuotų trijų Elachista rūšių drugių mtDNR COI geno atkarpų polimorfizmas rūšių ir populiacijų lygyje.

6 SUMMARY

The chosen group - Elachistidae (Insecta: Lepidoptera) was researched only with the help of traditional research methods and the molecular DNA method was never applied. Model species Elachista argentella, E. maculicerusella and E. pollinariella. Selected populations were located in a different distance from each other. Elachista argentella,. E. maculicerusella and E. pollinariella were examined using traditional entomological methods such as identifying of species, making of morphological preparations, documenting of important for morphological structures. DNA extraction method was applied for the above mentioned Elachista species. There were 4 specific and 2 random primers chosen for the molecular research. Analysis of Elachista argentell,. E. maculicerusella and E. pollinariella was carried out using oligonucleotide pair which amplifies mitochondrial DNA sequences of the COI gene. The polymorphism of sequenced mtDNA segments of the COI gene in three Elachista species was assessed on species and population level.

7